Антитело или фрагмент антитела, которое связывается с белком ron человека, и его применение

АНТИТЕЛО ИЛИ ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА, КОТОРОЕ СВЯЗЫВАЕТСЯ С БЕЛКОМ Согласно настоящему изобретению предложены антитела или фрагменты антител, включая антитела человека, специфичные в отношении рецептора к белку, стимулирующему макрофаги(MSP-R или RON), которые подавляют активацию RON. Также предложены способы ингибирования RON, в частности применение RON для лечения таких заболеваний, как рак. Перекрестные ссылки на родственные заявки По заявке на данный патент испрашивается приоритет согласно временной заявке СШАUSSN 60/989558, поданной 21 ноября 2007 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Область техники Изобретение относится к способам и композициям для ингибирования рецептора человека к белку,стимулирующему макрофаги ("MSP-R" или "RON" (receptor d'origine nantais. Настоящее изобретение также относится к способам лечения опухолей и других заболеваний у млекопитающих, включающим введение антител или фрагментов антител, специфичных к RON, которые ингибируют активацию RON. Уровень техники Рецептор к белку, стимулирующему макрофаги, также известный как "RON", принадлежит к семейству c-met рецепторных тирозинкиназ. RON представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из внеклеточной альфа-цепи и трансмембранной бета-цепи. Сначала RON экспрессируется в виде предшественника, состоящего из одной цепи с последующим расщеплением на альфа- и бета-цепи (1). Считается, что бета-цепь необходима для связывания лиганда-белка, стимулирующего макрофаги ("MSP"; также известный как HGF-подобный белок), с рецептором, а крингл-домены (Kringle domains) 2 и 3 MSP необходимы для взаимодействия RON/MSP. См. публикацию США 2003/0073656. Считают, что внеклеточный домен RON обладает низкой степенью гомологии с соответствующими доменами рецепторов семейства с-met. Действительно, связывание фактора роста гепатоцитов ("HGF"), которое стимулирует другие рецепторы семейства c-met, с рецептором RON не приводит к стимуляции тирозинкиназной активности (WO 02/083047). Считается, что RON принимает участие в миграции клеток, изменении формы и инвазии опухолей в ткани (1). Однако в более ранних публикациях сообщалось об ограниченной роли RON в индукции трансформации, но была описана стимуляция инвазивного роста в результате активации RON (16). Мутации, делеции и перестановки генов, а также альтернативный сплайсинг мРНК могут приводить к активации RON в отсутствие связывания лиганда (1). Изменения в тирозинкиназном домене RON возможно имеют большое значение для активации RON (1). Путем клонирования RON из различных линий раковых клеток была продемонстрирована активация RON в результате различных дефектов мРНК,кодирующей RON.MSP является членом семейства родственных плазминогену белков, содержащих крингл-домен (1). Как следует из его названия, первоначально было обнаружено, что MSP стимулирует макрофаги по различным механизмам (обзор можно найти в 2, 3). Например, добавление MSP к некоторым макрофагам,экспрессирующим RON, стимулирует изменения формы, хемотаксис, макропиноцитоз, фагоцитоз и продукцию иммуномедиаторов (4, 5, 6). Также было обнаружено, что RON экспрессируется в эпителиальных клетках, таких как кератиноциты, в которых, как было показано, MSP фосфорилирует RON и активирует ряд сигнальных путей, что вызывает ответы, связанные с адгезией/подвижностью клеток, антиапоптотические и пролиферативные ответы (7, 8). За последние несколько лет повышенную экспрессиюRON обнаружили в нескольких опухолях и линиях клеток эпителия (например, толстой кишки (9, 10, 11),легкого (12), груди (13. В недавнем исследовании у мышей с искусственно повышенной экспрессиейRON в легких развивались опухоли легкого (14, 15).RON экспрессируется в разнообразных линиях раковых клеток. Антитело к RON способно ингибировать активацию этого рецептора (фосфорилированного RON), а также активацию нижележащих по сигнальному пути сигнальных молекул: фосфор-MAPK и фосфор-AKT, во многих линиях раковых клеток. Было показано, что оба антитела к RON (RON6 и RON8), описанные ниже, при введении бестимусным мышам в значительной степени ослабляют способность некоторых линий клеток, полученных из злокачественных опухолей (НТ-29 толстой кишки, Н-292 легкого, BxPC3 поджелудочной железы, JIMT1 молочной железы), образовывать опухоли. Это наблюдение подтверждает то, что рецепторная тирозинкиназа RON оказывает отрицательное влияние на пролиферацию указанных раковых клеток и приводит к занижению оценки значения ингибирования RON, например, в злокачественных опухолях толстой кишки, легкого, поджелудочной железы и молочной железы. С использованием стандартных процедур метода Вестерн-блот и поточной цитометрии было показано, что RON экспрессируется во многих линиях клеток человека, полученных из разнообразных раковых опухолей: толстой кишки (НТ-29, Colo205,HCT-116, DLD-1, Sw480, Sw620), поджелудочной железы (BxPC3, CAPAN-2, ASPC-1, HPAF-II,L3.7p17, Hs766T), предстательной железы (DU-145, РС-3), желудка (AGS, NCI-N87), легкого (А 549,Н 596), печени (HepG2, SNU-182) и молочной железы (JIMT-1, DU4475, AU565). Таким образом, сохраняется потребность в разработке способов лечения различных заболеваний, в частности рака, основанных на идентификации мишеней, включая специфичные эпитопы RON. Краткое изложение сущности изобретения Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены антитела к RON, обладающие повышенной способностью к специфичному связыванию по сравнению с известными антителами к RON,которые были доступны ранее. Указанные антитела могут быть изолированными и/или очищенными. Антитела согласно настоящему изобретению можно использовать для связывания RON, включая RON,кодируемый аллелями дикого типа RON, который обычно встречается в популяции людей, и измененные белки RON, например, варианты с незначительными изменениями или мутациями, сохраняющие активность RON. В одном варианте реализации антитела согласно настоящему изобретению специфичны в отношении RON и обладают Kd (т.е. равновесной константой диссоциации для антигена с антителом),равной приблизительно 110-9 M-1 или меньше. В других вариантах осуществления очищенные антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют Kd, равную приблизительно 110-10 М-1 или приблизительно 110-11 M-1 или меньше. В других вариантах осуществления антитело или функциональный фрагмент антитела согласно настоящему изобретению являются полностью человеческими по природе. Настоящее изобретение относится, например, к антителу, которое специфичным образом связывается с белком RON, которое содержит гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность, CDR), полученный из одной или более вариабельных областей антитела, выбранных из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи RON6, вариабельной области легкой цепи RON6,вариабельной области тяжелой цепи RON8, вариабельной области легкой цепи RON8 и их комбинаций,причем CDR вариабельной области тяжелой цепи RON6 представляют собой SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO: 19 и SEQ ID NO: 21; CDR вариабельной области легкой цепи RON6 представляют собой SEQ IDNO: 23, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 27; CDR вариабельной области тяжелой цепи RON8 представляют собой SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 33 и CDR вариабельной области легкой цепи RON8 представляют собой SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 39. Каждая из приведенных вариабельных областей может быть источником трех CDR. Антитело может представлять собой, например,моноклональное антитело, одноцепочечное антитело, Fab, Fv, диатело или триатело. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать участки CDR, полученные по меньшей мере из двух вариабельных областей антитела, выбранных из группы, состоящей из тяжелой цепи RON6, легкой цепи RON6, тяжелой цепи RON8, легкой цепи RON8 и их комбинаций. В более предпочтительном варианте антитела согласно настоящему изобретению включают CDR, полученные по меньшей мере из трех вариабельных областей антитела, выбранных из группы, состоящей из тяжелой цепи RON6, легкой цепи RON6, тяжелой цепи RON8, легкой цепи RON8 и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой RON6 или RON8. Далее согласно настоящему изобретению предложена изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, а также рекомбинантный вектор, включающий нуклеиновую кислоту, функционально связанную с одной или более последовательностями, которые обеспечивают экспрессию этой нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Также предложены клетки-хозяева, включающие рекомбинантный вектор. Далее согласно настоящему изобретению предложен способ получения антитела к RON согласно настоящему изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина в условиях, допускающих экспрессию антитела, и возможно очистку полученного антитела. Далее согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, включающая антитело согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать один или более других терапевтически эффективных агентов. Также предусмотрены наборы, включающие антитела к RON согласно настоящему изобретению,отдельно или в комбинации с другими агентами, например химиотерапевтическими агентами. Также предложены способы с использованием антитела согласно настоящему изобретению, например способы лечения рака, ингибирования ангиогенеза, роста, миграции, пролиферации или инвазии опухолевых клеток, которые экспрессируют RON, включающие введение млекопитающему эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению или опухолевые клетки представляют собой клетки фрагмента такого антитела с ингибированием активации RON. Опухолевые клетки представляют собой, например, опухолевые клетки, происходящие из толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, легкого, печени, яичника, почки, молочной железы и мозга, или клетки,имеющие эпителиальное или нейроэндокринное происхождение. Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают введение других агентов,например, небольших органических молекул, с антителом, причем другие агенты могут включать, но не ограничиваются перечисленными, химиотерапевтический агент, антиангиогенный агент, или ингибируют активацию RON. Антитело может быть, но необязательно, конъюгировано с другим агентом, например, с небольшой органической молекулой. Антитело согласно настоящему изобретению может быть введено совместно по меньшей мере с одним другим противораковым средством для лечения, например антиангиогенным агентом, антагонистомFGFR-3, химиотерапевтическим агентом, излучением, антинеопластическим агентом, небольшой молекулой или другим антителом. Например, антитело согласно настоящему изобретению возможно вводят по меньшей мере с одним дополнительным антителом, которое подавляет опухоли, например с антителом к EGFR, таким как Erbitux (Imclone Systems, Inc. Нью-Йорк, Нью-Йорк). Антитело согласно настоящему изобретению может быть нацелено на или может связывать RON дикого типа или измененный RON (вариант RON). Способы согласно настоящему изобретению далее включают способ детекции RON в образце,включающий приведение указанного образца в контакт с антителом согласно настоящему изобретению для достижения специфичного связывания и детекции такого связывания. Также предложен способ профилактики или лечения воспаления у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему антитела согласно настоящему изобретению. Также предложен способ профилактики или лечения заболевания, например заболевания печени,желчных путей, желчных протоков и желчного пузыря у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению. Также предложен способ ингибирования фосфорилирования RON, MAPK и/или Akt у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления описанных выше способов антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно вводить млекопитающему в дозе от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг. В других вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела можно вводить в дозе от приблизительно 3 до приблизительно 8 мг/кг. Краткое описание фигур На фиг. 1 А показана ДНК (SEQ ID NO: 1) и транслируемая последовательность (SEQ ID NO: 2) вариабельной области тяжелой цепи RON6. Участки CDR выделены одинарным подчеркиванием. На фиг. 1 В показана ДНК (SEQ ID NO: 3) и транслируемая последовательность (SEQ ID NO: 4) вариабельной области легкой цепи RON6. Участки CDR выделены одинарным подчеркиванием. На фиг. 1 С показана ДНК (SEQ ID NO: 5) и транслируемая последовательность (SEQ ID NO: 6) вариабельной области тяжелой цепи RON8. Участки CDR выделены одинарным подчеркиванием. На фиг. 1D показана ДНК (SEQ ID NO: 7) и транслируемая последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельной области легкой цепи RON8. Участки CDR выделены одинарным подчеркиванием. На фиг. 2 А-2 С совместно показана полная последовательность RON6-H (IgG1 человека, подгруппаI), ДНК (SEQ ID NO: 9) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10). Секреторная сигнальная последовательность (курсив); вариабельная область (двойное подчеркивание, за исключением участковCDR); участки CDR (одинарное подчеркивание); константная область гамма (неизмененная). Звездочкой отмечен стоп-кодон. На фиг. 2D, 2 Е совместно показана полная последовательность RON6-L (легкая каппа-цепь человека, подгруппа III), ДНК (SEQ ID NO: 11) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 12). Секреторная сигнальная последовательность RON6-L (курсив); вариабельная область (двойное подчеркивание,за исключением участков CDR); участки CDR (одинарное подчеркивание); константная область каппа(немодифицированная). На фиг. 3 А-3 С совместно показана полная последовательность RON8-H, ДНК (SEQ ID NO: 13) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 14). Секреторная сигнальная последовательность(курсив), вариабельная область (двойное подчеркивание) с участками CDR (подчеркивание), константная область гамма (немодифицированная). Звездочкойотмечен стоп-кодон. На фиг. 3D, 3 Е показана полная последовательность RON8-L, ДНК (SEQ ID NO: 15) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 16). Секреторная сигнальная последовательность (курсив), вариабельная область (двойное подчеркивание, за исключением участков CDR) с участками CDR (подчеркивание), константная область каппа (немодифицированная). Звездочкойотмечен стоп-кодон. На фиг. 4 А и 4 В показаны графики размера опухоли в зависимости от времени в модели на мышах с ксенографтом Н-292 после введения антител к RON, RON6 (фиг. 4 А) и RON8 (фиг. 4 В). Графики демонстрируют, что антитела RON6 и RON8 подавляют рост опухолевых клеток Н-292 в ксенографтной системе на мышах. На фиг. 4 С и 4D показаны графики размера опухоли в зависимости от времени в модели на мышах с ксенографтом НТ-29. Графики демонстрируют, что антитела RON6 (фиг. 4 С) и RON8 (фиг. 4 С) подавляют рост опухолевых клеток НТ-29 в ксенографтной системе на мышах. На фиг. 4 Е показаны графики размера опухоли в зависимости от времени в модели на мышах с ксенографтом BxPC3 только с антителом RON8, антителом RON8 плюс Erbitux (ERB), только Erbitux иRON8 (фиг. 4 Е) отдельно подавляет рост опухолевых клеток BxPC3 в ксенографтной системе на мышах. График также демонстрирует, что в комбинации с Erbitux имеет место тенденция к регрессии или подавлению опухоли.