Модифицированные полипептиды рецептора активина и их применение
Номер патента: 20510
Опубликовано: 28.11.2014
Авторы: Квак Кейт Су-Ньюнг, Хэн Эйчкью, Сан Йонгхун, Жоу Ксяолан, Тэм Лей-Тинг Тони
Формула / Реферат
1. Изолированный белок, содержащий модифицированный полипептид рецептора IIB активина (vActRIIB), причем указанный полипептид выбран из группы, состоящей из
a) полипептида, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y;
b) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 19 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, М, K, H,W и Y;
c) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 23 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, М, K, H, W и Y;
d) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, М, K, H,W и Y;
e) полипептида, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью с любым из (а)-(d), причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и при этом полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11.
2. Изолированный белок, содержащий модифицированный полипептид рецептора IIB активина (vActRIIB), причем указанный полипептид выбран из группы, состоящей из
a) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 2, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y;
b) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 19 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, М, K, H, W и Y;
c) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 23 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, М, K, H, W и Y;
d) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 25 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, М, K, H, W и Y;
e) полипептида, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью с любым из (а)-(с), причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и при этом полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11.
3. Изолированный белок, содержащий модифицированный полипептид рецептора IIB активина (vActRIIB), причем указанный полипептид выбран из группы, состоящей из
a) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K или N;
b) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 19 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2 или с 19 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K или N;
c) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 23 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2 или с 19 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N;
d) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 25 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2 или с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N;
e) полипептида, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью с любым из (а)-(d), заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K или N, и при этом полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11.
4. Изолированный белок, содержащий модифицированный полипептид рецептора IIB активина (vActRIIB), причем указанный полипептид выбран из группы, состоящей из
a) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N;
b) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 19 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2 или с 19 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N;
c) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 23 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2 или с 23 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N;
d) полипептида, имеющего последовательность аминокислот, представленную аминокислотами с 25 по 160 последовательности SEQ ID NO: 2 или с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 40, причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N;
e) полипептида, обладающего по меньшей мере 90% идентичностью с любым из (а)-(d), причем заместитель для R в положении 40 представляет собой любую аминокислоту из A, G, Q, M, H, K и N на R, и при этом полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11.
5. Изолированный белок по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что заместитель для Е в положении 28 представляет собой любую аминокислоту из А, W или Y.
6. Изолированный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид обладает по меньшей мере 90% идентичностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем указанная замена представляет собой замену E на W.
7. Изолированный белок по п.6, отличающийся тем, что указанный полипептид обладает по меньшей мере 95% идентичностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем указанная замена представляет собой замену E на W.
8. Изолированный белок по п.7, отличающийся тем, что указанный полипептид обладает по меньшей мере 99% идентичностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем указанная замена представляет собой замену E на W.
9. Изолированный белок по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что полипептид дополнительно содержит замену R на А в положении 64.
10. Изолированный белок по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что полипептид имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 87 и 88.
11. Изолированный белок по п.1, отличающийся тем, что полипептид имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 87 и 88.
12. Изолированный белок по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что полипептид соединен по меньшей мере с одним гетерологичным полипептидом.
13. Изолированный белок по п.9, отличающийся тем, что гетерологичный полипептид представляет собой область Fc антитела человека.
14. Изолированный белок по п.12 или 13, отличающийся тем, что указанный полипептид соединен с указанным по меньшей мере одним гетерологичным полипептидом посредством линкера.
15. Изолированный белок по п.14, отличающийся тем, что указанный линкер представляет собой пептидный линкер.
16. Изолированный белок по п.14 или 15, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97.
17. Изолированный белок по п.14 или 15, отличающийся тем, что имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 91.
18. Изолированный белок по любому из пп.14-17, отличающийся тем, что линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, и при этом указанный гетерологичный пептид содержит SEQ ID NO: 80.
19. Изолированный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид обладает по меньшей мере 99% идентичностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем указанная замена представляет собой замену Е на W, причем указанный изолированный белок содержит полипептид, соединенный с гетерологичным полипептидом посредством линкера, и при этом указанный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, и указанный гетерологичный полипептид содержит SEQ ID NO: 80.
20. Изолированный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид обладает по меньшей мере 99% идентичностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с 25 по 134 последовательности SEQ ID NO: 18, которая содержит замену одной аминокислоты в положении 28, причем указанная замена представляет собой замену Е на W, причем указанный изолированный белок состоит из полипептида, соединенного с гетерологичным полипептидом посредством линкера, и при этом указанный линкер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, и указанный гетерологичный полипептид состоит из последовательности SEQ ID NO: 80.
21. Фармацевтическая композиция для ингибирования трансформирующего фактора роста, выбранного из миостатина, активина А и фактора роста и дифференцировки (GDF), содержащая эффективное количество белка по любому из пп.1-20 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
22. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, кодирующий белок по любому из пп.1-20.
23. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.22, содержащая полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из
a) полинуклеотида, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 59, 61, 63, 65, 69, 71, 92, 94 и 96, или последовательность, комплементарную указанной; и
b) полинуклеотида, кодирующего полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97.
24. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок по п.1, содержащая полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из
a) полинуклеотида, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 19, 23, 25, 27, 33, 37, 39, 41, 59, 61, 63, 92, 94 и 96, или последовательность, комплементарную указанной; и
b) полинуклеотида, кодирующего полипептид, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 20, 24, 26, 28, 34, 38, 40, 42, 60, 62, 64, 87, 88, 91, 93, 95 и 97.
25. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновые кислоты по любому из пп.22, 23 или 24.
26. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.25.
27. Способ получения белка по любому из пп.1-20, включающий культивирование клетки-хозяина по п.26, что обеспечивает экспрессию белка.
28. Способ ингибирования активности миостатина у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества белка по любому из пп.1-20 или композиции по п.21.
29. Способ увеличения сухой массы мышц или увеличения отношения сухой массы мышц к массе жира у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества белка по любому из пп.1-20 или композиции по п.21.
30. Способ лечения расстройства или заболевания, связанного с атрофией мышц, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества белка по любому из пп.1-20 или композиции по п.21.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что расстройство или заболевание, связанное с атрофией мышц, представляет собой или является следствием заболевания, выбранного из мышечной дистрофии, амиотрофического латерального склероза, застойного обструктивного заболевания легких, хронической сердечной недостаточности, раковой кахексии, СПИДа, почечной недостаточности, уремии, ревматоидного артрита, возрастной саркопении, атрофии органов, кистевого туннельного синдрома, андрогенной недостаточности, ожогового повреждения, диабета и истощения мышц вследствие длительного постельного режима, повреждения спинного мозга, инсульта, перелома костей, старения или воздействия микрогравитации.
32. Способ лечения нарушения обмена веществ у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества белка по любому из пп.1-19 или композиции по п.21.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что нарушение обмена веществ выбрано из диабета, ожирения, гипергликемии и остеопороза.
34. Способ лечения заболевания, при котором в организме субъекта происходит избыточная экспрессия активина, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества белка по любому из пп.1-20 или композиции по п.21.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что заболевание представляет собой рак.
36. Способ лечения заболевания, связанного с атрофией мышц или нарушением обмена веществ у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту вектора по п.25, причем вектор обладает способностью обеспечивать экспрессию полипептидов vActRIIB в организме субъекта.
Текст
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ РЕЦЕПТОРА АКТИВИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В настоящем изобретении предлагают вариантные полипептиды и белки растворимого рецептора активина IIB, способные связывать активин А, миостатин или GDF-11 и ингибировать их активность. В настоящем изобретении также предлагают полинуклеотиды, векторы и клетки хозяина, способные продуцировать вариантные полипептиды и белки. Также предложены композиции и способы лечения атрофии мышц и других заболеваний и нарушений. Перекрестная ссылка на родственные заявки Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США, серийный номер 61/065474, поданной 11 февраля 2008 г., и предварительной заявке США, серийный номер 60/905459,поданной 6 марта 2007 г., описание которых положено в основу и полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Область техники Настоящее изобретение относится к белкам семейства трансформирующего фактора роста(TGF) и к растворимым рецепторам TGF-, а также к способам модуляции активности членов семействаTGF- для лечения различных заболеваний. Предпосылки создания изобретения Семейство белков TGF- включает TGF-, активины, белки морфогенеза кости (BMP), факторы роста нервов (NGF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и факторы роста/дифференцировки (GDF). Указанные белки участвуют в регуляции широкого спектра биологических процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и другие функции клеток.GDF-8, называемый также миостатином, является членом семейства TGF-, который экспрессируют главным образом клетки растущей и взрослой скелетной мышечной ткани. Очевидно, миостатин играет существенную роль в отрицательной регуляции роста скелетной мускулатуры (McPherron et al., Nature (Лондон) 387, 83-90 (1997. Было показано, что антагонизм миостатина приводит к увеличению сухой мышечной массы животных (McFerron et al., см. выше, Zimmers et al., Science 296:1486 (2002. Другой представитель семейства TGF- - это GDF-11. GDF-11 приблизительно на 90% идентичен миостатину по последовательности аминокислот. GDF-11 участвует в развитии осевой структуры животных (Oh et al., Genes Dev 11:1812-26 (1997, а также играет роль в развитии и росте скелетной мускулатуры. Активины А, В, АВ представляют собой гомо- и гетеродимеры, соответственно, двух полипептидных цепей, ВА и ВВ (Vale et al., Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986. Активины впервые были открыты как пептиды гонад, участвующие в регуляции синтеза фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). В настоящее время считают, что они участвуют в регуляции ряда биологических процессов. Активин А - это превалирующая форма активина. Активин, миостатин, GDF-11 и другие члены надсемейства TGF связываются и с рецепторами активина типа II и типа IEB, каждый из которых является трансмембранной серин-треониновой киназой, что обеспечивает передачу сигнала (Harrison etal., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004. Исследование поперечного связывания показало, что миостатин способен связывать рецепторы активина типа II ActRIIA и ActRIEB in vitro (Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001. Также существуют свидетельства того, что GDF-11 связывает как ActRIIA, так и ActRIEB (Oh et al., Genes Dev 16:2749-54 (2002. Известно, что экспрессия белка TGF- связана с разнообразными заболеваниями и расстройствами. Соответственно, терапевтические молекулы, обладающие активностью агонистов нескольких белков,TGF- одновременно могут быть очень эффективны при таких болезнях и расстройствах. Дополнительно, получение лекарственных средств на основе белков может быть связано с проблемами, возможно возникающими в ходе экспрессии и очистки белка. Одна из таких проблем - агрегация белков во время экспрессии и очистки. Накопление большого количества белков в ходе культивирования клеток может приводить к агрегации. В процессе очистки могут возникнуть условия, дополнительно стимулирующие агрегацию белков (Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8:E572-E579, 2006). Можно попытаться ослабить факторы, которые вызывают агрегацию, однако, существует потребность в белках с пониженной склонностью к образованию агрегатов. Настоящее изобретение удовлетворяет потребность в терапевтических молекулах, которые связываются с многочисленными лигандами и обладают пониженной склонностью к агрегации и, таким образом, улучшают технологичность, что обеспечивает эффективное производство белков, полезных для лечения патологических состояний, связанных с TGF-. Краткое описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложен изолированный (выделенный) белок, содержащий модифицированный полипептид рецептора IEB активина человека (обозначаемого vActRIIB). В настоящем документе термин полипептид vActRIIB относится к полипептидам vActRIIB человека и полипептидам vActRIIB5 человека. Согласно одному варианту реализации изобретения белок содержит полипептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2 или 18, в которой аминокислоты в любом положении Е 28 или R40 или в обоих положениях Е 28 и R40 заменены на другую ненативную (т.