Конструкции нуклеиновых кислот

010056 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к областям молекулярной биологии и иммунологии и, в широком смысле, к реагентам, пригодным для использования в технологии иммунизации нуклеиновыми кислотами. Конкретнее, изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот для экспрессии антигенных полипептидов и к стратегии иммунизации нуклеиновыми кислотами с использованием таких реагентов. Предшествующий уровень техники Генная терапия и иммунизация нуклеиновыми кислотами являются многообещающими подходами к лечению и предупреждению и приобретенных и наследственных заболеваний. Эти технологии предполагают внесение соответствующей нуклеиновой кислоты в организм субъекта, с последующей экспрессией in vivo. Это внесение может быть выполнено путем трансфекции клеток или тканей субъекта ex vivo и возвращения трансформированного материала в клетки хозяина. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота может быть принята in vivo непосредственно субъектом. Каждая из этих технологий требует эффективной экспрессии нуклеиновой кислоты в трансфицированной клетке для обеспечения достаточного количества терапевтического или антигенного продукта гена. Известно, что некоторые факторы влияют на достигаемый уровень экспрессии, включая эффективность трансфекции и эффективность, с которой ген или представляющая интерес последовательность транскрибируется и их мРНК транслируется. Ряд экспрессирующих систем описаны в данной области, каждая из которых обычно состоит из вектора, содержащего ген или представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанные с последовательностями, контролирующими экспрессию. Эти контрольные последовательности содержат последовательности промоторов транскрипции и последовательности для начала и окончания транскрипции. В экспрессирующих системах клеток млекопитающих обычно используемые промоторы включают в себя, помимо прочего, ранний промотор SV40; цитомегаловирусный (CMV) промотор,такой как предранний промотор CMV (Chapman et al. (1991), Nucl. Acids Res. 19: 3979-3986); промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса рака молочной железы мыши; основной поздний аденовирусный промотор (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса (HSV). Обычно используют также невирусные промоторы, такие как промотор гена металлотионеина мыши. Экспрессирующие системы часто содержат элементы-модуляторы транскрипции, упоминаемые как энхансеры, усилители. Энхансеры в широком смысле определяются как агенты, действующие в цисположении, которые, будучи соединены с последовательностью промотора и гена, ускоряют транскрипцию. Энхансеры могут функционировать из положений, гораздо более удаленных от представляющей интерес последовательности, чем другие контролирующие экспрессию элементы (например, промоторы), и могут оказывать воздействие, будучи расположены в любой ориентации относительно представляющей интерес последовательности (Banerji et al. (1981), Cell 27: 299-308, deVilleirs et al. (1981), Nucl.Acids Res. 9: 6251-6264). Энхансеры были идентифицированы в ряде вирусных источников, включая полиома-вирус, ВК-вирус, цитомегаловирус (CMV), аденовирус, обезьяний вирус 40 (SV40), вирус саркомы Молони, бычий папиллома-вирус и вирус саркомы Рауса (deVilleirs et al., выше, Rosenthal.et al.(1983), Science 222: 749-755, Hearing et al. (1983), Cell 33: 695-703, Weeks et al. (1983), Mol. Cell Biol. 3: 1222-1234, Levinson et al. (1982), Nature 295: 568-572 и Luciw et al. (1983), Cell 33: 705-716). В ряде экспрессирующих систем для иммунизации нуклеиновыми кислотами и генной терапии используется предранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV). См., например, патенты США 5168062 и 5385839, выданные Стински, и описание EP 0323997 B1. Экспрессирующие векторы, использующие hCMV, включают в себя, например, pWRG7128 (Roy et al., Vaccine 19: 764-778, 2001), а также pBC12/CMV и pJW4303, которые упоминаются в WO 95/20660. Chapman et al. (1991) сообщают о сниженных уровнях экспрессии с hCMV предраннего промотора в отсутствие интрона A hCMV. Краткое описание сущности изобретения Конструкция нуклеиновой кислоты была разработана с использованием видоизмененных вирусных промоторов и экспрессирующихся последовательностей, которые обеспечивают повышенную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей в клетках хозяина. Конструкция подходит для эффективной экспрессии генов, кодирующих антигены, и может, следовательно, быть использована в иммунизации нуклеиновыми кислотами. В частности, конструкция может быть доставлена на частицах носителя для применения в опосредованной частицами иммунизации нуклеиновыми кислотами. Соответственно, в настоящем изобретении представлена конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя последовательность химерного промотора и сайт для клонирования путем встраивания кодирующей последовательности в функциональной связи с химерным промотором, где последовательность химерного промотора содержит:(a) последовательность предраннего промотора hCMV;(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV;(c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона A в основном предраннем гене hCMV. В изобретении представлены также конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая:(a) последовательность предраннего промотора hCMV,(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV,(c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона A в основном предраннем гене hCMV;(ii) сайт для клонирования путем встраивания кодирующей последовательности в функциональной связи с химерным промотором;(а) нетранслируемую лидерную последовательность, которая является производной от последовательности HBV пре-S2-антигена, последовательности HBV е-антигена или антигена последовательности(b) последовательность энхансера, которая является производной от 3'-нетранслируемой области(UTR) последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян и которая находится в функциональной связи с химерным промотором, где последовательность энхансера расположена ниже сайта для клонирования; конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая:(ii) нетранслируемую лидерную последовательность, являющуюся производной от последовательности HBV пре-S2-антигена, последовательности HBV е-антигена или последовательности HSV типа 2gD-антигена;(iii) кодирующую последовательность, функционально связанную с (i) и (ii),где кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности; конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая:(iii) последовательность энхансера с 3'стороны от кодирующей последовательности, функционально с нею связанная (ii),где последовательность энхансера (iii) является производной от 3'-UTR последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян, и кодирующая последовательность (ii) является гетерологичной 3'-последовательности энхансера; способ получения экспрессии в клетках млекопитающих представляющего интерес полипептида,который включает в себя перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты, представленной в изобретении, причем конструкция содержит последовательность, кодирующую полипептид; покрытые частицы, пригодные для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, которые содержат частицы носителя, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты, представленной в изобретении, причем конструкция включает в себя последовательность, кодирующую полипептид; дозирующая емкость для устройства для опосредованной частицами доставки, содержащая покрытые частицы; устройство для опосредованной частицами доставки, заряженное покрытыми частицами; способ иммунизации нуклеиновыми кислотами, включающий в себя прием субъектом эффективного количества покрытых частиц, в которых кодирующая последовательность кодирует антиген; очищенную выделенную последовательность химерного промотора, которая содержит:(a) последовательность предраннего промотора hCMV;(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV;(c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона A в основном предраннем гене hCMV. Эти и другие цели, аспекты, варианты осуществления и преимущества согласно изобретению будут легко восприняты рядовыми специалистами в данной области на основании их раскрытия в данном описании. Краткое описание чертежей Фиг. 1 иллюстрирует уровни экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg), полученные с применением различных плазмидных экспрессирующих векторов; на фиг. 2 показано влияние включения интрона на экспрессию HBsAg в клетках SCC15 и бетагалактозидазы в клетках B16 (среднее по трем экспериментам); на фиг. 3 показано влияние интрона A инсулина крысы и HBV 3'-UTR на экспрессию бетагалактозидазы в клетках SCC15 (среднее по трем экспериментам); на фиг. 4 показано влияние интрона A инсулина крысы и HBV 3'-UTR на экспрессию HSVgD в клетках SCC15 (среднее по трем экспериментам); на фиг. 5 показано действие интрона A инсулина крысы и HBV 3'-UTR на экспрессию SEAP в клетках SCC15 и В 16 (три повтора для каждой линии клеток); на фиг. 6 показана способность гетерологичных сигнальных пептидов управлять секрецией SEAP-2 010056 или hFc-фрагмента в клетках В 16; на фиг. 7 показаны уровни антител, определяемые в сыворотках мышей, иммунизированных кодирующими антиген нуклеиновыми кислотами, содержащимися в разнообразных плазмидных экспрессирующих векторах; на фиг. 8 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор pJV; на фиг. 9 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор pJV7389; на фиг. 10 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор pJV7400; на фиг. 11 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор pJV7468; на фиг. 12 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор pJV7563; на фиг. 13 представлен состав оснований pJV7563. Краткое описание последовательностей Последовательность SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность предраннего промотораhCMV (GenBank M60321, Х 17403). Последовательность SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность экзонов 1 и 2 основного предраннего гена hCMV (GenBank M60321, X17403). Последовательность SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность интрона A инсулина крысы (GenBank J00748). Последовательность SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность химерного промотора в соответствии с настоящим изобретением. Последовательность SEQ ID NO: 5 является лидерной последовательностью 5'-UTR последовательности антигена пре-S2 HBV (GenBank M54923). Последовательность SEQ ID NO: 6 является лидерной последовательностью 5'-UTR последовательности gD-антигена HSV типа 2 (GenBank Z86099). Последовательность SEQ ID NO: 7 представляет собой лидерную последовательность 5'-UTR последовательности е-антигена HBV (GenBank M54923). Последовательность SEQ ID NO: 8 является 3'-UTR последовательностью HBVenh (GenBankAF143308). Последовательность SEQ ID NO: 9 представляет собой 3'-UTR последовательность предраннего гена обезьян (GenBank M16019). Последовательность SEQ ID NO: 10 представляет собой поли-А последовательность -глобина кролика (GenBank K03256). Последовательность SEQ ID NO: 11 представляется собой поли-А последовательность sCMV предраннего гена обезьян (GenBank M16019). Последовательность SEQ ID NO: 12 представляет собой поли-А последовательность гена gB HSV2HPV16 (GenBank K02718). Последовательность SEQ ID NO: 14 является последовательностью вектора экспрессии pJV. Последовательность SEQ ID NO: 15 представляет собой ПЦР-праймер JF93. Последовательность SEQ ID NO: 16 представляет собой ПЦР-праймер F110. Последовательность SEQ ID NO: 17 представляет собой ПЦР-праймер GW1. Последовательность SEQ ID NO: 18 представляет собой ПЦР-праймер JF254. Последовательность SEQ ID NO: 19 представляет собой ПЦР-праймер GW150. Последовательность SEQ ID NO: 20 представляет собой ПЦР-праймер JF255. Последовательность SEQ ID NO: 21 представляет собой ПЦР-праймер DS1. Последовательность SEQ ID NO: 22 представляет собой ПЦР-праймер DA1. Последовательность SEQ ID NO: 23 представляет собой ПЦР-праймер JF301. Последовательность SEQ ID NO: 24 представляет собой ПЦР-праймер JF302. Последовательность SEQ ID NO: 25 представляет собой ПЦР-праймер JF84. Последовательность SEQ ID NO: 26 представляет собой ПЦР-праймер JF225. Последовательность SEQ ID NO: 27 представляет собой ПЦР-праймер JF335. Последовательность SEQ ID NO: 28 представляет собой ПЦР-праймер JF336. Последовательность SEQ ID NO: 29 представляет собой ПЦР-праймер JF357. Последовательность SEQ ID NO: 30 представляет собой ПЦР-праймер JF365. Последовательность SEQ ID NO: 31 представляет собой ПЦР-праймер JF393. Последовательность SEQ ID NO: 32 представляет собой ПЦР-праймер JF406. Последовательность SEQ ID NO: 33 представляет собой ПЦР-праймер JF256. Последовательность SEQ ID NO: 34 представляет собой ПЦР-праймер JF257. Последовательность SEQ ID NO: 35 представляет собой ПЦР-праймер JF320. Последовательность SEQ ID NO: 36 представляет собой ПЦР-праймер JF321. Последовательность SEQ ID NO: 37 представляет собой ПЦР-праймер JF386. Последовательность SEQ ID NO: 38 представляет собой ПЦР-праймер FcAS.-3 010056 Последовательность SEQ ID NO: 39 представляет собой олигонуклеотид JF354. Последовательность SEQ ID NO: 40 представляет собой ПЦР-праймер JF355. Последовательность SEQ ID NO: 41 представляет собой ПЦР-праймер JF356. Последовательность SEQ ID NO: 42 представляет собой олигонуклеотид JF348. Последовательность SEQ ID NO: 43 представляет собой ПЦР-праймер JF349. Последовательность SEQ ID NO: 44 представляет собой ПЦР-праймер JF350. Последовательность SEQ ID NO: 45 представляет собой олигонуклеотид JF351. Последовательность SEQ ID NO: 46 представляет собой ПЦР-праймер JF352. Последовательность SEQ ID NO: 47 представляет собой ПЦР-праймер JF353. Последовательность SEQ ID NO: 48 представляет собой ПЦР-праймер JF430. Последовательность SEQ ID NO: 49 представляет собой ПЦР-праймер JF442. Последовательность SEQ ID NO: 50 представляет собой ПЦР-праймер JF421. Последовательность SEQ ID NO: 51 представляет собой ПЦР-праймер JF444. Последовательность SEQ ID NO: 52 представляет собой последовательность промотора вируса псевдобешенства (PRV). Последовательность SEQ ID NO: 53 представляет собой последовательность промотора вируса саркомы Рауса (RSV). Подробное описание Прежде чем приступать к подробному описанию настоящего изобретения, следует уяснить, что это изобретение не ограничено конкретно приведенными в качестве примеров молекулами или параметрами способа, так как они могут, несомненно, меняться. Также следует понимать, что использованная здесь терминология служит только для описания отдельных вариантов осуществления изобретения и не носит ограничительного характера. К тому же, в практике согласно изобретению будут использоваться, если не указано иначе, традиционные методы вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, методы рекомбинации ДНК и иммунологии, которые всецело доступны рядовым специалистам в данной области. Такие методы подробно раскрыты в литературе. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: AOligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); and Fundamental Virology, 2nd Edition, vol.1II (B.N. Fields b D.M. Knipe, eds). Все публикации, патенты и заявки на патенты, указанные здесь, или выше, или ниже, полностью включены в данное описание в качестве ссылки в их полноте. Нужно отметить, что в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа относится также и к множественному числу, за исключением тех случаев, когда содержание ясно указывает на обратное. А. Определения. За исключением специально оговоренных, все использованные здесь методические и научные термины имеют то же значение, которое является общепринятым среди рядовых специалистов в области, к которой относится изобретение. Хотя ряд способов и материалов, таких же - или эквивалентных - описанных здесь, может быть использован в практике настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные материалы и способы. В описании согласно изобретению будут использованы следующие термины, которые должны быть определены, как показано ниже. Термин иммунизация нуклеиновой кислотой применяется здесь по отношению к введению молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более выбранных антигенов, в клетку-хозяина для экспрессии антигена или антигенов in vivo. Молекула нуклеиновой кислоты может быть введена субъекту непосредственно, как при стандартной внутримышечной или внутрикожной инъекции; чрескожной доставке частицы; ингаляции; локально или при приеме внутрь, интраназально или через слизистую оболочку. Молекула альтернативно может быть введена ex vivo в клетки, которые взяты у субъекта. В этом последнем случае клетки, содержащие представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты, вводят обратно субъекту, так что может возникать иммунный ответ против антигена, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для такой иммунизации, как правило, упоминаются здесь как вакцины нуклеиновой кислоты. Термин адъювант означает материал или композицию, способные к специфическому или неспецифическому изменению, повышению, управлению, переадресации, потенцированию или инициированию специфического иммунного ответа на антиген. Таким образом, совместное введение адъюванта с антигеном может приводить к более низкой или меньшей дозе антигена, необходимого для достижения желаемого иммунного ответа у субъекта, которому введен антиген, или совместное введение может приводить к количественному и/или качественному изменению иммунного ответа субъекта. В частности,введение адъюванта может приводить к усилению иммунного ответа, например, увеличению его силы и продолжительности. Эффективность адъюванта может быть определена путем введения адъюванта вместе с вакцинной композицией параллельно с введением отдельно вакцинной композиции животным и сравнения антител и/или медиаторов клеточного иммунитета в двух группах, применяя стандартный-4 010056 анализ, например радиоиммунный анализ, ELISA, CTL-анализ. Под базовым носителем подразумевают носитель, на который нанесена чужеродная нуклеиновая кислота (например, ДНК, РНК), чтобы придать определенный размер частице, также как и достаточно высокую плотность, для достижения импульса, необходимого для проникновения через мембрану, так что чужеродная молекула может быть доставлена с использованием опосредованных частицами технологий (см., например, Patent US5100792). Базовые носители обычно включают в себя такие материалы,как вольфрам, золото, платину, феррит полистирол и латекс. См., например, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer (1994), Yang, N. ed., Oxford University Press, New York, NY, p. 10-11. Под безыгольным шприцем подразумевают инструмент, который доставляет композицию микрочастиц чрескожно без помощи традиционной иглы для прокалывания кожи. Безыгольный шприц для применения в настоящем изобретении рассмотрен в настоящем описании. Термин чрескожная доставка означает внутрикожное (например, в дерму или эпидермис), чрескожное (например, перкутанное) введение и введение через слизистую, т.