Псевдоинфекционный флавивирус и его применение
Формула / Реферат
1. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, содержащий делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания prM/М, или их комбинацию, где указанный дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Flaviviridae.
2. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.1, где указанный вирус представляет собой Flavivirus, Hepacivirus или Pestivirus или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты prM-Е других вирусов с кассетой prM-Е псевдоинфекционного вируса.
3. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.2, где указанный Flavivirus является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей.
4. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.3, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного Flavivirus, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С.
5. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.2, где указанный Hepacivirus является вирусом гепатита С.
6. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.2, где указанный Pestivirus является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
7. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.1, где указанный делетированный ген заменен на ген, кодирующий маркерный белок или антиген.
8. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.7, где маркерный белок является зеленым флуоресцентным белком.
9. Популяция клеток, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Flaviviridae, эффективно поддерживающая размножение дефектного по репликации вируса по п.1 в подходящих условиях, где ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства Flaviviridae в составе репликона, заменен на кодон-оптимизированную версию гена, кодирующую белок (белки) указанного вируса, так что эта замена снижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae.
10. Популяция клеток по п.9, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
11. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства Flaviviridae.
12. Популяция клеток по п.10, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной рекомбинации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами.
13. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения C-prM таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода SVP, содержащих prM/E, in vivo или их комбинацию.
14. Популяция клеток по п.10, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства Flaviviridae, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных in vitro РНК репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки.
15. Популяция клеток по п.10, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы.
16. Популяция клеток по п.15, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (EEEV), вирус западного энцефалита лошадей (WEEV) или вирус лихорадки реки Росс.
17. Способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae, включающий инфицирование популяции клеток по п.9 дефектным по репликации псевдоинфекционным вирусом семейства Flaviviridae, который содержит делецию в капсидном гене таким образом, что эта делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания prM/М, или их комбинацию, получая таким образом дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae.
18. Способ по п.17, где указанный вирус представляет собой Flavivirus, Hepacivirus или Pestivirus или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты prM-Е других вирусов с кассетой prM-Е псевдоинфекционного вируса.
19. Способ по п.18, где указанный Flavivirus является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей.
20. Способ по п.19, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного Flavivirus, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С.
21. Способ по п.18, где указанный Hepacivirus является вирусом гепатита С.
22. Способ по п.18, где указанный Pestivirus является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
23. Способ по п.17, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса, получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
24. Способ по п.23, где ген, кодирующий мутантный белок (белки) вируса семейства Flaviviridae в составе репликона, заменен на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок (белки) указанного вируса, так что эта замена понижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae.
25. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства Flaviviridae.
26. Способ по п.24, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами.
27. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-prM таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода SVP, содержащих prM/E, in vivo или их комбинацию.
28. Способ по п.23, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства Flaviviridae, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных in vitro РНК репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки.
29. Способ по п.23, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы.
30. Способ по п.29, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (EEEV), вирус западного энцефалита лошадей (WEEV) или вирус лихорадки реки Росс.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, полученный способом по п.17.
32. Способ защиты индивидуума от инфекций, возникающих в результате контакта с Flaviviridae, включающий введение в организм индивидуума иммунологогически эффективного количества фармацевтической композиции по п.31, которая индуцирует у индивидуума иммунный ответ против Flaviviridae, защищая таким образом индивидуума от инфекций.
33. Способ по п.32, где указанное введение производится внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно, внутримышечно, перорально или интраназально.
34. Способ по п.32, где индивидуумом является человек или животное.
Текст
