Противовоспалительные dab

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному доменному антителу (dAb),связывающемуся с TNF- человека, где dAb содержит вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, где указанный вариабельный домен содержит по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), имеющую последовательность, полученную от примата Нового Света, где CDR выбрана из группы, где группа состоит из YAATKLQS (SEQID1), YEASSLQS (SEQ ID2), YEASKLQS (SEQ ID3), YSASNLET (SEQ ID4). Рекомбинантное доменное антитело используют для определения TNF- человека в образце и для лечения нарушения, характеризующегося активностью TNF- человека. Вулвен Бенджамин П., Томлинсон Ян М., Ли Дженнифер А. (GB), Дойл Энтони Джерард, Дженнингз Филип Энтони (AU) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СЕФАЛОН АВСТРАЛИЯ ПТИ ЛТД. 017710 Область изобретения Изобретение относится к рекомбинантным доменным антителам (dAb), пригодным для лечения человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к доменному антителу (dAb), которое связывается с TNF- человека, и к его использованию для лечения нарушений, характеризующихся активностью TNF- человека. Предпосылки изобретения Фактор некроза опухоли альфа (TNF-) представляет собой цитокин, который продуцируется многими типами клеток, включая моноциты и макрофаги, вовлеченный в опосредование шока и патофизиологию ряда заболеваний и нарушений человека, включая сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания,отторжение трансплантата и реакцию "трансплантат против хозяина". С целью противодействия неблагоприятным эффектам, опосредуемым TNF- человека, в качестве средства ингибирования активности TNF- найдены антитела, которые связывают и нейтрализуют TNF- человека. Некоторые из самых ранних антител к TNF- человека представляли собой моноклональные антитела мышей, секретируемые гибридомными клеточными линиями, получаемыми из лимфоцитов, полученных от мышей, иммунизированных TNF- человека. Хотя такие антитела были эффективными в отношении связывания и нейтрализации TNF- человека, их применение в терапии in vivo было ограничено проблемами, связанными с введением людям антител мышей, в частности, с активацией нежелательного иммунного ответа у человека на антитело мыши, называемому реакциями антителами человека к антителам мыши (НАМА). В попытках преодолеть эти проблемы антитела мыши к TNF- человека генетически конструировали так, чтобы они были более похожими на антитела человека. Например, получали химерные антитела человека/мыши, где последовательности вариабельных областей антитела из генома мыши комбинировали с последовательностями константных областей антитела из генома человека. Химерные антитела проявляют характеристики связывания исходного антитела мыши и эффекторные функции, ассоциированные с константной областью человека. Хотя эти химерные антитела использовали для лечения человека, они все еще содержат некоторые последовательности мыши и, следовательно, могут активировать реакции против химерных антител у людей, особенно, когда их вводят в течение продолжительных периодов времени, что, таким образом, ограничивает их терапевтическое применение. С применением способов гибридомы человека получены моноклональные антитела человека кTNF- человека. Однако этот подход страдает от этических, клинических и иммунологических ограничений на иммунизацию людей. Постулировано, что люди будут обладать толерантностью к антителам не являющихся человеком приматов, так как они структурно сходны с антителами человека (Ehrlich PH et al Human and primatemonoclonal antibodies for in vivo therapy. Clin. Chem. 34:9 pg 1681-1688 (1988. Кроме того, так как антитела человека неиммуногенны у макак Резус (Ehrlich PH et al., Rhesus monkey responses to multiple injections of human monoclonal antibodies. Hybridoma 1987; 6:151-60), вероятно, что обратное тоже верно и антитела приматов не будут иммуногенными у людей. Эволюционно далекие приматы, такие как приматы Нового Света, не только достаточно отличаются от людей, чтобы допускать образование антител к антигенам человека, но и достаточно сходны с людьми, чтобы иметь антитела, сходные с антителами человека до такой степени, что у хозяина не активируется иммунный ответ к антителам, когда людям вводят такие полученные от приматов антитела. Приматы Нового Света (подотряд Platyrrhini) включают по меньшей мере 53 вида, как правило, разделяемых на два семейства Callithricidae и Cebidae. Callithricidae состоит из игрунков и тамаринов. Cebidae включает беличьих обезьян, прыгунов, паукообразных обезьян, шерстистых обезьян, капуцинов, ночных обезьян или трехполосных дурукули и ревунов. В предшествующих исследованиях был охарактеризован спектр экспрессируемых тяжелых цепей иммуноглобулинов игрунки Callithrix jacchus (von Budingen H-C et al., Characterization of the expressedimmunoglobulin IGHV repertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus. Immunogenetics 2001; 53:557-5 63). Идентифицировано шесть подгрупп IGHV, показавших высокую степень сходства последовательности с их аналогами IGHV человека. Каркасные области были более консервативными по сравнению с определяющими комплементарность областями (CDR). Степень сходства между последовательностями IGHV С. jacchus и человека была меньше, чем между приматами Старого Света и людьми. Доменные антитела Доменные антитела (dAb) представляют собой наименьшие функционирующие связывающие единицы антител и соответствуют вариабельным областям тяжелых (VH) или легких (VL) цепей антител. Молекулярная масса доменных антител составляет приблизительно 13 кДа или менее чем одну десятую часть полноразмерного антитела. Легкие цепи иммуноглобулинов обозначают или как легкие цепи каппа, или как легкие цепи лямбда, а тяжелые цепи как гамма, мю, дельта, альфа или эпсилон. Вариабельная область придает антителу его специфичность. В каждой вариабельной области находятся области гипервариабельности, также