-3 018717 Фиг. 4F демонстрирует, что антитело к RON8 подавляет рост ксенографтом опухоли молочной железы у бестимусных мышей. Клетки рака молочной железы JIMT-1 вводили путем инъекции бестимусным мышам и позволяли опухоли расти до размера приблизительно 250 мм 3. На графике изображен объем опухоли на протяжении курса лечения контрольным средством (физиологический раствор), антителом RON8 (60 мг/кг, 2/неделя), доцетакселом или комбинацией доцетаксел + антитело к RON8. На фиг. 5 А-5 С показаны результаты анализа методом Вестерн-блот, подтверждающие подавление фосфорилирования, индуцированного MSP, антителами к RON, в частности RON6 и RON8. Было подтверждено, что антитела RON6 и RON8 ингибируют MSP-зависимую активацию рецептора RON и активацию каскадов передачи сигналов после рецептора RON соответственно. Для анализа,иллюстрируемого фиг. 5 А, клетки NIH3T3-RON выдерживали без питательных веществ в течение ночи,обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией антитела, а затем стимулировали 10 нМ MSP в течение 10 мин. После стимуляции клетки лизировали и полные лизаты клеток разделяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и тестировали с указанными антителами. Для анализа, иллюстрируемого фиг. 5 В, клетки Н-292 выдерживали без питательных веществ в течение ночи, обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией антитела, а затем стимулировали 10 нМ MSP в течение 10 мин. После стимуляции клетки лизировали и полные лизаты клеток разделяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и тестировали с указанными антителами. Для анализа, иллюстрируемого фиг. 5 С, клетки НТ-29 выдерживали без питательных веществ в течение ночи, обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией антитела, а затем стимулировали 10 нМMSP в течение 10 мин. После стимуляции клетки лизировали и полные лизаты клеток разделяли методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и тестировали с указанными антителами. На фиг. 6 А характеристики блокирования антитела RON8, определенные в твердофазном анализе. Методом ELISA определяли значение IC50 антитела RON8, необходимое для блокирования взаимодействия рекомбинантного белка RON человека с иммобилизованным MSP человека. Фиг. 6 В демонстрирует способность антитела RON8 ингибировать миграцию клеток рака легкого Н 596. Фиг. 6 С демонстрируют индуцируемый MSP синтез ДНК в клетках рака поджелудочной железыBxPC3 под действием антитела RON8. Фиг. 6C(1) иллюстрирует стимуляцию белком MSP включения [3 Н]-тимидина, который является мерой синтеза ДНК. На фиг. 6 С(2) показана система, в которой клетки вначале обрабатывали антителом RON8 в течение 1 ч, а затем добавляли MSP. Подробное описание изобретения Согласно настоящему изобретению предложены антитела к RON, которые можно использовать, например, в средствах и способах анализа для детекции белков RON в диагностических целях и в способах ингибирования активности RON в терапевтических целях. Далее, антитела к RON согласно настоящему изобретению можно вводить животному, например млекопитающему, такому как человек, в терапевтически эффективном количестве, например в количестве, которое обеспечивает подавление роста, пролиферации, метастатической активности (т.е. миграцию и/или инвазию) любой из и всех опухолевых клеток, экспрессирующих RON. Согласно настоящему изобретению также предложены фармацевтические композиции, включающие антитела к RON согласно настоящему изобретению, или фрагменты таких антител. Далее, согласно настоящему изобретению предложены полностью человеческие антитела, которые связывают рецепторную тирозинкиназу RON человека. Такие антитела включают, но не ограничиваются приведенными в качестве примеров RON6 и RON8, а также активные или функциональные фрагменты и производные таких антител. Для ясности понимания описания следует иметь в виду, что белок-мишень называется RON, как подробно разъясняется выше в разделе "Уровень техники", а предпочтительные антитела к RON, приведенные в качестве примеров в настоящем описании, обозначены "RON6" и "RON8" соответственно. Путем скрининга антитела к RON согласно настоящему изобретению были отобраны из сотен кандидатных антител к RON. Как подробно описано в приведенных ниже примерах, антитела согласно настоящему изобретению демонстрируют неожиданно предпочтительные характеристики связывания RON по сравнению с другими антителами к RON, которые были доступны ранее. В частности, новые антитела RON6 и RON8 обладают аффинностью к рецептору RON, в 100 раз большей, чем у RON1, полностью человеческого антитела к RON, которое было получено ранее с использованием системы на основе фаговой библиотеки. Конкретно, RON6 и RON8 связывают RON с KD, равной 4,110-11 и 3,210-11 М соответственно,в то время как RON1 связывает RON с KD, равной 7,710-9 M. RON1 - текущее обозначение известного в данной области антитела, описанного в международной заявке на патент WO 2005120557, см. выше, которая включена в настоящее описание путем ссылки. В настоящем описании информация о последовательности CDR, раскрытая в настоящем описании для использования в способах согласно настоящему изобретению, может быть "полученной из" (произ-4 018717 водной), т.е. основанной на, созданной или произошедшей из информации о последовательности из любого и всех возможных источников вариабельных областей антитела, которые могут включать формы дикого типа или измененные (модифицированные) формы, а также встречающиеся в природе или полученные путем синтеза методами, знакомыми специалисту в данной области. Используемый в настоящем описании термин "опухоль" включает раковые заболевания (рак) в целом и как злокачественные, так и доброкачественные заболевания, если не указано иное. В настоящем описании злокачественные опухоли включают первичные и вторичные опухоли. Первичные опухоли развиваются непосредственно из ткани, в которой их обнаруживают. Вторичная опухоль, или метастаз,представляет собой опухоль, которая происходит из какого-либо другого участка организма, но распространяется в удаленный орган. Обычные пути распространения метастазов включают прямое прорастание в смежные структуры, распространение через кровеносную или лимфатическую систему и прохождение по поверхности ткани или по полостям организма (перитонеальная жидкость, спинно-мозговая жидкость и др.) Конкретные типы рака или злокачественных опухолей, первичных или вторичных, которые можно включить для возможного лечения с использованием способов согласно настоящему изобретению включают лейкемии, рак молочной железы, рак кожи, рак кости, рак предстательной железы, рак печени, рак легких, рак мозга, рак гортани, желчного пузыря, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидной железы, щитовидной железы, надпочечников, нервной ткани, головы и шеи, ободочной кишки, желудка, бронхов, почек, базально-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному язвенного и папиллярного типа, метастазирующую карциному кожи, остеосаркому, саркому Эвинга, ретикулоклеточную саркому, миелому, гигантоклеточную опухоль, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, камни в желчном пузыре, опухоли из островковых клеток, первичную опухоль мозга, острые и хронические лимфоцитарные и гранулоцитарные опухоли, волосатоклеточную опухоль, аденому, гиперплазию, медуллярный рак, феохромоцитому, слизистую неврому, кишечные ганглионевромы, гиперпластические опухоли роговичных нервов, опухоль при марфаноидном внешнем виде, опухоль Вильма, семиному, опухоль яичника, лейомиому, дисплазию шейки матки и рак на месте шейки матки, нейробластому, ретинобластому, саркому мягких тканей, злокачественный карциноид, местные поражения кожи,грибковые микозы, рабдомиосаркому, саркому Капоши, остеогенную и другие саркомы, злокачественную гиперкальциемию, гипернефроидный рак, истинную полицитемию, аденокарциному, мультиформную глиобластому, лимфомы, злокачественные меланомы, эпидермоидный рак и другие карциномы и саркомы, но не ограничиваются ими. Для ясности, также предполагается, что использование терминов в единственном числе для удобства в описании не накладывает никаких ограничений. Так, например, термин "антитело" или "опухоль" включает указание на одно или более таких антител или опухолей. Использование терминов во множественном числе также не предполагает ограничения, если не указано иное. Антитела согласно настоящему изобретению или их фрагменты, специфичные в отношении RON,нейтрализуют активацию рецептора RON. Используемый здесь термин "нейтрализация рецептора" обозначает инактивацию внутренней киназной активности рецептора, приводящей к передаче сигнала. Надежным способом анализа нейтрализации RON является ингибирование фосфорилирования рецептора. Настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом нейтрализации RON. Такая нейтрализация, например, может возникать при введении антитела, блокирующего доступ к определенным эпитопам для лиганда, или путем изменения конформации RON определенным образом так,что лиганд, в частности MSP, не сможет активировать рецептор даже несмотря на то, что он может связываться с рецептором. В патенте США 6165464 перечислены возможные механизмы такой нейтрализации, включая антитела, связывающие лиганд сам по себе, антитела, угнетающие рецептор, антитела, ингибирующие тирозинкиназную активность рецептора, или антитела, вызывающие цитотоксический ответ. Отрицательная регуляция может возникать, когда у клеток, экспрессирующих RON, в частности клетки с гиперэкспрессией (включая дифференциальную экспрессию) RON, снижается число рецепторных RON на поверхности. Следовательно, нейтрализация вызывает разные эффекты, включая ингибирование, сокращение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенеза (задействования кровеносных сосудов, инвазии и метастазирования) и подвижности клеток и метастазов (адгезии и инвазивности клеток). Нейтрализация RON под действием антител к RON также может включать нейтрализацию варианта рецепторной тирозинкиназы RON, которая активна в отсутствие связывания лиганда или связывается с лигандом и в дальнейшем не инактивируется. Так, нейтрализация RON может включать нейтрализациюRON дикого типа и/или его варианта (точечные мутации, делеции, альтернативный сплайсинг и др.). В настоящем описании термин "вариант" RON может включать белки RON, которые короче или длиннее, чем RON дикого типа, и возможно будет включать аналоги, содержащие замены аминокислот. Варианты RON также можно получить путем альтернативного сплайсинга или инициации и/или точечной мутации (мутаций). Одной полезной мерой степени нейтрализации RON антителами к RON является ингибирование тирозинкиназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы может быть определено хорошо-5 018717 известными способами; например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантного киназного рецептора, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Так, анализ фосфорилирования применяют при определении нейтрализации антител в контексте настоящего изобретения. Фосфорилирование можно выявить, например, при помощи антител, специфических в отношении фосфортирозина в анализе ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) или вестерн-блот. Некоторые виды анализа тирозинкиназной активности описаны у Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44 (1997) и Batley et al., Life Sci. 62:143-50 (1998). Другой мерой нейтрализации RON является ингибирование фосфорилирования субстратов, расположенных выше RON в метаболическом пути. Соответственно, можно измерять, например, уровень фосфорилирования MAPK или Akt. Существующие в природе антитела обычно включают две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, причем каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью внутрицепочечными дисульфидными связями, и множественные дисульфидные связи дополнительно связывают две тяжелых цепи друг с другом. Отдельные цепи могут скручиваться в домены, обладающие близкими размерами (110-125 аминокислот) и структурами, но разными функциями. Легкая цепь может содержать одну вариабельную область (VL) и/или одну константную область (CL). Тяжелая цепь также может содержать одну вариабельную область (VH) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных области (CH1, CH2, СН 3 и СН 4). У людей изотипы включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM,причем IgA и IgG еще подразделяют на подклассы или подтипы (IgA1-2 и IgG1-4). В целом, вариабельные домены демонстрируют значительную вариабельность последовательности аминокислот между разными антителами, особенно в антигенсвязывающем сайте. В каждой VL или VH обнаруживают три области, именуемые гипервариабельными или комплементарно детерминирующими областями (CDR), которые поддерживают менее вариабельные области, называемые каркасными вариабельными областями. Антитела согласно настоящему изобретению в качестве примера включают моноклональные антитела IgG. Также предполагается, что "антитело" или "антитела" согласно изобретению могут включать фрагменты антител или рекомбинантные формы. Имеют место, например, фрагменты Fv или белки, в которых CDR и/или вариабельные домены приводимых в качестве примера антител сконструированы как одноцепочечные антигенсвязывающие белки, димеры и/или тримеры, чтобы обеспечить преимущество новых предложенных в изобретении антител в альтернативных структурных формах. Кратко, часть антитела, содержащую области VL и VH, обозначают Fv (вариабельный фрагмент), и она содержит антигенсвязывающий сайт. Одноцепочечный Fv (scFv или SCA) в фрагменте антитела, содержащий область VL и область VH в одной полипептидной цепи, в которой N-конец одной области и Сконец другой области соединены гибким линкером (см., например, патент США 4946778 (Ladner etal.); в WO 88/09344 (Huston et al В WO 92/01047 (McCafferty et al.) описан фенотип фрагментов scFv на поверхности растворимых рекомбинантных дисплеев генов, таких как бактериофаг. Пептидные линкеры, используемые для получения одноцепочечных антител, могут быть гибкими пептидами, которые выбирают, таким образом, чтобы обеспечить адекватное трехмерное скручивание областей VL и VH. Линкер обычно включает от 10 до 50 остатков аминокислот. Предпочтительно линкер включает от 10 до 30 остатков аминокислот. Более предпочтительно линкер включает от 12 до 30 остатков аминокислот. Наиболее предпочтительно линкер включает от 15 до 25 остатков аминокислот. Пример таких пептидов-линкеров включает повторы четырех глицинов, после которых идет серин. Одноцепочечные антитела не имеют части или всех константных доменов, присущих полному антителу, из которого их выделили. Следовательно, они могут преодолевать некоторые из проблем, связанных с применением полного антитела. Например, одноцепочечные антитела обычно не проявляют некоторых нежелательных взаимодействий между константными областями тяжелых цепей и другими биологическими молекулами. Кроме того, одноцепочечные антитела значительно меньше, чем полные антитела, и могут иметь более высокую проницаемость, чем полные антитела, что позволяет одноцепочечным антителам локализовать и связываться с целевыми антигенсвязывающими сайтами с большей эффективностью. Кроме того, относительно малый размер одноцепочечного антитела ведет к снижению вероятности провоцирования нежелательного иммунного ответа у реципиента по сравнению с полными антителами. Многие одноцепочечные антитела, в которых каждая одиночная цепь содержит один VH и один VL домен, ковалентно связанные первым пептидным линкером, могут быть ковалентно связаны по меньшей мере одним или более пептидными линкерами, образуя мультивалентные одноцепочечные антитела, которые могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными. Каждая цепь мультивалентного одноцепочечного антитела содержит один вариабельный фрагмент легкой цепи и один вариабельный фрагмент тяжелой цепи и связана пептидным линкером по меньшей мере с одной другой цепью. Пептидный линкер состоит по меньшей мере из пятнадцати остатков аминокислот. Максимальное число остатков аминокислот составляет около одной сотни. Два одноцепочечных антитела могут быть соединены с получением димера (диатела), который также называют двухвалентным димером. Димеры содержат две цепи и два сайта связывания и могут быть-6 018717 моноспецифичными или биспецифичными. Каждая цепь антитела включает домен VH, соединенный с областью VL. Области соединены с линкерами, которые достаточно коротки, чтобы не допустить комплементарного связывания между доменами одной цепи, чтобы происходило комплементарное связывание между комплементарными доменами разных цепей с образованием двух антигенсвязывающих сайтов. Исключительно в качестве примера, димер, соответствующий изобретению, может быть биспецифичным и может содержать оба домена, связывающих RON6 и RON8. Три одноцепочечных антитела можно соединять с образованием тримеров, также именуемых трехвалентными димерами. Тримеры конструируют путем прямого связывания аминокислотного конца области VL или VH с карбоксильным концом VL или VH домена, т.