Элементы нуклеиновых кислот, обладающие регуляторной функцией

В изобретении описаны последовательности ДНК, прежде всего усиливающие транскрипцию или экспрессию элементы (ТЕ-элементы), а также их применение в экспрессионном векторе в сочетании с энхансером, промотором, геном продукта и селектируемым маркером. В изобретении описаны также последовательность SEQ ID NO: 1, а также ТЕ-элементы ТЕ-01, -02, -03, -04,-06, -07, -08, -10, -11 или -12. Наиболее предпочтительными являются ТЕ-06, ТЕ-07 или ТЕ-08,что обусловлено их небольшим размером. Последовательность NO: 1 выведена из области последовательности, расположенной против хода транскрипции относительно кодирующей области гена Ub/S27a из СНО-клеток. ТЕ-элементы вызывают усиление экспрессии гена продукта при стабильной интеграции в эукариотический геном, предпочтительно геном CHO-DG44-клетки. Это позволяет преодолевать хромосомальные позиционные воздействия, защищать от них или устранять их. В результате этого достигается повышение доли высокопродуктивных клеток в трансфектированной смеси, а также абсолютного уровня экспрессии вплоть до 15 раз.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: БРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ФАРМА ГМБХ УНД КО. КГ (DE) 016880 Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к цис-активным нуклеотидным последовательностям, так называемым ТЕ-элементам. ТЕ-элементы предпочтительно выводят из генома СНО. Их применение, например, в экспрессионных векторах позволяет обеспечивать в стабильных клеточных популяциях по меньшей мере в два раза более высокий уровень экспрессии представляющего интерес гена в требуемом локусе хромосомы по сравнению с используемыми до настоящего времени векторами. Предпосылки создания изобретения Клетки млекопитающих представляют собой предпочтительные клетки-хозяева для получения сложных биофармацевтических белков, поскольку осуществленные посттрансляционные модификации совместимы с человеческим организмом как в функциональном, так и фармакокинетическом отношении. Наиболее пригодными типами клеток являются гибридомы, миеломы, СНО-клетки (клетки яичника китайского хомячка) и ВНК-клетки (клетки почки детеныша хомяка). Культивирование клеток-хозяев осуществляют во все возрастающем масштабе в бессывороточных и безбелковых условиях производства. Основаниями для этого являются связанное с этим снижение затрат, меньшие трудности при очистке рекомбинантного белка, а также уменьшение возможности внесения патогенов (например, прионов, вирусов). Применение СНО-клеток в качестве клеток-хозяев находит все большее распространение, поскольку такие клетки могут быть адаптированы к росту в виде суспензионной культуры в бессывороточной и безбелковой среде и, кроме того, рассматриваются и признаны регулирующими органами как безопасные клетки-продуценты. Для создания стабильной линии клеток млекопитающего, экспрессирующих представляющий интерес гетерологичный ген, гетерологичный ген, как правило, вместе с селектируемым маркерным геном,таким, например, как ген неомицинфосфотрансферазы (NPT), встраивают путем трансфекции в требуемую линию клеток. Гетерологичный ген и селектируемый маркерный ген могут экспрессироваться в клетке-хозяине после ее трансфекции одним вектором, содержащим оба указанных гена, или после котрансфекции векторами, содержащими каждый из указанных генов по отдельности. Через два-три дня после осуществления трансфекции трансфектированные клетки переносят в среду, содержащую селектирующий агент, например G418, в случае применения гена неомицинфосфотрансферазы (NPT-гена), и культивируют в течение нескольких недель в этих селектирующих условиях. Выращенные устойчивые клетки, в которые интегрирована экзогенная ДНК, можно выделять и анализировать в отношении экспрессии требуемого продукта гена (представляющего интерес гена). Для биофармацевтического производства требуются линии клеток с высокой и стабильной продуктивностью. Для обеспечения высоких уровней экспрессии продукта в экспрессионные векторы для клеток-продуцентов встраивают сильные, прежде всего конститутивно экспрессируемые промоторы и энхансеры, такие, например, как энхансер и промотор CMV. Поскольку экспрессию продукта необходимо обеспечивать в течение как можно большего промежутка времени, то отбирают клетки, в геном которых стабильно интегрирован ген продукта. Это осуществляют с помощью селектируемых маркеров, таких,например, как неомицинфосфотрансфераза (NPT) и дигидрофолатредуктаза (DHFR). В результате случайной интеграции экспрессионных векторов в геном клетки-хозяина получают клетки, характеризующиеся различными уровнями экспрессии требуемого продукта гена, поскольку его экспрессия обусловлена не только силой предварительно включенного промотора или комбинации промотор/энхансер. Присутствующие в сайте интеграции хроматиновые структуры могут оказывать на экспрессию как отрицательное, так и положительное влияние. Поэтому в экспрессионные векторы все более часто интегрируют также цис-активные элементы, которые оказывают положительное влияние на экспрессию на уровне хроматина. К ним относятся локус контролирующие участки (Locus Control Regions) (LCR), которые встречаются, например, в 5'-области гена -глобина (Li и др., 2002) и в 3'-области гена TCR. Они обеспечивают высокий уровень тканеспецифичной экспрессии сшитого трансгена в хроматине, характеризующейся тем, что она не зависит от положения и не зависит от количества копий. Эти свойства свидетельствуют о том, что LCR обладают способностью "открывать" хроматин ("закрытую" конформацию хроматина) в его нативной ткани (Ortiz и др., 1997). Существуют различные формы (-талассемии, при которых локус-глобина находится в интактном состоянии, но не экспрессируется. Причина отсутствия экспрессии заключается в наличии большой делеции в 5'-области генов -глобина. Делеция этого LCR -глобина приводит к "закрытой" конформации хроматина, которая распространяется на весь локус и приводит к подавлению экспрессии гена (Li и др., 2002). LCR локализованы вместе с гиперчувствительными сайтами (HS) ДНКазы I в хроматине экспресирующих клеток. Присутствие HS свидетельствует также об "открытой" конформации хроматина. HS включают ряд различных общих и тканеспецифичных сайтов связывания факторов транскрипции. В результате взаимодействия факторов транскрипции с ДНК возникаетHS, функции которых в большей или меньшей степени отличаются друг от друга. Например, ген TCR экспрессируется под эндогенным контролем только в Т-клеточной ткани. В зависимости от ткани и ста-1 016880 туса экспрессии локус существует в различных формах хроматина. В 3'-области он имеет локус, контролирующий участок, который содержит восемь HS. HS 2-6, представляющие собой частичный фрагментLCR длиной 6 т.п.н., обладают активностью в отношении "открытия" хроматина и не являются тканеспецифичными. HS 7, 8 и 1 (длиной 3 т.п.н.) придают тканеспецифичность специфичной в отношении Тклеток экспрессии в тимусе. TCRLCR обладает полной функциональной способностью только при наличии полной комбинации всех HS (Ortiz и др., 1997). Более полное описание распределения и спецификации функций индивидуальных HS TCRLCR можно найти у Ortiz и др., 1999. Этот пример показывает,что LCR в функциональном отношении являются очень сложными и могут состоять из различных контролирующих элементов, таких как энхансеры, "выключающие элементы" и "изолирующие элементы". Другими примерами доменов, между которыми распределены функции LCR, являются TCR-локус и локус -глобина. Первый состоит из гиперчувствительного сайта ДНКазы I HsA и энхансера 3'EC1. Считается, что TCR-LCR помимо своей обычной функции участвует в рекомбинации генов TCR (Baker и др., 1999). Локус -глобина имеет пять HS с различными функциями, для осуществления которыми своих функций в полном объеме требуется также наличие тканеспецифичного промотора. LCR могут играть также важную роль в тканеспецифичном деметилировании ДНК, поскольку метилирование ДНК приводит к образованию "закрытой" структуры хроматина и инактивации генов. Возможно также наличие механизма действия, который активирует экспрессию гена в результате повышенного ацетилирования гистона (Li и др., 2002). Участки присоединения к ядерному скелету/матриксу (S/MAR) представляют собой последовательности ДНК, которые связываются с высокой аффинностью in vitro с компонентами матрикса или скелета клеточного ядра. Они формируют структурные и возможно также функциональные границы доменов хроматина (Zahn-Zabal и др., 2001). S/MAR обладают способностью взаимодействовать с энхансерами, а также повышать местную доступность ДНК в хроматине и те самым усиливать экспрессию стабильно интегрированных гетерологичных генов в линиях клеток, в организме трансгенных животных и растениях (Klehr и др., 1991; Stief и др., 1989; Jenuwein и др., 1997; Zahn-Zabal и др., 2001). Однако они не могут полностью защитить хромосомный локус от близко расположенных элементов для того, чтобы могла осуществляться независимая от положения экспрессия (Poljak и др., 1994). Воздействие MAR можно использовать для того, чтобы повышать долю клонов клеток или трансгенных животных, получаемых в эксперименте по трансфекции, характеризующихся высоким уровнем экспрессии (McKnight и др., 1992;Zahn-Zabal и др., 2001). Однако опубликованы также данные о MAR, которые не приводят к высокому уровню экспрессии, но играют важную роль в правильной регуляции генов, специфических в отношении стадии развития (McKnight и др., 1992). Под "изолирующими элементами" понимают нейтральную границу между соседними участками,оказывающими друг на друга влияние, например между активным и неактивным хроматином (пограничные элементы). Они могут ограничивать воздействие энхансеров или изолировать от него целые домены ДНК и защищать стабильно трансфектированные репортерные гены от позиционных воздействий (Bell иFelsenfeld, 1999; Udvardy, 1999). Таким образом, эти элементы приводят к независимости экспрессии от положения в геноме. Кроме того, они могут предотвращать "молчание (выключение)" трансгенов в отсутствие давления отбора (Pikaart и др., 1998). Еще одна предполагаемая функция "изолирующих элементов" заключается в ограничении территорий репликации (Bell и Felsenfeld, 1999). Первыми описанными "изолирующими элементами" были scs и scs' из Drosophila. Они образуют границу для генов "теплового шока" hsp70 и подавляют позиционные воздействия (Udvardy и др., 1985). Еще одним элементом, обладающим изолирующей функцией, является богатый GC фрагмент, присутствующий в dhfr-гене китайского хомячка, который содержит CpG-островки (Poljak и др., 1994). Сам по себе фрагмент не оказывает никакого влияния на экспрессию репортерного гена. Однако этот фрагмент, расположенный между стимулирующим экспрессию SAR и репортерным геном, может существенно препятствовать усиливающему экспрессию воздействию SAR-элемента. Возможно, что этот богатый GC фрагмент блокирует присущий SAR-элементу механизм "открытия" хроматина и, следовательно,функционирует в качестве "изолятора". Элементы, содержащие обширные CpG-островки, с высокой вероятностью подвергаются метилированию, поскольку они распознаются ДНК-метилтрансферазой, которая превращает цитозин в 5-метилцитозин. В результате этого образуется неактивный хроматин (Poljak и др., 1994). Впервые Aronow с соавторами обнаружили в первом интроне человеческого гена ADA (аденозиндеаминаза) новый регуляторный элемент, который вносит существенный вклад в зависимую от количества копий гена и не зависимую от положения экспрессию (Aronow и др., 1995). Элемент имеет длину вплоть до 1 т.п.н. и обладает функциональной активностью только в том случае, когда он фланкирует специфический в отношении Т-клеток энхансер длиной 200 пар нуклеотидов. Если присутствует только один из двух сегментов или сегменты расположены в неправильном порядке и ориентации, то элемент не обладает функциональной активностью, так как это препятствует образованию гиперчувствительных в отношении ДНКазы I сайтов на энхансере. В заявке на патент WO 02/081677 на имя фирмы Cobra Therapeutics описан еще один оказывающий-2 016880 влияние на хроматин элемент. Повсеместно распространенные открывающие хроматин элементы(UCOE) ответственны за "открытие" структуры хроматина в областях хромосомы, несущих повсеместно экспрессируемые гены "домашнего хозяйства" (человеческий ген hnRNP A2, человеческий ген -актина,человеческий ген PDCD2). Все эти гены имеют богатые CpG островки в нетранслируемых областях, которые сравнительно слабо метилированы. Отсутствие метилирования CpG-островков означает, что в этом месте хроматин является активным. UCOE способствуют усилению экспрессии, независимо от геномного окружения и типа клетки или ткани. Фирма Immunex также опубликовала данные о цис-активных последовательностях ДНК, которые вызывают усиление экспрессии (US 6027915, US 6309851). Элемент, который получил название "элемент последовательности, усиливающий экспрессию" (Expression Augmenting Sequence Element) (EASE), способствует обеспечению высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих,он не обладает активностью в системах кратковременной экспрессии и не обладает типичными особенностями последовательности, присущими LCR и S/MAR. Он не представляет собой также последовательность, кодирующую транс-активируемый белок, поскольку не содержит открытой рамки считывания. Фрагмент имеет длину 14,5 т.п.н., происходит из геномной ДНК СНО-клеток и обладает способностью повышать в восемь раз экспрессию стабильно интегрированного репортерного гена. Свыше 50% активности элемента обусловлены сегментом длиной 1,8 т.п.н., причем первые 600 пар оснований этого сегмента являются необходимыми для правильного его функционирования. Дополнительным свойством участков последовательности с высокой EASE-активностью является наличие нескольких сайтов связывания HMG-I(Y). HMG-I(Y)-белки относятся к семейству высокоподвижной группы не содержащих гистон хроматиновых белков. Их обозначают также как "архитектурные факторы транскрипции" и они образуют новую категорию транс-регуляторов генов млекопитающих. HMG-I(Y)-белки распознают богатые AT последовательности и связываются с их так называемыми "АТ-крючками" (ДНК-связывающими доменами) в малой борозде ДНК. Это может приводить к локальным изменениям топологии ДНК и вследствие этого к изменению экспрессии гена. Авторы патента US 6309841 предполагают, что воздействия EASE связаны с индуцируемой МТХ амплификацией интегрированной плазмиды. В случае индуцируемой МТХ амплификации гена возникают так называемые циклы разрыва-слияния мостиков. Легко можно предположить, что при этом HMG-I(Y)-белки играют роль в структурных изменениях ДНК, приводящих к возникновению и устранению разрывов ДНК. Другие элементы, усиливающие экспрессию гена в клетках млекопитающих, описаны у Kwaks и др., 2003. Эти так называемые STAR-элементы (стимулирующие и антирепрессорные элементы (Stimulatory and Anti-Repressor Elements получают путем скрининга библиотеки человеческих генов, содержащей ДНК-фрагменты длиной от 500 до 2100 пар оснований. Скрининг осуществляют с использованием специально сконструированной репортерной плазмиды. Экспрессия репортерного гена может осуществляться только в том случае, когда он функционально связан с антирепрессорным элементом из банка человеческих генов. С помощью таких STAR-элементов авторам удалось защитить трансгены от позиционных воздействий в геноме клеток млекопитающих. Сопоставление с геномом мыши показало, что большинство таких STAR-элементов присутствуют как в человеческом, так и в мышином геноме и являются высококонсервативными в обоих этих видах. При создании линий клеток с высоким уровнем экспрессии требуемых белков возникает большая проблема, связанная со случайной и ненаправленной интеграцией рекомбинантного вектора в обладающие транскрипционной активностью или неактивные локусы генома клетки-хозяина. В результате этого получают популяцию клеток, характеризующихся совершенно различными уровнями экспрессии гетерологичного гена, причем продуктивность клеток, как правило, подчиняется нормальному закону распределения. Поэтому для идентификации клонов клеток, которые обеспечивают очень высокий уровень экспрессии представляющего интерес гетерологичного гена, необходимо проверить и протестировать большое количество клонов, что сопряжено с большими затратами времени, трудоемкостью и высокой стоимостью. Поэтому оптимизация применяемых для трансфекции векторных систем нацелена на то,чтобы, прежде всего, обеспечить или даже усилить транскрипцию стабильно интегрированного трансгена путем применения пригодных цис-активных элементов. К цис-активным элементам, которые оказывают свое действие на уровне хроматина, относятся, например, уже описанные локус контролирующие участки, участки присоединения к скелету/матрице, "изолирующие элементы" и т.д. Некоторые из этих элементов защищают определенные гены от воздействий окружающего хроматина. Другие обладают энхансер-подобной активностью, хотя она распространяется только на стабильно интегрированные конструкции. Еще одни элементы объединяют некоторые из указанных функций. Часто оказывается невозможным однозначно отнести такие элементы именно к определенной группе. В стабильных линиях клеток экспрессия трансгенного продукта гена в значительной степени зависит также от хромосомных позиционных воздействий. Это явление обусловлено воздействием структуры хроматина и/или присутствия присущих ей регуляторных элементов на сайт интеграции чужеродной ДНК. Это приводит к очень сильной вариации уровней экспрессии. Поэтому в процессе отбора клеток часто возникают клоны, характеризующиеся очень низким уровнем экспрессии продукта или полным ее отсутствием. Такие хромосомные позиционные воздействия часто являются причиной того, что создание-3 016880 стабильных линий клеток-продуцентов, в которых происходит экспрессия терапевтических белков с высоким уровнем, как правило, является продолжительным, трудоемким и дорогостоящим процессом. Как правило, стабильные линии клеток с высокой продуктивностью создают путем отбора с использованием положительных селектируемых маркеров, часто в сочетании с индуцируемой различными агентами амили глутаминсинтетаплификацией гена(например,дигидрофолатредуктаза/метотрексат за/метионинсульфоксим). Полученные с помощью этой стратегии отбора пулы и клоны анализируют в отношении высокой и стабильной экспрессии с помощью трудоемкого процесса скрининга. Большинство клонов не обладают способностью продуцировать продукт или продуцируют его лишь в небольших количествах, только немногие клоны являются высокоэффективными продуцентами. Долю эффективных продуцентов в смешанной популяции можно повышать, например, с помощью мутации, введенной в селектируемый маркер (Sautter и Enenkel, 2005, WO 2004/050884). Однако желательным является дальнейшее повышение удельной продуктивности каждого индивидуального клона, а также доли высокоэффективных продуцентов в популяции трансфектированных клеток. Необходимо повышать удельную продуктивность стабильно трансфектированных клеток, прежде всего СНО-клеток или других пригодных для продуцирования клеток, и долю высокоэффективных продуцентов в трансфектированной партии. В конечном итоге это должно приводить к созданию более эффективной линии клеток. Таким путем можно за более короткий промежуток времени создавать в большем количестве обладающие более высокой продуктивностью линии клеток и при этом сокращать трудоемкость, затраты времени и средств. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к регуляторным нуклеиновым кислотам, прежде всего к нуклеиновой кислоте, которая имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, которую называют"ТЕ-элементом", или ее фрагменту или производному, которая приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в стабильно трансфектированных клетках. При создании изобретения неожиданно было установлено, что встраивание такого ТЕ-элемента в экспрессионном векторе в сочетании с промотором, геном продукта, селектируемым маркером и необязательно энхансером путем стабильной интеграции в геном хозяина, такой, например, как геном CHO-DG44, позволяет преодолевать хромосомные позиционные воздействия, защищает от них или устраняет их. В результате этого повышается как доля высокоэффективных продуцентов в трансфектированной партии, так и абсолютный уровень экспрессии. Кроме того, изобретение относится к экспрессионным векторам, которые содержат усиливающие транскрипцию или экспрессию области, фрагменты или производные SEQ ID NO: 1, предпочтительно ТЕ-элементы ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), ТЕ-01 (SEQ ID NO: 3), TE-02 (SEQ ID NO: 4), ТЕ-03 (SEQ ID NO: 5),TE-04 (SEQ ID NO: 6), TE-06 (SEQ ID NO: 8), TE-07 (SEQ ID NO: 9), TE-08 (SEQ ID NO: 10), TE-10 (SEQID NO: 12), ТЕ-11 (SEQ ID NO: 13), ТЕ-12 (SEQ ID NO: 14), ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), ТЕ-14 (SEQ ID NO: 16), ТЕ-15 (SEQ ID NO: 17), TE-16 (SEQ ID NO: 18), ТЕ-17 (SEQ ID NO: 19), ТЕ-18 (SEQ ID NO: 20) и ТЕ-21 (SEQ ID NO: 21). Наиболее предпочтительными являются TE-06, TE-07 или ТЕ-08, а также ТЕ-13(SEQ ID NO: 15) благодаря их малому размеру.SEQ ID NO: 1 происходит из области последовательности, которая расположена против хода транскрипции относительно кодирующей области гена убикитина/S27 а, выделенной из СНО-клеток, где указанный ген кодирует белок, необходимый для метаболизма рибосомы клетки. При создании изобретения неожиданно было установлено, что дополнительное введение цисактивных ТЕ-элементов в экспрессионные векторы приводит к повышению вплоть до 7 раз удельной продуктивности стабильно трансфектированных пулов клеток, прежде всего пулов клеток линии СНОDG44, по сравнению с используемыми до настоящего времени экспрессионными векторами. В отличие от этого при кратковременной трансфекции пулов клеток линии CHO-DG44 введение ТЕ-элементов не позволяет достигать повышения продуктивности. Следовательно, наблюдаемое повышение продуктивности в стабильных пулах клеток не обусловлено энхансером, присутствующим в ТЕ-элементах. Таким образом, для обусловленного ТЕ-элементами повышения продуктивности абсолютно необходима интеграция в хромосому. Это свидетельствует о том, что ТЕ-элементы могут подавлять негативные хромосомальные позиционные воздействия, защищать от них или устранять их. Тем самым можно создавать и идентифицировать цис-активные элементы, которые отличаются тем, что они являются наиболее пригодными для применения при отборе и обогащении клеток, обладающих высокой продуктивностью, и тем самым можно снижать затраты времени, денежных средств и мощностей для выделения и идентификации высокоэффективных клонов-продуцентов. Изобретение можно применять, например, для создания линий клеток, обладающих высокой продуктивностью, которые, например, требуются для производства биофармацевтических лекарственных средств, в аналитических анализах, основанных на использовании клеток, в высокопроизводительных методах скрининга субстанций или для получения рекомбинантных белковых продуктов для ЯМРспектроскопии, а также для других анализов и т.д. Благодаря высокой удельной продуктивности и уменьшению доли клеток, которые не экспрессируют продукт или экспрессируют его в небольшом количестве, можно за более короткое время создавать большее количество обладающих высокой продук-4 016880 тивной способностью линий клеток и тем самым снижать трудоемкость и стоимость. Другими возможными применениями являются создание более совершенных робастных линий клеток-хозяев (например,встраивание антиапоптозных генов или генов гликозилирования), трансгенных животных или растений,а также применение в генной терапии. Прототипы для изобретения отсутствуют. Нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, представляет собой нуклеотидную последовательность, выделенную из генома китайского хомячка (Cricetulus griseus). Она происходит из области последовательности, расположенной против хода транскрипции относительно кодирующей области гена убикитина/S27 а. Нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, имеет среднее содержание GC 44% и не содержит никаких более длинных участков, состоящих из GC-повторов. Такое содержание GC сопоставимо со средним содержанием GC в геномной ДНК млекопитающих, которое,как описано, составляет примерно 40% (Delgado и др., 1998). Поиск богатых CpG областей с помощьюnewcpgseek (пакет программ для анализа последовательностей EMBOSS) позволил выявить только пять очень коротких областей последовательности, которые характеризуются абсолютно более высокой частотой встречаемости димеров CpG и/или повышенной долей CpG по сравнению с GpC: нуклеотиды 2242-2259 (18 пар оснований), 3129-3146 (18 пар оснований), 3215-3240 (26 пар оснований), 3417-3461(44 пары оснований) и 3658-3788 (131 пара оснований) SEQ ID NO: 1. Результаты поиска показали, что нуклеотидная последовательность не содержит более длинных CpG-островков. Кроме того, SEQ ID NO: 1 содержит два тандемных повтора (нуклеотиды 2179-2244 и нуклеотиды 1027-1080) и два инвертированных повтора (нуклеотиды 8-47 и нуклеотиды 1726-1766), которые были идентифицированы с помощью программ EMBOSS как etandem (тандемные) и einverted (инвертированные). ТЕ-08 соответственно содержит один инвертированный повтор. В области последовательности,расположенной между 1 и 1578 парой оснований, находится соответственно один тандемный повтор и один инвертированный повтор. Участки нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1,уже были описаны в WO 97/15664: нуклеотиды 1579-3788 SEQ ID NO: 1 соответствуют нуклеотидам 12201 SEQ ID NO: 5, описанной в WO 97/15664, однако с одним отличием. При создании SEQ ID NO: 1,предлагаемой в изобретении, в процессе клонирования были встроены 4 дополнительных нуклеотида,которые возникли в результате реакции заполнения существующего сайта рестрикции EcoRI. Указанное встраивание 4 дополнительных нуклеотидов имело место между нуклеотидами 357 и 358 SEQ ID NO: 5,описанной в WO 97/15664. Однако нуклеотиды 1-1578 нуклеотидной последовательности, которая представлена SEQ ID NO: 1, предлагаемой в настоящем изобретении, представляют собой новые, до настоящего времени неизвестные области последовательности, которые выделены согласно настоящему изобретению. В WO 97/15664 не было описано также, что SEQ ID NO: 1, предлагаемая в настоящем изобретении, или ее фрагменты или производные, усиливают транскрипцию или экспрессию представляющего интерес гена независимо от сайта интеграции в хромосому, когда они функционально связаны с комбинацией промотор/энхансер, которая позволяет осуществляться транскрипции представляющего интерес функционально связанного гена. Напротив, в WO 97/15664 описано применение 5'UTRпоследовательностей гена убикитина/S27 а в качестве промотора, где область последовательности от положения - 161 до положения - 45, представленная на фиг. 5 WO 97/15664, является необходимой для обеспечения промоторной активности. Указанная область последовательности только частично присутствует в предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте, последовательность которой представлена вSEQ ID NO: 1, и в выведенном из нее фрагменте, последовательность которого представлена в SEQ IDNO:2 (от положения - 161 до положения -89 согласно фиг. 5 WO 97/15664). Другие фрагменты и производные SEQ ID NO: 1 вообще не содержат указанной области последовательности. Кроме того, предлагаемая в изобретении нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 1, согласно результатам анализа с помощью стандартного алгоритма сравнения первичной структуры последовательностей, такого, например, как BLAST, не обладает гомологией последовательности с нуклеотидными последовательностями, описанными в перечисленных ниже заявках на патент, которые также могут оказывать положительное воздействие на экспрессию на уровне хроматина в cis: а) нуклеотидные последовательности UCOE, описанные в WO 00/05393; б) нуклеотидные последовательности EASE, описанные в US 6309841; в) нуклеотидные последовательности STAR, описанные в WO 03/004704. Применение более сложных стратегий сравнительного анализа первичной структуры последовательностей также не позволило выявить обширной гомологии последовательности с нуклеотидными последовательностями, указанными в подпунктах а)-в). Описание чертежей Фиг. 1 - схематическое изображение базовых векторов. Векторы, обозначенные буквой А, применяли для экспрессии рекомбинантных моноклональных антител IgG1 типа в клетках линии СНО-DG44. В данном случае "Е/Р" обозначает комбинацию энхансера-5 016880 из CMV и промотора убикитина/S27 а хомячка, "Р" обозначает только промоторный элемент, а "Т" обозначает сигнал терминации транскрипции, необходимый для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждой транскрипционной единице обозначено стрелкой. Для клонирования ТЕ-элементов перед комбинацией промотор/энхансер присутствует сайт, распознаваемый рестриктазой SpeI ("SpeI"). Амплифицируемый селектируемый маркер,представляющий собой дигидрофолатредуктазу, обозначен сокращением "dhfr". Селектируемый маркер,представляющий собой неомицинфосфотрансферазу, содержит точковую мутацию D227G и на чертеже сокращенно обозначен как "D227G". Элемент "IRES", имеющий происхождение из вируса энцефаломиокардита, служит в качестве внутреннего сайта связывания рибосомы в бицистронной единице транскрипции и позволяет осуществлять трансляцию расположенного за ним зеленого флуоресцентного белка"GFP". "НС" и "LC" обозначают тяжелую и легкую цепь гуманизированного моноклонального антителаIgG1-типа соответственно. Вектор, обозначенный буквой "Б", применяли для экспрессии рекомбинантного белка МСР-1 в клетках линии CHO-DG44. "Е/Р" обозначает комбинацию энхансера из CMV и промотора из CMV, "P" обозначает только промоторный элемент, а "Т" обозначает сигнал терминации транскрипции, необходимый для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждой транскрипционной единице обозначено стрелкой. Для клонирования ТЕ-элемента перед промотором встроена область последовательности "А", содержащая сайты ресткрикции, расщепляемые эндонуклеазами (адаптер). Селектируемый маркер неомицин-фосфотрансфераза содержит точковую мутацию F240I и сокращенно обозначен на чертеже как "F240I". Элемент "IRES", имеющий происхождение из вируса энцефаломиокардита, служит в качестве внутреннего сайта связывания рибосомы в бицистронной транскрипционной единице и позволяет осуществлять трансляцию расположенного за ним красного флуоресцентного белка "dsRed". "МСР-1" обозначает человеческий моноцитарный хемоаттрактантный белок-1. Фиг. 2 - схематическое изображение базового экспрессионного вектора для МСР-1. Представленный на данном чертеже вектор применяли для экспрессии рекомбинантного белка МСР-1 в клетках линии CHO-DG44. "Е/Р" обозначает комбинацию энхансера из CMV и промотора изCMV, "Р" обозначает только промоторный элемент, а "Т" обозначает сигнал терминации транскрипции,необходимый для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждой транскрибируемой единице обозначено стрелкой. Для клонирования ТЕ-элемента перед промотором встроена область последовательности "А", содержащая сайты ресткрикции, расщепляемые эндонуклеазами (адаптер). На данном чертеже селектируемый маркер, представляющий собой дигидрофолатредуктазу, сокращенно обозначен как "dhfr". Элемент "IRES", имеющий происхождение из вируса энцефаломиокардита, служит в качестве внутреннего сайта связывания рибосомы в бицистронной единице транскрипции и позволяет осуществлять трансляцию расположенного за ним красного флуоресцентного белка "dsRed". "МСР-1" обозначает человеческий моноцитарный хемоаттрактантный белок-1. Фиг. 3-5' - последовательность гена убикитина/S27 а СНО. Область последовательности длиной 3788 пар оснований (SEQ ID NO: 1) выделяли из генома СНОклеток (клетки яичника китайского хомячка) и помещали против хода транскрипции относительно кодирующей области гена Ub/S27a, которая представляет собой слияние единицы убикитина (Ub) и рибосомального белка малой рибосомальной субъединицы (S27a). Фиг. 4 - графическое изображение ТЕ-элементов 00-12. На этом чертеже схематически представлена область геномной последовательности длиной 3788 пар оснований, локализованная против хода транскрипции относительно кодирующей области гена убикитина/S27 а СНО, которую субклонировали в плазмиде. Из этой геномной последовательности (SEQ IDNO: 1), которая обозначена также как ТЕ-элемент А, получали частичные фрагменты различной длины,которые ниже обозначены как ТЕ-элементы. ТЕ-элемент 00 (SEQ ID NO: 2) выделяли из субклона указанной последовательности в виде рестрикционного SacII-фрагмента и клонировали в сайте, расщепляемом SpeI векторов-мишеней pBID-HC и pBING-LC. Они содержали либо ген тяжелой цепи (НС), либо ген легкой цепи IgG1 (см. фиг. 1 А). В результате получали экспрессионные векторы, в которых ТЕэлемент 00 расположен в прямой и обратной ориентации против хода транскрипции относительно промотора. ТЕ-элементы 01-12 получали с помощью ПЦР с использованием различных пар праймеров (см. фиг. 5 и 6) и клонировали в сайте BamHI/BsrGI в базовых плазмидах рТЕ 4/МСР-1 (фиг. 1 Б) и рТЕ 5/МСР 1 (фиг. 2). Фиг. 5 - ТЕ-элементы 00-12. В этой таблице представлены размеры, а также начальные и конечные положения ТЕ-элементов 0021, полученных из последовательности ТЕ-A (SEQ ID NO: 1). Для фрагментов, которые получали с помощью ПЦР, дополнительно указаны праймеры, которые применяли для этой цели. Градации размеров элементов составляли примерно 500 пар оснований, и элементы по сравнению с исходной последовательностью ТЕ-А (SEQ ID NO: 1) имели делеции на 5'- или 3'-конце. Фиг. 6 - праймеры для синтеза ТЕ-элементов 01-12-6 016880 Праймеры представлены в направлении 5'3'. Праймеры, в обозначении которых имеется слово"for", представляют собой праймеры в прямой ориентации относительно SEQ ID NO: 1, праймеры, в обозначении которых имеется слово "rev", представляют собой праймеры в обратной ориентации. Каждый праймер на 5'-конце содержит шесть любых нуклеотидов, за которыми следует сайт рестрикции BamHI или BsrGI и последовательность длиной примерно 20-30 нуклеотидов, которая на 100% гомологична участку последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Область праймера, гомологичная SEQ IDNO: 1, выделена жирным шрифтом. Для амплификации участка последовательности SEQ ID NO: 1 каждый раз применяли один "for-праймер" и один "rev-праймер". Полученный ПЦР-продукт клонировали в сайтах рестрикции BamHI и BsrGI в базовой плазмиде рТЕ 4/МСР-1 (фиг. 1 Б) или рТЕ 5/МСР-1 (фиг. 2). Фиг. 7 - FACS-анализ серий трансфектированных продуктов Б. На чертеже представлено относительное усиление экспрессии GFP в клетках, несущих ТЕ-элемент 00, по сравнению с клетками, не имеющими ТЕ-элемент 00. Для этого анализа клетки линии CHO-DG4 трансфектировали комбинациями плазмид pBING-LC и pBID-HC, которые отличались друг от друга только наличием и ориентацией ТЕ-элемента 00. После двух-, трехнедельного отбора трансфектированных пулов клеток в среде, не содержащей НТ, но дополненной G418, измеряли флуоресценцию GFP с помощью FACS-анализа. На каждом графике, за исключением графика для служивших в качестве отрицательного контроля нетрансфектированных клеток линии CHO-DG44 ("DG44") данные представляют собой средние значения флуоресценции GFP, полученные в каждом случае для десяти пулов серий трансфектированных продуктов Б. Анализировали по 20000 клеток на пул. "Контроль" обозначает базовые плазмиды pBING-LC и pBID-HC, "Revers" обозначает обратную ориентацию ТЕ-элемента 00 в базовых векторах, "Direkt" обозначает прямую ориентацию ТЕ-элемента 00 в базовых векторах. Фиг. 8 - FACS-анализ серий трансфектированных продуктов В. На чертеже представлена доля клеток, экспрессирующих dsRed2, в стабильных популяциях клеток,которые содержат ТЕ-элементы 01, 02, 05, 06, 08 или 09, в сравнении с долей клеток в популяциях клеток, которые не содержат ТЕ-элемент. Для этого анализа клетки линии CHO-DG44 трансфектировали плазмидой рТЕ 4/МСР-1 или полученными на ее основе производными, которые дополнительно содержали один из указанных выше ТЕ-элементов. После примерно трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в среде, дополненной G418, измеряли флуоресценцию dsRed2 с помощью FACSанализа. Анализировали по 10000 клеток на пул и вычитали флуоресценцию, обусловленную нетрансфектированными клетками линии CHO-DG44. Каждое значение представляет собой среднее значение доли (в процентах) клеток, экспрессирующих dsRed2, полученное для 6 пулов серий трансфектированных продуктов В. Фиг. 9 - влияние ТЕ-элементов на удельную продуктивность. На этом чертеже проиллюстрированы изменения уровня экспрессии IgG1 или МСР-1, обусловленные присутствием ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элемент,которые представлены в виде графика (А) или в виде таблицы (Б). Пулы клеток получали путем стабильной трансфекции клеток линии CHO-DG44 базовыми плазмидами pBING-LC и pBID-HC или рТЕ 4/МСР 1 ("контроль") и созданными на их основе производными, каждая из которых дополнительно содержала ТЕ-элемент ("00" в прямой ориентации ("00 direct") и в обратной ориентации ("00 revers"), "01"-"12"). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в несодержащей НТ среде, дополненной G418 (серии А и Б) или в содержащей НТ среде, дополненной G418 (серии В и Г) оценивали с помощью ELISA экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линииCHO-DG44 осуществляли путем нескольких пересевов в Т-колбах площадью 75 см 2 с цикличностью пересевов 2-2-3 дня. В сериях А анализировали по 4 пула для комбинаций плазмид "00 обратная" и "00 прямая" и по 3 пула для контроля с использованием 8 пересевов в культуре, в сериях Б анализировали по 10 пулов для каждой комбинации плазмид с использованием 6 пересевов и в сериях В и Г анализировали по 6 пулов для каждого типа плазмид с использованием 6 пересевов. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для каждой комбинации плазмид и серии опытов и среднее значение для контролей в каждой серии принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент. Фиг. 10 - влияние ТЕ-элементов на удельную продуктивность в пулах клеток, полученных в результате отбора с использованием DHFR. На этом чертеже проиллюстрированы изменения уровня экспрессии МСР-1, обусловленные присутствием ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элементы, которые представлены в виде графика (А) или в виде таблицы (Б). Пулы клеток получали путем стабильной трансфекции клеток линии CHO-DG44 базовой плазмидой рТЕ 5/МСР-1 ("контроль") или созданными на ее основе производными, каждая из которых дополнительно содержала ТЕ-элемент ("01"-"12") (серии Д). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в несодержащей НТ среде оценивали с помощью ELISA экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии CHO-DG44 осуществляли путем нескольких пересевов в Т-колбах площадью 75 см 2 с циклично-7 016880 стью пересевов 2-2-3 дня. Для каждого варианта плазмиды использовали по 6 пулов, которые подвергали 6 пересевам в культуре. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для рассматриваемого варианта плазмиды и среднее значение для контролей принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент. Фиг. 11 - результаты анализа ТЕ-элементов в отношение энхансерной активности. Результаты, полученные при кратковременной трансфекции клеток линии CHO-DG44, показали,что использование экспрессионных векторов, содержащих ТЕ-элементы, не приводило к существенному повышению титров МСР-1 по сравнению с использованием контрольных векторов, не содержащих ТЕэлемент. Таким образом, ТЕ-элементы 01-12 не функционируют в качестве энхансеров и, следовательно,могут приводить к существенному повышению экспрессии только в том случае, когда они интегрированы в хромосомы. Шесть пулов трансфектировали базовым вектором рТЕ 4/МСР-1 ("контроль") и полученными на его основе производными, каждое из которых дополнительно содержало ТЕ-элемент ("0112"). Одновременно производили котрансфекцию с использованием экспрессионной плазмиды SEAP с целью оценки эффективности трансфекции (SEAP = секретируемая щелочная фосфатаза). После культивирования в течение 48 ч в общем объеме 3 мл удаляли супернатант клеточной культуры и с помощьюELISA определяли титр МСР-1, а также SEAP-активность. Титр МСР-1 корректировали с помощью коэффициента эффективности трансфекции, полученного на основе данных об экспрессии SEAP. На чертеже представлены средние значения со стандартными отклонениями, каждое из которых получено для 6 параллельных пулов. Фиг. 12 - другие ТЕ-элементы. Полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что путем выбора фрагментов последовательности SEQ ID NO: 1, представленных на чертеже, можно также достигать усиления экспрессии гена. Путем клонирования этих других ТЕ-элементов и осуществления стабильной трансфекции с их использованием следует более полно охарактеризовать последовательность SEQ ID NO: 1 для более точного определения положения областей последовательности, важных для осуществления функции. Фиг. 13 - результаты анализа различных положений и комбинаций ТЕ-элементов. На этом чертеже представлен набор возможных экспрессионных векторов, в которых использовали различные положения, ориентация и комбинации ТЕ-элементов для исследования того, можно ли таким путем достичь дополнительного усиления экспрессии. Наряду с фланкированием гена продукта ТЕэлементами присоединяли также один за другим несколько идентичных или различных коротких ТЕэлементов, таких, например, как ТЕ-элементы 06 и 08 или новые ТЕ-элементы 13 и 14. Фиг. 14 - влияние ТЕ-элементов ТЕ-13-ТЕ-18 на удельный уровень экспрессии МСР-1. На этом чертеже представлены в виде графиков изменения уровней экспрессии МСР-1, обусловленные присутствием ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕэлементы. Пулы клеток создавали путем стабильной трансфекции клеток линии CHO-DG44 базовой плазмидой рТЕ 4/МСР-1 ("контроль") или созданными на ее основе плазмидами-производными, каждая из которых дополнительно содержала ТЕ-элемент ("13"-"18") (серия Е). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в дополненной НТ среде + G418 (400 мкг/мл) оценивали с помощью ELISA экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии CHODG44 осуществляли путем нескольких пересевов в Т-колбах площадью 75 см 2 с цикличностью пересевов 2-2-3 дня. Для каждого варианта плазмиды анализировали по 4 пула с использованием от 5 до 6 пересевов в культуре. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для рассматриваемого варианта плазмиды и среднее значение для контролей принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент. Фиг. 15 - влияние ТЕ-элементов в различных положениях и в различных комбинациях на экспрессию МСР-1. На этом чертеже представлены в виде графиков изменения уровней экспрессии МСР-1, обусловленные присутствием и положением ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элементы. Пулы клеток создавали путем стабильной трансфекции клеток линии CHO-DG44 базовой плазмидой рТЕ 4/МСР-1 ("контроль") или созданными на ее основе плазмидами-производными,каждая из которых дополнительно содержала один или два ТЕ-элемента ("06" и "08", "08rev", "09rev","А") (серия Ж). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в дополненной НТ среде + G418 (300 мкг/мл) оценивали с помощью ELISA экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии CHO-DG44 осуществляли путем нескольких пересевов в 6-луночных планшетах (МАТ 6) с цикличностью пересевов 2-2-3 дня. Для каждого варианта плазмиды анализировали по 6 пулов с использованием 6 пересевов в культуре. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для рассматриваемого варианта плазмиды и среднее значение для контролей принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент. Фиг. 16 - тестирование ТЕ-элемента ТЕ-08 с помощью антител IgG4-типа. Представленные на этом чертеже векторы применяли для экспрессии рекомбинантных монокло-8 016880 нальных антител IgG4-типа в клетках линии СНО-DG44. В этом случае "Е/Р" обозначает комбинацию энхансера и промотора из CMV, "Р" обозначает только промоторный элемент и "Т" обозначает сигнал терминации транскрипции, который необходим для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждом транскрипционной единице указано стрелкой. Гены легкой цепи (LC2 или LC3) и тяжелой цепи (НС 2 или НС 3) клонировали вместо кассеты МСР-1-IRES-dsRed2 (фиг. 1 Б и 2). Они кодируют тяжелую и легкую цепи гуманизированного моноклонального антитела IgG4-типа. Амплифицируемый селектируемый маркер дигидрофолатредуктаза сокращенно обозначен как "dhfr". Селектируемый маркер неомицинфосфотрансфераза содержал точковую мутацию F240I и соответственно обозначен на чертеже как "F240I". Подробное описание изобретения Употребляемые в описании настоящего изобретения понятия и обозначения имеют следующие указанные ниже значения. Общие понятия "содержащий" или "содержит" включают более конкретное понятие "состоящий из". Кроме того, понятия "единственное число" и "множественное число" не следует рассматривать как ограничительные. Понятие "ТЕ-элемент" обозначает регуляторные нуклеиновые кислоты. Понятия "ТЕ-элемент" или "усиливающий экспрессию элемент" либо "усиливающий транскрипцию элемент", или "усиливающий экспрессию или транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты" применяются в тексте как синонимы. Все эти понятия обозначают регуляторные нуклеотидные последовательности."ТЕ-элемент" или "усиливающий экспрессию элемент" либо "усиливающий транскрипцию элемент", или "усиливающий экспрессию или транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты" обозначает,прежде всего, последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, включая комплементарную ей последовательность, выделенную из генома китайского хомячка (Cricetulus griseus), или любую ее часть,фрагмент или область, или производное последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, или одной из ее частей, фрагментов или областей, которая при стабильной интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Равным образом указанные понятия относится к любой комбинации частей, фрагментов, областей или производных последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, которые состоят из нескольких идентичных или различных частей,фрагментов, областей или производных последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, которые в свою очередь могут быть расположены в любой ориентации и на любом расстоянии по отношению друг к другу, или могут быть также скомбинированы с другими регуляторными последовательностями, и которые приводят к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Понятие ТЕэлемент может обозначать также саму последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, a также любые ее фрагменты, части, области или производные. Кроме того, понятие "ТЕ-элемент", "усиливающий транскрипцию или усиливающий экспрессию элемент нуклеиновой кислоты" или его фрагменты, части, области или производные включает помимо частей последовательности, полученной из китайского хомячка (Cricetulus griseus), также соответствующие функциональные гомологи нуклеотидных последовательностей, полученные из других организмов. К таким другим организмам относятся, например, человек, мышь, крыса, обезьяна, а также другие млекопитающие и грызуны, рептилии, птицы, рыбы и растения. Понятие "фрагмент" или "часть" либо "область" (указанные понятия используются как синонимы) обозначает молекулу нуклеиновой кислоты (одно- или двухцепочечную), которая идентична на 100% части последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, или комплементарной ей последовательности. Известно, что клонирование фрагментов, которые получены путем расщепления рестриктазами или с помощью ПЦР, может приводить к модификациям в концевых областях фрагмента, например реакции заполнения или расщепления могут приводить к появлению дополнительных нуклеотидов или к удалению нуклеотидов, или дополнительные нуклеотиды могут появляться в результате использования праймеров. Такие фрагменты, имеющие вариации в концевых областях, подпадают под определение понятия"фрагмент", даже если такие области последовательности идентичны последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, менее чем на 100%. "Участки" или "фрагменты" либо "области" представляют собой, например, ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), TE-01 (SEQ ID NO: 3), TE-02 (SEQ ID NO: 4), TE-03 (SEQ ID NO: 5), TE-04 (SEQ ID NO: 6), TE-05 (SEQ ID NO: 7), TE-06 (SEQ ID NO: 8), TE-07 (SEQ ID NO: 9), TE-08NO: 14), ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), ТЕ-14 (SEQ ID NO: 16), TE-15 (SEQ ID NO: 17), TE-16 (SEQ ID NO: 18),TE-17 (SEQ ID NO: 19), TE-18 (SEQ ID NO: 20), TE-21 (SEQ ID NO: 21). Предпочтительно при стабильной интеграции в хромосому фрагмент приводит к усилению транскрипции или экспрессии функционально связанного представляющего интерес гена. "Частями" или "фрагментами" либо "областями" последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, которые приводят к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, являются, например, ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), TE-01 (SEQ IDID NO: 14), TE-13 (SEQ ID NO: 15), ТЕ-14 (SEQ ID NO: 16), ТЕ-15 (SEQ ID NO: 17), ТЕ-16 (SEQ ID NO: 18), TE-17 (SEQ ID NO: 19), TE-18 (SEQ ID NO: 20) и ТЕ-21 (SEQ ID NO: 21). Однако понятие "фраг-9 016880 мент" относится также ко всем возможным другим участкам последовательности, представленной в SEQID NO: 1, расположенным в любой ориентации, которые приводят к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, прежде всего к таким, которые целиком или, по меньшей мере,частично расположены в 5'-области ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2). Она соответствует области SEQ ID NO: 1,расположенной между парами оснований 1 и 1578. Предпочтительным является также фрагмент ТЕ-08(SEQ ID NO: 10). В контексте настоящего изобретения понятие "производное" относится к молекуле нуклеиновой кислоты (одно- или двухцепочечной), последовательность которой идентична по меньшей мере примерно на 70% или идентична по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% последовательности, представленной вSEQ ID NO: 1 или комплементарной ей последовательности, или части или фрагменту, или области SEQID NO: 1 или комплементарной ей последовательности, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Отличия от последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, с одной стороны, могут быть результатом различий в гомологичных эндогенных нуклеотидных последовательностях, выведенных из других организмов. С другой стороны, они могут быть результатом целенаправленных модификаций нуклеотидной последовательности,например замены, инсерции или делеции одного или нескольких нуклеотидов. Мутанты, образованные в результате делеции, инсерции и замены, можно создавать с помощью "сайт-направленного мутагенеза" и/или "методов мутагенеза, основанных на ПЦР". Соответствующие методы описаны, например, у Lottspeich и Zorbas (1998; см. главу 36.1 и указанные в ней ссылки). Идентичность последовательности референс-последовательности, в данном случае последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, можно определять с помощью так называемых стандартных алгоритмов "сравнительного анализа первичной структуры последовательностей", таких, например, как "BLAST" (Altschul S.F., Gish W., Miller W., MyersZhang J. и Madden T.L., "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation", Genome Res. 7, 1997, c. 649-656). Последовательности можно сопоставлять в том случае, когда их последовательности соответствуют друг другу и их можно идентифицировать с использованием стандартных алгоритмов сравнительного анализа первичной структуры последовательностей. В контексте настоящего изобретения понятие "производное" относится также к молекуле нуклеиновой кислоты (одно- или двухцепочечной), которая гибридизуется с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или с последовательностью фрагмента или участка, или области последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, или комплементарной ей последовательности. Предпочтительно гибридизацию осуществляют в строгих условиях гибридизации и отмывки (например, гибридизация при 65 С в буфере, содержащем 5SSC; отмывка при 42 С с помощью 0,2SSC/0,1% ДСН). Соответствующие методы описаны, например, у Ausubel и др., 1994, предпочтительно участок или фрагмент, или область SEQ ID NO: 1 содержит всю или по меньшей мере части области последовательности между парами нуклеотидов 1 и 1578. Это соответствует 5'-области последовательности ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2). Предпочтительным является также фрагмент ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10). Понятие "вариант" относится к экспрессионным векторам, применяемым в конкретной смеси для трансфекции. Оно включает как базовые векторы (рТЕ 4/МСР-1 или рТЕ 5/МСР-1) или комбинации базовых векторов (pBING-LC + pBID-HC), так и базовые векторы, содержат один или несколько ТЕэлементов в различных положениях, комбинациях и ориентации. В случае праймеров понятие "ориентация" относится к расположению праймера в определенном порядке по отношению к SEQ ID NO: 1. Все праймеры, порядок расположения последовательности которых соответствует направлению 5'3' последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 (= "прямой праймер"), находятся в одинаковой ориентации с указанной последовательностью, что называют также"прямой ориентацией". Праймеры, порядок расположения последовательностей которых комплементарен порядку расположения последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 ("обратный праймер"),находятся в противоположной ориентации по отношению к указанной последовательности, что называют также "обратной ориентацией". Применительно к ТЕ-элементам, предлагаемым в настоящем изобретении, под "ориентацией" следует понимать порядок расположения относительно представляющего интерес гена. Последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1, представляет собой геномную последовательность, которая расположена в 5'-направлении относительно кодирующей области гена убикитина/S27 а, что обозначают также как "расположенная против хода транскрипции". Если следовать вдоль указанной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, в направлении кодирующей области следующего за ней гена убикитина/S27 а, то это должно привести к стартовому кодону указанного гена. Поэтому такой порядок расположения обозначают как "прямая ориентация". Аналогично этому согласно настоящему изобретению ТЕ-элемент находится в прямой ориентации, если последовательность, пред- 10016880 ставленная в SEQ ID NO: 1, или ее любой участок, фрагмент, область или производное присутствует в экспрессионном векторе на той же цепи ДНК, что и стартовый кодон представляющего интерес гена. Если, в противоположность этому, в экспрессионном векторе на той же цепи ДНК, что и стартовый кодон представляющего интерес гена, присутствует последовательность, комплементарная SEQ ID NO: 1,или ее любой участок, фрагмент, область или производное, то ТЕ-элемент находится в "обратной ориентации". Если не указано иное, то при упоминании ТЕ-элемента всегда имеется в виду, что это понятие включает/подразумевает обе ориентации, т.