известные как определяющие комплементарность области (CDR), фланкированные более консервативными областями, обозначаемыми как каркасные области. В каждой вариабельной области находятся три CDR-1 017710 и четыре каркасные области. В отличие от обычных антител доменные антитела хорошо экспрессируются в бактериальных,дрожжевых системах и системах млекопитающих. Их небольшой размер обеспечивает высокие молярные количества на грамм продукта, таким образом, обеспечивая значительное увеличение эффективности дозы, кроме того, доменные антитела можно использовать в качестве строительных блоков для получения терапевтических продуктов, таких как многоцелевые dAb, в которых конструкция, содержащая два или более вариабельных домена, связывается с двумя или более терапевтическими мишенями, или dAb,предназначенные для легочного или перорального введения. Сущность изобретения В первом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному доменному антителу (dAb),которое связывается с TNF- человека, где dAb содержит вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, где указанный вариабельный домен содержит, по меньшей мере, одну определяющую комплементарность область (CDR), имеющую последовательность, происходящую от примата Нового Света, где CDR выбрана из группы, состоящей из AATKLQS (SEQ ID1), EASSLQS (SEQ ID2),EASKLQS (SEQ ID3), SASNLET (SEQ ID4). Во втором аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество dAb по первому аспекту изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению dAb по первому аспекту изобретения в диагностике для определения TNF- человека. В четвертом аспекте изобретение относится к способу лечения нарушения у человека, характеризующегося активностью TNF- человека, включающему введение субъекту фармацевтической композиции по второму аспекту изобретения. В пятом аспекте изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующейdAb по первому аспекту изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведены аминокислотная (SEQ ID6) и нуклеотидная последовательности (SEQ ID5) акцепторного dAb. На фиг. 2 приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности генных сегментов VK одиннадцати (11) игрунок и шести (6) трехполосных дурукули. На фиг. 3 приведены аминокислотная (SEQ ID6) и нуклеотидная последовательности (обе цепи;SEQ ID5 и 53) акцепторного dAb. На фигуре указаны участки расщепления рестриктаз KpnI и SanD1,вырезающих область, содержащую CDR2. Вырезаемые остатки CDR2 указаны подчеркиванием. На фиг. 4 показаны выравнивания последовательностей, демонстрирующие олигонуклеотиды, используемые при клонировании и подтверждении конечных последовательностей нуклеотидной (А; SEQID5, 36, 54-56, 37, 57-59, 14, 60-62, 15, 63-65, соответственно) и аминокислотной (В; SEQ ID6, 42,66-68, 43, 69-71, 25, 72-74, 26, 75-77, соответственно) последовательностей, приведенных на фиг. 2. На фиг. 5 показана способность dAb со вставленной CDR2 ингибировать связывание TNF с рекомбинантным рецептором TNF. Тестируемые dAb представляли собой следующее: dAb трехполосной дурукули 1 (CDR = AATKLQS; SEQ ID1), dAb трехполосной дурукули 2 (CDR = EASSLQS; SEQ ID2), dAb игрунки 1 (CDR = EASKLQS; SEQ ID3), dAb игрунки 2 (CDR = SASNLET; SEQ ID4) и акцепторное dAb (CDR = SASELQS; SEQ ID49). На фиг. 6 показана улучшенная способность соединений 100 и 123 нейтрализовать цитотоксическую активность TNF на фибробласты L929 мышей относительно акцепторного dAb (соединение 145). Подробное описание изобретения В первом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному доменному антителу (dAb),которое связывается с TNF- человека, где dAb содержит вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, где указанный вариабельный домен содержит по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), имеющую последовательность, происходящую от примата Нового Света, где CDR выбран из группы, состоящей из AATKLQS (SEQ ID1), EASSLQS (SEQ ID2),EASKLQS (SEQ ID3), SASNLET (SEQ ID4). Предпочтительно CDR представляет собой CDR2. В предпочтительном варианте осуществления dAb содержит последовательность, выбранную из: В дополнительном аспекте изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей dAb по первому аспекту изобретения. Как используют в настоящем документе, термин "связывается с" предназначен для обозначения связывания антигена вариабельной областью иммуноглобулина с константой диссоциации (Kd) 1 мкМ или менее, как измеряют посредством анализа поверхностного плазмонного резонанса, например, с применением системы поверхностного плазмонного резонанса BIAcore и программного обеспечения оценки кинетики BIAcore (например, версии 2.1). Аффинность или константа диссоциации (Kd) для конкретного взаимодействия связывания предпочтительно составляет приблизительно 500 нМ или менее, более предпочтительно приблизительно 300 нМ или менее и предпочтительно по меньшей мере от 300 нМ до 50 пМ, от 200 нМ до 50 пМ, а более предпочтительно по меньшей мере от 100 нМ до 50 пМ,от 75 нМ до 50 пМ, от 10 нМ до 50 пМ. Как используют в настоящем документе, термин "вариабельный домен" означает свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, свойственные вариабельным доменам тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов, и специфически связывающий антиген. А доменное антитело или dAb представляет собой эквивалент одному полипептиду вариабельного домена. Специалистам в данной области понятно, что остаток последовательности вариабельного домена может происходить из последовательности вариабельного домена человека, примата Нового Света или примата Старого Света, которые, вследствие их эволюционной связи с людьми, обладают высокой степенью гомологии с последовательностью человека. Таким образом, например, CDR, выбранный из указанных выше последовательностей, можно вставлять в последовательность вариабельной области человека или примата с заменой CDR дикого типа. Таким образом, изобретение