е. доставку посредством переноса агента в кожу или через кожу или слизистую. См., например, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled DrugDelivery of Drugs, vol. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). Таким образом, термин заключается в доставке из безыгольного шприца, как описано в патенте США 5630796, также как и опосредованной частицами доставке, как описано в патенте США 5865796. Термин полипептид применяется в самом широком смысле в отношении вещества, содержащего две и более субъединицы аминокислот, аналогов аминокислот или других пептидомиметиков. Субъединицы могут быть связаны пептидной связью или другими типами связи, например эфирной, сложноэфирной и т.д. В данном контексте термин аминокислота относится либо к натуральным и/или искусственным,либо к синтетическим аминокислотам, включая глицин и оба, D и L, оптических изомера, аналоги аминокислот и пептидомиметики. Пептид из трех и более аминокислот обычно называется олигопептидом,если пептидная цепь коротка. Если пептидная цепь длинна, пептид, как правило, называется полипептидом или белком. Антиген относится к любому агенту, обычно макромолекуле, которая может вызвать иммунный ответ у индивида. Термин может быть использован в отношении индивидуальных макромолекул или гомогенной или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. В этом смысле антиген, как правило, относится к белковой молекуле или ее части, которая содержит один или более эпитопов. Для целей согласно изобретению антигены могут быть получены или извлечены из любого подходящего источника. Кроме того, для целей, согласно изобретению, понятие антиген включает в себя белок, имеющий модификации, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе) в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет достаточную иммуногенность. Эти модификации могут быть намеренными, например, через направленный точечный мутагенез, или могут быть случайными, такими как мутации у хозяев, которые производят антигены. Иммунный ответ на представляющий интерес антиген - это выработка у индивида гуморального и/или клеточного иммунного ответа на антиген. Для целей настоящего изобретения гуморальный иммунный ответ относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител, в то время как клеточный иммунный ответ - это ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими клетками белой крови. Термины молекула нуклеиновой кислоты и полинуклеотид используются здесь как взаимозаменяемые и относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают в себя ген, фрагмент гена, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированную ДНК любого происхождения, изолированную РНК любого происхождения, образцы нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид обычно состоит из специфической последовательности четырех нуклеотидных оснований: аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и тимина (T) (урацил (U) заменяет тимин (T), если полинуклеотидом является РНК). Таким образом, понятие последовательности нуклеиновой кислоты заключается в алфавитном изображении полинуклеотидной молекулы. Это алфавитное изображение можно ввести в базы данных компьютера, имеющего центральный процессор, и использовать для биоинформационных приложений, таких как функциональная геномика или поиск гомологии. Вектор обладает способностью переносить последовательности нуклеиновых кислот в клеткимишени (например, вирусные векторы, невирусные векторы, частицы носителя и липосомы). Как правило, векторная конструкция, экспрессирующий вектор и вектор, переносящий ген означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную направлять экспрессию представляющего интерес гена,которая может переносить последовательности гена в клетки-мишени. Таким образом, термин включает-5 010056 в себя средства клонирования и экспрессии, также как и вирусные векторы. Плазмида - это вектор в форме внехромосомного генетического элемента. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует отобранный антиген, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) или транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo, будучи помещена под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'(амино)конце и стоп-кодоном на 3'(карбокси)-конце. Для целей изобретения такие последовательности нуклеиновых кислот могут включать в себя (но не ограничиваться ими) кДНК вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные последовательности вирусной или прокариотической ДНК или РНК и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может располагаться с 3'-конца от кодирующей последовательности. Промотор - это нуклеотидная последовательность, которая инициирует и регулирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего полипептид. Промоторы могут включать в себя индуцируемые промоторы (в которых экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируется неким веществом, кофактором, регуляторным белком и т.д.), репрессируемые промоторы (в которых экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, репрессируется неким веществом, кофактором, регуляторным белком и т.д.) и конститутивные промоторы. Подразумевается, что термин промотор или контролирующий элемент включает в себя полноразмерные области промоторов и функциональные (например, контролирующие транскрипцию или трансляцию) сегменты этих областей. Функционально связанный относится к организации элементов, при которой компоненты, описанные таким образом, скомпонованы так, чтобы выполнять свои обычные функции. Таким образом,данный промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, способен оказывать влияние на экспрессию этой последовательности в присутствии надлежащих ферментов. Промотор не должен граничить с последовательностью при условии, что он управляет ее экспрессией. Таким образом, например, между последовательностью промотора и последовательностью нуклеиновой кислоты могут присутствовать промежуточные нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности,при этом последовательность промотора может по-прежнему рассматриваться как функционально связанная с кодирующей последовательностью. Термин рекомбинантный используется здесь для описания молекулы нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, которая, в силу своего происхождения или конструирования, не связана полностью или частично с полинуклеотидом, с которым она ассоциирована в природе, и/или связана с полинуклеотидом, отличающимся от того,с которым она связана в природе. Две последовательности нуклеиновых кислот, которые содержатся в одной молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, являются гетерологичными по отношению друг к другу, если они обычно не ассоциированы друг с другом в природе. Здесь упоминаются гомологи полинуклеотидов. Как правило, полинуклеотид, который гомологичен другому полинуклеотиду, гомологичен этому полинуклеотиду по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95, 97 или 99%. Способы измерения гомологии хорошо известны в данной области, и специалистам будет понятно, что в настоящем контексте гомология рассчитывается на основании идентичности нуклеиновых кислот. Такая гомология может покрывать участок по меньшей мере из 15, предпочтительно по меньшей мере из 30,например, по меньшей мере 40, 60 или 100 или более соседних нуклеотидов. Способы измерения гомологии или идентичности полинуклеотидов известны в данной области. Например, пакет программ UWGCG предоставляет программу BESTFIT, которая может быть использована для вычисления уровня гомологии (например, при использовании параметров программы, принятых по умолчанию) (Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Research 12, p. 387-395). Алгоритмы PILEUP и BLAST также могут быть использованы для определения уровня гомологии или поиска последовательностей (обычно на основе параметров, принятых по умолчанию), например,как описано у Altschul S.F. (1993), J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul, S.F. et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-10. Программное обеспечение для проведения BLAST-анализа является общедоступным в Национальном центре биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм сначала включает распознавание быстро вычисляемых пар последовательностей (HSPs) посредством идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые или точно совпадают,или удовлетворяют некоторому положительному пороговому уровню T, когда сравниваются со словами такой же длины в последовательностях базы данных. T рассматривается как порог вычисления близких слов (Altshul et al., указано выше). Эти исходные совпадения близких слов выполняют роль источников для первоначального поиска содержащих их HSP. От этих совпадающих слов поиск продолжается в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, пока суммарный результат совпадения растет. Распространение участка совпадения в каждом направлении прекращается, если суммарный результат совпадения снижается до нуля и ниже, вследствие накопления одного или более несовпадающих остатков в-6 010056 выравнивании, или достигается конец последовательности. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость сравнения. По умолчанию в программе BLAST используется длина слова (W) в 11 знаков, матрица обсчета BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89: 10915-10919) для 50 выравниваний (В), с ожиданием (E), равным 10, М=5, N=4, при этом сравниваются обе цепи. Алгоритм BLAST позволяет проводить статистический анализ сходства между двумя последовательностями; см., например, Karlin and Altschul (1993), Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877. Результат измерения сходства, выдаваемый алгоритмом BLAST, представляет собой наименьшую суммарную вероятность (P(N, которая указывает на вероятность, с которой будет происходить случайное совпадение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. Например, последовательность считается сходной с другой последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности и второй последовательности меньше чем примерно 1, желательно, если меньше чем примерно 0,1, еще более предпочтительно, если меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно, если меньше чем примерно 0,001. Гомологи обычно гибридизуются с подходящим полинуклеотидом на уровне, значительно превышающем фон. Уровень сигнала, получаемый при взаимодействии между гомологом и полинуклеотидом,обычно превышает фоновую гибридизацию по меньшей мере в 10 раз, лучше, если по меньшей мере в 100 раз. Интенсивность взаимодействия может быть измерена, например, путем введения в образец радиоактивных изотопов, например 32P. Избирательная гибридизация обычно достигается путем применения жестких условий среды (например, 0,03 M хлорид натрия и 0,003 M цитрат натрия при температуре примерно от 50 примерно до 60C). Строгие условия гибридизации могут включать в себя 50% формамид, 5-кратный раствор Дэнхардта, 5-кратный раствор SSC, 0,1% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, а условия промывки могут включать в себя промывку 2-кратным раствором SSC, 0,1% SDS, при 37 С, затем 1-кратным раствором SSC, 0,1% SDS, при 68 С. Определение подходящих условий гибридизации находится в рамках данной области. См., например, ссылку Sambrook et al., указанную выше. Гомолог может отличаться от последовательности рассматриваемого полинуклеотида по 3, 5, 10, 20 или более мутациям (каждая из которых может быть заменой, делецией или вставкой). Эти мутации могут покрывать участок по меньшей мере в 30, например, по меньшей мере в 40, 60 или 100 и более соседних нуклеотидов гомолога. Там, где полинуклеотид кодирует полипептид, замена предпочтительно приводит к консервативным изменениям в кодируемых аминокислотах. Они определяются в соответствии со следующей таблицей. Аминокислоты в одной и той же группе во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут быть заменены друг на друга при консервативных изменениях. Термины индивид и субъект используются здесь как взаимозаменяемые по отношению к любому члену подтипа хордовых, включая, без ограничения, человека и других приматов (включая нечеловекообразных приматов, таких как шимпанзе и другие виды обезьян); сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничье-промысловых птиц, таких как куры, индейки и другие птицы отряда куриных, утки, гуси и т.п. Эти термины не относятся к определенному возрасту. Таким образом, подразумевается, что будут включены и взрослые, и новорожденные индивиды. Описанные здесь способы предназначены для применения к любому из указанных выше видов позвоночных, так как иммунные системы у всех этих позвоночных функционируют одинаково. В. Общий обзор. Изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот, которые обеспечивают эффективную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей и, в частности, генов, кодирующих антигены, в клетках хозяина. Более конкретно, изобретение представляет конструкции нуклеиновых кислот,содержащие или в некоторых вариантах осуществления, по существу, состоящие из последовательности химерного промотора и сайта для клонирования, таким образом, что, когда кодирующая последовательность встроена в сайт для клонирования, кодирующая последовательность находится в функциональной(a) последовательности предраннего промотора hCMV;(b) экзона 1 и по меньшей мере части экзона 2 основного предраннего гена hCMV;(c) гетерологичного интрона, расположенного на месте участка интрона A в основном предраннем гене hCMV. Последовательность (а) предраннего промотора hCMV может содержать:(i) последовательность предраннего промотора нативного hCMV;(ii) ее функциональный гомологичный вариант или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). В целом последовательность (а) содержит примерно от 100 до 600, предпочтительно от 200 до 600,например от 400 до 600 нуклеотидов. Обычно последовательность (а) содержит последовательности,представленные в (i), которые связывают факторы транскрипции или РНК-полимеразу, или, вместо любой из этих последовательностей, гомологи этих последовательностей, способные связывать те же факторы транскрипции и РНК-полимеразу. Обычно такие последовательности или их гомологи представлены в последовательности (а) промотора в том же порядке и/или, по существу, с теми же интервалами, как в (i). Как правило, (i) включает в себя нуклеотиды по меньшей мере от -100 до -1, обычно от -150 до -1,например, от -500 до -1 или от -600 до -1, относительно основного предраннего гена hCMV. Последовательность (i), как правило, содержит центральную последовательность промотора hCMV и может также включать в себя один или более энхансерных элементов, присутствующих в предраннем промотореhCMV. Например, (i) может включать в себя нуклеотиды от -118 до -1 или от -524 до -1, как вUS 6218140, или нуклеотиды от -62 до -1 или от -465 до -1, как в US 5385839. Как правило, (i) содержит TATA-бокс или CAAT-бокс, в большинстве случаев обнаруживаемые в промоторных последовательностях. Предпочтительно, чтобы последовательность включала в себя одну или более повторяющихся последовательностей предраннего промотора hCMV. В предпочтительном варианте осуществления (i) содержит SEQ ID NO: 1. Последовательность предраннего промотора hCMV может быть получена с применением известных способов. Предранний промотор нативного hCMV может быть выделен непосредственно из образца вируса с использованием стандартных методов. В US 5385839, например, описано клонирование промоторного участка hCMV. Последовательность предраннего промотора hCMV имеется в Genbank M60321(Towne штамм hCMV) и X17403 (Ad169 штамм hCMV). Нативная последовательность могла поэтому быть выделена посредством ПЦР с применением праймеров для ПЦР, основанных на известной последовательности. См., например, ссылку Sambrook et al, указанную выше, для описания методов, используемых для получения и очистки ДНК. Подходящая последовательность промотора hCMV может также быть изолирована из существующего плазмидного вектора. Последовательность промотора может быть получена также синтетическим путем. Функциональный вариант (ii) или фрагмент (iii), как правило, сохраняет или дополняет активность нативного промотора (i). Обычно эта активность представляет собой способность вызывать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функционально связанного полинуклеотида, в частности основного предраннего гена hCMV. B одном варианте осуществления вариант или фрагмент способны дополнять активность нативного промотора в hCMV вирусе, давая вирусу возможность, например, сохранять способность к инфекции и/или репликации в клетках. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) могут быть оценены по способности сохранять и/или дополнять активность (i). Например, гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) могут быть оценены по способности восстанавливать функциональность (такую как способность к инфекции и/или репликации) у мутанта hCMV, дефектного по нативному предраннему промотору hCMV. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) могут быть тестированы на возможность использования с помощью сравнительного анализа экспрессии, описанного ниже. Тестируемая промоторная последовательность заменяет в исходном векторе нативный предранний промотор hCMV. Обычно функциональный вариант и/или фрагмент обеспечивает по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80, 90% и более от уровня экспрессии, обеспечиваемого использованием исходного вектора. Обычно экспрессия обеспечивается по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух типах клеток, используемых для оценки. Обычно для оценки используются клетки млекопитающих HEK 293 Т, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. Дополнительно или в качестве альтернативы последовательность промотора может быть протестирована с помощью сравнительного анализа иммуногенности, описанного ниже. Тестируемая промоторная последовательность заменяет в исходном векторе нативный предранний промотор hCMV. Функциональная промоторная последовательность обеспечивает титр антител, по меньшей мере, такой же или выше, чем исходный вектор, по меньшей мере для одного, а лучше, если для двух антигенов. Предпочтительно титр антител по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем с исходным вектором. Предпочтительными антигенами являются HBsAg, HSV2gD и flu-M2 антигены. В соответствии с этим тестом функциональным гомологичным вариантом (ii) и/или функциональным фрагментом (iii) нативной про-8 010056 моторной последовательности является такой, который обеспечивает высший титр антител, достигаемый с использованием нативной последовательности. Как указывалось выше, конструкция может содержать последовательность экзона (b), которая включает в себя последовательности, производные от экзона 1 и экзона 2 основного предраннего генаhCMV. Экзоны - это кодирующие последовательности, которые в природе, как правило, разделяются интронами. В нативном основном предраннем гене hCMV экзоны 1 и 2 обычно разделены нативным интроном А. В настоящей химерной конструкции последовательность экзона 2 целиком поставлена в 3' положение относительно последовательности экзона 1, без промежуточной последовательности интрона,так что последовательности экзона 1 и экзона 2 граничат. Последовательность экзона (b) может содержать:(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Последовательность (i) может содержать от 50 до 100% нативной последовательности экзона 1 основного предраннего гена hCMV, например от 60 до 90% или от 70 до 80%. В типичном случае присутствует по меньшей мере 50% нативного экзона 1, например 60, 70, 80, 90% или более. Последовательность экзона (b) может также содержать по меньшей мере часть последовательности экзона 2. В последовательности (i) присутствуют обычно 2 или более оснований нативного экзона 2, например присутствуют основания 2-9, или 2-7, или 3-5. До 100% включительно природной последовательности экзона 2,например, может присутствовать от 5 до 95%, от 20 до 80% или от 40 до 60% природной последовательности экзона 2. Гомологичный вариант имеет обычно любую из указанных для нативной последовательности протяженность. Предпочтительно (i) содержит последовательность SEQ ID NO: 2. Подходящая последовательность экзона (b) может быть получена с использованием известных методов. См., например, ссылку Sambrook et al., указанную выше, для описания методов, используемых для получения и очистки ДНК. Нативную последовательность основного предраннего гена hCMV можно изолировать прямо из образца вирусов, используя стандартные методы (см., например, MacLean, A.(1998), "Preparation of HSV-DNA and Production of Infectious Virus" in Herpes Simplex Virus Protocols,S. Brown, A. MacLean, editors, Humana Press, Totowa, NJ, p. 19-26). Последовательность основного предраннего гена hCMV, включая положение экзонов 1 и 2, доступна в Genbank M60321, X17403. Нативные последовательности экзонов 1 и 2 поэтому могут быть получены посредством вырезания из нативной последовательности основного гена по подходящим сайтам рестрикции или с помощью ПЦР, используя ПЦР-праймеры на основе известной последовательности. Как альтернатива, подходящие последовательности экзонов могут быть изолированы из существующего плазмидного вектора, такого как pWRG7128. Последовательности экзонов могут также быть синтезированы, скорее, чем клонированы. Вариантные последовательности легко могут быть сконструированы рутинными методами, такими как направленный точечный мутагенез. В целом, последовательность экзона, присутствуя в конструкции по изобретению, увеличит уровень экспрессии, обычно вызывая сравнимое увеличение нативной последовательности экзона 1 и экзона 2,указанной выше. Последовательность экзона может быть проверена на функциональность с помощью сравнительного теста экспрессии, описанного ниже. Тестируемая последовательность экзона вставляется в исходный вектор на место уже имеющейся последовательности экзона. Как правило, последовательность экзона функциональна, если она не прекращает экспрессии, но предпочтительно увеличивает экспрессию по меньшей мере в одном, но желательно в двух типах клеток, используемых для оценки, по сравнению с исходным вектором. Как правило, оценка производится в клетках млекопитающих HEK 293 Т, CHO,HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. Экспрессия предпочтительно увеличивается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40%. В соответствии с этим тестом функциональным гомологичным вариантом (ii) или функциональным фрагментом (iii) нативной последовательности экзона (i) является такой, который обеспечивает усиление экспрессии, составляющее по меньшей мере 50% от уровня, обеспечиваемого природной последовательностью. Дополнительно или как альтернатива последовательность экзона может быть протестирована сравнительным анализом иммуногенности, описанным ниже. Тестируемая последовательность экзона помещается в исходный вектор на место уже существующей последовательности экзона. Функциональная последовательность экзона обеспечивает титр антител, по меньшей мере, такой же или выше, чем исходный вектор, по меньшей мере для одного, а лучше, если для двух антигенов. Предпочтительно титр антител по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем с исходным вектором. Предпочтительными антигенами являются антигены HBsAg, HSV2gD и flu-M2. B соответствии с этим тестом функциональным гомологичным вариантом (ii) и/или функциональным фрагментом (iii) нативной последовательности экзона является такой, который обеспечивает наивысший титр антител, достигаемый с использованием природной последовательности.-9 010056 Конструкция химерного промотора содержит гетерологичный интрон (с) на месте нативного участка интрона A основного предраннего гена hCMV. Интрон - это некодирующая последовательность, которая вырезается из пре-мРНК, транскрибированной с гена. Гетерологичным интроном является такой,который не присутствует в кодирующей последовательности в природе. Гетерологичный интрон (с) заменяет полностью или частично нативный интрон А основного предраннего гена hCMV. Природный интрон, как правило, отсутствует. Обычно гетерологичный интрон (с) помещается в положение 3' относительно последовательности экзона (b). Как правило, гетерологичный интрон (с) содержит:(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Гетерологичный интрон (с) является обычно вирусным или эукариотическим интроном. Предпочтительно, чтобы он был интроном млекопитающих, в частности не человека, а, например, крысы или цыпленка. Предпочтительно интрон является интроном А, например интроном А инсулина крысы, интроном А кератина кур или сердечного актина кур. Как правило, интрон (с) имеет длину примерно от 50 до примерно 1000 нуклеотидов, например,примерно от 100 до примерно 500 нуклеотидов. Интрон (с) может, для примера, содержать от 50 до 500 нуклеотидов, т.е. до 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов. Предпочтительно интрон содержит последовательность, найденную в положении примерно 50-133 нуклеотидов нативного интрона A инсулина крысы, или гомолог этой последовательности. Предпочтительно гетерологичный интрон (с) способен вырезаться из транскрипта РНК в эукариотической клетке хозяина. Как правило, интрон содержит одну или более донорных последовательностей(таких как GT), акцепторную последовательность (такую как AG), 3'-район, богатый пиримидинами и последовательностями, определяющими разветвление. Обычно в химерной конструкции интрон (с) содержит неинтронные фланкирующие последовательности, производные последовательностей экзонов,обнаруженные на границах интрон/экзон в природном интроне (i). Фланкирующая последовательность экзона может быть нативной последовательностью экзона или гомологом этой последовательности, который в значительной степени сохраняет функцию сплайсинга. Обычно от 5 до 10, предпочтительно от 7 до 10 оснований последовательности экзона включаются по каждому концу интрона. Интрон (с) может быть искусственным при условии, что интрон функционален. Например, можно использовать рекомбинантный или химерный интрон. Такой интрон может содержать последовательности более чем из одного природного интрона. В типичном случае интрон (с) содержит последовательности, присутствующие в интроне A hCMV,который связывает факторы транскрипции или регуляторные белки, или вместо этих последовательностей гомологи этих последовательностей, способные связывать те же факторы или белки. Как правило,такие последовательности или их гомологи присутствуют в интроне (с) в том же порядке и/или, по существу, с теми же относительными интервалами, что и в интроне A hCMV. Интрон (с) может содержать гомологичный вариант (ii), в котором последовательность природного интрона (i) была модифицирована с удалением внутреннего сайта рестрикции. Например, можно использовать гомологичный вариант интрона A инсулина крысы, в котором был разрушен внутренний сайт(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Последовательность интрона можно получить с использованием стандартных методов клонирования. Например, последовательность интрона A инсулина крысы доступна в Genbank J00748, последовательность интрона A кератина кур - в Genbank J00847 и последовательность интрона A сердечного актина кур - в Genbank Х 02212. Последовательность интрона можно изолировать из природных источников с использованием праймеров, основанных на известных последовательностях. Последовательность можно приготовить синтетически. Вариантная последовательность может быть получена мутагенезом. Обычно функциональной последовательностью интрона, например функциональным вариантом (ii) или функциональным фрагментом (iii), является такая, которая обладает, по существу, такой же активностью и/или дополняет активность природного интрона (i). B определенном варианте осуществления эта активность является активностью в сплайсинге. Последовательность интрона (с) может быть проверена на активность в сплайсинге с помощью рутинного теста на сплайсинг. Вообще, функциональный гомолог (ii) или функциональный фрагмент (iii) будет проявлять при анализе по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80, 90 и больше 100% или более от эффективности сплайсинга природного интрона (i). В целом, гетерологичная последовательность интрона будет, присутствуя в конструкции согласно изобретению, усиливать экспрессию. Как правило, вариант (ii) или фрагмент (iii) интрона будет вызы- 10010056 вать усиление, сравнимое с таковым природного интрона (i). Функциональные возможности потенциальной последовательности интрона (с) могут быть проверены с применением далее сравнительного анализа экспрессии. Гетерологичный интрон вставляется в исходный вектор. Обычно последовательность гетерологичного интрона является функциональной, если добавление последовательности повышает экспрессию по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух типах клеток, применяемых для оценки, на 25% или больше по сравнению с основным вектором. Обычно клетки образца являются клетками млекопитающихHEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. Повышение экспрессии может быть по меньшей мере на 35,45, 55% или более. В соответствии с этим анализом функциональный вариант (i) или функциональный фрагмент (ii) последовательности природного интрона (i) делает возможным повышение более чем на 50% экспрессии, достигаемой природной последовательностью. Функциональные возможности последовательности гетерологичного интрона (с) могут, дополнительно или альтернативно, быть проверены далее с применением сравнительного анализа иммуногенности. Последовательность интрона (с) добавляется к основному вектору. Функциональная последовательность интрона (с) обеспечивает титры антител, которые выше, чем титры антител, полученные при использовании основного вектора по меньшей мере с одним, предпочтительно двумя антигенами. Предпочтительно, чтобы титры антител были выше по меньшей мере на 5 или 10%, например, на 20, 30 или 40%, чем при использовании основного вектора. Предпочтительными антигенами являются антигеныHBsAg, HSV2gD или Flu-M2. B соответствии с этим исследованием функциональный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii) последовательности природного интрона (i) дает самые высокие титры антител, достигаемые природной последовательностью. Подходящая последовательность гетерологичного интрона может быть получена с применением стандартных методов клонирования. Например, последовательность интрона A инсулина крыс, имеющаяся в GenBank J00748, интрона A кератина кур в GenBank J00847 и интрона A сердечного актина кур Х 02212. Последовательность интрона может быть выделена из нативного источника с применением праймеров, основанных на известной информации о последовательности. Подходящая последовательность может быть также получена путем синтеза. Связывание вместе соответствующим образом составляющих последовательностей (а), (b) и (с) для того, чтобы формировать химерный промотор, может быть обеспечено применением стандартного клонирования или методов молекулярной биологии. Предпочтительно последовательность интрона (с) стоит к 3' от последовательности экзона (b). Конструкция химерного промотора связана с сайтом для клонирования таким образом, что промотор может влиять на экспрессию кодирующей последовательности,встроенной в сайт, при наличии специфических ферментов. Подходящие сайты для клонирования, включая множественные сайты клонирования, известны в данной области, например множественные сайты клонирования pUC19, pBC SK, pBluescript II KS, cDNA3.1, pSP72, pGEM 7Z. Как правило, нуклеиновые кислоты для встраивания (или встроенные) в сайт для клонирования кодируют терапевтически значимые полипептиды. Предпочтительно, чтобы кодирующая последовательность подходила для применения в иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии. Вставка нуклеиновой кислоты может, таким образом, содержать последовательность, способную к обеспечению иммунитета, например иммуногенная последовательность, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении субъекту. Как альтернатива, нуклеиновая кислота может содержать один или более генов, кодирующих терапевтический полипептид, например белок, дефектный или отсутствующий в геноме клетки-мишени, или ненативный белок, имеющий желаемый биологический или терапевтический эффект (например, антивирусную функцию). Известно, что для лечения генетических нарушений функциональные гены, соответствующие дефицитным генам при данном нарушении, могут быть введены субъекту. Предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота являлась ДНК. Подходящие для вставки нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, применяемые для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных, хронических и инфекционных заболеваний, включая такие нарушения, как СПИД, рак, неврологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания,гиперхолестеринемию; различную патологию крови, включая различные анемии, талассемию и гемофилию; генетические дефекты, такие как кистозный фиброз, болезнь Гошера, дефицит аденозиндиаминазы(ADA), эмфизема и т.