е. как прямую, так и обратную. Понятие "интеграция в хромосому" относится к интеграции любой нуклеотидной последовательности в геном, т.е. в хромосомы, клетки, причем интеграцию необязательно можно осуществлять в одну или несколько хромосом в любом количестве, положении и ориентации. Кроме того, понятие "интеграция в хромосому" относится также к интеграции любой куклеотидной последовательности в синтетические, искусственные или мини-хромосомы. Представляющий интерес ген. Представляющий интерес ген, который содержится в экспрессионном векторе, предлагаемом в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность любой длины, которая кодирует представляющий интерес продукт. Продукт гена или также "представляющий интерес продукт", как правило, представляет собой белок, полипептид, пептид или его фрагмент либо производное. Однако он может представлять собой также РНК или антисмысловую РНК. Представляющий интерес ген может находиться в своей полноразмерной форме, укороченной форме, в виде слитого гена или меченого гена. Он может представлять собой геномную ДНК или предпочтительно кДНК либо соответствующие фрагменты или слияния. Представляющий интерес ген может иметь нативную последовательность гена или содержать мутации либо может быть модифицирован иным путем. К таким модификациям относятся оптимизации кодонов для адаптации к конкретной клетке-хозяину, а также гуманизация. Представляющий интерес ген может, например, кодировать секретируемый, цитоплазматический, локализованный в ядре, связанный с мембраной или связанный с клеточной поверхностью полипептид. Понятие "нуклеиновая кислота", "нуклеотидная последовательность" или "последовательность нуклеиновой кислоты" обозначает олигонуклеотид, нуклеотиды, полинуклеотиды и их фрагменты, а также ДНК или РНК, выведенную из генома или полученную синтетическим путем, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной или может представлять собой кодирующую или некодирующую цепь гена. Модификацию нуклеотидных последовательностей можно осуществлять с помощью стандартных методов, таких, например, как сайт-специфический мутагенез или ПЦР-опосредуемый мутагенез (такие методы описаны, например, у Sambrook и др., 1989 или у Ausubel и др., 1994). Понятие "кодировать" обозначает свойство или способность конкретной последовательности нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, например гена в хромосоме или мРНК, выполнять функцию матрицы для синтеза других полимеров и макромолекул, таких, например, как рРНК, тРНК, мРНК, других молекул РНК, кДНК или полипептидов, в ходе биологического процесса. Таким образом, ген кодирует белок,если требуемый белок продуцируется в клетке или другой биологической системе в результате транскрипции и последующей трансляции мРНК. При этом как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и, как правило, содержится также в банке данных о последовательностях, например EMBL или GenBank, так и служащая в качестве матрицы для транскрипции некодирующая цепь гена могут рассматриваться как кодирующие продукт или белок. К нуклеиновым кислотам, которые кодируют белок, относятся также нуклеиновые кислоты, которые вследствие вырожденности генетического кода имеют другой порядок нуклеотидной последовательности, но приводят к образованию такой же аминокислотной последовательности белка. Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, могут содержать также интроны. Понятие "кДНК" обозначает дезоксирибонуклеиновые кислоты, которые получают путем обратной транскрипции и синтеза второй цепи ДНК с продуцируемой геном мРНК или другой РНК. Если кДНК присутствует в виде молекулы двухцепочечной ДНК, то она содержит как кодирующую, так и некодирующую цепь. Понятие "интрон" обозначает некодирующие нуклеотидные последовательности любой длины. Они встречаются в естественных условиях во многих генах эукариотических организмов и их удаляют из ранее транскрибированного мРНК-предшественника с помощью процесса, известного как сплайсинг. Для этого требуется осуществлять точное вырезание интрона на 5'- и 3'-концах и правильное соединение возникающих в результате этого концов мРНК, чтобы создать зрелую процессированную мРНК, содержащую правильную рамку считывания для успешного синтеза белка. В настоящее время охарактеризованы многочисленные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, участвующие в этом процессе сплайсинга,которые представляют собой последовательности, расположенные непосредственно на границах раздела экзон-интрон или интрон-экзон (см. обзор Ohshima и др., 1987). Представляющий интерес белок/продукт. К имеющим биофармацевтическое значение белкам/полипептидам относятся (но не ограничиваясь только ими), например, антитела, ферменты, цитокины, лимфокины, адгезионные молекулы, рецепторы,а также их производные или фрагменты. В целом, заслуживают внимание все полипептиды, которые- 11016880 действуют в качестве агонистов или антагонистов и/или могут найти применение в качестве терапевтических или диагностических средств. К другим представляющим интерес белкам относятся (но не ограничиваясь только ими), например, белки/полипептиды, которые применяют для изменения свойств клеток-хозяев в рамках так называемой "клеточной инженерии", такие, например, как антиапоптозные белки, шапероны, ферменты, участвующие в метаболизме, гликозилирующие ферменты, а также их производные или фрагменты. Понятие "полипептиды" применяют к аминокислотным последовательностям или белкам и оно означает полимеры аминокислот любой длины. Это понятие включает также белки, подвергнутые посттрансляционной модификации с помощью таких реакций, как, например, гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование или процессинг белка. Структуру полипептида можно модифицировать, например, с помощью замен, делеций или инсерций аминокислот, путем слияния с другими белками при сохранении его биологической активности. Кроме того, полипептиды можно подвергать мультимеризации и образовывать гомо- и гетеромеры. Примерами имеющих терапевтическое значение белков являются инсулин, инсулиноподобный фактор роста, человеческий гормон роста (hGH) и другие факторы роста, рецепторы, тканевый активатор плазминогена (tPA), эритропоэтин (ЕРО), цитокины, например интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-2,IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, интерферон (IFN)-альфа, -бета, -гамма, -омега или -тау, фактор некроза опухоли (TNF), такой, например, какTNF-альфа, -бета или -гамма, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, МСР-1 и VEGF. Другими примерами являются моноклональные, поликлональные, мультиспецифические и одноцепочечные антитела и их фрагменты, такие, например, как Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fc- и Fc'-фрагменты, легкие (L) и тяжелые (Н) цепи иммуноглобулина и их константные, вариабельные или гипервариабельные области, а также Fv- и Fdфрагменты (Chamov и др., 1999). Антитела могут иметь человеческое происхождение или происходить из организма, кроме человека. Можно рассматривать также гуманизированные и химерные антитела.Fab-фрагменты (антигенсвязывающий фрагмент = Fab) состоят из вариабельных областей обеих цепей, которые связаны друг с другом посредством примыкающих константных областей. Их можно создавать из обычных антител, например, путем обработки протеазой, такой как папаин, или также путем клонирования ДНК. Другими фрагментами антител являются F(ab')2-фрагменты, которые можно создавать путем протеолитического расщепления пепсином. С помощью клонирования гена можно создавать также укороченные фрагменты антител, которые состоят только из вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи. Их обозначают как Fvфрагменты (вариабельный фрагмент - синоним фрагмента вариабельной области). Поскольку в этих Fvфрагментах не может иметь место ковалентное связывание посредством цистеиновых остатков, присутствующих в константных цепях, то эти Fv-фрагменты часто стабилизируют другим образом. Для этой цели вариабельные области тяжелой и легкой цепей часто связывают друг с другом с помощью короткого пептидного фрагмента, состоящего примерно из 10-30 аминокислот, предпочтительно из 15 аминокислот. Таким путем получают одну полипептидную цепь, в которой VH и VL связаны друг с другом через пептидный линкер. Такие фрагменты антител обозначают также как одноцепочечные Fvфрагменты (scFv). Примеры scFv-фрагментов антител известны и они описаны, например, у Huston и др.(1988). В прошлые годы были разработаны различные стратегии создания мультимерных scFvпроизводных. Целью этого являлось создание рекомбинантных антител с улучшенными фармакокинетическими свойствами и повышенной авидностью к связыванию. Для достижения мультимеризации scFvфрагментов их создавали в виде слитых белков, содержащих домены мультимеризации. При этом в качестве доменов мультимеризации могут служить, например, СН 3-области IgG или спиралевидные структуры ("структуры в виде свернутой спирали"), такие как домены типа лейциновой "молнии". В других стратегиях для мультимеризации используют взаимодействие между VH- и VL-областями scFvфрагмента (например, двойные, тройные и пентатела). В данной области техники понятие "двойное антитело" обозначает бивалентное гомодимерное производное scFv. Укорочение пептидного линкера в молекуле scFv до 5-10 аминокислот приводит к образованию гомодимеров в результате наложения друг на друга VH/VL-цепей. Двойные антитела можно дополнительно стабилизировать путем встраивания дисульфидных мостиков. Примеры двойных антител описаны в научной литературе (см., например, у Perisic и др. (1994. В данной области техники понятие "минитело" обозначает бивалентное гомодимерное производноеscFv. Оно состоит из слитого белка, который в качестве области димеризации содержит СН 3-область иммуноглобулина, предпочтительно IgG, наиболее предпочтительно IgG1. Она связывает scFvфрагменты посредством шарнирной области, также происходящей из IgG, и линкерной области. Примеры таких минител описаны у Hu и др. (1996). В данной области техники понятие "тройное тело" обозначает трехвалентное гомодимерное производное scFv (Kortt и др., 1997). К образованию тримеров приводит непосредственное слияние VH-VL без использования линкерной последовательности. Фрагменты, которые в данной области техники обозначают как "миниаантитела", имеющие би-,- 12016880 три- или тетравалентную структуру, также представляют собой производные scFv-фрагментов. При этом мультимеризации достигают с помощью ди-, три- или тетрамерных структур типа "свернутой спирали"(Pack и др., 1993 и 1995; Lovejoy и др., 1993). Ген, кодирующий флуоресцентный белок. В другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит ген, кодирующий флуоресцентный белок, функционально связанный с представляющим интерес геном. Предпочтительно транскрипцию обоих генов осуществляют под контролем одного гетерологичного промотора, так что белок/представляющий интерес продукт и флуоресцентный белок кодируются бицистронной мРНК. Это позволяет идентифицировать клетки, продуцирующие в больших количествах представляющий интерес белок/продукт, по уровню экспрессии флуоресцентного белка. В альтернативном варианте транскрипцию гена, кодирующего флуоресцентный белок, можно осуществлять под контролем его собственного промотора. Флуоресцентный белок может представлять собой, например, зеленый, сине-зеленый, синий, желтый или имеющий другой цвет флуоресцентный белок. Конкретным примером является зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea victoria или Renilla reniformis и полученных из них мутантов (см.,например, Bennet и др. (1998); Chalfie и др. (1994); WO 01/04306 и процитированную в этой заявке литературу). Другие флуоресцентные белки и кодирующие их гены описаны в WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 и WO 01/27150, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Эти флуоресцентные белки представляют собой флуорофоры не обладающих биолюминисцентностью организмов видовAnthozoa, например "красный" из Ammonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp., "зеленый" из Discosoma sp., "фуксин" из Discosoma sp., Ammonia sulcata,Aequorea coerulescens. К флуоресцентным белкам, предлагаемым в изобретении, относятся помимо белков дикого типа также встречающиеся в естественных условиях или созданные с помощью генной инженерии мутанты и варианты, их фрагменты, производные или, например, слитые с другими белками или пептидами варианты. При этом созданные мутации могут, например, изменять спектр возбуждения или испускания, образование хромофоров, коэффициент экстинкции или стабильность белка. Кроме того, путем оптимизации кодонов можно повышать уровень экспрессии в клетках млекопитающих или других видов. Флуоресцентный белок, предлагаемый в изобретении, можно применять также в виде слияния с селектируемым маркером, предпочтительно с амплифицируемым селектируемым маркером, таким, например, как дигидрофолатредуктаза (DHFR). Испускаемая флуоресцентными белками флуоресценция дает возможность осуществлять обнаружение белков, например, методом проточной цитометрии с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS) или флуоресцентной микроскопии. Другие регуляторные элементы. Экспрессионный вектор содержит по меньшей мере один гетерологичный промотор, который позволяет осуществлять экспрессию представляющего интерес гена и предпочтительно также флуоресцентного белка. Понятие "промотор" обозначает полинуклеотидную последовательность, которая позволяет осуществлять и контролирует транскрипцию функционально связанных с ней генов или последовательностей. Промотор содержит последовательности, распознаваемые связывающейся с ними РНК-полимеразой, и сайт инициации транскрипции. Для экспрессии требуемой последовательности в определенном типе клеток или клетке-хозяине необходимо выбрать пригодный функциональный промотор. Специалисту в данной области известны многочисленные промоторы из различных источников, к которым относятся конститутивные, индуцибельные и репрессируемые промоторы. Они депонированы в банках данных, например в GenBank, и их можно получать в виде выделенных элементов или в виде элементов, клонированных в полинуклеотидных последовательностях, от коммерческих поставщиков или индивидуальных производителей. У индуцибельных промоторов активность промотора может понижаться или повышаться в ответ на сигнал. Примером индуцибельного промотора является промотор тетрациклина (tet). Он содержит операторные последовательности тетрациклина (tetO), которые можно индуцировать с помощью регулируемого тетрациклином белка-активатора (tTA). Присутствие тетрациклина ингибирует связывание tTA с tetO. Примерами других индуцибельных промоторов являются промоторы jun, fos, металлотионеина и промотор белка "теплового шока" (см. также у Sambrook и др., 1989; Gossen и др., 1994). К промоторам, которые являются наиболее пригодными для обеспечения экспрессии с высоким уровнем в эукариотических организмах, относятся, например, промотор убикитина/S27 а хомячка (WO 97/15664), ранний промотор SV40, главный поздний промотор аденовируса, мышиный промотор металлотионеина-I, область длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, ранний промотор человеческого цитомегаловируса. Примером(ами) других гетерологичных промоторов млекопитающих является(ются) промотор(ы) актина, иммуноглобулина или белка "теплового шока". Для повышения/регулирования транскрипционной активности в кассете экспрессии соответствующий гетерологичный промотор можно функционально связывать с другими регуляторными последова- 13016880 тельностями. Например, для повышения транскрипционной активности промотор можно функционально связывать с энхансерными последовательностями. Для этой цели можно использовать один или несколько энхансеров и/или одну или несколько копий энхансерной последовательности, например энхансер CMV или SV40. Соответственно в другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит один или несколько/одну или несколько энхансеров/энхансерных последовательностей, предпочтительно энхансер CMV или SV40. Понятие "энхансер" обозначает полинуклеотидную последовательность, которая в цис-положении оказывает воздействие на активность промотора и тем самым стимулирует транскрипцию функционально связанного с этим промотором гена. В отличие от промоторов действие энхансеров не зависит от положения и ориентации и поэтому их можно помещать перед или после транскрипционной единицы,внутри интрона или даже внутри кодирующей области. При этом энхансер можно располагать как в непосредственной близости от транскрипционной единицы, так и на значительном расстоянии от промотора. Может иметь место также физическое или функциональное перекрытие с промотором. Специалисту в данной области известны многочисленные энхансеры, происходящие из различных источников (и депонированные в банках данных, таких как GenBank, например энхансеры SV40, энхансеры CMV, энхансеры полиомы, энхансеры аденовируса) и доступные в виде индивидуальных элементов или клонированные в полинуклеотидных последовательностях (например, депонированных в АТСС или получаемых от коммерческих поставщиков или индивидуальных производителей). Многие промоторные последовательности, такие, например, как часто применяемый промотор CMV, содержат также энхансерные последовательности. Человеческий энхансер CMV является одним из наиболее сильных из известных в настоящее время энхансеров. Примером индуцибельного энхансера является энхансер металлотионеина,который можно стимулировать глюкокортикоидами или тяжелыми металлами. Еще одной возможной модификацией является, например, встраивание множественных сайтов связывания Sp1. Кроме того, промоторные последовательности можно комбинировать с регуляторными последовательностями, которые позволяют контролировать/регулировать транскрипционную активность. Таким путем можно создавать репрессируемый/индуцибельный промотор. Это можно осуществлять,например, путем связывания с последовательностями, которые являются сайтами связывания осуществляющих повышающую или понижающую регуляцию факторов транскрипции. Например, вышеупомянутый фактор транскрипции SP-1 оказывает положительное воздействие на транскрипционную активность. Другим примером является сайт связывания белка-активатора АР-1, который может оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на транскрипцию. Активность АР-1 можно контролировать с помощью различных типов факторов, таких, например, как факторы роста, цитокины и сыворотка (см.Faisst и др., 1992 и приведенные в этой публикации ссылки). Эффективность транскрипции можно повышать также путем изменения промоторной последовательности с помощью мутации (замены, инсерции или делеции) одного, двух, трех или большего количества оснований и последующего определения с помощью анализа с использованием репортерного гена, повышается ли за счет этого промоторная активность. В целом к регуляторным элементам относятся гетерологичные промоторы, энхансеры, сигналы терминации и полиаденилирования и другие контролирующие экспрессию элементы. Для различных типов клеток известны как индуцибельные, так и конститутивные регуляторные последовательности."