е. без последовательности линкера. Тример обладает тремя головами Fv, причем полипептиды выстраиваются циклическим образом, т.е. голова-к-хвосту. Возможной конформацией тримера является плоская конформация, в которой три связывающих сайта лежат в плоскости под углом 120 друг относительно друга. Тримеры могут быть моноспецифичными, биспецифичными или триспецифичными.Fab (антигенсвязывающий фрагмент) обозначает фрагменты антитела, содержащие области VL, CL,VH, CH1. Фрагменты, образующиеся после расщепления папаином, называют просто Fab, в них не сохраняется шарнирная область тяжелой цепи. После расщепления пепсином образуются разные Fab, сохраняющие шарнирную область тяжелой цепи. Такие фрагменты с интактными межцепочечными дисульфидными связями обозначают F(ab')2, a одиночный Fab' образуется, когда дисульфидные связи не сохранены. Фрагменты F(ab')2 обладают более высокой авидностью в отношении антигена, чем моновалентные фрагменты Fab.Fc (фрагмент кристаллизации) - это обозначение для части фрагмента антитела, который содержит соединенные константные домены тяжелых цепей. В антителе IgG, например Fc содержит домены СН 2 и СН 3. Fc в антителе IgA или IgM дополнительно содержит домен СН 4. Fc ассоциирован со связыванием рецепторов Fc, активацией ковалентно-опосредуемой цитотоксичности и антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Для таких антител, как IgA и IgM, которые представляют собой комплексы многих IgG-подобных белков, образование комплекса требует константных доменов Fc. Кроме того, шарнирная область отделяет участки Fab и Fc антитела, придавая подвижность Fab относительно друг друга и относительно Fc, а также включая множественные дисульфидные связи в ковалентное связывание двух тяжелых цепей. Так, антитела, специфичные в отношении RON, включают существующие в природе антитела и их фрагменты, но не ограничиваются ими. Такие фрагменты включают, просто для примера, бивалентные фрагменты, такие как (FaV)2, моновалентные фрагменты, такие как Fab, одноцепочечные антитела, одиночную цепь Fv (scFv), антитела из одиночных доменов, которые специфически связывают RON. Предпочтительно, чтобы такие фрагменты включали один или более CDR антител RON6 и/или RON8, примеры которых приведены в настоящем изобретении. Определение антител в соответствии с изобретением может также включать рекомбинантные антитела, которые связываются специфически с RON, такие как мультивалентные одноцепочечные антитела, димеры, тримеры и подобные, которые специфически связываются с антигенами. Предпочтительно, чтобы такие мультивалентные рекомбинантные антитела включали один или более CDR антител RON6 и/или RON8, примеры которых приведены в настоящем изобретении. Каждый домен антител согласно настоящему изобретению может являться полным антителом с вариабельным доменом тяжелой и легкой цепи, или он может являться функционально идентичным мутантом или производным существующего в природе домена, или синтетическим доменом, сконструированным, например, in vitro с применением методов, таких как один из описанных в WO 93/11236 (Griffiths etal.). Например, возможно соединить вместе домены, соответствующие вариабельным доменам антитела,в которых пропущена по меньшей мере одна аминокислота. Важной характерной особенностью является способность каждого домена к связыванию с комплементарным доменом с образованием антигенсвязывающего сайта. Соответственно, термины "вариабельный фрагмент тяжелой и легкой цепи" не следует толковать с исключением вариантов, которые не обладают материальным эффектом на специфичность. В настоящем патенте термины "антитела" и "фрагменты антител" включают варианты модификации, которые сохраняют специфичность в отношении рецептора RON. Такие модификации включают конъюгацию с молекулой эффектора, такой как химиотерапевтический препарат (например, цисплатин,таксол, доксорубицин) или цитотоксин (например, какой-либо белковый или небелковый органический химиотерапевтический препарат), но не ограничиваются ими. Антитела можно модифицировать путем конъюгации с получением определяемых компонентов-репортеров. Также включены антитела с изменениями, которые влияют на характеристики, не имеющие отношения к связыванию, такие как время полураспада (например, конъюгация с полимерами полиэтиленгликоля). Белковые и небелковые препараты можно конъюгировать с антителами способами, хорошо известными в области техники. Способы конъюгации включают прямое связывание, связывание при помощи ковалентно присоединенных линкеров и парных членов специфического связывания (например, авидинбиотин). Такие способы включают, например, способ, описанный Greenfield et al., Cancer Research 50,6600-6607 (1990) для конъюгации доксорубицина, и способ, описанный Arnon et al., Adv. Exp. Med. Biol.-7 018717 303, 79-90 (1991), и в Kiseleva et al., Mol Biol. (USSR) 25, 508-514 (1991), для конъюгации соединений платины."Специфичность" антитела означает селективное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клеток, или к другому взаимодействию с определенной молекулой. Детерминанты эпитопов обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи сахаров, и обычно обладают характерной трехмерной структурой, а также специфическими характеристиками заряда. Эпитоп может быть "линейным" или "конформационным". В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) возникают линейно вдоль первичной последовательности аминокислот белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействия возникают по всем остаткам аминокислот на белке, которые отделены один от другого, т.е. в незаменимых аминокислотах, соседствующих из-за третичного скручивания белка. Эпитопы, образуемые из заменимых аминокислот, обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, а эпитопы, образованные третичной структурой, обычно утрачиваются при воздействии денатурирующих растворителей. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, еще чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, которые распознают одинаковый эпитоп, можно проверять путем простого иммуноферментного анализа, показывающего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном. После определения желаемого эпитопа антигена можно получить антитела к данному эпитопу, например, при помощи методов, описанных в настоящем изобретении. В качестве альтернативы, в ходе процесса открытия получение и описание свойств антител может выявить информацию относительно желаемых эпитопов. На основании этой информации далее можно провести скрининг антител по конкурентному связыванию одного и того же эпитопа. Подход к достижению этого состоит в проведении исследований перекрестной конкуренции в целях поиска антител, которые конкурентно связываются друг с другом, например антитела, конкурирующие за связывание с антигеном. Картирование эпитопов и соответствующие методики. Для скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом (например, антител, которые блокируют связывание IgE с его высокоаффинным рецептором), можно использовать рутинный анализ перекрестного блокирования, такой как описан в HarlowLane, ANTIBODIES (1990), Cold Spring HarborLaboratory Press. Другие методы включают аланин-сканирующие мутанты (alanine scanning mutants), пептидные блоты (Reineke, 2004 Methods Mol. Biol. 248:443-63) (полностью включена в настоящее описание посредством ссылки) или анализ расщепления пептидов. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопов и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000 Protein Science: 9: 487496, полностью включена в настоящее описание путем ссылки). Функциональные анализы. Описание на основе модификаций (Modification-Assisted Profiling, MAP), также известное как характеристика антител по структуре антигенов (Antigen Structure-based Antibody Profiling, ASAP) представляет собой метод, который позволяет категоризировать большие количества моноклональных антител (MAT, mAb), направленных против одного и того же антигена, на основании схожести профилей связывания каждого антитела с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигенов (публикация патента США 2004/0101920, полностью включенная в настоящее описание посредством ссылки). Каждая категория может соответствовать уникальному эпитопу, явно отличающемуся от эпитопа, соответствующему другой категории, или частично перекрывающемуся с таким эпитопом. Данная технология позволяет объединять генетически идентичные антитела, и таким образом, можно сосредоточить характеризацию на генетически различающихся антителах. При применении для скрининга гибридом MAP может обеспечить идентификацию редких клонов гибридом, которые продуцируют МАТ, обладающие желаемыми характеристиками. MAP можно использовать для сортировки антителRON6 и RON8 согласно настоящему изобретению на группы антител, способных связывать различные эпитопы. Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть моноспецифичными или биспецифичными. Биспецифичные антитела (BsAb) представляют собой антитела, которые обладают двумя разными специфичностями или сайтами связывания антигенов (см. публикацию заявки США 2004/0259156, поданной 13 февраля 2004 г.). В случае, когда антитела обладают более чем одной специфичностью, распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или более чем с одним антигеном. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены биспецифичные антитела или фрагменты антител, которые связывают два разных антигена, и при этом по меньшей мере одна специфичность направлена к RON. Специфичность антител или фрагментов антител в отношении RON может быть установлена на основании аффинности и/или авидности. Аффинность, представленная равновесной константой диссоциации антигена и антитела ("Kd"), является мерой прочности связывания между антигенной детерминантой и сайтом связывания антитела. Авидность является мерой прочности связывания между антителом и его-8 018717 антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и соответствующим антигенсвязывающим сайтом антитела, так и с валентностью антитела, соответствующей числу антигенсвязывающих сайтов конкретного эпитопа. Связывание антител обычно осуществляется с константой диссоциации(Kd), равной от приблизительно 10-5 до приблизительно 10-11 литров/моль (л/моль) (например, Kd 100 нМ). Обычно считается, что любая Kd меньше приблизительно 10-4 л/моль указывает на неспецифичное связывание. Чем ниже значение Kd, тем выше прочность связывания между антигенной детерминантой и сайтом связывания антитела. Для стимуляции иммунного ответа RON может быть выделен из различных источников, таких как клетки, которые экспрессируют RON: толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы,желудка, легкого, печени, яичника, почки, молочной железы и мозга, а также эпителиальные и нейроэндокринные клетки. Также возможно получение синтетического рецепторного пептида с использованием коммерчески доступных аппаратов и соответствующей последовательности аминокислот. Еще одна альтернатива заключается в том, что DNA, кодирующую белок RON, такую как кДНК или фрагмент кДНК,можно клонировать и экспрессировать, а полученный белок выделить и использовать в качестве иммуногена для стимуляции образования антител согласно настоящему изобретению. Для приготовления белкаRON или фрагмента такого белка, к которому получают антитела, молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует RON, или какую-либо часть RON, или какую-либо его часть, например, внеклеточные части (в частности, части альфа и бета), можно встроить в известный вектор для экспрессии в клеткехозяине с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК. Аналогичным образом могут быть получены антитела к лигандам RON, в частности MSP. Последовательности RON и его лиганда MSP находятся в публичном доступе в базе данных (номер доступа RON X70040, а номер доступа для MSP-NM 020998, оба указания включены в настоящее описание посредством ссылки), и их можно свободно использовать для получения антитела. Также могут быть получены антитела к вариантам/мутантам RON или MSP. Интерес представляют антитела к эпитопам,расположенным на внеклеточных доменах вариантов и мутантов. Было показано, что измененный рецептор RON, отличающийся внутрирамочной делецией 109 аминокислот во внеклеточном домене, конститутивно активирован (1). Могут быть получены антитела, например, к такому измененному рецепторуRON. Антитела, специфичные к RON, могут быть получены путем иммунизации млекопитающего RON. Растворимые рецепторы можно использовать в качестве иммуногенов отдельно, или после присоединения к белку-носителю или другим объектам, таким как гранулы, например гранулы из сефарозы. После того как млекопитающее выработало антитела, выделяют смесь клеток, продуцирующих антитело, таких как спленоциты. Моноклональные антитела могут быть получены путем выделения отдельных клеток,продуцирующих антитело, и иммортализации таких клеток путем, например, обеспечения их с клетками миеломы. Полученные в результате гибридомы сохраняют в культуре, и они экспрессируют моноклональные антитела, которые собирают из культуральной среды. Далее, антитела и фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть получены по стандартной гибридомной технологии (HarlowLane, ed., ANTIBODIES: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor, 211-213 (1998), Лабораторное руководство, включенное в настоящее описание посредством ссылки) с использованием трансгенных мышей, которые продуцируют тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте осуществления значительную часть генома, кодирующего антитело человека, встраивают в геном мыши, который делают дефицитным по продукции эндогенных антител мыши. Таких мышей можно иммунизировать путем подкожного (s.c.) введения RON в полном адъюванте Фрейнда. К антителам согласно настоящему изобретению можно присоединить дополнительные остатки аминокислот. Такие остатки аминокислот могут представлять собой пептидную метку, возможно, облегчающую выделение. Также предусмотрены остатки аминокислоты, направляющие антитела в определенные органы или ткани. Антитела RON согласно настоящему изобретению могут быть выделены из библиотеки фагового дисплея, такой как библиотека, конструированная из генов тяжелой цепи человека и легкой цепи человека. Например, вариабельная область согласно настоящему изобретению может быть получена из лимфоцитов периферической крови, которые содержат реорганизованный ген вариабельной области. В качестве альтернативы части вариабельной области, такие как участки CDR и FW, могут быть получены из различных последовательностей человека. Антитела, специфичные к RON, связывают RON с Kd, предпочтительно равной приблизительно 110-9 М-1 или меньше, более предпочтительно приблизительно 110-10 M-1 или меньше и наиболее предпочтительно приблизительно 110-11 M-1 или меньше. Антитела или фрагменты антител, специфичные к RON, ингибируют активацию данного рецептора. Ингибирование рецептора означает препятствование активации присущей данному рецептору киназной активности, связанной с передачей сигнала. Надежным тестом на RON является ингибирование фосфорилирования рецептора. Настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом ингибирования RON.