д. Например, в способах лечения солидных опухолей гены, кодирующие токсичные пептиды (например, химиотерапевтические агенты, такие как рицин, дифтерийный токсин и действующий агент яда кобры), гены, подавляющие опухоль, такие как р 53, гены, кодирующие последовательности мРНК, которые являются антисмысловыми по отношению к трансформирующим онкогенам, противоопухолевые пептиды, такие как фактор некроза опухолей (ФНО) и другие цитокины, или трансдоминантные негативные мутанты трансформирующих онкогенов, могут быть встроены для экспрессии в или рядом с сайтом опухоли. Подобным образом, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипетиды, проявляющие противовирусную и/или антибактериальную активность, или стимулирующие иммунную систему хозяина, могут также быть включены. Нуклеиновая кислота может кодировать один из различных цитокинов (или их функ- 11010056 циональных фрагментов), таких как интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы. Нуклеиновая кислота может кодировать антиген для лечения или предотвращения ряда состояний,включающих, но не ограниченных, рак, аллергии, интоксикации и инфекции, вызываемых патогеном,таким как, но не ограниченным, грибы, вирус, включая вирус папилломы человека (HPV), HIV,HSV2/HSV1, вирус гриппа (тип А, B и С), вирус полиомиелита, RSV вирус, риновирусы, ротавирусы,вирус гепатита А, группу вирусов Norwalk, энтеровирусы, астровирусы, вирус кори, вирус парагриппа,вирус свинки, вирус герпеса Зостер, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, аденовирусы, вирус краснухи, вирус Т-клеточной лимфомы человека I типа (HTLV-I), вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита Cpestis, Streptococcus (типы А и B), Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (тип b),Toxoplasma gondic, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis и Actinomycosis; патогенные грибы, включая кандидоз и аспериллез; паразитарные патогены, включая ленточных червей, сосальщиков, круглых червей, амебиаз, лямблиоз, криптоспоридий, шистосом, пневмоцист, трихомониаз и трихинеллеза. Нуклеиновая кислота может также применяться для обеспечения подходящего иммунного ответа против многочисленных ветеринарных заболеваний, таких как ящур, коронавирус, Pasteurellamultocida, Helicobacter, Strongulys vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), Klebsiela pneumoniae, E.coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis иBordetella bronchiseptica. Таким образом, в одном аспекте конструкции нуклеиновых кислот согласно изобретению могут находить применение в качестве вакцины. В некоторых вариантах осуществления конструкция нуклеиновых кислот будет кодировать адъювант. Так, последовательности, встроенные в сайт для клонирования для встраивания кодирующей последовательности, могут кодировать полипептид, способный действовать как адъювант. В предпочтительном примере кодируемый адъювант может представлять собой ADP-рибозилирующий бактериальный токсин. Он включает в себя дифтерийный токсин (DT), коклюшный токсин (PT), холерный токсин(CT), тепловой лабильный токсин E.coli (LT1 и LT2), эндотоксин A Pseudomonas, эндотоксинS.Pseudcmonas, экзоэнзим В.cereus, токсин В.sphaericus, токсины C2 и C3 C.botulinum, экзоэнзим С.limosum, так же как и токсины C.perfringens, С.spiriforma и С.difficile и Staphylococcus aureus EDIN. Наиболее ADP-рибозилирующие бактериальные токсины содержат А и B субъединицы. Конструкция может экспрессировать субъединицу А, субъединицу B и/или обе субъединицы. В предпочтительном примере конструкция нуклеиновых кислот может кодировать теплолабильный токсин E.coli и/или холерный токсин и, в частности, может экспрессировать теплолабильный токсин E.coli. Информация GenBank для полных последовательностей CT субъединиц А и B генов может быть найдена в локусе VIBCTXABB (AccessionD30053), в то время как информация GenBank для полных последовательностей LT субъединиц А и B генов может быть найдена в локусе АВ 0116677(AccessionAB011677). Конструкция может экспрессировать активные варианты или фрагмент специфического адъюванта. Вариант или фрагмент может считаться активным, если он сохраняет, по меньшей мере, небольшое количество адъювантной активности полипептида, из которого он получен. Таким образом, вариант и/или фрагмент будут по-прежнему способны усиливать иммунный ответ на специфический антиген в сравнении с иммунным ответом, наблюдаемым, когда с антигеном не вводится адъювант. Кодируемая последовательность может быть активными фрагментами или вариантами субъединиц CT А и/или B и, в частности, может быть активными фрагментами субъединиц LT А и/или В. Из субъединицы токсина может быть делетирована ее естественно встречающаяся сигнальная последовательность. Естественно встречающаяся субъединица экзотоксина может быть модифицирована с целью детоксикации токсина. Субъединица А может быть модифицирована для того, чтобы разрушить или инактивировать ADP-рибозилтрансферазную активность. Таким образом, конструкции адъюванта согласно изобретению могут быть использованы для усиления иммунного ответа на отдельный антиген. Усиленный иммунный ответ может включать иммунный ответ большей величины или длительности. Это может означать, что, когда антиген повторно встречается с иммунным ответом, он бывает сильнее, чем если бы адъювант не применялся. Усиление иммунного ответа может выражаться в росте титра антител. В случае некоторых конструкций, и особенно тех, которые экспрессируют субъединицы экзотоксина, адъювант может вызывать увеличенный клеточный ответ и иммунный ответ, подобный ответу Т-хелпера 1, против изучаемого антигена. Нуклеиновая кислота, которая должна быть вставлена в сайт для клонирования, может содержать последовательность полиаденилирования (поли-А). Такая поли-А последовательность обычно естественно присутствует в кодирующей последовательности. Как альтернатива, конструкция нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть снабжена гетерологичной поли-А последовательностью. В типичном случае поли-А последовательность встраивается после сайта для клонирования, так что она функционально связана с кодирующей последовательностью, помещенной в сайт для клонирования. Любая подходящая поли-А последовательность может быть включена в конструкцию с помощью стандартных(ii) функциональным гомологичным вариантом (i);-глобина кролика, ранних или поздних генов вируса папилломы человека (HPV), гена HSV-2gB, предраннего гена CMV обезьяны или позднего гена HSV gD. Предпочтительно природная поли-А последовательность выбирается из группы, состоящей изSEQ ID NO: 10 (GenBank K03256), SEQ ID NO: 11 (GenBank M16019), SEQ ID NO: 12 (GenBank Z80699) и SEQ ID NO: 13 (GenBank K02718). Как правило, функциональной является поли-А последовательность, которая сохраняет активность полиаденилирования. Поли-А последовательность может быть протестирована с помощью рутинного экспрессионного теста на способность осуществлять полиаденилирование транскрипта РНК. Функциональный гомологичный вариант (ii) или функциональный фрагмент (iii) в таком тесте обычно проявляет по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80% или более поли-А активности природной поли-А последовательности. Будучи вставлена в конструкцию данного изобретения, поли-А последовательность обычно увеличивает экспрессию до уровня, сравнимого с тем, что дает природная поли-А последовательность (i), указанная выше. Поли-А последовательность может быть также проверена на функциональность с помощью сравнительного анализа экспрессии, описанного ниже. Поли-А последовательность помещается в исходный вектор на место RBGpA. Тестируемая поли-А последовательность считается функциональной, если она не прекращает экспрессию, но предпочтительно усиливает экспрессию в одном, но предпочтительно в двух типах клеток, используемых для оценки, по сравнению с исходным вектором. Предпочтительно,когда наблюдается увеличение экспрессии по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50% или более. Предпочтение отдается клеткам млекопитающих HEK 293 Т, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. B соответствии с тестом гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) является функциональными, если обеспечивает более 50% улучшение экспрессии от уровня, который дает природная поли-А последовательность (i). В качестве альтернативы или дополнительно, поли-А последовательность может быть проверена на активность с помощью сравнительного теста иммуногенности, описанного ниже. Поли-А последовательность вставляют в исходный вектор на место RBGpA. Функциональной считается поли-А последовательность, которая обеспечивает титр антител, по меньшей мере, такой же или превышающий титр, который дает исходный вектор по меньшей мере для одного, предпочтительно двух антигенов. Предпочтительно, если титры антител превышают по меньшей мере на 5, 10, например, 20, 30 или 40% титры, достигаемые с применением исходного вектора. Предпочтение отдается антигенам HBsAg,HSV2gD и Flu-M2 антигенам. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) являются функциональными,если обеспечивают максимально высокие титры антител, достигаемые с природной поли-А последовательностью (i). Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать дополнительные контролирующие последовательности, которые влияют на экспрессию кодирующей последовательности, вставленной в сайт для клонирования. Конструкция может включать в себя нетранслируемую лидерную последовательность. Последовательность обеспечивается в конструкции функциональной связью с химерным промотором, а поэтому и с кодирующей последовательностью, вставленной в сайт для клонирования. Лидер обеспечивает сайт начала трансляции для экспрессии встроенной кодирующей последовательности и, как правило, содержит элемент Козака. В типичном виде нетранслируемая лидерная последовательность представлена:(i) естественной нетранслируемой лидерной последовательностью;(ii) функциональным гомологичным вариантом (i) или(iii) функциональным фрагментом (i) или (ii). Обычно природная последовательность (i) - это эукариотическая или вирусная последовательность,в частности, вируса, который инфицирует эукариот. Предпочтительно природной последовательностью(i) является последовательность HBV или HSV, например последовательность пре-S2-антигена HBV,последовательность е-антигена HBV или последовательность типа 2gD-антигена HSV. Наиболее предпочтительно, если (i) выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7. Как правило, лидерная последовательность содержит последовательности, присутствующие в (i),которые связывают компоненты транскрипции или регуляторные белки, или гомологи этих последовательностей, которые способны связывать те же компоненты или белки. В типичном случае такие последовательности или их гомологи присутствуют в лидерной последовательности в таком же порядке и/или относительном пространственном расположении, как и в (i). Обычно лидерная последовательность содержит сайт начала трансляции для экспрессии встроенной кодирующей последовательности. Типичная лидерная последовательность включает в себя элемент Козака.- 13010056 Нетранслируемая лидерная последовательность имеет, как правило, длину примерно от 10 до примерно 200 нуклеотидов, например, примерно от 15 до 150 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до примерно 130 нуклеотидов. Можно использовать лидерные последовательности, содержащие, например, 15,50, 75 или 100 нуклеотидов. Функциональной нетранслируемой лидерной последовательностью является обычно такая, которая способна обеспечить сайт начала трансляции для экспрессии кодирующей последовательности в функциональной связи с лидерной последовательностью. В типичном случае функциональный вариант (ii) или фрагмент (iii) имеют такую же активность и/или дополняют активность природной последовательности (i) обычно путем облегчения или ускорения экспрессии кодирующей последовательности в функциональной связи с этой последовательностью. Вариант (ii) или фрагмент (iii) могут быть проверены на активность как нетранслируемые лидерные последовательности в сравнении с природной лидерной последовательностью с помощью стандартных протоколов. Например, можно приготовить экспрессирующие векторы, содержащие естественную лидерную последовательность (i), функционально связанную со своей нативной кодирующей последовательностью, и наблюдать экспрессию в подходящих клетках-хозяевах, например клетках млекопитающих HEK293 Т, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. Можно приготовить также тестовые конструкции, в которых природная лидерная последовательность заменена гомологичным вариантом или фрагментом, и наблюдать экспрессию в клетках-хозяевах тех же типов. Как правило, вариант (ii) или фрагмент (iii) обеспечивают экспрессию по меньшей мере 50%, такую как 60, 70, 80, 90 и 100% или более уровня экспрессии, обеспечиваемого природной последовательностью. Потенциальная лидерная последовательность может быть проверена также на возможность применения с помощью сравнительного экспрессионного анализа, описанного ниже. Изучаемая лидерная последовательность вставляется в исходный вектор вместо 5'-UTR пре-S2 вируса HBV. Функциональная лидерная последовательность не прекращает экспрессии, но, предпочтительно, увеличивает уровень экспрессии по меньшей мере в одном, а лучше в двух типах клеток, используемых для оценки, в сравнении с исходным вектором. Обычно экспрессия увеличивается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50. Типами клеток млекопитающих, которым отдается предпочтение, являются HEK 293 Т, CHO, HeLa,BHK, 3 Т 3 или COS. B соответствии с тестом гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) являются функциональными, если способствуют более чем 50% увеличению уровня экспрессии по сравнению с достигаемым с природной лидерной последовательностью. Дополнительно или как альтернатива, лидерная последовательность может быть протестирована с помощью сравнительного анализа иммуногенности, описанного ниже. Лидерная последовательность вставляется в исходный вектор вместо 5'-UTR пре-S2 вируса HBV. Функциональная лидерная последовательность обеспечивает титр антител, который, по меньшей мере,также высок или выше, чем титр, достигаемый с исходным вектором для одного или лучше для двух антигенов. Предпочтительно, чтобы титр антител был по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем при использовании исходного вектора. Предпочтение отдается антигенам HBsAg, HSV2gD и Flu-М 2. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) являются функциональными, если они обеспечивают наивысший титр антител, полученный с использованием природной лидерной последовательности (i). Подходящая лидерная последовательность может быть получена с помощью стандартных методов. Например, последовательности антигена пре-S2 вируса HBV, е-антигена вируса HBV и антигена типа 2gD вируса HSV имеются в наличии в GenBank M54923, М 54923 и Z86099 соответственно. Праймеры могут быть составлены на основе этих известных последовательностей и использованы для изолирования гомологичных последовательностей. Лидерная последовательность может быть синтезирована на основе известных последовательностей. Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать энхансерную последовательность. Последовательность энхансера помещается с 3' от сайта для клонирования в функциональной связи как с химерным промотором, так и с вставленной кодирующей последовательностью и действует в направлении увеличения уровня транскрипции вставленной последовательности. Как правило, энхансер представляет собой:(ii) функциональный гомологичный вариант (i) или(iii) функциональный фрагмент (i) или (ii). Энхансерная последовательность обычно содержит примерно от 50 до примерно 850 нуклеотидов,например примерно от 75 до примерно 500 нуклеотидов. Могут быть использованы энхансеры длиной примерно 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов. В типичном виде (i) - это эукариотический или вирусный энхансер, в частности, вируса, инфицирующего эукариот. Обычно такие энхансеры встречаются в 3' нетранслируемой области (3'UTR) гена. Предпочтительно (i) является энхансером HBV или CMV, например 3'-UTR HBsAg или 3'-UTR предраннего гена CMV обезьян. Предпочтительно (i) содержит последовательность SEQ ID NO: 8 или последовательность SEQ ID NO: 9.- 14010056 Как правило, энхансер в конструкции содержит последовательности, обнаруженные в (i), которые связывают компоненты транскрипции или регуляторные белки, например факторы транскрипции, или гомологи этих последовательностей, которые связывают те же компоненты или белки. Предпочтительно такие последовательности присутствуют в энхансере в таком же порядке и/или в значительной степени в относительном пространственном расположении, как и в (i). Функциональным обычно является энхансер, который усиливает или увеличивает экспрессию полинуклеотида, например кодирующей последовательности, которая функционально связана с последовательностью энхансера. В типичном случае функциональные гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) обладают в значительной мере такой же активностью (например, увеличение экспрессии) и/или дополняют активность природного энхансера (i). Активность энхансера можно протестировать, используя метод энхансерной ловушки. Протоколы известны в данной области. Функциональный гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) обеспечивают предпочтительно по меньшей мере 50% энхансерной активности, проявленной в таком тесте природным энхансером. В типичном случае активность составляет 60, 70, 80, 90, 100% и более активности природного энхансера. Как правило, функциональный вариант (ii) или фрагмент (iii) способны дополнять активность природного энхансера (i) в этом тесте. Применимость энхансера может быть также определена с помощью сравнительного анализа экспрессии, изложенного ниже. Изучаемая 3'-UTR последовательность вставляется в исходный вектор. 