Элемент, регулирующий транскрипцию", как правило, включает промотор, расположенный против хода транскрипции относительно последовательности гена, предназначенного для экспрессии, сайты инициации и терминации транскрипции, а также сигнал полиаденилирования. Понятие "сайт инициации транскрипции" обозначает нуклеиновую кислоту в составе конструкции,соответствующую первой нуклеиновой кислоте, которую встраивают в первичный транскрипт, т.е. мРНК-предшественник. Сайт инициации транскрипции может перекрываться с промоторной последовательностью. Понятие "сайт терминации транскрипции" относится к нуклеотидной последовательности, которая,как правило, присутствует на 3'-конце представляющего интерес гена или транскрибируемого участка гена и которая вызывает прекращение транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой."Сигнал полиаденилирования" представляет собой сигнальную последовательность, которая вызывает расщепление в специфическом сайте на 3'-конце эукариотической мРНК и посттранскрипционное встраивание последовательности, состоящей примерно из 100-200 аденильных нуклеотидов (polyAхвост), на расщепленном 3'-конце. Сигнал полиаденилирования содержит последовательность ААТААА,расположенную на расстоянии примерно 10-30 нуклеотидов против хода транскрипции от сайта расщепления, а также последовательность, расположенную по ходу транскрипции. Известны различные элементы полиаденилирования, такие, например, как tk polyA, поздний SV40 и ранний polyA или BGH polyA"Элементы, регулирующие трансляцию" включают сайт инициации трансляции (AUG), стоп-кодон и polyA-сигнал для каждого экспрессируемого полипептида. Для оптимальной экспрессии может оказаться целесообразным удалять, добавлять или изменять 5'- и/или 3'-нетранслируемые области экспрес- 14016880 сируемой нуклеотидной последовательности для того, чтобы элиминировать все потенциально непригодные дополнительные кодоны инициации трансляции или иные последовательности, которые могут оказывать неблагоприятное воздействие на экспрессию на уровне транскрипции или экспрессии. В альтернативном варианте для стимулирования экспрессии можно встраивать рибосомальные консенсусные сайты связывания против хода транскрипции непосредственно перед стартовым кодоном. Для получения секретируемого полипептида представляющий интерес ген, как правило, должен содержать сигнальную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид-предшественник, транспортирующий синтезируемый полипептид к мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР-мембране) и через нее. Сигнальная последовательность часто, но не всегда, располагается на аминоконце секретируемого белка, и она расщепляется сигнальными пептидазами после проникновения белка через ЭР-мембрану. Последовательность гена, как правило, но не обязательно, содержит свою собственную сигнальную последовательность. Если нативная сигнальная последовательность отсутствует, то можно известным методом встраивать гетерологичную сигнальную последовательность. Специалисту в данной области известны многочисленные сигнальные последовательности такого типа, и они депонированы в банках данных последовательностей, таких как GenBank и EMBL. Другим регуляторным элементом является внутренний рибосомальный сайт проникновения (IRES)."IRES-элемент" содержит последовательность, которая функционально активирует инициацию трансляции независимо от 5'-концевого метилгуанозинового кэпа (кэп-структура) и расположенного против хода транскрипции гена и позволяет осуществлять в клетке животного трансляцию двух цистронов (открытых рамок считывания) из одного транскрипта. IRES-элемент представляет собой независимый рибосомальный сайт проникновения для трансляции открытой рамки считывания, расположенной непосредственно перед ним против хода транскрипции. В отличие от бактериальной мРНК, которая может быть мультицистронной, т.е. может кодировать несколько различных полипептидов или продуктов, которые мРНК транслирует один за другим, большинство мРНК из клеток животных являются моноцистронными и кодируют только один белок или продукт. В случае мультицистронного транскрипта в эукариотической клетке трансляция инициируется от ближайшего расположенного против хода транскрипции сайта инициации трансляции и заканчивается на первом стоп-кодоне, после чего транскрипт высвобождается из рибосомы. Таким образом, в результате трансляции образуется только первый кодируемый мРНК полипептид или продукт. В отличие от этого мультицистронный транскрипт, содержащий IRES-элемент,функционально связанный со второй или следующей открытой рамкой считывания в транскрипте, позволяет осуществлять последующую трансляцию открытой рамки считывания, расположенной по ходу транскрипции относительно него, в результате чего в эукариотической клетке продуцируются два или большее количество плипептидов или продуктов, кодируемых одним транскриптом.IRES-элемент может иметь различную длину и различное происхождение, он может происходить,например, из вируса энцефаломиокардита (EMCV) или из других пикорнавирусов. В научной литературе описаны различные IRES-последовательности и их применение при конструировании векторов; см., например, у Pelletier и др., 1988; Jang и др., 1989; Davies и др., 1992; Adam и др., 1991; Morgan и др., 1992;Sugimoto и др., 1994; Ramesh и др., 1996, Mosser и др., 1997. Расположенную по ходу транскрипции последовательность гена функционально связывают с 3'концом IRES-элемента, т.е. выбирают такое расстояние, чтобы он не оказывал влияния или оказывал лишь незначительное влияние на экспрессию гена, или чтобы уровень экспрессии был достаточным для конкретной цели. Для обеспечения достаточного уровня экспрессии можно выбирать оптимальное и допустимое расстояние между IRES-элементом и стартовым кодоном расположенного по ходу транскрипции относительно него гена на основе простых экспериментов путем вариации расстояния и определения уровня экспрессии в функции расстояния с помощью анализа с использованием репортерного гена. С помощью описанных мер можно создавать оптимальную кассету экспрессии, которая имеет большую ценность с точки зрения обеспечения экспрессии гетерологичных продуктов гена. Таким образом, кассета экспрессии, полученная с помощью одного или нескольких таких средств, представляет собой еще одни объект изобретения. Промотор убикитина/S27 а хомячка. В другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит промотор убикитина/S27 а хомячка, предпочтительно функционально связанный с представляющим интерес геном и еще более предпочтительно функционально связанный с представляющим интерес геном и геном, кодирующим флуоресцентный белок или селектируемый маркер. Промотор убикитина/S27 а хомячка представляет собой сильный гомологичный промотор, описанный в WO 97/15664. Такой промотор предпочтительно обладает по меньшей мере одним из следующих отличительных признаков: наличием богатой GC области последовательности, сайта связывания Sp1,полипиримидинового элемента, отсутствием ТАТА-бокса. Наиболее предпочтительным является промотор, в котором присутствует сайт связывания Sp1, но отсутствует ТАТА-бокс. Кроме того, предпочтительным является такой промотор, который конститутивно активируется и, прежде всего, обладает одинаковой активностью в содержащей сыворотку, имеющей низкое содержание сыворотки и бессывороточной клеточной культуре. Другой вариант осуществления изобретения относится к индуцибельному- 15016880 промотору, прежде всего к промотору, который активируется при удалении сыворотки. Наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения является промотор, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 5 WO 97/15664. При этом наиболее предпочтительными являются промоторные последовательности, которые содержат участок от положения-161 до - 45 последовательности, представленной на фиг. 5. Каждый из промоторов, описанных в примерах, которые приведены в описании настоящей заявки,содержат молекулу ДНК, имеющую последовательность, которая соответствует фрагменту от положения- 372 до положения +111 последовательности, представленной на фиг. 5 WO 97/15664, и представляет собой предпочтительный промотор, т.е. предпочтительный промотор должен содержать указанную область последовательности. Создание экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении. Экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, можно создавать в целом согласно общепринятым известным в данной области методам, которые описаны, например, у Sambrock и др. (1989). В этом руководстве описаны также функциональные компоненты вектора, например пригодные промоторы (в дополнение к промотору убикитина/S27 а хомячка), энхансеры, сигналы терминации и полиаденилирования, гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, селектируемые маркеры, сайты инициации репликации и сигналы сплайсинга. Для конструирования можно применять общепринятые клонирующие векторы, например плазмиды, бактериофаги, фагмиды, космиды или вирусные векторы, такие как векторы на основе бакуловируса, ретровируса, аденовирусы, аденоассоциированного вируса и вируса герпеса простого, а также синтетические или искусственные хромосомы/мини-хромосомы. Эукариотические экспрессионные векторы, как правило, содержат также прокариотические последовательности, такие, например, как сайт инициации репликации, и гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, которые позволяют осуществлять репликацию и отбор вектора в бактериях. Известно большое количество эукариотических экспрессионных векторов, которые содержат множественные сайты клонирования для встраивания полинуклеотидной последовательности, некоторые их них можно покупать у различных фирм, таких как Stratagene, Ла-Джолла, шт. Калифорния, США; Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США; Promega, Мэдисон, шт. Висконсин, США или BD Biosciences Clontech, Пало-Альто, шт. Калифорния, США. Гетерологичный промотор, представляющий(е) интерес ген (или гены), селектируемые маркеры и необязательно также ген, кодирующий флуоресцентный белок, дополнительные регуляторные элементы,такие, например, как внутренний рибосомальный сайт проникновения (IRES), энхансер, сигнал полиаденилирования и другие цис-активные элементы, такие, например, как ТЕ-элемент, встраивают в экспрессионный вектор с помощью известного специалистам в данной области метода. Экспрессионный вектор,предлагаемый в изобретении, содержит, как минимум, гетерологичный промотор, представляющий интерес ген и ТЕ-элемент. Предпочтительно экспрессионный вектор содержит также ген, кодирующий флуоресцентный белок. Согласно изобретению наиболее предпочтительно использовать в качестве гетерологичного промотора промотор убикитина/S27 а. Наиболее предпочтительным является экспрессионный вектор, в котором гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/S27 а, представляющий интерес ген и ТЕ-элемент функционально связаны друг с другом или находятся в функциональной связи. В контексте настоящего описания понятие "функциональная связь" или "функционально связаны" относится к двум или большему количеству нуклеотидных последовательностей или фрагментов последовательностей, которые расположены таким образом, что они могут выполнять предназначенные для них функции. Например, промотор/энхансер, промотор/ТЕ-элемент или промотор/энхансер/ТЕ-элемент функционально связаны с кодирующей последовательностью гена, если они могут контролировать или модулировать транскрипцию связанной последовательности гена в цис-положении. Как правило, хотя это не является необходимым, функционально связанные последовательности ДНК расположены близко друг к другу и, если связаны две кодирующие последовательности генов, или в случае последовательности сигнала секреции, находятся в одной рамке считывания. Хотя, как правило, функционально связанный промотор расположен против хода транскрипции относительно кодирующей последовательности гена, не является необходимым, чтобы они были смежными. Не является необходимым также, чтобы энхансер или ТЕ-элементы были смежными при условии, что они способствуют осуществлению транскрипции или экспрессии последовательности гена. Для осуществления своей функции они могут располагаться как против хода транскрипции, так и по ходу транскрипции относительно последовательности гена, при необходимости на определенном расстоянии от нее. Сайт полиаденилирования функционально связан с последовательностью гена, если он расположен на 3'-конце последовательности так, что транскрипция кодирующей последовательности проходит до сигнала полиаденилирования. Связывание можно осуществлять с помощью общепринятых методов рекомбинации, например с помощью метода ПЦР,встраивания путем лигирования в пригодные сайты рестрикции или путем сплайсинга. Если пригодные сайты рестрикции отсутствуют, то можно применять хорошо известным методом синтетические олигонуклеотидные линкеры или адаптеры. В одном из описанных вариантов осуществления изобретения функционально связывают друг с- 16016880 другом гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/S27 а или промотор CMV,представляющий интерес ген и ген, кодирующий флуоресцентный белок. Это означает, например, что как представляющий интерес ген, так и ген, кодирующий флуоресцентный белок, экспрессируются под контролем одного и того же гетерологичного промотора. В одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения функциональное связывание осуществляют с использованием IRESэлемента, так что из обоих генов синтезируется бицистронная мРНК. Экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, может дополнительно содержать энхансерные элементы и/или ТЕ-элементы, которые оказывают функциональное воздействие на один или несколько промоторов. Наиболее предпочтительным является экспрессионный вектор, в котором гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/S27 а или его модифицированная форма либо промотор CMV связаны с энхансерным элементом, например энхансером SV40 или энхансерным элементом CMV, а также с ТЕ-элементом. В принципе экспрессия генов в экспрессионном векторе может инициироваться из одной или нескольких транскрипционных единиц. При этом "транскрипционная единица" обозначает область, которая содержит один или несколько транскрибируемых генов. При этом гены в транскрипционной единице функционально связаны друг с другом таким образом, что все гены, содержащиеся в такой единице, находятся под транскрипционным контролем одного и того же промотора, промотора/энхансера или промотора/энхансера/ТЕ-элемента. В результате такого транскрипционного связывания генов из одной транскрипционной единицы могут осуществляться транскрипция и, следовательно, экспрессия более чем одного белка или продукта. При этом каждая транскрипционная единица содержит регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции содержащихся в ней последовательностей гена. Каждая транскрипционная единица может содержать одинаковые или различные регуляторные элементы. Для функционального связывания генов в транскрипционной единице можно применять IRESэлементы или интроны. Экспрессионный вектор может содержать одну транскрипционную единицу, предназначенную для экспрессии представляющего(их) интерес гена (или генов), селектируемый маркер и необязательно ген,кодирующий флуоресцентный белок. В альтернативном варианте указанные гены могут располагаться также в двух или большем количестве транскрипционных единиц. Могут иметь место различные комбинации генов в транскрипционной единице. В другом варианте осуществления настоящего изобретения в клетку-хозяина можно встраивать путем котрансфекции или последовательных трансфекций, осуществляемых в любом порядке, более одного экспрессионного вектора, состоящего из одной, двух или большего количества транскрипционных единиц. Можно выбирать любые комбинации регуляторных элементов и генов в каждом векторе при условии, что при этом обеспечивается достаточный уровень экспрессии транскрипционных единиц. При необходимости в экспрессионных векторах можно размещать другие регуляторные элементы, такие, например, как ТЕ-элементы, и гены, такие, например, как дополнительные представляющие интерес гены или селектируемые маркеры. Под объем изобретения подпадают также предпочтительные экспрессионные векторы, которые содержат один или несколько ТЕ-элементов и вместо представляющего интерес гена содержат множественный сайт клонирования, который позволяет осуществлять клонирование представляющего интерес гена с использованием последовательностей, распознаваемых рестриктазами. Из существующего уровня техники известны многочисленные последовательности, распознаваемые самыми разнообразными рестриктазами, а также соответствующие рестриктазы. Предпочтительно в качестве распознаваемой последовательности применяют последовательность, которая состоит по меньшей мере из 6 нуклеотидов. Перечень пригодных распознаваемых последовательностей можно найти, например, у Sambrook и др.,(1989). Кроме того, под объем изобретения подпадают также такие экспрессионные векторы, которые вместо представляющего интерес гена содержат только множественный сайт клонирования, который позволяет осуществлять клонирование представляющего интерес гена с использованием последовательностей,распознаваемых рестриктазами, и которые, кроме того, содержат один или несколько множественных сайтов клонирования в различных положениях экспрессионного вектора, которые дополнительно позволяют клонировать ТЕ-элементы с использованием последовательностей, распознаваемых рестриктазами. Из существующего уровня техники известны многочисленные последовательности, распознаваемые самыми разнообразными рестриктазами, а также соответствующие рестриктазы. Предпочтительно в качестве распознаваемых последовательностей применяют последовательности, которые состоят по меньшей мере из 6 нуклеотидов. Перечень пригодных распознаваемых последовательностей можно найти, например, у Sambrook и др. (1989). Клетки-хозяева. Для трансфекции экспрессионным вектором, предлагаемым в изобретении, применяют эукариотические клетки-хозяева, предпочтительно клетки млекопитающих и наиболее предпочтительно клетки грызунов, например линии клеток мышей, крыс и хомячков. В результате успешной трансфекции соответствующих клеток экспрессионным вектором, предлагаемым в изобретении, получают трансформированные, генетически модифицированные, рекомбинантные или трансгенные клетки, которые также являются объектом настоящего изобретения.