-9 018717 Такое ингибирование может осуществляться, например, антителом, блокирующим доступность некоторых эпитопов для лиганда, или посредством изменения конформации RON таким образом, что лиганд, в частности MSP, не может активировать рецептор, даже несмотря на то, что он связывается с рецептором. В патенте США 6165464 перечислены возможные механизмы такого ингибирования, включая связывание самого лиганда, снижение активности рецептора, ингибирование тирозинкиназной активности рецептора или стимулирование цитотоксического отчета. Снижение активности может иметь место, когда у клеток, которые экспрессируют RON, в частности клеток с повышенной экспрессией (включая дифференциальную экспрессию) RON, снижается число рецепторных тирозинкиназ RON на поверхности. Активность металлопротеиназ матрикса, которые принимают участие в инвазии и метастазировании опухолевых клеток, также может снижаться под действием антител согласно настоящему изобретению. Ингибирование RON имеет различные эффекты, включая ингибирование, снижение, инактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенеза (задействование кровеносных сосудов, инвазию и метастазирование), а также подвижности и метастазирования (адгезия и способность клеток к адгезии). Настоящее изобретение также предусматривает антитела, которые связывают и инактивируют измененные (вариантные) или мутированные рецепторные тирозинкиназы RON, активные в отсутствие связывания лиганда. У млекопитающего, страдающего заболеванием, связанным с RON, возможно, например, экспрессируются и RON дикого типа, и измененный RON, при этом вариантный рецептор экспрессируется в непропорциональном количестве. Интерес представляют варианты/мутанты, отличающиеся по внеклеточному домену, такие как варианты/мутанты, содержащие делеции во внеклеточном домене, описанные Wang (1) (9). Таким образом, ингибирование RON может затрагивать RON дикого типа и/или измененный RON (точечные мутации, делеции, альтернативный сплайсинг и т.д.). Активация RON может осуществляться посредством димеризации и активации с другими RTK, такими как с-met или EGFR. Так, ингибирование RON может также включать ингибирование гетеродимеризации между RON и другими рецепторными тирозинкиназами (RTK), такими как EGFR или c-met. Такое ингибирование может также включать ингибирование передачи сигнала образованными димеромRON и EGF или c-met, например. Такая димеризация может быть индуцирована по лиганд-зависимому механизму, например, путем связывания MSP, HGF или EGF с их рецепторами и стимуляции димеризации. Одной мерой ингибирования RON является подавление тирозинкиназной активности данного рецептора. Ингибирование тирозинкиназы может быть определено хорошо известными методами; например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантной рецепторной киназы, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Так, средства анализа фосфорилирования можно применять для определения антител согласно настоящему изобретению. Фосфорилирование можно детектировать, например, с использованием антитела, специфичного к фосфотирозину в тестеELISA или в методе Вестерн-блот. Некоторые анализы на активность тирозинкиназы описаны в Panek etal., J. Pharmacol. Exp. Them. 283: 1433-44 (1997) и Batley et al., Life Sd. 62:143-50 (1998) [52]. Кроме того,для определения ингибирования RON могут быть использованы методы детектирования экспрессии белков. Такие методы включают методы иммуногистохимии (IHC) для определения экспрессии белка,флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) для детектирования амплификации генов, конкурентные методы анализа связывания с радиолигандами, методики твердофазного блоттинга, такие как Нозернблот и Саузерн-блот, полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (RT-PCR) и иммуноферментный анализ (ELISA). Другая мера ингибирования RON включает уровень фосфорилирования нижележащих субстратовRON. Соответственно, можно измерять уровень фосфорилирования MAPK или Akt, например. В одном варианте осуществления млекопитающему вводят антитело, специфичное к RON, включающее один,два, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных участков (CDR) антител согласно настоящему изобретению. В другом варианте воплощения вводимое антитело включает вариабельные области антител согласно настоящему изобретению. На фиг. 2 А-2 Е показаны последовательности антител согласно настоящему изобретению. Без конкретного теоретического обоснования считается, что RON6 и RON8 связываются с внеклеточным доменом бета RON, но такая специфичность может также возникать вследствие связывания с другими доменами RON, или в результате связывания других эпитопов того же домена. Участки CDR антител RON6 и RON8, выделенных согласно настоящему изобретению, включают Специфичные к RON функциональные варианты антител и фрагментов антител также включают полипептиды с последовательностями аминокислот, по существу, близкими последовательностям аминокислот вариабельных или гипервариабельных участков антител согласно настоящему изобретению. По существу, близкая последовательность аминокислот определена в настоящем описании как последовательность, которая имеет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере примерно 80% и более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% гомологии со сравниваемой последовательностью аминокислот, определенной методом поиска FASTA так, как описано в работе Pearson и Lipman, Proc.Natl. Acad. Sci. США 85, 2444-2448 (1988), включая последовательности, которые идентичны по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90, 95 или 99%, включая все поддиапазоны в указанных пределах. Такие антитела будут иметь идентичные или близкие характеристики связывания, блокирования лиганда и активность ингибирования рецептора как и антитела настоящего изобретения, которые имеют,по существу, те же гипервариабельные участки (CDR).- 11018717 Варианты антител и фрагментов антител, специфичных к RON, также включают антитела, включающие одну или более консервативных замен аминокислот. Консервативная замена аминокислоты определена как изменение состава аминокислот путем изменения одной, двух или более аминокислот пептида, полипептида или белка, или его фрагмента. Заменяют аминокислоты в общем с близкими свойствами (например, кислотные, основные, ароматические, одинакового размера, положительно или отрицательно заряженные, полярные, неполярные) таким образом, что замена не приводит к существенному изменению свойств пептида, полипептида или белка (например, заряд, изоэлектрическая точка, аффинность, авидность, конформация, растворимость) или активность. Типичные замены, которые можно сделать в качестве такой консервативной замены аминокислоты, могут быть среди следующих групп аминокислот: глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L) и изолейцин (I); аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (Е); аланин (А), серин (S) и треонин (Т); гистидин (Н), лизин (K) и аргинин (R): аспарагин (N) и глутамин (Q); фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W). Консервативные замены аминокислот можно осуществить, например, в участках, фланкирующих гипервариабельные участки, первоначально отвечающие за характеристики избирательного и/или специфичного связывания молекулы, а также в других частях молекулы, например, кассете вариабельной тяжелой цепи. Антитела или фрагменты антител также включают такие, для которых характеристики связывания были улучшены путем прямой мутации, методов созревания аффинности, фагового дисплея или перегруппировки цепей. Аффинность и специфичность могут быть изменены или улучшены путем изменения гипервариабельных участков и/или остатков в каркасе, и путем скрининга на антигенсвязывающие сайты, имеющие желаемые характеристики (см., например, Yang et al., J. Mol. Biol. (1995), 254: 392-403). Один такой метод состоит в случайном комбинировании отдельных остатков или комбинаций остатков таким образом,чтобы в популяции в остальном идентичных антигенсвязывающих сайтов в определенных положениях находились подмножества от двух до двадцати аминокислот. Кроме того, мутации в массиве остатков можно осуществить методами ПЦР с ошибками (см., например, Hawkins et al., J. Mol. Biol. (1992), 226: 889-96). В другом примере векторы для фагового дисплея, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, можно поместить в мутагенные штаммы E.coli (см., например, Low et al., J. Mol. Biol.(1996), 250: 359-68). Эти способы мутагенеза являются иллюстрацией многих методов, известных специалисту в данной области. Другой способ повышения аффинности антител настоящего изобретения состоит в перемешивании цепей, где тяжелую или легкую цепь произвольно спаривают с другой тяжелой или легкой цепью для получения антитела с более высокой аффинностью. Различные гипервариабельные участки антитела также можно перемешивать с соответствующими гипервариабельными участками других антител. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела или фрагменты антител, а также к векторам экспрессии, включающим такие последовательности нуклеотидов, функционально связанные с последовательностью для экспрессии. Эти нуклеотиды приведены на фиг. 1 А-1D, 2 А-2 Е и 3 А-3 Е. Также предусмотрены рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие один или более векторов экспрессии, которые экспрессируют антитела настоящего изобретения, или фрагменты антител. Также предусмотрены способы производства антител или их фрагментов, включающие выращивание этих клеток в условиях, допускающих экспрессию антител или их фрагментов. Антитела или фрагменты антител затем можно очищать от клеток или среды для культивирования клеток. Варианты нуклеотидов, приведенные на фиг. 1 А-1D, 2 А-2 Е и 3 А-3 Е включают варианты, которые кодируют антитела или фрагменты антител, имеющие ту же функцию, что и антитела согласно настоящему изобретению, т.е. блокирование или ингибирование активации RON. Такие варианты имеют последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% и более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична RON дикого типа. Настоящее изобретение также предусматривает белки слияния антител. Такие белки слияния могут кодировать последовательности нуклеотидов фиг. 1 А-1D, 2 А-2 Е и 3 А-3 Е, которые оперативно связаны с последовательностями нуклеотидов, кодирующими ферменты, флуоресцентные белки, полипептидыметки или люминесцентные маркеры и/или их сочетания. Последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению также включают (а) последовательности ДНК антител, показанные на фиг. 1A-1D, 2 А-2 Е и 3 А-3 Е; (b) любую последовательность нуклеотидов, которая (i) гибридизуется с комплементарными последовательностями нуклеотидов, приведенными в изобретении (а) при строгих условиях, например, гибридизации со связанной с фильтром ДНК в 0,5 М NaHPO4, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ EDTA при 65 С и отмывке 0,1SSC/0,1%I, Green Publishing Associates, Inc., и John Wileysons, Inc., New York, at p. 2.10.3), и (ii) кодирует антитело или фрагмент антитела, имеющие в значительной степени то же функциональное назначение; и (с) любую последовательность нуклеотидов, которая гибридизуется с последовательностью ДНК, которая кодирует последовательность антитела, показанную на фиг. 2 А-2 Е и 3 А-3 Е при менее жестких условиях,- 12018717 например, в условиях умеренной жесткости, например, отмывке в 0,2SSC/0,1% SDS при 42 С (Ausubelet al., ранее), при условии, что она кодирует антитело или фрагмент антитела, имеющий в значительной степени то же функциональное назначение. Функциональное назначение антител настоящего изобретения состоит в блокировании активации RON. Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, оперативно связанную с регуляторной последовательностью, а также к клетке-хозяину, содержащей такой вектор экспрессии. Указанные клетки-хозяева можно выращивать в некоторых условиях, обеспечивающих экспрессию антител или фрагментов антител согласно настоящему изобретению, и антитела затем можно очистить от клеток-хозяев. Для экспрессии антител согласно настоящему изобретению используют стандартные рекомбинантные методы и известные векторы экспрессии. Векторы для экспрессии белков в бактериях, в частности в Е.coli, являются известными. Такие векторы включают векторы PATH, описанные Dieckmann и Tzagoloff в J. Biol. Chem. 260, 1513-1520 (1985). Эти векторы содержат последовательности ДНК, которые кодируют антранилат синтетазу (TrpE) с полилинкером на карбоксильном конце. Другие векторные системы экспрессии основываются на бета-галактозидазе (рЕХ); лямбда-PL; мальтозосвязывающем белке(pMAL); и глутатион-S-трансферазе (pGST). См. Gene 67, 31 (1988) и Peptide Research 3, 167 (1990). Применимые для дрожжей векторы являются доступными. Пригодным примером является плазмида 2 D. Также известны векторы, пригодные для экспрессии в клетках млекопитающего. Такие векторы включают хорошо известные производные SV-40, аденовируса, последовательности ДНК - производные ретровирусов, и челночные векторы, производные от сочетания функциональных векторов млекопитающих, например, тех, что описаны выше, и функциональных плазмид и фаговой ДНК. В данной области техники известны различные эукариотические векторы (например, P.J. Southern иAcad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); G. Urlaub and L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220,(1980. Векторы экспрессии, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат по меньшей мере одну последовательность контроля экспрессии, которая функционально связана с последовательностью ДНК или фрагментом, который экспрессируется. Контрольная последовательность включена в вектор для контроля и регуляции экспрессии клонированной последовательности ДНК. Примерами применимых для контроля экспрессии последовательностей являются lac-система, trp-система,tac-система, trc-система, основной оператор и промоторный участок бактериофага лямбда, контрольный участок белка оболочки fd, гликолитические промоторы дрожжей, например промотор для 3 фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы дрожжей, например Pho5, промоторы альфафактора спаривания дрожжей, и промоторы, производные от вирусов полиомы, аденовирусов, ретровирусов и вирусов обезьян, например ранний и последний промоторы SV40, и другие последовательности,о которых известно, что они управляют экспрессией генов в клетках прокариот или эукариот и их вирусов, или их сочетания. Для использования в настоящему изобретении предусмотрены векторы (рекомбинантные и векторы для экспрессии). Например, векторы экспрессии, содержащие управляющие сигналы и ДНК, подлежащую экспрессии, например, которые кодируют антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению, встроены в клетку-хозяина для экспрессии. Некоторые применимые для экспрессии клетки-хозяева включают известные клетки прокариот и эукариот. Некоторые применяемые клетки-хозяева прокариот включают, например, Е.coli, такие как Е.coli SG-936, E.coli HB 101, Е.coli W3110, Е.coliStreptomyces. Пригодные клетки эукариот включают клетки дрожжей и других грибов, насекомых, животных, такие как клетки COS, линии клеток лимфоидного происхождения, такие как лимфома, миелома(например, NSO) и клетки СНО, клетки человека и клетки растений в культуре ткани. Предусмотрен способ получения антител. Этот способ включает культивирование клетки-хозяина,которая содержит пригодный вектор экспрессии, при этом вектор экспрессии содержит одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, например, тяжелой или легкой цепи такого антитела, или его фрагмента, или его сконструированного варианта, в условиях, допускающих экспрессию полипептида. После экспрессии в клетке-хозяине, выращиваемой в пригодной среде, экспрессируемый полипептид можно выделить из среды и очистить известными в данной области техники способами. Если полипептид или пептид не выделяется в культуральную среду, клетки-хозяева перед выделением и очисткой лизируют. Очищенным антителом является такое антитело, которое было отделено и/или выделено из компонентов своей естественной среды. Загрязняющие компоненты в их естественной- 13018717 среде, которые являются материалами, которые могут препятствовать диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества, в общем случае удаляют. Таким образом, например, моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением секретируются субклонами, которые выделяют или очищают из культуральной среды или асцитной жидкости путем стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, сорбция на протеин А-сефарозе, хроматография на гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. В другом варианте осуществления антитело по изобретению, которое является специфичным дляRON, получают путем экспрессии одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих легкие и/или тяжелые цепи, или их аналоги, которые включает антитело, в трансгенном животном, таким образом, что антитело экспрессируется и может быть выделено. Например, антитело можно экспрессировать тканеспецифическим образом, что облегчает его выделение и очистку. В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения антитело по изобретению экспрессируют в молочной железе с целью его секреции во время лактации. Трансгенные животные включают, но не ограничиваются перечисленными, мышей, коз и кроликов. Также можно использовать любую другую известную в данной области трансгенную систему, например экспрессию в белке птичьих яиц, например, куриных яиц. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим антитела кRON согласно настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может включать одно или более антител к RON: RON6 и/или RON8, приведенных в настоящем изобретении. Следует понимать, что антитела к RON согласно настоящему изобретению, используемые с целью профилактики или лечения млекопитающего, будут вводиться в форме композиции, дополнительно включающей фармацевтически приемлемый носитель. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более носителей из следующих: вода, солевой раствор,фосфатно-солевой буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут далее включать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность связанных белков. Композиции для инъекции, как хорошо известно в данной области техники, можно ввести в форму для обеспечения быстрого, непрерывного или задержанного высвобождения активного компонента после введения его млекопитающему. Термин "носитель" в настоящем патенте включает фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые нетоксичны для клеток или млекопитающего при использовании их в применяемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный раствор с буферизованным рН. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные полипептиды (менее чем приблизительно 10 остатков); белки,такие как альбумин сыворотки, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелаторы, такие как ЭДТА; сахароспирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полиэтиленгликоль (ПЭГ) иPLURONICS. Активные компоненты также можно заключать в микрокапсулы, полученные, например, путем межфазовой полимеризации, например микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли(метилметацилата), соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например,липосомах, микросферах альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Фармацевтические формы для использования с целью введения in vivo должны быть стерильными. Это условие легко выполняется с помощью фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Также можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, при этом матрицы находятся в форме формованных тел, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели(например, поли(2 гидроксиэтил метакрилат), или поли(виниловый спирт, полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, не разрушающиеся этиленвинил ацетат, разрушающиеся сополимеры молочной и гликолевой кислот, например, LUPRONDEPOT (микросферы для инъекций, сделанные из сополимера молочной и гликолевой кислот и лейпролид ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинил ацетат и полимеры молочной и гликолевой кислот, позволяют молекулам высвобождаться свыше 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в теле долгое время, они могут денатурировать или агрегировать под действием влажности при 37 С, что приводит к потере биологической активности и- 14018717 возможным изменениям иммуногенности. Для их стабилизации можно разработать рациональные стратегии, зависящие от вовлеченного механизма. Например, если обнаружено, что механизм агрегации является внутримолекулярным. Образование S-S связи происходит посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации ее можно достичь путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизированных из кислых растворов, с помощью контроля за влажностью содержимого, с использованием подходящих добавок и разработки специфичных композиций полимерных матриц. Изобретение относится к способам лечения, включающим введение млекопитающему терапевтически эффективного количества антител или фрагментов антител, специфичных к RON в виде монотерапии или в комбинации с другими способами лечения. В одном варианте осуществления настоящего изобретения млекопитающее является человеком. Такие антитела могут включать химерные, гуманизированные антитела, антитела мыши, кролика и человека, полученные различными способами. В другом варианте осуществления вводимое антитело является антителом человека. В другом варианте осуществления указанное антитело включает по меньшей мере одну последовательность гипервариабельного участкаRON6 или RON8. Состояния, при которых эти способы являются применимыми, включают опухоли,которые экспрессируют RON, воспалительные заболевания, гиперпролиферативные заболевания и заболевания печени, желчного тракта, желчных каналов, желчного пузыря и относящиеся к печеночножелчной системе. Как обсуждается в настоящем изобретении, предусмотрено, что антитела к RON согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения любого патологического состояния, включая, но не ограничиваясь ими, новообразования или другие патологии в виде монотерапии и/или в сочетании с другими терапевтическими агентами. Далее предусмотрено, что при лечении определенных состояний, например рака, антитела можно использовать в одиночку или при конъюгации с другими лекарственными агентами в качестве стратегии первичного лечения (например, в качестве первого курса лечения для пациента с первично диагностированным раком) или в качестве стратегии вторичного лечения (например,при лечении ракового пациента, которого ранее лечили другими способами, но он не дал ответа на первичный лекарственный агент или выработал к нему устойчивость). Лечение означает любое лечение заболевания млекопитающего и включает (1) предотвращение развития заболевания у млекопитающего, которое может иметь предрасположенность к заболеванию, но еще не поражено или не проявляет симптомов заболевания; например, предотвращение проявления клинических симптомов; (2) подавление заболевания, например, остановка его развития; или (3) облегчение течения заболевания, например регрессия симптомов заболевания. В способах согласно настоящему изобретению млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество антитела изобретения. Термин "вводят" в настоящем изобретении означает доставку антитела настоящего изобретения внутрь млекопитающего любым методом, который может достичь искомого результата. Антитела можно вводить, например, внутривенно или внутримышечно. Хотя антитела человека по настоящему изобретению особенно применимы для введения людям, их также можно вводить другим млекопитающим. Термин "млекопитающее" в настоящем описании включает людей, лабораторных животных, домашних животных и сельскохозяйственных животных, но не ограничивается перечисленными. "Терапевтически эффективное количество" означает количество антитела настоящего изобретения, которое при введении млекопитающему является эффективным для создания желаемого терапевтического эффекта, например, подавления киназной активности или ингибирования роста опухоли. Антитела к RON в соответствии с настоящим изобретением можно вводить для терапевтического лечения пациенту, страдающему опухолевым или связанным с ангиогенезом патологическим состоянием в количестве, достаточном для профилактики, подавления или уменьшения прогрессирования опухоли или патологического состояния. Прогрессирование включает, например, рост, инвазивность, метастазы и/или рецидивы опухоли или патологического состояния. Требуемое для выполнения этого количество определяют как терапевтически эффективную дозу. Эффективные количества для этого использования будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента. Режим дозирования также зависит от состояния заболевания и состояния пациента и обычно колеблется от единственной дозировки в болюсе или непрерывного вливания до многоразового введения за день(например, каждые 4-6 ч), или так, как предписано лечащим врачом и состоянием пациента. Следует отметить, тем не менее, что настоящее изобретение не ограничивается любой конкретной дозировкой. Пригодная доза антител согласно настоящему изобретению может быть определена на основании данных in vivo, проиллюстрированных в настоящем описании. В эксперименте in vivo использовали дозу приблизительно 1 мг/20 г каждые три дня. Средняя мышь весила приблизительно 0,02 кг и имела поверхность приблизительно 0,008 м 2. Средний человек весит приблизительно 70 кг и имеет поверхность приблизительно 1,85 м 2. Доза приблизительно 200 мг/м 2 соответствовала приблизительно 40 мг/кг для мыши и приблизительно 2,6 мг/кг для человека. Для определения этой дозы 1 раз в неделю вводили другое антитело, Erbitux, в дозировке приблизительно 250 мг/м 2, которая соответствовала приблизительно 6,5 мг/кг для человека. На основании этих вычислений и экспериментов доза для введения человеку со- 15018717 ставляет предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 8 мг/кг (1 доза в неделю). Доза может быть сходной с дозой дляErbitux, например, от приблизительно 6 до приблизительно 7 мг/кг. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что in vivo ингибирование RON антитела согласно настоящему изобретению подавляет рост опухоли. Как показано на фиг. 4D,антитело к RON подавляет клетки НТ-29, выращиваемые подкожно в бестимусных мышах. В различных вариантах осуществления рост опухоли подавляется по меньшей мере на приблизительно 20% или по меньшей мере на приблизительно 40%. Фиг. 4D демонстрирует приблизительно 50-60% снижение роста опухоли НТ-29 в течение периода продолжительностью 40 дней. Антитела к RON согласно настоящему изобретению обладают способностью блокировать, в различных вариантах осуществления, по меньшей мере приблизительно 60%, приблизительно 80% или приблизительно 100% индицируемого MSP фосфорилирования RON, MAPK и AKT (например, НТ-29,Colo205, AGS и DU145). На фиг. 5 А полосы для дорожек 1 и 3 почти идентичны, что указывает на полное блокирование фосфорилирования. Считается, что фосфорилирование MAPK и AKT важно для пролиферации (увеличения числа клеток во времени), миграции (перемещение клеток к какому-либо агенту,в частности, MSP, т.е. хемоаттракция), инвазии (способности перемещаться сквозь новую ткань) и выживания клеток. Ингибирование пролиферации прикрепленных клеток НТ-29 и Colo205 в присутствии антитела RON и 10% сыворотки может составлять от приблизительно 20% до приблизительно 30% или приблизительно 25%. Кроме того, когда клетки НТ-29 и Colo205 выращивают на мягком агаре в присутствии антитела к RON и 10% сыворотки, ингибирование образования колоний может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 80%, более типично приблизительно 75% для НТ-29, и от приблизительно 50% до приблизительно 70%, более типично 60%, для Colo205. Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что специфичные антитела к RON могут подавлять рост раковых клеток в мягком агаре и подавлять пролиферацию при выращивании прикрепленных клеток в условиях клеточной культуры. Антитело к RON может существенно снизить способность линий раковых клеток к образованию опухолей при введении путем инъекции бестимусным мышам, что демонстрирует тот факт, что ингибирование тирозинкиназного рецептора RON отрицательно влияет на пролиферацию клеток рака толстой кишки. С использованием обычных методов Вестерн-блот и поточной цитометрии было показано, что RON экспрессируется во многих линиях клеток опухолей человека: толстой кишки (НТ-29, Colo205, НСТ-116,DLD-I, Sw480, Sw620), поджелудочной железы (BxPC3, CAPAN-2, ASPC-I, HPAF-II, L3.7pl7, Hs766T),предстательной железы (DU-145, РС-3), желудка (AGS, NCI-N87), легкого (А 549, Н 596), печени (HepG2,SNU-182) и молочной железы (JIMT-1, DU4475, AU565). Соответственно, терапевтическими мишенями антитела к RON являются опухоли, образованные из клеток различных типов. Согласно настоящему изобретению можно подвергать лечению опухоли, которые включают первичные опухоли и метастатические опухоли, а также не поддающиеся лечению опухоли. Не поддающиеся лечению опухоли включают опухоли, не дающие реакции или устойчивые к лечению химиотерапевтическим агентом в отдельности, антителами в отдельности, к радиотерапии в отдельности или к их комбинациям. Не поддающиеся лечению опухоли также включают опухоли, которые по-видимому ингибируются лечением такими агентами, но рецидивируют до пяти лет, в некоторых случаях до десяти лет или дольше, после того как лечение прекращается. Согласно настоящему изобретению также можно подвергать лечению опухоли, включающие опухоли, которые не васкуляризированы, или еще не васкуляризированы существенно, а также васкуляризированные опухоли. Примеры солидных опухолей, которые можно лечить, включают карциному молочной железы, карциному легкого, колоректальную карциному, карциному поджелудочной железы, глиому и лимфому. Некоторые примеры таких опухолей включают эпидермоидную опухоль, плоскоклеточную опухоль, такую как опухоль головы и шеи, колоректальные опухоли, опухоли предстательной железы,опухоли молочной железы, опухоли легкого, включая мелкоклеточные и немелкоклеточные опухоли,опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичек и опухоли печени. Другие примеры включают саркому Капоши, неоплазмы ЦНС, нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы,менингиомы и церебральные местастазы, меланому, карциномы желудочно-кишечного тракта и почки и саркомы, рабдомиосаркомы, глиобластому, предпочтительно мультиформную глиобластому, и лейомиосаркому. В частности, терапевтический интерес представляет рак толстой кишки, поджелудочной железы,предстательной железы, желудка, легкого и печени, однако здесь предусматривается, что любые и все формы патологических состояний, включая неопластические и не неопластические заболевания, при которых введение антител согласно данному изобретению может привести к положительному терапевтическому эффекту, включены в объем данного изобретения. Указанные патологические состояния могут быть определены опытным в данной области человеком с учетом идей, изложенных здесь. Таким образом, человеческие антитела к RON могут быть эффективны при лечении пациентов с васкуляризированными опухолями или неоплазмами или ангиогенными