В настоящем изобретении описывается дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, не содержащий ген капсида, где дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус размножается только в клетках, экспрессирующих капсид или капсид,prM и белок оболочки флавивируса. В настоящем изобретении также описывается способ широкомасштабного производства таких вирусов и использование таких псевдоинфекционных вирусов в качестве вакцин для профилактики заболеваний, вызванных инфекциями человека и животных вирусами, принадлежащими к этому семейству.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЗЕ БОРД ОФ РИДЖЕНТС ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ ТЕХАС СИСТЕМ (US) 016490 Уровень техники Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. В общем, настоящее изобретение раскрывает конструирование дефектных по репликации вирусов семейства Flaviviridae и их использование в качестве вакцин для профилактики заболеваний, вызываемых вирусами этого семейства. В частности, настоящее изобретение относится к дефектным по репликации флавивирусам или псевдоинфекционным флавивирусам (PIV или RepliVAX) и к их применению в качестве профилактических вакцин против заболеваний, опосредованных флавивирусами. Предшествующий уровень техники Род Flavivirus семейства Flaviviridae включает большое число важных патогенов человека и животных; его разделяют на четыре различных антигенных комплекса на основании разницы в реактивности в иммунологических тестах. Обычно флавивирусы циркулируют между амплифицирующими вирус хозяевами - птицами или млекопитающими и переносчиками - насекомыми или клещами. Геном флавивируса представляет собой одноцепочечную кэпированную РНК положительной полярности без концевой поли(А)-последовательности на 3'-конце. Геном кодирует единственный полипептид, который процессируется котрансляционно и посттрансляционно с получением структурных белков вируса С, prM/М и Е, образующих вирусные частицы, и неструктурных белков NS1, NS2A, NS2B,NS3, NS4B и NS5, необходимых для репликации вирусного генома и его упаковки в инфекционные вирионы (Chambers, 1990). Вирионы содержат единственную копию геномной РНК вируса, упакованную в нуклеокапсид, содержащий белок С, окруженный липидной оболочкой, содержащей гетеродимеры белков М и Е. В отличие от многих других оболочечных вирусов, взаимодействие между нуклеокапсидом и выступами оболочки не является специфическим, то есть оболочка, содержащая димеры М/Е может успешно образоваться вокруг нуклеокапсида, полученного из гетерологичного флавивируса, демонстрируя ограниченный уровень гомологии капсидной последовательности (Lorenz, 2002). С другой стороны, экспрессия prM и Е в отсутствие С может приводить к образованию субвирусных частиц (SVP), не содержащих РНК или белкок С (Mason, 1991). Кассеты prM/M-E, продуцирующие субвирусные частицы, составляют основу нескольких вакцинкандидатов, известных из уровня техники. Эти вакцины-кандидаты включают субъединичные вакциныColombage, 1998; Aberle, 1999; Konishi, 2000; Konishi, 2000; Kochel, 2000; Davis, 2001) и живые векторные вакцины (Mason, 1991; Konishi, 1992; Pincus, 1992; Fonseca, 1994; Pugachev, 1995; Colombage, 1998;Kanesa, 2000; Minke, 2004). Однако у этих вакцин существует ряд серьезных недостатков. Например,субъединичные вакцины безопасны в употреблении, но их трудно получить в больших количествах; ДНК-вакцины слабоиммуногенны, а векторные вакцины недостаточно эффективны при наличии иммунитета к вектору. Поэтому, несмотря на серьезную озабоченность заболеваниями, опосредованными флавивирусами,и продолжающимся распространением флавивирусов на новые территории, для этих инфекций пока не разработано средств противовирусной терапии, и на сегодняшний день создано очень ограниченное количество одобренных вакцин. Инактивированные вирусные вакцины (INV) были разрешены к применению для профилактики клещевого энцефалита (TBEV) и японского энцефалита (JEV). Однако, как и другие инактивированные вирусные вакцины, эти вакцины имеют низкую эффективность и требуют повторных вакцинаций. Несмотря на эти недостатки, преимуществом INV против японского энцефалита и клещевого энцефалита являются хорошие показатели безопасности. Единственной разрешенной к применению живой аттенуированной вакциной (LAV) против флавивируса является широкоиспользуемая живая аттенуированная вакцина на основе штамма 17D вируса желтой лихорадки (YFV), полученного путем многократных перевиваний дикого типа штамма Asibi вируса желтой лихорадки в культуре тканей куриных эмбрионов. Несмотря на то, что эта вакцина считается высокоэффективной и безопасной, были описаны случаи заболевания желтой лихорадкой среди вакцинированных, включая недавний случай заболевания новобранца ВС США (Gerasimon, 2005). Кроме того, эта вакцина не рекомендована к применению у новорожденных, беременных женщин или пациентов с ослабленным иммунитетом из-за побочных эффектов, включая энцефалит, опосредованный вакциной. Однако развитие систем обратной генетики для флавивирусов привело к разработке и производству новых типов живой аттенуированной вакцины, основанных на рациональной аттенуации этих вирусов. Этот новый класс вакцин включает в себя химеры на основе штамма 17D вируса желтой лихорадки, в которых кассета, содержащая фрагмент генома вируса желтой лихорадки, кодирующий белки prM-Е,была заменена на кассету, кодирующую белки prM-E, полученную из гетерологичных флавивирусов(Chambers, 1999). Аналогичный подход, основанный на использовании химерных вирусов, был проведен с использованием материала лихорадки Денге или клещевого энцефалита (Pletnev, 2002; Huang, 2003). В большинстве случаев химерные флавивирусы демонстрируют значительно ослабленный фенотип, сохраняя при этом способность вызывать эффективный защитный иммунный ответ и способность защищать против последующих инфекций вирусами, структурные белки которых экспрессируются химерами(Monath, 2002). Показано, что существующий иммунитет к вектору не снижает эффективности вакци-1 016490 нации такими химерными вакцинами-кандидатами (Monath, 2002), но снижает эффективность вирусных рекомбинантных вакцин на основе других вирусных векторов. Кроме того, несмотря на то, что химерные флавивирусы могут представлять собой достаточно универсальный подход для производства новых вакцин, существуют опасения, что химеры сами по себе могут оказаться патогенными (Chambers, 1999), по крайней мере, для пациентов с ослабленным иммунитетом, или что патогенные химеры могут возникнуть, поскольку в процессе распространения этих вирусов были выявлены случаи мутаций (Pugachev,2004). Еще одно многообещающее направление развития разработки вакцин основано на индукции в геноме флавивируса неисправимых делеций, при которых продуктивная репликация вируса в вакцинированном хозяине либо малоэффективна, либо невозможна. В последнем случае вирусный геном, полностью кодирующий белки, необходимые для репликации вируса, но не содержащий области, кодирующей, например, белок С, может быть предоставлен для иммунизации in vivo в виде способной к саморепликации РНК, синтезированной in vitro (Kofler, 2004; Aberle, 2005) или, возможно, в виде ДНК (под контролем промоторов РНК-полимеразы II или в виде способной к саморепликации РНК, синтезированнойin vitro (Kofler, 2004; Aberle, 2005). Было показано, что прямая иммунизация дефектными РНК-геномами,синтезированными in vitro, ведущая к производству SVP в отсутствие полного цикла репликации вируса,является эффективным и безопасным методом стимуляции защитного иммунитета (Kofler, 2004; Aberle,2005). Однако для производства вакцины-кандидата, основанной на РНК, могут существовать серьезные препятствия из-за проблем, связанных с синтезом, стабильностью и