3'-UTR пригоден для использования, если он не прекращает экспрессии, но, предпочтительно, увеличивает уровень экспрессии по меньшей мере в одном, а лучше в двух типах клеток, используемых для оценки в сравнении с исходным вектором в данном тесте. Предпочтительно, если экспрессия увеличивается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50%. Типами клеток млекопитающих, которым отдается предпочтение, являются HEK293 Т, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. B соответствии с этим тестом гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) являются функциональными, если они способствуют более чем 50% увеличению уровня экспрессии по сравнению с достигаемым с природной энхансерной последовательностью (i). Дополнительно или как альтернатива энхансерные последовательности могут быть протестированы на активность с помощью сравнительного анализа иммуногенности, описанного ниже. 3'-UTR вставляется в исходный вектор. Функциональная энхансерная последовательность обеспечивает титр антител, который, по меньшей мере, также высок или выше, чем титр, достигаемый с исходным вектором для одного, или лучше, для двух антигенов. Предпочтительно, чтобы титр антител был по меньшей мере на 5, 10,20, 30 или 40% выше, чем при использовании исходного вектора. Предпочтение отдается антигенамHBsAg, HSV2gD и Flu-М 2. Гомологичный вариант (ii) или фрагмент (iii) являются функциональными,если они обеспечивают наивысший титр антител, полученный с использованием природной энхансерной последовательности (i). Подходящая энхансерная последовательность может быть получена с помощью стандартных методов клонирования. Например, 3'-UTR последовательность HBsAg или 3'-UTR последовательность предраннего гена CMV обезьян доступны через GenBank AF143308 и М 16019. Праймеры могут быть составлены на основе этих известных последовательностей и использованы для изолирования гомологичных последовательностей. В предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную поли-А последовательность, гетерологичную лидерную последовательность и гетерологичный энхансер - все в функциональной связи с химерным промотором для эффективной экспрессии вставленной кодирующей последовательности. В дополнительном аспекте настоящее изобретение также представляет конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую или иногда в основном состоящую из следующих последовательностей:(ii) нетранслируемой лидерной последовательности, производной от последовательности пре-S2 антигена HBV, последовательности е-антигена HBV или последовательности типа 2gD антигена HSV;(iii) кодирующей последовательности, функционально связанной с (i) и (ii), в которой кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности. В типичном случае промоторная последовательность (i) является производной от эукариотической или вирусной промоторной последовательности. Промоторная последовательность может быть природной промоторной последовательностью, функциональным гомологом природной последовательности или функциональным фрагментом той или другой. Пригодные природные промоторы включают, например, предранний промотор hCMV, промотор вируса псевдобешенства (PRV) и промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Предпочтительно природный промотор содержит последовательности SEQ ID NO: 52 илиSEQ ID NO: 53. Искусственная промоторная конструкция, такая как химерный промотор, описанный выше, может быть использована при условии, что промотор функционален. Последовательностью функционального промотора обычно является последовательность, которая способна вызывать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функционально связанной коди- 15010056 рующей последовательности в подходящей хозяйской клетке. Промоторная последовательность может быть проверена на промоторную активность с помощью рутинного экспрессионного анализа. Функциональный гомолог или фрагмент природной промоторной последовательности обычно обеспечивают в таком тесте по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% экспрессии от уровня, обеспечиваемого природной промоторной последовательностью. Нетранслируемая лидерная последовательность (ii) такая, как она описана выше. Подходящие кодирующие последовательности (iii) включают те, что были уже описаны в связи с конструкцией химерного промотора. Однако в настоящем аспекте изобретения кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности. Настоящая конструкция в типичном виде включает в себя поли-А последовательность, которая, как было описано, может быть нативной для кодирующей последовательности или обеспечивается как гетерологичная поли-A последовательность в конструкции. Пригодные поли-А последовательности уже были описаны. Конструкция может дополнительно включать энхансерную последовательность к 3' от кодирующей последовательности. Подходящие энхансерные последовательности описаны выше в связи с конструкцией химерного промотора. В другом аспекте изобретение представляет конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую или в некоторых вариантах воплощения в основном состоящую из:(iii) энхансерной последовательности к 3' от кодирующей последовательности (ii), связанной с ней функционально; где энхансерная последовательность (iii) является производной от 3'-UTR последовательности HBsAg или 3'-UTR последовательности предраннего гена CMV обезьян и кодирующая последовательность (ii) гетерологична для энхансерной последовательности. Конструкция может включать в себя нетранслируемую лидерную последовательность, такую как была уже описана выше в связи с конструкцией химерного промотора. Характерно, что промоторная последовательность (i) является производной от вирусной или эукариотической промоторной последовательности. Промоторная последовательность может быть природной промоторной последовательностью, функциональным гомологом природной последовательности или функциональным фрагментом той или другой. Пригодные природные промоторы включают, например, предранний промотор hCMV, промотор вируса псевдобешенства (PRV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Предпочтительно природный промотор содержит последовательности SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53. Конструкция искусственного промотора, такого как химерный промотор, описанный выше, может быть использована при условии, что промотор функционален. Функциональной промоторной последовательностью является обычно такая, которая способна вызвать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функциональной связанной кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине. Промоторная последовательность может быть проверена на промоторную активность с помощью рутинного экспрессионного анализа. Функциональный гомолог или фрагмент природной промоторной последовательности обычно обеспечивают в таком тесте по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% от уровня экспрессии, обеспечиваемого природной последовательностью. Подходящие кодирующие последовательности (ii) включают те, что уже были указаны в связи с конструкцией химерного промотора. В данном аспекте, однако, кодирующая последовательность является гетерологичной относительно 3' энхансерной последовательности. Энхансерная последовательность(iii) конструкции описана выше. Настоящая конструкция также в типичном виде содержит поли-А последовательность. Как и в случае конструкции химерного промотора, этот поли-А участок может быть нативным для кодирущей последовательности (ii) или может обеспечиваться в конструкции как гетерологичный поли-А компонент. В соответствии с любым из аспектов данного изобретения конструкция может содержать последовательность сигнального пептида. Последовательность сигнального пептида вставляется в функциональной связи с промотором, так что сигнальный пептид экспрессируется и облегчает секрецию полипептида,кодируемого кодирующей последовательностью, также в функциональной связи с промотором. В типичном случае последовательность сигнального пептида кодирует пептид из от 10 до 30 аминокислот, например 15-20 аминокислот. Часто аминокислоты являются преимущественно гидрофобными. В типичной ситуации сигнальный пептид направляет растущую полипептидную цепь, несущую сигнальный пептид, в эндоплазматический ретикулюм экспрессирующей клетки. Сигнальный пептид отщепляется в эндоплазматическом ретикулюме, разрешая секрецию полипептида через аппарат Гольджи. Для использования в изобретении сигнальный пептид может представлять собой:(i) природную последовательность сигнального пептида;(ii) гомологичный вариант (i), который сохраняет активность сигнального пептида; или(iii) фрагмент (i) или (ii), который сохраняет активность сигнального пептида. Последовательность (i) может быть, например, сигнальным пептидом тканевого активатора плазминогена человека (hTPAsp) (GenBank L00141), сигнальным пептидом апротинина (GenBankAAD13685), сигнальным пептидом экстенсина табака (GenBank JU0465) или сигнальным пептидом лизоцима кур (GenBank AF410481). Сигнальным пептидом, пригодным для использования в данном изобретении, является такой, который будет способствовать секреции гетерологичных белков. Функциональный сигнальный пептид может быть идентифицирован в тесте, который проводит сравнение эффекта изучаемого сигнального пептида с эффектом известного сигнального пептида, например сигнального пептида тканевого активатора плазминогена человека (hTPAsP), и с эффектом отсутствия какого-либо сигнального пептида. Можно использовать сравнительный экспрессирующий анализ, представленный ниже, но со следующими модификациями. Конструируются векторы для экспрессии и секреции, содержащие исходный вектор или исследуемый сигнальный пептид, или с hTPAsp, или без сигнального пептида. Последовательности, кодирующие полипептиды, лишенные своих естественно встречающихся сигнальных пептидов, вставляются в векторы, и векторы трансформируются в хозяйские клетки, выбранные для оценки. Типами клеток млекопитающих, которым отдается предпочтение, являются HEK293 Т, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS клетки. Клеточная среда анализируется на уровень экспрессии полипептида. Функциональный сигнальный пептид способствует секреции полипептида на более высоком уровне, чем вектор, лишенный сигнального пептида, для одного, а лучше, если для двух полипептидов. В типичном случае секреция выше на 5, или еще лучше на 10% или более, например на 20 или 50% или более. Обычно уровни секреции сравнимы с теми, что получаются с применением hTPAsp. Возможность секреции кодируемого белка за пределы экспрессирующей клетки может иметь ряд преимуществ, в особенности, если белок является антигеном. Например, увеличенная секреция антигена могла бы вызвать большее включение антигена и больший ответ иммунных клеток (макрофагов, клеток Лангенгарса, В-клеток, Т-клеток и т.д.), дала бы возможность антигену достичь кровяного русла и принимать сигналы клеток (цитокинов), находить клеточные лиганды и влиять на функцию (антитела, токсины, такие как холерный токсин, E.coli LT) и участвовать в нормальных клеточных биохимических процессах (клеточные рецепторы). Конструкция нуклеиновой кислоты данного изобретения может быть в форме плазмидного экспрессионного вектора. Вектор может также включать дополнительные элементы, такие как сайт начала репликации, или селективные гены. Такие элементы известны в данной области и могут быть включены с использованием стандартных методов. В одном варианте осуществления плазмидный вектор содержит последовательность SEQ ID NO: 14. Как альтернатива конструкция может быть включена в состав вирусного вектора. В некоторых вариантах воплощения конструкция нуклеиновой кислоты, по изобретению, может содержать два или более химерных промотора, определяемых здесь. Так, конструкция может содержать множество химерных промоторов, и, в частности, конструкция может иметь два, три, четыре, пять или более химерных промоторов. Химерные промоторы, предпочтительно, будут функционально связаны,каждый по отдельности, с сайтом для клонирования, по которому встраивается кодирующая последовательность. Так, конструкция может экспрессировать две, три, четыре, пять или более кодирующих последовательностей. Экспрессируемые кодирующие последовательности могут быть любыми из тех, что указываются здесь. В предпочтительном случае конструкция имеет два химерных промотора, каждый функционально связан с кодирующей последовательностью. В частности, два промотора могут быть транскрибированы на расстоянии друг от друга. В частности, конструкции с двумя промоторами могут экспрессировать субъединицы А и BADP-рибозилирующего бактериального токсина, включая любые из тех, что указаны здесь, и предпочтительно, субъединицы LT-A и -В. В случаях, когда конструкция имеет множественные химерные промоторы, каждый может содержать или быть функционально связанным с любой из последовательностей, указанных здесь. В особенном предпочтительном случае гетерологичным интроном одного или более промоторов может быть последовательность интрона A гена инсулина крысы. Один или более химерных промоторов могут, предпочтительно, также содержать 5'-UTR пре-S2 HSV-2gB. Один или более промоторов могут содержать последовательность полиаденилирования гена бета-глобина крысы. В предпочтительном случае конструкция нуклеиновой кислоты, согласно изобретению, может содержать две химерные промоторные последовательности, причем каждая промоторная последовательность функционально связана с сайтом для клонирования, в который вставлена кодирующая последовательность, где каждый промотор содержит:(a) последовательность предраннего промотора hCMV;(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV;(c) гетерологичный интрон, вставленный в район интрона A основного предраннего гена hCMV,с кодирующей последовательностью, функционально связанной с одним химерным промотором, кодирующей субъединицу LT-A, и кодирующей последовательностью, связанной с другим химерным промо- 17010056 тором, кодирующей субъединицу LT-B. Конструкция поэтому может экспрессировать обе субъединицы. Предпочтительно, если гетерологичный интрон каждого промотора является последовательностью интрона A гена инсулина крысы; последовательность, кодирующая каждую субъединицу LT функционально связана с 5'-UTR пре-S2HBV; и/или каждая кодирующая LT последовательность функционально связана с последовательностью полиаденилирования гена бета-глобина крысы. Полинуклеотидная конструкция согласно изобретению может быть в основном свободна от клеток или ассоциирована с клетками или клеточным материалом. Она может быть в значительной степени в изолированном виде или в очищенной форме, в этом случае она, как правило, составляет по меньшей мере 90, например, 95, 98 или 99% полинуклеотида или сухой массы в препарате. Данные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть доставлены в подходящие хозяйские клетки для экспрессии полинуклеотида в функциональной связи с промотором. Предпочтительно, чтобы хозяйские клетки были клетками млекопитающих, в особенности клетками человека. Методы, пригодные для доставки нуклеиновых кислот к таким клеткам, известны в данной области и включают, например, опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, электропорацию и прямую микроинъекцию в ядра. Как описано выше, последовательность, кодирующая нуклеиновую кислоту в конструкции, может кодировать терапевтически значимый полипептид. В связи с этим настоящие конструкции могут быть использованы для иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии с применением стандартных протоколов доставки генов. Подходящие способы для доставки генов известны в этой области, как описано ниже. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть доставлены или непосредственно субъекту,или, как альтернатива, доставлены ех vivo в клетки, полученные у субъекта, после чего клетки реимплантируются субъекту. Для применения в иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии конструкции нуклеиновых кислот могут быть разработаны в качестве стандартных фармацевтических препаратов. Это может быть осуществлено с применением стандартных химических технологий и методик получения фармацевтических композиций, которые доступны специалистам в данной области. Например, композиции, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот (например, представленные в подходящей векторной форме, такой как ДНК-плазмиды), могут комбинироваться с одной или более фармацевтически пригодными наполнителями или переносчиками с получением жидкого препарата. Вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т.п., могут быть представлены в наполнителе или переносчике. Эти наполнители, переносчики и вспомогательные вещества являются, как правило, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены без неспецифической токсичности и которые, что касается вакцинных композиций, не вызывают иммунный ответ у индивида, получающего композицию. Фармацевтически пригодные наполнители включают, но не ограничивают, жидкости, такие как вода, солевой раствор, полиэтиленгликоль,гиалуроновая кислота, глицерол и этанол. Фармацевтически пригодные соли могут также включать в себя, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д. Также предпочтительно, хотя и не обязательно, чтобы препарат содержал фармацевтически подходящий наполнитель,который служит в качестве стабилизатора, в частности, для пептида, белка или других молекул, если они подлежат включению в композицию. Примеры подходящих переносчиков, которые также действуют как стабилизаторы для пептидов, включают в себя, без ограничения, фармацевтические марки декстрозы,сахарозы, лактозы, трегалозы, маннитола, сорбитола, инозитола, декстрана и т.