е. не содержащуюся в нативном белке в данном положении) аминокислоту, при этом указанный полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11. Согласно одному варианту реализации изобретения белок содержит полипептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2 или 18, в которой аминокислоты в положениях Е 28, или R40, или в обоих положениях Е 28 и R40 заменены на другую ненативную аминокислоту, при этом сигнальный пептид удален, и указанный полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11. Согласно одному варианту реализации изобретения белок содержит полипептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2 или 18, в которой аминокислоты в положениях Е 28, или R40, или в обоих положениях Е 28 и R40 заменены на другую ненативную аминокислоту, при этом сигнальная последовательность удалена и N-конец зрелого полипептида укорочен, причем указанный полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11. Согласно одному варианту реализации изобретения в N-концевом зрелом укороченном полипептиде vActRIIB отсутствуют четыре N-концевые аминокислоты или шестьN-концевых аминокислот зрелой последовательности, при этом указанный полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11. Согласно одному варианту реализации изобретения заместитель в положении Е 28 выбран из группы, включающей W, Y и А. Согласно дополнительному варианту реализации заместитель в положении Е 28 выбран из группы аминокислот, включающей A, F, Q, V, I, L, М, K, Н, W и Y. Согласно дополнительному варианту реализации заместитель в положении R40 выбран из группы аминокислот, включающей G, Q, М, Н, K и N. Согласно дополнительному варианту реализации заместитель в положении Е 28 выбран из группы аминокислот, включающей A,F, Q, V, I, L, М, K, Н, W и Y, и заместитель в положении R40 выбран из группы аминокислот, включающей A, G, Q, M, H, K и N. Согласно дополнительному варианту реализации полипептид также содержит гетерологичный белок. Согласно одному варианту реализации изобретения гетерологичный белок представляет собой Fc-домен. Согласно дополнительному варианту реализации Fc-домен представляет собойFc-домен IgG человека. Согласно одному варианту реализации изобретения белок содержит полипептиды с последовательностью аминокислот, представленной SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. Согласно еще одному варианту изобретения белок содержит полипептид, кодированный полинуклеотидом, который имеет последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 или комплементарную ей последовательность. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотид, кодирующий полипептид vActRIIB. Согласно одному варианту реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 69, 71, 92, 94, 96 или комплементарной ей последовательности. Согласно еще одному варианту изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид с последовательностью аминокислот, представленной в группу, состоящей из SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64,66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. Согласно дополнительному варианту реализации молекула нуклеиновой кислоты также содержит последовательность регуляции транскрипции или трансляции. В другом аспекте предложен рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты vActRIIB. В другом аспекте предложены клетки-хозяева, содержащие рекомбинантные векторы, а также предложены способы получения полипептидов vActRIIB. В настоящем изобретении также предложена композиция, содержащая по меньшей мере один полипептид или белок vActRIIB согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую полипептид или белок vActRIIB в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или предотвращения заболевания, связанного с атрофией мышц (мышечной слабостью), у субъекта, страдающего от такого нарушения, путем введения субъекту терапевтической композиции, содержащей полипептид или белок vActRIIB. Атрофия включает или является следствием, помимо прочего, следующих состояний: раковой кахексии, мышечной дистрофии, бокового амиотрофического склероза, застойного обструктивного заболевания легких, хронической сердечной недостаточности, химической кахексии, кахексии в результате ВИЧ/СПИД, почечной недостаточности, уремии, ревматоидного артрита, возрастной саркопении, возрастной хрупкости, атрофии органов, кистевого туннельного синдрома, андрогенной недостаточности и атрофии мышц вследствие обездвиженности из-за длительного постельного режима, повреждения спинного мозга, инсульта, перелома костей и старости. Атрофия мышц может также возникать в результате невесомости, обусловленной космическим полтом, устойчивости к инсулину, атрофии мышц вследствие ожогов, андрогенной недостаточности и других заболеваний. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания, связанного с экспрессией активина А. Согласно одному варианту реализации изобретения такое заболевание представляет собой рак. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения нарушения обмена веществ, включающий введение терапевтической композиции субъекту, нуждающемуся в таком лечении, при этом нарушение обмена веществ выбирают из остеопороза, диабета, ожирения, нарушения механизма усвоения глюкозы, гипергликемии, андрогенной недостаточности и метаболического синдрома. В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение терапевтической композиции в изготовлении лекарственного препарата для лечения указанных заболеваний. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ генной терапии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту вектора, кодирующего полипеп-2 020510 тид или белок vActRIIB согласно настоящему изобретению, при этом вектор обладает способностью к экспрессии полипептида или белка vActRIIB в организме субъекта. Краткое описание фигур На фиг. 1 показана последовательность аминокислот растворимый ActRIIB-IgG1Fc человека дикого типа (SEQ ID NO: 98). Последовательность сигнального пептида выделена жирным шрифтом, за ней следует внеклеточный домен зрелого ActRIIB и курсивом обозначен Fc IgG1 человека, в том числе неполная шарнирная область. Аминокислоты Е 28 и R40 подчеркнуты. Последовательность линкеров GGGGS (SEQID NO: 75) выделена курсивом и подчеркнута. На фиг. 2 показана последовательность аминокислот растворимый ActRIIB5-IgG1Fc человека (SEQID NO: 99). Последовательность сигнального пептида выделена жирным шрифтом, за ней следует растворимый домен зрелого ActRIIB5 и Fc IgG1 человека, включающий неполную шарнирную область, выделен курсивом. Е 28 и R40 подчеркнуты. Последовательность линкеров (GGGGS) (SEQ ID NO: 75) выделена курсивом и подчеркнута. На фиг. 3 показано влияние обработки растворимым vActRIIB-Fc E28W на массу яичек (фиг. 3 А) и яичников (фиг. 3 В) у мышей с нокаутом по ингибину-. На фиг. 4 показано влияние обработки растворимым vActRIIB-Fc E28W на коэффициент выживаемости у самцов (фиг. 4 А) и самок (фиг. 4 В) мышей с нокаутом по ингибину-. На фиг. 5 показано влияние обработки растворимым vActRIIB-Fc E28W на массу тела у мышей с опухолью 26 толстой кишки. На фиг. 6 показано влияние обработки растворимым vActRIIB-Fc E28W на выживание мышей с опухолью 26 толстой кишки. Подробное описание Предложены белки, включающие различные полипептиды рецептора активина IIB человека (vActRIIB). Данные белки и полипептиды отличаются своей способностью связываться по крайней мере с одним из трех TGF- белков: миостатином (GDF-8), активином А и GDF-11, и ингибировать активность этих белков. Данные белки и полипептиды также демонстрируют тенденцию к агрегации, сниженную по сравнению с полипептидами без модификаций согласно настоящему изобретению. Модификации состоят в замене аминокислот в положениях 28, 40 или и 28 и 40 относительно ActRIIB дикого типа номерNO: 2). В настоящей заявке термин "члены семейства TGF-" или "белки TGF-" относится к структурно сходным факторам роста семейства трансформирующих факторов роста, включающего активины и белковые факторы роста и дифференцировки (GDF) (Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherronet al. Growth factors and cytokines in health and disease, vol. IB, D. LeRoith and C.Bondy. ed., JAI Press Inc.,Greenwich, Conn, USA: pp. 357-393). GDF-8, также называемый миостатином, является отрицательным регулятором ткани скелетных мышц (McPherron et al., PNAS USA 94:12457-12461 (1997. Миостатин синтезируется в форме неактивного белкового комплекса длиной приблизительно 375 аминокислот,имеющий номер в ГенБанке ААВ 86694 (SEQ NO: 49) для человека. Белок-предшественник активируется в результате протеолитического расщепления в четырхосновном сайте процессинга с образованием Nконцевого неактивного продомена и С-концевого белка приблизительно из 109 аминокислот, который димеризуется с образованием гомодимера массой приблизительно 25 кДа. Этот гомодимер является зрелым, биологически активным белком (Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002. В настоящей заявке термин "продомен" или "пропептид" относится к неактивному N-концевому белку, который отщепляется с высвобождением активного С-концевого белка. В настоящей заявке термин "миостатин" или "зрелый миостатин" относится к зрелому, биологически активному С-концевому полипептиду в виде мономера, димера или другой форме, а также к биологически активным фрагментам или родственным полипептидам, включая аллельные варианты, варианты сплайсинга, рекомбинантные белки и полипептиды. Как сообщалось, зрелый миостатин обладает 100%-ной идентичностью последовательности у многих видов, включая человека, мышь, курицу, свинью, индейку и крысу (Lee et al.,PNAS 98, 9306 (2001. В настоящей заявке термин GDF-11 относится к BMP (морфогенетический белок кости), имеющему номер в базе Swissprot 095390 (SEQ ID NO: 50), так же как вариантам и гомологам разновидностей этого белка. GDF-11 приблизительно на 90% идентичен миостатину на уровне аминокислотной последовательности. GDF-11 вовлечен в регуляцию формирования передне-заднего осевого строения скелета (McPherron et al., Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al., Dev. Biol. 208 (1),222-232 (1999, но постнатальные функции его неизвестны. Активин А является гомодимером цепей полипептида ВА. В настоящей заявке термин "активин" относится к белку активину, имеющему номер в GenBank: NM 002192 (SEQ ID NO: 48), а также к вариантам и гомологам данного белка у других видов. Рецепторы активина. В настоящей заявке термин рецепторы активина типа IIB (ActRIIB) относится к рецепторам активина человека, имеющим номер NP001097 (SEQ ID NO: 47). Термин "растворимый ActRIIB" относится к внеклеточной области ActRIIB (SEQ ID NO: 18), ActRIIB5 (SEQ ID NO: 2), а также к этим последовательностям, в которых аргинин в положении 64 заменен на аланин. Модифицированные растворимые полипептиды ActRIIB. Данное изобретение обеспечивает изолированные белки, содержащие модифицированные полипептиды рецептора ActIIB человека (называемые в настоящей заявке полипептидами vActRIIB, или модифицированными полипептидами). В настоящей заявке термин "vActRIIB белок" относится к белку, содержащему полипептид vActRIIB. В настоящей заявке термин "изолированный" относится к молекуле белка или полипептида, до некоторой степени очищенной от эндогенного материала. Эти полипептиды и белки характеризуются способностью связывать и ингибировать активность активина А, миостатина илиGDF-11. В некоторых вариантах аффинность связывания различных полипептидов с активином А, миостатином или GDF-11 улучшена по сравнению с полипептидами дикого типа. В одном из вариантов полипептид vActRIIB имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 или 18, в которой аминокислоты в любом из положений Е 28, или R40, или в обоих положениях Е 28 иR40 заменены на другую ненативную аминокислоту, и при этом полипептид обладает способностью к связыванию миостатина, активина А или GDF-11. В другом варианте полипептиды vActRIIB представляют собой зрелые варианты или укороченные зрелые варианты этих последовательностей. В настоящей заявке термин "зрелый полипептид vActRIIB" относится к полипептиду с удаленной сигнальной последовательностью. В одном варианте зрелые последовательности представляют собой, например, аминокислоты 19-160 из SEQ ID: 2 и аминокислоты 19-134 из SEQ ID: 18, причем одна или обе аминокислоты в положениях 28 и 40 заменены на другую ненативную аминокислоту, и полипептиды сохраняют способность связываться с активином А, миостатином или GDF-11. В настоящей заявке термин "укороченный зрелый полипептид vActRIIB" относится к полипептиду с удаленной сигнальной последовательностью и, кроме того, аминокислотами N-концевой части зрелого полипептида. В одном варианте удалены 4N-концевые аминокислоты или 6N-концевых аминокислот зрелого полипептида. В этом варианте укороченные зрелые последовательности представляют собой, например, аминокислоты 23-160 из SEQ IDNO: 2 или аминокислоты 25-160 из SEQ ID NO: 2 и аминокислоты 23-134 из SEQ ID NO: 18 или аминокислоты 25-134 из SEQ ID NO: 18, причем одна или обе аминокислоты в положениях 28 и 40 заменены аминокислотами, не характерными для дикого типа, которые сохраняют способность связываться с активином А, миостатином или GDF-11. В настоящей заявке термин "положение 28" и "положение 40" (т.