дополнительно основано на способе амплификации генов вариабельных доменов иммуноглобулинов приматов Нового Света, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с нуклеиновой кислотой, выделенной из лимфоцитов приматов Нового Света с праймерами, специфичными для семейства генов вариабельных доменов тяжелых и легких цепей. Например,информацию о границах генов вариабельных доменов тяжелых и легких цепей (VH и VL, соответственно) можно использовать для конструирования праймеров ПЦР, амплифицирующих вариабельный домен из клонированной кодирующей последовательности тяжелой или легкой цепи, кодирующей антитело, для которого известно, что оно связывает данный антиген. Затем амплифицированный вариабельный домен вставляют отдельно или в виде слияния с другой полипептидной последовательностью в подходящий экспрессирующий вектор. Затем экспрессированный вариабельный домен испытывают на высокую аффинность связывания с желаемым антигеном. Спектр доменов VH и VL может представлять собой природный спектр последовательностей иммуноглобулинов или синтетический спектр. Природный спектр представляет собой спектр, получаемый,например, из экспрессирующих иммуноглобулины клеток, полученных от одного или нескольких приматов. Такие спектры являются первичными, т.е., полученными из экспрессирующих иммуноглобулины клеток новорожденных или перегруппированными, т.е., полученными, например, из В-клеток взрослых приматов. При желании, клоны, идентифицированные из природного спектра, или любого спектра, связывающего антиген-мишень, затем подвергают мутагенезу и дальнейшему скринингу для получения и отбора вариантов с улучшенными характеристиками связывания.-3 017710 Синтетические спектры одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов получают посредством искусственного внесения разнообразия в клонированный вариабельный домен. Спектр доменов VH и VL можно скринировать на желаемую специфичность связывания и функциональное поведение, например, посредством фагового дисплея. Способы конструирования библиотек бактериофагового дисплея и экспрессионных библиотек фага лямбда хорошо известны в данной области. Способ фагового дисплея подробно описан в данной области, а примеры способов и соединений для получения и скрининга таких библиотек и созревания аффинности их продуктов можно найти, например, вPCT WO 97/08320; Ladner et al. патенты США 5223409,5403484,5571698,5837500 и Европейский патент 436597; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; McCafferty et al. PCT. WO 92/01047,патент США 5969108 и Европейский патент 589877; Salfeld et al. PCT WO 97/29131, предварительная заявка США 60/126603 и Winter et al. PCT WO 92/20791 и Европейский патент 368684. Рекомбинантные библиотеки, экспрессирующие спектр доменов VH и VL, можно экспрессировать на поверхности микроорганизмов, например дрожжей или бактерий (см. публикации PCT WO 99/36569 и 98/49286). Способ, основанный на антителах, полученных из отобранных лимфоцитов, или SLAM, как его обозначают в уровне техники, представляет собой другой способ быстрого получения высокоаффинных антител. В отличие от подходов фагового дисплея все антитела являются полностью бивалентными. Для получения антител приматов Нового Света, приматов Нового Света иммунизируют антигеном человека,например, полипептидом TNF-. После иммунизации выделяют клетки и селективно размножают в индивидуальных микролунках. Из лунок извлекают супернатанты и тестируют на связывание и функцию. Для последующих манипуляций, например, гуманизирования, получения фрагментов Fab, scFv или dAb,можно выделять генные последовательности. Таким образом, другим примером является получение антитела или видов антител по изобретению посредством SLAM и его производных (Babcock, J.S. et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93; 7843-7848, патент США 5627052 и публикация PCT WO92/02551). Адаптации SLAM, такие как использование альтернатив для тестирования супернатантов, таких как пэннинг, также входят в объем данного изобретения. В одной из экспрессионных систем библиотека рекомбинантных пептидов/белков представлена на рибосомах (для примеров см. Roberts, RW and Szostak, J.W.1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12297123202 и публикация PCTWO98/31700). Таким образом, другой пример включает получение и транскрипцию in vitro библиотеки ДНК (например, антител или производных, предпочтительно полученных из иммунизированных клеток, но не ограниченно этим), трансляцию библиотеки так, что белок и "иммунизированная" мРНК остаются на рибосоме, отбор по аффинности (например, посредством связывания сRSP), выделение мРНК, обратную трансляцию и последующую амплификацию (например, посредством полимеразной цепной реакции или родственного способа). Дополнительные циклы отбора и амплификации можно по мере необходимости сочетать с созреванием аффинности посредством внесения в эту систему соматических мутаций или посредством других способов созревания аффинности, как известно на существующем уровне техники. Другой пример представляет собой использование для получения доменных антител по изобретению способа эмульсионной компартментализации. В эмульсионной компартментализации, способы сортировки in vitro и оптической сортировки сочетают с совместной компартментализацией транслированного белка и его нуклеотидной кодирующей последовательностью в водной фазе внутри масляной капли в эмульсии (смотри публикации РСТWO 99/026711 и WO 00/40712). Основные элементы для получения и отбора антител, по существу, сходны со способом рибосомного дисплея in vitro. Последовательности CDR можно получать из нескольких источников, например баз данных, например базы данных белков и нуклеотидов The National Centre for Biotechnology Information, The RabatDatabase of Sequences of Proteins of Immunological Interest. Альтернативно, области CDR можно предсказывать из спектра доменов VH и VL (см., например, Kabat ЕА and Wu ТТ. Attempts to locate complementarity determining residues in the variable positions of light and heavy chains. Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93(1971. Последовательность CDR может представлять собой геномную ДНК или кДНК. Существует ряд способов, в которых в последовательность вариабельного домена можно встраивать замещающий CDR, и такие способы известны специалистам в данной области. Предпочтительный способ по настоящему изобретению включает замену CDR2 в домене вариабельной области посредством направляемого праймерами мутагенеза. Этот способ состоит из отжига синтетического олигонуклеотида, кодирующего желаемые мутации, с областью матрицы, где он служит в качестве праймера для инициации синтеза ДНК in vitro; удлинения олигонуклеотида ДНК-полимеразой-4 017710 с получением двухцепочечной ДНК, которая несет желаемые мутации; и лигирования, и клонирования последовательности в подходящий экспрессирующий вектор. Предпочтительно доменное антитело по изобретению обладает низкой иммуногенностью у людей. При указании термина "низкая иммуногенность" подразумевают, что доменное антитело не индуцирует у человека образование антител в достаточной степени, чтобы снизить эффективность непрерывного введения антитела в течение достаточного периода времени для достижения терапевтической эффективности. Предпочтительно последовательность вариабельной области, в которую встраивают CDR представляет собой "последовательность акцепторного dAb" (обозначенную, как соединение 128) представленную на фиг. 1. Последовательность акцепторного dAb состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID5: Эта последовательность кодируется нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID5: В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения последовательность CDR игрунки SASNTLET (SEQ ID4) встраивают в последовательность акцепторного dAb так,чтобы заменить последовательность CDR2 (SASELQS; SEQ ID49) последовательности акцепторного Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления dAb, которое связывается сTNF- человека, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID7. В объем настоящего изобретения входит, что последовательность dAb можно дополнительно подвергать созреванию аффинности для улучшения ее характеристик связывания антигена. Это может требовать модификации некоторых аминокислотных остатков в CDR1 и CDR3. Например, dAb со встроенным CDR игрунки, приведенное в SEQ ID7 подвергали аффинному созреванию, как указанно в разделе "материалы и методы", и тестировали на связывание TNF. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления dAb, которое связывается с TNF- человека, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID8 или SEQ ID9. Они обозначены как соединение 123 и соединение 100, соответственно, и их последовательности представлены ниже: В особенно предпочтительном варианте осуществления dAb, которое связывается с TNF- человека, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID10. Его обозначили как соединение 196, а его последовательность представлена ниже:DAb по изобретению может дополнительно содержать связанную с ним константную область (Fcобласть) иммуноглобулина. Последовательность константной области можно получать из последовательностей человека или примата. Последовательность примата может представлять собой последова-5 017710 тельность примата Нового Света или примата Старого Света. Подходящие приматы Старого Света включают шимпанзе или других человекообразных обезьян, например горилл или орангутангов, у которых вследствие их непосредственной филогенетической близости с людьми существует большая степень гомологии с последовательностью константной области человека.DAb (с соединенной с ним константной областью или без нее) можно дериватизировать или связывать с другой функциональной молекулой. Например, dAb посредством химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным способом может быть функционально связан с одной или несколькими другими молекулами, такими как другое антитело, детектируемое средство, цитотоксическое средство, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, которые могут опосредовать ассоциацию антитела с другой молекулой (такой как основная область стрептавидина или полигистидиновая метка). Подходящие детектируемые средства, которыми можно дериватизировать dAb включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые средства включают флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и т.п. DAb также можно дериватизировать детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза,пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т.п. Когда dAb дериватизировано детектируемым ферментом, его детектируют посредством добавления дополнительных реагентов, которые фермент использует для образования детектируемого продукта реакции. DAb также можно дериватизировать биотином и детектировать посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. Настоящее изобретение также относится к пегилированным dAb (с соединенной с ними константной областью или без нее), которые обеспечивают более продолжительное время полужизни и увеличенную устойчивость к разрушению без потери активности (например, аффинности связывания) относительно непегилированных полипептидов антител.DAb с использованием известных в данной области способов можно связывать с полимерными молекулами (предпочтительно ПЭГ), пригодными для обеспечения свойств более продолжительного времени полужизни и увеличенной устойчивости к разрушению. Полимерные молекулы, которые можно использовать по изобретению могут быть синтетическими или природными и включать в качестве неограничивающих примеров полиалкилен с разветвленной или неразветвленной цепью, полиалкениленовые или полиоксиалкиленовые полимеры или разветвленный или неразветвленный полисахарид, такой как гомо- или гетерополисахарид. Предпочтительные примеры синтетических полимеров, которые можно использовать по изобретению, включают