доставкой вакцины. Таким образом, в известном уровне техники отсутствует безопасный, сильный и эффективный вид вакцин, который может быть использован против заболеваний, вызываемых вирусами, принадлежащими семейству Flaviviridae. Настоящее изобретение удовлетворяет давние потребности существующего уровня техники. Сущность изобретения В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описано получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae. Такой псевдоинфекционный вирус содержит делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) , при этом делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания белка prM/М, или их комбинацию,где дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный С, мутантный белок prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию, принадлежащие вирусу семейства Flaviviridae. В другом варианте осуществления настоящего изобретения описано получение системы культуры клеток, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинации, принадлежащие вирусу семейства Flaviviridae, делающие возможным размножение вышеописанного дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae в подходящих условиях. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описан способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae, описанного выше. Такой способ включает получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae,содержащего делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида, таким образом,что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания белка prM/М или их комбинацию; получение клеточной линии, экспрессирующей белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинации, принадлежащие вирусу семейства Flaviviridae, где клеточная линия синтезирует высокий уровень белков Flaviviridae, необходимых для размножения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae; и инфицирование клеточной линии псевдоинфекционным вирусом семейства Flaviviridae, получая, таким образом, дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae. В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывается фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, полученный способом, описанным в настоящей заявке. В другом варианте осуществления настоящего изобретения описан способ защиты пациента от инфекций, возникающих в результате контакта с вирусами семейства Flaviviridae. Такой способ включает назначение пациенту иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, полученной по способу, описанному в настоящей заявке, которая индуцирует у пациента иммунный ответ против вирусов семейства Flaviviridae, защищая, таким образом, пациента от инфекций. Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение репликации PIV-флавивируса в клетках,продуцирующих С или все структурные белки вируса, обеспечивающие транс-комплементацию дефекта. Репликация PIV в нормальных клетках in vivo или in vitro приводит к выходу SPV, не содержащих нуклеокапсида.YFV, могут комплементировать репликацию PIV YF. На фиг. 2 А приведено схематическое изображение геномов YFV и PIV YFV, экспрессирующего GFP. На фиг. 2 В приведено схематическое изображение репликонов VEEV, экспрессирующих гены Рас и С YFV, а также сигнальный пептид для prM (заякоренный в мембране С; VEErep/C1/Pac), или заякоренный в мембране С с 20 аминокислотными остаткамиprM (VEErep/C2/Pac), или все структурные белки YFV (VEErep/C-prM-E/Pac). На фиг. 2 С показан выходPIV YF из клеточных линий, трансфицированных геномом PIV, синтезированным in vitro. Культуральную среду меняли в указанные моменты времени и измеряли титры PIV. В моменты времени, отмеченные стрелками, клетки пассировались с разведением 1:5. На фиг. 3 А-3 В показаны кривые роста PIV YFV в пакующих клеточных линиях. Клетки BHK-21,содержащие репликоны VEErep/C2/Pac и VEErep/C-prM-E/Pac, инфицировали PIV YFV с множественностью инфекции (MOI), указанной в инфекционных единицах на клетку. В указанные моменты времени культуральная среда заменялась, и измерялись титры вышедших PIV. В моменты времени, отмеченные стрелками, клетки пассировались с разведением 1:5. На фиг. 3 А показана кривая роста при множественности инфекции 10 инф. ед./кл, на фиг. 3 В показана кривая роста при множественности инфекции 0,1 инф. ед./кл. На фиг. 4 А-4 С показано, что клетки, экспрессирующие кодон-оптимизированный ген С, продуцировали PIV YF. На фиг. 4 А показана нуклеотидная последовательность синтезированного гена. Введенные мутации обозначены строчными буквами (SEQ ID NO: 1). На фиг. 4 В приведены кривые роста PIVYF в пакующих клеточных линиях. Клетки BHK-21, содержащие репликоны VEErep/C2/Pac, VEErep/CprM-E/Pac, VEErep/C2opt/Pac и VEErep/Copt-prM-E/Pac, были инфицированы PIV YF при указанных значениях множественности инфекции в инфекционных единицах на клетку. В указанные моменты времени культуральная среда заменялась, и измерялись титры вышедших PIV. На фиг. 4 С показаны бляшки, образованные в пакующей клеточной линии, содержащей VEErep/C2opt/Pac YFV и PIV YF через 4 дня инкубации при 37 С. На фиг. 5 А-5 С показано, что PIV WN вызывает распространение инфекции в пакующих клетках. На фиг. 5 А приведено схематическое изображение генома PIV WN и репликона VEEV, экспрессирующего структурные гены вируса WNV. На фиг. 5 В показано, что PIV WN вызывали образование фокусов клеток, позитивных на антиген WNV (обнаружено с помощью антител к NS1 после инфекции клеток BHK(VEErep/C-E-Pac) через 70 ч инкубации). На фиг. 5 С показано, что те же самые препараты PIV WN вызывали образование только единичных инфицированных клеток при инфицировании монослойных клеток Vero (выявлено через 70 ч после инфекции способом окрашивания с помощью трагаканта, аналогично фиг. 5 В). На фиг. 6 А-6 С показано обнаружение белка Е после выхода из клеток, инфицированных PIV YF иWN. На фиг. 6 А клетки BHK-21 были инфицированы PIV YF при множественности инфекции 5 инф. ед. на клетку. Вышедшие SVP собирались и очищались с помощью ультрацентрифугирования. Полученные образцы разделялись с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS PAGE), переносились на фильтры; белок Е детектировался с помощью моноклональных антител D1-4G2. Дорожка 1 - культуральная среда, собранная с неинфицированных клеток, дорожка 2 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных PIV YF, через 48 ч после инфекции; дорожка 3 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных PIV YF, через 72 ч после инфекции, дорожка 4 - YFV (2107 бляшкообразующих единиц). На фиг. 6 В клетки Vero были инфицированы WN YF в течение 24 ч, затем порции осветленной культуральной жидкости (собранной до обнаружения лизиса клеток) разделялись с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, переносились на фильтры и к