Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
Формула / Реферат
1. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полную идентичность последовательности с SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157 или SEQ ID NO:161, или ее ферментативно активный фрагмент,
где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, имеющий активность целлюлазы, и идентичность последовательностей необязательно определяется посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки;
и необязательно алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритм BLAST version 2.2.2, где настройки фильтра настраиваются как blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F и все остальные опции настраиваются по умолчанию, или
(b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, имеющий последовательность, как приведено в SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152 или SEQ ID NO:154, или ее ферментативно активный фрагмент, или
(c) последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную (а) или (b);
где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя активность целлобиогидролазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя активность бета-глюкозидазы или маннаназы; активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоцеллюлазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз глюкана с получением более низкомолекулярного полисахарида или олигомера; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза 1,4-бета-D-гликозидных связей; необязательно активность эндоцеллюлазы включает в себя активность эндо-1,4-бета-эндоцеллюлазы; активность по отношению к 1,4-бета-D-гликозидной связи необязательно включает в себя гидролиз 1,4-бета-D-гликозидной связи в целлюлозе, производном целлюлозы, лихенине или зерновой культуре; производное целлюлозы необязательно включает в себя карбоксиметилцеллюлозу или гидроксиэтилцеллюлозу; зерновая культура необязательно содержит бета-D-глюкан или ксилоглюкан; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей глюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей бета-1,4- и/или бета-1,3-глюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей эндоглюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза эндо-1,4-бета-D-глюкан 4-глюканогидролазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних связей эндо-бета-1,4-глюканазы и/или связей бета-1,3-глюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних бета-1,3-глюкозидных связей; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих глюкопиранозу; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих 1,4-бета-глюкозидсвязанные D-глюкопиранозы; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы, производного целлюлозы или гемицеллюлозы; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы или гемицеллюлозы в древесине или бумажной пульпе или в продукте из древесины или бумаги; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в корме, пищевом продукте или напитке; корм, пищевой продукт или напиток необязательно включают в себя корм для животных на основе зерновых культур, сусло или пиво, тесто, фрукт или овощ; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в микробной клетке, в клетке грибка, в клетке млекопитающего, в клетке растения или в любом растительном материале, содержащем целлюлозную часть; активность целлюлазы необязательно является термостабильной; полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы при условиях, включающих в себя диапазон температур от примерно 37 до примерно 95°С, или от примерно 55 до примерно 85°С, или от примерно 70 до примерно 75°С, или от примерно 70 до примерно 95°С, или от примерно 90 до примерно 95°С, или поддерживает активность целлюлазы при температуре в пределах от примерно 1 до примерно 5°С, от примерно 5 до примерно 15°С, от примерно 15 до примерно 25°С, от примерно 25 до примерно 37°С или от примерно 37 до примерно 95, 96, 97, 98 или 99°С; активность целлюлазы необязательно является термотолерантной и где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 37 до примерно 95°С, от более чем 55 до примерно 85°С, или от примерно 70 до примерно 75°С, или от более чем 90 до примерно 95°С, или после экспонирования для температуры в пределах от примерно 1 до примерно 5°С, от примерно 5 до примерно 15°С, от примерно 15 до примерно 25°С, от примерно 25 до примерно 37°С или от примерно 37 до примерно 95, 96, 97, 98 или 99°С.
2. Выделенная и рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, в которой последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, как приведено в SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157 или SEQ ID NO:161.
3. Зонд на основе нуклеиновой кислоты для идентификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, где зонд содержит по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 или 150 либо более последовательных оснований последовательности по п.1, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации; зонд необязательно содержит олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80, примерно 60-100 или примерно 50-150 последовательных оснований; зонд необязательно содержит последовательные основания последовательности, как приведено в SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:157 или SEQ ID NO:161.
4. Кассета экспрессии, вектор или носитель клонирования, содержащие нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по п.1, где носитель клонирования необязательно включает в себя вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагемиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, и вирусный вектор необязательно включает в себя аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор аденоассоциированного вируса, и носитель клонирования необязательно включает в себя искусственную бактериальную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, полученный из бактериофага PI (РАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC) или искусственную хромосому млекопитающего (MAC).
5. Трансформированная клетка, содержащая нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по п.1 или кассету экспрессии, вектор или носитель клонирования по п.4, где клетка необязательно представляет собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку грибка, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку растения.
6. Выделенный или рекомбинантный полипептид:
(i) имеющий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152 или SEQ ID NO:154, или ее ферментативно активный фрагмент, где идентичность последовательностей необязательно определяется посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки и алгоритм сравнения последовательностей необязательно представляет собой алгоритм BLAST version 2.2.2, где настройки фильтра настраиваются как blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F и все остальные опции настраиваются по умолчанию;
(ii) имеющий последовательность аминокислот, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид имеет активность целлюлазы или имеет иммуногенную активность, при которой он способен генерировать антитело, которое специфично связывается с полипептидом, имеющим последовательность, как приведено в SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152 или SEQ ID NO:154;
(iii) имеющий последовательность аминокислот, как приведено в (i) или (ii), или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1 и содержащий по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка,
где консервативная замена необязательно включает в себя замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или наоборот; замену кислотного остатка другим кислотным остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком, или их сочетание, и
алифатический остаток необязательно включает в себя аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислотный остаток включает в себя аспарагиновую кислоту, глютаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; остаток, содержащий амидную группу, включает в себя аспарагиновую кислоту, глютаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; основной остаток включает в себя лизин, аргинин или их синтетический эквивалент, или ароматический остаток включает в себя фенилаланин, тирозин или их синтетический эквивалент;
(iv) полипептид, как приведено в (i), (ii) или (iii), где полипептид не имеет сигнальной или лидерной последовательности или препропоследовательности, или
(v) полипептид, как приведено в (i), (ii), (iii) или (iv), имеющий гетерологичную сигнальную или лидерную последовательность или гетерологичную препропоследовательность,
где активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоглюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя активность целлобиогидролазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя активность бета-глюкозидазы или маннаназы; активность целлюлазы необязательно включает в себя активность эндоцеллюлазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз глюкана с получением более низкомолекулярного полисахарида или олигомера; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза 1,4-бета-D-гликозидных связей; необязательно активность эндоцеллюлазы включает в себя активность эндо-1,4-бета-эндоцеллюлазы; активность по отношению к 1,4-бета-D-гликозидной связи необязательно включает в себя гидролиз 1,4-бета-D-гликозидной связи в целлюлозе, производном целлюлозы, лихенине или зерновой культуре; производное целлюлозы необязательно включает в себя карбоксиметилцеллюлозу или гидроксиэтилцеллюлозу; зерновая культура необязательно содержит бета-D-глюкан или ксилоглюкан; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей глюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей бета-1,4- и/или бета-1,3-глюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза связей эндоглюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза эндо-1,4-бета-D-глюкан 4-глюканогидролазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних связей эндо-бета-1,4-глюканазы и/или связей бета-1,3-глюканазы; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза внутренних бета-1,3-глюкозидных связей; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих глюкопиранозу; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз полисахаридов, содержащих 1,4-бета-глюкозидсвязанные D-глюкопиранозы; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы, производного целлюлозы или гемицеллюлозы; активность целлюлазы необязательно включает в себя гидролиз целлюлозы или гемицеллюлозы в древесине или бумажной пульпе или в продукте из древесины или бумаги; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в корме, пищевом продукте или напитке; корм, пищевой продукт или напиток необязательно включают в себя корм для животных на основе зерновых культур, сусло или пиво, тесто, фрукт или овощ; активность целлюлазы необязательно включает в себя катализ гидролиза глюкана в микробной клетке, в клетке грибка, в клетке млекопитающего, в клетке растения или в любом растительном материале, содержащем целлюлозную часть; активность целлюлазы необязательно является термостабильной; полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы при условиях, включающих в себя диапазон температур от примерно 37 до примерно 95°С, или от примерно 55 до примерно 85°С, или от примерно 70 до примерно 75°С, или от примерно 70 до примерно 95°С, или от примерно 90 до примерно 95°С, или поддерживает активность целлюлазы при температуре в пределах от примерно 1 до примерно 5°С, от примерно 5 до примерно 15°С, от примерно 15 до примерно 25°С, от примерно 25 до примерно 37°С или от примерно 37 до примерно 95, 96, 97, 98 или 99°С; активность целлюлазы необязательно является термотолерантной и где полипептид необязательно поддерживает активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 37 до примерно 95°С, от более чем 55 до примерно 85°С, или от примерно 70 до примерно 75°С, или от более чем 90 до примерно 95°С либо после экспонирования для температуры в пределах от примерно 1 до примерно 5°С, от примерно 5 до примерно 15°С, от примерно 15 до примерно 25°С, от примерно 25 до примерно 37°С или от примерно 37 до примерно 95, 96, 97, 98 или 99°С; активность целлюлазы необязательно включает в себя удельную активность при примерно 37°С в пределах от примерно 100 до примерно 1000 ед. на 1 мг белка, от примерно 500 до примерно 750 ед. на 1 мг белка, от примерно 500 до примерно 1200 ед. на 1 мг белка или от примерно 750 до примерно 1000 ед. на 1 мг белка;
термотолерантность необязательно включает в себя сохранение, по меньшей мере, половины удельной активности целлюлозы при 37°С после нагрева до повышенной температуры или где термотолерантность включает в себя удерживание удельной активности при 37°С в пределах от примерно 500 до примерно 1200 ед. на 1 мг белка после нагрева до повышенной температуры; полипептид необязательно содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования; гликозилирование необязательно представляет собой N-связанное гликозилирование и полипептид необязательно гликозилируется после экспрессирования в P. pastoris или S. Pombe; полипептид необязательно сохраняет активность целлюлазы при условиях, включающих в себя рН примерно 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5 или 4,0 либо более кислотный, или после экспонирования для условий, включающих в себя рН примерно 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5 или 4,0 либо более кислотный, и где полипептид необязательно сохраняет активность целлюлазы при условиях, включающих в себя рН примерно 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10 или 10,5 либо более основной, или после экспонирования для условий, включающих в себя рН примерно 7,5, 8,0, 8,5, 9, 9,5, 10 или 10,5 либо более основной.
7. Композиция, содержащая полипептид по п.6.
8. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий:
(a) обеспечение нуклеиновой кислоты по п.1 и
(b) экспрессию нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые делают возможной экспрессию полипептида, с получением рекомбинантного полипептида, где способ необязательно дополнительно включает в себя трансформирование клетки-хозяина с помощью нуклеиновой кислоты из стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а) с получением рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.
9. Способ генерирования варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью целлюлазы, включающий:
(a) обеспечение матричной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность по п.1; и
(b) модифицирование, делецию или добавление одного или более нуклеотидов в шаблонной последовательности или их сочетания с генерированием варианта матричной нуклеиновой кислоты,
где способ необязательно дополнительно включает экспрессию варианта нуклеиновой кислоты с генерированием варианта полипептида целлюлазы, и модификации, добавления или делеции необязательно вводятся посредством способа, включающего в себя ошибочно направленную PCR, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сборку посредством PCR, мутагенез посредством половой PCR, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов, насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM), перестановку искусственным лигированием (SLR), рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез фосфотиоат-модифицированной ДНК, мутагенез урацилсодержащих шаблонов, дуплексный мутагенез с разрывами, мутагенез с репарациями точечных несовпадений, мутагенез штамма-хозяина с дефицитом репарационной способности, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, рестрикционно-селекционный мутагенез, мутагенез с применением рестрикции и очистки, синтез искусственных генов, групповой мутагенез, создание мультимеров химерных нуклеиновых кислот и их сочетания, и способ необязательно итеративно повторяют до тех пор, пока не будет получена целлюлаза, имеющая измененную или иную активность или измененную или иную стабильность по сравнению с полипептидом, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой, где необязательно вариант полипептида целлюлазы:
(а) является термотолерантным и поддерживает некоторую активность после экспонирования для повышенной температуры;
(b) имеет повышенное гликозилирование по сравнению с целлюлазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой; или
(с) имеет активность целлюлазы при высокой температуре, где целлюлаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не является активной при высокой температуре, и
где способ необязательно повторяют итеративно до тех пор, пока
(а) не будет получена последовательность, кодирующая целлюлазу, имеющую измененное использование кодона по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой, или
(b) не будет получен ген целлюлазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии мессенджера или стабильности по сравнению с шаблонной нуклеиновой кислотой.
10. Выделенная, или рекомбинантная сигнальная, или лидерная последовательность, состоящая из последовательности аминокислот, как приведено в аминоконцевых остатках 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 1-28, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43 или 1-44, из:
(a) последовательности аминокислот по п.6 или
(b) последовательности аминокислот, как приведено в SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:150, SEQ ID NO:152 или SEQ ID NO:154.
11. Способ гидролиза, разрушения или разрыва связей глюкан-, целлюлозо- и/или гемицеллюлозосодержащей композиции, включающий:
(a) обеспечение полипептида, имеющего активность целлюлазы по п.6, или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1;
(b) обеспечение композиции, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и/или глюкан; и
(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией из стадии (b) при условиях, где целлюлаза гидролизирует, разрушает или разрывает связи глюкан-, целлюлозо- или гемицеллюлозосодержащей композиции,
где композиция необязательно включает в себя клетку растения, бактериальную клетку, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку животного и полипептид необязательно имеет активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
12. Способ получения пищи или корма, включающий приведение пищи, корма, пищевого продукта или кормового продукта в контакт по меньшей мере с одним полипептидом по п.6 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, в условиях, достаточных для нужного обращения с пищей, кормом, пищевым продуктом или кормовым продуктом.
13. Способ получения напитка, включающий введение по меньшей мере одного полипептида по п.6 или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по п.1, в напиток или предшественник напитка, в условиях, достаточных для уменьшения вязкости напитка, где напиток или предшественник напитка необязательно представляет собой сусло или пиво.
14. Способ получения топлива, включающий приведение композиции, содержащей глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и/или ферментируемый сахар, в контакт с полипептидом по п.6 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, где композиция, содержащая глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и/или ферментируемый сахар, необязательно включает в себя растение, продукт растения или производное растения и растение или продукт растения необязательно включают в себя растения или продукты растений сахарного тростника, свеклы или сахарной свеклы, пшеницы, кукурузы, сои, картофеля, риса или ячменя, и полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и топливо необязательно включает в себя биоэтанол или смесь бензин-этанол.
15. Комбинация ферментов для деполимеризации глюкановых, целлюлозных и/или гемицеллюлозных полимеров до метаболизируемых углеродных остатков, содержащая полипептид по п.6 или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы.
16. Способ обработки материала биологической массы, включающий приведение материала биологической массы, содержащего глюкан, целлюлозу, гемицеллюлозу и/или ферментируемый сахар, в контакт с полипептидом по п.6 или полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, где материал биологической массы необязательно происходит из сельскохозяйственной культуры, представляет собой побочный продукт производства пищевых продуктов или кормов, представляет собой продукт лигноцеллюлозных отходов или представляет собой остаток растения, или использованную бумагу, или использованный бумажный продукт и полипептид необязательно имеет активность, включающую в себя активность целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и остаток растения необязательно включает стебли, листья, кожуру, шелуху, кочерыжки, древесину, древесные стружки, древесную пульпу и опилки, и использованная бумага необязательно включает в себя испорченную или использованную фотобумагу, бумагу для компьютерных принтеров, бумагу блокнотов, писчую бумагу, бумагу для пишущих машинок, газеты, журналы, картон и упаковочные материалы на основе бумаги, и переработка материала биологической массы необязательно генерирует биоэтанол.