д. Другие подходящие носители включают в себя, также без ограничения, крахмал, целлюлозу, фосфаты натрия или кальция,лимонную кислоту, винную кислоту, глицин, высокомолекулярные полиэтиленгликоли (PEG) и их комбинации. Подробное описание фармацевтически пригодных наполнителей, переносчиков и вспомогательных веществ можно найти в Remington's pharmaceutical sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991), включенном в настоящее описание путем ссылки. Определенные агенты, облегчающие поглощение и/или экспрессию нуклеиновых кислот (агенты,облегчающие трансфекцию), могут также быть включены в композиции, например такие облегчающие трансфекцию агенты, как бупивакаин, кардиотоксин и сахароза, и облегчающие трансфекцию агенты,такие как липосомные или липидные препараты, которые обычно используются для доставки молекул нуклеиновых кислот. Анионные и нейтральные липосомы представляют собой широкодоступные и хорошо известные средства для доставки молекул нуклеиновых кислот (см., например, Liposomes:A Practical Approach, (1990), RPC New Ed., IRL Press). Катионные липидные препараты также представляют собой хорошо известные переносчики для применения в доставке молекул нуклеиновых кислот. Подходящие липидные препараты включают в себяDOTMA (N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид), доступный под торговой маркой Lipofectin, иNatl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081; Patent US5283185 и 5527928 и International Publication WO 90/11092, WO 91/15501 и WO 95/26356. Эти катионные липиды могут предпочтительно использоваться в соединении с нейтральным липидом, например DOPE (диолеилфосфатидилэтаноламин). Дополнительно, композиции посредников трансфекции, к которым могут быть добавлены вышеуказанные липидные или липосомные препараты, включают в себя дериваты спермина (см., например,International Publication WO 93/18759) и мембрано-пермеабилизующие соединения, такие как GALA, грамицидин S и катионные желчные соли (см., например, International Publication WO 93/19768). В качестве альтернативы, молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть инкапсулированы, адсорбированы или связаны с носителем в виде частиц. Подходящие твердые носители включают в себя носители, полученные из полимеров полиметилметакрилата, так как микрочастицыPLG получены из поли(лактидов) и поли(лактид-когликолидов). См., например, Jeffery et al. (1993),Pharm. Res 10: 362-368. Другие твердые системы и полимеры могут также применяться, например полимеры, такие как полилизин, полиаргинин, полиорнитин, спермин, спермидин, также как и конъюгаты этих молекул. Как только композиции составлены, они могут быть доставлены субъекту in vivo с применением множества известных путей и методик. Например, жидкие препараты могут быть предоставлены в качестве раствора для инъекций, суспензии или эмульсии и вводиться посредством парентеральных, подкожных, внутрикожных, внутримышечных, внутривенных инъекций с применением стандартных игл и шприцев или с применением систем для безыгольного впрыскивания жидкостей. Жидкие препараты могут также применяться местно на кожу или слизистую оболочку или предоставляться в качестве высокодисперсного спрея, подходящего для дыхательного или легочного введения. Другие методы введения включают в себя пероральный прием, суппозитории и активные или пассивные методы трансдермальной доставки. В качестве альтернативы, композиции можно вводить ex vivo, например, известны доставка и реимплантация измененных клеток субъекту (например, трансфекция, опосредованная декстраном, преципитация фосфатом кальция, электропорация и прямые микроинъекции в ядро). Композиции вводят субъекту в количестве, которое совместимо с определением дозы и которое будет эффективно для профилактики и терапии. Адекватное эффективное количество будет попадать в относительно широкий диапазон, но может быть легко определено специалистами в данной области при помощи рутинных исследований. Physicians Desk Reference и Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics являются полезными для определения необходимого количества. Например,в большинстве случаев ожидается, что эффективная доза полинуклеотида будет попадать в диапазон примерно от 0,001 до 1000 мкг, более предпочтительно от 0,01 до 10,0 мкг. Например, конструкция нуклеиновых кислот согласно изобретению может применяться в связи с другой конструкцией нуклеиновых кислот. В одном случае конструкция нуклеиновых кислот может быть одной из конструкций, описанных здесь для экспрессии адъюванта, и другая конструкция может представлять собой конструкцию, кодирующую один или более антигенов. В предпочтительной ситуации обе конструкции могут использовать химерный промотор изобретения. В ситуации, когда одна конструкция экспрессирует адъювант, а другая - антиген или антигены, антигены могут, в частности, быть из HSV или вируса гепатита (особенно вируса гепатита В). Антигены могут, в частности, представлять собой антигены HSV ICP0, ICP4, ICP22 и ICP27, предпочтительно все четыре. В случаях, когда экспрессируются такие антигены, адъювантные конструкции будут экспрессировать, в частности, LTA и/или LTB и, в особенности, оба. Две конструкции могут вводиться раздельно, одновременно или последовательно. Две конструкции могут быть введены в одной и той же или различных композициях. В частности, когда одна конструкция обладает адъювантным эффектом, обе будут доставляться таким образом, что будет проявляться адъювантный эффект, так что вызванный иммунный ответ будет сильнее и/или на более длительный период,чем если бы адъювант не вводился антигеном. В предпочтительном примере две конструкции могут быть доставлены в одной и той же композиции, предпочтительно на одних и тех же частицах носителя. В предпочтительном варианте осуществления конструкции нуклеиновых кислот согласно изобретению доставляются к клеткам-мишеням с использованием опосредованных частицами методов доставки. Опосредованные частицами способы доставки препаратов нуклеиновых кислот известны в этой области техники. Частицы для опосредованной частицами доставки могут быть сформированы путем нанесения представленных молекул нуклеиновых кислот на частицы носителя (например, ядерных переносчиков) с применением множества методов, известных в этой области техники. Частицы носителя выбираются из материалов, которые имеют подходящую плотность в диапазоне размеров частиц, обычно используемых для внутриклеточной доставки из устройства доставки, опосредованной частицами. Как правило, частицы носителя имеют диаметр от 0,1 до 5 мкм, например от 0,5 до 3 мкм, предпочтительно от 1 до 2 мкм.- 19010056 Оптимальный размер частиц носителя будет, конечно, зависеть от диаметра клеток-мишеней. В качестве альтернативы, частицы коллоидного золота могут применяться там, где покрытое коллоидное золото вводится (например, инъецируется) в ткани (например, кожу или мышцу) и впоследствии захватывается иммунокомпетентными клетками. Обычно частицы носителя выбираются из инертных металлов. Металлы являются инертными в том случае, когда они физиологически не активны. Для целей изобретения могут применяться вольфрамовые,золотые, платиновые и иридиевые частицы носителя. Предпочтение отдается вольфрамовым и золотым частицам. Легко доступны вольфрамовые частицы диаметром в среднем от 0,5 до 2,0 мкм. Хотя такие частицы имеют оптимальную плотность для применения в способах доставки, ускоренной частицами, и обеспечивают высоко эффективное покрытие ДНК, вольфрам потенциально может быть токсичным для различных типов клеток. Частицы золота или микрокристаллическое золото (например, порошок золота А 1570, имеющийся в наличии в Engelhard Corp., East Newark, NJ) также находят применение в представленных способах. Частицы золота обеспечивают однородность в размере (имеющиеся в Alpha Chemicals частицы 1-3 мкм в размере или имеющиеся в Degussa, South Plainfield, NJ в диапазоне размеров частиц,включающем 0,95 мкм) и сниженную токсичность. Микрокристаллическое золото обеспечивает различное распределение размеров частиц, обычно в диапазоне 0,1-5 мкм. Однако неправильная поверхность микрокристаллического золота обеспечивает высоко эффективное покрытие нуклеиновыми кислотами. Известно и описано множество способов покрытия или преципитации ДНК, или РНК на золотые или вольфрамовые частицы. Большинство таких способов в основном комбинируются с заранее определенным количеством золота или вольфрама с ДНК плазмиды, CaCl2 и спермидином. Конечный раствор постоянно встряхивается, пока проведение процедуры покрытия не обеспечит однородности реакционной смеси. После преципитации нуклеиновых кислот покрытые частицы могут быть перенесены на подходящие мембраны и высушены перед применением, нанесены на поверхность модуля или кассеты для образцов или помещены в кассету для доставки для применения, в частности в приборах опосредованной частицами доставки. В качестве альтернативы, полинуклеотиды изобретения могут быть составлены как дисперсная композиция. Соединение может быть выполнено с использованием вышеуказанных стандартных фармацевтических химических технологий. Например, полинуклеотиды могут быть скомбинированы с одним или более фармацевтически пригодным наполнителем или переносчиком для того, чтобы предоставить подходящую композицию. Разработанные композиции затем приготавливаются в виде частиц с применением стандартных методов, таких как простое выпаривание (высушивание на воздухе), вакуумное высушивание, высушивание из распыленного состояния, высушивание из замороженного состояния (лиофилизация), высушивание из распыленного замороженного состояния, напыление, преципитация, сверхкритическое флюидное формирование частиц и т.п. При необходимости конечные частицы могут быть уплотнены с применением методов, описанных в International Publication WO 97/48485, которая находится в открытом доступе и включена в настоящее изобретение путем ссылки. Эти способы могут использоваться для получения частиц нуклеиновых кислот, имеющих размер в диапазоне примерно от 0,01 до примерно 250 мкм, предпочтительно примерно от 10 до 150 мкм и наиболее предпочтительно примерно от 20 до 60 мкм, плотность частицы в диапазоне примерно от 0,1 до примерно 25 г/см 3 и удельный вес примерно от 0,5 до примерно 3,0 г/см 3 или более. Сразу после образования частицы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, могут быть упакованы в одиночное приспособление или контейнеры на много доз. Такие контейнеры могут содержать герметично запечатанный контейнер, заключающий в себе подходящее количество частиц. Частицы могут быть упакованы в виде стерильного состава, и герметично запечатанный контейнер может быть сконструирован таким образом, чтобы сохранить стерильность состава до его использования для доставки субъекту. Контейнеры предпочтительно приспособлены для непосредственного применения в устройстве для опосредованной частицами доставки субъекту. Обычно такие контейнеры имеют форму капсул, ячеек из фольги, пакетов-саше, кассет и т.д. Устройства для доставки частиц могут быть также предоставлены в заряженном виде и содержать подходящую дозу частиц. Затем заряженное устройство может быть также упаковано в герметично запечатанный контейнер. Контейнер, в которой упакованы частицы, может в дальнейшем быть маркирован для того, чтобы обозначить композицию и предоставить информацию о подходящих дозировках. К тому же, контейнер может быть маркирован пометкой в форме, предписанной правительственной организацией, например Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, в которой пометка указывает на разрешение организацией, в соответствии с Федеральным законом о производстве, применении или продаже препарата нуклеиновых кислот, содержащегося в нем, для введения человеку. Устройства для придания скорости частицам, подходящие для опосредованной частицами доставки,известны в этой области техники. Например, существующие устройства типа генного пистолета используют взрывной, электрический или газовый разряд для того, чтобы выстрелить покрытыми частицами носителя по направлению к клеткам-мишеням. Покрытые частицы носителя могут быть обратимо прикреплены к подвижному слою носителя или подвижно фиксированы к поверхности, вдоль которой проходит струя газа, отрывая частицы от поверхности и ускоряя их движение по направлению к цели. При- 20010056 мер устройства на основе газового разряда описан в патенте США 5204253. Устройство взрывного типа описано в патенте США 4945050. Один пример аппарата с электрическим разрядом, подходящего для применения здесь, описан в патенте США 5120655. Другой аппарат с электрическим разрядом описан в патенте США 5149655. Сущность всех этих патентов включена в настоящее изобретение в качестве ссылки во всей их полноте. Частицы могут также быть введены с применением устройства для безыгольных инъекций, такого как устройства, описанные в патенте США 5630796 Bellhouse et al. ("the PowderJect needleless syringedevice") и в International Publication WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 и WO 96/20022, все из которых включены в настоящее изобретение в качестве ссылки. Устройства, такие как устройство, описанное в патенте США 5630796, могут быть представлены как инструмент, имеющий форму ручки, содержащий, в порядке расположения сверху вниз, цилиндр с газом, кассету или пакетик с частицами и ультразвуковой наконечник со связанным с ним глушителем. Частицы заключены в подходящий контейнер, например кассету, формируемую двумя разрываемыми полимерными мембранами, которые припаяны к прокладке, имеющей форму шайбы, с образованием самостоятельной изолированной единицы. Материалы мембраны могут быть выбраны с целью достижения определенного принципа открытия и давления разрыва, которые диктуют условия возникновения ультразвукового потока. На практике устройство приводится в действие путем высвобождения сжатого газа из цилиндра в камеру расширения устройства. Освобожденный газ контактирует с кассетой для частиц и, когда создается достаточное давление, резко разрывает мембраны кассеты, увлекая частицы в ультразвуковой наконечник для последующей доставки. Наконечник сделан так, чтобы достигнуть определенной скорости и характера движения потока газа для доставки дозы частиц к намеченной поверхности предварительно определенной области. Глушитель применяется для того, чтобы ослабить шум, производимый ультразвуковым током газа. Система доставки, описанная в International Publication WO 96/20022, также использует энергию сжатого газа, чтобы ускорить и доставить порошкообразные композиции. Однако она отличается от системы в патенте США 5630796 применением ударной волны вместо потока газа для ускорения частиц. Более детально, мгновенный подъем давления, обеспеченный ударной волной, генерируемой позади гибкого поршня, давит на поршень, вызывая резкое выталкивание поршня в направлении цели. Катапультирование порошкообразной композиции (которая располагается снаружи от поршня) происходит с достаточной скоростью, создавая таким образом импульс для проникновения в ткань, например в ткань слизистой оболочки ротовой полости. Порошкообразная композиция высвобождается в момент полного выдвижения поршня. Поршень также служит для того, чтобы удержать поток газа с высоким давлением,который таким образом не приходит в контакт с тканью. Так как газ не освобождается в процедуре доставки, система является по определению бесшумной. Эта конструкция может применяться в любых прилагаемых или любых чувствительных применениях, например, для доставки частиц при миниинвазивном хирургическом вмешательстве. Частицы могут быть доставлены in vivo непосредственно субъекту или ex vivo в клетки, взятые от субъекта, с последующей реимплантацией измененных клеток субъекту. При доставке in vivo инъекция частиц обычно подкожная, эпидермальная, внутрикожная, внутрислизистая (например, назально, ректально и/или вагинально), внутрибрюшинная, внутривенная, пероральная или внутримышечная. Предпочтительно, чтобы доставка осуществлялась к высокодифференцированным клеткам; однако частицы могут также быть доставлены к недифференцированным клеткам или частично дифференцированным клеткам, таким как стволовые клетки крови и фибробласты кожи. Более предпочтительно, чтобы доставка осуществлялась к эпидермальным клеткам кожи. Частицы вводятся субъекту способом, сочетающимся с формой дозирования и в количестве, которое будет профилактически и и/или терапевтически эффективно. Терапевтически эффективное количество настоящих дисперсных композиций будет являться необходимым для того, чтобы осуществлять лечение или предотвращение заболевания или симптомов состояния, и будет попадать в относительно широкий диапазон, который может быть определен рутинными способами. Как правило, частицы доставляются в количестве от 0,001 до 1000 мкг, более предпочтительно от 0,01 до 10,0 мкг нуклеиновых кислот в дозе. Однако точное количество обязательно будет изменяться в зависимости от возраста и общего состояния индивида, подлежащего лечению, и отдельной выбранной последовательности нуклеотида, так же, как и от других факторов. Подходящее необходимое количество может быть легко определено путем клинических испытаний. Physicians Desk Reference и Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics являются полезными для определения необходимого количества. Тесты Сравнительный экспрессирующий анализ Подходящий тест на возможность использования элемента определяет эффект, который элемент оказывает на экспрессию полипептида. Основой для сравнения по тестируемой пригодности элемента служит исходный вектор, обычно (если не указано иначе) плазмида с промотором hCMV, экзоном 1- 21010056 кролика, расположенные так, чтобы осуществлять экспрессию кодирующей последовательности. Обычно исходным вектором является pJV7384, pJV7401, pJV7450 или pJV7533. Гетерологичные интроны и 3'-UTR участки добавляются или промоторные последовательности, экзоны, 5'-UTR участки и поли-А сайты заменяют элементы исходных векторов с образованием векторов для тестирования экспрессии. Таким образом могут проверяться функциональные варианты или фрагменты. Исходные векторы и тестируемые векторы трансформируются в подходящие хозяйские клетки, и клетки анализируются по уровням экспрессии полипептида. Предпочтительно используются клетки млекопитающих. Пригодные клетки включают клетки HEK293 Т, CHO, HeLa, BHK, 3 Т 3 или COS. В типичном случае функциональный элемент вызывает экспрессию, сравнимую с таковой для исходного вектора, например по меньшей мере такую же или выше. Экспрессия предпочтительно тестируется на более чем одном типе клеток и с более чем одной кодирующей последовательностью. Подходящие экспериментальные протоколы предоставлены, например, в примерах 1-13, описанных ниже. Сравнительный тест на иммуногенность Если полипептид, который должен быть экспрессирован, является антигеном, следующий анализ может быть выполнен для идентификации функциональных или особенно предпочтительных элементов конструкции. В этом анализе определяется влияние элемента на иммунный ответ после доставки экспрессирующего вектора в тестовый организм. Определение уровней антител против антигена - это простейший путь оценить иммунный ответ. Группы мышей вакцинируются исходными векторами или тестовыми векторами, сконструированными, как описано выше. Сыворотки собираются после соответствующего периода времени и анализируются по уровню антител. Этот эксперимент проводится дважды, и уровни антител от всех групп в двух экспериментах наносятся на график. Функциональные элементы вызовут, по меньшей мере, такие же или большие титры антител против отдельного антигена в обоих экспериментах, чем исходные векторы. Предпочтительно получить результат более чем с одним антигеном для того, чтобы продемонстрировать возможность широкого использования элемента (элементов) в этой экспрессирующей панели. Подходящие экспериментальные протоколы предоставлены, например, в примере 14, описанном ниже. Экспериментальная часть. Ниже приведены примеры специфических воплощений для осуществления согласно изобретению. Примеры предлагаются исключительно в иллюстративных целях и не призваны ограничить каким-либо образом пределы использования данного изобретения. Были приложены усилия обеспечить достоверность в отношении используемых численных значений (например, количеств, значений температуры и т.