е. Е 28 и R40) относится к положению аминокислоты в последовательностях SEQ ID NO: 2 и 18, которые включают сигнальную последовательность из 18 аминокислот. Для единообразия, если зрелые полипептиды vActRIIB содержат замены в положении 10 и/или положении 22, или укороченные зрелые полипептиды содержат замены в положении 6 и/или положении 18, или замены в положениях 4 и/или положении 16 зрелых или укороченных зрелых последовательностей, эти варианты будут все еще указаны относительно полноразмерных SEQ ID NO: 2 и 18 или, как показано на фиг.1 или 2, т.е. как замены аминокислоты в положении Е 28 и/или R40. Такие зрелые варианты или укороченные N-концевые варианты описаны ниже. В одном варианте заместитель в положении Е 28 выбран из группы аминокислот, состоящей из W, Y и А. В одном варианте заместитель в положении 28 представляет собой W. В другом варианте заместитель в положении 28 выбран из группы аминокислот, состоящей из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W иY. В дальнейшем варианте заместитель в положении 40 выбран из группы аминокислот, состоящих из G,Q, M, H, K и N. В дальнейшем варианте заместитель в положении 28 выбран из группы аминокислот,состоящих из A, F, Q, V, I, L, M, K, H, W и Y, и заместитель в положении 40 выбран из группы аминокислот, состоящей из A, G, Q, M, H, K и N. В одном варианте белок включает полипептиды, имеющие последовательность аминокислот из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. В другом варианте белок включает полипептид, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность,представленную в группе, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94, 96 или последовательность, комплементарную указанной. В одном варианте реализации в полипептиде vActRIIB удалены сигнальные последовательности, и в результате получается зрелый модифицированный полипептид. Для получения полипептидов, готовых к применению, можно использовать различные сигнальные пептиды. Сигнальный пептид может иметь последовательность, показанную на фиг. 1 и 2 (SEQ ID NO: 73) или альтернативные сигнальные последовательности, такие как SEQ ID NO: 74, сигнальная последовательность SEQ ID NO: 2 и 18. Можно использовать любые другие сигнальные пептиды, полезные для экспрессии vActRIIB илиvActRIIB5. В другом варианте реализации vActRIIB полипептидов имеют последовательности, которые, по существу, подобны SEQ ID NO: 2 и 18. В настоящей заявке термин "по существу, подобный" относится к полипептидам, имеющим по меньшей мере приблизительно 80%-ную идентичность, по меньшей мере приблизительно 85%-ную идентичность, по меньшей мере приблизительно 90%-ную идентичность, по меньшей мере приблизительно 95%-ную идентичность, по меньшей мере приблизительно 98%-ную идентичность или по меньшей мере приблизительно 99%-ную идентичность относительно последовательности аминокислот, представленной SEQ ID NO: 2 и 18, в которых одну или обе аминокислоты в положениях 28 и/или 40 заменены на аминокислоты, не характерные для дикого типа, причем полипептид сохраняет активность полипептида SEQ ID NO: 2 и 18, которая представляет собой способность связывать и ингибировать миостатин, активин А или GDF-11. Кроме того, термин полипептид vActRIIB включает фрагменты SEQ ID NO: 2 или 18, такие как укороченные по N- и С-концу варианты, содержащие замены в положении 28 и/или 40, описанные здесь, причем полипептид обладает способностью к связыванию и ингибированию миостатина, активина А или GDF-11. В настоящей заявке термин "производное" полипептидов vActRIIB и vActRIIB5 относится к присоединению по меньшей мере одной дополнительной химической группировки или по крайней мере одного дополнительного полипептида с образованием ковалентного конъюгата или агрегата, таких как гликозильные группы, липиды, ацетильные группы, или полипептиды, присоединяемые на С-конце или Nконце (полипептиды слияния), конъюгаты с молекулами ПЭГ и другие модификации, которые описаны более полно ниже. Различные полипептиды рецептора ActRIIB (vActRIIB) могут также включать дополнительные модификации и производные, включая модификации С- и N-концов, которые являются результатом процессинга в ходе экспрессии в различных типах клеток, таких как клетки млекопитающих, Е. coli, дрожжи и другие рекомбинантные клетки-хозяева. Далее предусмотрены фрагменты полипептида vActRIIB и полипептиды, содержащие инактивированный участок(ки) N-гликозилирования, инактивированный участок(ки) протеазы или консервативную замену(ы) аминокислот, в последовательностях полипептида,представленных в SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52,54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. В настоящей заявке термин "активность полипептида vActRIIB или vActRIIB5" или "биологическая активность растворимого полипептида ActRIIB или ActRIIB5" относится к одному или более видов активности полипептидов vActRIIB и vActRIIB5 in vitro или in vivo, включая, но не ограничиваясь приведенными в примерах ниже. Виды активности полипептидов vActRIIB включают, но не ограничены перечисленными, способность связываться с миостатином, активином A, GDF-11 и способность снижать или нейтрализовать активность миостатина, активина А или GDF-11. В настоящем описании термин "способный к связыванию" (обладающий способностью к связыванию) с миостатином, активином или GDF11 относится к связыванию, измеренному методами, известными в данной области, такими как методBiacore, описанный в примере 2 ниже. Кроме того, в примере 2 тест-систему на основе клеток pMAREC2C12 используют для измерения активности нейтрализации активина, активности нейтрализации миостатина и активности нейтрализации GDF-11. Виды активности in vivo включают, но не ограничены,увеличение массы тела, увеличение сухой (без жира) массы мышц, увеличение массы скелетных мышц,уменьшение общей массы, продемонстрированные в моделях с использованием животных ниже и известные в данной области. Виды биологической активности далее включают сокращение или предотвращение кахексии, вызванной определенными типами опухолей, предотвращение роста определенных типов опухолей и увеличение выживания в определенных моделях на животных. Дальнейшее обсуждение vActRIIB действий полипептида приведено ниже. Полипептиды согласно настоящему изобретению далее включают гетерологичные полипептиды,присоединенные к полипептиду vActRIIB напрямую или через линкерную последовательность с образованием гибридного (рекомбинантного, слитого) белка. В настоящем описании термин "рекомбинантный белок" относится к белку и гетерологичному полипептиду, соединенными методами рекомбинантных ДНК. Гетерологичные полипептиды включают, но не ограничены, полипептиды Fc, гистидиновые метки и лейциновые "молнии", стимулирующие олигомеризацию и стабилизацию различных полипептидовActRIIB, как описано, например, в WO 00/29581, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. В одном варианте реализации гетерологичный полипептид представляет собой полипептид Fc или Fc-домен. В одном варианте Fc-домен выбран из Fc-доменов IgG1, IgG2 и IgG4 человека. Они приведены в SEQ ID NO: 80, 82 и 84. vActRIIB может далее включать шарнирные последовательности IgG1, IgG2 и IgG4 (полностью или их частью), прилежащие к соответствующему Fc-домену IgG. Полные шарнирные последовательности для IgG1, IgG2 и IgG4 представлены в SEQ ID NO: 76, 77 и 78 соответственно. Полипептид vActRIIB может дополнительно включить линкерную последовательность. Линкеры, в первую очередь, выполняют функцию спейсеров между полипептидом и вторым гетерологичным полипептидом, или другим присоединенным элементом, или между двумя или более модифицированными полипептидами ActRIIB. В одном варианте реализации линкер состоит из аминокислот,связанных пептидными связями, предпочтительно из 1-20 аминокислот, причем аминокислоты выбраны из 20 природных аминокислот. Одна или более из этих аминокислот может быть гликозилирована в том смысле, как это понимают специалисты в данной области. В одном варианте реализации от 1 до 20 выбраны из глицина, аланина, пролина, аспаргина, глутамина и лизина. Предпочтительно линкер состоит из аминокислот, которые не содержат групп, создающих пространственные затруднения, таких как глицин и аланин. Типичные линкеры являются полиглицинами, например (Gly)5, (Gly)8, poly(Gly-Ala), и полиаланинами. Один особенно подходящий линкер показан в разделе примеры ниже (Gly)4Ser (номер последовательности 75). В другом варианте реализации vActRIIB может содержать шарнирный линкер, т.е. линкер соседний с шарнирной областью (см. последовательность номер 79). Линкеры также могут представлять собой непептидные линкеры. Например, алкильные линкеры,такие как -NH-(CH2)S-C(O)-, где s=2-20. Эти алкильные линкеры могут дополнительно содержать в качестве заместителей группы, не создающие пространственных помех, такие как низший алкил (например,Q-C), низший ацил, галоген (например, Cl, Br), CN, NH2, фенил. В одном варианте реализации полипептиды vActRIIB связаны с полипептидом Fc прямо, или через линкер, или через шарнирный линкер. В другом варианте реализации Fc представляет собой Fc область иммуноглобулина человека. vActRIIB,присоединенные к Fc, включают, например, vActRIIB-IgG1Fc, E28A (SEQ ID NO: 60); vActRIIB-IgG1Fc,E28W (SEQ ID NO: 62), vActRIIB-IgG1Fc, E28Y (SEQ ID NO: 64), vActRIIB-IgG Fc, R40G (SEQ ID NO: 66), vActRIIB5-IgG1Fc, E28A (SEQ ID NO:70) и vActRIIB5-IgG1Fc E28W (SEQ ID NO:72), как показано в табл. 1-2 и описано в приведенных в настоящем описании примерах. Другие варианты реализации включают vActRIIB- IgG2 Fc, E28W (SEQ ID NO: 91), vActRIIB-IgG2 Fc, E28Y (SEQ ID NO: 93) и vActRIIBIgG2 Fc (SEQ ID NO: 95). Было показано, что эти варианты (модификации) демонстрируют пониженную агрегацию по сравнению с ActRIIB-IgG2 IgG2 дикого типа, как показано в примерах ниже. Полипептиды vActRIIB, раскрытые в настоящем описании, могут также быть присоединены к непептидной молекуле, что придает им желательные свойства, такие как пониженная разрушаемость и/или увеличенный период "полужизни", сниженная токсичность, пониженная иммунногенность и/или повышенная биологическая активность полипептида ActRIIB. Примеры таких молекул включают, но не ограничены, линейными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (PEG), полилизин, декстран, липид,холестерольная группа (как, например, стероид), углевод или олигосахарид. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает изолированные нуклеиновые кислоты,включая полинуклеотиды, кодирующие полипептиды vActRIIB согласно настоящему изобретению. Термин "изолированные" относится к молекулам, в определенной степени очищенным от эндогенного материала. В одном примере нуклеиновая кислота данного изобретения содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30,32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. Ввиду вырожденности генетического кода, заключающейся в том, что в некоторых случаях одну аминокислоту кодирует более чем один кодон, последовательность ДНК может отличаться от представленной в SEQ ID NO: 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94,и 96 или в комплементарной нити ДНК SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 и 96, и тем не менее кодировать полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46,52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. Эти вариантные последовательности могут возникать в результате "молчащих" мутаций в процессе репликации или могут быть продуктом направленного мутагенеза этих последовательностей. В другом примере молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения включает полинуклеотид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92,94 и 96 и комплементарных последовательностях SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 и 96. В другом варианте реализации, данное изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях или условиях средней жесткости с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 или 96,или комплементарной последовательностью SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 45, 51, 53, 55, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 92, 94 и 96, которые кодируют полипептид, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97, и где кодируемый полипептид сохраняет активность полипептида vActRIIB. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению ДНК в одноцепочечной и двухцепочечной форме, а также РНК. ДНК включает, например кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК, ДНК, амплифицированную методом ПЦР, и их комбинации. Геномная ДНК может быть выделена обычными методами, например с использованием ДНК последовательностей 1 и 17 или их подходящий фрагмент в качестве зонда. Геномную ДНК, кодирующую полипептиды ActRIIB, получают из геномных библиотек, которые существуют для большинства видов. Синтетическая ДНК может быть получена путем химического синтеза перекрывающихся олигонуклеотидных фрагментов с последующей сборкой, в результате которой происходит восстановление части или всех кодирующих областей и фланкирующих последовательностей. РНК может быть получена из прокариотического вектора экспрессии, который обеспечивает синтез мРНК в большом количестве, например,вектора, содержащего промотор Т 7 и полимеразу РНК. кДНК получают из библиотек, приготовленных из мРНК из различных тканей, продуцирующих ActRIIB. Молекула ДНК этого изобретения включает в себя гены с полной последовательностью, а также полинуклеотиды и их фрагменты. Полноразмерный ген может также включать последовательности, кодирующие N-концевую последовательность. В другом аспекте настоящего изобретения дополнительно предложены векторы экспрессии, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, а также клетки, трансформированные такими векторами, и способы получения полипептидов vActRIIB. Термин вектор экспрессии относится к плазмиде, фа-6 020510 гу, вирусу или вектору, экспрессирующему полипептид с последовательности полинуклеотида. Вектор экспрессии содержит единицу транскрипции, включающую набор: 1) генетический элемент или элементы, играющие роль регулятора экспрессии гена, например промоторы или энхансеры,2) последовательность, кодирующая полипептиды vActRIIB, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок,3) подходящие последовательности для инициирования и терминирования транскрипции. Эти последовательности могут также включать маркер селекции. Векторы для использования в клетках легко доступны, и молекулы нуклеиновых кислот встраивают в векторы, используя стандартные технологии рекомбинантной ДНК. Такие векторы могут включать промоторы для функционирования в конкретных тканях, а вирусные векторы предназначены для экспрессии vActRIIB в определенных клетках животных или человека. Примером вектора, подходящего