Текст
ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ, И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или глюкозидазы, полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на активность полипептидов в качестве целлюлаз, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или -глюкозидазы, включая термостабильную и термотолерантную активность, и полинуклеотиды, кодирующие эти ферменты, и получение и использование этих полинуклеотидов и полипептидов. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться в различных фармацевтических, сельскохозяйственных контекстах,контекстах переработки пищевых продуктов и кормов и в промышленных контекстах. Правительственная поддержка Настоящее изобретение осуществлено при поддержке правительства Соединенных Штатов Америки согласно контрактамDE-FG03-02ER83395 и DE-FG02-03ER83865, заключенным Министерством энергетики США. Правительство имеет определенные права в настоящем изобретении. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к молекулярной и клеточной биологии и биохимии. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полипептидам, имеющим активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или -глюкозидазы, полинуклеотидам,кодирующим эти полипептиды, и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на полипептиды, имеющие активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или -глюкозидазы,включая термостабильную и термотолерантную активность, и на полинуклеотиды, кодирующие эти ферменты, и на получение и применение этих полинуклеотидов и полипептидов. Полипептиды по настоящему изобретению могут применяться в различных фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных контекстах. Уровень техники Целлюлоза является наиболее обильным возобновляемым ресурсом на земле. Она состоит из линейной цепи из 1-4 -субъединиц глюкозы, при этом повторяющаяся единица представляет собой целлобиозу, которая представляет собой димер глюкозы, имеющий структуру, как показано на фиг. 5. Полимер деградирует под действием ряда ферментов, которые включают в себя эндоглюканазы (EG), которые случайным образом гидролизуют полимер целлюлозы, и целлобиогидролазы (СВН), которые удаляют конечные остатки целлобиозы с целлюлозы. Целлобиоза и целлоолигосахариды гидролизуются до глюкозы под действием -глюкозидаз (BG). Все три этих фермента являются необходимыми для полного разрушения целлюлозы до глюкозы. Для каждого из этих трех ферментов существуют различные структурные варианты, которые осуществляют одну и ту же функцию. В дополнение к этому грибки и бактерии, как известно, производят множество форм одних и тех же структурных вариантов, в дополнение к различным структурным вариантам. Дополнительно усложняющим эту систему является тот факт, что некоторые анаэробные бактерии и грибки, как известно, производят эти ферменты в мультиферментных комплексах, которые содержат множество ферментов, все они присоединены к ферментному скелету, с молекулярными массами более 2 млн дальтон. Почему такая сложная система ферментов является необходимой для такой простой молекулы Некоторые исследователи предполагают, что эта сложность связана со сложной для переработки природой субстрата. Цепи целлюлозы образуют микрофибриллы, которые упаковываются в кристаллическую матрицу посредством водородных связей между соседними цепями. Эта структура является очень устойчивой к химической или ферментативной деградации. СВН рассматриваются как ключевой фермент при деградации этой кристаллической целлюлозы,из-за природы их ферментативного воздействия на целлюлозы. EG в отличие от СВН имеют открытый карман, который воздействует на цепь целлюлозы под перпендикулярным углом. СВН воздействуют на цепь непосредственно с помощью туннеля, содержащего активный сайт. В настоящее время считается,что цепи целлюлозы поступают в туннель, и в это же время водородные связи между соседними цепями разрушаются. После того как целлобиогидролазы устанавливают эту "исходную позицию" на субстрате,затем могут поступать EG и воздействовать на субстрат с большей легкостью. Главным недостатком известных СВН является их низкая каталитическая активность. Некоторые группы утверждают, что низкая активность проистекает из того факта, что энергия от гидролиза преобразуется в кинетическую энергию для разрушения водородных связей и для предоставления возможности ферменту перемещаться вдоль субстрата. СВН представляют собой экзоактивные ферменты, они обнаружены в 6 из 90 семейств гликозилгидролаз. Они включают в себя семейства 5, 6, 7, 9, 10 и 48. Семейство 5 включает в себя множество различных типов гликозилгидролаз, включая целлюлазы, маннаназы и ксиланазы. Хотя большинство целлюлаз в этом семействе представляют собой эндоглюканазы,имеются примеры целлобиогидролаз, наиболее заметные - CelO из Clostridium thermocellum. Семейство 6 включает в себя только эндоглюканазы или целлобиогидролазы, при большем количестве элементов целлобиогидролаз, чем эндоглюканаз. Ферменты имеют механизм преобразования, и кристаллографические исследования говорят, что фермент имеет искаженную структуру / цилиндра, содержащую семь,а не восемь параллельных -нитей. Семейство 7 ферментов также состоит как из эндоглюканаз, так и из целлобиогидролаз, с преобладанием целлобиогидролаз, и единственные известные элементы происходят от грибков. Фермент имеет механизм удерживания, и кристаллическая структура говорит о структуре рулета. Семейство 9 содержит эндоглюканазы, целлобиогидролазы и -глюкозидазы с преобладанием эндоглюканаз. Однако Thermobifida fusca производит эндо/экзо-1,4-глюканазу, кристаллическая структура которой говорит об (/)6 цилиндрической укладке. Фермент характеризуется как эндо-, так и экзоглюканазами СВН. Семейство 10 содержит только 2 элемента, описанных как целлобиогидролазы, при этом основная оставшаяся часть описывается как ксиланазы. Целлобиогидролазы и ксиланазы из семей-1 018577 ства 10 имеют активность на метилумбеллиферилцеллобиозид. Семейство 48 содержит в основном бактериальные и анаэробные целлобиогидролазы и эндоглюканазы грибков. Структура представляет собой(/)6 цилиндрическую укладку, подобную семейству 9. Имеется необходимость в менее дорогостоящих и возобновляемых источниках топлива для транспортных средств. Новые источники топлива будут более привлекательными, если они производят не приносящие вреда конечные продукты после сгорания. Этанол предлагает привлекательную альтернативу топливу на основе нефти и может быть получен посредством ферментирования мономерных сахаров,полученных из крахмала или лигноцеллюлозы. Однако современная экономика не поддерживает широкого использования этанола из-за высокой стоимости его генерирования. Одной из областей исследований, направленных на понижение стоимости, является увеличение технической эффективности ферментов, которые могут использоваться для генерирования ферментируемых сахаров из лигноцеллюлозы. Разработка ферментов, которые более эффективно расщепляют исходные материалы, приведет к уменьшению стоимости производства этанола. Более эффективные способы понизят зависимость Соединенных Штатов от иностранной нефти и скачков цен, которые могут быть связаны с такой зависимостью. Использование более чистых топлив для транспорта, подобных биоэтанолу, также могут уменьшить общие выбросы СО 2, которые, как предполагается, являются частично ответственными за глобальное потепление. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к целлюлазам, например эндоглюканазам, целлобиогидролазам и/или -глюкозидазе (бета-глюкозидазы), и способам их получения и применения. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют увеличенную скорость катализа для улучшения способа гидролиза субстрата. Эта увеличенная эффективность скорости катализа приводит к увеличению эффективности при производстве сахаров, которые могут быть полезными в промышленных применениях, например сахара, полученные таким образом, могут использоваться микроорганизмами для производства этанола. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к высокоактивным (например, имеющим увеличенную скорость катализа) целлобиогидролазам, эндоглюканазам и бета-глюкозидазе. Настоящее изобретение относится к промышленным применениям (например, получению этанола из биологической массы) с использованием ферментов по настоящему изобретению, имеющим пониженную стоимость фермента, например пониженную стоимость способа преобразования биологической массы в этанол. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективным способам производства биоэтанола и биоэтанолсодержащих композиций, включая топлива, содержащие биоэтанол, из любой биологической массы. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют активность глюканазы, например активность эндоглюканазы, например, катализируя гидролиз внутренних эндо 1,4- и/или -1,3 глюканазных связей. В одном из аспектов активность эндоглюканазы (например, активность эндо-1,4 бета-D-глюкан 4-глюканогидролазы) включает в себя гидролиз 1,4- и/или -1,3-бета-D-гликозидных связей в целлюлозе, производных целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозе и гидроксиэтилцеллюлозе), лихенине, бета-1,4 связей в смешанных бета-1,3 глюканах, таких как бета-D-глюканы из зерновых культур или ксилоглюканы, и в другом растительном материале, содержащем целлюлозные части. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению имеют активность эндоглюканазы (например, эндо-бета-1,4-глюканаз, ЕС 3.2.1.4; эндо-бета-1,3(1)-глюканаз, ЕС 3.2.1.6; эндо-бета-1,3 глюканаз, ЕС 3.2.1.39) и могут гидролизировать внутренние -1,4- и/или -1,3-глюкозидные связи в целлюлозе и глюкане, с получением глюкозы с меньшей молекулярной массой и олигомеров глюкозы. Настоящее изобретение относится к способам производства глюкозы с меньшей молекулярной массой и олигомеров глюкозы, с использованием этих ферментов по настоящему изобретению. В одном из аспектов ферменты по настоящему изобретению используются для генерирования глюканов, например полисахаридов, образующихся из 1,4 и/или 1,3-глюкозидсвязанной Dглюкопиранозы. В одном из аспектов эндоглюканазы по настоящему изобретению используются в пищевой промышленности, например, для пекарных целей и переработки фруктов и овощей, разрушения сельскохозяйственных отходов, при производстве кормов для животных, при производстве пульпы и бумаги, в текстильной промышленности и в бытовых и промышленных чистящих агентах. В одном из аспектов ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению производятся посредством микроорганизма, например посредством грибков и/или бактерий. В одном из аспектов ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для гидролиза бета-глюканов (-глюканов), которые являются главными отличными от крахмала полисахаридами зерновых культур. Содержание глюкана для полисахарида может значительно изменяться в зависимости от различных условий и условий роста. Физико-химические свойства этого полисахарида являются такими, что он дает вязкие растворы или даже гели при окислительных условиях. В дополнение к этому глюканы имеют очень высокую емкость связывания воды. Все эти характеристики представляют собой проблемы для нескольких областей промышленности, включая пивоваренную, пекарную, производство кормов для животных. При применениях в пивоваренной промышленности при-2 018577 сутствие глюкана приводит к проблемам с плохой фильтруемостью и к образованию взвеси. При применениях в пекарной промышленности (в особенности, для печенья и крекеров) глюканы могут образовывать липкое тесто, которое является сложным для машины и ограничивает размер лепешки. Таким образом, ферменты, например эндоглюканазы по настоящему изобретению, используются для уменьшения количества -глюкана в -глюкансодержащей композиции, например ферменты по настоящему изобретению используются в процессах для уменьшения вязкости растворов или гелей; для уменьшения емкости связывания воды композиции, например -глюкансодержащей композиции; в пивоваренных процессах (например, для повышения низкой фильтруемости и уменьшения образования взвеси), для уменьшения липкости теста, например, такого, из которого делают печенье, хлеб, лепешки и т.п. В дополнение к этому углеводы (например, -глюкан) вовлечены в быстрое повторное гидратирование пекарных продуктов, что приводит к потери хруста и уменьшению времени хранения в упакованном состоянии. Таким образом, ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для сохранения хруста, увеличения хруста или уменьшения скорости потери хруста и для увеличения времени хранения в упакованном состоянии любого пищевого продукта, корма или напитка,содержащего углеводы, например пищевого продукта, корма или напитка, содержащего -глюкан. Ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для уменьшения вязкости содержимого кишечника (например, у животных, таких как жвачные животные, или у людей),например, с растительными диетами. Таким образом, в альтернативных аспектах ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для положительного воздействия на перевариваемость пищи или корма, на скорость роста животного (например, человека или домашнего животного) и в одном из аспектов используются для генерирования более высоких коэффициентов преобразования корма. При применениях для кормов для моногастрических животных с растительными диетами бета-глюкан представляет собой фактор, вносящий вклад в вязкость содержимого кишечника и по этой причине отрицательно влияет на переваривание корма и скорость роста животного. Для жвачных животных эти бета-глюканы представляют собой значительные компоненты потребления волокон, и более полное переваривание глюканов способствовало бы повышению коэффициентов преобразования корма. Соответственно настоящее изобретение относится к кормам для животных и пищевым продуктам, содержащим эндоглюканазы по настоящему изобретению, а в одном из аспектов эти ферменты являются активными в пищеварительном тракте животного, например в желудке и/или кишечнике. Ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются для расщепления целлюлозы или любого синтетического или природного материала, содержащего бета-1,4-связанный глюкан, включая те, которые находятся в любом растительном материале. Ферменты, например эндоглюканазы, по настоящему изобретению используются в качестве промышленных ферментов для расщепления целлюлозы, например, в переработке древесины, промышленности пульпы и/или бумаги, в текстильной промышленности и в бытовых и промышленных чистящих агентах, и/или при переработке отходов биологической массы. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям, пищевым продуктам, кормам, лекарственным средствам, пищевым добавкам), содержащим ферменты, полипептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению. Эти композиции могут приготавливаться в различных формах, например в виде таблеток, гелей, пилюль, имплантов, жидкостей, спреев, порошков, пищевых продуктов, гранулированных кормов или в виде любого типа инкапсулированной формы. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность нуклеиновых кислот, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53,54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полную (100%) идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включая SEQ ID NO:1, SEQNO:157, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163 и SEQ ID NO:165; см. также табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже и список последовательностей, в области по меньшей мере из примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35,-3 018577 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900,1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более остатков; и в альтернативных аспектах эти нуклеиновые кислоты кодируют по меньшей мере один полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, или кодируют полипептид, способный к генерированию антитела, которое может специфично связываться с полипептидом по настоящему изобретению, или эти нуклеиновые кислоты могут использоваться в качестве зондов для идентификации или выделения нуклеиновых кислот, кодирующих целлюлазу, или для ингибирования экспрессии нуклеиновых кислот, экспрессирующих целлюлазу (все эти аспекты упоминаются как "нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению"). В одном из аспектов идентичности последовательностей определяются посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательности или посредством визуальной проверки. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению также включают в себя выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие примерный фермент по настоящему изобретению, включая полипептид, имеющий последовательность, как приведено в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:160, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:166, см. также табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже, и список последовательностей, и их субпоследовательности и их варианты. В одном из аспектов полипептид имеет активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к кодирующим целлюлазам, например кодирующим эндоглюканазу, целлобиогидролазу и/или бета-глюкозидазу нуклеиновым кислотам, имеющим общую новизну в том, что они получены от смешанных культур. Настоящее изобретение относится к кодирующим ферментам, деградирующим целлюлозам, нуклеиновым кислотам, выделенным из смешанных культур, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению, например последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полную (100%) идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, например SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:163 и SEQ ID NO:165, и см. табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже и список последовательностей в области по меньшей мере из примерно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент целлюлазу, например фермент эндоглюканазу, фермент целлобиогидролазу и/или фермент бетаглюкозидазу, содержащим примерные последовательности полинуклеотидов по настоящему изобретению, см. также табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже и список последовательностей, и полипептиды, кодируемые ими, включая ферменты по настоящему изобретению, например полипептиды по настоящему изобретению, например SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ IDNO:166, см. также табл. 1 и список последовательностей, имеющие общую новизну в том, что их получают из общего источника, например источника из окружающей среды. В одном из аспектов настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим фермент целлюлазу, например фермент эндоглюканазу, фермент целлобиогидролазу и/или фермент бета-глюкозидазу, с той общей новизной, что их получают из источников из окружающей среды, например из смешанных источников из окружающей среды. В одном из аспектов алгоритм сравнения последовательностей представляет собой алгоритмBLAST version 2.2.2, где настройки фильтра настраиваются как blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, и все остальные опции настраиваются по умолчанию. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300,1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2200, 2250,2300, 2350, 2400, 2450, 2500 или более последовательных оснований последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, последовательностей, по существу идентичных им, и последовательностей, комплементарных к ним. В одном из аспектов выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид,имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, которая является термостабильной. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы в условиях, включающих в себя диапазон температур примерно от 37 примерно до 95 С; примерно от 55 примерно до 85 С, примерно от 70 примерно до 95 С или примерно от 90 примерно до 95 С. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы при температурах в пределах примерно от 1 примерно до 5 С, примерно от 5 примерно до 15 С, от примерно 15 примерно до 25 С, примерно от 25 примерно до 37 С, примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99 С, примерно от 55 примерно до 85 С, примерно от 70 примерно до 75 С или примерно от 90 примерно до 99 С или 95, 96, 97,98, или 99 С, или более. В другом аспекте выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует полипептид,имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, которая является термотолерантной. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 37 примерно до 95 С или где-либо в пределах от более чем 55 примерно до 85 С. Полипептид может поддерживать активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах примерно от 1 примерно до 5 С, примерно от 5 примерно до 15 С, примерно от 15 примерно до 25 С, примерно от 25 примерно до 37 С, примерно от 37 примерно до 95, 96, 97, 98 или 99 С, примерно от 55 примерно до 85 С, примерно от 70 примерно до 75 С или примерно от 90 примерно до 95 С или более. В одном из аспектов полипептид поддерживает активность целлюлазы после экспонирования для температуры в пределах от более чем 90 примерно до 99 С или 95, 96, 97, 98 или 99 С, примерно при рН 4,5 или более. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, которая гибридизируется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включая примерную последовательность по настоящему изобретению, например последовательность, как приведено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ IDNO:161, SEQ ID NO:163 или SEQ ID NO:165 (см. также табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже) или их фрагменты или субпоследовательности. В одном из аспектов нуклеиновая кислота кодирует полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Нуклеиновая кислота может составлять по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,1050, 1100, 1150, 1200 или более остатков в длину, или полноразмерный ген, или транскрипт. В одном из аспектов строгие условия включают в себя стадию отмывки, включающую в себя отмывку в 0,2 SSC при температуре примерно 65 С в течение примерно 15 мин. Настоящее изобретение относится к зонду нуклеиновой кислоты для идентификации или выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где зонд содержит по меньшей мере примерно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более последовательных оснований последовательности, составляющей последовательность по настоящему изобретению, или ее фрагментов или субпоследовательностей, где зонд идентифицирует нуклеиновую кислоту посредством связывания или гибридизации. Зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 последовательных оснований последовательности, составляющей последовательность по настоящему изобретению,или ее фрагментов или субпоследовательностей. Настоящее изобретение относится к зонду нуклеиновой кислоты для идентификации или выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где зонд содержит нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по меньшей мере примерно из 10, 15, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 или более остатков нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например полинуклеотид,имеющий по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,99% или более либо полную (100%) идентичность последовательности с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов идентичности последовательностей определяют посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. В альтернативных аспектах зонд может содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 последовательных оснований последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или ее субпоследовательности. Настоящее изобретение относится к паре праймеров амплификации для амплификации (например, с помощью PCR) нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность по настоящему изобретению, или ее фрагменты или субпоследовательности. Один из элементов или каждый из элементов пары последовательностей праймеров амплификации может содержать олигонуклеотид,содержащий по меньшей мере примерно 10-50 или более последовательных оснований последовательности или примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36 или более последовательных оснований последовательности. Настоящее изобретение относится к паре праймеров амплификации, где пара праймеров содержит первый элемент, имеющий последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, и второй элемент, имеющий последовательность, как отсчитывается от первого (5'), из 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более остатков комплементарной нити первого элемента. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим целлюлазу, например кодирующим эндоглюканазу, целлобиогидролазу и/или бета-глюкозидазу, генерируемым посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (PCR), с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам,кодирующим целлюлазу, например кодирующие эндоглюканазу, целлобиогидролазу и/или бетаглюкозидазу, генерируемые посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (PCR),с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы,маннаназы и/или бета-глюкозидазы посредством амплификации, например полимеразной цепной реакции (PCR), с использованием пары праймеров амплификации по настоящему изобретению. В одном из аспектов пара праймеров амплификации амплифицирует нуклеиновую кислоту из библиотеки, например генной библиотеки, такой как библиотека из окружающей среды. Настоящее изобретение относится к способам амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим амплификацию матричной нуклеиновой кислоты с помощью пары последовательностей праймеров амплификации, способных амплифицировать последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, или ее фрагменты или субпоследовательности. Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или ее субпоследовательность. В одном из аспектов кассета экспрессии может содержать нуклеиновую кислоту, которая функционально связана с промотором. Промотор может представлять собой вирусный, бактериальный промотор, промотор из млекопитающего или растения. В одном из аспектов растительный промотор может представлять собой промотор из картофеля, риса, кукурузы, пшеницы, табака или ячменя. Промотор может представлять собой конститутивный промотор. Конститутивный промотор может включать в себя CaMV35S. В другом аспекте промотор может представлять собой индуцируемый промотор. В одном из аспектов промотор может представлять собой ткане-специфичный промотор или регулируемый окружающей средой или регулируемый развитием промотор. Таким образом, промотор может представлять собой, например, семя-специфичный, листспецифичный, корень-специфичный, ствол-специфичный или индуцируемый обрезкой промотор. В одном из аспектов кассета экспрессии может дополнительно содержать вектор экспрессии растения или вируса растения. Настоящее изобретение относится к носителям клонирования, содержащим кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Носитель клонирования может представлять собой вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагемиду, космиду,фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому. Вирусный вектор может включать в себя аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или вектор аденоассоциированного вируса. Носитель клонирования может включать в себя бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, полученный из бактериофага Р 1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC) или искусственную хромосому млекопитающего (MAC). Настоящее изобретение относится к трансформированной клетке, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению,или носитель клонирования по настоящему изобретению. В одном из аспектов трансформированная клетка может представлять собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку грибка, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку растения. В одном из аспектов клетка растения может представлять собой клетку сои, рапса, подсолнечника, томата, сахарного тростника, зерновой культуры, картофеля, пшеницы, риса, кукурузы, табака или ячменя. Настоящее изобретение относится к трансгенным животным, не являющимся человеком, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению. В одном из аспектов животное представляет собой мышь, крысу, свинью, козу или овцу. Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению. Трансгенное растение может представлять собой растение зерновой культуры, растение кукурузы, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение подсолнечника, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя или растение табака. Настоящее изобретение относится к трансгенным семенам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или кассету экспрессии (например, вектор) по настоящему изобретению. Трансгенное семя может представлять собой семя зернового растения, семя кукурузы, ядро семени пшеницы, семя подсолнечника, семя рапса, семя сои, семя пальмового ореха, семя южного подсолнечника,кунжутное семя, семя арахиса или растение табака. Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или способную к гибридизации с ней при строгих условиях. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции мессенджера фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы в клетке, включающим введение в клетку или экспрессирование в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или способную к гибридизации с ней при строгих условиях. В одном из аспектов антисмысловой олигонуклеотид имеет длину в пределах примерно 10-50, примерно 20-60, примерно 30-70, примерно 40-80 или примерно 60-100 оснований, например в длину 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более оснований. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования трансляции мессенджера фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, в клетке, включающим введение в клетку или экспрессирование в клетке антисмыслового олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых кислот, комплементарную к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению или способную к гибридизации с ней при строгих условиях. Настоящее изобретение относится к молекулам двухцепочечной ингибиторной РНК (РНК-i, или РНК-интерференции) (включая малую интерферирующую РНК, или si-РНК, для ингибирования транскрипции, и микро-RNA, или mi-РНК, для ингибирования трансляции), содержащим субпоследовательность последовательности по настоящему изобретению. В одном из аспектов si-РНК имеет длину в пределах между примерно 21-24 остатками или по меньшей мере примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более дуплексных нуклеотидов. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы в клетке, включающим введение в клетку или экспрессирование в клетке двухцепочечной ингибиторной РНК (si-РНК или mi-РНК), где РНК содержит субпоследовательность последовательности по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, содержащим последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере примерно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полную (100%) идентичность последовательности с примерным полипептидом или пептидом по настоящему изобретению в области по меньшей мере примерно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225,250, 275, 300, 325, 350 или более остатков или по всей длине полипептида. В одном из аспектов идентичности последовательностей определяются посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки. Примерный полипептид или последовательность пептидов по настоящему изобретению включает в себя SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQNO:162, SEQ ID NO:164 и SEQ ID NO:166 (см. также табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже и список последовательностей), и их субпоследовательности и их варианты. Примеры полипептидов также включают в себя фрагменты длиной по меньшей мере примерно из 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 или более остатков, или полноразмерные ферменты. Полипептид или последовательности пептидов по настоящему изобретению включают в себя последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. Полипептид или последовательности пептидов по настоящему изобретению включают в себя полипептиды или пептиды, специфично связывающиеся с антителом по настоящему изобретению (например, эпитопы), или полипептиды или пептиды, которые могут генерировать антитело по настоящему изобретению (например, иммуноген). В одном из аспектов полипептид по настоящему изобретению имеет активность по меньшей мере одного фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В альтернативных аспектах полинуклеотид по настоящему изобретению кодирует полипептид, который имеет активность по меньшей мере одного фермента целлюлазы, например фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, является термостабильной. Полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы в условиях, включающих в себя температуры в пределах примерно от 1 примерно до 5 С,примерно от 5 примерно до 15 С, примерно от 15 примерно до 25 С, примерно от 25 примерно до 37 С,примерно от 37 примерно до 95 С, примерно от 55 примерно до 85 С, примерно от 70 примерно до 75 С,или примерно от 90 примерно до 95 С или более. В другом аспекте активность фермента целлюлазы,например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, может быть термотолерантной. Полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, после экспонирования для температуры в пределах от более чем 37 примерно до 95 С или в пределах от более чем 55 примерно до 85 С. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, после экспонирования для температуры в пределах от более чем 90 примерно до 95 С при рН 4,5. Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду или пептиду, содержащему по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95, 100, 125, 150 или более последовательных оснований последовательности полипептида или пептида по настоящему изобретению, последовательностей, по существу идентичных им, и последовательностей, комплементарных к ним. Пептид может представлять собой, например, иммуногенный фрагмент, мотив (например, сайт связывания), сигнальную последовательность, препропоследовательность или активный сайт. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы,например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и сигнальную последовательность, где нуклеиновая кислота содержит последовательность по настоящему изобретению. Сигнальная последовательность может быть получена из другого фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или фермента не-целлюлазы, например фермента не-эндоглюканазы, не-целлобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы (гетерологичного). Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы,например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где последовательность не содержит сигнальной последовательности, а нуклеиновая кислота содержит последовательность по настоящему изобретению. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду, включающему в себя полипептид по настоящему изобретению, в котором нет всей сигнальной последовательности или ее части. В одном из аспектов выделенный или рекомбинантный полипептид может включать в себя полипептид по настоящему изобретению, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность, такую как сигнальная последовательность гетерологичного фермента целлюлазы, например сигнальную последовательность фермента эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или сигнальную последовательность фермента нецеллюлазы, например не-эндоглюканазы, не-целлобиогидролазы и/или не-бета-глюкозидазы. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к химерным белкам, содержащим первый домен, содержащий сигнальную последовательность по настоящему изобретению, и, по меньшей мере,второй домен. Белок может представлять собой белок слияния. Второй домен может содержать фермент. Фермент может представлять собой не-фермент. Настоящее изобретение относится к химерным полипептидам, содержащим, по меньшей мере, первый домен, содержащий сигнальный пептид (SP), препропоследовательность и/или каталитический домен (CD) по настоящему изобретению, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не связывается в природе с сигнальным пептидом (SP), препропоследовательностью и/или каталитическим доменом (CD). В одном из аспектов гетерологичный полипептид или пептид не является ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой. Гетерологичный полипептид или пептид может находиться на аминоконце, карбоксиконце или на обоих концах сигнального пептида (SP),препропоследовательности и/или каталитического домена (CD). Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим химерный полипептид, где химерный полипептид содержит, по меньшей мере, первый домен, содержащий сигнальный пептид (SP), препродомен и/или каталитический домен (CD) по настоящему изобретению, и, по меньшей мере, второй домен, содержащий гетерологичный полипептид или пептид, где гетерологичный полипептид или пептид не связан в природе с сигнальным пептидом (SP), препродоменом и/или каталитическим доменом (CD). Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным сигнальным последовательностям (например, сигнальным пептидам), состоящим из последовательности или содержащим их, как приведено в остатках 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 1-27, 1-28, 128, 1-30, 1-31, 1-32, 1-33, 1-34, 1-35, 1-36, 1-37, 1-38, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43, 1-44, 1-45, 1-46 или 1-47 полипептида по настоящему изобретению, например SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:162, SEQ ID NO:164 или SEQ ID NO:166 (см. табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже и список последовательностей). В одном из аспектов настоящее изобретение относится к сигнальным последовательностям, содержащим первый 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70 или более амино конечных остатков полипептида по настоящему изобретению. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность примерно при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 1200 единиц (ед.) на 1 мг белка или примерно от 100 примерно до 1000 ед. на 1 мг белка. В другом аспекте активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность примерно от 100 примерно до 1000 ед. на 1 мг белка или примерно от 500 примерно до 750 ед. на 1 мг белка. Альтернативно, активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 750 ед. на 1 мг белка или примерно от 500 примерно до 1200 ед. на 1 мг белка. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 500 ед. на 1 мг белка или примерно от 750 примерно до 1000 ед. на 1 мг белка. В другом аспекте активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 250 ед. на 1 мг белка. Альтернативно, активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы,целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включает в себя удельную активность при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 100 ед. на 1 мг белка. В другом аспекте термотолерантность включает в себя удерживание по меньшей мере половины удельной активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, при 37 С после нагрева до повышенной температуры. Альтернативно, термотолерантность может включать в себя удерживание удельной активности при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 1200 ед. на 1 мг белка или примерно от 500 примерно до 1000 ед. на 1 мг белка после нагрева до повышенной температуры. В другом аспекте термотолерантность может включать в себя удерживание удельной активности при 37 С в пределах примерно от 1 примерно до 500 ед. на 1 мг белка после нагрева до повышенной температуры. Настоящее изобретение относится к выделенному или рекомбинантному полипептиду по настоящему изобретению, где полипептид содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. В одном из аспектов гликозилирование может представлять собой N-связанное гликозилирование. В одном из аспектов полипептид может быть гликозилирован после экспрессирования в P. pastoris или S. pombe. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, в условиях, включающих в себя примерно рН 6,5; 6; 5,5; 5; 4,5 или 4 либо при более кислотных рН. В другом аспекте полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы,маннаназы и/или бета-глюкозидазы, в условиях, включающих в себя примерно рН 7; 7,5; 8,0; 8,5; 9; 9,5; 10; 10,5 или 11 либо более основные рН. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, после экспонирования для условий, включающих в себя примерно рН 6,5; 6; 5,5; 5; 4,5 или 4 либо более кислотные рН. В другом аспекте полипептид может поддерживать активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, после экспонирования для условий, включающих в себя примерно рН 7; 7,5; 8,0; 8,5; 9; 9,5; 10; 10,5 или 11 либо более основные рН. В одном из аспектов фермент целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению имеет активность при щелочных условиях, например при щелочных условиях кишечника, например тонкого кишечника. В одном из аспектов полипептид может поддерживать активность после экспонирования для кислотных рН желудка. Настоящее изобретение относится к белковым препаратам, содержащим полипептид (включая пептиды) по настоящему изобретению, где белковый препарат включает в себя жидкость, твердый продукт или гель. Настоящее изобретение относится к гетеродимерам, содержащим полипептид по настоящему изобретению и второй белок или домен. Второй элемент гетеродимера может представлять собой другой фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу,другой фермент или другой белок. В одном из аспектов второй домен может представлять собой полипептид, а гетеродимер может представлять собой белок слияния. В одном из аспектов второй домен может представлять собой эпитоп или таг. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к гомодимерам, содержащим полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к иммобилизованным полипептидам (включая пептиды), имеющим активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где иммобилизованный полипептид включает в себя полипептид по настоящему изобретению, полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, или полипептид, содержащий полипептид по настоящему изобретению и второй домен. В одном из аспектов полипептид может иммобилизоваться на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде,графитовой частице, шарике, геле, пластинке, матрице или капиллярной трубке. Настоящее изобретение также относится к матрицам, содержащим иммобилизованную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, включая, например, зонды по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к матрицам, содержащим антитело по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным антителам, которые специфично связываются с полипептидом по настоящему изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. Эти антитела по настоящему изобретению могут представлять собой моноклональное или поликлональное антитело. Настоящее изобретение относится к гибридомам, содержащим антитело по настоящему изобретению, например антитело, которое специфично связывается с полипептидом по настоящему изобретению или с полипептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам,кодирующим эти антитела. Настоящее изобретение относится к способу выделения или идентификации полипептида, имеющего активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающему стадии: (а) получения антитела по настоящему изобретению; (b) получения образца, содержащего полипептиды; и (с) приведения в контакт образца из стадии (b) с антителом из стадии (а) в условиях, когда антитело может специфично связываться с полипептидом, при этом выделяя или идентифицируя полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Настоящее изобретение относится к способам получения антитела к ферменту, антицеллюлазы, например антиэндоглюканазы, антицеллобиогидролазы и/или анти-бета-глюкозидазы, включающим в себя введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или полипептида по настоящему изобретению, или его субпоследовательностей в количестве, достаточном для генерирования гуморального иммунного ответа, с получением антитела к ферменту, антицеллюлазу, например антиэндоглюканазу, антицеллобиогидролазу и/или анти-бета-глюкозидазу. Настоящее изобретение относится к способам получения иммунной реакции антицеллюлазы, например антиэндоглюканазы, антицеллобиогидролазы и/или анти-бета-глюкозидазы (клеточной или гуморальной), включающим введение животному, не являющемуся человеком, нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или полипептида по настоящему изобретению, или его субпоследовательностей в количестве,достаточном для генерирования иммунного ответа (клеточного или гуморального). Настоящее изобретение относится к способам продуцирования рекомбинантного полипептида,включающим в себя стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, функционально связанной с промотором; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты из стадии (а) в условиях, которые дает возможным экспрессирование полипептида, с получением рекомбинантного полипептида. В одном аспекте способ может дополнительно включать трансформацию клетки-хозяина с помощью нуклеиновой кислоты из стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты из стадии (а), с получением рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке. Настоящее изобретение относится к способам идентификации полипептида, имеющего активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, включающим следующие стадии: (а) получения полипептида по настоящему изобретению или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (b) получения субстрата для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы; (с) приведения в контакт полипептида или его фрагмента или варианта из стадии (а) с субстратом из стадии (b) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, где уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции детектирует полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов субстрат представляет собой соединение,содержащее целлюлозу. Настоящее изобретение относится к способам идентификации субстрата для фермента целлюлазы,например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим следующие стадии: (а) получения полипептида по настоящему изобретению; или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (b) получения исследуемого субстрата и (с) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с исследуемым субстратом из стадии (b) и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции, при этом уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции идентифицирует исследуемый субстрат как субстрат для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Настоящее изобретение относится к способам определения того, связывается ли исследуемое со- 11018577 единение специфично с полипептидом, включающим в себя следующие стадии: (а) экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в условиях, которые делают возможным трансляцию нуклеиновой кислоты в полипептид, где нуклеиновая кислота включает в себя нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, или получения полипептида по настоящему изобретению; (b) получения исследуемого соединения; (с) приведения в контакт полипептида с исследуемым соединением и(d) определения, связывается ли специфично исследуемое соединение из стадии (b) с полипептидом. Настоящее изобретение относится к способам идентификации модулятора активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим следующие стадии: (а) получения полипептида по настоящему изобретению или полипептида,кодируемого нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (b) получения исследуемого соединения; (с) приведения в контакт полипептида из стадии (а) с исследуемым соединением из стадии (b) и измерения активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где изменение активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы,целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, измеренное в присутствии исследуемого соединения, по сравнению с активностью в отсутствие исследуемого соединения, дает определение того,что исследуемое соединение модулирует активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы,целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы может измеряться посредством получения субстрата для фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции или увеличения количества субстрата или уменьшения количества продукта реакции. Уменьшение количества субстрата или увеличение количества продукта реакции с помощью исследуемого соединения по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без исследуемого соединения идентифицирует исследуемое соединение как активатор активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Увеличение количества субстрата или уменьшение количества продукта реакции с помощью исследуемого соединения, по сравнению с количеством субстрата или продукта реакции без исследуемого соединения,идентифицирует исследуемое соединение как ингибитор активности фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Настоящее изобретение относится к компьютерным системам, содержащим процессор и устройство для хранения данных, где указанное устройство для хранения данных содержит сохраняемую в нем последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению (например, полипептид или пептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению). В одном из аспектов компьютерная система может дополнительно содержать алгоритм сравнения последовательностей, и устройство для хранения данных имеет по меньшей мере одну эталонную последовательность, сохраняемую в нем. В другом аспекте алгоритм сравнения последовательностей включает в себя компьютерную программу, которая показывает полиморфизмы. В одном из аспектов компьютерная система может дополнительно содержать идентификатор, который идентифицирует одну или несколько признаков в указанной последовательности. Настоящее изобретение относится к считываемым компьютером средам, имеющим сохраняемые на них последовательности полипептидов или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам идентификации признака в последовательности, включающим в себя стадии: (а) считывания последовательности с использованием компьютерной программы, которая идентифицирует одну или несколько признаков в последовательности, где последовательность включает в себя последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению; и (b) идентификации одной или нескольких признаков в последовательности с помощью компьютерной программы. Настоящее изобретение относится к способам сравнения первой последовательности со второй последовательностью, включающим в себя стадии: (а) считывания первой последовательности и второй последовательности посредством использования компьютерной программы, которая сравнивает последовательности, где первая последовательность включает в себя последовательность полипептидов или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению; и (b) определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью с помощью компьютерной программы. Стадия определения различий между первой последовательностью и второй последовательностью может дополнительно включать в себя стадию идентификации полиморфизмов. В одном из аспектов способ может дополнительно включать в себя идентификатор, который идентифицирует один или несколько признаков в последовательности. В другом аспекте способ может включать в себя считывание первой последовательности с использованием компьютерной программы и идентификацию одного или несколько признаков в последовательности. Настоящее изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца, включающим стадии: (а) получения пары праймеров последовательностей амплификации для амплификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где пара праймеров способна амплифицировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению; (b) выделения нуклеиновой кислоты из полученного из окружающей среды образца или обработку полученного из окружающей среды образца таким образом, что нуклеиновая кислота в образце является доступной для гибридизации с парой праймеров амплификации; и (с) объединения нуклеиновой кислоты из стадии (b) с парой праймеров амплификации из стадии (а) и амплификации нуклеиновой кислоты из полученного из окружающей среды образца, тем самым выделяя или извлекая нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца. Один элемент из пары последовательностей праймеров амплификации, или каждый из них, может содержать олигонуклеотид, содержащий пару последовательностей праймеров амплификации по настоящему изобретению, например имеющий по меньшей мере примерно 10-50 последовательных оснований последовательности по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам выделения или извлечения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца, включающим стадии: (а) получения полинуклеотидного зонда, содержащего нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или ее субпоследовательность; (b) выделения нуклеиновой кислоты из полученного из окружающей среды образца или обработку полученного из окружающей среды образца таким образом, что нуклеиновая кислота в образце является доступной для гибридизации с полинуклеотидным зондом из стадии (а); (с) объединения выделенной нуклеиновой кислоты или обработанного полученного из окружающей среды образца из стадии (b) с полинуклеотидным зондом из стадии (а); (d) выделения нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизируется с полинуклеотидным зондом из стадии (а),с выделением или извлечением таким образом нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, из полученного из окружающей среды образца. Полученный из окружающей среды образец может включать образец воды, образец жидкости, образец почвы, образец воздуха или биологический образец. В одном из аспектов биологический образец может быть получен из бактериальной клетки, клетки простейших, клетки насекомого, клетки дрожжей, клетки растения, клетки грибка или клетки млекопитающего. Настоящее изобретение относится к способам генерирования варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим стадии: (а) получения матричной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению; и (b) модификации, делеции или добавления одного или нескольких нуклеотидов в шаблонной последовательности, или их сочетание, с генерированием варианта матричной нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов способ может дополнительно включать в себя экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для генерации полипептида фермента варианта целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. Модификации, добавления или делеции могут вводиться посредством способа, включающего в себя ошибочно направленную PCR, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез,сборку PCR, мутагенез посредством половой PCR, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов, насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM), перестановку искусственным лигированием (SLR), хромосомальный насыщающий мутагенез (CSM) или их сочетание. В другом аспекте модификации, дополнения или делеции вводятся посредством способа, включающего в себя рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез фосфотиоат-модифицированной ДНК, мутагенез с урацилсодержащим шаблоном, мутагенез с дуплексными разрывами, точечный мутагенез с мисматч репарацией, мутагенез штамма хозяина с дефицитом репарационной способности, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, рестрикционно-селекционный мутагенез, мутагенез с применением рестрикции и очистки, синтез искусственных генов, групповой мутагенез, создание мультимеров химерных нуклеиновых кислот и их сочетание. В одном из аспектов способ может повторяться итеративно до тех пор, пока не будет получен фермент целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза,имеющий измененную или иную активность или измененную или иную стабильность, отличную от полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой. В одном из аспектов вариант полипептида фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, является термотолерантным и поддерживает некоторую активность после экспонирования для повышенной температуры. В другом аспекте вариант фермента полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, имеет повышенное гликозилирование по сравнению с ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой, кодируемым матричной нуклеиновой кислотой. Альтернативно, вари- 13018577 ант полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, имеет активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы,маннаназы и/или бета-глюкозидазы, при высокой температуре, где фермент целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, кодируемый матричной нуклеиновой кислотой, является неактивным при высокой температуре. В одном из аспектов способ может итеративно повторяться до тех пор, пока не будет получена последовательность, кодирующая фермент целлюлазу,например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, имеющий измененное использование кодонов, иное, чем у матричной нуклеиновой кислоты. В другом аспекте способ может итеративно повторяться до тех пор, пока не будет получен ген фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии мессенджера или стабильности, чем у матричной нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение относится к способу модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для увеличения его экспрессии в клетке-хозяине, включающему следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; и (b) идентификации непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентируемый в кодирующих последовательностях, в генах в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клеткехозяине, с модификацией таким образом нуклеиновой кислоты для увеличения ее экспрессии в клеткехозяине. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; способ включает следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и (b) идентификации кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его другим кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, с модификацией кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для увеличения его экспрессии в клетке-хозяине, включающим следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующей полипептид фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; и (b) идентификации непредпочтительного или менее предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены его предпочтительным или нейтрально используемым кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах в клеткехозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клетке-хозяине, с модификацией нуклеиновой кислоты, для увеличения его экспрессии в клетке-хозяине. Настоящее изобретение относится к способам модификации кодонов в нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, имеющий активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, для уменьшения его экспрессии в клетке-хозяине, включающим следующие стадии: (а) получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и (b) идентификации по меньшей мере одного предпочтительного кодона в нуклеиновой кислоте из стадии (а) и замены ее непредпочтительным или менее предпочтительным кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, что и замененный кодон, где предпочтительный кодон представляет собой кодон, сверхпрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клетке-хозяине, а непредпочтительный или менее предпочтительный кодон представляет собой кодон, недопрезентируемый в кодирующих последовательностях в генах, в клетке-хозяине, с модификацией, таким образом, нуклеиновой кислоты для уменьшения ее экспрессии в клетке-хозяине. В одном из аспектов клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, клетку грибков, клетку насекомых, клетку дрожжей, клетку растений или клетку млекопитающих. Настоящее изобретение относится к способам создания библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, или сайтов связывания с субстратом, где модифицированные активные сайты или сайты связывания с субстратом получают из первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую первый активный сайт или первый сайт связывания с субстратом, причем способ включает следующие стадии: (а) получения первой нуклеино- 14018577 вой кислоты, кодирующей первый активный сайт или первый сайт связывания с субстратом, где первая последовательность нуклеиновых кислот содержит последовательность, которая гибридизируется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, и нуклеиновая кислота кодирует активный сайт фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, или сайт связывания с субстратом фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы; (b) получения набора мутагенных олигонуклеотидов,которые кодируют встречающиеся в природе варианты аминокислоты на множестве целевых кодонов в первой нуклеиновой кислоте; и (с) использования набора мутагенных олигонуклеотидов для генерирования набора вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих активные сайты или кодирующих сайты связывания с субстратом, кодирующих набор вариантов аминокислот на каждом кодоне аминокислоты, который мутагенизируется, с получением, таким образом, библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих множество модифицированных активных сайтов или сайтов связывания с субстратом фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов способ включает в себя мутагенизацию первой нуклеиновой кислоты из стадии (а) посредством способа, включающего в себя оптимизированную направленную эволюцию системы, насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM), использование целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (PASC)(SLR), ошибочно направленную PCR, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сборку PCR,мутагенез посредством половой PCR, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез, экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов и их сочетание. В другом аспекте способ включает мутагенизацию первой нуклеиновой кислоты из стадии(а) или ее вариантов с помощью способа, включающего в себя рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез фосфотиоат-модифицированной ДНК, мутагенез урацилсодержащего шаблона, мутагенез с дуплексными разрывами, мутагенез с мисматч репарацией, мутагенез с дуплексными разрывами, мутагенез штамма-хозяина с дефицитом репарационной способности, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, мутагенез с делециями, рестрикционно-селекционный мутагенез, мутагенез с применением рестрикции и очистки, синтез искусственного гена, групповой мутагенез, создание мультимерных химерных нуклеиновых кислот и их сочетания. Настоящее изобретение относится к способам получения малой молекулы, включающим следующие стадии: (а) получения множества биосинтетических ферментов, способных синтезировать или модифицировать малую молекулу, где один из ферментов включает в себя фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению; (b) получения субстрата по меньшей мере для одного из ферментов из стадии (а) и (с) взаимодействия субстрата из стадии (b) с ферментами в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций, с генерированием малой молекулы посредством ряда биокаталитических реакций. Настоящее изобретение относится к способам модификации малой молекулы, включающим следующие стадии: (а) получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где фермент включает в себя полипептид по настоящему изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению или ее субпоследовательностью; (b) получения малой молекулы и (с) взаимодействия фермента из стадии (а) с малой молекулой из стадии (b) в условиях, которые облегчают ферментативную реакцию, катализируемую ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бетаглюкозидазой, с модификацией, таким образом, малой молекулы посредством ферментативной реакции целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов способ может включать множество низкомолекулярных субстратов для фермента из стадии(а), с генерацией библиотеки модифицированных малых молекул, полученных с помощью по меньшей мере одной ферментативной реакции, катализируемой ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой. В одном из аспектов способ может включать множество дополнительных ферментов в условиях, которые облегчают множество биокаталитических реакций посредством ферментов, с образованием библиотеки модифицированных малых молекул, получаемых с помощью множества ферментативных реакций. В другом аспекте способ может дополнительно включать стадию исследования библиотеки для определения того, присутствует ли конкретная модифицированная малая молекула, которая демонстрирует желаемую активность, в библиотеке. Стадия исследования библиотеки может дополнительно включать в себя стадии систематического устранения всех биокаталитических реакций, кроме одной, используемой для получения части множества модифицированных малых молекул в библиотеке, посредством исследования части модифицированной малой молекулы на присутствие или отсутствие конкретной модифицированной малой молекулы с желаемой активностью и идентификации по меньшей мере одной конкретной биокаталитической реакции, которая производит конкретную модифицированную малую молекулу с желаемой активностью. Настоящее изобретение относится к способам определения функционального фрагмента фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим стадии: (а) получения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы,маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где фермент содержит полипептид по настоящему изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, или его субпоследовательность; и (b) делеции множества остатков аминокислот из последовательности из стадии (а) и исследования оставшейся субпоследовательности на активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с определением функционального фрагмента фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, измеряется посредством получения субстрата фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и детекции уменьшения количества субстрата или увеличения количества продукта реакции. Настоящее изобретение относится к способам генной инженерии цельных клеток, новых или модифицированных фенотипов посредством использования анализа метаболических потоков в реальном времени, включающим следующие стадии: (а) получения модифицированной клетки посредством модификации генетической композиции клетки, где генетическая композиция модифицируется посредством добавления к клетке нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению; (b) культивирования модифицированной клетки с генерированием множества модифицированных клеток; (с) измерения по меньшей мере одного метаболического параметра клетки посредством мониторинга культуры клеток из стадии (b) в реальном времени и (d) анализа данных из стадии (с) для определения того, отличается ли измеренный параметр от сравнимого измерения в немодифицированной клетке при сходных условиях с идентификацией, таким образом, полученного с помощью генной инженерии фенотипа клетки с использованием анализа метаболических потоков в реальном времени. В одном из аспектов генетическая композиция клетки может модифицироваться посредством способа, включающего делецию последовательности, или модификацию последовательности в клетке, или нокаутирование экспрессии гена. В одном из аспектов способ может дополнительно включать селекцию клетки, содержащей фенотип, вновь полученный с помощью генной инженерии. В другом аспекте способ может включать культивирование селектированной клетки, с генерацией, таким образом, нового штамма клетки, содержащего фенотип, вновь полученный с помощью генной инженерии. Настоящее изобретение относится к способам увеличения термотолерантности или термостабильности полипептида фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, включающим гликозилирование полипептида фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, где полипептид содержит по меньшей мере тридцать непрерывных аминокислот полипептида по настоящему изобретению; или полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, тем самым увеличивая термотолерантность или термостабильность полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы. В одном из аспектов удельная активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, может быть термостабильной или термотолерантной при температуре в пределах от более примерно чем 37 примерно до 95 С. Настоящее изобретение относится к способам для суперэкспрессии в клетке рекомбинантного полипептида целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, включающие экпрессирование вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, включающую нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, где идентичности последовательностей определяются посредством анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или посредством визуальной проверки, где суперэкспрессия осуществляется посредством использования промотора с высокой активностью, дицистронного вектора или посредством генной амплификации вектора. Настоящее изобретение относится к способам получения трансгенного растения, включающим следующие стадии: (а) введения гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает в себя последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, с получением, таким образом, трансформированной клетки растения; и (b) создания трансгенного растения из трансформированной клетки. В одном из аспектов стадия(а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот посредством электропорообразования или микроинъекции протопластов клеток растений. В другом аспекте стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот непосредственно в ткань растения посредством бомбардировки частицами ДНК. Альтернативно, стадия (а) может дополнительно включать введение гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в ДНК клетки растения, используя хозяина Agrobacterium tumefaciens. В одном из аспектов клетка растения может представлять собой клетку сахарного тростника, свеклы, сои, томата, картофеля,кукурузы, риса, пшеницы, табака или ячменя. Настоящее изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку растения, включающим следующие стадии: (а) трансформации клетки растения с помощью гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанных с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает нуклеиновую кисло- 16018577 ту по настоящему изобретению; (b) выращивания растений в условиях, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетку растения. Настоящее изобретение относится к способам экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот в клетку растения, включающим следующие стадии: (а) трансформации клетки растения с помощью гетерологичной последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанных с промотором, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот включает последовательность по настоящему изобретению; (b) выращивания растения в условиях, где гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот экспрессируется в клетки растения. Настоящее изобретение относится к кормам или пищевым продуктам, содержащим полипептид по настоящему изобретению или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к пищевому продукту, корму, жидкости,например напитку (такому как фруктовый сок или пиво), хлебу или продукту из теста или хлебному продуту, или промежуточному продукту для напитка (например, суслу), содержащему полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к пищевым или питательным добавкам для животного, содержащим полипептид по настоящему изобретению, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов полипептид в пищевой или питательной добавке может быть гликозилированным. Настоящее изобретение относится к съедобным матрицам для доставки фермента, содержащим полипептид по настоящему изобретению, например полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов матрица для доставки включает в себя гранулы. В одном из аспектов полипептид может быть гликозилированным. В одном из аспектов активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, является термотолерантной. В другом аспекте активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, является термостабильной. Настоящее изобретение относится к пищевому продукту, корму или пищевой добавке, содержащим полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам применения фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, в качестве пищевой добавки к диете животного, включающим приготовление пищевой добавки, содержащий фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, содержащий по меньшей мере тридцать непрерывных аминокислоты полипептида по настоящему изобретению; и введение пищевой добавки животному. Животное может представлять собой человека, жвачное или моногастрическое животное. Фермент целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, может быть получен посредством экспрессирования полинуклеотида, кодирующего фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, в организме, выбранном из группы, состоящей из бактерий, дрожжей, растений, насекомых, грибков и животных. Организм может выбираться из группы, состоящей из S. pombe, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Е.coli, Streptomyces sp., Bacillus sp. и Lactobacillus sp. Настоящее изобретение относится к съедобной матрице для доставки фермента, включающей термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, например полипептид по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам доставки добавки с ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бета-глюкозидазой, животному, включающим приготовление съедобной матрицы для доставки фермента в форме гранул, содержащих гранулированный съедобный носитель и термостабильный рекомбинантный фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, где гранулы легко диспергируют фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, содержащийся в них, в водных средах, и введение съедобной матрицы для доставки фермента животному. Рекомбинантный фермент целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза,может содержать полипептид по настоящему изобретению. Фермент целлюлаза, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, может быть гликозилированным для получения термостабильности в условиях гранулирования. Матрица для добавки может формироваться посредством гранулирования смеси, содержащей зародыши зерновых культур и фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу. Условия гранулирования могут включать в себя применение пара. Условия гранулирования могут включать в себя применение температуры, превышающей примерно 80 С, в течение примерно 5 мин, и при этом фермент поддерживает удельную активность по меньшей мере от 350 примерно до 900 ед. на 1 мг фермента. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу по настоящему изобретению, или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению. В одном из аспектов фармацевтическая композиция действует в качестве средства, облегчающего переваривание. В определенных аспектах соединение, содержащее целлюлозу, приводят в контакт с полипептидом по настоящему изобретению, имеющим активность фермента целлюлазы, например эндоглюканазы,целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, при рН в пределах примерно от рН 3,0 до 9,0,10,0, 11,0 или более. В других аспектах соединение, содержащее целлюлозу, приводится в контакт с ферментом целлюлазой, например эндоглюканазой, целлобиогидролазой, маннаназой и/или бетаглюкозидазой, при температуре примерно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 С или более. Детали одного или нескольких аспектов настоящего изобретения приводятся в прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут ясны из описания, чертежей и из формулы изобретения. Все публикации, патенты, заявки на патенты, последовательности GenBank и депозиты АТСС, цитируемые здесь, включены в качестве ссылок для всех целей. Краткое описание чертежей Следующие далее чертежи представляют собой иллюстрацию аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения рамок настоящего изобретения, как охватывается формулой изобретения. Фиг. 1 представляет собой блок-схему компьютерной системы. Фиг. 2 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа сравнения новой последовательности нуклеотидов или белков с базой данных последовательностей для определения уровней гомологии между новой последовательностью и последовательностями в базе данных. Фиг. 3 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов способа в компьютере для определения, являются ли две последовательности гомологичными. Фиг. 4 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую один из аспектов процесса идентификатора 300 для детекции присутствия признака в последовательности. Фиг. 5 представляет собой иллюстрацию структуры целлобиозы. Фиг. 6 и 7 иллюстрируют результаты анализа с помощью ТСХ продуктов реакции из целлогексаозы, как обсуждается подробно в примере 1 ниже. Фиг. 8 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие высвобождения целлобиозы из PASC с помощью примерного фермента 22/22 а (СВН) по настоящему изобретению, как обсуждается подробно в примере 2 ниже. Фиг. 9 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие высвобождения целлобиозы изAVICEL МСС с помощью примерного фермента 22/22 а (СВН) по настоящему изобретению, как обсуждается подробно в примере 2 ниже. Фиг. 10 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие типичное разрушение GIGAMATRIX, где активные клоны, экспрессирующие фермент, способный гидролизовать метилумбеллиферилцеллобиозид, идентифицируются, как обсуждается подробно в примере 4 ниже. Фиг. 11 иллюстрирует в форме графика данные, показывающие активность выбранных ферментов против целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (PASC), посредством анализа с помощью капиллярного электрофореза (СЕ), как обсуждается подробно в примере 4 ниже. Фиг. 12 иллюстрирует в форме графика данные анализов примерного фермента по настоящему изобретению и вариантов субклонов на микрокристаллической целлюлозе AVICEL (МСС), где продукты реакции анализируют посредством анализа с использованием восстанавливающего сахара ВСА, как обсуждается подробно в пример 4 ниже. Фиг. 13 иллюстрирует в форме графика данные анализов первичного скрининга GSSM, как обсуждается подробно в примере 4 ниже. Фиг. 14 иллюстрирует в форме графика данные анализов вторичного скрининга GSSM, как обсуждается подробно в примере 4 ниже. Фиг. 15 иллюстрирует в форме графика данные анализов скрининга смешанных или "смеси" GSSM,как обсуждается подробно в примере 4 ниже. Схожие ссылочные символы на различных чертежах указывают на сходные элементы. Подробное описание Настоящее изобретение относится к полипептидам с активностью целлюлазы, например эндоглюканазам, целлобиогидролазам, маннаназам и/или бета-глюкозидазам, полинуклеотидам, кодирующим их,и способам получения и применения этих полинуклеотидов и полипептидов. Настоящее изобретение также относится к ферментам целлюлазы, например ферментам эндоглюканазе, целлобиогидролазе,маннаназе и/или бета-глюкозидазе, полинуклеотидам, кодирующим эти ферменты, применению таких полинуклеотидов и полипептидов. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к целлюлазе, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе, с увеличенной скоростью катализа, усовершенствующей процесс гидролиза субстрата. Это увеличенная эффективность скорости катализа приводит к увеличению эффективности при получении сахаров, которые впоследствии будут использования микроорганизмами для производства этанола. В одном из аспектов микроорганизмы, генерирующие фермент по настоящему изобретению, используются вместе с микроорганизмами, производящими этанол. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам производства этанола и получения "чистого горючего" на основе этанола, например, для транспорта, использующего биоэтанол. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям (например, препаратам ферментов, кормам, лекарственным средствам, пищевым добавкам), содержащим ферменты, полипептиды или полинуклеотиды по настоящему изобретению. Эти композиции могут приготавливаться в различных формах, например, как жидкости, гели, пилюли, таблетки, спреи, порошки, пищевые продукты, кормовые гранулы или инкапсулированные формы, включая наноинкапсулированные формы. Анализ для измерения активности целлюлазы, например активности эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, например, для определения того, имеет ли полипептид активность целлюлазы, например активность эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бетаглюкозидазы, хорошо известны в данной области и находятся в рамках настоящего изобретения; см.,например, Baker W.L., Panow A., Estimation of cellulase activity using a glucose-oxidase-Cu(II) reducing assay for glucose, J. Biochem Biophys Methods. 1991 Dec, 23 (4):265-73; Sharrock K.R., Cellulase assay methods: review, J. Biochem Biophys Methods. 