д.), но некоторые экспериментальные погрешности и отклонения, конечно, допустимы. Способы. Стандартные условия ПЦР. Стандартные условия ПЦР, использованные при конструировании векторов были следующими: однократный основной буфер с 1,5 мМ MgCl2 (Promega Corporation, Madison, WI); 0,4 мкМ каждого праймера; 200 мкМ каждого dNTP (USB, Inc, Cleveland, OH); 2,5 ед. Taq полимеразы (Promega Corporation, Madison, WI); 1,0 нг ДНК-матрицы; вода до 100 мкл и наслоенное минеральное масло (Aldrich Chemical, Inc, Milwaukee, WI). Термоблок РТС-200 (MJ Research, Inc, Waltham, MA) был настроен на выполнение следующей программы: 4 мин при 95 С, 30 циклов (1 мин при 95 С/1 мин 15 с при 55 С/1 мин при 72C), 10 мин при 72C, закончить при 4 С. Перед обработкой ферментами рестрикции (New England Biolabs, Beverly, MA) продукты амплификации выделялись из ПЦР-реакционной смеси с использованием набора для очисткиQIAquickaPCR (Qiagen Inc, Valencia, CA). Для гарантии точности амплификации для всех продуктов ПЦР после клонирования были определены последовательности. Пример 1. Конструирование панелей векторов поверхностного антигена вируса гепатита B(HBsAg). Ряд плазмидных экспрессирующих векторов был сконструирован для экспрессии HBsAg. Исходные материалы.(i) pWRG7128 (Roy, M., et al. Vaccine (2001), 19: 764-778), который содержит последовательность предраннего промотора hCMV, первый экзон, первый интрон и частично второй экзон основного предраннего гена hCMV, последовательность, кодирующую HBsAg, с фланкирующими районами (последовательностью, производной от 5'-UTR пре-S2 HBV, и 3' посттранскрипционным респонсивным элементом) и область полиаденилирования гормона роста быка (BGHpA).(ii) pJV7284, производный от pWRG7128, в котором область полиаденилирования бета-глобинаpWRG7128 был размножен в ПЦР с праймерами JF93 (SEQ ID NO: 15) и F110 (SEQ ID NO: 16) с использованием стандартных условий и разрезан Sal1 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержащего CMV промотор, экзон 1 и частично последовательность экзона 2. рАМ 6 (ATCC, Mannassas, VA) был разрезан BamH1 и BstX1 для выделения фрагмента вставки, который содержал 5'-UTR HBsAg и приблизительно 70% кодирующего района HBsAg.pJV7284 был разрезан Sal1 и BstX1 для получения фрагмента вектора, с которым были лигированы два фрагмента вставок, давая в результате pJV7293.pWRG7128 был размножен в ПЦР с праймерами GW1 (SEQ ID NO: 17) и JF254 (SEQ ID NO: 18) и разрезан BstX1 и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, который содержал 3'-конец кодирующей области HBsAg.pJV7293 был разрезан BstX1 и Bgl2 с образованием фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки, давая в результате pJV7384.pJV7293 был разрезан Xho1 и Xba1 для получения фрагмента вставки, содержащего CMV промотор/экзоны и 5'-UTR с 5'-концом кодирующей последовательности HBsAg.pWRG7128 был разрезан Xba1 и Bcl1 для получения фрагмента вставки, содержавшего большую часть кодирующей последовательности HBsAg и 3'-UTR.pJV7284 был разрезан Xho1 и Bgl2 для получения фрагмента вектора, с которым были лигированы два фрагмента вставок, давая в результате pJV7382.(c) pJV7389 (CMV (RIA), 3'-UTR HBsAg, 5'-UTR пре-S2 HBV и RBGpA). Интрон А инсулина крысы (RIA) был размножен в ПЦР по плазмиде p5'rlns (неизвестного происхождения) с праймерами GW150 (SEQ ID NO: 19) и JF255 (SEQ ID NO: 20). Продукт ПЦР был вырезан с помощью BamH1 и вставлен в линеаризованный по BamH1 pJV7382, что дало в результате pJV7389.pJV7384 был разрезан BstX1 и EcoR1 для получения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец кодирующей области HBsAg и RBGpA.pJV7389 был разрезан BstX1 и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки, давая в результате pJV7387. Пример 2. Конструирование панели векторов антигена D гликопротеина вируса простого герпеса(HSVgD). Ряд плазмидных экспрессирующих векторов был сконструирован для экспрессии HSVgD. Исходные материалы.HBsAg, заменена на сайт NheI, в рамке, непосредственно после стартового кодона ATG, за которым следует фрагмент-наполнитель с сайтом BamH1 непосредственно к 5' от HBVEnh.(b) pWRG7202, производный от pGem3Z (Promega) с фрагментом-наполнителем, который обеспечивает слияние кодирующей последовательности с сигнальным пептидом тканевого активатора плазминогена человека (TPA) ниже NheI сайта.(a) pJV7392 (CMV (нативный интрон), 3'-UTR HBsAg, 5'-UTR HBsAg и RBGpA. Кодирующий район для 2gD HSV был размножен в ПЦР по суммарной вирусной ДНК (AdvancedBiotech, Inc, Columbia, MD) с использованием праймеров DS1 (SEQ ID NO: 21) и DA1 (SEQ ID NO: 22) и разрезан NheI и EcoR1 для получения фрагмента вставки.pWRG7202 был разрезан NheI и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7391.pJV7391 был разрезан NheI и Bgl2 для получения фрагмента вставки, содержавшего последовательность, кодирующую 2gD HSV.pJV7334 был разрезан NheI и BamH1 для получения фрагмента вектора, в который был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7392. Этот вектор содержит следующие экспрессирующие элементы: последовательность предраннего промотора hCMV, первый экзон, первый интрон и частично второй экзон основного предраннего гена hCMV, 5'-UTR от HBsAg, кодирующую последовательность гена gD(b) pJV7399 (CMV (без интрона), 3'-UTR HBsAq, 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Вариант pJV7392, лишенный интрона, был сконструирован следующим образом.pJV7384 был разрезан Hind3 и Nde1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 5'-концы гена устойчивости к канамицину и промотора CMV.pJV7384 был разрезан Nde1 и Ssp1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец промотора CMV, экзоны 1/2 CMV и 5'-конец 5'-UTR от HBsAg. Эти фрагменты вставок были встроены вpJV7392, из которого был удален фрагмент Hind3-Ssp1 с образованием pJV7399.- 23010056 Вариант RIA вектора pJV7392 был сконструирован следующим образом.pJV7384 был разрезан Hind3 и Nde1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 5'-концы гена устойчивости к канамицину и промотора CMV.pJV7387 был разрезан Nde1 и Ssp1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец промотора CMV, экзоны 1/2 (частично) CMV, RIA и 5'-конец 5'-UTR от HBsAg. Эти фрагменты вставок были встроены в pJV7392, из которого был удален фрагмент Hind3-Ssp1 с образованием pJV7400.(d) pJV7401 (CMV (без интрона), 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Вариант pJV7399, лишенный 3'-UTR, был сконструирован следующим образом.pJV7391 был разрезан Bsp1201 и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец гена gD HSV2.pJV7284 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для выделения сигнала RBGpA. Эти фрагменты вставок были встроены в pJV7399, из которого был удален фрагмент Bsp1201-EcoR1 с образованием pJV7401.(e) pJV7402 (CMV (RIA), 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Вариант pJV7400, лишенный 3'-UTR, был сконструирован следующим образом.pJV7391 был разрезан Bsp1201 и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец гена gD HSV2.pJV7284 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для выделения сигнала RBGpA. Эти фрагменты вставок были лигированы с pJV7400, из которого был удален фрагмент Bsp1201-EcoR1 с образованием pJV7402. Пример 3. Конструирование панели векторов антигена Flu-M2.(a) pJV7450 (CMV (без интрона), 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Кодирующая область для Flu-M2 была размножена в ПЦР по плазмиде pFL-M2 (Joel Haynes, pJV) с использованием праймеров JF301 (SEQ ID NO: 23) и JF302 (SEQ ID NO: 24) и разрезана NheI и Bgl2 для получения фрагмента вставки.pJV7401 был разрезан NheI и Bgl2 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7450.(b) pJV7452 (CMV (без интрона), 3'-UTR HBsAg, 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Фрагмент 3'-UTR был размножен в ПЦР по матрице pJV7389 с праймерами JF84 (SEQ ID NO: 25) иJF225 (SEQ ID NO: 26), разрезан Bsp1201, достроен Т 4 ДНК-полимеразой и объединен с Bgl2 линкерными последовательностями (кат.1036, New England Biolabs). Фрагмент был затем разрезанBgl2 и EcoR1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-UTR от HBsAg и район RBGpA.pJV7450 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7452.(c) pJV7458 (CMV (RIA), 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Вариант pJV7450, содержавший RIA, был сконструирован следующим образом.pJV7389 был разрезан BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержащего RIA.pJV7450 был разрезан BamH1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7458.(d) pJV7468 (CMV (RIA), 3'-UTR HBsAg, 5'-UTR HBsAg и RBGpA). Вариант pJV7458, содержавший 3'-UTR HBsAg, был сконструирован следующим образом.pJV7452 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для получения фрагмента вставки, содержавшего 3'-UTRpJV7458 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7468. Пример 4. Конструирование панелей векторов Beta-gal.(SEQ ID NO: 28) и разрезан NheI и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, кодирующего бетагалактозидазу.pJV7452 был разрезан NheI и Bgl2 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7488.pJV7450 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего RBGpA.pJV7488 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7533.pJV7530 (см. пример 5) был разрезан Xho1 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего участок от промотора CMV до RIA.pJV7488 был разрезан Xho1 и BamH1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7551.pJV7530 был разрезан Xho1 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего CMV промотор через RIA.pJV7533 был разрезан Xho1 и BamH1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7552. Пример 5. Конструирование экспрессирующих векторов pJV (pJV7563).pJV7389 был размножен в ПЦР с праймерами JF357 (SEQ ID NO: 29) и JF365 (SEQ ID NO: 30), обработан Т 4 ДНК-полимеразой для того, чтобы затупить концы, и разрезан Sal1 для выделения фрагмента вставки, кодирующего устойчивость к канамицину.pJV7389 был разрезан Ava1, обработан Т 4 ДНК-полимеразой для затупления концов и разрезан Sal1 для выделения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7496.pJV7389 был размножен в ПЦР с праймерами JF393 (SEQ ID NO: 31) и JF406 (SEQ ID NO: 32) и разрезан Bgl2 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего RIA, лишенного внутреннего сайта NheI.pJV7496 был разрезан BamH1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7530.pJV7468 был разрезан BamH1 и EcoR5 для выделения фрагмента вставки, содержавшего М 2 и часть 3'ENH HBV.pJV7530 был разрезан BamH1 и EcoR5 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7549.(d) pJV7563. Праймеры JF256 (SEQ ID NO: 33) и JF 257 (SEQ ID NO: 34) были подвергнуты отжигу для того,чтобы приготовить фрагмент вставки, содержащий множественный сайт для клонирования.pJV7549 был разрезан NheI и Bgl2 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7563. Карта плазмиды pJV7563 показана на фиг. 12. Состав оснований плазмиды pJV7563 показан на фиг. 13. Компоненты и их положение в плазмиде pJV7563 таковы: 1-44 - последовательности транспозона 903; 45-860 - кодирующая последовательность для устойчивости к канамицину от транспозона 903; 861-896 - последовательности транспозона 903; 897-902 - сайт Sal1; 903-1587 - промотор CMV; 1588-1718 - нетранслируемая лидерная последовательность предраннего гена CMV; 1719-1724 - слияние рестрикционных ферментов BamH1 и BgIII; 1725-1857 - интрон А инсулина крысы; 1858-1863 - сайт BamH1; 1864-1984 - 5'-нетранслируемый лидер поверхностного антигена HBV; 1985-1993 - синтетический стартовый кодон/сайт NheI для клонирования; 1994-2011 - синтетические сайты для клонирования; 2012-2544 - энхансер HBV; 2545-2555 - бывшая последовательность вектора. Не содержит совпадений с базами данных NCBI; 2556-2686 - участок полиаденилирования бета-глобина кролика; 2687-3759 - последовательность вектора pUC19. Пример 6. Конструирование набора векторов, экспрессирующих сигнальные пептиды, с использованием в качестве модельных антигенов секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP) человека и(SEQ ID NO: 36), затем разрезан с помощью NheI и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, содержащей фрагмент SEAP человека.pJV7079 (Macklin, et al.) был разрезан NheI и Bgl2 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7507.(ii) pJV7508 (hTPAsp и hFc). ДНК человека была размножена в ПЦР с праймерами JF386 (SEQ ID NO: 37) и FcAS(SEQ ID NO: 38), затем разрезана NheI и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, содержащегоpJV7079 был разрезан NheI и Bgl2 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7508.(iii) Приготовление последовательности, кодирующей сигнальный пептид апротинина. Синтетический олигонуклеотид JF354 (SEQ ID NO: 39) был размножен в ПЦР с праймерами JF355(SEQ ID NO: 40) и JF356 (SEQ ID NO: 41) для получения последовательности, кодирующей сигнальный пептид апротинина.(iv) Приготовление последовательности, кодирующей сигнальный пептид экстенсина табака.(SEQ ID NO: 43) и JF350 (SEQ ID NO: 44) для получения кодирующей последовательности для сигнального пептида экстенсина табака.(v) Приготовление последовательности, кодирующей сигнальный пептид лизоцима кур. Синтетический олигонуклеотид JF351 (SEQ ID NO: 45) был размножен в ПЦР с праймерами JF352(SEQ ID NO: 46) и JF353 (SEQ ID NO: 47) для получения кодирующей последовательности для сигнального пептида лизоцима кур.(a) Панели сигнального пептида антигена Flu М 2:pJV7499 (CMV (без интрона), 5'-UTR HBsAg, RBGpA, с.п. апротинина),pJV74 97 (CMV (без интрона), 5'-UTR HBsAg, RBGpA, с.п. экстенсина табака),pJV7500 (CMV (без интрона), 5'-UTR HBsAg, RBGpA, с.п. лизоцима кур). Кодирующие последовательности для сигнальных пептидов были разрезаны Spe1 и NheI для выделения фрагментов вставок.pJV7450 был разрезан NheI для приготовления фрагмента вектора, с которым были лигированы фрагменты вставок с образованием pJV7499 (апротинин), pJV7497 (экстенсин табака) и pJV7500 (лизоцим кур).(b) Панели сигнального пептида SEAP:pJV7499, 7497 и 7500 были разрезаны Xho1 и NheI для выделения фрагментов вставок, включавших в себя участки плазмид от промотора CMV до кодирующей последовательности сигнального пептида.pJV7507 был разрезан Xho1 и NheI для приготовления фрагмента вектора, с которым были лигированы фрагменты вставок с образованием pJV7513 (апротинин), pJV7512 (экстенсин табака) и pJV7510(c) Панели сигнального пептида hFc:pJV7499, 7497 и 7500 были разрезаны Xho1 и NheI для выделения фрагментов вставок, включавших в себя участки плазмид от промотора CMV до кодирующей последовательности сигнального пептида.pJV7508 был разрезан Xho1 и NheI для приготовления фрагмента вектора, с которым были лигированы фрагменты вставок с образованием pJV7524 (апротинин), pJV7525 (экстенсин табака) и pJV7526(лизоцим кур). Пример 7. Конструирование панелей секретируемой щелочной фосфатазы человека (SEAP).pJV7510 был разрезан Sal1 и Bgl2 для выделения фрагмента вставки, включавшей в себя участок от промотора CMV до сигнального пептида лизоцима.pJV7450 был разрезан Sal1 и Bgl2 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7531.pJV7530 был разрезан Xho1 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, включавшей в себя участок от промотора CMV до RIA.pJV7531 был разрезан Xho1 и BamH1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7554.pJV7563 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей 3'-UTR HBV иpJV7531 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7568.pJV7563 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей 3'-UTR HBV иpJV7554 был разрезан Bgl2 и EcoR1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7572. Пример 8. Конструирование векторов Beta-gal и HBsAg с использованием интронов кератина кур и сердечного актина кур.