- 17016880 Для целей изобретения предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки хомячка, такие,например, как клетки линий BHK21, BHK TK-, СНО, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 и CHODG44 или производные/потомки указанных линий клеток. Наиболее предпочтительными являются клетки линий CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 и BHK21, прежде всего клетки линий СНО-DG44 и CHODUKX. Пригодными являются также клетки мышиной миеломы, предпочтительно клетки линий NS0 иSp2/0, а также производные/потомки этих линий клеток. Примеры линий клеток хомячка и мыши, которые можно применять согласно изобретению, представлены в приведенной ниже табл. 1. Однако в качестве клеток-хозяев для производства биофармацевтических белков пригодны также производные и потомки этих линий клеток, линии клеток других млекопитающих, включая (но не ограничиваясь только ими) линии клеток человека, мыши, крыс, обезьян,грызунов, или эукариотические клетки, включая (но не ограничиваясь только ими) клетки дрожжей, насекомых, птиц и растений. Таблица 1 Применяемые для получения продукта линии клеток хомячка и мыши Трансфекцию эукариотических клеток-хозяев полинуклеотидом или одним из экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении, осуществляют с помощью общепринятых методов (Sambrook и др.,1989; Ausubel и др., 1994). К пригодным методам трансфекции относятся, например, опосредуемая липосомой трансфекция, совместное осаждение фосфатом кальция, электропорация, опосредуемая поликатионами (например, ДЭАЭ-декстраном) трансфекция, слияние с протопластами, микроинъекция и заражение вирусом. Согласно изобретению предпочтительно осуществляют стабильную трансфекцию, при которой конструкцию интегрируют либо в геном клетки-хозяина или в искусственную хромосому/минихромосому, либо стабильно встраивают в клетку в составе эписомы. При этом предпочтительным является метод трансфекции, который позволяет осуществлять оптимальную частоту трансфекции и экспрессию гетерологичного гена в конкретной клетке-хозяине. По определению каждую последовательность или каждый ген, которую/который встраивают в клетку-хозяина, обозначают как "гетерологичная последовательность" или "гетерологичный ген" по отношению к клетке-хозяину. Это имеет место даже в том случае, когда встраиваемая последовательность или встраиваемый ген является идентичной/идентичным эндогенной последовательности или эндогенному гену клетки-хозяина. Например, ген актина хомячка, встроенный в клетку хомячка, служащую в качестве клетки-хозяина, по определению является гетерологичным геном. Согласно изобретению предпочтительными являются рекомбинантные клетки млекопитающих,предпочтительно клетки грызунов, наиболее предпочтительно клетки хомячка, такие, например, как СНО- или BHK-клетки, трансфектированные одним из представленных в настоящем описании экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении. Для рекомбинантного производства гетеромерных белков, таких, например, как моноклональные антитела (МАт), трансфекцию пригодных клеток-хозяев в принципе можно осуществлять двумя различными путями. Такие МАт состоят из нескольких субъединиц, т.е. тяжелых и легких цепей. Гены, кодирующие эти субъединицы, можно вводить в независимые или мультицистронные транскрипционные единицы в одну плазмиду, которой затем трансфектируют клетку-хозяина. Это должно обеспечивать стехиометрическое представление генов после интеграции в геном клетки-хозяина. Однако в случае независимых транскрипционных единиц необходимо гарантировать, чтобы мРНК, которые кодируют различные белки, обладают одинаковой стабильностью и эффективностью транскрипции и трансляции. Во втором случае экспрессия гена осуществляется в мультицисторонной транскрипционной единице при участии одного промотора и при этом образуется только один транскрипт. Путем применения IRESэлементов достигают высокоэффективной внутренней инициации трансляции генов во втором и последующих цисторонах. Однако скорости экспрессии для этих цистронов меньше, чем для первого цистрона, инициация трансляции которого благодаря так называемому "кэп"-зависимому комплексу предварительной инициации является существенно более эффективной по сравнению с IRES-зависимой инициа- 18016880 цией трансляции. Для достижения действительно эквимолярных уровней экспрессии цистронов можно,например, встраивать дополнительные межцистронные элементы, которые в сочетании с IRESэлементами обеспечивают одинаковые уровни экспрессии (WO 94/05785). Другим возможным путем получения многочисленных гетерологичных белков, предлагаемым в изобретении, является последовательная трансфекция, при которой трансфекцию генами, интегрированными в различные экспрессионные векторы, осуществляют в разные моменты времени. Например, тяжелую цепь и легкую цепь антитела можно встраивать в клетку одну после другой в ходе двух стадий трансфекции. Еще один путь одновременного получения нескольких гетерологичных белков, который является предпочтительным согласно изобретению, заключается в осуществлении котрансфекции, при которой гены по отдельности интегрируют в различные экспрессионные векторы. Этот путь обладает тем преимуществом, что он позволяет регулировать определенные взаимные соотношения между генами и продуктами генов, благодаря чему можно выравнивать различия в стабильности мРНК, а также эффективности транскрипции и трансляции. Кроме того, экспрессионные векторы благодаря их небольшим размерам являются более стабильными и ими легче манипулировать в процессе клонирования, а также трансфекции. Для этого в одном конкретном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева дополнительно трансфектируют, предпочтительно котрансфектируют одним или несколькими векторами, содержащими гены, которые кодируют один или несколько других представляющих интерес белков. Другой вектор или другие векторы, применяемые для котрансфекции, кодируют, например, другой или другие белок/белки,представляющий/представляющие интерес, под контролем одного и того же промотора, предпочтительно под контролем одной и той же комбинации промотор/энхансер или наиболее предпочтительно под контролем одной и той же комбинации промотор/энхансер/ТЕ-элемент, или также под контролем одной и той же комбинации промотор/энхансер с различными ТЕ-элементами, а также по меньшей мере один селектируемый маркер, например дигидрофолатредуктазу. В другом варианте осуществления изобретения векторы, применяемые для трансфекции, могут содержать один или несколько ТЕ-элементов в любой комбинации, положении и ориентации. В следующем конкретном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева котрансфектируют по меньшей мере двумя эукариотическими экспрессионными векторами, причем по меньшей мере один из двух векторов содержит по меньшей мере один ген, который кодирует, по меньшей мере, представляющий интерес белок, а второй вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, в любой комбинации, положении и ориентации, и необязательно кодирует также по меньшей мере один ген, представляющий интерес, и указанные нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, благодаря коинтеграции с другим вектором оказывают свое усиливающее транскрипцию или экспрессию действие на гены, представляющие интерес. Согласно изобретению клетки-хозяева предпочтительно создают, адаптируют и культивируют в бессывороточных условиях, необязательно в средах, не содержащих белков/пептидов животного происхождения. Примерами имеющихся на рынке сред являются среда Хэма F12 (фирма Sigma, Дейзенхофен,Германия), RPMI-1640 (фирма Sigma), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM; фирма Sigma), минимальная поддерживающая среда (MEM; фирма Sigma), модифицированная по способу Исков среда Дульбекко (IMDM; фирма Sigma), CD-CHO (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США), CHO-S-SFMII (фирма Invitrogen), бессывороточная СНО-среда (фирма Sigma) и безбелковая СНО-среда (фирма Sigma). Каждую из этих сред необязательно можно дополнять различными соединениями, например гормонами и/или другими факторами роста (например, инсулином, трансферрином,эпидермальным фактором роста, инсулинподобным фактором роста), солями (например, хлоридом натрия, кальция, магния, фосфатом), буферами (например, HEPES), нуклеозидами (например, аденозином,тимидином), глутамином, глюкозой или другими эквивалентными питательными веществами, антибиотиками и/или микроэлементами. Хотя согласно изобретению предпочтительными являются бессывороточные среды, для культивирования клеток-хозяев можно использовать также среды, дополненные сывороткой в пригодном количестве. Для отбора генетически модифицированных клеток, которые экспрессируют один или несколько маркерных генов, в среду можно добавлять один или несколько селектирующих агентов. Понятие "селектирующий агент" обозначает субстанцию, которая оказывает воздействие на рост или выживание клеток-хозяев с дефицитом соответствующего гена селектируемого маркера. В рамках настоящего изобретения предпочтительно используют генетицин (G418) в качестве добавки к среде для отбора гетерологичных клеток-хозяев, которые несут ген неомицинфосфотрансферазы дикого типа или предпочтительно модифицированный ген. Предпочтительно G418 применяют в концентрации от 100 до 800 мкг/мл среды, наиболее предпочтительно концентрация составляет от 200 до 400 мкг G418/мл среды. Если требуется трансфектировать клетки-хозяева несколькими экспрессионными векторами, например если требуется по отдельности встраивать в клетку-хозяина несколько представляющих интерес генов,то, как правило, они имеют различные селектируемые маркерные гены."Селектируемый маркерный ген" представляет собой ген, который позволяет осуществлять специ- 19016880 фический отбор клеток, содержащих этот ген, путем добавления соответствующего селектирующего агента в культуральную среду. Примером позитивного селектируемого маркера может служить ген, обусловливающий устойчивость к антибиотикам. В присутствии соответствующего антибиотика могут расти только клетки, трансформированные этим геном, и можно осуществлять их отбор по этому признаку. В отличие от них нетрансформированные клетки не могут расти или выживать в этих селектирующих условиях. Существуют позитивные, негативные и бифункциональные селектируемые маркеры. Позитивные селектируемые маркеры позволяют осуществлять отбор и тем самым обогащение трансформированных клеток в результате придания устойчивости к селектирующему агенту или за счет компенсации метаболического или катаболического дефекта клетки-хозяина. В отличие от этого благодаря негативному селектируемому маркеру можно избирательно элиминировать клетки, несущие селектируемый маркер. Примером является ген тимидинкиназы вируса герпеса простого, экспрессия которого в клетках при одновременном добавлении ацикловира или ганцикловира приводит к их элиминации. К применяемым согласно настоящему изобретению селектируемым маркерам относятся амплифицируемые селектируемые маркеры, включая измененные методами генной инженерии мутанты и варианты, фрагменты, функциональные эквиваленты, производные, гомологи и слияния с другими белками или пептидами при условии, что селектируемый маркер сохраняет свои избирательные (пригодные для селекции) свойства. Такие производные обладают значительной гомологией аминокислотной последовательности в областях или доменах, которые, как предполагается, обусловливают пригодные для селекции свойства. В научной литературе описаны многочисленные селектируемые маркерные гены, включая бифункциональные (позитивные/негативные) маркеры (см., например, WO 92/08796 и WO 94/28143). Примерами селектируемых маркеров, которые, как правило, применяют в эукариотических клетках, являются гены аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), гигромицинфосфотрансферазы (HYG), дигидрофолатредуктазы (DHFR),тимидинкиназы (TK), глутаминсинтетазы, аспарагинсинтетазы и гены, обусловливающие устойчивость к неомицину (G418), пуромицину, гистидинолу D, блеомицину, флеомицину и зеоцину. Понятие "модифицированная неомицинфосфотрансфераза (NPT)" включает все описанные в WO 2004/050884 мутанты, прежде всего мутант D227G (Asp227Gly), который характеризуется заменой аспарагиновой кислоты (Asp, D) на глицин (Gly, G) в положении 227 аминокислотной последовательности, и наиболее предпочтительно мутант F240I (Phe240Ile), который характеризуется заменой фенилаланина(Phe, F) на изолейцин (Ile, I) в положении 240 аминокислотной последовательности. Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадает способ создания и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, который заключается в том, что осуществляют следующие стадии: (I) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют по меньшей мере один белок/продукт, представляющий интерес, и неомицинтрансферазу, предпочтительно модифицированную, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одним ТЕ-элементом; (II) культивируют клетки в условиях, в которых может происходить экспрессия различных генов; и (III) отбирают такие коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как G418. При этом предпочтительно трансфектированные клетки культивируют в бессывороточной среде. Предпочтительно концентрация G418 составляет по меньшей мере 200 мкг/мл. Однако концентрация может составлять также по меньшей мере 400 мкг/мл. Амплифицируемый селектируемый маркерный ген. Кроме того, клетки, предлагаемые в изобретении, необязательно можно подвергать также одной или нескольким стадиям амплификации гена, на которых их культивируют в присутствии селектирующего агента, что приводит к амплификации амплифицируемого селектируемого маркерного гена. Предпосылкой этого является осуществление дополнительной трансфекции клеток-хозяев геном,который кодирует амплифицируемый селектируемый маркер. Возможно, чтобы ген, который кодирует амплифицируемый селектируемый маркер, присутствовал в одном из экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении, или был встроен в клетку-хозяина с помощью другого вектора. Амплифицируемый селектируемый маркерный ген, как правило, кодирует фермент, необходимый для роста эукариотических клеток в определенных условиях культивирования. Например, амплифицируемый селектируемый маркерный ген может кодировать дигидрофолатредуктазу (DHFR). В этом случае амплификация гена происходит, когда трансфектированную им клетку-хозяина культивируют в присутствии селектирующего агента метотрексата (МТХ). В приведенной ниже табл. 2 даны примеры других амплифицируемых селектируемых маркерных генов и соответствующих селектирующих агентов, которые можно применять согласно изобретению и которые описаны в обзоре Kaufman, Methods in Enzymology, 185, 1990, c. 537-566.- 20016880 Таблица 2 Амплифицируемые селектируемые маркерные гены В качестве амплифицируемого селектируемого маркерного гена согласно изобретению предпочтительно применяют ген, который кодирует полипептид, обладающий функцией DHFR, например DHFR или слитый белок, содержащий флуоресцентный белок и DHFR. DHFR необходим для биосинтеза пуринов. Клетки, в которых отсутствует ген DHFR, не могут расти в среде с дефицитом пурина. Поэтому генDHFR представляет собой селектируемый маркер, который можно применять для отбора и амплификации генов в клетках, культивируемых в не содержащей пурин среде. Селектирующим агентом, который применяют в сочетании с геном DHFR, является метотрексат (МТХ). При использовании DHFR в качестве амплифицируемого селектируемого маркера предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки млекопитающих, предпочтительно клетки мышиной миеломы и клетки хомячка. Наиболее предпочтительными являются линии клеток CHO-DUKX (ATCC CRL9096) и CHO-DG44 (Urlaub и др., 1983), поскольку вследствие мутации они не обладают собственнойDHFR-активностью. Для того чтобы иметь возможность применять индуцируемую DHFR амплификацию также и в других типах клеток, которые обладают собственной эндогенной DHFR-активностью,можно использовать для трансфекции мутантный ген DHFR, который кодирует белок с пониженной чувствительностью к метотрексату (Simonson и др., 1983; Wigler и др., 1980; Haber и др., 1982).DHFR-маркер наиболее пригоден для отбора и последующей амплификации при использованииDHFR-негативных базовых клеток, таких как CHO-DG44 или CHO-DUKX, поскольку эти клетки не экс- 21016880 прессируют эндогенную DHFR и следовательно не растут в не содержащей пурин среде. Поэтому в данном случае можно применять ген DHFR в качестве основного селектируемого маркера и отбирать трансформированные клетки в не содержащей гипоксантин/тимидин среде. Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадает способ получения и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, отличающийся тем, что осуществляют стадии, на которых: (I) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют по меньшей мере один белок/продукт, представляющий интерес, и амплифицируемый селектируемый маркер DHFR, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одним ТЕ-элементом; (II) культивируют клетки в условиях, в которых может происходить экспрессия различных генов; и (III) осуществляют амплификацию таких коинтегрированных генов путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, который позволяет осуществлять амплификацию, по меньшей мере, амплифицируемого селектируемого маркерного гена,такого, например, как метотрексат. При этом предпочтительно трансфектированные клетки культивируют в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, в присутствии сыворотки и при добавлении МТХ в возрастающих концентрациях. Предпочтительно концентрация МТХ на первой стадии амплификации составляет по меньшей мере 100 нМ. Однако концентрация МТХ может составлять также по меньшей мере 250 нМ и ее можно ступенчато повышать вплоть до 1 мкМ. В отдельных случаях можно применять концентрации, превышающие 1 мкМ, например 2 мкМ. Под объем настоящего изобретения подпадает также способ получения и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, который отличается тем, что осуществляют стадии, на которых: (I) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют по меньшей мере один белок/продукт, представляющий интерес, неомицинфосфотрансферазу, предпочтительно модифицированную, и амплифицируемый селектируемый маркер DHFR, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген(или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одним ТЕэлементом; (II) культивируют клетки в условиях, в которых может происходить экспрессия различных генов; и (III) осуществляют отбор таких коинтегрированных генов путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как G418, в не содержащей гипоксантин/тимидин среде; и (IV) осуществляют амплификацию таких коинтегрированных генов путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, который позволяет осуществлять амплификацию, по меньшей мере, амплифицируемого селектируемого маркерного гена, такого, например, как метотрексат. При этом предпочтительно трансфектированные клетки культивируют в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, дополненной по меньшей мере 200 мкг/мл G418, предпочтительно 400 мкг/мл G418 или даже более, в присутствии сыворотки и при добавлении МТХ в возрастающих концентрациях. Предпочтительно концентрация МТХ на первой стадии амплификации составляет по меньшей мере 100 нМ. Однако концентрация МТХ может составлять также по меньшей мере 250 нМ и ее можно ступенчато повышать вплоть до 1 мкМ. В отдельных случаях можно применять концентрации, превышающие 1 мкМ, например 2 мкМ. Отбор трансфектированных клеток можно осуществлять также с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS). Для этой цели можно применять, например, бактериальную галактозидазу, маркеры клеточной поверхности или флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты, полученные из Aequorea victoria и Renilla reniformis или других видов; красный флуоресцентный белок и белки, испускающие флуоресценцию другого цвета, и их варианты, полученные из не обладающих биолюминесценцией организмов, таких, например, как Discosomasp., Ammonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp., Aequorea coerulescens. Экспрессия гена и отбор высокопродуктивных клеток-хозяев. Понятие "экспрессия гена" относится к транскрипции и/или трансляции гетерологичной генной последовательности в клетке-хозяине. Уровень экспрессии, как правило, можно оценивать либо на основе количества соответствующей мРНК, присутствующей в клетке-хозяине, либо на основе количества продуцированного продукта гена, кодируемого представляющим интерес геном. Количество мРНК, полученной в результате транскрипции выбранной нуклеотидной последовательности, можно определять,например, с помощью гибридизации методом нозерн-блоттинга, защиты РНК от рибонуклеазы, гибридизации in situ клеточной РНК или методами ПЦР (например, с помощью количественной ПЦР) (Sambrook и др., 1989; Ausubel и др., 1994). Белки, кодируемые выбранной нуклеотидной последовательностью,также можно оценивать с помощью различных методов, таких, например, как ELISA, ЖХВР с использованием протеина А, вестерн-блоттинг, радиоиммунный анализ, иммунопреципитация, путем выявления биологической активности белка, путем иммунноокрашивания белка с последующим FACS-анализом или с помощью флуоресцентной микроскопии, путем прямого обнаружения флуоресцирующего белка с помощью FACS-анализа или флуоресцентной микроскопии (Sambrook и др., 1989; Ausubel и др., 1994). Эти методы позволяют, например, исследовать приводит ли предлагаемый в изобретении ТЕ-элемент,имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или его любой участок, фрагмент или область либо их производные или комбинации к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена."Повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности" означает повышение экспрессии или синтеза встроенной в клетку-хозяина гетерологичной последовательности, например, гена, кодирующего терапевтический белок, по сравнению с контролем. Считается, что повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место, если предлагаемую в изобретении клетку культивируют согласно представленному в настоящем описании способу, предлагаемому в изобретении, и если указанная клетка обладает по меньшей мере в 1,3 раза или в 1,5 раза более высокой удельной продуктивностью либо предпочтительно в два раза более высокой удельной продуктивностью. Повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в три раза более высокой удельной продуктивностью. Предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в четыре раза более высокой удельной продуктивностью. Наиболее предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в пять раз более высокой удельной продуктивностью. Наиболее предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в шесть раз более высокой удельной продуктивностью. Наиболее предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в семь раз более высокой удельной продуктивностью. Повышения экспрессии, транскрипции или продуктивности можно достигать как путем применения одного из предлагаемых в изобретении экспрессионных векторов, так и путем применения одного из предлагаемых в изобретении способов. Соответствующие способы можно объединять с FACS-опосредуемым отбором рекомбинантных клеток-хозяев, которые содержат в качестве дополнительного селектируемого маркера, например, один(или несколько) флуоресцентный белок/флуоресцентных белков (например, GFP) или маркер клеточной поверхности. Для достижения повышенной экспрессии можно применять другие методы, а также комбинации различных методов, которые основаны, например, на использованиии цис-активных элементов для воздействия на структуру хроматина (например, LCR, UCOE, EASE, изоляторы, S/MAR, STARэлементы), использовании (созданных искусственным путем) факторов транскрипции, обработке клеток природными или синтетическими агентами с целью повышающей регуляции экспрессии эндогенного или гетерологичного гена, улучшении стабильности (времени полужизни) мРНК или белка, улучшении инициации трансляции мРНК, повышении уровня гена за счет применения эписомальных плазмид (основанных на использовании в качестве сайтов инициации репликации вирусных последовательностей,например вирусов SV40, полиомы, аденовируса, EBV или BPV), применении стимулирующих амплификацию последовательностей (Hemann и др., 1994) или систем амплификации in vitro на основе ДНКконкатемеров (Monaco и др., 1996). Таким образом, следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится также к способам получения и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, экспрессирующих по меньшей мере один представляющий интерес гетерологичный ген, который отличается тем, что: (I) трансфектируют рекомбинантные клетки млекопитающих экспрессионным вектором, предлагаемым в изобретении,и геном, представляющим собой амплифицируемый селектируемый маркерный ген; (II) культивируют клетки млекопитающих в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию гена(ов), представляющего(их) интерес, модифицированный ген неомицинфосфотрансферазы и ген, кодирующий флуоресцентный белок; (III) культивируют клетки млекопитающих в присутствии по меньшей мере одного селектирующего агента, который оказывает избирательное воздействие на рост клеток млекопитающих и создает предпочтительные условия для роста тех клеток, которые экспрессируют ген неомицинфосфотрансферазы; (IV) отбирают с помощью анализа методом проточной цитометрии клетки млекопитающих, обладающие высоким уровнем экспрессии флуоресцентного белка; (V) культивируют отобранные клетки в условиях, в которых экспрессируется амплифицируемый селектируемый маркерный ген; и (VI) добавляют в культуральную среду селектирующий агент, который приводит к амплификации амплифицируемого селектируемого маркерного гена. Кроме того, в изобретении предложен способ, с помощью которого размножают продуцирующие клетки и используют их для получения представляющего интерес продукта кодирующего гена. Для этого отобранные высокопродуктивные клетки предпочтительно культивируют в бессывороточной культуральной среде и предпочтительно в суспензионной культуре в условиях, в которых может происходить экспрессия представляющего интерес гена. При этом представляющий интерес белок/продукт предпочтительно выделяют из среды для культуры клеток в виде секретируемого продукта гена. В том случае,когда экспрессия белка осуществляется при отсутствии сигнала секреции, то продукт гена можно выделять также из клеточных лизатов. Для получения чистого гомогенного продукта, практически не содержащего другие рекомбинантные белки и белки клеток-хозяев, осуществляют общепринятые стадии очистки. Для этого часто сначала из культуральной среды или лизата удаляют клетки и клеточный дебрис. Затем требуемый продукт гена можно очищать от загрязняющих растворимых белков, полипептидов и- 23016880 нуклеиновых кислот, например, с помощью фракционирования на иммунноаффинных и ионообменных колонках, осаждения этанолом, ЖХВР с обращенной фазой или хроматографии на сефадексе, силикагеле или катионообменных смолах, таких как ДЭАЭ. Методы, позволяющие очищать гетерологичные белки,экспрессируемые рекомбинантными клетками-хозяевами, известны специалисту в данной области и описаны в научной литературе, например, у Harris и др. (1995) и Scopes (1988). Композиции, предлагаемые в изобретении. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или фрагмент ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности,или производное ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или фрагмент ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности,или производное ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, при условии, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты между 1 и 1578 парой оснований (положения указаны для SEQ ID NO: 01). Под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований. Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или фрагмент ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности,или производное ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, при условии, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности ТЕ-09 (SEQ ID NO: 11) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) либо ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15). И в этом случае также под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований. Усиление экспрессии представляющего интерес гена можно оценивать, например, путем измерения титра продукта с помощью ELISA. Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) или фрагмент ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе. В предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении,условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты между 1 и 1578 парой оснований (положения указаны дляSEQ ID NO: 01). В наиболее предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении, условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности ТЕ-09 (SEQ ID NO: 11) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) либо TE-13 (SEQ ID NO: 15). Под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований. Другой вариант осуществления изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая содержитSEQ ID NO: 1 или фрагмент SEQ ID NO: 1, или комплементарные им нуклеотидные последовательности,или производное SEQ ID NO: 1 или ее фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе. В предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении,условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты между 1 и 1578 парой оснований (положения указаны дляSEQ ID NO: 01). В наиболее предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении, условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности ТЕ-09 (SEQ ID NO: 11) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) либо ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15). Под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований. Настоящее изобретение относится также к нуклеиновой кислоте (т.е. ТЕ-элементу), предназначенной для усиления транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, которая имеет SEQ IDNO: 1 либо ее фрагмент или производное, или комплементарные им нуклеотидные последовательности,- 24016880 которая приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Усиление экспрессии представляющего интерес гена можно оценивать, например, путем измерения титра продукта с помощью ELISA. Настоящее изобретение относится, прежде всего, к нуклеиновой кислоте, предлагаемой в изобретении, которая гибридизуется в строгих условиях:(а) с областью нуклеотидной последовательности ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10); или(б) с комплементарными им нуклеотидными последовательностями; или(в) с нуклеотидной последовательностью, которая идентична по меньшей мере примерно на 70%,предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 85%,более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% последовательностям, указанным в подпункте (а) или (б). В конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, имеет длину, составляющую по меньшей мере 511 пар оснований (длина ТЕ-13, SEQ ID NO: 15) или по меньшей мере 1015 пар оснований (длина ТЕ-08, SEQ ID NO: 10). Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к 5'-фрагменту ТЕэлемента ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2). Он соответствует области, расположенной между 1 и 1578 парой оснований SEQ ID NO: 1 или комплементарной ей нуклеотидной последовательности. Настоящее изобретение относится, прежде всего, к нуклеиновой кислоте или усиливающему транскрипцию или усиливающему экспрессию элементу нуклеиновой кислоты (ТЕ-элементу), которая/который содержит ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10), или его производное, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, которая/который при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Предпочтительно настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте или выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, или выделенной нуклеотидной последовательности, или выделенному усиливающему транскрипцию элементу нуклеиновой кислоты, или выделенному ТЕ-элементу. Настоящее изобретение относится, прежде всего, к выделенной нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) или комплементарную ему нуклеотидную последовательность, и при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты, или выделенная нуклеиновая кислота содержит производное ТЕ-элемента или SEQ ID NO: 1, последовательность которого идентична по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% соответствующей области последовательности ТЕэлемента или комплементарной ему последовательности, прежде всего области последовательности,расположенной между 1 и 1578 парой оснований нуклеотидной последовательности, представленной вSEQ ID NO: 1, которая соответствует 5'-области последовательности ТЕ-00 и наиболее предпочтительно ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10). В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты, или выделенная нуклеиновая кислота содержит производное нуклеиновой кислоты ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10) или предпочтительно нуклеиновой кислоты ТЕ-13(SEQ ID NO: 15), последовательность которого идентична по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% соответствующей области последовательности ТЕ-элемента или комплементарной ему последовательности. Другой вариант осуществления изобретения относится к нуклеиновой кислоте или усиливающему транскрипцию элементу нуклеиновой кислоты, или выделенной нуклеиновой кислоте или производному ТЕ-элемента, которые гибридизуются с последовательностью ТЕ-элемента или с последовательностью,комплементарной ТЕ-элементу, прежде всего с областью последовательности, расположенной между 1 и 1578 парой оснований нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, которая соответствует 5'-участку последовательности элемента ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), или предпочтительно гибридизуется с элементом ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10). Предпочтительно гибридизацию осуществляют в строгих условиях гибридизации и отмывки. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или предлагаемый в изобретении усиливающий транскрипцию элемент (ТЕэлемент) выбирают из группы, включающей ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), ТЕ-01 (SEQ ID NO: 3), TE-02 (SEQNO: 19), TE-18 (SEQ ID NO: 20) и ТЕ-21 (SEQ ID NO: 21). В следующем варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) отличается тем, что нуклеиновая кислота представляет собой ТЕ-00 (SEQID NO: 2), TE-06 (SEQ ID NO: 8), TE-10 (SEQ ID NO: 12), TE-11 (SEQ ID NO: 13) или TE-12 (SEQ ID NO: 14), предпочтительно TE-06 (SEQ ID NO: 8). В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) отличается тем, что нуклеиновая кислота представляет собой ТЕ-01(SEQ ID NO: 3), TE-02 (SEQ ID NO: 4), TE-03 (SEQ ID NO: 5),TE-07 (SEQ ID NO: 9), TE-08 (SEQ ID NO: 10). В более предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) представляет собой TE-08 (SEQ ID NO: 10). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) представляет собой ТЕ-18 (SEQ ID NO: 20). В другом варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) отличается тем, что она/он представляет собой фрагмент или производное ТЕ 01 (SEQ ID NO: 3), предпочтительно ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), ТЕ-14 (SEQ ID NO: 16), TE-15 (SEQ ID NO: 17), TE-16 (SEQ ID NO: 18), ТЕ-17 (SEQ ID NO: 19), ТЕ-18 (SEQ ID NO: 20). В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, представляет собой ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15). В другом варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении нуклеиновая кислота или ее фрагмент либо производное представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту. Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, предлагаемой в изобретении,которая отличается тем, что содержащий нуклеиновую кислоту ТЕ-13 (SEQ ID NO: 15), или ТЕ-08 (SEQID NO: 10), или ТЕ-07 (SEQ ID NO: 9), или ТЕ-06 (SEQ ID NO:8), или фрагмент этих последовательностей, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производные этих последовательностей, или производные фрагментов этих последовательностей, предпочтительно ТЕ-13 (SEQ IDNO: 15) или ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10), или фрагмент этих последовательностей, или производные этих последовательностей, или производные фрагментов этих последовательностей, или комплементарные им нуклеотидные последовательности связаны с гетерологичной последовательностью. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, связанная с гетерологичной последовательностью гена, может представлять собой экспрессионный вектор, например плазмиды, бактериофаги, фагмиды, космиды, вирусные векторы или также конкретно вектор, осуществляющий направленный перенос. Нуклеиновая кислота, связанная с гетерологичной последовательностью гена, может также представлять собой любую другую синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты, такую, например, как синтетическую, искусственную молекулу или мини-хромосомы. Кроме того, настоящее изобретение относится к эукариотическому экспрессионному вектору, отличающемуся тем, что указанный экспрессионный вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, или один или несколько усиливающих транскрипцию элементов (ТЕэлементов), предлагаемых в изобретении. В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он содержит промотор и/или представляющий интерес гетерологичный ген, и/или селектируемый маркер, и/или необязательно энхансер. Кроме того, настоящее изобретение относится к эукариотическому экспрессионному вектору, отличающемуся тем, что указанный экспрессионный вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, или один или несколько усиливающих транскрипцию элементов (ТЕэлементов), предлагаемых в изобретении, и промотор и/или представляющий интерес гетерологичный ген и/или селектируемый маркер, и/или необязательно энхансер. В другом варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он представляет собой вектор, осуществляющий направленный перенос, который предназначен для направленной интеграции представляющего интерес гена. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что промотор представляет собой гетерологичный промотор, такой как ранний промотор человеческого цитомегаловируса (CMV-промотор), ранний промотор SV40, главный поздний промотор аденовируса, мышиный промотор металлотионеина-I, участок длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, промотор(ы) актина, иммуноглобулина или белка "теплового шока", предпочтительно CMV-промотор. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что промотор представляет собой гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/S27 а, наиболее предпочтительно промотор убикитина/S27 а хомячка. В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он содержит комбинацию нескольких одинаковых или различных предлагаемых в изо- 26016880 бретении нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов, расположенных в любой ориентации по отношению друг к другу, причем одна/один или несколько нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и/или одна/один или несколько нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что входящие в комбинацию нуклеиновые кислоты или ТЕ-элементы представляют собой ТЕ-06 (SEQ ID NO: 8) и наиболее предпочтительно ТЕ-08 (SEQ ID NO: 10). Предпочтительными комбинациями нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов являются ТЕ-06 элемент (SEQ ID NO: 8), расположенный перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и ТЕ-06-элемент (SEQ ID NO: 8), расположенный после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него), а также три ТЕ-06-элемента (SEQ ID NO: 8), расположенные после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него) (см. также фиг. 13). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что одна/один или несколько ТЕ-08-нуклеиновых кислот или -элементов(SEQ ID NO: 10) расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и одна/один или несколько расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'направлении относительно него), предпочтительно один ТЕ-08-элемент (SEQ ID NO: 10) расположен перед указанным геном и один после него (см. также фиг. 13). Другой предпочтительной комбинацией ТЕ-нуклеиновых кислот или -элементов являются 2 ТЕ-08 нуклеиновые кислоты/элемента (SEQ ID NO: 10), расположенные перед и/или после представляющего интерес гена. Еще одним вариантом осуществления изобретения является эукариотический экспрессионный вектор, отличающийся тем, что несколько ТЕ-06-нуклеиновых кислот или элементов (SEQ ID NO: 8), предпочтительно 3, расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него) (см. также фиг. 13). В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что комбинация, включающая одну/один или несколько ТЕ-08 нуклеиновых кислот или элементов (SEQ ID NO: 10) и одну/один или несколько ТЕ-06-нуклеиновых кислот или элементов (SEQ ID NO: 8), расположена перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'направлении относительно него) и/или после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него), предпочтительной является комбинация, включающая одну/один ТЕ-08-нуклеиновую кислоту или элемент (SEQ ID NO: 10), за которой следует одна/один ТЕ-06-нуклеиновая кислота или элемент (SEQ ID NO: 8), расположенная перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) (см. также фиг. 13). В другом варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что одна/один или несколько ТЕ-13-нуклеиновых кислот или элементов (SEQ ID NO: 15) расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и/или после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он дополнительно содержит интегразу. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева котрансфектируют по меньшей мере двумя эукариотическими экспрессионными векторами, причем по меньшей мере один из двух векторов содержит по меньшей мере один ген, который кодирует по меньшей мере один представляющий интерес белок, и другой вектор содержит одну или несколько предлагаемых в изобретении нуклеиновых кислот в любой комбинации, положении и ориентации и необязательно кодирующих также по меньшей мере один ген, представляющий интерес, и указанные нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, оказывают свое усиливающее транскрипцию или экспрессию воздействие на представляющие интерес гены, которые локализованы на другом применяемом для котрансфекции векторе, в результате коинтеграции с другим вектором. В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что селектируемый маркер представляет собой DHFR или Neo, например Neo F240I. Кроме того, изобретение относится к способу получения эукариотического экспрессионного вектора, отличающегося тем, что осуществляют интеграцию предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты в экспрессионный вектор. Кроме того, изобретение относится к эукариотической клетке-хозяину, отличающейся тем, что она содержит предлагаемый в изобретении эукариотический экспрессионный вектор. В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин отличается тем,что она обладает высокой продуктивностью, т.е. обладает более высокой удельной продуктивностью по сравнению с эукариотической клеткой-хозяином, которая не содержит предлагаемый в изобретении ТЕэлемент или предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту, причем указанная клетка-хозяин характеризуется повышенным вплоть до двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или десяти раз уровнем экс- 27016880 прессии или повышенным более чем в два, более чем в три, более чем в четыре, более чем в пять, более чем в шесть, более чем в семь, более чем в десять раз уровнем экспрессии, предпочтительно повышенным вплоть до пяти раз или более чем в три раза уровнем экспрессии. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотическая клеткахозяин отличается тем, что экспрессионный вектор стабильно интегрирован в геном. В другом варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку хомячка или мыши, такую, например, как СНО-, NSO-, Sp2/0-Ag14-, BHK21-, BHK TK-, HaK-,2254-62.2 (производное BHK-21)-, CHO-K1-, CHO-DUKX (т.е. СНО duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1-,CHO-DG44-, СНО Pro-5-, V79-, B14AF28-G3-, CHL-клетку, предпочтительно СНО-клетку, и наиболее предпочтительно CHO-DG44-клетку. В следующем варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включая (но не ограничиваясь только ими) линии клеток человека, мыши, крысы, обезьян или грызунов. Еще в одном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, включая (но не ограничиваясь только ими) клетки дрожжей, насекомых, птиц и растений. В другом конкретном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин отличается тем, что она дополнительно содержит антиапоптозный ген, такой как BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL1, A1, MCL-1, BOO, BRAG-1, NO:-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1, LMW5-HL или CED-9, предпочтительно BcL-xL или BCL-2, наиболее предпочтительно BcL-xL. Настоящее изобретение относится также к способу создания линии высокопродуктивных стабильно трансфектированных эукариотических клеток-хозяев, отличающемуся тем, что осуществляют стадии, на которых:(а) интегрируют по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, или один ТЕ-элемент, предлагаемый в изобретении, в эукариотический экспрессионный вектор, который содержит представляющий интерес ген,(б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором,(в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина. Настоящее изобретение относится также к способу создания линии высокопродуктивных стабильно трансфектированных эукариотических клеток-хозяев, отличающемуся тем, что осуществляют стадии, на которых:(а) интегрируют представляющий(ие) интерес ген(гены) в эукариотический экспрессионный вектор,который содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, или один ТЕ-элемент, предлагаемый в изобретении,(б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором,(в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина. В конкретном варианте осуществления изобретения способ отличается тем, что осуществляют по меньшей мере одну дополнительную стадию амплификации. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу создания и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, который отличается тем, что осуществляют стадии, на которых:(а) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют, по меньшей мере, представляющий интерес белок/продукт, неомицинтрансферазу, предпочтительно модифицированную, и амплифицируемый селектируемый маркер DHFR, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой по одному из пп.1-14 формулы изобретения,(б) культивируют клетки в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию различных генов,(в) отбирают такие коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как G418, в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, и(г) амплифицируют указанные коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, позволяющего осуществлять амплификацию, по меньшей мере, амплифицируемого селектируемого маркерного гена, такого, например, как метотрексат. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный способ отличается тем, что трансфектированные клетки культивируют в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, дополненной по меньшей мере 200 мкг/мл G418, предпочтительно 400 мкг/мл G418 или даже более, в отсутствие сыворотки и при добавлении МТХ в возрастающих концентрациях. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный способ отличается тем, что концентрация МТХ на первой стадии амплификации составляет по меньшей мере 100 нМ или по меньшей мере 250 нМ и ее ступенчато повышают до 1 мкМ или более. В отдельных случаях концентрация МТХ может составлять 2 мкМ. Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения способ отличается тем, что осуществляют дополнительную стадию клонирования. В другом варианте способа, предлагаемого в изобретении, клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна/хомячка, такую, например, как СНО-, NSO-, Sp2/0-Ag14-, BHK21-, BHK TK-, HaK-, 2254-62.2CHO-DG44-клетку. В предпочтительном способе, предлагаемом в изобретении, экспрессионный вектор содержит селектируемый маркер, такой как DHFR или NPT, например NPT F240I или NPT D227G. В наиболее предпочтительном варианте предлагаемого в изобретении способа долю высокопродуктивных клеток повышают вплоть до двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или десяти раз или повышают более чем в два, три, четыре, пять, шесть, семь или десять раз, предпочтительно повышают вплоть до пяти раз или более чем в три раза. Настоящее изобретение относится также к способу получения биофармацевтического продукта, который отличается тем, что осуществляют стадии, на которых:(а) интегрируют по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или один предлагаемый в изобретении ТЕ-элемент в эукариотический экспрессионный вектор, содержащий представляющий интерес ген,(б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором,(в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина и(г) культивируют полученную высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию гена (генов), представляющего(их) интерес. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу создания высокопродуктивной линии стабильно трансфектированных эукариотических клеток-хозяев, отличающемуся тем, что осуществляют стадии, на которых:(а) интегрируют ген (гены), представляющий(ие) интерес, в эукариотический экспрессионный вектор, содержащий по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или один предлагаемый в изобретении ТЕ-элемент,(б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором,(в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина и(г) культивируют полученную высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию гена (генов), представляющего(их) интерес. В конкретном варианте осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что осуществляют по меньшей мере одну дополнительную стадию амплификации. В конкретном варианте осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что осуществляют дополнительную стадию, на которой:(г) собирают и очищают представляющий интерес белок. Настоящее изобретение относится также к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕ-элемента) в эукариотическом экспрессионном векторе для усиления транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе в эукариотической клетке-хозяине или для получения биофармацевтического продукта. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕ-элемента) для создания трансгенных животных или растений. Настоящее изобретение относится также к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕ-элемента) в генной терапии. Настоящее изобретение относится, прежде всего, к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕэлемента) в качестве лекарственного средства или в составе фармацевтической композиции. Настоящее изобретение относится также к набору, включающему предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или предлагаемый(е) в изобретении ТЕ-элемент(ы), необязательно экспрессионный(е) вектор(ы), необязательно клетку-хозяина (клетки-хозяева) и необязательно реагент(ы) для осуществления трансфекции. Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, прежде всего к выделенной нуклеиновой кислоте, более точно к усиливающему транскрипцию или усиливающему экспрессию элементу нуклеиновой кислоты (ТЕ-элементу), который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или его фрагменту или производному, который при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена,за исключением ТЕ-элемента ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2). Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте за исключением ТЕ-элементов ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), ТЕ-04 (SEQ ID NO: 6) и ТЕ 06 (SEQ ID NO: 8). Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте за исключением ТЕ-элементов ТЕ-00 (SEQ ID NO: 2), ТЕ-04 (SEQ ID NO: 6), TE-05