фильтрам добавлялись моноклональные антитела, специфичные к белку Е (7 Н 2, производство Bioreliance). Добавление поликлональной сыворотки к этому образцу на выявило никаких неструктурных белков, ассоциированных с клетками (не показано), что подтверждает факт активной секреции белка Е. Дорожка 1 - образец WNV, дорожка 2 культуральная среда, собранная с неинфицированных клеток, дорожка 3 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных PIV WN, через 48 ч после инфекции. На фиг. 6 С приведены результаты Вестерн-блот-анализа, показывающие содержание белка Е во фракциях, полученных с помощью градиента сахарозы, полученных из SVP, собранных с нормальных (не пакующих) клеток BHK, в которые была введена РНК PIV YFV с помощью электропорации. Пик реактивности белка Е (32%) соответствует плотности SVP и в соответствии с этим фактом мигрирует медленнее, чем YFV (42%) при параллельном анализе. На фиг. 7A-7F показано схематическое изображение плазмид, использовавшихся для выработки псевдоинфекционных вирусов (PIV) желтой лихорадки (YF), лихорадки Западного Нила (WN). На фиг. 7 А показана pYFPIV, на фиг. 7 В показана pWNPIV, на фиг. 7 С показана pVEErep/C1/Pac, на фиг. 7D показана pVEErep/C2/Pac, на фиг. 7 Е показана pVEErep/C3/Pac, на фиг. 7F показана pVEErep/C-E-Pac. На фиг. 8A-8V приведены последовательности плазмид, использовавшихся в настоящей работе. На фиг. 8A-8D приведена последовательность pYFPIV (SEQ ID NO: 6), на фиг. 8 Е-8 Н приведена последовательность pVEErep/C1/Pac (SEQ ID NO: 7), на фиг. 8I-8K приведена последовательность pVEErep/C2/Pac-3 016490 фиг. 8P-8R приведена последовательность pVEErep/C2opt/Pac (SEQ ID NO: 10), на фиг. 8S-8V приведена последовательность pVEErep/Copt-prM-Е/Рас (SEQ ID NO: 11). На фиг. 9 показано схематическое изображение перекрывающихся областей RepliVAX и репликонаVEE, использованного для транс-выработки белка С. 1 В VEErep/Pac-Ubi-С было введено тридцать шесть мутаций для уменьшения вероятности гомологической рекомбинации с фрагментом С, кодируемым геномом RepliVAX. 2 Положения 5'- и 3'-последовательностей циклизации в геноме RepliVAX. На фиг. 10 для сравнения показаны фокусы инфекции, образовавшиеся в клеточной линии, экспрессирующей белок С BHK(VEErep/Pac-Ubi-C), под действием RepliVAX WN на пассаже 0 (считая от электропорации) и пассаже 10 видно, что легко отбираются варианты, растущие лучше. На фиг. 11 показаны результаты титрования PIV RepliVAX, продуцированные клетками Vero, сертифицированными ВОЗ, содержащими кассету экспрессии С (VEErep/Pac-Ubi-C). Несмотря на то, что получившийся титр PIV немного ниже титра, полученного из клеток BHK, клетки Vero позволяют многократно собрать PIV с высоким титром, что невозможно при работе с клетками BHK. На фиг. 12 А-12 В показаны мутанты по циклизации. На фиг. 12 А показана репликация репликонаWNV/IRES-RLuc с заменой одного основания, сопоставление мутаций последовательности циклизации показывает, что некоторые мутанты с заменой одного основания реплицируются на уровне дикого типа. На левой части фигуры показана схема экспериментального генома, и под ним - 5'- и 3'последовательности циклизации. На правой части фигуры приведены уровни репликации, определенные с помощью репортера RLuc, в процентном соотношении от уровня репликации дикого типа. Подчеркнутые основания обозначают мутированные основания. На фиг. 12 В показана репликация репликонаWNV/IRES-RLuc с соответствующими изменениями двух оснований (m17), полученного при комбинации m10 и m13 (раздел А) в сравнении с уровнями репликации мутантов, сочетающих мутантную последовательность циклизации с последовательностью циклизации дикого типа в любом возможном формате, а также мутант, продуцирующий неактивную полимеразу (отрицательный контроль). На левой части фигуры показана схема экспериментального генома, и под ним 5'- и 3'-последовательности циклизации. На правой части фигуры приведены уровни репликации, определенные с помощью репортера RLuc, в процентном соотношении от уровня репликации дикого типа. Подчеркнутые основания обозначают мутированные основания.Означает, что репликация не обнаружена. Подробное описание изобретения Безопасные и эффективные вакцины существуют лишь против некоторых заболеваний, вызываемых флавивирусами. С помощью классических способов получения инактивированной вирусной вакцины (INV) и живой аттенуированной вакцины (LAV), использующихся для получения вакцин против YF,JE и TBEV, до сих пор не удалось получить лицензированные продукты для профилактики заболеваний,вызванных другими флавивирусами, в частности лихорадки Денге и энцефалита Западного Нила (WNE). Существуют проблемы безопасности существующих LAV (остаточная вирулентность или реверсия вирулентности) и INV (реактогенность ввиду антигенной нагрузки и добавочных антигенов). К тому же дляINV, как правило, требуется множественная вакцинация. Кроме того, для обоих типов вакцины существуют проблемы производства, включая необходимость избегать реверсии вирулентности во время размножения живой аттенуированной вакцины и принимая во внимание количество материала, необходимое для стимуляции сильного иммунного ответа на инактивированную вирусную вакцину, а также потребность в лабораториях с высокой степенью защиты для размножения вирулентных вирусов, необходимых для получения продуктов INV. Несмотря на существование перспективных кандидатов новых типов вакцин против флавивирусов, путь к их получению предусматривает необходимость решения всех этих проблем. В целом, настоящее изобретение направлено на конструирование и использование дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов, принадлежащих семейству Flaviviridae. В этой связи настоящее изобретение относится к разработке нового типа дефектных по репликации флавивирусов, также называемых RepliVAX, сочетающих безопасность инактивированных вакцин, эффективность и масштабируемость производства живых аттенуированных вакцин. Эти флавивирусы, также называемые в настоящем изобретении псевдоинфекционными вирусами (PIV), содержат генетически измененные геномы флавивирусов, несущие делецию большей части области, кодирующей капсид (С), таким образом, этот геном неспособен производить инфекционное потомство в нормальных клеточных линиях или вакцинированных животных. Однако эти псевдоинфекционные вирусы могут быть размножены в клетках, экспрессирующих кассеты С или С-prM-Е, в которых репликация вируса достигает высокого уровня. Таким образом, эти псевдоинфекционные флавивирусы неспособны индуцировать распространение инфекции в нормальных клетках in vitro или in vivo по причине отсутствия транс-комплементации с белком С, следовательно, неспособны вызывать заболевание у животных. В отличие от вакцин и способов получения этих вакцин, известных из уровня