для экспрессии vActRIIB, является pDSRavActRIIB, а также другие известные подходящие векторы, описанные ниже. Далее в настоящей заявке предложены способы получения полипептидов vActRIIB. Разнообразные системы экспрессии/хозяев могут быть использованы. Такие системы включают микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидные или космидные ДНКвекторы экспрессии, клетки насекомых, инфицированные вирусной системой экспрессии, напимер бакуловирусом, клетки растений, трансфицированные вирусными векторами (например, вирусами мозаики цветной капусты, табака, TMV) или трансформированные бактериальными векторами (например, плазмидами Ti или pBR322), или системы на основе клеток животных. Клетки животных, используемые для рекомбинантной продукции белков, включают, например,клетки VERO, HeLa, CHO и их производные, такие как Veggie СНО и родственные линии клеток, выращиваемые в бессывороточной среде (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) или линия СНО-DX-BI 1, которая не имеет DHFR (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), клетки COS, такие как COS-7 (ATCC CRL 1651) (see Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), W138, BHK, HepG2, 3T3 (ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, клетки L, клетки C127, клетки BHK (ATCC CRL 10), клеткиVI/EBNA, полученные из клеточной линии CVI (ATCC CCL 70) (McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821),клетки почки эмбрионов человека 293, 293 EBNA или MSR 293, клетки эпидермиса человека А 431, клетки Colo205, другие трансформированные клетки приматов, обычные диплоидные клетки, клетки in vitro культуры первичных тканей, первичные экспланты, HL-60, U937, клетки HaK или Jurkat. Экспрессия в клетках млекопитающих позволяет получать секретируемые или растворимые, которые можно собирать из среды, в которой выращивали клетки. Используя подходящую комбинацию вектора и системы-реципиента, полипептиды vActRIIB получали рекомбинантным способом: путем культивирования в подходящих условиях клеток, трансформированных вектором экспрессии, содержащим последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Трансформированные клетки можно использовать для продуцирования полипептидов в течение длительного времени и с большим выходом. После того как клетки трансформируют векторами, содержащими маркеры селекции и нужную кассету экспрессии, клетки можно выращивать 1-2 дня в обогащенной среде, после чего их можно перенести на обычную среду. Маркер селекции обеспечивает рост и выделение клеток, которые экспрессируют встроенные последовательности. Устойчивые группы стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с использованием методов культивирования тканей, подходящих для используемой клеточной линии. Обзор экспрессии рекомбинантных белков можно найти в Methods of Enzymology,v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990). В некоторых случаях, таких как экспрессия в прокариотических системах, для обеспечения биологической активности может быть необходим "рефолдинг". Окисление экспрессируемых полипептидов согласно настоящему изобретению до образования правильной третичной структуры и дисульфидных связей. Рефолдинг можно осуществить с использованием различных известных методов. Такие методы включают, например, помещение солюбилизированного полипептида в условия с pH 7 в присутствии хаотропного агента. Выбор такого агента аналогичен выбору агента для нерастворимых гранул, но хаотропный агент обычно используют в более низкой концентрации. Примеры таких веществ включают гуанидин и мочевину. В большинстве случаев растворы для рефолдинга/окисления включают восстанавливающий агент и его окисленную форму в определенном соотношении, что обеспечивает редокспотенциал, допускающий дисульфидные переходы, которые необходимы для образования цистеиновых мостиков. Наиболее часто используемые редокс-пары включают в себя цистеин-цистамин, глутатиондитиобио-GSH, хлорид меди, ДТТ-дитиан-ДТТ, 2-меркаптоэтанол-дитио-2-меркаптоэтанол. Во многих случаях можно использовать корастворитель для увеличения активности свертывания. Часто используемые корастворители включают в себя глицерин, ПЭГ различного молекулярного веса и аргинин. Кроме того, полипептиды могут быть синтезированы в растворе или на твердой поверхности с использованием подходящих методов. Различные автоматические синтезаторы доступны коммерчески и могут быть использованы в соответствии с принятыми протоколами. См. также Stewart and Young, Solid Phase PeptideSynthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tarn et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield,Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides. Gross and Meienhofer, eds, Academic Press,New York, 1-284; Barany et al., Int. J. Pep. Protein Res, 30:705-739 (1987). Полипептиды и белки данного изобретения могут быть очищены в соответствии с принятыми методами очистки белков, известными в данной области. Примеры таких методик включают, например,фракционирование неочищенного материала на белковые и небелковые факторы. После отделения полипептидов от других белков целевые пептиды или полипептиды можно далее очищать с использованием хроматографических и электрофоретических методов до достижения частичной или полной очистки. Термин "изолированные (выделенные) полипептиды" или "очищенные полипептиды" относится к компоненту, отделенному от других компонентов, в тех случаях, когда полипептид очищен до степени по сравнению с его природным состоянием. Соответственно, "очищенный полипептид" также относится к полипептиду, свободному от природного окружения. Обычно термин "очищенный" относится к полипептидному компоненту, который был фракционирован, с удалением других компонентов, который сохраняет свою биологическую активность. В настоящем описании термин "по существу, очищенный" относится к пептиду или полипептиду, составляющему основной компонент композиции, например примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85% или примерно 90% и более белков данной композиции. Специалистам в данной области известны многочисленные методики, подходящие для использования в очистке. Например, осаждение с помощью сульфата аммония, ПЭГ, антител (иммунопреципитация) и.т.п. или тепловая денатурация с последующим центрифугированием, хроматография (такая как аффинная хроматография (колонки с белком А), ионообменная хроматография, гель-фильтрация, обращенно-фазовая, хроматография на гидроксил-апатите, хроматография гидрофобных взаимодействий),изоэлектрическое фокусирование, электрофорез и комбинация этих методов. Как известно, порядок проведения различных этапов очистки может быть изменен, определенные этапы могут быть опущены с тем же результатом значительно очищенного белка. Примеры этапов очистки приведены ниже в разделе"Примеры". Специалистам в данной области известны различные методы оценки степени очистки полипептида,которые можно использовать в контексте настоящего изобретения. Они включают, например, определение активности специфичного связывания активной фракции или определение количества пептида или полипептида во фракции методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия(SDS-PAGE). Предпочтительным методом оценки чистоты фракции полипептида является расчет активности связывания фракции и сравнение этой активности с активностью исходного экстракта, что позволяет рассчитать степень очистки, которую в данной заявке определяют как "-кратную очистку". Единицы, используемые для выражения количества активности связывания (связывающей активности) на практике, будут, конечно, зависеть от конкретного метода, выбранного для оценки степени очистки и от того, показывают ли полипептид(ы) определяемую активность связывания или нет. Модифицированные полипептиды активина типа IIB связываются с лигандами, которые активируют каскады деградации мышц. Полипептиды vActRIIB, способные к связыванию и ингибированию лигандов активина А, миостатина и/или GDF-11, обладают терапевтическим потенциалом для лечения заболеваний, включающих атрофию мышц, а также определенные виды рака и т.д., как показано ниже в разделе "Примеры". Однако агрегация может происходить в процессе экспрессии или очистки полипептидов ActRIIB или ActRIIB5 дикого типа. Эта агрегация включает образование структур из олигомеров в процессе экспрессии и неструктурированных агрегатов в процессе экспрессии и очистки полипептидов. Вместе методы структурного анализа, молекулярного моделирования и масс-спектрометрии показали, что мультимеризация полипептидов ActRIIB может происходить по механизму образования дисульфидных связей между молекулами, чему способствуют электростатические и водородные взаимодействия между негликозилированными полипептидами ActRUB. Сильные водородные связи существуют, например, между двумя молекулами ActRIIB, между боковой цепью Е 28 одного ActRIIB и боковой цепью R40 другого полипептида ActRIIB. Кроме того, значительные электростатические связи существуют между Е 28 одного ActRIIB и R40 другого ActRIIB. Эти электростатические взаимодействия могут вносить значительный вклад в увеличение популяции нестабильных димеров ActRIIB, что приводит к стимулированию образования нековалентных или ковалентных связей между молекулами ActRIIB. Взаимодействие между аминокислотами 28 и 40 - наиболее важное из этих взаимодействий, т.к. эти 2 остатка участвуют в образовании двойных водородных связей и сильных электростатических связей. Аминокислоты 28 и 40 участвуют во взаимодействиях ActRIIB:ActRIIB, но не участвуют во взаимодействии ActRIIB и его лигандов. Таким образом, 28 и 40 могут быть заменены на ненативные аминокислоты в соответствии с настоящим изобретением, и это обеспечит улучшение растворимости и уменьшение агрегации полипептидов рецепторов. Таким образом, Е 28 иR40 заменяют, соответственно, другими возможными природными аминокислотами, осуществляют экспрессию и тестирование методом Biocore, как показано ниже. Связывание, определенное в тесте Biocore,показано в табл. 1A и 1B и в примере 2 (см. ниже). Кроме того, ниже показан процент агрегации поли-8 020510 пептидов vActRIIB. Результаты в разделе "Примеры" демонстрируют агрегацию полипептидов vActRIIB и белков с заменами аминокислот, описанными в настоящей заявке, и при этом сохраняют способность к связыванию и нейтрализации миостатина, активина А и GDF-11. Антитела. Настоящее изобретение далее включает антитела, которые связывают модифицированные полипептиды ActRIIB, включая те, которые специфично связываются с полипептидами vActRIIB согласно настоящему изобретению. В настоящей заявке термин "специфично связывает" относится к антителам с аффинностью связывания (Ka) для полипептидов vActRIIB от 106 М-1 и более. В настоящей заявке термин "антитело" относится к целым антителам, включая поликлональные антитела (См., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988 и моноклональные антитела (см., например, патенты СШАRE 32011, 4902614, 4543439 и 4411993, а также Monoclonal(1980. В настоящей заявке термин "антитело" также относится к фрагменту антитела, такому как F(ab),F(ab'), F(ab')2, Fv, Fc и одноцепочечным антителам, получаемым с помощью технологии рекомбинатной ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления исходных антител. Термин "антитело" также относится к биспецифическим или бифункциональным антителам, которые являются искусственными гибридными антителами, содержащими две разные пары тяжелых/легких цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела могут быть получены разнообразными методами,включая слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов (см. Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol.148: 1547-1553 (1992. В настоящей заявке термин "антитело" также относится к гибридным антителам, в частности к антителам, содержащим константную область иммуноглобулина человека, связанную с одной или более модифицированных областей иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, или фрагментам таких антител (см., например,патент США 5595898 и патент США 5693493). К антителам также относятся "гуманизированные" антитела (см. патент США 4816567 и WO 94/10332), минитела (WO 94/09817), макситела и антитела,продуцируемые трансгенными животными, имеющими определенную долю генов для продуцирования антител человека, но не продуцирующих эндогенных антител, что позволяет получать антитела человека(см. Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) и патент США 6300129). Термин "антитела" также включает мультимерные антитела, комплекс белков высшего порядка, таких как гетеродимерные и антиидиотипичные антитела. "Антитела" также включают антидиотипические антитела. Антитела к vActRIIB можно применять, например, для идентификации и количественного анализа vActRIIB in vitro и in vivo. Также включены поликлональные антитела всех млекопитающих, например антитела мышей и крыс и антитела кроликов, которые специфично связывают описанные в настоящей заявке полипептидыvActRIIB, включая SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52,54, 56, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95 и 97. Такие антитела находят применение как средства исследования и в количественных анализах для определения и анализа обнаруживаемых здесь полипептидов. Такие антитела получают, используя описанные выше методы и существующие техники. Фармацевтические композиции. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие белки и полипептиды vActRIIB согласно настоящему изобретению. Такие композиции содержат терапевтически или профилактически эффективное количество полипептидов или белков в смеси с физиологически приемлемыми материалами. Фармацевтическая композиция может содержать материалы для изменения, поддержания и сохранения,например, pH, осмоляльности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, степени растворения или высвобождения, адсорбции или проникающей способности. Подходящие материалы включают (но не ограничены) аминокислоты (такие как глицин, глютамин, аспарагин,аргинин или лизин); антимикробные средства; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит или гидросульфат натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, Tris-HCl, цитраты, фосфаты, другие органические кислоты); наполнители (такие как маннитол или глицин), хелатные агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА; комплексообразователи (такие как кофеин, поливинилпирролидон, -циклодекстрин или гидроксипропилциклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие карбогидраты (такие как глюкоза, манноза, или декстрины); протеины (такие как серумальбумин, желатин или иммуноглобулины); красители; ароматизаторы и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота,салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннитол или сорбитол); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или увлажнители (такие как ПАВ для эмульсий, ПЭГ, эфир сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тринитротолуол, трометамин, лецитин, холестерол,тилоксапал); стабилизаторы (сахароза или сорбитол); увеличивающие тонус агенты (такие как галогени-9 020510 ды щелочных металлов (предпочтительно хлориды натрия и калия), маннитол, сорбитол); носители; растворители инертные носители и/или фармацевтические адъюванты (Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). Оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, способа доставки и желаемой дозировки. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, уровень высвобождения in vivo и клиренс (выведение) полипептидов invivo. Например, подходящими композициями могут быть вода для инъекций, физиологический раствор для парентерального введения. Основной носитель или среда (основа) фармацевтической композиции может быть как водной, так и не водной природы. Например, подходящим носителем или средой может быть вода для инъекций,физиологический раствор или искусственная спинно-мозговая жидкость, возможно дополненная другими материалами, обычно применяемыми в композициях для парентерального введения. Нейтральная буферная соль или соль в смеси с альбумином сыворотки являются наиболее распространенными носителями. Другие типичные фармацевтические композиции включают буфер Tris с pH 7,0-8,5, или ацетатный буфер с pH 4,0-5,5, которые могут дополнительно содержать сорбитол или подходящий заменитель сорбитола. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции могут быть получены смешиванием выбранной композиции, имеющей желаемый уровень чистоты, с дополнительными агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, выше) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, терапевтическая композиция может быть в виде лиофилизата, содержащего подходящий наполнитель, такой как сахароза. Доставку композиции можно осуществлять различными методами, например ингаляционной терапией, перорально или путем инъекций. В случаях, когда предусмотрено парентеральное введение, терапевтические композиции согласно настоящему изобретению могут иметь форму апирогенного водного раствора для парентерального введения, содержащего полипептиды в фармацевтически приемлемой среде. Особенно подходящим носителем для парентеральных инъекций является стерильная дистиллированная вода, в которой полипептиды готовят в виде стерильного стабильного изотонического раствора. Еще один вариант изготовления может включать смешивание целевой молекулы с агентом, таким как микросферы, биоразрушающиеся частицы, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы, или липосомы, которые обеспечивают контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который может быть затем доставлен путем инъецирования формы с замедленным высвобождением. Также можно использовать гиалуроновую кислоту, что обеспечивает эффект непрерывной циркуляции. Другие подходящие средства для введения желаемой молекулы включают имплантируемые средства для доставки лекарственного средства. В другом аспекте фармацевтические препараты, подходящие для введения путем инъекции могут включать водные растворы, предпочтительно физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как Na-КМЦ (Naкарбоксиметилцеллюлоза), сорбитол или декстран. Дополнительно суспензии активных соединений могут быть приготовлены в форме соответствующих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры синтетических жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Для доставки можно также использовать нелипидные поликатионные аминополимеры. Дополнительно суспензии могут содержать подходящие стабилизаторы или агенты для увеличения растворимости соединений,позволяющие получать растворы с высокой концентрацией. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть использована для ингаляции. Также могут быть изготовлены ингаляционные растворы с пропеллентом для доставки в форме аэрозоля. Еще в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена доставка растворов орошением. Введение через легкие дополнительно описано в заявке РСТUS 94/001875, которая описывает доставку химически модифицированных белков через легкие. Также предусмотрена возможность перорального введения композиций. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы, введенные таким образом, могут быть дополнены веществами, обычно используемыми при приготовлении твердых дозированных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, капсула может быть предназначена для высвобождения активной порции композиции в том участке желудочно-кишечного тракта, в котором биодоступность максимальна, а пресистемная деградация минимальна. Могут быть включены дополнительные агенты для облегчения всасывания терапевтического соединения. Также могут быть включены растворители, ароматизаторы, воски с низкой точкой плавления, растительные масла, лубриканты, суспендирующие агенты, дезинтеграторы и связующие агенты. Фармацевтические композиции для орального введения также могут быть дополнены фармацевтически приемлемыми носителями, известными в данной области техники. Такие носители обеспечивают возможность приготовления фармацевтических композиций в виде таблеток, гранул, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей,суспензий и подобных форм для приема внутрь пациентом. Фармацевтические препараты для орального использования могут быть получены путем объединения активных веществ с твердым носителем и обработки полученной в результате смеси гранул (обычно после измельчения) с получением ядер таблеток или драже. Подходящие вспомогательные вещества могут быть добавлены по желанию. Подходящие носители включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннитол и сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или Na-КМЦ; смолу, включая гуммиарабик и трагакант; и белки, такие как желатин и коллаген. Если необходимо, могут быть добавлены дезинтеграторы или солюбилизаторы, такие как поперечносшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота и ее соль, например альгинат натрия. Ядра драже могут быть использованы в сочетании с соответствующими оболочками, такими как насыщенные растворы сахара, которые могут также содержать гуммиарабик, тальк, ПВП, гель карбопол,полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, летучий раствор и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены в оболочки таблеток или драже для идентификации продукта или для характеристики количественного содержания активного соединения, например дозировки. Фармацевтические препараты для перорального введения также включают жесткие желатиновые капсулы наряду с мягкими, герметичными капсулами, выполненными из желатина и покрытия, такого как глицерол или сорбитол. Жесткие капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителями или связующими агентами, такими как лактоза или крахмал, лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и дополнительно стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкости или жидкий ПЭГ со стабилизаторами или без них. Другие фармацевтические композиции будут очевидны для специалиста в данной области. Такие композиции включают композиции, содержащие полипептиды в формах замедленного или контролируемого высвобождения. Методики изготовления множества других средств длительного или контролируемого высвобождения, такие как липосомы-носители, биоэродируемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекция веществ замедленного всасывания, также известны в данной области. См., например, PCT/US 93/00829, в которой описано контролируемое выделение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтической композиции. Дополнительные примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме профилированных изделий, например пленки, микрокапсулы. Матрицы замедленного высвобождения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды(US 3773919, ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамат (Sidman et al.,Biopolymers, 22:547-556 (1983), поли-(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.,15:167-277 (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105 (1982, этиленвинилацетат (выше Langer et al.) или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988). Композиции замедленного высвобождения также включают липосомы, которые могут быть получены одним из ряда известных методов. См., например, Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); ЕР 36676; ЕР 88046; ЕР 143949. Фармацевтическая композиция, используемая для введения in vivo, обычно должна быть стерильной. Это может быть достигнуто фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны. Когда композиция лиофилизована, стерилизация может быть осуществлена как до, так и после лиофилизации и растворения. Композиция для парентерального введения обычно заключена в контейнер, имеющий стерильное отверстие, например пакет для внутривенного раствора или сосуд, имеющий проницаемую для иглы пробку. После приготовления композиции ее можно хранить в стерильных сосудах в форме раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, дегидрированного или лиофилизированного порошка. Такие формулы могут храниться как в виде готовой к применению формы, так и в виде формы (например, лиофилизированной), требующей растворения перед введением. В одном из вариантов осуществления данное изобретение относится к получению наборов для произведения разового введения дозы. Наборы могут содержать оба контейнера: один - содержащий сухой белок и второй, содержащий водный раствор. Также в рамках настоящего изобретения предусмотрены наборы, содержащие однокамерный и многокамерный предварительно наполненный шприц (например,шприц для жидкости и лиоофилизированные шприцы). Эффективное количество фармацевтической композиции для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целей. Каждый, разбирающийся в данной области,скажет, что примерная дозировка для лечения будет варьироваться в зависимости, отчасти, от доставляемой молекулы, цели, для которой используется полипептид, пути введения, размера (вес тела, поверхность тела, размер органа) и состояния пациента (возраст и общее здоровье). Следовательно,клинический врач может изменить дозу и путь введения, чтобы достичь оптимального терапевтического эффекта. Типичная доза может меняться от 0,1 до 100 мг/кг и более в зависимости от упомянутых выше факторов. Композиции, содержащие полипептиды, вводят предпочтительно внутривенно. Фармацевтические композиции длительного воздействия можно вводить каждые три или четыре дня, каждую неделю, раз в две недели в зависимости от периода полувыведения и уровня чистоты конкретного вещества. две недели в зависимости от периода полувыведения и уровня чистоты конкретного вещества. Частота дозирования будет зависеть от фармакокинетических параметров полипептидов, используемых в препарате. Обычно композицию вводят до достижения дозировки, обеспечивающей желаемый эффект. Следовательно, композицию можно разводить однократно, или за несколько раз (той же или разных концентрации/дозировке) с интервалами, или же в форме продолжительной инфузии. Дальнейший подбор подходящей дозировки осуществляется рутинными методами. Необходимые дозы могут быть определены путем оценки данных о зависимости между дозой и эффектом. Пути введения фармацевтической композиции соответствуют известным методам, например оральный, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрицеребральный (интрапаренхиматозный), интрацеребровентрикулярный, внутримышечный, внутриглазной, внутриартериальный, введение в воротную вену,внутрь пораженных тканей, интрамедуллярный, интратекальный, внутрижелудочковый, трансдермальный, подкожный или внутрибрюшинный; а также интраназальный, энтеральный, местный, сублингвальный, уретральный, вагинальный или ректальный пути, с помощью систем замедленного высвобождения или имплантационных средств. При необходимости, композиции могут быть введены методом болюсной инъекции, продолжительной инфузии или с помощью имплантируемых средств. В качестве альтернативы или дополнительно композиции можно вводить местно путем имплантации мембран, губчатых материалов или других подходящих материалов, на которые может быть адсорбирована или инкапсулирована желаемая молекула. В случае использования имплантируемого средства средство может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, доставка необходимой молекулы может быть осуществлена по механизму диффузии, болюсной инъекции, замедленного действия или непрерывного введения. В некоторых случаях доставку полипептидов vActRIIB согласно настоящему изобретению можно осуществлять путем имплантации определенных клеток, генетически модифицированных согласно описанным в настоящей заявке способам для экспрессии и секреции полипептидов. Такие клетки могут быть получены из организма животного или человека и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. Дополнительно, клетки могут быть иммортализованными. С целью уменьшения вероятности иммунной реакции клетки могут быть инкапсулированы, что исключает инфильтрацию окружающих тканей. Материалы инкапсуляции обычно представляют собой биосовместимые, полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые обеспечивают высвобождение полипептидного(ых) продукт(ов), и в то же время предотвращают разрешение клеток иммунной системой пациента или другими негативными факторами окружающих тканей. vActRIIB генная терапия in vivo предусматривает также кодировку vActRIIB молекулы нуклеиновой кислоты или непосредственных производных vActRIIB,представленных в объекте. Например, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих vActRIIB,вводят в клетки-мишени путем местной инъекции конструкта нуклеиновой кислоты с использованием вектора доставки или без него, такого как аденовирусный вектор. Альтернативные вирусные векторы включают (но не ограничены) ретровирусы, аденовирусы, герпетическую лихорадку, векторы вируса папилломы. Физический перенос вирусного вектора может быть осуществлен in vivo путем местной инъекции необходимого конструкта нуклеиновой кислоты или другим подходящим вектором, содержащим необходимую последовательность нуклеиновой кислоты, перенос посредством липосом, непосредственная инъекция (депротеинизированная ДНК) или бомбардировка микрочастицами (генная пушка). Применение композиций, содержащих vActRIIB. Настоящее изобретение обеспечивает способы и фармацевтические композиции для уменьшения или нейтрализации активности миостатина, активина А или GDF-11 in vivo и in vitro путем осуществления контакта данных полипептидов с полипептидом vActRIIB. Полипептиды vActRIIB обладают высокой аффинностью к миостатину, активину А и GDF-11 и способны снижать или подавлять биологическую активность по крайней мере одного из миостатина, активина А и GDF-11. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды vActRIBB проявляют более высокую активность,чем дикий тип полипептидов vActRIIB. Это показано ниже в разделе "Примеры". В одном из аспектов настоящего изобретения предложены способы и реагенты для лечения нарушений, связанных с миостатином и/или активином А у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающие введение субъекту эффективной дозы композиции, содержащей vActRIBB. В настоящей заявке термин "субъект" относится к любому млекопитающему, включая человека. Композиции согласно настоящему изобретению используют для увеличения доли (%) сухой мышечной массы по отношению к весу тела и снижению процентной доли жировой массы в массе тела. Нарушения, которые можно лечить с использованием композиций, содержащих vActRIBB, включают, но не ограничены, различные формы атрофии мышц, такие как метаболические нарушения: диабет и связанные с ним нарушения, дегенеративные заболевания костей, такие как остеопороз. Была подтверждена эффективность композиций, содержащих vActRIBB, в лечении нарушений, связанных с атрофией мышц, в различных моделях болезней, представленных ниже в примере 3. Это было продемонстрировано в экспериментах по лечению мышей с нокаутом по ингибину-А, лечению атрофии мышц в моделях раковой кахексии colon-26, предотвращении атрофии мышц в модели хирургического вмешательства на задней конечности, лечении эффектов овариэктомии у самок, в которых было показано увеличение сухой мышечной массы, уменьшение жировой массы и увеличение содержания минералов. Нарушения, свя- 12020510 занные с дистрофией мышц, включают такие виды дистрофии, как мышечная дистрофя Дюшенна, прогрессирующая мышечная дистрофия, мышечная дистрофия Беккера, мышечная дистрофя ДежеринЛандуза, мышечная дистрофия Эрба и детская нейроаксональная мышечная дистрофия. Причиной других заболеваний мышц являются хронические заболевания или такие нарушения, как боковой амиотрофический склероз, хроническое обструкционное заболевание легких, рак, СПИД, почечная недостаточность, атрофия органов, андрогенная недостаточность и ревматоидный артрит. Сверхэкспрессия миостатина и/или активина может вносить вклад в развитие кахексии, тяжелых мышечных синдромов и синдрома атрофии жировой ткани. Эффективность полипептидов vActRIBB в лечении кахексии в моделях на животных показана в примере 3. Кахексия также развивается вследствие ревматоидного артрита, диабетической нефропатии, почечной недостаточности, химиотерапии, ожоговых повреждений, а также других причин. В другом примере сывороточные и внутримышечные концентрации миостатин-иммунореактивного протеина были увеличены у людей, страдающих мышечными слабостями, связанными со СПИДом, и были обратно пропорциональны жировой массе (GonzalezCadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998. Также было показано, что уровень миостатина также повышается в ответ на ожоги, что приводит к катаболическому эффекту в мышцах (Lang et al., FASEB J. 15, 1807-1809 (2001. Дополнительные состояния, приводящие к атрофии мышц, могут появляться вследствие отсутствия активности из-за инвалидности, например нахождения в инвалидном кресле, длительный постельный режим вследствие паралича, болезни, повреждения спинного мозга, перелома кости или травмы и мышечной атрофии в условиях микрогравитации (космический полет). Например, было обнаружено увеличение уровня миостатин-иммунореактивного белка в плазме после продолжительного постельного режима (Zachwieja et al., J. Gravit Physiol. 6(2): 11 (1999). Также было обнаружено, что в мышцах крыс, помещенных в условия микрогравитации в ходе полета космического шаттла, количество миостатина было повышено по сравнению с крысами, не подвергавшимися действию микрогравитации(Lalani et al., J. Endocrin 167 (3):417-28 (2000. К тому же, возрастное увеличение в соотношении жир/мышцы и возрастная мышечная атрофия, повидимому, связаны с миостатином. Например, среднее содержание миостатин-иммунореактивного белка увеличивается с возрастом в группах молодых (19-35 лет), среднего возраста (36-75 лет) и старых (76-92 лет) мужчин и женщин, в то время как средняя мышечная масса и масса без жира в тех же группах с возрастом снижается (Yarasheski et al., J. Nutr Aging 6(5):343-8 (2002. Кроме того, обнаружено, что миостатин экспрессируется в сердечной мышце в небольших количествах, и после инфаркта происходит повышение экспрессии в кардиомоцитах (Sharma et al., J. Cell. Physiol. 180 (I):l-9 (1999. Следовательно, понижение уровня миостатина в сердечной мышце может улучшить восстановление сердца после инфаркта. Миостатин также, по-видимому, влияет на нарушения обмена веществ, включая диабет второго типа,инсулиннезависимый сахарный диабет, гипергликемию и ожирение. Например, было показано, что недостаток миостатина приводит к улучшению состояния при ожирении и диабетического фенотипа в двух моделях на мышах (Yen et al., FASEB J. 8:479 (1994. Это было показано в заявке на патент США 11/590962, на патент США 2007/0117130, векторы AAV-ActRIIB5 обеспечивают увеличение соотношение мышц к жиру в моделях на животных. vActRIIB полипептиды согласно настоящему изобретению,такие как SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 52, 54, 56,60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 87, 88, 91, 93, 95, подходят для такого применения. Соответственно, снижение отложений жира путем введения композиций согласно настоящему изобретению улучшит состояние при диабете, ожирении и гипергликемических состояниях у животных. Кроме того, композиции, содержащие полипептиды vActRIBB, могут снизить потребление пищи у индивидуумов, страдающих ожирением, как показано в заявке на патент США 11/590962 и заявке на патент США 2007/0117130 для полипептида ActRIIB5. Введение полипептидов ActRIIB настоящего изобретения может улучшить прочность костей и снизить выраженность остеопороза и других дегенеративных заболеваний костей. Это было показано на примере модели овариэктомии у мышей, описанной ниже. Также было обнаружено, что, например, у мышей, дефицитных по миостатину, наблюдали повышенное содержание минералов и плотность плечевой кости, повышенное содержание минералов в трабекулярной и кортикальной кости в местах прикрепления мышц, а также повышенную мышечную массу (Hamrick et al., Calcif Tissue Int. 71(I):63-8 (2002. Кроме того, композиции, содержащие vActRIIB настоящего изобретения, можно применять для лечения эффектов андрогенной недостаточности, например при терапии, направленной на снижение уровня андрогенов, используемой для лечения рака простаты. Настоящее изобретение также обеспечивает способы и композиции для увеличения мышечной массы животных путем введения животному эффективной дозы белков vActRIIB. Так как С-концевой полипептид миостатина идентичен у всех протестированных типов, можно ожидать, что полипептиды vActRIIB будут эффективны для увеличения мышечной и снижении жировой массы важных для сельского хозяйства видов, включая крупный рогатый скот, куриц,индеек и свиней. Полипептиды vActRIIB и композиции согласно настоящему изобретению также снижают активность активина А. Активин А экспрессируется при определенных типах рака, обычно опухолях половых желез, таких как рак яичников, и вызывает тяжелую кахексию (Ciprano et al., Endocrinol 141 (7):2319-27(1999. В примере 3 показана эффективность полипептидов vActRIIB согласно настоящему изобретению в лечении тяжелой кахексии, уменьшение размера опухоли и продолжительное действие в экспериментах с мышами с нокаутом по ингибину- и в моделях с раковой кахексией при опухоли colon-26. Соответственно, композиции настоящего изобретения можно применять для лечения состояний, связанных со сверхэкспрессией (повышенной экспрессией) активина А, а также в состояниях со сверхэкспрессией миостатина, такие как раковая кахексия и лечение опухолей определенных типов рака половых желез. Композиции согласно настоящему изобретению можно применять как отдельно, так и в комбинации с другими терапевтическими агентами, что обеспечивает усиление терапевтического действия и снижение возможных побочных эффектов. Эти свойства включают повышенную активность, повышенную растворимость, сниженную разрушаемость, увеличенный период полувыведения, пониженную токсичность и пониженную иммуногенность. Таким образом, композиции согласно настоящему изобретению можно применять в схемах продолжительного лечения. Кроме того, гидрофильные и гидрофобные свойства соединений согласно настоящему изобретению хорошо сбалансированы, так что они полезны при использовании как in vivo, так и in vitro. В частности, соединения согласно настоящему изобретению имеют подходящий уровень растворимости в водных средах, обеспечивают их всасывание и биодоступность в организме и в то же время обладают достаточной степенью растворимости в жирах, чтобы проникать через клеточные мембраны в предполагаемое место действия, такое как масса мышц. Кроме того, полипептиды vActRIIB согласно настоящему изобретению можно применять для обнаружения (детектирования) и количественного анализа миостатина, активина А или GDF-11 в любых тестах. В целом, полипептиды ActRIIB настоящего изобретения можно применять в качестве агентов захвата для связывания и иммобилизации миостатина, активина А или GDF-11 в различных анализах, похожих на описанные, например в Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, AcademicPress, Inc., New York (1993). Полипептиды можно снабжать определенными метками или можно осуществлять реакцию с третьей молекулой, такой как антитело, что обеспечивает обнаружение миостатина и определение его количества. Например, полипептид или третья молекула могут быть модифицированы путем присоединения детектируемой группировки, такой как биотин, который может быть связан с четвертой молекулой, такой как помеченный ферментом стрептавидин, или другие белки (Akerstrom, J. Immunol. 135:2589 (1985); Chaubert, Mod. Pathol. 10:585 (1997. После описания настоящего изобретения приведены иллюстрирующие, но не ограничивающие,примеры. Пример 1. Экспрессия и очистка полипептидов vActRIIB. Для экспрессии и очистки модифицированных полипептидов vActRIIB использовали следующие методы. кДНК рецептора активина человека типа IIB выделяли из библиотеки кДНК, полученной из яичка человека (Clontech, Inc.) и клонировали, как описано в заявке США 11/590962, опубликованной под номером 2007/0117130. Определение замен аминокислот. Следующие подходы: структурный анализ, молекулярное моделирование и масс-спектрометрия, показали, что агрегация (олигомеризация) ActRIIB может происходить в результате образования межмолекулярных дисульфидных связей, обусловленного электростатическими и водородными взаимодействиями между негликозилированными молекулами ActRIIB. Было показано, что аминокислоты 28 и 40 участвуют во взаимодействиях ActRIIB:ActRIIB, но не участвуют во взаимодействиях ActRIIB с его лигандами. Первоначально аминокислоты ActRIIB-Fc - Е 28 и R40 заменяли на А в каждом положении. Анализ методами светорассеяния и масс-спектрометрии подтвердили, что фракция полностью гликозилированного vActRIIB-IgG1Fc, E28A и vActRIIB-IgG1Fc R40A была значительно увеличена по сравнению с белком дикого типа. Е 28 А и R40A vActRIIB-IgG1Fc инкубировали при 37C в течение 6 дней и при этом наблюдали отсутствие агрегации или агрегацию, незначительную по сравнению с диким типом. Были сделаны замены аминокислот в положениях 28 и 40 (по отношению к последовательностям номер 2 и 18 с сигнальной последовательностью), что проводило к уменьшению или предотвращению агрегации, которая может возникать в ходе экспрессии или очистки ActRIIB (номер последовательности 2 и 18). Агрегацию определяют как образование структурированных олигомеров в ходе экспрессии и образование неструктурированных олигомеров в ходе экспрессии генов и очистки белков. Агрегацию на разных стадиях процесса получения и очистки определяли с помощью эксклюзионной хроматографии в соответствии с процедурой, описанной ниже. Например, следующий метод использовали для получения модифицированных полипептидов ActRIIB (vActRIIB и vActRIIB5). Полинуклеотиды, кодирующие vActRIIB, E28W (SEQ ID NO: 23), были соединены с полинуклеотидами, кодирующими домен Fc IgG1 человека (SEQ ID NO: 82), через последовательность шарнирного линкера (SEQ IDNO: 79) путем ПЦР перекрывающихся последовательностей с использованием праймеров, содержащих мутацию, дающую E28W. Полная последовательность полинуклеотида представлена в SEQ ID NO: 61. Двуцепочечные ДНК клонировали в рТТ 5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montreal (Quebec) Canada H4P 2R2), pDSR (описанная вWO/9014363) и/или производные pDSR. В других вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие полипептиды vActRIIB, соединяли с полинуклеотидами, кодирующими линкер GGGGS (SEQ IDNO: 75), мультимерами таких линкеров или шарнирными линкерами (например, SEQ ID NO: 79). Временную экспрессию модифицированных vActRIIB-Fc и vActRIIB5-Fc осуществляли следующим образом. Транзиентную (временную) экспрессию модифицированных вариантов двух указанных молекул осуществляли в бессывороточной суспензии клеток 293-6 Е (National Research Council of Canada, Ottawa,Канада), поддерживаемых в среде FreeStyle (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Канада) с добавлением 250 мкг/мл генетицина Invitrogen) и 0,1% реагента Pluronic F68 (Invitrogen). Трансфекцию осуществляли в культуре объемом 1 л. Вкратце, клеточный посев выращивали до плотности 1,1106 клеток на 1 мл в 4-литровой колбе Фернбаха (Corning, Inc.). Культуру в колбе для встряхивания на качающейся платформе Innova 2150 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) при 65 об/мин, которая была помещена в инкубатор с влажной средой при 37C и 5% CO2. В момент трансфекции клетки разбавляли до 1,0106 клеток/мл. Трансфекционные комплексы формировали в 100 мл среды FreeStyle. В среду добавляли 1 мг плазмидной ДНК, а затем 3 мл трансфекционного реактива FuGene HD (Roche Applied Science, Indianapolis,IN). Трансфекционный комплекс инкубировали при комнатной температуре примерно 15 мин, а потом добавляли к клеткам в колбе. Через 24 ч после трансфекции добавляли 20% (мас./об.) пептона TNI (OrganoTechnie S.A., TeknieScience, QC, Канада) в конечной концентрации 0,5% (мас./об.). Трансфекцию/экспрессию осуществляли в течение 4-7 дней, после чего собирали кондиционированную среду путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 60 мин при 4C. Стабильную трансфекцию и экспрессию осуществляли по следующей методике. Создавали линию клеток vActRIIB-(hu) IgG2-Fc путем трансфекции клеток СНО плазмидами экспрессии pDC323-vActRIIB(E28W)-huIgG2 Fc и pDC324-vActRIIB (E28W)-huIgG2 Fc (как описано в Bianchi et al., Biotech and Bioengineering, 84(4):439-444 (2003 с использованием стандартной процедуры электропорации. После трансфекции плазмидой экспрессии принимающей линии клеток клетки выращивали в бессывороточной среде без GHT в течение 2-3 недель, что обеспечивало отбор по плазмиде и выделению клеток. Клетки подвергали отбору до достижения жизнеспособности как минимум 85%. Этот пул трансфицированных клеток далее выращивали в среде, содержащей 150 нмоль метотрексата. Клонирование линии клеток. Создавали банк клеток из отобранных клонов в соответствии со следующей процедурой. Размноженный пул стабильно трансфицированных клеток высевали в планшеты с 96 лунками и оценивали способность клонов-кандидатов к росту и продуктивность в исследованиях небольшого масштаба. Из выбранного клона готовили предварительные банки клеток (РМСВ) приблизительно по 60 пробирок. Все РМСВ были протестированы на стерильность, микоплазму и вирусы. Линию клеток, экспрессирующую vActRIIB-Fc, размножали с использованием стандартной методики периодической культуры. Клетками инокулировали биореактор Wave (Wave Biotech LLC). Культуру подпитывали 3 раза болюсными партиями. На 10 день собирали 10 л, а остатки собирали в день 11; обе партии собранного материала подвергали глубокой фильтрации с последующей стерильной фильтрацией. Кондиционированную среду фильтровали сначала через 10-дюймовый фильтр с размером пор 0,45/0,2 мкм, а потом через 6-дюймовый фильтр с размером пор 0,2 мкм. Очистка белка. Примерно 5 л кондиционированной среды, содержащей ActRIIB-Fc (IgG1 и IgG2), ActRIEB5-Fc(IgG1 и IgG2) и их варианты, концентрировали при помощи поточного мембранного фильтра на 10K площадью 5 кв.