полиэтиленгликоль с разветвленной или неразветвленной цепью (ПЭГ), полипропиленгликоль или поливиниловый спирт и их производные или замещенные формы. Особенно предпочтительные замещенные полимеры для связывания с dAb включают замещенный ПЭГ,включая метокси(полиэтиленгликоль). Природные полимерные молекулы, которые можно использовать в дополнение к ПЭГ или вместо него включают лактозу, амилозу, декстран или гликоген, а также их производные, которые известны специалистам в данной области. Дериватизированные формы молекул полимеров включают, например, производные, которые содержат дополнительные функциональные или реакционно-способные группы, находящиеся на них для обеспечения взаимодействия с аминокислотными остатками полипептидов доменных антител, описываемых в настоящем документе. Такие производные включают активные сложные эфиры Nгидроксилсукцинимида (NHS), полимеры сукцинимидилпропионата и сульфгидрил-селективные реактивные средства, такие как имид малеиновой кислоты, винилсульфон и тиол. ПЭГ полимеры, пригодные по данному изобретению, могут представлять собой линейные молекулы или могут быть разветвленными, где в одном полимере присутствует несколько групп ПЭГ. Реакционно-способную группу (например, MAL, NHS, SPA, VS или тиол) можно присоединять непосредственно к ПЭГ полимеру или ее можно присоединять к ПЭГ посредством линкерной молекулы. Размер полимеров, пригодных по данному изобретению, может находиться в диапазоне от 500 до 60 кДа, например, от 1000 до 60 кДа, от 10 до 60 кДа, от 20 до 60 кДа, от 30 до 60 кДа, от 40 до 60 кДа и до размеров от 50 до 60 кДа. Полимеры, используемые по изобретению, особенно ПЭГ, могут представлять собой полимеры с неразветвленной цепью или могут обладать разветвленной конформацией. Молекулы полимеров (ПЭГ), пригодные по данному изобретению, можно присоединять к доменному антителу хорошо известными в данной области способами. Первый этап в присоединении ПЭГ или других полимерных молекул к полипептидному мономеру или полимеру антитела по изобретению представляет собой замещение гидроксильных концевых групп ПЭГ полимера содержащими электрофилы функциональными группами. В частности ПЭГ полимеры присоединяют к цистеиновым или лизиновым остаткам, находящимся в доменном антителе. Цистеиновые и лизиновые остатки могут быть природными или они могут быть сконструированы в молекуле полипептида антитела. Например, цистеиновые остатки можно рекомбинантными способами сконструировать на С-конце полипептида dAb или цистеином или лизином можно замещать остатки в конкретных доступных растворителю положениях на dAb или другом полипептиде антитела.DAb по изобретению могут быть связаны с одной или несколькими молекулами, которые могут увеличивать время ее полужизни in vivo. Эти молекулы можно связывать посредством линкера так, что-6 017710 они не являются препятствием/пространственным затруднением для антигенсвязывающего участка. Альтернативно их можно связывать с константной областью. Как правило, такие молекулы представляют собой полипептиды, которые встречаются в природе in vivo и которые препятствуют разрушению или удалению посредством эндогенных механизмов. Молекулы, которые продлевают время полужизни можно выбирать из следующего:(a) белки из внеклеточного матрикса, например коллаген, ламинин, интегрин и фибронектин;(b) белки, находящиеся в крови, например фибрин -2 макроглобулин, сывороточный альбумин,фибриноген А, фибриноген В, сывороточный амилоидный белок А, гептаглобин, белок, убиквитин, утероглобулин, -2 микроглобулин, плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и панкреатический ингибитор кипсина;(f) белки, находящиеся на гематоэнцефалическом барьере или в нервных тканях, например рецептор меланокортина, миелин, транспортер аскорбиновой кислоты;(g) слитные белки специфичного для рецептора трансферрина лиганда и нейрофармацевтического средства (смотри US5977307); рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина, инсулин, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1), рецептор инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2), рецептор инсулина;(h) белки, локализующиеся в почках, например полицистин, коллаген IV типа, транспортер органических анионов К 1, антиген Нейманна;(j) фактор свертывания крови X;(m) белки, локализующиеся в легких, например секреторный компонент (связывает IgA);(р) специфичные для костей белки, такие как морфогенетические белки кости (BMP), например ВМР-2, -4, -5, -6, -7 (также обозначаемый как остеогенный белок (ОР-1 и -8 (ОР-2);(q) опухолеспецифичные белки, например трофобластный антиген человека, рецептор герцептина,рецептор эстрогена, катепсины, например, катепсин В (находящийся в печени и селезенке);(r) белки, специфичные для заболеваний, например антигены, экспрессируемые только на активированных Т-клетках, включая LAG-3 (гена активации лимфоцитов); лиганд остеопротегерина (OPGL),смотри Nature 402, 304-309, 1999; ОХ 40 (представитель семейства рецепторов TNF, экспрессируемый на активированных Т-клетках, и для которого известно, что только костимулирующая молекула Т-клеток специфически стимулируется в клетках, продуцирующих вирус Т-клеточной лейкемии типа I человека(HTLV-I), см. J. Immunol. 2000 Jul. 1; 16561): 263-70; металлопротеазы (ассоциированные с артритом/злокачественными опухолями), включая CG6512 Drosophila, параплегия человека, FtsH человека,AFG3L2 человека, ftsH мышей; ангиогенные факторы роста, включая кислый фактор роста фибробластов(FGF-1), основный фактор роста фибробластов (FGF-2), фактор роста сосудистого эндотелия/фактор проницаемости сосудов (VEGF/VPF), трансформирующий фактор роста- (TGF-), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-), ангиогенин, интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-8 (IL-8), тромбоцитарный эндотелиальный фактор роста (PD-ECGF), плацентарный фактор роста (P1GF), мидкин тромбоцитарный фактор роста-ВВ (PDGF), фракталкин;(u) антитела, фрагменты или производные, направленные к эндогенным белкам, например сывороточному альбумину. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения dAb по первому аспекту можно мультимеризовать, например, в качестве гетеро- или гомодимеров, гетеро- или гомотримеров, гетероили гомотетрамеров или гетеро- или гомомультимеров более высокого порядка. Мультимеризация может увеличить силу связывания антигена, где сила связывания относится к сумме аффинностей связывания участков множественного связывания. Таким образом, изобретение относится к доменному антителу по первому аспекту, где доменное антитело связано по меньшей мере с одним дополнительным доменным антителом. Каждое dAb может связывать тот же или другой антиген. Мультимеры dAb могут дополнительно содержать одно или несколько dAb, которые являются связанными и где каждое dAb связывает различный антиген, полиспецифичные лиганды, включающие так называемые "лиганды с двойной специфичностью". Например, лиганды с двойной специфичностью могут содержать пару доменов VH или пару доменов VL. Такие лиганды с двойной специфичностью описа-7 017710 ны в WO 2004/003019 (PCT/GB2003/002804) на имя Domantis Ltd. Во втором аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество dAb по первому аспекту по изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем."Фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, средства придания изотоничности и задержки всасывания и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или несколько из воды, физиологического раствора,фосфатно-солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их сочетания. Во многих случаях предпочтительным является включать в композицию средства придания изотоничности, например,сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые вещества, такие как увлажнители или незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы. Композиция может находиться во множестве форм, включая жидкую, полутвердую и твердую лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузируемые растворы),дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительно,композиция находится в форме инъецируемого раствора для иммунизации. Введение может быть внутривенным, подкожным, интраперитонеальным, внутримышечным, трансдермальным, интратекальным и внутриартериальным. Как правило, терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиции можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии,липосомы или других упорядоченных структур, подходящих для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством введения активного соединения (т.е. dAb) в необходимое количество подходящего растворителя с одним или сочетанием ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. Композицию также можно составлять в виде стерильного порошка для приготовления стерильных инъецируемых растворов. Должную текучесть раствора можно поддерживать, например, применением покрытия, такого как лецитин и/или поверхностно-активные вещества,В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получать с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, в таком виде как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Композицию также можно составлять для перорального введения. В этом варианте осуществленияdAb можно помещать в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, прессовать в таблетки или непосредственно вводить в диету субъекта. Композицию также можно составлять для ректального введения. В композицию также можно вводить дополнительные активные соединения. Доменное антитело можно составлять совместно и/или вводить совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например, противовоспалительными соединениями, растворимым рецепторомTNF- или химическим средством, которое ингибирует продукцию TNF-, или антителами, которые связывают другие мишени, такие как цитокины или молекулы клеточной поверхности. Альтернативно,его можно вводить совместно с растворимым иммунохимическим реагентом, таким как белок А, С, G или L. Эффективное количество может включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество dAb по изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному при дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. В предпочтительном варианте осуществления композицию вводят млекопитающим, предпочтительно людям или приматам. В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению dAb по первому аспекту изобретения в диагностическом приложении для определения TNF- человека. Например, dAb к TNF- человека по изобретению можно использовать для выявления TNF- человека, например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма с применением общепринятого иммунологического анализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) или тканевая иммуногистохимия. DAb к TNF- человека по изобретению можно анализировать в биологических жидкостях посредством конкурентного иммунологического анализа с применением стандартов рекомбинантного TNF- человека, меченных детектируемым веществом и немеченого антитела к TNF- человека.DAb к TNF- человека по изобретению также можно использовать для определения TNF- видов,отличных от человека, например шимпанзе, игрунка, резус, мышь, свинья.DAb к TNF- человека по изобретению также можно использовать в приложениях для клеточных культур, где желательно ингибировать активность TNF-. В четвертом аспекте, изобретение относится к способу лечения нарушения у человека, характеризующегося активностью TNF- человека, включающему введение субъекту фармацевтической композиции по второму аспекту изобретения. Нарушение, характеризующееся активностью TNF- человека, включает заболевания и другие нарушения, при которых присутствие TNF- у субъекта, страдающего от нарушения, обнаруживается или подозревается в качестве отвечающего за патофизиологию нарушения или в качестве фактора, способствующего прогрессированию нарушения. Предпочтительно нарушение, характеризуемое