техники, настоящее изобретение относится к системе для производства псевдоинфекционных флавивирусов в промышленных масштабах, что позволит сделать такие вакцины более дешевыми и в то же время более эффективными, чем живые аттенуированные вакцины. В настоящем изобретении предлагается новый тип рекомбинантной вакцины, способной к единственному раунду репликации в иммунизированных животных-4 016490 или людях, ведущему к высвобождению субвирусных частиц (SVP), которые не содержат генетического материала, но могут служить эффективными иммуногенами. В настоящем изобретении показано, что псевдоинфекционные флавивирусы могут быть получены для вируса желтой лихорадки (YFV) или вируса лихорадки Западного Нила (WNV). На этом основании в соответствии с настоящим изобретением было сделано предположение, что метод, описанный в настоящем изобретении, может широко использоваться для разработки вакцин против других флавивирусов. Кроме того, заражение нормальных клеток такими псевдоинфекционными флавивирусами приводило к выходу SVP, не содержащих нуклеокапсида и генетического материала. Показано, что псевдоинфекционные флавивирусы, описанные в настоящем изобретении, не способны вызывать заболевания и, таким образом, являются безопасными. Кроме того, эти псевдоинфекционные флавивирусы оказались иммуногенными для мышей благодаря своей способности к единственному раунду репликации и высвобождению SVP, несущих вирусные антигены. Также WN PIV оказались способными к профилактике смертельно опасного энцефалита у мышей при контрольном заражении WNV.PIV, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены способами, обеспечивающими высокий уровень выхода продукта в клеточной культуре и неспособными вызывать заболевания у животных. Эти продукты могут вводиться в организм животных, где дефектный процесс репликации не допускает распространения инфекции и развития заболевания, но допускает продукцию SVP, иммуногенных субъединиц флавивируса, для которых показана эффективность индукции эффективного иммунного ответа на заболевания, вызываемые некоторыми флавивирусами. Настоящее изобретение также демонстрирует, что способ создания вакцины с применением псевдоинфекционных флавивирусов может быть использован в отношении двух флавивирусов с низкой степенью родства, переносимых комарами. Аналогичная технология может использоваться для РНК-вакцин к клещевому энцефалиту (Kofler, 2004), что указывает на то, что технология на основе PIV может использоваться для флавивирусов с более низкой степенью родства. Кроме того, результаты работы с РНКвакцинами против TBEV показали, что кроме иммунного ответа антител на SVP (сходный с описанным в настоящем изобретении), введение репликационно активных геномов флавивируса в клетки вакцинированных хозяев также может вызвать Т-клеточный иммунный ответ (Kofler, 2004; Aberle, 2005) . Несмотря на то, что Т-клеточный иммунный ответ не анализировался в настоящей работе, было сделано предположение, что PIV способны вызывать Т-клеточный иммунный ответ, сходный с вызываемым вирусной инфекцией. Несмотря на то, что вакцины, содержащие PIV, описанные в настоящем изобретении, основываются на той же стратегии, которая использовалась для получения РНК-вакцин против TBEV (Kofler, 2004;Aberle, 2005), для вакцин, содержащих PIV, не требуется использование генной пушки для доставки в организм животных, они легко растут в клеточных культурах и выдерживают процедуры стабилизации и хранения (лиофилизация) при тех же условиях, которые используют в настоящее время для коммерчески производимой вакцины YFV 17D, давая, таким образом, масштабируемый и легко хранимый товарный продукт-вакцину. Предварительные исследования стабильности RepliVAX WN показали, что хранение лиофилизированных препаратов в течение 30 дней при 4 С не оказывает заметного влияния на титр. Для разработки оптимальных условий для быстрого роста, необходимого для эффективной транскомплементации (и, следовательно, высокого уровня выхода) псевдоинфекционных флавивирусов, в настоящем изобретении использовали клетки, экспрессирующие высокие уровни С (или C-prM-E) с репликонов VEEV. Репликоны VEEV обладают меньшим цитопатическим эффектом, чем репликоны, полученные из других альфавирусов, так что в некоторых клеточных линиях позвоночных и насекомых устанавливается их постоянная репликация. Такая система подходит для получения псевдоинфекционных флавивирусов, поскольку: i) репликоны VEEV высокоэффективны для синтеза гетерологичных белков, и в настоящем изобретении синтезировали С на уровне, необходимом для образования капсида вокруг генома флавивируса; ii) не отмечено взаимодействия между репликонами VEEV и репликацей флавивируса (Petrakova, 2005). Кроме того, репликоны VEE и геномы PIV YF могут реплицироваться вместе в клетках BHK, не приводя к заметному цитопатогенному эффекту; iii) репликоны VEEV могут паковаться с высоким титром в вирионы VEE, которые можно использовать для быстрого получения пакующих клеточных линий, производящих структурные белок (белки) флавивируса. Кроме того, исследование влияния контекста экспрессии С на уровень выхода PIV показало, что пакующие клетки, экспрессирующие заякоренную в мембране форму С, содержащую 20 дополнительных аминокислотных остатков prM, производили большее количество частиц, чем клетки, экспрессирующие только С, что указывает на важность соблюдения правильной последовательности событий процессинга при сборке вириона. Неясно, почему конструкция, содержащая первые 20 аминокислот prM,пакуется более эффективно, однако это явление можно объяснить требованием к соблюдению специфического порядка расщепления по двум близкорасположенным сайтам расщепления (специфичных дляNS2B/NS3 и сигнальной пептидазы) (Yamshchikov and Compans, 1994) и/или разницей в распределении и стабильности белковых продуктов гена С в двух разных контекстах. Кроме того, было показано, что коэкспрессия С с prM и Е (VEErep/C-prM-E/Pac) приводила лишь к небольшому повышению уровня выхода PIV по сравнению с VEErep/C2/Pac, экспрессирующему заякоренный в мембране С, содержащий-5 016490 фрагмент prM. При исследовании оптимизации кодонов генов С, кодируемых репликонами VEEV, с целью выяснения, может ли такое изменение последовательности гена С повышать уровень выхода PIV, не было обнаружено большой разницы в уровне выхода YF PIV по сравнению с клетками, не экспрессирующими кодон-оптимизированный ген С. Это наблюдение позволяет предположить, что репликоны VEEV, даже содержащие неоптимизированные кодоны, продуцируют С на уровне насыщения. Эти результаты подтверждаются результатами других работ, показывающими, что клеточные линии, экспрессирующие репликоны VEEV, кодирующие кассеты WNV С-Е, продуцировали более высокий уровень Е, чем клетки,инфицированные WNV. Несмотря на