заболеваниями. Такие опухоли и неоплазмы включают, например, злокачественные опухоли и неоплазмы, такие как бластомы, карцино- 16018717 мы или саркомы, и сильно васкуляризированные опухоли и неоплазмы. Разновидности раковых заболеваний, которые можно лечить способами согласно данному изобретению, включают, например, рак мочевого пузыря, надпочечников, семенников, центральной и периферической нервной системы, мозга,мочеполовой системы, лимфатической системы, желудка, почек, толстой кишки, гортани, легкого и костей. Неограничивающие примеры далее включают эпидермоидные опухоли, плоскоклеточные опухоли,такие как опухоли головы и шеи, колоректальные опухоли, опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы, опухоли легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточные и немелкоклеточные опухоли легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичек и опухоли печени. Способ также используют для лечения васкуляризированной раковой опухоли кожи,включая плоскоклеточную карциному, базально-клеточную карциному, и разновидности рака кожи, которые возможно лечить, подавляя рост злокачественных кератиноцитов, таких как злокачественные кератиноциты человека. Другие разновидности рака, которые возможно лечить, включают эпителиальномезенхимальные изменения (ЭМИ), саркому Капоши, неоплазмы ЦНС (нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и церебральные метастазы), меланому, гастроинтестинальную и почечную карциному, включая папиллярную карциному почки, и саркомы, рабдомиосаркому, глиобластому,включая мультиформную глиобластому, и лейомиосаркому. В другом аспекте изобретения антитела к RON ингибируют ангиогенез, связанный с опухолью. Стимуляция слизистого эндотелия рецепторной тирозикиназы связана с васкуляризацией опухолей. Обычно слизистый эндотелий стимулируется по паракринному механизму. Введение антитела к RON составляет монотерапию. В других предусмотренных вариантах осуществления может применяться комбинированная терапия, в которой антитело анти-RON вводят в комбинации с антинеопластическим агентом или другим агентом, обладающим активностью против данного патологического состояния. Антинеопластические агенты можно вводить по отдельности или в качестве конъюгата к антителуRON. Антинеопластические агенты, известные на данный момент в области или исследуемые, можно разбить на ряд классов, включающих, например, митотические ингибиторы, алкилирующие агенты, антиметаболиты, интеркалирующие антибиотики, ингибиторы факторов роста, ингибиторы клеточного цикла, ферменты, ингибиторы топоизомеразы, агенты, противодействующие выживанию, модификаторы биологической реакции, антигормоны и антиангиогенные агенты."Малая органическая молекула" согласно изобретению определяется как стандартный антинеопластический агент, например относительно небольшая биомолекула, такая как антитело или нуклеиновая кислота. Например, многие из известных антинеопластических агентов являются маленькими органическими молекулами, такими как ингибиторы топоизомеразы, среди прочих. Таким образом, варианты осуществления изобретения могут включать способы, в которых ингибитор топоизоимеразы вводят в комбинации с антителом, которое связывается с RON. Ингибиторы могут являться ингибиторами топоизомеразы I или топоизомеразы II. Ингибиторы топоизомеразы I включают иринотекан (CPT-II), аминокамптотецин, камптотецин, DX-8951f, топотекан. Ингибиторы топоизомеразы II включают этопозид(VP-16) и тенипозид (VM-26). Другие вещества на данный момент оцениваются в отношении активности ингибирования топоизомеразы и эффективности в качестве антинеопластических агентов. Все другие антинеопластические агенты с маленькими органическими молекулами, или химиотерапевтические агенты, возможно вводимые вместе с антителами согласно изобретению, могут быть алкилирующими агентами или антиметаболитами. Примеры алкилирующих агентов включают, но не ограничиваются перечисленными, цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и декарбазин. Дополнительные малые органические молекулы включают цитотоксичные и/или химиотерапевтические агенты, такие как таксол, доксорубицин, актиномицин-D, метотрексат, гемцитабин, оксиплатин, флуороурацил (5-FU), лейкоурин (LU), цисплатин, иринотекан (CPT-II), паклитаксел, доцетаксел, винбластин, эпотилон, цисплатин/карбоплатин и пегилированный адриамицин. Малые органические молекулы можно вводить в комбинациях, таких как(CPT-II; 5-FU; LU); (Паклитаксел; 5-FU) и (CPT-II; 5-FU; LU). Антинеопластические агенты также включают радиотерапию. Когда антинеопластическим агентом является радиотерапия, источник излучения может быть как внешним (наружная дистанционная лучевая терапия - НДЛТ), так и внутренним (брахитерапия - БТ) по отношению к субъекту лечения. Доза вводимого антинеопластического агента зависит от многих факторов, включающих, например, тип агента, тип и стадию развития опухоли и способ введения агента. Следует подчеркнуть, однако, что изобретение не ограничивается какой-либо определенной дозой. Излучение может использоваться в сочетании с другими антинеопластическими агентами. В другом аспекте изобретения антитела к RON или фрагменты антител могут быть химически или биосинтетически связаны с противоопухолевыми агентами или детектируемыми испускающими сигнал агентами, в особенности когда антитело интернализировано. Противоопухолевые агенты, связанные с антителом, включают любые агенты, разрушающие или наносящие вред опухоли, с которой антитело может связываться, или в окружающей среде клетки, с которой антитело может связываться. Например,противоопухолевый агент представляет собой токсичный агент, такой как химиотерапевтический агент или радиоизотоп. Подходящие химиотерапевтические агенты известны специалисту и включают антра- 17018717 циклины (например, дауномицин и доксорубицин), метотрексат, виндезин, неокарциностатин, цисплатину, хлорамбуцил, цитозин-арабинозид, 5-флуороуридин, мелфалан, рицин и калихеамицин. Химиотерапевтические агенты конъюгируются к антителу при помощи стандартных способов (см., например,Hermentin and Seiler, Behring Inst. Mitt. 82:197-215 (1988. Антитело к RON можно также вводить раковому больному с радиоизотопами. Подходящие радиоизотопы также хорошо известны специалисту в данной области. Например, может быть использован 1311 или 21 IAt. Эти изотопы прикрепляются к антителу стандартными технологиями (см., например,Pedley et al., Br. J. Cancer 68, 69-73 (1993. В качестве альтернативы противоопухолевый агент, прикрепленный к антителу, может представлять собой фермент, активирующий пролекарство, таким образом,вводится пролекарство, остающееся в инактивированной форме до тех пор, пока не достигнет очага опухоли, где оно переходит в свою цитотоксичную форму после введения комплекса антитела. На практике,конъюгат антитело-фермент вводят пациенту и обеспечивают его присутствие в области ткани, в которой предполагается осуществлять лечение. Затем пациенту вводится пролекарство, так что превращение в цитотоксичное лекарство осуществляется в области ткани, в которой предполагается производить лечение. В качестве альтернативы противоопухолевый агент, конъюгированный с антителом, представляет собой цитокин, такой как интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-4 (IL-4) или фактор некроза опухоли альфа(TNF-, ФНО-). Антитело доставляет цитокин к опухоли, так что цитоцин наносит вред или разрушает опухоль, не затрагивая другие ткани. Цитокин внедряют в антитело на уровне ДНК путем стандартных технологий рекомбинантной ДНК. Также предусмотрено использование интерферонов. Изобретение также относится к способу лечения не раковых гиперпролиферативных заболеваний у млекопитающих, включающему введение млекопитающему эффективного количества антитела по изобретению. Как указано здесь, "гиперпролиферативное заболевание" определяется как состояние, вызванное избыточным ростом не раковых клеток, экспрессирующих члены семейства рецепторов RON. Избыточные клетки, генерируемые гиперпролиферативным заболеванием, экспрессируют RON на нормальном уровне или могут чрезмерно экспрессировать RON. Различные типы гиперпролиферативных заболеваний, которые можно лечить в соответствии с изобретением, включают гиперпролиферативные заболевания, которые стимулирует лиганд RON или мутанты такого лиганда. Примеры гиперпролиферативных заболеваний включают псориаз, актиниевый кератоз и себорейный кератоз, бородавки, келоидные шрамы и экзему. Также включены гиперпролиферативные заболевания, вызываемые вирусными инфекциями, такими как инфекция вируса папилломы. Например, псориаз подходит в различных вариантах и степенях тяжести. Различные типы псориаза проявляют характерные черты, такие как гнойные очаги (гнойный псориаз), сильное шелушение кожи(эритродермальный псориаз), пятна (точечный псориаз) и гладкие воспаленные участки (инверсный псориаз). Лечение всех типов псориаза (например, psoriasis vulgaris, psoriasis pustulosa, psoriasis erythrodermica, psoriasis arthropathica, parapsoriasis, palmoplantar pustulosis) включено в настоящее изобретение. Для лечения гиперпролиферативных заболеваний введение антител согласно изобретению, как указано выше, может сочетаться с введением любого обычного лечебного агента. Например, если гиперпролиферативным заболеванием является псориаз, существует ряд доступных общепринятых системных и местных агентов. Системные агенты для лечения псориаза включают метотрексат и пероральные ретиноиды, такие как ацитретин, этретинат и изотретиноин. Другие виды системного лечения псориаза включают гидроксимочевину, NSAIDS, сульфазалазин и 6-тиогуанин. Антибиотики и антимикробные агенты могут использоваться для лечения или профилактики инфекций, которые могут вызывать обострение или ухудшение псориаза. Местные агенты для лечения псориаза включают антралин, кальципотриен, деготь, кортикостероиды, ретиноиды, кератолитики и тазаротен. Местные стероиды являются одним из наиболее распространенных агентов терапии, назначаемых при среднем и умеренном псориазе. Местные стероиды наносятся на поверхность кожи, но некоторые вводятся в очаги псориаза. Виды лечения гиперпролиферативных заболеваний далее включают введение анти-RON антител в комбинации с фототерапией. Фототерапия включает применение света любой длины волны, которая уменьшает симптомы гиперпролиферативного заболевания так же, как и фотоактивацию химиотерапевтических агентов (фотохимиотерапия). Для получения дальнейших подробностей о лечении гиперпролиферативных заболеваний см. WO 02/11677 (Teufel et al., describing treatment of hyperproliferative diseases with epidermal growth factor receptor antagonists). В настоящем изобретении любые подходящие способы и пути введения могут быть использованы для введения антитела к RON согласно изобретению, и возможно, для совместного введения других агентов, например антинеопластических агентов и/или антагонистов других рецепторов. Режимы использования антинеопластических агентов согласно изобретению включают любые режимы, предполагаемые оптимально подходящими для лечения новообразований у пациента. Различные злокачественные образования могут требовать использования специфических противоопухолевых антител и специфичных антинеопластических агентов, которые будут определены на основании данных о пациенте. Способы введения включают, например, инъекции, парентеральное введение, инфузии, пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное или внутримышечное введение. Доза вводимого антагониста зависит от многих факторов, включающих, например, тип антагониста, типа и стадии развития опухоли, и- 18018717 способа введения антагониста. Следует подчеркнуть, однако, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным способом введения. Антитела к RON, в частности для лечения рака, можно вводить с антагонистами внутриклеточнойRTK, которые ингибируют активность RTK или ассоциированных с ними downstream сигнальных элементов, которые вовлечены в процесс роста опухоли и ассоциированного с опухолью ангиогенеза. Внутриклеточные антагонисты RTK представляют собой предпочтительно малые молекулы. Некоторые примеры маленьких молекул включают органические соединения, органометаллические соединения, соли органических и органометаллических соединений, а также неорганические соединения. Атомы в маленькой молекуле соединены ковалентными и ионными связями; первая характерна для маленьких органических соединений, таких как малые молекулы ингибиторов тирозинкиназы, а вторая типична для маленьких неорганических соединений. Упорядочивание атомов в маленькой органической молекуле может представлять собой цепь, например углерод-углеродную цепь, или углерод-гетероатомную цепь, или может представлять собой кольцо, содержащее атомы углерода, например бензин или полициклическую систему, или комбинацию атомов углерода и гетероатомов, например гетероциклы, такие как пиримидин или хиназолин. Хотя малые молекулы могут иметь любую молекулярную массу, они обычно включают молекулы, которые в остальном рассматривают как биологические молекулы, за тем исключением, что их молекулярная масса не превышает 650 Да. Малые молекулы включают как природные соединения,такие как гормоны, нейромедиаторы, нуклеотиды, аминокислоты, сахара, липиды, и их производные, так и синтетические соединения, полученные как путем традиционного органического синтеза, синтеза с применением биологических компонентов, так и их сочетанием. См., например, Ganesan, Drug Discov.Today 7(1): 47-55 (Jan. 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (Dec. 2001). В одном из вариантов осуществления предполагается использовать маленькую молекулу, так как внутриклеточный антагонист RTK в соответствии с настоящим изобретением является внутриклеточным антагонистом RON, соперничающим с АТФ за присоединение к внутриклеточной области присоединения EGFR с доменом киназы или к белкам, включенным в проводящие пути передачи сигналов с активацией EGFR. Примеры таких проводящих путей передачи сигналов включают проводящий путь rasмитоген активированной протеинкиназы (MAPK), проводящий путь фосфатидилинозитал-3 киназы(Р 13 К)-протеинкиназы В (Akt), проводящий путь стресс-активированной протеинкиназы (SAPK) и проводящие пути трансдукторов сигналов и активаторов транскрипции (STAT). Неограничивающие примеры белков, включенных в такие проводящие пути (и к которым в соответствии с настоящим изобретением может присоединиться маленькая молекула антагониста RON), включают GRB-2, SOS, Ras, Raf,MEK, MAPK и металлопротеиназы матрикса (ММР). Способ лечения согласно настоящему изобретению, в частности рака, можно также осуществлять в сочетании с введением других антител. Например, антитело-антагонист EGFR, такое как Erbitux (цетуксимаб), также можно вводить, в частности, при лечении рака толстой кишки. Erbitux MAb является рекомбинантным, химерным человек/мышь, моноклональным антителом, которое специфично связывается с внеклеточным доменом человеческого EGFR. Erbitux является антагонистом EGFR, который блокирует лиганд, связывающийся с EGFR, предотвращает активацию рецептора и ингибирует рост опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR. Erbitux был одобрен для использования в комбинации с иринотеканом или самостоятельно при лечении пациентов с метастатической раковой опухолью толстой кишки, экспрессирующей рецептор эпидермального фактора роста, которые не чувствительны или не переносят химиотерапию на основе иринотекана. Erbitux также показал свою эффективность в лечении псориаза. В дополнение к Erbitux могут быть использованы другие антитела, такие как антителоVEGFR, антитело IGF-IR, антитело PDGFR и антитело PDGFR. Другие антитела для использования в комбинации включают герцептин (трастузумаб) (против клеток рака молочной железы, экспрессирующих HER2, или экспрессии HER2 на других раковых клетках) иAvastin (бевацизумаб) (антитела, ингибирующие ангиогенез). Другие антитела для применения в комбинации и антитела, специфично связывающиеся с человеческим инсулиновым фактором роста-1(IGFR), включая антитела 2F8 и А 12, как описано, например, в опубликованной международной заявке на патент WO 2005/016970, опубликованной 24 февраля 2005 г. (см., например, с. 18, табл. 1), которые имеют следующие последовательности CDR: Способы лечения, описанные в настоящем патенте, также можно осуществлять с введением других пептидов. Например, можно вводить варианты MSP в тех случаях, когда такие варианты связываются сRON, но не активируют RON, или, по меньшей мере, конкурентно ингибируют MSP. См., например,публикацию заявки на патент США 2003/0073656. Введение антител к RON с другими антителами и/или малыми органическими молекулами можно осуществлять одновременно, или раздельно, одним или разными путями. Антитела к RON согласно настоящему изобретению можно вводить с антагонистами RON и/или антагонистами других RTK, такими как антитела, которые блокируют лиганды RTK или ингибируютRTK иным образом. Примеры таких других RTK включают EGFR, c-met и VEGFR. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к RON используют в комбинации с антагонистом VEGFR. Например, антагонист VEGFR IMC-18F1 описан в Wu, et al., Clin CancerRes; 12(21) 6573-6584 (2006). В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к RON используют в комбинации с антагонистом рецептора, который специфичным образом связывается с рецептором VEGFR-2/KDR (PCT/US92/01300, подана 20 февраля 1992 г.; Terman et al., Oncogene 6: 16771683 (1991. В другом варианте осуществления антитело к RON вводят в комбинации с антагонистом рецептора, который специфичным образом связывается с рецептором VEGFR-I/Fit-I (Shibuya M. et al.,Oncogene 5, 519-524 (1990. Особенно предпочтительными являются антигенсвязывающие белки, которые связываются с внеклеточным доменом VEGFR-1 или VEGFR-2 и блокируют связывания лиганда(VEGF или PIGF), и/или ингибируют активацию, индуцируемую VEGF или PIGF. Например, MAT IMC1121 связывается с растворимым и экспрессируемым на поверхность клетки KDR. МАТ IMC-1121 включает области VH и VL, полученные из библиотеки Fab человека на фаговом дисплее (см. WO 03/075840). В другом примере ScFv 6.12 связывается с растворимым и экспрессируемым на поверхность клетки Fit-I.ScFv 6.12 включает области VH и VL моноклонального антитела мыши MAb 6.12. Известна линия клеток гибридомы, продуцирующих MAb 6.12, о которой писали Wang et al., Blood 104(9), 2893-2902 (2004). Другим примером таких RTK является рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGFR). В клетках определенных опухолей ингибирование функции RTK может компенсироваться активацией путей передачи сигнала с участием других факторов роста, в частности, путем стимуляции RON. Кроме того,ингибирование передачи сигнала через IGFR приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к некоторым терапевтическим агентам. Стимуляция одного из RON или IGFR приводит к фосфорилированию обычных сигнальных молекул ниже по пути передачи сигнала, включая Akt и р 44/42, хотя и в разной степени. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антагонист IGFR (например, антитело, которое связывает IGF или IGFR и подавляет данный рецептор) вводят одновременно с антителом согласно настоящему изобретению, что обеспечивает блокирование второго входа общего нижележащего пути передачи сигнала (например, ингибирование активации Akt и/или р 44/42). Примером антитела человека, специфичного в отношении IGFR, является IMC-A12 (см.WO 2005/016970). Другой рецептор, который может быть мишенью в комбинации с RON, представляет собой EGFR.EGFR может быть мишенью для антитела, такого как описанное выше Erbitux, или небольшой органической молекулы. Одним из примеров небольшой молекулы-антагониста RTK является IRESS A (ZD 1939), которая представляет собой производное хиназолина, функционирующее в качестве миметика АТФ, ингибирующего EGFR. См., например, заявку на патент США 5616582 (Zeneca Limited);WO 96/33980 (Zeneca Limited), с. 4; см. также, Rowinsky et al., Abstract 5, представленный на 37-й ежегодной встрече ASCO, San Francisco, CA, 12-15 мая 2001; Anido et al., Abstract 1712, представленный на 37-й ежегодной встрече ASCO, San Francisco, CA, 12-15 мая 2001 г. Другим примером малых молекул антагонистов EGFR является TARCEVA (OSI-774), представляющая собой производное 4(замещенный фениламино)хиназолина[6,7-бис-(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-ил]-(3 этинилфенил)амингидрохлорид, являющееся ингибитором EGFR. См. WO 96/30347 (Pfizer Inc.), напри- 20018717 мер, на с. 2, строка 12 по с. 4, строка 34, и с. 19, строки 14-17. См. также Moyer et al., Cancer Res., 57: 4838-48 (1997); Pollack et al., J. Pharmacol, 291: 739-48 (1999). TARCEVA может ингибировать фосфорилирование EGFR и нижележащих каскадов передачи сигнала с участием PI3/Akt и MAP (митогенактивируемый белок), что приводит к опосредуемой р 27 блокировке клеточного цикла. См. Hidalgo et al.,Abstract 281, представленный на 37-й ежегодной встрече ASCO, San Francisco, CA, 12-15 мая 2001 г. Описанные выше малые молекулы также могут ингибировать RON. Другие примеры рецепторов к факторам роста, участвующих в образовании опухоли, представляют собой рецепторы к тромбоцитарному фактору роста (PDGF), фактору роста нервов (NGF) и фактору роста фибробластов (FGF). Такие рецепторы можно вводить в комбинации с RON. В другом варианте осуществления антитела к RON можно вводить в комбинации с одним или более подходящими вспомогательными агентами, такими как, например, цитокины (например, IL-10 и IL-13),или другие иммуностимуляторы, такие как, без ограничения, хемокины, опухоль-ассоциированные антигены и пептиды. В комбинированной терапии антитело к RON вводят перед, во время, по существу одновременно с или после применения другого агента, а также в любой комбинации условий, т.е. перед и после, во время и после или перед, во время и после применения антинеопластической терапии. Например, антитело кRON можно вводить за от 1 до 30 дней, или от 3 до 20 дней, или от 5 до 12 дней перед применением лучевой терапии. В одном варианте осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент вводят одновременно или после лечения антителом. Настоящее изобретение также относится к антителам к RON или фрагментам таких антител, к которым присоединена нацеливающая группа или репортерная молекула. Нацеливающая группа является одним из членов пары связывающихся молекул. В качестве примера, противоопухолевый агент конъюгируют со вторым членом такой пары и таким образом направляют в сайт, в котором связывается антигенсвязывающий белок. Обычным примером такой пары связывающихся молекул являются авидин и биотин. В предпочтительном варианте осуществления биотин конъюгирован с антигенсвязывающим белком согласно настоящему изобретению и, таким образом, обеспечивает мишень для противоопухолевого агента или другой молекулы, которая конъюгирована с авидином или стрептавидином. В качестве альтернативы биотин или другую подобную молекулу связывают с антигенсвязывающим белком согласно настоящему изобретению и используют в качестве репортера, например, в диагностической системе, в которой агент, обеспечивающий детектируемый сигнал, конъюгирован с авидином или стрептавидином. Агенты, обеспечивающие детектируемый сигнал, можно использовать in vivo и in vitro в диагностических целях. Обеспечивающие сигнал агенты порождают измеряемый сигнал, который можно детектировать внешними средствами, обычно путем измерения электромагнитного излучения. Обычно агент,обеспечивающий сигнал, представляет собой фермент или хромофор, или испускает свет по механизму флуоресценции, фосфоресценции или хемилюминесценции. Хромоформы включают красители, которые поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой области, и могут быть субстратами или продуктами разрушения в реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, в объем настоящего изобретения включено применение настоящих антител in vivo и invitro в диагностических и исследовательских методах, хорошо известных в данной области. Диагностические методы включают наборы, которые содержат антитела согласно настоящему изобретению. Такие наборы могут быть пригодны для идентификации лиц, для которых существует риск развития некоторых видов рака, путем детектирования повышенной экспрессии RON на поверхности клеток таких лиц. Дополнительно, антитела согласно настоящему изобретению благодаря своей способности выявлять RON могут быть использованы в лаборатории для исследовательских целей. Настоящее изобретение также включает наборы, например наборы для подавления роста опухоли и/или ангиогенеза, связанного с опухолью, включающие терапевтически эффективное количество антитела человека к EGFR. Такие наборы могут дополнительно включать любой подходящий антагонист,например, другого рецептора фактора роста, вовлеченного в опухолегенез или ангиогенез (например,VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2, PDGFR, IGFR, NGFR, EGFR, FGFR и т.д., как описано выше). В качестве альтернативы или дополнения, наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать антинеопластический агент. Примеры подходящих антинеопластических агентов в контексте настоящего изобретения приведены в данном описании. Наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать вспомогательный агент; примеры также были описаны выше. Настоящее изобретение далее относится к способу идентификации и выделения антител, обладающих теми же функциональными особенностями, что и RON6 или RON8, или фрагментов таких антител, в которых скрининг библиотеки включает обеспечения аффинной матрицы, на которой расположен RON,обладающий функцией связывания лиганда, связанный с твердой подложкой, осуществление контакта аффинной матрицы с библиотекой фрагментов антител и отделение тех фрагментов антител, которые связываются с аффинной матрицей, от тех антител, которые не связываются с аффинной матрицей. Твердая подложка обозначает неводный матрикс, к которому может прикрепляться RON. Примеры твердых фаз включают фазы, полностью или частично состоящие из стекла (например, стекло с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливи- 21018717 нилового спирта или силикона. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от контекста твердые фазы могут также включать лунку или планшет для анализа; в других твердая фаза представляет собой колонку для очистки (например, колонку для аффинной хроматографии). Этот термин также включает не непрерывные твердые фазы, состоящие из дискретных частиц, такие как описаны в патенте США 4275149. Настоящее изобретение также относится к способам лечения, в которых используют антитело кRON, отличное от представленного в настоящем описании. В настоящем описании подробно описаны некоторые варианты осуществления изобретения. Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на эти конкретные варианты осуществления, очевидно, что настоящее изобретение не ограничено указанными конкретными вариантами реализации. Напротив,предполагается, что объем изобретения охватывает альтернативы, модификации и эквиваленты изобретения, определенного в формуле изобретения. В настоящем описании приведены многочисленные частные подробности, обеспечивающие лучшее понимание настоящего изобретения. Настоящее изобретение может быть осуществлено без одной из или без всех из указанных конкретных деталей. В других примерах известные процессы и операции не были подробно описаны, чтобы не препятствовать пониманию изобретения. Все упомянутые выше патенты США, публикации заявок на патент США, заявки на патент США, а также иностранные патенты, опубликованные заявки на иностранные патенты и иностранные заявки на патенты полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Все публикации, цитируемые в настоящем описании, ссылаются на опыт специалиста в области, к которой относится изобретение. Все такие публикации полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, в той же мере как если бы для каждой отдельной публикации было конкретно и отдельно указано, что она включена посредством ссылки. Примеры Приведенные ниже примеры представлены исключительно с целью иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Примеры не включают подробное описание традиционных методов, например, тех, которые используют для создания векторов и плазмид, вставки генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы и плазмиды или введения плазмид в клетку-хозяина. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных публикациях,включая Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Maniatis, Т. (1989). Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Материалы и методы. Получение и свойства двух антител к RON: RON6 и RON8. Пример 1. Получение антител к RON. Человеческие моноклональные антитела к RON (в настоящем описании RON6 и RON8) получали с помощью стандартных гибридомных методик (HarlowLane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor, 211-213 (1998), включено в настоящее описание посредством ссылки) с использованием мышей HuMAb (Medarex, San Jose, Calif.), которые продуцируют гамма-тяжелые и каппа-легкие цепи иммуноглобулина человека. Мышей HuMAb подкожно иммунизировали фрагментом внеклеточного домена RON, клетки RE7 и MDCK, экспрессирующие рецептор RON человека в полном адъюванте Фрейнда. Животным трижды внутрибрюшинно вводили одинаковый белок RON в неполном адъюванте Фрейнда перед слиянием. Животным давали отдохнуть в течение месяца перед тем, как ввести i.p. конечную дозу 25 мкг белка RON в фосфатном буфере (PBS). Спустя 4 дня из иммунизированных мышей выделяли спленоциты и объединяли их с Bcl-2 трансфектантами плазмоцитомных клеток Р 3-Х 63Ag8.653 с помощью полиэтиленгликоля (PEG, MW: 1450 KD). После слияния клетки ресуспендировали в среде HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой(FBS), и помещали в 96-луночные планшеты в плотности 200 мкл на лунку для получения гибридомных клеток. Спустя 6 дней после слияния 100 мкл среды удаляли и заменяли на 100 мкл свежей среды. Следует отметить, оказалось, что 180 клонов гибридом после одного слияния продуцировали антитела, взаимодействующие с белком rhu-RON. Из 180 положительных клонов только 5 оказывали блокирующее действие. Из этих 5 для дальнейшей разработки отобрали только 2, RON6 и RON8, на основе повышенной способности к специфичному связывания. Трижды проводили субклонирование этих клонов гибридом, оказывающих блокирующее действие,для получения моноклональных гибридомных клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела (МАТ), направленные против RON. Далее проводили селекцию клонов, оказывающих блокирующее действие, на повышенную блокирующую активность. Клоны, обозначенные как RON6 и RON8, обладали большей блокирующей активностью с IC50 2-3 нМ, как определили с помощью ELISA, и высоким сродством (Kd=45 и 23 пМ соответственно). Эти два клона отобрали для дальнейшей разработки. Антитела RON6 и RON8 представляют собой IgG антитела, их соответствующие тяжелые и легкие цепи были просеквенированы. Со структурой каждого антитела можно ознакомиться на приложенных- 22018717 фигурах и соответствующих последовательностях, приведенных ниже. Структура RON6. Антитело RON6 содержит две тяжелые цепи, изображенные на фиг. 2 А-2 С, которые в совокупности иллюстрируют SEQ ID NO: 10, которые кодируются последовательностью ДНК SEQ ID NO: 9. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 2 А представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела. Антитело RON6 также содержит две легкие цепи, изображенные на фиг. 2D-2 Е, которые в совокупности иллюстрируют SEQ ID NO: 12, которые кодируются последовательностью ДНК SEQ ID NO: 11. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 2D представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела. Структура RON8. Антитело к RON8 включает две тяжелые цепи, изображенные на фиг. 3 А-3 С, которые в совокупности иллюстрируют SEQ ID NO: 14, которые кодируются последовательностью ДНК SEQ ID NO: 13. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 3 А представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела. Антитело к RON8 также содержит две легкие цепи, изображенные на фиг. 3D-3 Е, которые в совокупности иллюстрируют SEQ ID NO: 16, которые кодируются последовательностью ДНК SEQ ID NO: 15. Следует отметить, что первые 19 остатков/кодонов на фиг. 3D представляют собой сигнальную секреторную последовательность, которая не входит в состав цепи зрелого антитела. Пример 2. Антитела к RON из примера 1 связываются с RON и подавляют связывание RON с его лигандом (MSP).ELISA на связывание: спустя 10-12 дней после слияния проводили скрининг гибридом на предмет продукции антител и избирательное связывающее действие супернатанта культуры с белком rh-RON в анализах по связыванию и блокированию ELISA. Maxi-sorp 96-луночные микротитровальные планшеты(Nunc) покрывали белком rh-RON (1 мкг/мл 100 мкл) (RD Systems) при КТ в течение 1,5 ч. После отмывания планшетов их блокировали 3% PBS на молоке. Затем антитела к RON, полученные из супернатантов гибридом, добавляли в покрытые лунки и инкубировали в течение 1,5 ч при RT (КТ). После нескольких отмывок в лунки добавляли разведения 1:1000 антител к IgG человека, конъюгированных сHRP, в течение 1,5 ч при RT для определения положительного связывания. Далее положительные гибридомы трижды клонировали с помощью метода предельного разведения для получения моноклональных гибридом.ELISA для определения антител, которые блокируют взаимодействие MSP/RON: Maxi-sorp 96 луночные микротитровальные планшеты (Nunc) покрывали (1 мкг/мл 100 мкл) MSP (RD Systems) приRT в течение 1,5 ч. После отмывки планшеты блокировали 3% PBS на молоке. Антитела к RON, выделенные из супернатантов гибридом, первоначально инкубировали на протяжении 1 ч при КТ с rh-RON и затем добавляли в лунки, покрытые MSP. Спустя 1,5 ч инкубации RT с последующими отмывками, в планшеты добавляли разведение 1:1000 антител к IgG человека, конъюгированных с HRP в течение 1,5 ч при RT для того, чтобы определить, какое антитело к RON может блокировать взаимодействиеELISA для определения RON8, блокирующих связывание MSP с RON: планшеты для ELISA покрывали MSP (100 нг/лунка) без носителя (RD Systems) в течение ночи при 4 С на шейкере. Планшеты отмывали 0,2% PBS/T и в течение 2 ч при 37 С блокировали 3% молоком (150 мкл/лунка). Готовили разведения RON8 15 мкг/мл и последовательно распределяли по другому планшету для ELISA. К RON8 добавляли человеческий рекомбинантный MSPR в количестве 100 нг/лунка (RD Systems). КомплексRON8/rh-MSPR формировался в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере. Затем планшеты для ELISA, покрытые MSP, отмывали 0,2% PBS/T и в каждую лунку добавляли по 100 мкл комплексаRON8/rh-MSPR. После 1,5-часовой инкубации при комнатной температуре планшеты пять раз отмывали 0,2% PBS/T и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с разведениями 1:2000 антитела кHis-метке HRP (Sigma), которое узнает His метку на рекомбинантном человеческом белке MSPR. Планшет отмывали 5 раз 0,2% PBS/T, и в лунки добавляли субстрат 100-AL до получения желтого цвета. Реакцию останавливали 50 мкл 1N H2SO4 и измеряли поглощение при 450 нм на стандартном планшетном считывающем устройстве. Результаты представлены на фиг. 6 А, на которой представлены блокирующие свойства твердой фазы RON8. С помощью ELISA определили значение IC50 для RON8, которое необходимо для того, чтобы блокировать взаимодействие рекомбинантного человеческого белка RON с иммобилизованным рекомбинантным человеческим MSP.- 23018717 Миграция клеток. Для того чтобы определить, способно ли RON8 блокировать миграцию клеток рака легкого Н 596 (АТСС, Manassas, VA), вызванную MSP, использовали 24-луночные вставки в клеточные культуры, содержащие пористые прозрачные полиэтиленовые терефталатные трековые мембраны(размер пор 8,0 A; Becton Dickinson Falcon). Перед проведением анализа нижнюю сторону пористых мембран покрывали коллагеном, помещая мембраны в 24-луночные планшеты Falcon, заполненные 700 мкл раствора очищенного коллагена Vitrogen-100 (25 мкг/мл; Cohesion, Palo Alto, CA). Вставки оставляли в течение 1 ч при 4 С и затем помещали в новый 24-луночный планшет. Затем 6105 жизнеспособных клеток, которые в течение 24 ч подвергали бессывороточному голоданию, однократно промывали ФБР(PBS), после чего сеяли в верхнюю камеру вставки в клеточную культуру в 300 мкл бессывороточной среды. В нижнюю камеру в 700 мкл бессывороточной среды добавляли MSP в течение 24 ч при 37 С для того, чтобы вызвать миграцию клеток через покрытую коллагеном пористую мембрану. 0% сыворотку использовали в качестве негативного контроля и 10% сыворотку использовали в качестве положительного контроля миграции клеток. Перед добавлением MSP в некоторые из верхних камер добавляли RON8 на протяжении 1 ч, для того чтобы определить, способен ли он подавить миграцию Н 596 клеток, вызванную MSP. В заключение анализа, мигрировавшие клетки, прикрепившиеся к нижней стороне мембраны,покрытой коллагеном, окрашивали красителем Хехст (2 мкг/мл; Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad,CA), анализировали препараты с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении 100 и считали клетки с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus. Фиг. 6 В иллюстрирует способность RON8 подавлять миграцию клеток рака легкого Н 596. Способность RON8 подавлять миграцию в In Vitro анализе заживления ран. На монослой клеток рака легкого H292 наносили царапину. Добавляли RON8 для того, чтобы определить, может ли он подавлять способность MSP вызывать миграцию клеток для того, чтобы заполнить рану. Клетки рака легкого Н 292 сеяли при плотности 2,5105 клеток/лунка в 6-луночный планшет Becton Dickinson Falcon и оставляли расти в течение ночи для достижения монослоя. Клетки выдерживали в бессывороточной среде в течение 48 ч. Перед добавлением MSP некоторые клетки предварительно инкубировали с антителомRON8 в течение 1 ч до нанесения раны. В начале анализа кончиком пластиковой пипетки на 200 мкл наносили небольшую ранку. Затем клетки инкубировали в течение 24 ч в присутствии или в отсутствиеMSP в бессывороточной среде с антителом RON8. 0% сыворотку использовали в качестве негативного контроля, 10% сыворотку использовали в качестве положительного контроля миграции клеток в рану. После 24-часовой инкубации клетки анализировали с помощью микроскопии в светлом поле при увеличении 40. Наблюдали, что 100 нМ RON8 подавляют миграцию клеток для заполнения раны, благодаря чему показали способность RON8 подавлять миграцию клеток на модели in vitro. Способность RON8 подавлять пролиферацию. Фиг. 6 С иллюстрирует подавление RON8 синтеза ДНК, вызванного MSP, в клетках рака поджелудочной железы. Фиг. 6C(1) показывает стимуляцию MSP включения [3H]-тимидина, которое является мерой синтеза ДНК. Опухолевые клетки (10000 на лунку) помещали в 96-луночные планшеты для тканевых культур и оставляли в покое. В течение 20 ч клетки стимулировали MSP. В каждую лунку добавляли [3 Н]-тимидин (0,25 mCi) и инкубировали еще 4 ч. Радиоактивность встроенной ДНК определяли с помощью счетчика люминесценции. Точки, среднее из двойной выборки, полоски, стандартное отклонение. На фиг. 6C(2) показана система, в которой клетки предварительно обрабатывали RON8 в течение 1 ч перед добавлением MSP. Анализ BIAcore. Кинетику связывания антител с белками определяли с помощью BIAcore 3000(BIAcore, Piscataway, NJ). Рекомбинантный RON-Fc иммобилизовали на сенсорном чипе и вводили антитела в различных концентрациях. Получали сенсорграммы и с помощью BIA Evaluation 2.0 анализировали их на программном обеспечении для определения констант скорости. Константу сродства, KD, вычисляли из соотношения констант Koff/Kon. "Kon, M-1.S-1 и "Koff, S-1" скорости взаимодействия использовали для определения сродства (Kd, M) взаимодействия антитело/рецептор. Скорости Kd, Kon и Koff RON6 составили 4,1 е-11, 2,2 е 6 и 8,6 е-5. Для RON8 они составляли 3,2 е-11, 6.1 е 6 и 2,0 е-4. Поточная цитометрия для экспрессии RON поверхности клетки. 1 млн клеток прикрепленных линий опухолевых клеток инкубировали в PBS+5% FCS в течение получаса с 5 мкг RON8 при 4 С. После отмывки PBS+5% FCS, клетки инкубировали со вторыми антителами против IgG человека, конъюгированными с фикоэритрином (Jackson Immuno Research), в течение 30 мин при 4 С. После отмывкиPBS+5% FCS клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на проточном цитометре FACSvantage SE (Becton Dickinson). Вестерн-блоттинг и иммунопреципитация. Клетки сеяли в 10-см или 6-луночные чашки для культивирования и выращивали до плотности 70-80%. Монослой дважды отмывали PBS и оставляли в бессывороточной среде в течение ночи. Затем добавляли антитела и инкубировали при 37 С 60-120 мин. Клетки стимулировали MSP лигандом 10 мин и затем помещали на лед и отмывали ледяным PBS. Клетки лизировали 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом, 0,5 мМ Na3VO4, 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина и 1 мкг/мл апротинина на льду в течение 10 мин. Лизат очищали центрифугированием при 4 С. Затем проводили иммунопреципитацию растворимого RON из лизата. Антитело к RON, клон С-20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,- 24018717CA) или RON6 и RON8 инкубировали с 400 мкл лизата 4 мкг/мл в течение ночи при 4 С. Иммунные комплексы осаждали добавлением белковых бусин А-агарозы в течение 1 ч при 4 С, осаждали центрифугированием и трижды отмывали лизирующим буфером. Иммунопреципитаты, связавшиеся с белковыми бусинами А-агарозы, вносили в буфер для образца денатурирующего геля. Проводили денатурирующий гель-электрофорез лизатов иммунопреципитатов в 4-12% акриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью Вестерн-блоттинга. Фосфорилированный по тирозину белок определяли на отпечатках с помощью антитела против фосфо-RON (Biosource) и вторых антител антимышиных с пероксидазой хрена. RON определяли с помощью моноклональных антител RON C-20 (SantaCruz Biotechnology. Фосфо-Akt и общие Akt антитела получали из PharMingen (BD Biosciences, SanDiego, CA). Для фосфорилирования MAPK, у Cell Signaling Technology приобретали фосфо-р 44/42 и общие р 44/42 антитела. Полоски визуализировали с помощью хемилюминесцентного реагента (AmershamPharmacia Biotech) на рентгеновской пленке (Eastman Kodak, Rochester, NY).ELISA для определения IC50 и ED50. Способность антител к RON, RON6 и RON8 связываться с человеческим рекомбинантным рецептором RON и блокировать взаимодействие MSP/RON определяли с помощью ELISA. С рецептором, иммобилизированным на планшете для ELISA, значения ED50 для связывания RON6 и RON8 с RON составили 4,2 пМ и 2,1 пМ соответственно. С помощью аналогичногоELISA проверяли два антитела по их способности блокировать взаимодействия MSP/RON. Определенные значения IC50 составили 46 пМ для RON6 и 62 пМ для RON8. Модель ксенотрансплантата опухоли человека. Ксенотрансплантаты опухоли получали посредством подкожных инъекций 5106 клеток, смешанных с Matrigel (Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA), в левый бок 5-6-недельных бестимусных самок мышей (nu/nu) (Charles River Laboratories,Wilmington, MA). Дожидались, пока опухоли достигнут 150-300 мм 3 в объеме, после чего мышей делили на 3 группы по 12 в каждой. Ежедневно в течение 3 дней мышам внутрибрюшинно вводили контрольное антитело (IgG человека) или антитела RON6 и RON8. Обработка животных продолжалась в течение исследования. Два раза в неделю опухоли измеряли циркулем и определяли объем опухолей по следующей формуле: (/6 (w1w2w2, где w1 - максимальный диаметр опухоли и w2 - минимальный диаметр опухоли. Объем опухолей анализировали с помощью U критерия Манна-Уитни и программы SigmaStat (версия 2.03; Jandel Scientific, San Rafeal, CA). Пример 3. Подтверждение подавления опухоли на модели ксенографта опухоли человека. Эффективность антител RON6 и RON8 в подавлении роста опухоли in vivo подтвердили на четырех различных опухолевых клетках с применением метода ксенографта мыши, описанного выше в примере 2. Использовали следующие клетки: клетки Н-292, выделенные из опухоли легкого, полученные из Американской коллекции культур (Manassas, VA). НТ-29 клетки, выделенные из опухоли прямой кишки,полученные из Американской коллекции культур (Manassas, VA). BxPC3 клетки, выделенные из опухоли поджелудочной железы и полученные из Американской коллекции культур (Manassas, VA). JIMT клетки,выделенные из опухоли молочной железы и полученные из Американской коллекции культур (Manassas,VA). С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки Н-292 вводили 24 мышам. 12 мышам вводили антитело к RON6 в количестве 60 мг/кг и 12 вводили физиологический раствор, как контроль. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4 А. Также эксперимент проводили на 40 мышах, поделенных на 4 группы, которым вводили физиологический раствор и антитело к RON8 в количестве 60, 20 и 2 мг/кг соответственно. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4 В. Как следует из фиг. 4 В, этот эксперимент также подтверждает, что ответ усиливается с дозой антитела. С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки НТ-29 вводили 24 мышам. 12 мышам вводили антитело к RON6 в количестве 60 мг/кг и 12 вводили физиологический раствор. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4 С. Аналогичные эксперименты также проводили с другой группой на 40 мышей, которых разделили на 4 группы, которым вводили физиологический раствор или антитело к RON8 в количестве 60 мг/кг, 20 мг/кг и 2 мг/кг соответственно. Наблюдали значительное подавление объема опухоли по сравнению с контролем, как показано на фиг. 4D. Как следует из фиг. 4D, этот эксперимент также подтверждает, что ответ усиливается с дозой антитела. С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки BxPC3 вводили всего 60 мышам. Мышей разделили на 5 групп по 12 в каждой и вводили им соответственно: физиологический раствор, 60 мг/кг RON8, 60 мг/кг Erbitux (полученный от ImClone Systems, Inc.), 60 мг/кг RON8 и 60 мг/кг Erbitux и 60 мг/кг Erbitux и 60 мг/кг hulgG (контроль IgG, полученный из Meridian Life Sciences). Результаты,отображенные на фиг. 4 Е, подтверждают, что RON8 усиливает противоопухолевый эффект Цетуксимаба на модели BxPC3 (р=0,06 односторонний анализ ANOVA). С помощью метода ксенографта, описанного выше, клетки JIMT-1 рака молочной железы подкожно вводили голым мышам и позволяли опухоли достигать размеров приблизительно 250 мм 3. Наносили на график объем опухоли в процессе лечения, которое включало контроль (физиологический раствор),- 25018717RON8 (60 мг/кг, дважды в неделю), доцетаксел или сочетание доцетаксела и RON8. Получили среднее+/- погрешность среднего. Результаты, отображенные на фиг. 4F, подтверждают, что RON8 подавляет рост ксенографтов опухоли молочной железы у голых мышей на модели JIMT-1. Цитируемые публикации 1) Wang, М.Н., Kurtz, A.L., Chen, Y. (2000b). Identification of a novel splicing product of the RON receptor tyrosine kinase in human colorectal carcinoma cells. Carcinogenesis 21, 1507-1512. 2) Leonard, E.J., Danilkovitch, A. (2000). Macrophage stimulating protein. Adv. Cancer Res. 77, 139-167. 3) Skeel, A., Leonard, E.J. (1994). Action and target cell specificity of human macrophage-stimulating protein (MSP). J. Immunol. 152, 4618-4623. 4) Leonard, E.J., Skeel, A. (1976). A serum protein that stimulates macrophage movement, chemotaxis and