футов (Pall). Концентрированный материал загружали на 5 мл колонку с белком A ProteinA High Performance Column (GE Healthcare), которую уравновешивали буфером ФБР (Дульбекко, но без хлорида магния или хлорида кальция). После того как колонку промывали уравновешивающим буфером до значения поглощения на длине волны 280 нм (OD280) меньше 0,1 нм, связанный белок элюировали с помощью буфера глицин-HCl 0,1 М (pH 2,7) и немедленно нейтрализовали буфером Tris-HCl 1 М (pH 8,5). Нейтрализованный собранный продукт концентрировали до 1 мл и загружали на 320 мл колонкуSephacryl 200 (GE Healthcare), которую уравновешивали ФБР (по формуле Дульбекко, но без хлорида магния или хлорида кальция). Проводили электрофорез в 4-20% ДСН-ПААГ гелях (Invitrogen) для определения того, какие фракции следует объединять. Эти полипептиды тестировали на активность и степень агрегации, как показано ниже. Полипептиды можно подвергать дальнейшей очистке с использованием, например, колонки с ShpСефарозой. Концентрацию определяли по OD280. Пример 2. Тесты на активность in vitro. Образцы полипептидов vActRIIB, очищенные, как описано выше, разбавляли фосфатным буферным раствором (2,67 мМ хлорида калия, 1,47 мМ хлорида натрия, 1,47 мМ монофосфата калия, 8,1 мМ дифосфата натрия, pH 7,4) до концентрации 0,2 мг/мл, а затем тестировали методами MALDI-MS (мат- 15020510 риксоопосредованная лазерная десорбция/ионизация), эксклюзионной хроматографии (SEC) и/или эксклюзионной хроматографии-светорассеяния (SEC-LS). Агрегацию полипептидов дикого и модифицированного типов после очистки с помощью белка А определяли методами SEC или SEC-LS, а молекулярный вес молекул подтверждали, используя процедуру MALDI-MS, описанную ниже. Эксклюзионная хроматография (SEC): эксперименты проводили на системе Agilent 1100 HPLC с двумя колонками (TOSOHAAS G3000swxl, 7,8300 мм) в тандеме. В качестве подвижной фазы использовали 2 ФБР при скорости 0,5 мл/мин. Эксклюзионная хроматография-светорассеяние (SEC-LS): эксперименты проводили на системе Agilent 1100 HPLC с гель-фильтрационной колонкой Superdex-200 (Amersham Pharmacia, Waukesha, WI,США). Затем образцы прогоняли через лазерный детектор светорассеяния Wyatt miniDawn LS и рефрактометер Wyatt Optilab DSP Wyatt Technology Co., Santa Barbara, CA), чтобы определить молекулярный вес. В качестве подвижной фазы использовали ФБР при скорости 0,4 мл/мин. Масс-спектроскопия - матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI-MS): образцы смешивали с синапиновой кислотой и подвергали MALDI-MS (Applied Biosystems Voyager System 2009). Эту процедуру использовали для проверки молекулярного веса молекул. Определение аффинности связывания и значения IC50 для активина и миостатина осуществляли, как описано ниже. Тест BIAcore: в гибридных конструктах IgG1 Fc аминокислоты Е 28 и R40 заменяли соответственно на другие аминокислоты, как описано выше. Конструкты получали с линкерами или без линкеров, как показано ниже в таблицах. Каждый образец vActRIIB-IgG1Fc из кондиционированной среды иммобилизовали на поверхности СМ 5, покрытой антителами козы к IgG1Fc человека (Jackson Immuno Research,номер каталога 109-005-098, номер партии 63550). 20 нМ активина А наносили на поверхности со связанными образцами, с использованием BIACore2000 (BIACore Life Sciences, Piscataway, New Jersey). Полученные сенсограммы нормировали по RL (500 RU) иммобилизованных модифицированных vActRIIBIgG1Fc. Нормированные ответы связывания для некоторых вариантов показаны в табл. 2 и описаны подробно ниже. Также определяли относительную аффинность связывания путем измерения методомBiacore с использованием кондиционированной среды, полученной в процессе экспрессии в клетках млекопитающих. Для иммобилизации полипептида в кондиционированной среде растворимого рецептора использовали активин А (20 нМ), измеренные сигналы SPR нормировали. Нормированные SPR: : 60, : 40-60, : 20-40, : 10-20, +: 5-10, - 5. Табл. 1 А и 1 В представляют результаты измерения связывания. В таблице ниже представлены определенные варианты реализации vActRUJB-IgG1Fc, в частности те варианты, что связываются с активином А с большей аффинностью, чем дикий тип, или те, которые сохранили аффинность, сравнимую с диким типом. Таблица 1 А Связывание дикого типа и модифицированного ActRIIB-IgG1Fc Таблица 1 В Связывание дикого типа и модифицированного ActRIIB-IgG1Fc Тест измерения клеточной активности на основе клеток С 2 С 12: модифицированные vActRIIB5IgG1Fc и vActRIIB-IgG1Fc получали, как описано выше. Способность этих вариантов ингибировать связывание активина А и миостатина с рецептором активина IIB исследовали в тесте измерения активности на основе клеток, как описано ниже. Репортерную линию клеток, чувствительных к миостатину/активину/GDF-11, получали путем трансфекции миобластов С 2 С 12 (АТСС No: CRL-1772) плазмидойpMARE-luc. pMARE-luc была получена путем клонирования 12 повторов последовательности CAGA,представляющей чувствительные элементы миостатина/активина (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100(1998, в репортерный вектор pLuc-MCS (Stratagene cat 219087) ближе к 3'-концу от последовательности ТАТА. Клетки С 2 С 12 в природе экспрессируют рецептор IIB активина на своей поверхности. При связывании миостатина/активина/GDF-11 с рецептором активируется путь Smad, и фосфорилированныйSmad связывается с чувствительным элементом (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996, что приводит к экспрессии гена люциферазы. Активность люциферазы измеряли с использованием коммерческого набора для измерения люциферазы (номер по каталогу Е 4550, Promega, Madison, WI, США) в соответствии с протоколом производителя. Линию клеток С 2 С 12, стабильно трансфицированных pMARE-luc(C2C12/pMARE), использовали в соответствии с изложенными ниже процедурами. Репортерную клеточную линию высевали в 96-луночные планшеты. Скрининг с использованием разбавлений дикого типа и конструктов ActRIIB-IgG1Fc, созданных, как описано выше, осуществляли при концентрациях активина 4 нМ. Активин А был предварительно инкубирован с рецепторами в нескольких различных концентрациях. Активность активина измеряли путем определения активности люциферазы в обработанных культурах. Для каждого полипептида определяли значения IC50. Эти значения показаны в табл. 2. Те же операции осуществляли с конструктами ActRIIB-huIgG2Fc, полученными, как описано выше, для определе- 17020510 ния миостатина. Очищенные на белке А полипептиды дикого типа и модифицированные полипептиды использовали для определения значений IC50 по той же методике. Для этого измерения полипептиды были предварительно инкубированы с 4 нМ миостатина. Дополнительно методами, описанными выше, определяли степень агрегации. Значения приведены в табл. 3 (см. ниже). Некоторые из модифицированныхActRITB5-IgG1Fc, показанных в табл. 1A, ActRIIB-IgG1Fc и 3 варианта ActRIIB5-IgG1Fc подваргали дальнейшей очистке и исследованию методом плазмонного резонанса (SPR) при концентрации активина 20 нМ. В табл. 2 приведены результаты измерения аффинности связывания с активином выбранных полипептидовvActRUB-IgG1Fc методом SPR. Активин А (20 нМ) использовали для иммобилизации полипептидов в образцах и измеренные сигналы SPR нормировали. Значения IC50 получали в тестах на ингибирование на основе клеток, описанных выше. Стандартная ошибка была меньше 10% для всех результатов. Таблица 2 Как показано в табл. 2 (см. выше), значение IC50 vActRIIB-IgG1Fc (E28W) для блокирования активина составило 2,07 нМ, а значение IC50 vActRIIB-IgG1Fc (E28Y) - 2,1 нМ по сравнению с диким типом. Более того, варианты vActRIIB-IgG1Fc - E28W и E28Y были стабильными и не агрегировали после очистки. Также определяли значение IC50 для блокирования миостатина, полученное в тесте на основе клеток, для дополнительных модифицированных полипептидов. Эти варианты представляли собой зрелые укороченные полипептиды vActRIIB без сигнальной последовательности и первых 6 аминокислот Nконца. Эти последовательности показаны в табл. 3. В табл. 3 показана процентная агрегация белка после очистки с помощью белка А и значение IC50 по отношению к миостатину. Можно увидеть, что процентная агрегация намного меньше для модифицированных полипептидов по сравнению с диким типом. Как показано ниже, близкие результаты были получены для усеченных полипептидов vActRIIB без сигнальной последовательности и 4 аминокислот на N-конце с идентичными заменами. В табл. 4 представлены последовательности, соответствующие номерам последовательностей 1-99 в списке последовательностей. Пример 3. Лечение in vivo с использованием vActRIIB AII. Описанные ниже исследования на животных выполняли с использованием зрелого укороченного полипептида vActRIIB-IgG2Fc (E28W) с номером последовательности 91, следуя процедурам, описанным ниже. Лечение атрофии мышц у мышей, дефицитных по ингибину-. Ингибин- представляет собой природный ингибитор активина А. Мыши, не имеющие ингибина-,демонстрируют значительно повышенный уровень ингибина А в крови и страдают синдромом летальной атрофии, который связан со спонтанным образованием раковых опухолей, таких как рак мужских и женских половых желез и рак надпочечников (Matzuk et al., PNAS 91(19):8817-21 (1994), Cipriano et al., Endocrinology 121(7): 2319-27(2000), Matzuk et al., Nature 360(6402):313-9 (1992. В описанных ниже экспериментах мыши с нокаутом гена ингибина- (C57BL/6J), были получены из Charles River Laboratories. Исследовали влияние vActRIIB-IgG2Fc E28W (SEQ ID NO: 91) (здесь и далее E28W, или полипептидE28W, или растворимый рецептор E28W) на вес тела и мышечную массу у мышей с нокаутом по ингибину- "-" мышах (knock-out, KO). Проводили 14-дневное исследование с одной инъекцией на 8 недельных мышах мужского пола. В возрасте 8 недель такие мыши уже потеряли 25% веса по сравнению с контрольными мышами того же возраста. В первый день эксперимента (день 0) 5 нокаутированным мышам путем однократной подкожной инъекции вводили E28W (30 мг/кг), одновременно 5 мышам с нокаутом также путем инъекции вводили равный объем носителя (ФБР). В качестве контроля фона 5 мышам дикого типа того же возраста путем однократной подкожной инъекции в день 0 вводили такой же объем носителя (ФБР) 0. Мышей взвешивали в дни 0, 7, 14. В конце 14-го дня всех мышей умерщвляли и измеряли вес их тушек (без жира) и мышечную массу. В течение этого 14-дневного исследования средний вес тела мышей, получивших инъекцию носителя, уменьшился примерно на 1,1 г - с 22,5 г в день 0 до 21,4 г в день 14. Напротив, средний вес тела KO мышей, получавших инъекции E28W, значительно увеличился (на 11 г) - с 21 г в день 0 до 33,1 г в день 14. Некропсия по окончании исследования показала,- 21020510 что полипептиды E28W практически удвоили вес тела и мышечной массы у мышей, дефицитных по ингибину-, как показано ниже. Средний вес тела таких мышей, получавших E28W, был равен примерно 14,9 г по сравнению примерно с 8 г мышей, получавших ФБР, и примерно 12,1 г мышей дикого типа,получивших ФБР. Средняя масса мышц обеих ног мышей, получавших E28W, составила примерно 426 мг, тогда как у мышей, получивших ФБР, 209 мг и примерно 324 мг у контрольных мышей дикого типа,получавших ФБР. Эти результаты показывают эффективность полипептида E28W в лечении заболеваний, связанных с потерей массы и атрофией мышц. Эти данные представлены в следующей таблице. Р 0,05 против WT + носитель;Р 0,05 против KO+носитель. Влияние введения E28W на образование раковых опухолей мужских и женских половых желез исследовали, соответственно, в самцах и самках мышей с нокаутом по ингибину-. В этом исследовании 11 таким мышам, включая самцов в возрасте 8 недель (n=5) и самок в возрасте 9 недель (n=6), вводили однократную дозу E28W (30 мг/кг), а другим 11 таким мышам, включая 5 самцов и 6 самок такого же возраста, вводили однократную дозу ФБР (носителя). Дополнительно 11 мышей дикого типа одного помета,включая 5 самцов и 6 самок того же возраста, получили однократную дозу носителя. Через 2 недели мышей умерщвляли и подвергали некропсии для исследования степени образования раковых опухолей, видимых невооруженным глазом. У 10 из 11 мышей KO, получивших ФБР, наблюдали раковые опухоли. В частности, раковые опухоли яичников и яичек были обнаружены, соответственно, у 5 из 5 самцов и у 5 из 6 самок, участвовавших в эксперименте. Размер этих опухолей был в 2-3 раза больше, чем нормальные яичники или яички, соответственно, у контрольных мышей дикого типа. Это показано на фиг. 3. Только у 10% (1 из 11) мышей с нокаутом по ингибину-, получивших E28W, наблюдали видимые опухоли яичников, и 5 из 6 самок KO не имели, по существу, никаких изменений в размере и морфологии яичников по сравнению с контролями дикого типа такого же возраста. 