неспособность транс-экспрессируемого оптимизированного гена С к повышению уровня выхода YF PIV, в клетках, содержащих репликон VEEV, экспрессирующий Copt,наблюдался цитопатический эффект и образование бляшек при инфекции YF PIV. Таким образом, инфекция PIV в клетках Copt оказывается еще более сходной с инфекцией, вызываемой вирусом, способным к репликации. Дополнительным преимуществом использования репликонов VEEV, кодирующих ген Copt YFV, в производстве псевдоинфекционных флавивирусов является повышение уровня безопасности, поскольку изменение в кодонах снижает вероятность гомологичной рекомбинации с геномом псевдоинфекционного флавивируса. Кроме того, последовательность циклизации гена Copt также подвергалась изменениям (в настоящем изобретении описано для области, кодирующей ген С WNV в клетках BHK (VEEp/C-E-Pac для снижения вероятности рекомбинации, в результате которой может получиться реплицирующийся флавивирус, кодирующий С. На сегодняшний день ни одна из систем WN иYF PIV, описанных в настоящем изобретении, не продуцировала реплицирующихся флавивирусов, которые могут быть обнаружены в клеточной культуре или у высоковосприимчивых животных. Кроме того,эксперименты in vivo показали, что как YF, так и WN PIV оказались безопасными и не вызывали заболевания даже после интрацеребральной инокуляции 3-4-дневных мышат самой высокой дозой PIV. Тем не менее, WN PIV были способны индуцировать высокий титр нейтрализующих антител и предохраняли мышей от инфекции способных к репликации WNV. Кроме того, гепатит С попадает наравне со СПИДом в категорию инфекций, являющихся причиной наибольшей заболеваемости и смертности, против которых на сегодняшний день не существует вакцин. В Японии и Корее вклад вируса гепатита С (HCV) превышает вклад гепатита В в развитие гепатоцеллюлярной карциномы, одного из наиболее распространенных типов раковых заболеваний и распространенной причины смерти от заболевания печени. Это соотношение, скорее всего, будет распространяться шире по азиатским странам и другим развивающимся странам из-за возрастающего преобладания HCV одновременно с эффективной иммунизацией против гепатита В. В некоторых районах Египта и других стран гепатит С является чрезвычайно распространенной инфекцией, вероятно отчасти по причине традиционных практик здравоохранения и/или по причине внедрения опасных западных технологий в прошлом (таких как перенос вируса с кровью при использовании одной иглы во время публичных кампаний по охране здоровья, направленных на борьбу с шистосомиазом). Во многих развивающихся странах, где частота заболеваний раком печени и циррозом высока, не существует эффективного контроля переноса гепатита С при переливании крови. Гепатит С также представляет собой большую проблему для здравоохранения в США, где проживают около 4 млн носителейHCV, многие из которых находятся в группе риска смерти по причине терминальной стадии заболевания печени или рака печени. На данный момент подсчитано, что в США ежегодно от гепатита С умирает 8000-10000 человек. В течение следующих 10-20 лет в отсутствие новых терапевтических или профилактических подходов, возможно, это число утроится, превзойдя количество смертей от СПИДа. Однако не существует вакцины для профилактики этой инфекции, в то время как попытки (как национальные, так и международные) разработки вакцины сильно затруднены из-за очевидных технических затруднений, недостаточного интереса к разработке вакцин со стороны фармацевтических компаний, а также отсутствия интереса со стороны финансирующих организаций. Так же, как и в случае многих других инфекционных заболеваний, малоимущие слои населения оказываются в группе наибольшего риска развития серьезного заболевания печени или смертности по причине гепатита С. На сегодняшний день попытки создания эффективной вакцины против инфекции HCV не привели к успеху. Однако в течение последних нескольких лет область HCV начала быстро развиваться, в результате чего в настоящее время этот вирус реплицируется в культуре с достаточно высоким титром, достигающим 106 инф. ед./мл. Между геномом HCV и геномами других флавивирусов, таких как YF, JEV, ТВЕ и других, существует ряд очевидных сходных черт. Следовательно, стратегия разработки дефектных по репликации флавивирусов может быть применена к членам не только рода Flavivirus, но также и родаHepacivirus, включая HCV. Капсидный белок HCV может быть получен с помощью рекомбинантного альфавирусного репликона (на основе SINV, VEEV, EEEV и других) в различных клеточных линиях,включая клетки Huh-7 и Huh-7.5, обладающие известной восприимчивостью к инфекции HCV. ГеномыHCV, дефектные по репликации, не содержащие гена, кодирующего капсид, могут быть трансфицированы в клеточную линию, продуцирующую капсид, и упакованы в инфекционные частицы, содержащие капсид. Последующие раунды инфицирования, необходимые для масштабного производства, также могут-6 016490 проводиться на этих клетках. Однако in vivo в наивных гепатоцитах (а также, возможно, и в других типах клеток), геномы HCV, не содержащие полного гена капсида или вообще не содержащие гена капсида,будут производить только неструктурные вирусные белки, а также гликопротеины Е 1 и Е 2. Эти белки будут презентироваться иммунной системе i) после протеасомной деградации; ii) на поверхности клеток;iii) в форме вирусоподобных частиц с оболочкой, содержащей Е 1 и Е 2. Отсутствие капсида будет препятствовать распространению вируса, таким образом, присутствие вируса будет ограничиваться клетками, получившими дозу вакцины. Таким образом, в настоящем изобретении показано, что псевдоинфекционные флавивирусы, не содержащие капсида: i) способны вызывать распространение инфекции в клеточных линиях, экспрессирующих капсид или все структурные гены флавивируса; ii) PIV оказались неспособными к распространению инфекции в нормальных клетках; iii) PIV продуцировали SVP, содержащие белок Е, при инфекции нормальных клеток; iv) PIV продемонстрировали высокий уровень безопасности для животных; v)PIV обеспечивали профилактику мышей от последующей флавивирусной инфекции. В целом, настоящее изобретение показывает, что флавивирусные PIV могут представлять собой безопасную, мощную и эффективную основу для создания вакцин против инфекций, вызываемых флавивирусами, и инфекций,вызываемых вирусами, сходными с Flavivirus. Настоящее изобретение относится к разработке дефектных по репликации псевдоинфекционных(С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания белкаprM/М или их комбинацию, где Flaviviridae реплицируются исключительно в клетках, экспрессирующих принадлежащие вирусу семейства Flaviviridae белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С,мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию. Как правило, Flaviviridae