(a) pJV7557 (Beta-ga1, CMV (интрон актина кур), 3'-UTR HBsAg, 5'-UTR HBsAg и RBGpA). ДНК кур была размножена в ПЦР с праймерами JF430 (SEQ ID NO: 48) и JF442 (SEQ ID NO: 49) и разрезана Bgl2 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей последовательности интрона и фланкирующего экзона сердечного актина кур.pJV7488 был разрезан BamH1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован(b) pJV7558 (Beta-gal, CMV (интрон кератина кур), 3'-UTR HBsAg, 5'-UTR HBsAg и RBGpA). ДНК кур была размножена в ПЦР с праймерами JF421 (SEQ ID NO: 50) и JF444 (SEQ ID NO: 51) и разрезана Bgl2 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей последовательности интрона и фланкирующего экзона гена кератина кур.pJV7488 был разрезан BamH1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7558.pJV7557 был разрезан Sal1 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей промоторpJV7496 был разрезан Sal1 и BamH1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7558.pJV7558 был разрезан Sal1 и BamH1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей промоторpJV7496 был разрезан Sal1 и BamH1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием pJV7579. Пример 9. Анализ In-Vitro экспрессии антигена панелью векторов HBsAg. В первый день клетки линий SCC15 (ATCC) или B16 (происхождение неизвестно, варианты имеются в ATCC) рассаживали в 6-луночные культуральные планшеты с плотностью 20-40% конфлуэнтности и подращивали в течение ночи в инкубаторе. Хозяйские клетки размножали в средах, рекомендованных ATCC. На второй день проводили реакцию трансфекции. Для каждого вектора, подлежащего тестированию, 20 мкл реагента Lipofectin (Life Technologies Inc, Grand Island, NY) добавляли к 130 мкл средыOptimem (Life Technologies Inc, Grand Island, NY) и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Для каждого тестируемого вектора 2 мкг вектора смешивали с 200 мкл Optimem на 40-й мин. На 45-й мин инкубации растворы вектора и Lipofectin смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 10 мин. Во время этой окончательной инкубации клетки-хозяева извлекали из инкубатора и дважды промывали средой Optimem. По прошествии 10 мин 1,6 мл Optimem добавляли к смеси Lipofectamine и вектора и 1 мл получившейся смеси добавляли к каждой из двух лунок с клетками. Хозяйские клетки возвращали в инкубатор и не тревожили в течение 5 ч, после чего смесьLipofectamine/вектор удаляли и заменяли стандартной средой для поддержания клеток. Через 18-24 ч после смены среды из культуральных планшетов отбирали 50-100 мкл среды для поддержания клеток и анализировали ее на экспрессию антигена путем помещения образцов в реакционные флаконы, содержащие AUSZYME. Моноклональный диагностический набор (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Объем тестируемых образцов был доведен до 200 мкл буфером PBS, затем в каждый образец были добавлены 50 мкл конъюгата и реакционных гранул. Флакон инкубировали в течение 80 мин при 40C,после чего стенки были отмыты от всех жидких реакционных компонентов. Гранулы переносили в новые пробирки, после чего добавляли 300 мкл буфера для развития цветной реакции. Через 30 мин цветную реакцию останавливали добавлением 1 M серной кислоты и измеряли оптическое поглощение реакционной смеси при длине волны 490 нм. Данные, представленные на фиг. 1, - это среднее значение показаний поглощения для двух лунок из двух экспериментов. Как показано на фиг. 1, добавление RIA, 3'-UTR HBV или обоих элементов к исходному векторуSCC15. Как показано на фиг. 2, добавление интрона или кератина кур или сердечного актина кур к исходному вектору (промотор CMV, экзон, 3'-UTR HBV и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию HBsAg в клетках SCC15. Пример 10. Анализ In-Vitro экспрессии антигена панелью векторов Beta-gal. Хозяйские клетки SSC15 и B16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Через 18-40 ч после смены среды супернатанты среды удаляли и клетки промывали PBS. После удаления промывающего раствора клетки лизировали инкубацией в 500 мкл буфера для лизиса (50 мМNaPO4, 0,1% Triton Х-100, рН 7) в течение 5 мин, затем физически соскабливали клетки с пластиковой чашки. Лизаты центрифугировали в течение 2 мин для удаления остатков клеток и по 10-25 мкл осветленного лизата добавляли к 500 мкл реакционного буфера (80 мкг/мл о-нитрофенилгалактопиранозид,50 мМ NaPO4, рН 7) и инкубировали при 37 С в течение 10-20 мин. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1 M Na2CO3 и снимали показания при длине волны 405 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии улучшенного (содержащего интрон, HBVenh, или оба элемента) вектора к экспрессии исходного вектора.- 27010056 Добавление RIA, 3'-UTR HBV или обоих элементов к исходному вектору (промотор CMV, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию beta-gal в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток SCC15 показаны на фиг. 3. Добавление интрона или кератина кур или сердечного актина кур к исходному вектору (промотор CMV, экзон, 3'-UTR HBV и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию beta-gal в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток B16 показаны на фиг. 2. Пример 11. Анализ In-Vitro экспрессии антигена панелью векторов HSV gD. Хозяйские клетки SCC15 или B16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Через 18 ч после трансфекции планшеты помещали на 15 мин на лед. Каждую лунку затем промывали 2 мл PBS(Biowhittaker, Walkerville, MD). Затем клетки фиксировали 0,05% глютаральдегидом (Polysciences Inc,Warrington, PA), разведенным на PBS, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Все последующие инкубации продолжались в течение 1 ч при комнатной температуре и клетки промывали между инкубациями, как указано выше. Планшеты блокировали с 2 мл 5% сухого молока (Bio-RadLaboratories, Melville, NY) на PBS. За этим следовали инкубации с 1 мл раствора моноклональных антител анти-gD (ABI, Columbia, MD) в разведении 1:1000 в 2% сухом молоке/PBS/0,05% Tween-20 (Sigma,St.Louis, MO) и 1 мл раствора козьих антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена(KPL, Gaithersburg, MD) в разведении 1:2500 на PBS/0,1% Tween-20. Цветное окрашивание развивалось с помощью 1 мМ TMB субстрата для микропланшетов (BioFX, Owings Mills, MD). Реакции останавливали 1 M H2SO4, жидкость переносили в пластиковые кюветы и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии улучшенного (содержащего интрон,HBVenh, или оба элемента) вектора к экспрессии исходного вектора. Добавление RIA, с или без, 3'-UTR HBM к исходному вектору (промотор CMV, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию HSVgD в обеих клеточных линиях. Результаты для клетокSCC15 показаны на фиг. 4. Пример 12. Анализ In-Vitro экспрессии антигена панелью векторов SEAP. Клетки SCC15 или B16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Через 18-40 ч после смены среды кондиционированные среды отбирали и прогревали при 70C в течение 30 мин. По 10-25 мкл инактивированных нагреванием супернатантов инкубировали в течение 5 мин с 1/10 объема 100 мМI-гомоаргинина. Затем к лизатам добавляли 500 мкл реакционного буфера для щелочной фосфатазы (кат.172-1063, Bio-Rad, приготовленный в соответствии с инструкциями) и инкубировали при 37C в течение 10-20 мин. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1 M NaOH и снимали показания при 405 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии улучшенного (содержащего интрон,HBVenh или оба элемента) вектора к экспрессии исходного вектора или отношения экспрессии экспериментальных сигнальных пептидов к экспрессии вектора с сигнальным пептидом TPA человека. Как показано на фиг. 5, добавление RIA, 3'-UTR HBV или обоих элементов к исходному вектору(промотор CMV, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию SEAP в клетках В 16. Неожиданно оказалось, что добавление одного только 3'-UTR HBV к исходному вектору (промоторCMV, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию SEAP в клетках SCC15. Добавление сигнальных пептидов от апротинина быка, лизоцима кур или экстенсина табака на Nконец зрелой SEAP приводило к эффективной секреции SEAP в культуральную среду в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток В 16 показаны на фиг. 6. Пример 13. Анализ In-Vitro экспрессии антигена панелью сигнального пептида Fc-фрагмента иммуноглобулина G человека. Хозяйские клетки SCC15 или В 16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Кондиционированные среды были отобраны через 18-40 ч после смены среды. Планшеты для ELISA (Costar) инкубировали в течение ночи при 4C со 100 мкл на лунку раствора козьих антител против иммуноглобулинов G человека (Sigma 13382, разведение 1/1000 в карбонатном буфере для нанесения). Все последующие инкубации продолжались в течение 1 ч при комнатной температуре с промыванием между инкубациями (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,1% Brij-35, pH 8,0). Лунки блокировались 100 мкл 5% сухого молока на PBS, затем инкубировались с серийными разведениями кондиционированных сред в буфере для разведения (2% сухое молоко, PBS, 0,05% Tween-20). После этого следовала инкубация с 100 мкл на лунку раствора козьих антител против иммуноглобулинов G человека,конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma A6029, разведение 1:5000 в буфере для разведения), и затем развивалась цветная реакция при добавлении 100 мкл TMB субстрата для микропланшетов. Реакции останавливали 100 мкл 1 M H2SO4 и считывали показания при 450 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии экспериментальных сигнальных пептидов к экспрессии вектора с сигнальным пептидом TPA человека. Добавление сигнальных пептидов от или апротинина быка, или лизоцима кур, или экстенсина табака на N-конец Fc-фрагмента человека делало возможным эффективную секрецию hFc в культуральную среду для обеих линий клеток. Результаты для клеток B16 показаны на фиг. 6.- 28010056 Пример 14. Использование плазмидных экспрессирующих векторов HBsAg, HSVgD и Flu-M2 для иммунизации мышей.a) Приготовление патронов иммунизации. Для каждой тестируемой плазмиды в микроцентрифужную пробирку взвешивали 25 мг 2-микронного золотого порошка. После добавления 250 мл порции 50 мМ спермидина (Aldrich ChemicalInc, Milwaukee, WI) пробирку встряхивали и быстро обрабатывали ультразвуком. Золото осаждали в микроцентрифуге, а спермидин заменяли на свежую 100-мкл порцию. Золото ресуспендировали встряхиванием, после чего в пробирку добавляли 25 мкг ДНК и перемешивали. При легком встряхивании добавляли 100 мкл 10% CaCl (Fujisawa USA, Inc, Deerfield, IL) для осаждения ДНК на гранулы золота. Реакция преципитации проводилась на столе в течение 10 мин, после чего золото собирали быстрым центрифугированием и три раза промывали абсолютным этанолом (Spectrum Quality Products, Inc, Gardena,CA) для удаления избытка преципитирующих реагентов. Промытый комплекс золота с ДНК затем ресуспендировался в 3,6 мл 0,05 мг/мл поливинилпирролидона (360 KD, Spectrum Quality Products, Inc,Gardena, CA) в абсолютном этаноле. Эта взвесь затем вводилась в Tefzela пробирку (McMaster-Carr, Chicago, IL), помещенную во вращатель пробирок (Powder Ject Vaccines), который изнутри покрывал Tefzela пробирку комплексом золота с ДНК. После окончания процедуры покрытия пробирки она нарезалась на 0,5-дюймовые дробинки вакцины, которые загружались в XR1 устройство (Powder Jet Vaccines) для доставки в мышей.b) Процедура вакцинации. Мышей в возрасте от 4 до 6 недель анестезировали смесью Ketaseta (Fort Dodge) и Rompuna (Bayer). Кожу на животе выбривали электрической машинкой для удаления волос и два неперекрывающихся заряда вакцины посылались в выбритую область с помощью устройства XR1(450 psi). Животных возвращали в их клетки и отбирали у них образцы крови через 6 недель после вакцинации. Для оценки векторов, экспрессирующих HBsAg, использовали мышей Balb/c, для оценки векторов, экспрессирующихHSV-gD и Flu-M2, использовали мышей Swiss Webster. Анализ сывороток на анти-HBsAg антитела. Через 6 недель у вакцинированных животных отбирали образцы крови. Порцию сыворотки, выделенной из этих образцов, помещали в лунки реакционного планшета, снабженные AUSAB EIA диагностическим набором (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Объем добавленной сыворотки зависел от титра антител в образце, и образец разводился буфером для разведения для того, чтобы попасть в диапазон значений, которые могли быть получены с помощью количественной панели. Из каждого флакона AUSAB количественной панели (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) 200 мкл добавляли к лункам реакционного планшета. К каждой лунке добавлялись гранулы, после чего планшет герметично закрывали и инкубировали при 40 С в течение 2 ч. Затем лунки отмывали от всех жидких реакционных компонентов. К каждой промытой лунке добавляли 200 мкл смеси конъюгата, после чего планшет герметично закрывали и инкубировали при 40C в течение 2 ч. Затем лунки опять промывали от всех жидких реакционных компонентов. Гранулы переносили в чистые пробирки, после чего добавляли по 300 мкл буфера для развития цветной реакции. Через 30 мин цветную реакцию останавливали добавлением 1 M серной кислоты и измеряли поглощение реакционной смеси при 490 нм с помощью спектрофотометраQuantum II (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Этот спектрофотометр рассчитывает уровень антител в образце путем сравнения поглощения образца со стандартной кривой, полученной на количественной панели. Эти уровни антител были затем скорректированы с учетом коэффициентов разведения. Данные,представленные на фиг. 7, представляют собой геометрически среднее значение титров всех животных,вакцинированных определенным вектором. Анализ сывороток на антитела против антигена Flu-M2. 96-луночные Costar средней связывающей способностью ELISA планшеты (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) покрывали синтетическим пептидом Flu-M2 (QCB/Biosource, Hopkinton, MA) в концентрации 1 мкг/мл в PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) и инкубировали в течение ночи при 4 С. Планшеты промывали три раза 10 мМ Трисом (Sigma, St. Louis, MO)/150 мМ NaCl (Fisher Scientific)/0,1% Brij-35(Sigma), затем блокировали 5% сухим молоком (Bio-Rad Laboratories, Melville, NY) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Все последующие инкубации проводили при комнатной температуре в течение 1 ч, между инкубациями промывали, как описано выше. Образец мышиной сыворотки, стандартный образец (высокий титр, мышиная сыворотка против M2) и отрицательный контроль (мышиная сыворотка против HBsAg) разводили 2% сухим молоком/PBS/0,05% Tween-20 (Sigma) и инкубировали вELISA планшетах. Затем следовали инкубации с козьими антимышиными иммуноглобулинами G (H+L),конъюгированными с биотином (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL), разведенными 1:8000 в 2% сухом молоке/PBS/0,05% Tween-20, и с конъюгатом пероксидазы хрена со стрептавидином(Southern Biotechnology), разведенным 1:8000 в PBS/0,1% Tween-20. Цветная реакция развивалась с TMB субстратом (BioFX, Owings Mills, MD). Реакции останавливали 1 M H2SO4 и снимали показания при 450 нм с помощью прецезионного ридера для микропланшетов (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Программа SoftMax Pro 4.1 (Molecular Devices) была использована для вычисления предельных значений- 29010056 титров с использованием анализа по четырем параметрам. Титры были нормализованы относительно стандартной сыворотки, которая имела заранее определенный титр, для того чтобы свести к минимуму вариации от анализа к анализу и от планшета к планшету. Результаты показаны на фиг. 7. Анализ сывороток на антитела против антигена HSVgD. 96-луночные Costar средней связывающей способности ELISA планшеты (Fisher Scientific, Pittsburg,PA) покрывали белком HSVgD (Viral Therapeutics, Ithaca, NY) в концентрации 1 мкг/мл в PBS(Biowhittaker, Walkerville, MD) и инкубировали в течение ночи при 4 С. Планшеты промывали три раза 10 мМ Трисом (Sigma, St. Louis, MO)/150 мМ NaCl (Fisher Scientific)/0,1% Brij-35 (Sigma), затем блокировали 5% сухим молоком (Bio-Rad Laboratories, Melville, NY) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Все последующие инкубации проводили при комнатной температуре в течение 1 ч, между инкубациями промывали, как описано выше. Образец мышиной сыворотки, стандартный образец (высокий титр, мышиная сыворотка против gD) и отрицательный контроль (мышиная сыворотка против HBsAg) разводили 2% сухим молоком/PBS/0,05% Tween-20 (Sigma) и инкубировали в ELISA планшетах. Затем следовали инкубации с козьими антимышиными иммуноглобулинами G (H+L), конъюгированными с биотином (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL), разведенными 1:8000 в 2% сухом молоке/PBS/0,05% Tween-20, и с конъюгатом пероксидазы хрена со стрептавидином (Southern Biotechnology), разведенным 1:8000 в PBS/0,1% Tween-20. Цветная реакция развивалась с TMB субстратом(BioFX, Owings Mills, MD). Реакции останавливали 1 M H2SO4 и снимали показания при 450 нм с помощью прецезионного ридера для микропланшетов (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Программа SoftMaxPro 4.1 (Molecular Devices) была использована для вычисления предельных значений титров с использованием анализа по четырем параметрам. Титры были нормализованы относительно стандартной сыворотки, которая имела заранее определенный титр, для того чтобы свести к минимуму вариации от анализа к анализу и от планшета к планшету. Результаты показаны на фиг. 7. Таким образом, описаны новые конструкции нуклеиновых кислот, композиции, содержащие эти конструкции, и методы иммунизации нуклеиновыми кислотами с использованием этих конструкций. Несмотря на то что предпочтительные варианты осуществления изобретения были описаны в деталях,должно быть понятно, что могут быть сделаны очевидные изменения без отступления от смысла и границ применения изобретения, как определено приложенной формулой изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя:(a) последовательность предраннего промотора hCMV,(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV и(c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона A в основном предраннем гене hCMV;(iii) нетранслируемую лидерную последовательность, которую выбирают из последовательностиHBV пре-S2-антигена, последовательности HBV е-антигена или последовательности антигена HSV типа 2gD и которая находится в функциональной связи с химерным промотором;(iv) последовательность энхансера, которая получена из 3'-нетранслируемой области (UTR) последовательности HBsAg или последовательности предраннего гена CMV обезьян, которая находится в функциональной связи с химерным промотором и которая расположена после кодирующей последовательности. 2. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, в которой:(i) последовательность предраннего промотора hCMV (а) содержит SEQ ID NO: 1, ее функциональный вариант, по меньшей мере на 80% ей гомологичный, или функциональный фрагмент той или другой и/или(ii) последовательность экзона (b) содержит SEQ ID NO: 2, ее функциональный вариант, по меньшей мере на 80% ей гомологичный, или функциональный фрагмент одной из них. 3. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, в которой гетерологичный интрон (с) включает в себя последовательность, выбранную из последовательности интрона A гена инсулина крыс, последовательности интрона A гена кератина кур и последовательности интрона A гена сердечного актина кур,функциональный вариант, по меньшей мере на 80% гомологичный указанной последовательности интрона A, и функциональный фрагмент указанной последовательности интрона A или ее указанный функциональный вариант. 4. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.3, где последовательность интрона A гена инсулина крыс содержит SEQ ID NO: 3, ее функциональный вариант по меньшей мере с 80% гомологией или функциональный фрагмент одной из них. 5. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, в которой:(i) нетранслируемую лидерную последовательность выбирают из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