1988 Oct, 17 (2):81-105; Carder J.H., Detection and quantification ofpH реакционных условий, используемых в настоящем изобретении, представляет собой другой переменный параметр, который относится к настоящему изобретению. В определенных аспектах рН реакции находится в пределах примерно от 3,0 примерно до 9,0. В других аспектах рН составляет примерно 4,5, или примерно 7,5, или примерно 9. Условия реакции, которые представляют собой щелочные условия, также могут быть преимущественными, например, в некоторых промышленных или фармацевтических применениях ферментов по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к полипептидам целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе, по настоящему изобретению в различных формах и препаратах. В способах по настоящему изобретению полипептиды целлюлазы, например эндоглюканазы,целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению используются в различных формах и препаратах. Например, очищенные полипептиды целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, могут использоваться в препаратах ферментов, используемых при производстве биоэтанола или в фармацевтических применениях, или в применениях, связанных с пищевыми добавками. Альтернативно, ферменты по настоящему изобретению могут использоваться непосредственно в способах производства биоэтанола, при получении чистого горючего, при переработке биологических отходов, при обработке пищевых продуктов, жидкости или кормов и т.п. Альтернативно, полипептиды целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут экспрессироваться в микроорганизме с использованием процедур, известных в данной области. В других аспектах полипептиды целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза, по настоящему изобретению могут иммобилизоваться на твердой подложке перед использованием в способах по настоящему изобретению. Способы иммобилизации ферментов на твердых подложках повсеместно известны в данной области, например, J. Mol. Cat. В: Enzymatic 6 (1999), 29-39; Chivata et al. Biocatalysis: Immobilizedcells and enzymes, J. Mol. Cat. 37 (1986), 1-24: Sharma et al., Immobilized Biomaterials Techniques and Applications, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (1982), 837-54: Laskin (Ed.), Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology. Нуклеиновые кислоты, зонды и ингибиторные молекулы. Настоящее изобретение относится к выделенным и рекомбинантным нуклеиновым кислотам, например, см. табл. 1-3, примеры 1 и 4 ниже и список последовательностей; нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды, включая примерные последовательности полинуклеотидов по настоящему изобретению, например, см. табл. 1 и список последовательностей; включая кассеты экспрессии, такие как векторы экспрессии и различные носители клонирования, содержащие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способы для обнаружения, идентификации или выделения новых последовательностей полипептидов целлюлаз, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, с использованием нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способы ингибирования экспрессии генов и транскриптов, кодирующих целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, с использованием нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Также предусматриваются способы модификации нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включающие получение вариантов нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например,посредством перестановки искусственным лигированием, оптимизированной направленной эволюции системы и/или насыщающего мутагенеза, такого как насыщающий мутагенез генных сайтов (GSSM). Термин "насыщающий мутагенез", насыщающий мутагенез генных сайтов или "GSSM" включает способ, который использует вырожденные олигонуклеотидные праймеры для введения точечных мутаций в полинуклеотид, как описано подробно ниже. Термин "оптимизированная система направленной эволюции" или "оптимизированная направленная эволюции" включает способ перестановки фрагментов родственных последовательностей нуклеиновых кислот, например родственных генов, как описано подробно ниже. Термин "перестановка искусственным лигированием" или "SLR" включает способ лигирования фрагментов олигонуклеотидов неслучайным образом, как объясняется подробно ниже. Термин "вариант" относится к полинуклеотидам или полипептидам по настоящему изобретению, модифицированным на одной или нескольких парах оснований, кодонах, интронах, экзонах или остатках аминокислот (соответственно), при этом по-прежнему поддерживающих биологическую активность целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, по настоящему изобретению. Варианты могут быть получены с помощью ряда средств, включая, например, такие способы, как ошибочно направленную PCR, шаффлинг, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сборку PCR, мутагенез посредством половой PCR, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный групповой мутагенез,экспоненциальный групповой мутагенез, сайт-специфичный мутагенез, перестановку генов, GSSM и любое их сочетание. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут изготавливаться, выделяться и/или подвергаться манипуляциям, например, посредством клонирования и экспрессии библиотек цДНК, амплификации сигнальной или геномной ДНК посредством PCR и т.п. Например, примерные последовательности по настоящему изобретению изначально получают из источников из окружающей среды. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим ферменты целлюлазы, например эндоглюканазе, целлобиогидролазе, маннаназе и/или бета-глюкозидазе,и полипептидам, кодируемым ими, имеющим общую новизну в том, что они получены из общего источника, например источника из окружающей среды, смешанной культуры или бактериального источника. При осуществлении способов по настоящему изобретению гомологичные гены могут модифицироваться посредством манипулирования с матричной нуклеиновой кислотой, как описано здесь. Настоящее изобретение может осуществляться в сочетании с любым способом или протоколом, или устройством,известным в данной области, которые хорошо описаны в научной и патентной литературе. Фразы "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновых кислот", как здесь используется, относится к олигонуклеотиду, нуклеотиду, полинуклеотиду или к фрагменту любого из них, к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может представлять собой смысловую или антисмысловую (комплементарную) нить, к пептидно-нуклеиновой кислоте (ПНК) или к любому материалу, подобному ДНК или подобному РНК,природного или синтетического происхождения. Фразы "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновых кислот" включают олигонуклеотид, нуклеотид, полинуклеотид или фрагмент любого из них, ДНК или РНК (например, m-РНК, r-РНК, t-РНК, i-РНК) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую нить, пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК), или любой подобный ДНК или подобный РНК материал природного или синтетического происхождения, включая, например, iРНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные i-РНК, например iRNP). Термин охватывает нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Термин также охватывает структуры, подобные нуклеиновым кислотам с синтетическими основными цепями, см., например, Mata (1997), Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997), Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996), Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156. "Олигонуклеотид" включает либо одноцепочечный полидеоксинуклеотид, либо две комплементарные нити полидеоксинуклеотидов,которые могут синтезироваться химически. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5' фосфата и, таким образом, не будут лигироваться с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата с помощью АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид может лигироваться с фрагментом,который не был дефосфорилирован."Кодирующая последовательность" или "последовательность нуклеотидов, кодирующая" конкретный полипептид или белок, представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, которая подвергается транскрипции и трансляции в полипептид или белок, когда попадает под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Термин "ген" означает сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептидной цепи; он включает области предшествующие и следующие после кодирующей области (лидерная и хвостовая), а также, где это применимо, промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами). Промоторная последовательность "функционально связывается с" кодирующей последовательностью, когда РНК полимераза, которая инициирует транскрипцию на промоторе, будет осуществлять транскрипцию кодирующей последовательность в m-РНК. "Функционально связанный", как здесь используется, относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Он может относиться к функциональной взаимосвязи транскрипционной регуляторной последовательности с последовательностью, полученной при транскрипции. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответст- 20018577 вующей клетке-хозяине или в другой системе экспрессии. Как правило, промоторные транскрипционные регуляторные последовательности, которые являются функционально связанными с последовательностью, полученной после транскрипции, являются физически непрерывными с последовательностью, полученной после транскрипции, т.е. они являются цис-действующими. Однако некоторые транскрипционные регуляторные последовательности, такие как энхансеры, не должны быть физически непрерывными или располагаться очень близко к кодирующим последовательностям, транскрипцию которых они усиливают. Термин "кассета экспрессии", как здесь используется, относится к последовательности нуклеотидов, которая способна влиять на экспрессию структурного гена (т.е. последовательности, кодирующей белки, такие как фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Кассеты экспрессии включают, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей полипептид; и, необязательно, с другими последовательностями, например, с сигналами завершения транскрипции. Могут также использоваться дополнительные факторы, необходимые или полезные при осуществлении экспрессии, например энхансеры, альфа-факторы. Таким образом,кассеты экспрессии включают также плазмиды, векторы экспрессии, рекомбинантные вирусы, любую форму вектора рекомбинантной "голой ДНК" и т.п. "Вектор" содержит нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, нестационарно или стационарно трансформировать клетку. Будет видно, что вектор может представлять собой голую нуклеиновую кислоту или нуклеиновую кислоту в комплексе с белком или липидом. Вектор необязательно содержит вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты и/или белки, и/или мембраны (например, клеточную мембрану, липидную оболочку вируса и т.п.). Векторы включают в себя, но не ограничиваясь этим, репликоны (например, репликоны РНК, бактериофаги), к которым фрагменты ДНК могут прикрепляться и реплицироваться. Таким образом, векторы включают в себя, но не ограничиваясь этим, РНК, автономную самореплицирующуюся круговую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см., например, патент США 5217879), и включают как экспрессирующиеся, так и неэкспрессирующиеся плазмиды. Когда рекомбинантный микроорганизм или культура клеток описывается как хозяин "вектора экспрессии", это включает как экстрахромосомальную круговую, так и линейную ДНК и РНК, которая инкорпорируется в хромосому (хромосомы) хозяина. Когда вектор поддерживается клеткой-хозяином, вектор может либо стабильно реплицироваться клетками во время митоза, как автономная структура, либо инкорпорироваться в геном хозяина. Как здесь используется, термин "рекомбинантный" охватывает нуклеиновые кислоты рядом с нуклеиновой кислотой "основной цепи", с которыми не является соседней в природной окружающей среде. В одном из аспектов, чтобы быть "обогащенными", нуклеиновые кислоты будут представлять собой примерно 5% или более от количества вставок нуклеиновых кислот в популяции молекул основной цепи нуклеиновых кислот. Молекулы основной цепи в соответствии с настоящим изобретением включают такие нуклеиновые кислоты, как векторы экспрессии, самореплицирующиеся нуклеиновые кислоты, вирусы, встраиваемые нуклеиновые кислоты и другие векторы или нуклеиновые кислоты, используемые для поддержания или манипуляций со вставкой нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой примерно 15% или более от количества вставок нуклеиновых кислота в популяции рекомбинантных молекул основной цепи. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой примерно 50% или более от количества вставок нуклеиновых кислота в популяции рекомбинантных молекул основной цепи. В одном из аспектов обогащенные нуклеиновые кислоты представляют собой примерно 90% или более от количества вставок нуклеиновых кислота в популяции рекомбинантных молекул основной цепи. Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую одну из последовательностей по настоящему изобретению или фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 либо более последовательных оснований нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Выделенная и рекомбинантная нуклеиновые кислоты могут содержать ДНК, включая цДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и если она одноцепочечная, может представлять кодирующую нить или некодирующую (антисмысловую) нить. Альтернативно, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты содержат РНК. Выделенная и рекомбинантная нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут использоваться для получения одного из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагментов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 либо более последовательных аминокислот одного из полипептидов по настоящему изобретению. Соответственно, другой аспект настоящего изобретения представляет собой выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует один из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 либо более последовательных аминокислот одного из полипептидов по настоящему изобретению. Кодирующие последовательности этих нуклеиновых кислот могут быть идентичными одной из кодирующих последовательностей одной из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или могут представлять собой иные кодирующие последовательности, которые кодируют одну из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, имеющую по меньшей мере 5, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 либо более последовательных аминокислот одного из полипептидов по настоящему изобретению, в результате избыточности или дегенерации генетического кода. Генетический код хорошо известен специалистам в данной области и может быть получен, например, на с. 214, В. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, включают в себя,но не ограничиваясь этим, кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и дополнительные кодирующие последовательности, такие как лидерные последовательности или пробелковые последовательности и некодирующие последовательности, такие как интроны или некодирующие последовательности 5' и/или 3' кодирующей последовательности. Таким образом, как здесь используется, термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид" охватывает полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность полипептида, а также полинуклеотид, который содержит дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность. В одном из аспектов последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению мутагенизируются с использованием обычных методик, таких как сайт-направленный мутагенез, или других методик, известных специалистам в данной области, для введения молчащих изменений в полинуклеотиды по настоящему изобретению. Как здесь используется, "молчащие изменения" включают в себя, например, изменения, которые не изменяют последовательность аминокислот, кодируемую полинуклеотидом. Такие изменения могут быть желательными для увеличения уровня полипептида, производимого клетками-хозяевами, содержащими вектор, кодирующий полипептид посредством введения кодонов или пар кодонов, которые часто встречаются в организме хозяина. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые имеют изменения нуклеотидов, которые приводят к замещениям, добавлениям, делециям, слияниям и процессингу аминокислот в полипептидах по настоящему изобретению. Такие изменения нуклеотидов могут вводиться с использованием таких методик, как методика сайт-направленного мутагенеза, случайного химического мутагенеза, делеции экзонуклеазы III и других методик с рекомбинантной ДНК. Альтернативно, такие изменения нуклеотидов могут представлять собой встречающиеся в природе аллельные варианты, которые выделяются посредством идентификации нуклеиновых кислот, которые специфично гибридизируются с зондами, содержащими по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 последовательных оснований одной из последовательностей по настоящему изобретению (или последовательностей, комплементарных к ним) в условиях высокой, умеренной или низкой строгости, как здесь предусматривается. Общие методики. Нуклеиновые кислоты, используемые для осуществления настоящего изобретения, представляют ли они собой РНК, si-РНК, mi-РНК, антисмысловую нуклеиновую кислоту, цДНК, геномную ДНК, векторы, вирусы или их гибриды, могут выделяться из различных источников, полученных с помощью генной инженерии, амплифицированных и/или экспрессированных/генерированных рекомбинантно. Рекомбинантные полипептиды (например, ферменты целлюлазы, например эндоглюканаза, целлобиогидролаза, маннаназа и/или бета-глюкозидаза), генерируемые из этих нуклеиновых кислот, могут индивидуально выделяться или клонироваться и исследоваться на желаемую активность. Может использоваться любая система рекомбинантной экспрессии, включая системы экспрессии клеток бактерий, млекопитающих,дрожжей, насекомых или растений. Альтернативно, эти нуклеиновые кислоты могут синтезироваться in vitro с помощью хорошо известных методик химического синтеза, как описано, например, в Adams (1983), J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997), Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995), Free Radic. Biol. Med. 19:373380; Blommers (1994), Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979), Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979),Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981), Tetra. Lett. 22:1859; патент США 4458066. Методики для манипуляций с нуклеиновыми кислотами, такие, например, как субклонирование,меченые зонды (например, мечение случайным праймером с использованием полимеразы Кленова,ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п., хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John WileySons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES INTheory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Другие пригодные для использования средства получения и манипулирования с нуклеиновыми кислотами, используемые для осуществления способов по настоящему изобретению, представляет собой клонирование из геномных образцов и, если это желательно, скрининг и повторное клонирование вставок, выделенных или амплифицированных, например, геномных клонов или клонов цДНК. Источники нуклеиновых кислот, используемые в способах по настоящему изобретению, включают библиотеки геномной или цДНК, содержащейся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (MAC), см.,- 22018577 например, патенты США 5721118; 6025155; в искусственных хромосомах человека, см., например,Rosenfeld (1997), Nat. Genet. 15:333-335; в искусственных хромосомах дрожжей (YAC); в бактериальных искусственных хромосомах (ВАС); искусственных хромосомах Р 1, см., например, Woon (1998), Genomics 50:306-316; векторы, полученные с помощью Р 1 (РАС), см., например, Kern (1997), Biotechniques 23:120-124; космиды, рекомбинантные вирусы, фаги или плазмиды. В одном из аспектов нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по настоящему изобретению,собирается в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секретирование полученного после трансляции полипептида или его фрагмента. Настоящее изобретение относится к белкам слияния и нуклеиновым кислотам, кодирующим их. Полипептид по настоящему изобретению может сливаться с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как идентификационные пептиды N-окончания, которые придают желаемые характеристики,такие как увеличение стабильности или упрощение очистки. Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению могут также синтезироваться и экспрессироваться как белки слияния с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ним, например, для производства более иммуногенного пептида, для более легкого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и В-клеток, экспрессирующих антител и т.п. Домены, облегчающие детекцию и очистку, включают в себя, например, пептиды, хелатирующие металлы, такие как полигистидиновые пути и модули гистидин-триптофан, которые делают возможным очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен,используемый в системе очистки на основе расширения FLAGS/афинности (Immunex Corp, Seattle WA). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как фактор Ха или энтерокиназа (Invitrogen, San Diego CA), между доменом очистки и пептидом или полипептидом, составляющим мотив,облегчает очистку. Например, вектор экспрессии может включать последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую эпитоп, связанную с шестью гистидиновыми остатками, затем с тиоредоксином и сайтом энтерокиназного расщепления (см., например, Williams (1995), Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli(1998), Protein Expr. Purif. 12:404-414). Гистидиновые остатки облегчают детекцию и очистку, в то время как сайт энтерокиназного расщепления обеспечивает средства для очистки эпитопа от остального белка слияния. Методики, относящиеся к векторам, кодирующим белки слияния, и к применениям белков слияния, хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, Kroll (1993), DNA Cell.Biol., 12:441-53. Контрольные последовательности транскрипции и трансляции. Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот (например, ДНК) по настоящему изобретению, функционально связанным с контрольной последовательностью (последовательностями) экспрессии (например, транскрипции или трансляции), например с промоторами или энхансерами, для направления или модулирования синтеза/экспрессии РНК. Контрольная последовательность экспрессии может находиться в векторе экспрессии. Примерные бактериальные промоторы включают lacI, lacZ, Т 3, Т 7, gpt, лямбда PR, PL и trp. Примерные эукариотические промоторы включают непосредственный ранний CMV, тимидинкиназу HSV, ранний и поздний SV40, LTR от ретровируса и металлотионеин I мыши. Как здесь используется, термин "промотор" включает все последовательности, способные приводить в действие транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, например в клетке растения или животного. Таким образом, промоторы, используемые в конструктах по настоящему изобретению,включают цис-действующие контрольные элементы транскрипции и регуляторные последовательности,которые вовлечены в регуляцию или модулирование временного графика и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор может представлять собой цис-действующий контрольный элемент транскрипции, содержащий энхансер, промотор, терминатор транскрипции, источник репликации, последовательность хромосомного встраивания, 5' и 3' нетранслируемые области, или интронную последовательность, которые вовлечены в регуляцию транскрипции. Эти цис-действующие последовательности могут взаимодействовать с белками или другими биологическими молекулами для осуществления (включения/выключения, регуляции, модулирования и т.п.) транскрипции. "Конститутивные" промоторы представляют собой такие, которые приводят в действие экспрессию непрерывно при большинстве условий окружающей среды и состояний развития или дифференциации клеток. "Индуцируемые" или "регулируемые" промоторы направляют экспрессию нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению под влиянием условий окружающей среды или условий развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут воздействовать на транскрипцию посредством индуцируемых промоторов, включают анаэробные условия, повышенную температуру, засуху или присутствие света."Ткань-специфичные" промоторы представляют собой контрольные элементы транскрипции, которые являются активными только в конкретных клетках, или тканях, или органах, например, в растениях или животных. Ткань-специфичная регуляция может достигаться посредством определенных внутренних факторов, которые обеспечивают то, что экспрессируются гены, кодирующие белки, специфичные к данной ткани. Такие факторы, как известно, существуют в млекопитающих и растениях, с тем, чтобы сделать возможным развитие конкретных тканей. Промоторы, пригодные для экспрессирования полипептидов в бактериях, включают промоторы Е.coli lac или trp, промотор lacI, промотор lacZ, промотор Т 3, промотор Т 7, промотор gpt, промотор лямбда PR, промотор лямбда PL, промоторы из оперонов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицераткиназа (PGK) и промотор кислой фосфатазы. Эукариотические промоторы включают промежуточный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, промоторы теплового шока,ранний и поздний промотор SV40, LTR из ретровирусов и промотор металлотионеин-I мыши. Также могут использоваться другие промоторы, известные в качестве контролирующих экспрессию генов в прокариотичесих или эукариотических клетках или в их вирусах. Промоторы, пригодные для экспрессирования полипептида или его фрагментов в бактериях, включают промоторы Е.coli lac или trp, промотор(PGK), и промотор кислую фосфатазу. Промоторы грибков включают промотор -фактора. Эукариотические промоторы включают промежуточный ранний CMV промотор, промотор тимидинкиназы HSV,промоторы теплового шока, ранний и поздний промотор SV40, LTR из ретровирусов и промотор металлотионеин-I мыши. Также могут использоваться другие промоторы, которые, как известно, контролируют экспрессию генов в прокариотических или эукариотических клетках или в их вирусах. Ткань-специфичные промоторы растений. Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии, которые могут экспрессироваться тканьспецифичным образом, например которые могут экспрессировать фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению тканьспецифичным образом. Настоящее изобретение также относится к растениям или семенам, которые экспрессируют фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу по настоящему изобретению ткань-специфичным образом. Ткань-специфичность может быть специфичной к семенам, специфичной к стволу, специфичной к листьям, специфичной к корням,специфичной к плодам и т.п. Термин "растения" включает цельные растения, части растений (например, листья, стволы, цветы,корни и т.п.), протопласты растений, семена и клетки растений и их потомство. Класс растений, которые могут использоваться в способе по настоящему изобретению, как правило, является таким же широким,как и класс высших растений, совместимых с методиками трансформации, включая покрытосеменные(однодольные и двудольные растения), а также голосеменные. Он включает растения с разнообразными уровнями плоидности, включая полиплоидные, диплоидные, гаплоидные и гемизиготные состояния. Как здесь используется, термин "трансгенное растение" включает растения или клетки растений, в которые может быть вставлена гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот, например нуклеиновые кислоты и различные рекомбинантные конструкты (например, кассеты экспрессии) по настоящему изобретению. В одном из аспектов конститутивный промотор, такой как промотор CaMV35S, может использоваться для экспрессии в конкретные части растения, или семя, или по всему растению. Например, для суперэкспрессии может использоваться фрагмент промотора растения, который будет использоваться для непосредственной экспрессии нуклеиновой кислоты в некоторые или во все ткани растения, например регенерированного растения. Такие промоторы упоминаются здесь как "конститутивные" промоторы и являются активными при большинстве условий окружающей среды и состояний развития или дифференциации клеток. Примеры конститутивных промоторов включают область инициирования транскрипции вирус мозаики цветной капусты (CaMV)35S, 1'- или 2'-промотор, полученный из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, и другие области инициирования транскрипции из различных генов растений, известных специалистам в данной области. Такие гены включают в себя, например, АСТ 11 из ArabidopsisGen. Genet. 251:196-203); ген, кодирующий стеароилацильный носитель протеиндесатуразу, из Brassica(1997), Plant Mol. Biol. 33:97-112); промоторы растений, описанные в патентах США 4962028; 5633440. Настоящее изобретение использует ткань-специфичные или конститутивные промоторы, полученные из вирусов, которые могут включать в себя, например, субгеномный промотор тобамовируса (Kumagai (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683); тунгро-вирус продолговатого риса (RTBV), который реплицируется только в флоемных клетках в инфицированных растениях риса, с его промотором, который приводит в действие сильную экспрессию флоем-специфичного репортерного гена; промотор вируса мозаики жилок маниоки (CVMV), с самой высокой активностью в сосудистых элементах, в клетках мезофилла листьев и в кончиках корней (Verdaguer (1996), Plant Mol. Biol. 31:1129-1139). В одном из аспектов промотор растения направляет экспрессию нуклеиновой кислоты, экспрессирующей фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу, в конкретной ткани, органе или типе клеток (т.е. ткань-специфичные промоторы), или может находиться иным образом под более точным контролем со стороны окружающей среды или разви- 24018577 тия, или под контролем индуцируемого промотора. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию, включают анаэробные условия, повышенную температуру, присутствие света или опыление химикалиями/гормонами. Например, настоящее изобретение включает индуцируемый засухой промотор маиса (Busk (1997), выше); индуцируемый холодом и засухой, и высокой концентрацией соли промотор из картофеля (Kirch (1997), Plant Mol. Biol. 33:897, 909). В одном из аспектов ткань-специфичные промоторы промотируют транскрипцию только в определенных временных рамках стадии развития в этой ткани. См., например, Blazquez (1998), Plant Cell 10:791-800, характеризующую промотор гена LEAFY Arabidopsis. См. также Cardon (1997), Plant J. 12:367-77, описывающую фактор транскрипции SPL3, который распознает консервативный мотив последовательности в промоторной области гена API идентичности цветочное меристемы A. thaliana; и Mandel(1995), Plant Molecular Biology, Vol. 29, p. 995-1004, описывающую промотор меристемы eIF4. Могут использоваться ткань-специфичные промоторы, которые являются активными в течение всего жизненного цикла конкретной ткани. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению функционально связываются с промотором активным, прежде всего, только в клетках хлопковых волокон. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению функционально связываются с промотором, активным, прежде всего, на стадиях удлинения клеток волокон хлопка, например, как описано Rinehart (1996), выше. Нуклеиновые кислоты могут функционально связываться с промотором гена Fb12A, который должен преимущественно экспрессироваться в клетках волокон хлопка (Ibid). См. также John (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al., патенты США 5608148 и 5602321, описывающие промоторы, специфичные к волокнам хлопка, и способы конструирования трансгенных растений хлопка. Специфичные к корням промоторы могут также использоваться для экпрессирования нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Примеры специфичных к корням промоторов включают промотор гена алкогольдегидрогеназы (DeLisle (1990), Int. Rev. Cytol. 123:39-60). Другие промоторы, которые могут использоваться для экпрессирования нуклеиновых кислоты по настоящему изобретению, включают в себя, например, овулярно-специфичные, эмбрио-специфичные, эндоспермспецифичные, специфичные к наружным покровам, специфичные к семенной оболочке промоторы, или некоторое их сочетание; специфичный к листьям промотор (см., например, Busk (1997), Plant J. 11:12851295, описывающую специфичный к листьям промотор в маисе); промотор ORF13 из Agrobacteriumrhizogenes (который демонстрирует высокую активность в корнях, см., например, Hansen (1997), выше); специфичный к пыльце маиса промотор (см., например, Guerrero (1990), Mol. Gen. Genet. 224:161-168); может использоваться промотор томатов, активный во время созревания плодов, старения и опадения листьев, и, до меньшей степени, цветов, (см., например, Blume (1997), Plant J. 12:731-746); специфичный к пестику промотор гена SK2 картофеля (см., например, Ficker (1997), Plant Mol. Biol. 35:425-431); генBlec4 из груши, который является активным в эпидермальной ткани вегетативных и в верхушках цветоножек в трансгенной люцерне, делая его полезным инструментом для нацеливания экспрессии посторонних генов в эпидермальном слое активно растущих всходов или волокон; овулярно-специфичный генBEL1 (см., например, Reiser (1995), Cell 83:735-742, GenBank No. U39944); и/или промотор, Klee, патент США 5589583, описывающем промоторную область растения, способные придавать высокие уровни транскрипции меристематической ткани и/или быстро делящимся клеткам. В одном из аспектов промоторы растений, которые индуцируются при экспонировании для гормонов растений, таких как ауксины, используются для экпрессирования нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение может использовать чувствительные к ауксинам элементы фрагмента промотора E1 (AuxREs) в сое (Glicine max L.) (Liu (1997), Plant Physiol. 115:397-407); чувствительный к ауксинам промотор GST6 Arabidopsis (также чувствительный к салициловой кислоте и перекиси водорода) (Chen (1996), Plant J. 10:955-966); индуцируемый ауксинами промотор parC из табака(Sakai (1996), 37:906-913); чувствительный к биотину растений элемент (Streit (1997), Mol. Plant MicrobeInteract. 10:933-937); и промотор, чувствительный к гормону стресса абсцизиновой кислоте (Sheen (1996),Science 274:1900-1902). Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут также функционально связываться с промоторами растений, которые индуцируются при экспонировании для химических реагентов, которые могут наноситься на растения, таких как гербициды или антибиотики. Например, может использоваться промотор In2-2 маиса, активируемый гербицидными средствами защиты на основе бензолсульфонамида(De Veylder (1997), Plant Cell Physiol. 38:568-577); нанесение различных гербицидных средств защиты индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корнях, гидатода и верхушечной меристеме всходов. Кодирующая последовательность может находиться под контролем, например,тетрациклин-индуцируемого промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Avena sativa L. (овса) (Masgrau (1997), Plant J. 11:465-473); или элемента, чувствительного к салициловой кислоте (Stange (1997), Plant J. 11:1315-1324). При использовании промоторов, индуцируемых химически (например, гормонами или пестицидами), т.е. промотора,чувствительного к химикалию, который может наноситься на трансгенное растение в поле, экспрессия полипептида по настоящему изобретению может индуцироваться на конкретной стадии развития растения. Таким образом, настоящее изобретение также относится к трансгенным растениям, содержащим индуцируемый ген, кодирующий полипептиды по настоящему изобретению, у которых набор хозяев ограничивается целевыми видами растений, таких как кукуруза, рис, ячмень, соя, томаты, пшеница, картофель или другие культуры, индуцируемыми на любой стадии развития культуры. Специалист в данной области заметит, что ткань-специфичный промотор растения может приводить в действие экспрессию функционально связанных последовательностей в тканях, отличных от целевой ткани. Таким образом, в одном из аспектов ткань-специфичный промотор представляет собой такой,который приводит в действие экспрессию преимущественно в целевой ткани или типе клеток, но может также приводить к некоторой экспрессии также и в других тканях. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут также функционально связываться с промоторами растений, которые индуцируются при экспонировании для химических реагентов. Эти реагенты включают в себя, например, гербициды, синтетические ауксины, или антибиотики, которые могут наноситься, например распыляться, на трансгенные растения. Индуцируемая экспрессия нуклеиновых кислот, производящих фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению даст возможность растениеводу выбирать растения с оптимальной экспрессией фермента целлюлазы, например эндоглюканазы, целлобиогидролазы, маннаназы и/или бета-глюкозидазы, и/или активностью. Таким образом, может контролироваться развитие частей растения. Таким путем настоящее изобретение предусматривает средства для облегчения сбора урожая растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используется промотор маиса In2-2, активируемый гербицидными средствами защиты на основе бензолсульфонамида(De Veylder (1997), Plant Cell Physiol. 38:568-577); нанесение различных средств защиты индуцирует различные паттерны экспрессии генов, включая экспрессию в корнях, гидатодах и в верхушечной меристеме всходов. Кодирующие последовательности по настоящему изобретению находятся также под контролем промотора, индуцируемого тетрациклином, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Avena sativa L. (овса) (Masgrau (1997), Plant J. 11:465-473); или элемента, чувствительного к салициловой кислоте (Stange (1997), Plant J. 11:1315-1324). В некоторых аспектах соответствующая экспрессия полипептида может потребовать присутствия области полиаденилирования на 3'-окончании кодирующей области. Область полиаденилирования может быть получена из природного гена, из различных генов других растений (или животных или иного) или из генов Agrobacterial Т-ДНК. Векторы экспрессии и носители клонирования. Настоящее изобретение относится к векторам экспрессии и носителям клонирования, содержащим нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, например, последовательности, кодирующие ферменты целлюлазы, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бета-глюкозидазу, по настоящему изобретению. Векторы экспрессии и носители клонирования по настоящему изобретению могут включать вирусные частицы, бакуловирус, фаг, плазмиды, фагемиды, космиды, фосмиды, бактериальные искусственные хромосомы, вирусную ДНК (например, вакцинии, аденовируса, вируса оспы птиц, ложного рабдовируса и производных SV40), искусственные хромосомы на основе Р 1, плазмиды дрожжей, искусственные хромосомы дрожжей и любые другие векторы, специфичные к конкретным хозяевам, представляющим интерес (таким как bacillus Aspergillus и дрожжи). Векторы по настоящему изобретению могут включать последовательности хромосомальной, нехромосомальной и синтетической ДНК. Большие количества соответствующих векторов известны специалистам в данной области и являются коммерчески доступными. Примерные векторы включают в себя бактериальные векторы pQE(Qiagen), плазмиды pBLUESCRIPT, векторы pNH (векторы лямбда-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK2233, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); эукариотические: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG,pSVLSV40 (Pharmacia. Однако может использоваться любая другая плазмида или другой вектор, постольку, поскольку они могут реплицироваться и являются жизнеспособными в хозяине. В настоящем изобретении могут использоваться векторы с малым количеством копирований или с высоким количеством копирований. "Плазмиды" могут быть коммерчески доступными, публично доступными на неограниченной основе или могут конструироваться из доступных плазмид в соответствии с опубликованными процедурами. Плазмиды, эквивалентные тем, которые описаны здесь, известны в данной области и будут очевидны специалисту в данной области. Вектор экспрессии может содержать промотор, сайт связывания рибосомы для инициирования трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также включать соответствующие последовательности для экспрессии с амплификацией. Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать источник репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсирования, последовательности завершения транскрипции, и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсирования и полиаденилирования SV40, могут использоваться для создания необходимых нетранскрибируемых генетических элементов. В одном из аспектов векторы экспрессии содержат один или несколько селектируемых маркерных генов, чтобы сделать возможной селекцию клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие дигидрофолиатредуктазу, или гены, придающие стойкость к неомицину культуре эукариотических клеток, гены, придающие стойкость к тетрациклину или ампициллину Е.coli, и ген TRP1 S. cerevisiae. Промоторные области могут выбираться из любого желаемого гена,используя векторы хлорамфениколтрансферазы (CAT) или другие векторы с селектируемыми маркерами. В одном из аспектов векторы для экспрессирования полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках содержат энхансеры для увеличения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, которые могут составлять примерно от 10 примерно до 300 bp в длину. Они могут действовать на промотор с повышением его транскрипции. Примерные энхансеры включают энхансер SV40 на поздней стороне источника репликации, bp 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне источника репликации и энхансеры аденовируса. Последовательность нуклеиновых кислот может вставляться в вектор посредством различных процедур. Как правило, последовательность лигируется в желаемом положении в векторе, после расщепления вставки и вектора с помощью соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. Альтернативно, могут лигироваться тупые концы как во вставке, так и в векторе. В данной области известны различные методики клонирования, например, как описано в Ausubel и Sambrook. Такие и иные процедуры, как предполагается, находятся в рамках знаний специалиста в данной области. Вектор может находиться в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают хромосомальные, нехромосомальные и синтетические последовательности ДНК, производные SV40; бактериальные плазмиды, ДНК фага, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмид и ДНК фага, ДНК вирусов, таких как вакциния, аденовирус, вирус fowl pox, и ложный рабдовирус. Различные векторы клонирования и экспрессии для использования с прокариотическими и эукариотическими хозяевами описаны, например, Sambrook. Конкретные бактериальные векторы, которые могут использоваться, включают коммерчески доступные плазмиды, содержащие генетические элементы хорошо известного вектора клонированияpBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (Promega Biotec,Madison, WI, USA), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD 10, psiX174 pBLUESCRIPT II KS, pNH8A,pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia),pKK232-8 и рСМ 7. Конкретные эукариотические векторы включают pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL (Pharmacia). Однако может использоваться любой другой вектор, постольку-поскольку он может реплицироваться и является жизнеспособным в клетке-хозяине. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут экспрессироваться в кассетах, векторах или вирусах экспрессии и нестационарно или стабильно экспрессироваться в клетках и семенах растений. Одна из примерных систем нестационарной экспрессии использует эписомальные системы экспрессии, например, вирусную РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), генерируемую в ядре посредством транскрипции эписомальной мини-хромосомы, содержащей суперспиральную ДНК, см., например,Covey (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. Альтернативно, кодирующие последовательности,т.е. цельные последовательности или их субфрагменты по настоящему изобретению, могут вставляться в геном клетки растения хозяина, становясь интегральной частью хромосомальной ДНК хозяина. Таким образом, могут экспрессироваться смысловые или антисмысловые транскрипты. Вектор, содержащий последовательности (например, промоторы или кодирующие области) из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, может содержать маркерный ген, который придает селектируемый фенотип клетке растения или семени. Например, маркер может кодировать стойкость к биоциду, например стойкость к антибиотику, такую как стойкость к канамицину, G418, блеомицину, гигромицину, или стойкость к гербициду, такую как стойкость к хлорсульфорону или Basta. Векторы экспрессии, способные экспрессировать нуклеиновые кислоты и белки в растениях, хорошо известны в данной области и могут включать в себя, например, векторы из Agrobacterium sp., вируса картофеля X (см., например, Angell (1997), EMBO J. 16:3675-3684), вируса табачной мозаики (см., например, Casper (1996), Ген 173:69-73), вируса кустистой карликовости томатов (см., например, Hillman(1989), Virology 169:42-50), вируса гравировки табака (см., например, Dolja (1997), Virology 234:243-252),вируса золотой мозаики бобов (см., например, Morinaga (1993), Microbiol Immunol. 37:471-476), вируса мозаики цветной капусты (см., например, Cecchini (1997), Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101),транспонируемого элемента маиса Ac/Ds (см., например, Rubin (1997), Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302;Kunze (1996), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), и транспонируемого элемента суппрессора гена-мутатора (Spm) маиса (см., например, Schlappi (1996), Plant Mol. Biol. 32:717-725); и их производные. В одном из аспектов вектор экспрессии может иметь две системы репликации, чтобы дать возможность для его поддержания в двух организмах, например в клетках млекопитающих или насекомых, для экспрессии, и в прокариотическом хозяине, для клонирования и амплификации. Кроме того, для встраиваемых векторов экспрессии вектор экспрессии может содержать по меньшей мере одну последовательность, гомологичную геному клетки-хозяина. Он может содержать две гомологичные последовательности, которые фланкируют конструкт экспрессии. Встраиваемый вектор может быть направлен на кон- 27018577 кретный локус в клетке-хозяине посредством выбора соответствующей гомологичной последовательности для включения в вектор. Конструкты для встраиваемых векторов хорошо известны в данной области. Векторы экспрессии по настоящему изобретению могут также содержать селектируемый маркерный ген для того, чтобы сделать возможной селекцию бактериальных штаммов, которые трансформируются, например генов, которые делают бактерии стойкими к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, неомицин и тетрациклин. Селектируемые маркеры могут также включать биосинтетические гены, такие как гены в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина. Последовательность ДНК в векторе экспрессии функционально связывается с соответствующей контрольной последовательностью (последовательностями) (промотором) экспрессии для направления синтеза РНК. Конкретные наименования бактериальных промоторов включают lacI, lacZ, Т 3, T7, gpt,лямбда PR, PL и trp. Эукариотические промоторы включают промежуточный ранний CMV, тимидинкиназу HSV, ранний и поздний SV40, LTR от ретровируса и металлотионеин-I мыши. Выбор соответствующего вектора и промотора хорошо известен специалистам в данной области. Вектор экспрессии также содержит сайт связывания рибосомы для инициирования трансляции и терминатор транскрипции. Вектор может также содержать соответствующие последовательности для экспрессии с амплификацией. Промоторные области могут выбираться из любого желаемого гена, используя векторы хлорамфениколтрансферазы (CAT) или другие векторы с селектируемыми маркерами. В дополнение к этому векторы экспрессии в одном из аспектов содержат один или несколько селектируемых маркерных генов для обеспечения фенотипического признака для селекции трансформированных клеток-хозяев, таких как стойкость культуры эукариотических клеток к дигидрофолиатредуктазе или неомицину, или таких как стойкость Е.coli к тетрациклину или ампициллину. Векторы экспрессии млекопитающих могут также содержать источник репликации, любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсирования, последовательности завершения транскрипции и 5' фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. В некоторых аспектах последовательности ДНК, полученные из сайтов сплайсирования и полиаденилирования SV40, могут использоваться для получения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов. Векторы для экспрессирования полипептида или его фрагмента в эукариотических клетках могут также содержать энхансеры для увеличения уровней экспрессии. Энхансеры представляют собой цисдействующие элементы ДНК, обычно примерно от 10 примерно до 300 bp в длину, которые действуют на промотор, с увеличением его транскрипции. Примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне источника репликации bp 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне источника репликации и энхансеры аденовируса. В дополнение к этому векторы экспрессии могут содержать один или несколько селектируемых маркерных генов для того, чтобы сделать возможной селекцию клеток-хозяев, содержащих вектор. Такие селектируемые маркеры включают гены, кодирующие стойкость к дигидрофолиатредуктазе, или гены,придающие стойкость к неомицину культуре эукариотических клеток, гены, придающие стойкость к тетрациклину или ампициллину E.coli, и ген TRP1 S. cerevisiae. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота, кодирующая один из полипептидов по настоящему изобретению, или фрагменты, содержащие по меньшей мере примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75,100 или 150 либо более ее последовательных аминокислот, собирается в соответствующей фазе с лидерной последовательностью, способной направлять секретирование транслированного полипептида или его фрагмента. В одном из аспектов нуклеиновая кислота может кодировать полипептид слияния, в котором один из полипептидов по настоящему изобретению или фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 или 150 либо более его последовательных аминокислот, сливаются с гетерологичными пептидами или полипептидами, такими как идентификационные пептиды N-окончания,которые придают желаемые характеристики, такие как повышенная стабильность или упрощение очистки. Соответствующая последовательность ДНК может вставляться в вектор с помощью различных процедур. Как правило, последовательность ДНК лигируется с желаемым положением в векторе после расщепления вставки и вектора с помощью соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. Альтернативно, тупые концы как вставки, так и вектора могут лигироваться. Различные методики клонирования описываются в Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Такие и иные процедуры, как предполагается, находятся в рамках знаний специалиста в данной области. Вектор может находиться, например, в форме плазмиды, вирусной частицы или фага. Другие векторы включают последовательности хромосомальной, нехромосомальной и синтетической ДНК, производные SV40; бактериальные плазмиды, ДНК фага, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из сочетаний плазмид и ДНК фага, ДНК вирусов, таких как вакциния, аденовирус, вирус оспы птиц и ложный рабдовирус. Различные векторы клонирования и экспрессии для использования с прокариотическими и эукариотическими хозяевами описаны в Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man- 28018577ual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Клетки-хозяева и трансформированные клетки. Настоящее изобретение также относится к трансформированной клетке, содержащей последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например последовательность, кодирующую фермент целлюлазу, например эндоглюканазу, целлобиогидролазу, маннаназу и/или бетаглюкозидазу, по настоящему изобретению или вектор по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой любую из клеток-хозяев, известных специалистам в данной области, включая прокариотические клетки, эукариотические клетки, такие как бактериальные клетки, клетки грибков, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых или клетки растений. Примерные бактериальные клетки включают любые виды из Streptomyces, Staphylococcus ox Bacillus, или примерные виды Е.coli,Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium. Примерные клетки насекомых включают любые виды из Spodoptera или Drosophila, включая Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Примерные клетки животных включают СНО, COS или меланому Bowes или любую линию клеток мыши или человека. Выбор соответствующего хозяина находится в пределах умений специалиста в данной области. Методики трансформирования различных видов высших растений хорошо известны и описаны в технической и научной литературе. См., например, Weising (1988), Ann. Rev. Genet. 22:421-477; патент США 5750870. Вектор может вводиться в клетки-хозяева с использованием любой из разнообразных методик,включая трансформирование, трансфицирование, трансдукцию, вирусную инфекцию, генные пушки илиTi-медиируемый перенос гена. Конкретные способы включают кальций фосфатное трансфицирование,DEAE-декстран-медиируемое трансфицирование, липофицирование, или электропорообразование(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986. В одном из аспектов нуклеиновые кислоты или векторы по настоящему изобретению вводятся в клетки для скрининга, таким образом, нуклеиновые кислоты попадают в клетки способом, пригодным для последующего экспрессирования нуклеиновой кислоты. Способ введения диктуется по большей части целевым типом клетки. Примерные способы включают преципитацию с помощью CaPO4, липосомное слияние, липофицирование (например, LIPOFECTIN), электропорообразование, вирусную инфекцию и т.п. Кандидаты из нуклеиновых кислот могут стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина (например,с помощью введения ретровируса) или могут существовать либо нестационарно, либо стабильно, в цитоплазме (т.е. посредством использования традиционных плазмид, используя стандартные регуляторные последовательности, маркеры селекции и т.п.). Поскольку многие фармацевтически важные виды скрининга требуют клеток мишеней человека или модельных млекопитающих, могут использоваться ретровирусные векторы, способные трансфицировать такие мишени. Где это необходимо, полученные с помощью генной инженерии клетки-хозяева могут культивироваться в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активирования промоторов, селекции трансформантов или амплифицирования генов по настоящему изобретению. После трансформирования соответствующего штамма хозяина и роста штамма хозяина до соответствующей плотности клеток выбранный промотор может индуцироваться с помощью соответствующих средств (например, сдвига температуры или химического индуцирования) и клетки могут культивироваться в течение дополнительного периода времени, чтобы дать им возможность для продуцирования желаемого полипептида или его фрагмента. Клетки могут харвестироваться посредством центрифугирования, разрушаться с помощью физических или химических средств, и полученный сырой экстракт удерживается для дальнейшей очистки. Микробные клетки, используемые для экспрессирования белков, могут разрушаться с помощью любого удобного способа, включая циклы заморозки-оттаивания, сонификацию, механическое разрушение, или использование агентов, лизирующих клетки. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Экспрессируемый полипептид или его фрагмент может извлекаться и очищаться от рекомбинантных культур клеток посредством способов, включающих преципитацию с помощью сульфата аммония или этанола, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, афинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Стадии рефолдинга белков могут использоваться, по необходимости, при завершении конфигурирования полипептида. Если это желательно,высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может использоваться для конечных стадий очистки. Конструкты в клетках-хозяевах могут использоваться обычным способом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного продуцирования, полипептиды, производимые клетками-хозяевами, содержащими вектор, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать или не содержать начальный метиониновый остаток аминокислоты. Бесклеточные системы трансляции могут также использоваться для получения полипептида по настоящему изобретению. Безклеточные системы трансляции могут использовать m-РНК, полученные после транскрипции из конструкта ДНК, содержащего промотор, функционально связанный с нуклеиновой
МПК / Метки
МПК: C12P 21/00, C12N 5/10, A23L 1/00, C12N 15/63, C12N 1/21, C12N 15/55, A23K 1/00, C12N 1/15, C12P 7/10, C12N 15/11, A23L 2/00, C12N 9/42
Метки: применения, кодирующие, способы, нуклеиновые, их, целлюлазы, кислоты, получения
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-18577-cellyulazy-nukleinovye-kisloty-kodiruyushhie-ih-i-sposoby-ih-polucheniya-i-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения</a>
Целлюлазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
Номер патента: 13540
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Блум Дэвид, Дикайко Марк, Гемсч Джослин
МПК: C12N 15/00, C12N 1/20, A62D 3/00...
Метки: получения, кислоты, целлюлазы, их, способы, применения, кодирующие, нуклеиновые
Формула / Реферат:
1. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая:(а) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая:(i) по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более, или полную идентичность последовательности сили ее ферментативно активный фрагмент,(ii) по меньшей мере 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93,...
Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения
Номер патента: 10903
Опубликовано: 30.12.2008
Авторы: Хэйзлвуд Джеофф, Лэм Дэвид, Граматикова Светлана, Бартон Нельсон
МПК: C12N 15/00, C07H 21/04, A61K 38/46...
Метки: кодирующие, нуклеиновые, применения, кислоты, способы, их, фосфолипазы, получения
Формула / Реферат:
1. Выделенная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая: (a) последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в последовательности SEQ ID NO:1, или ее фрагмент, кодирующий ферментативно активный полипептид, обладающий фосфолипазной активностью; (b) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность с последовательностью SEQ...
Фосфолипазы, кодирующие их нуклеиновые кислоты и способы их получения и применения
Номер патента: 15591
Опубликовано: 31.10.2011
Авторы: Бартон Нельсон Р., О’донохью Эйлин
МПК: C12N 15/00, C07H 21/04, C12N 1/20...
Метки: получения, фосфолипазы, нуклеиновые, применения, способы, кислоты, кодирующие
Формула / Реферат:
1. Изолированная, синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты:(a) кодирующую полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, и (i) имеющую по меньшей мере 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 177, и имеющую одну или несколько мутаций, кодирующих E41A, E41W,...
Полипептиды монооксигеназы со смешанными функциями, способные катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, кодирующие их нуклеиновые кислоты, способы применения полипептидов и нуклеиновых кислот и трансгенные растения
Номер патента: 4568
Опубликовано: 24.06.2004
Авторы: Сингх Суриндер, Стюмне Стен, Грин Аллан, Ленман Марит
МПК: C12N 15/53
Метки: связи, монооксигеназы, трансгенные, углеродной, катализировать, функциями, кислот, кодирующие, способы, молекуле, жирной, полипептиды, нуклеиновых, растения, полипептидов, способные, кислоты, эпоксигенизацию, нуклеиновые, смешанными, применения
Формула / Реферат:
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид монооксигеназы Crepis palaestina со смешанными функциями, способный катализировать эпоксигенизацию углеродной связи в молекуле жирной кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид монооксигеназы, имеющий аминокислотную...
Выделенные полипептиды baff-r, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды baff-r, антитела анти baff-r и способы применения таких полипептидов, нуклеиновых кислот и антител
Номер патента: 12833
Опубликовано: 30.12.2009
Авторы: Амброуз Кристин М., Томпсон Джеффри С.
МПК: A61K 38/17, A61K 48/00, C07H 21/04...
Метки: полипептиды, применения, нуклеиновых, антитела, нуклеиновые, способы, baff-r, анти, выделенные, таких, кодирующие, антител, кислоты, полипептидов, кислот
Формула / Реферат:
1. Выделенный полипептид, который связывается с BAFF (BAFF-R), содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO:5; (b) фрагмента SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF; (c) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF и по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:5 или фрагменту SEQ ID NO:5, который связывается с BAFF; (d) аминокислотной последовательности, которая связывается с BAFF...