включает вирус, принадлежащий к роду Flavivirus, Hepacivirus или Pestivirus, или химеры вышеупомянутых вирусов,полученные путем обмена кассет prM-Е других вирусов на кассеты prM-E псевдоинфекционныхFlaviviridae. Список вирусов, принадлежащих к роду Flavivirus, может включать в себя, но ими не ограничивается, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сент-Луиса, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррей. Кроме того, пример вирусов, принадлежащих к роду Hepacivirus, включает, но им не ограничивается, вирус гепатита С, а примеры вирусов, принадлежащих к роду Pestivirus, включают, но ими не ограничиваются, вирусную диарею коров, вирус свиной лихорадки или вирус холеры свиней. В случае флавивируса, делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С флавивируса, может кодировать аминокислотные остатки 26-100 белка С или комбинацию аминокислотных остатков, находящихся в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С. Такие комбинации могут включать, но ими не ограничиваются, аминокислотные остатки 26-93, 31-100 или 31-93. Средний специалист в данной области может по такому принципу делетировать нуклеотидную последовательность белка С других вирусов, принадлежащих семейству Flaviviridae, или других вирусов со сходной организацией генома. В общем и применительно ко всем вирусам, делетированный ген заменяют геном,кодирующим маркерный белок или антиген. Пример маркерного белка включает, но им не ограничивается, зеленый флуоресцентный белок. Настоящее изобретение также относится к разработке системы культуры клеток, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию, принадлежащие вирусу семейства Flaviviridae, эффективно поддерживающих размножение вышеописанных дефектных по репликации Flaviviridae в соответствующих условиях. Для этой цели клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки Flaviviridae, могут быть получены с помощью репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами. В общем, ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства Flaviviridae, в репликоне заменяют на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок или белки вируса семейства Flaviviridae,таким образом, что эта замена уменьшает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae и/или увеличивает производство псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae. Например, такие репликоны могут экспрессировать белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства Flaviviridae. Репликон может экспрессировать белок С в репликоне, который содержит неприродную последовательность циклизации таким образом, что присутствие последовательностей циклизации снижает вероятность продуктивной рекомбинации дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами. Кроме того, репликон может экспрессировать белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-prM таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов, в клеточной культуре, уровень выхода SVP, содержащих prM/E, in vivo или их комбинации. Далее репликоны, экспрессирующие белки Flaviviridae, вводят в клетку путем трансфекции РНК-7 016490 репликона, синтезированной in vitro, путем трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНКполимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки. Вирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой альфавирусы. Типичные примеры таких альфавирусов могут включать, но ими не ограничиваются,вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (EEEV), вирус западного энцефалита лошадей (WEEV) или вирус лихорадки реки Росс (Ross Rivervirus). Настоящее изобретение также относится к способу получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae, включающему получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae, содержащего делецию в гене капсида таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания белка prM/М или их комбинацию; получение клеточной линии, экспрессирующей принадлежащие вирусу семействаFlaviviridae белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию, где клеточная линия синтезирует высокий уровень белков, необходимых для размножения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae; и инфицирования клеточной линии псевдоинфекционным вирусом семейства Flaviviridae, получая, таким образом, дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae. Все остальные аспекты, касающиеся типа вирусов, положения делеции в гене капсида, способа получения клеточной линии, экспрессирующей мутантные белки и белки дикого типа Flaviviridae, типа репликона и мутаций внутри репликонов и модификаций генов, кодирующих мутантные белки и белки дикого типа Flaviviridae, такие, как описано выше. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, полученный способом, описанным выше. Настоящее изобретение также относится к способу защиты индивида от инфекций, возникающих при контакте с Flaviviridae, путем введения в организм индивида иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, при этом композиция индуцирует в организме индивида иммунный ответ на Flaviviridae, защищая таким образом индивида от инфекций. Эта композиция может доставляться в организм внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно, внутримышечно, перорально или интраназально. Кроме того, индивидом, для которого введение такой композиции может быть эффективно, является человек или животное. При использовании в настоящем описании единственного числа следует понимать, что его использование подразумевает и множественное число. При использовании в формуле изобретения в сочетании со словом содержащий единственное число также включает и множественное. При употреблении в настоящем описании слова другой оно может обозначать, по крайней мере, второй, тот же самый или отличный элемент пункта формулы изобретения или его компонентов. При употреблении в настоящем описании под термином Flaviviridae понимают род Flavivirus, Hepacivirus и Pestivirus. Примеры вирусов, принадлежащих роду Flavivirus, включают, но ими не ограничиваются, вирус желтой лихорадки,вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита СентЛуиса, вирус японского энцефалита или вирус энцефалита долины Мюррей. Также примеры вирусов,принадлежащих роду Hepacivirus, включают, но ими не ограничиваются, вирус гепатита С, а примеры вирусов, принадлежащих роду Pestivirus, включают, но ими не ограничиваются, вирусную диарею коров,вирус свиной лихорадки или вирус холеры свиней. Кроме того, несмотря на то, что в настоящем изобретении описано конструирование и применение дефектного по репликации псевдоинфекционного Flaviviridae, средний специалист в данной области может, используя те же принципы, сконструировать химеры, содержащие другие вирусы семействаFlaviviridae, или сконструировать химеры