5 из 5 самцов KO, получавшихE28W, не имели, по существу, никаких изменений в размере и морфологии яичек по сравнению с контролями дикого типа такого же возраста. Эти результаты показывают, что введение E28W оказывало эффективное влияние на образование раковых опухолей яичников и яичек у мышей с нокаутом по ингибину-, что указывает на возможность клинического использования растворимых рецепторов в терапии рака. Эффективность полипептида E28W в лечении анорексии исследовали на самцах мышей с нокаутом по ингибину-. В этом исследовании потребление пищи у таких мышей (n=5) было значительно уменьшено по сравнению с мышами того же возраста дикого типа (n=10). Было показано, что потребление пищи у мышей с нокаутом по ингибину-, получавших E28W, было значительно повышено в течение 3 недельного периода эксперимента. Среднее потребление пищи повысилось до уровня, который был немного выше, чем у мышей того же возраста дикого типа, и примерно 50% выше, чем у мышей KO, получавших ФБР. Таким образом, эти данные показывают, что E28W был очень эффективен в лечении анорексии у мышей с нокаутом по ингибину-. Также исследовали влияние E28W на выживание самок и самцов мышей с нокаутом по ингибину-. У самцов, 25 мышей с нокаутом по ингибину- в возрасте примерно 50 дней получали полипептид E28W(10 мг/кг в неделю, подкожно), тогда как 26 мышей с нокаутом по ингибину- того же возраста получили только носитель (ФБР). 19 мышей того же возраста дикого типа получали ФБР. Этих мышей использовали в качестве контроля. Мыши KO, получавшие ФБР, начали умирать на 15-й день эксперимента (в возрасте примерно 65 дней). К 34-му дню эксперимента (возраст примерно 84 дня) умерло 50% мышей,получивших ФБР, а к 78-му дню (возраст примерно 128 дней) умерло 100%. Напротив, ни одна из 25 мышей KO, получавших E28W, или из 19 контрольных мышей дикого типа, получавших ФБР, не умерла до 78-го дня эксперимента (возраст примерно 128 дней). Среди мышей KO, получавших E28W, 1 из 25 умерла на 78-й день эксперимента (возраст примерно 128 дней), а 24 из 25 были живы после 100-го дня(возраст примерно 150 дней). Ни одна из мышей, получавших ФБР, не умерла в течение всех 100 дней эксперимента. Аналогичные результаты были получены у самок KO. 22 самки в возрасте примерно 50 дней получали полипептид E28W (10 мг/кг в неделю, SC), а 23 мыши с нокаутом по ингибину- того же возраста получали только носитель (ФБР). Параллельно 17 самок того же возраста дикого типа получали ФБР. Этих мышей использовали в качестве контроля. Самки, получившие ФБР, начали умирать на 40-й день эксперимента (возраст примерно 90 дней). К 58-му дню эксперимента (возраст примерно 108 дней) умерло 50% мышей KO, получивших ФБР, и к 86-му дню (возраст примерно 136 дней) умерло 100%. Напротив, только 5% (1 из 22) мышей KO, получавших E28W, умерли, а 90% (2 из 22) были живы после 120-го дня эксперимента. Следовательно, данные показывают, что терапия полипептидом E28W была эффективна в лечении самок и самцов мышей с нокаутом по ингибину-. График выживания для самок и самцов мышей KO представлен на фиг. 4. Лечение атрофии мышц у мышей с раком colon-26. Мыши с раком colon-26 представляют собой частоиспользуемую модель для изучения раковой какексии (Fujita et al., hit J. Cancer 68(5):637-43 (1996), Kwak et al., Cancer Research 64(22):8193-8 (2004. Влияние полипептида E28W на вес, мышечную массу и выживание изучали на мышах-носителях рака. Раковые клетки С-26 были имплантированы подкожно 40 10-недельным мышам CDFI (0,5106/мышь). Имплантацию опухоли осуществляли в день 0. С 5-го дня после имплантации 20 мышам С-26 ежедневно путем подкожной инъекции вводили 10 мг/кг vActRIIB IgG2Fc E28W (SEQ ID NO 91), a 20 вводили носитель (ФБР). Параллельно 10 нормальным мышам того же веса и возраста путем инъекции вводили носитель (ФБР). Вес тела и потребление пищи измеряли 3 раза в неделю. Мышей-носителей рака проверяли 2 раза в день на предмет выживания. Размер опухоли измеряли циркулем (Ultra-Cal IV IP65 электронный циркуль, Fred V Fowler Co. Boston MA), соединенным с ПК, и значения автоматически фиксировали вMicrosoft Excel. Как показано на фиг. 5, через 2 недели после имплантации опухоли у мышей-носителей рака С-26 наблюдали тяжелую кахексию и сильную потерю веса. Лечение E28W эффективно устраняло эти проблемы у мышей-носителей опухоли. Средний размер таких мышей, получавших E28W, был значительно выше, чем размер мышей-носителей опухоли, получавших ФБР (р 0,001 с 7 по 33 день после имплантации рака, односторонний Т-критерий (Graph pad Software Inc. San Diego CA, США).E28W не оказывало никакого влияния на размер опухоли С-26. Некропсия по окончании исследования показала, что средняя масса тела (без жира) и масса мышц конечностей мышей С-26, получавших E28W,была значительно выше, чем у мышей, получавших ФБР (р 0,001 для обоих измерений). Влияние E28W на выживание мышей С-26 показано на фиг. 6. Мыши, получавшие ФБР, начали умирать на 14-й день после имплантации опухоли. На 35-й день все 20 таких мышей С-26 умерли, тогда как 17 из 20 мышей С 26, получавших E28W, выжили. Таким образом, E28W обеспечивало значительное увеличение продолжительности жизни мышей-носителей опухоли С-26 (р 0,0001, хи 2). Следовательно, полипептид E28W был эффективен не только в поддержании веса тела и мышечной массы, но и в выживании мышейносителей опухоли С-26. Лечение мышей с ограничением подвижности задней конечности. Эту модель используют для исследования влияния vActRIIB-IgG2Fc E28W (SEQ ID NO 91) на мышечную массу в состоянии не использования конечности. Процедура в общем такая, как описано у Carlson C.J. el al. (Carlson C.J., Booth F.W. and Gordon S.E.:Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 277: R601-RR606, 1999). Использовали мышей в возрасте 9 недель C57BL/6. 60 мышей были разделены на 3 группы. 1. Контрольная группа без ограничения, получавшая носитель (ФБР). 2. Группа, подвергнутая ограничению (20 мышей), получавшая носитель (ФБР). 3. Группа, подвергнутая процедуре ограничения (20 мышей), получавшая vActRIIB-IgG2Fc, E28W. Делали однократную подкожную инъекцию 30 мг/кг vActRIIB-IgG2Fc E28W или ФБР в группах во время начала ограничения подвижности задней конечности. На протяжении 2-3 недель определяли среднее увеличение массы тела. 5 мышей из каждой группы умерщвляли в день 1, 3, 7 и 14. Масса ножных мышц была измерена посредством некропсии. Как показано в табл. (см. ниже), ограничение подвижности задней конечности привело к значительной потере веса (до 10%). Лечение мышей, подвергнутых процедуре ограничения подвижности задней конечности, получавших vActRIIB-IgG2Fc E28W, обеспечивало значительную прибавку до значений выше, чем у таких же мышей, получивших ФБР, или у контрольных мышей (метод ANOVA). В течение 2 недель средняя прибавка в весе у мышей, получавших vActRIIB-IgG2Fc E28W (SEQ ID NO: 91), была 12,6% по сравнению с 0,2% уменьшения в группе с ограничением подвижности, получившей ФБР, и с 4,8% прибавки у контрольных мышей соответственно. Результаты некропсии в определенные моменты времени показали, что мышечная масса задних конечностей менялась в соответствии с массой тела. Лечение мышей с ограничением подвижности путем инъекции vActRIIB-IgG2Fc (E28W) полностью останавливало потерю веса. Следовательно, результаты этого эксперимента показали, что E28W эффективен в лечении мышечной атрофии, связанной с заболеванием. Лечение мышей с оваирэктомией (OVX). Мыши с удаленными яичниками (OVX) считаются моделью для изучения женского гипогонадизма и остеопороза. У 24 самок С 57 В 16 в возрасте 3 месяцев были удалены яичники и мыши были оставлены на 3 месяца. В возрасте 6 месяцев 24 мыши OVX, а также 24 такие же мыши того же возраста (контроль),прооперированные без удаления яичников, подвергали исследованию на предмет изменения массы тела,мышечной и жировой массы методом ЯМР (NMR). Также измеряли массу костей на аппарате PIXImus(GE LUNAR Corporation) в течение 3 месяцев. В конце этого периода мышей умерщвляли, костные ткани собирали в процессе некропсии и подвергали рентгеновскому анализу и микро-САТ-скану (Faxitron Xray Corporation and GE Medical system). Было показано, что модифицированный рецептор E28W (SEQ IDNO: 91) был эффективен в увеличении веса тела, в частности мышечной и костной массы, тогда как жировая масса уменьшилась до уровня, наблюдаемого у мышей, имеющих яичники. Конкретно, в течение периода 12 недель мышечная масса увеличилась с 20 до 27 г у мышей OVX, получивших E28W, по сравнению с 20 до 27,5 г у контрольных мышей, получивших E28W, тогда как не наблюдалось почти никакого увеличения у мышей обеих групп, получивших ФБР (примерно 19 г - мыши OVX, 20 г - контрольные мыши). В том же исследовании у OVX мышей, получавших E28W, наблюдали уменьшение жировой массы на 4-8 г в среднем на животное по сравнению с контрольными мышами в конце 12-недельного эксперимента. У мышей OVX, получавших ФБР, напротив, не наблюдали уменьшения количества жировой массы в течение эксперимента. Также костная масса увеличилась в мышах OVX, получавших E28W,по сравнению с мышами OVX, получавшими ФБР. Минеральную плотность костей - МПК (малоберцовая и большая берцовая кости), извлеченных в ходе посмертного вскрытия, определяли методом томографии pQCT (Peripheral Quantitative Computed Tomography). У OVX мышей, получавших E28W, МПК увеличилась с 0,045 до 0,055 г/см к концу 12-недельного эксперимента, что было сравнимо с конечной МПК контрольных мышей, получавших ФБР. У мышей OVX, получавших ФБР, наблюдали такую же МСК (0,045 г/см) в конце 12-недельного эксперимента. Мыши дикого типа, получавшие E28W, продемонстрировали увеличение МПК с 0,054 до 0,065 г/см в конце 12-недельного эксперимента. Это исследование показало, что полипептид E28W эффективен в качестве потенциального средства для лечения атрофии, остеопороза и ожирения при старении. Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными примерами реализации, описанными в настоящей заявке, которые являются иллюстрациями отдельных аспектов изобретения. Функционально эквивалентные способы и соединения также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации этого изобретения, отличные от показанных и описанных в настоящей заявке, будут очевидны для специалистов в данной области на основании приведенного выше описания и чертежей. Предполагаются, что такие модификации лежат в пределах объема прилагающейся формулы.
МПК / Метки
МПК: C12N 15/861, C07K 14/71, A61K 38/17, C12N 15/12, C12N 5/10
Метки: полипептиды, рецептора, применение, активина, модифицированные
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-20510-modificirovannye-polipeptidy-receptora-aktivina-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Модифицированные полипептиды рецептора активина и их применение</a>
Модифицированные бычьи полипептиды g-csf и их применение
Номер патента: 19968
Опубликовано: 30.07.2014
Авторы: Кнудсен Ник, Кеннинг Питер К., Кодер Алан, Норман Теа, Крайнов Вадим, Скидмор Лиллиан, Хэйс Путмэн Анна-Мария А.
МПК: A61K 38/00
Метки: применение, полипептиды, модифицированные, бычьи, g-csf
Формула / Реферат:
1. Полипептид bG-CSF, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, причем положение 133 в SEQ ID NO: 1 или положение 134 в SEQ ID NO: 2 замещено на пара-ацетилфенилаланин; и полипептид связан с водорастворимым полимером, содержащим молекулу поли(этиленгликоля).2. Полипептид bG-CSF по п.1, где молекулярная масса водорастворимого полимера составляет от около 0,1 до около 100 кДа.3. Полипептид bG-CSF по п.1, где молекулярная масса...
Модифицированные полипептиды эритропоэтина животных и их применение
Номер патента: 19653
Опубликовано: 30.05.2014
Авторы: Барнетт Ричард С., Силади Марк, Тянь Фэн, Сонг Фрэнк, Чу Стефани, Эткинсон Кайл, Хейз Путнэм Анна-Мария А., Шеффер Джозеф, Ли Дарин, Кеннинг Питер К.
МПК: C07K 14/505, C07H 21/00, C07K 1/113...
Метки: применение, животных, эритропоэтина, полипептиды, модифицированные
Формула / Реферат:
1. Полипептид кошачьего эритропоэтина (fEPO), содержащий некодируемую аминокислоту.2. fEPO полипептид по п.1, где fEPO полипептид связан по меньшей мере с одним дополнительным fEPO полипептидом.3. fEPO полипептид по п.1, где некодируемая аминокислота связана с водорастворимым полимером.4. fEPO полипептид по п.3, где водорастворимый полимер содержит молекулу поли(этиленгликоля).5. fEPO полипептид по п.4, где молекула поли(этиленгликоля)...
Модифицированные растворимые слитые конструкции рецептора fgf и fc с улучшенной биологической активностью и их применение
Номер патента: 18700
Опубликовано: 30.10.2013
Авторы: Сорделло Сильви, Несбит Марк, Тромб Марк, Николацци Селин, Камерон Беатрис, Бланш Франсис
МПК: A61K 38/17, C07K 14/47, A61K 47/48...
Метки: слитые, применение, биологической, рецептора, конструкции, модифицированные, активностью, улучшенной, растворимые
Формула / Реферат:
1. Модифицированная слитая конструкция растворимого фрагмента или домена рецептора FGF с Fc-областью иммуноглобулина (Ig), где среднее количество сиаловой кислоты на N-гликан компонента рецептора FGF составляет 0,9 или выше, обладающая активностью в отношении ADCC и/или CDC, в которой занят, по меньшей мере, 5-й участок N-гликозилирования компонента рецептора FGF.2. Модифицированная слитая конструкция по п.1, в которой среднее количество...
Полипептиды zalpha 11 рецептора цитокина человека класса i, кодирующие их полинуклеотиды и способы их применения
Номер патента: 6501
Опубликовано: 29.12.2005
Авторы: Хэммонд Анджела К., Конклин Даррелл К., Новак Джулия Э., Преснелл Скотт Р.
МПК: C12N 15/12, C07K 14/715
Метки: класса, zalpha, полипептиды, рецептора, способы, применения, человека, цитокина, полинуклеотиды, кодирующие
Формула / Реферат:
1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из (a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен); (b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID NO:2...
Антагонисты активина – actriia и их применение для стимулирования роста кости
Номер патента: 15105
Опубликовано: 30.06.2011
Авторы: Нопф Джон, Сихра Джасбир
МПК: A61K 38/17, C07K 14/705, C12N 5/10...
Метки: роста, actriia, активина, антагонисты, применение, стимулирования, кости
Формула / Реферат:
1. Выделенный активин-связывающий полипептид ActRIIa, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.2. Активин-связывающий полипептид ActRIIa по п.1, где полипептид имеет чистоту по меньшей мере 95%, в отношении белковых примесей, как определено эксклюзионной хроматографией.3. Активин-связывающий полипептид ActRIIa по п.1 или 2, где указанный полипептид проявляет селективность к активину по меньшей мере в 10 раз выше по константе...
Предыдущий патент: Стенты с биоразлагаемыми слоями
Следующий патент: Конформационно ограниченные бифенильные производные для применения в качестве ингибиторов вируса гепатита с
Случайный патент: Фармацевтическая композиция с замедленным высвобождением, включающая венлафаксин