активностьюTNF- человека, выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительных заболеваний, сепсиса,включая септический шок, эндотоксический шок, сепсиса из-за грамотрицательных бактерий и синдром токсического шока; аутоиммунного заболевания, включая ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет,аутоиммунный увеит и нефротический синдром; инфекционного заболевания, включая лихорадку и миальгию вследствие инфекции и вторичную относительно инфекции кахексию; реакции трансплантат против хозяина; роста опухолей или метастаз; легочных нарушений, включая синдром расстройства дыхания у взрослых, шоковое легкое, хроническое легочное воспалительное заболевание, легочный саркоидоз, легочный фиброз и силикоз; воспалительных нарушений толстой кишки, включая болезнь Крона и язвенный колит; нарушений сердечной деятельности; воспалительных нарушений костей, гепатита,нарушений свертывания, ожогов, реперфузионного повреждения, келоидного образования и формирования рубцовой ткани. На всем протяжении данной спецификации слово "содержать" или такие вариации, как "содержит" или "содержащий", следует понимать как подразумевающее включение указанного элемента, числа или стадии, или группы элементов, чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, числа или стадии, или группы элементов, чисел или стадий. Все указанные в данной спецификации публикации включены в настоящий документ в качестве ссылки. Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, статей и т.п., которое может быть включено в настоящем описании, приведено исключительно с целью определения контекста настоящего изобретения. Это не следует рассматривать как допущение, что любой или все из этих материалов составляют часть предшествующего уровня техники или общего уровня знания в области, относящейся к настоящему изобретению, как это имеет место в Австралии или в другом месте перед датой приоритета каждого пункта формулы изобретения данной заявки. Для того чтобы можно было яснее понять сущность настоящего изобретения, предпочтительные его формы будут в настоящий момент описаны на основании следующих далее неограничивающих примеров. Пример 1. Материалы и методы Выделение генов VL приматов Нового Света Геномную ДНК игрунки (род Callithrix, вид неизвестен) и трехполосной дурукули (Aotus trivirgatus) получали из European Collection of Cell Cultures (ECACC), каталожные номера 85011419 и 90110510, соответственно. ДНК игрунки получали из клеточной линии В 95-8, тогда как ДНК трехполосной дурукули ДНК получали из клеточной линии ОМК 637-69. Вырожденные праймеры на основе лидирующих последовательностей VK человека и сигнальных последовательностей рекомбинации (RSS) получали на основании Walter and Tomlinson, Antibody Engineering: A Practical Approach (1996). Используемые для амплификации ДНК VK зародышевой линии праймеры представляли собой следующее: Геномную ПЦР (30 циклов) проводили с использованием полимеразы Taq с одной из пар праймеровVK1BLVK1BL35a или VK1BLVK1BL35b. Между клонированными последовательностями существовало перекрытие и использовали два набора праймеров. Продукты ПЦР клонировали в набор для клонирования ТОРО ТА Invitrogen (каталожныйК 450001) и секвенировали с прямым М 13 и обратным pUC праймерами. Последовательность подтверждали в-9 017710 прямом и обратном направлениях для дополнительного подтверждения того, что ключевые последовательности не содержат ошибок ПЦР, ПЦР и процесс клонирования для последовательностей игрунки повторяли дважды. Нуклеотидные (SEQ ID14-24 и SEQ ID36-41) и аминокислотные (SEQ ID25-35 и SEQ ID42-47) последовательности приведены на фиг. 2. Последовательности игрунки 1, 2 и 3 были подтвержденными. Последовательности 4, 5, 6, 7 и 8 присутствовали только в исходной ПЦР. Последовательности 9, 10 и 11 присутствовали только в повторных (т.е. вторых) ПЦР и клонировании. Синтез олигонуклеотидов и клонирование в акцепторную последовательность Как указано, из аминокислотных последовательностей, представленных на фиг. 2 выбрали четыре последовательности CDR, а именно AATKLQS (SEQ ID1) из последовательности 1 трехполосной дурукули (SEQ ID42), EASSLQS (SEQ ID2) из последовательности 2 трехполосной дурукули (SEQID43), EASKLQS (SEQ ID3) из последовательности 1 игрунки (SEQ ID25) и SASNLET (SEQ ID4) из последовательности 2 игрунки (SEQ ID26). Обнаружено, что последовательность 5 из трехполосной дурукули, YASSLQS (SEQ ID48), является идентичной последовательности кДНКGI6176295 Aotus nancymaae (ночная обезьяна Ма), все остальные последовательности являлись уникальными. Вариабельную область акцепторной последовательности (доменное антитело к TNF) в экспрессирующем векторе (патентованный вектор Domantis) последовательно расщепляли (25 мкг) KpnI и SanD1,которые вырезали большинство FR2, а также CDR2, как показано на рестрикционной карте. Затем вектор очищали на геле для удаления вырезанных последовательностей FR2 и CDR2 дикого типа. Отжиг олигонуклеотидов проводили посредством инкубации пар олигонуклеотидов (500 пмоль каждого, как показано на фиг. 4 А и 4 В) при 95 С в течение 5 мин с последующими 65 С в течение 5 мин, а затем оставляли медленно остывать до комнатной температуры в нагревательном блоке. Затем перекрывания достраивали посредством реакции Кленова в присутствие dNTP. Созревание аффинности Соединение 145 со встроенной CDR игрунки (SEQ ID7) подвергали созреванию аффинности посредством конструирования 14 отдельных библиотек, где каждая отличалась от последовательности SEQID7 по одному аминокислотному остатку. Выбранные остатки показаны ниже заштрихованными. Отбор основывался на остатках в CDR1 и CDR3, которые, как известно, являются разнообразными в спектре зрелых Ig человека, и каркасных остатках, для которых наблюдали, что они дают функциональные белки после мутагенеза в родственных dAb. Для каждого из выбранных остатков сконструирована пара комплементарных прямого и обратного праймеров для ПЦР с вырожденностью NKK и проводили две исходных реакции ПЦР, каждую с одним мутагенным праймером и фланкирующим праймером. После очистки два продукта ПЦР отжигали, а затем амплифицировали с использованием только фланкирующих праймеров (сплайсинг посредством достройки перекрывания посредством ПЦР; Lowman H.L.Clackson Т. (eds) , Phage Display: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, UK) . Сначала клоны подвергали скринингу посредством ELIZA с использованием TNF на твердой фазе и положительные клоны секвенировали. Белок dAb очищали от лучших клонов и оценивали на эффективность в анализах связывания рецептора и анализах цитотоксичности для L929. Выявлено, что соединения 100 (SEQ ID9) и 123 (SEQ ID8) обладают улучшенной способностью к нейтрализации TNF относительно исходного соединения dAb 145 (SEQ ID7). Сочетание усиливающих аффинность замен соединений 100 (SEQ ID9) и 123 (SEQ ID8), давало dAb к TNF с дополнительно улучшенной эффективностью в анализе цитотоксичности для L929 (соединение 196; SEQ ID10). Результаты Эффективность клонов dAb к TNF в анализе связывания рецептора (RBA) и в анализе цитотоксичности Способность dAb к TNF ингибировать связывание TNF с его рецептором и нейтрализовать опосредованную TNF цитотоксичность для клеток L929 проводили следующим образом: Анализ связывания рецептораDAb, отличающиеся по 14 выбранным положениям, тестировали на способность ингибировать связывание TNF с рекомбинантным рецептором TNF 1 (р 55). В кратком изложении планшеты Maxisorp инкубировали в течение ночи с 30 мг/мл моноклональным антителом мыши к Fc человека (Zymed, SanFrancisco, USA) . Лунки перед инкубацией со 100 нг/мл слитного белка рецептора TNF 1 и Fc (RD Systems, Minneapolis, USA) промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 0,05% Tween-20, а затем блокировали 1% BSA в PBS. Каждое dAb смешивали с TNF, который добавляли к отмытым лункам в конечной концентрации 10 нг/мл. Связывание TNF выявляли с использованием 0,2 мг/мл биотинилированного антитела к TNF (HyCull biotechnology, Uben, Netherlands) с последующим разведением 1 в 500 меченным пероксидазой хрена стрептавидином (Amersham Biosciences, UK), а затем инкубировали с суб- 10017710 стратом ТМВ (KPL, Gaithersburg, USA). Реакцию останавливали добавлением НСl, а поглощение определяли при 450 нм. Активность dAb в отношение TNF приводила к уменьшению связывания TNF и, таким образом, снижала поглощение по сравнению с контролем в виде одного TNF (фиг. 5). Анализ цитотоксичности для L929DAb к TNF, идентифицированные посредством подхода с отличающимися минибиблиотеками,включая соединения 100 (SEQ ID9) и 123 (SEQ ID8), также тестировали на способность нейтрализовать цитотоксическую активность TNF в отношении фибробластов L929 мыши (Evans, Т. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). В кратком изложении клетки L929 помешенные на планшеты для микротитрования инкубировали в течение ночи с dAb к TNF, 100 пг/мл TNF и 1 мг/мл актиномицина D(Sigma, Poole, UK). Жизнеспособность клеток измеряли посредством определения поглощения при 490 нм после инкубации с [3-(4,5-диметилтиазол-2-ид)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2 Нтетразолом (Promega, Madison, USA). Активность dAb к TNF приводила к снижению цитотоксичностиTNF и, таким образом, увеличению поглощения по сравнению с контролем в виде одного TNF. Результаты в сравнении с исходным соединением dAb 145 (SEQ ID7) представлены на фиг. 6. Специалистам в данной области понятно, что в отношении изобретения можно осуществлять многочисленные вариации и/или модификации без отклонения от сущности или объема изобретения в широком описании, как показано в конкретных вариантах осуществления. Таким образом, настоящие варианты изобретения во всех отношениях следует считать иллюстративными, а не ограничительными. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантное доменное антитело (dAb), связывающееся с TNF- человека, где dAb имеет последовательность, выбранную из последовательностей, состоящих из: 3. Рекомбинантное dAb по п.1 или 2, где CDR1 и/или CDR3 модифицированы для улучшения связывания антигена. 4. Рекомбинантное dAb по любому из пп.1-3, где dAb обладает низкой иммуногенностью у людей. 5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая dAb по любому из пп.1-4. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество рекомбинантного доменного антитела (dAb) по пп.1-4, совместно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. 7. Способ определения TNF- человека в образце, включающий контактирование образца с эффективным количеством рекомбинантного dAb по любому из пп.1-4 и определения количества связанногоdAB. 8. Способ по п.7, где образец представляет собой биологический образец. 9. Способ лечения нарушения у человека, характеризующегося активностью TNF- человека,включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции по п.6. 10. Способ по п.9, где нарушение, характеризующееся активностью TNF- человека, выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительных заболеваний, сепсиса, включая септический шок, эндотоксический шок, сепсис из-за грамотрицательных бактерий и синдром токсического шока; аутоиммунного заболевания, включая ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит и нефротический синдром; инфекционного заболевания, включая лихорадку и миальгию вследствие инфекции и вторичную относительно инфекции кахексию; реакции трансплантат против хозяина; роста- 11017710 опухолей или метастаз; легочных нарушений, включая синдром расстройства дыхания у взрослых, шоковое легкое, хроническое легочное воспалительное заболевание, легочный саркоидоз, легочный фиброз и силикоз; воспалительных нарушений толстой кишки, включая болезнь Крона и язвенный колит; нарушений сердечной деятельности; воспалительных нарушений костей, гепатита, нарушений свертывания,ожогов, реперфузионного повреждения, келоидного образования и формирования рубцовой ткани. Список последовательностей