путем обмена кассет prM-Е между вирусами, принадлежащими к Flaviviridae, или другими сходными вирусами и вирусами, принадлежащими к Flaviviridae. Фармацевтические композиции, содержащие дефектные по репликации псевдоинфекционные вирусы семейства Flaviviridae, описанные в настоящем изобретении, могут использоваться одновременно или последовательно в сочетании друг с другом или с другими фармацевтическими композициями. Эффект совместного приема таких композиций состоит в защите индивида от инфекций, вызванными такими вирусами, а также других заболеваний, лечение которых с помощью вакцин может быть эффективно. Композиция, описанная в настоящем изобретении, другая композиция или их комбинации может приниматься независимо друг от друга, системно или местно, любым способом, известным из уровня техники,как, например: подкожно, внутривенно, парентерально, внутрибрюшинно, чрескожно, внутримышечно,наружно, энтерально, ректально, назально, защечно, вагинально, путем ингаляции спрея, с помощью насоса, или содержаться в трансдермальном пластыре или импланте. Состав композиции, описанной в настоящем изобретении, может включать общепринятые нетоксичные, физиологически или фармацевтически приемлемые носители, подходящие для способа введения и хорошо известные среднему специалисту-8 016490 в данной области. Композиция, описанная в настоящем изобретении, другая фармацевтическая композиция или их комбинации может вводиться независимо один или более раз с целью достижения, закрепления и улучшения терапевтического эффекта. Определение дозы, а также содержания подходящей дозы одной или обеих композиций в одной или нескольких дозах для приема находится в пределах компетенции специалиста. Подходящая доза рассчитывается исходя из состояния здоровья пациента, степени защиты пациента от флавивирусных инфекций, способа применения и используемой формулы. Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение хорошо приспособлено для выполнения поставленных задач и достижения упомянутых в настоящем изобретении целей и преимуществ, а также подразумеваемых задач, целей и преимуществ. Специалист в данной области может принимать решения, связанные с изменениями и другими способами употребления, охватываемыми сущностью изобретения, определяемыми рамками формулы изобретения. Пример 1. Культуры клеток. Клетки BHK-21 были предоставлены Полом Олайво (Paul Olivo, Washington Unversity, St. Louis,Mo). Клетки растили в минимальной среде(MEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и витаминов. Клетки Vero, сертифицированные ВОЗ (WHO), были предоставлены д-ром Стивом Уайтхедом (Dr. Steve Whitehead, NIH) . Клетки Vero растили в среде MEM, содержащей 6% FBS. Пример 2. Плазмидные конструкции. Для получения плазмидных конструкций использовались стандартные приемы работы с рекомбинантной ДНК. Схематическое изображение использовавшихся плазмид приведено на фиг. 7 А-7 Е. Карты и последовательности плазмид приведены на фиг. 8 А-8F. Родительская низкокопийная плазмидаpACNR/FLYF-17Dx, содержащая инфекционную кДНК генома штамма 17D YFV, была описана ранее(Bredenbeek et al, 2003); плазмида была предоставлена д-ром Чарльзом М. Райсом (Dr. Charles M. Rice,Rockefeller University, New York, N.Y.). pYFPIV содержала дефектный геном YFV (YF PIV), в котором фрагмент, кодирующий аминокислотные остатки 26-93 гена капсида YF, был заменен на кодоноптимизированный ген GFP, полученный из pEGFP-N1 (производство Clontech). Геном WN PIV(pWNPIV) был получен из инфекционной кДНК Texas 2002 (Rossi et al., 2005) путем слияния кодона 30 гена С с кодоном 101 гена С (см. фиг. 5 А). Плазмиды pVEErep/C1/Pac, pVEErep/C2/Pac и pVEErep/CprM-E/Pac (фиг. 2 А) кодировали двойные субгеномные репликоны VEEV, в которых первый субгеномный промотер регулировал транскрипцию РНК, содержащей 5'-UTR VEEV 26S РНК, за которой следовали последовательности, соответствующие нуклеотидам 119-481, 199-541 и 119-2452 генома YFV в указанном порядке. Второй субгеномный промотер регулировал экспрессию гена пуромицинацетилтрансферазы (Рас), продукт которого делает клетки резистентными к остановке трансляции, вызванной пуромицином (Pur). Нецитопатические репликоны VEEV, экспрессирующие кассету C-prM-EWNV полученные из репликона вируса Синдбис (Scholle et al., 2004), слитую с геном Рас (обозначенную pVEErep/C-E-Pac), были получены из нецитопатического репликона VEE (Petrakova et al., 2005); последовательность, кодирующая Е, была слита с геном Рас посредством линкера, состоящего из первых 9 кодонов NS1 и последних 25 кодонов NS2B, за которыми следовали 2 кодона NS3, слитых напрямую сFMDV 2A (см. фиг. 5 А). Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая капсид YFV 17D и первые 20 аминокислотных остатков prM, была получена с использованием данных частот кодонов, описанных ранее (Haas et al., 1996). Этот ген был синтезирован с помощью полимеразной цепной реакции из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов. Амплифицированный фрагмент секвенировали перед клонированием в кассеты экспрессииVEErep/C2opt/Pac и VEErep/Copt/prM-E/Pac. Последние репликоны имели строение, сходное сpVEErep/C2/Pac и pVEErep/C-prM-E/Pac, но содержали кодон-оптимизированную последовательность,представленную на фиг. 4 А. Кроме того, был получен химерный WN-RepliVAX, экспрессирующий prM-E JEV. Это было достигнуто путем замены генов prM и Е штамма Накаяма JEV в A RepliVAX, кодирующем геном WNV. Обмен генами производился путем прямого слияния последнего кодона процессированного белка СWNV с первым кодоном последовательности, кодирующей prM JEV (штамм Накаяма). Эта же схема слияния была применена на 3'-конце кассеты, где последний кодон белка Е JEV сливался напрямую с первым кодоном NS1 WNV. Слияние производили на плазмиде ВАС, кодирующей полную последовательность кДНК RepliVAX WN, ограниченную промотором Т 7 и рибозимом, и РНК, полученная с этой ДНК ВАС, была введена в клетки BHK(VEErep/Pac-Ubi-C). Полученный RepliVAX (обозначенный JERepliVAX) формировал фокусы распространения инфекции в BHK(VEErep/Pac-Ubi-C). Что касаетсяWN RepliVAX, фокусы, формирующиеся на этой клеточной линии, имели меньший размер, чем фокусы,продуцируемые полностью инфекционной химерой WNV-JEV. JE RepliVAX росли до значений титров,приблизительно в 10 раз ниже титров WN RepliVAX, титр в BHK(VEErep/Pac-Ubi-C) достигал 106 ед./мл. Как и ожидалось, JE RepliVAX связывается с моноклональными антителами, специфичными к JE,и предполагается, что как и химерные флавивирусы JE RepliVAX будет индуцировать высокие титры-9 016490 антител, нейтрализующих JEV, и, как следствие, предохранять от JE. Пример 3. Транскрипция РНК. Плазмиды очищали путем центрифугирования в градиенте CsCl. Перед реакцией транскрипции плазмиды линеаризовали с помощью XhoI (для pYFPIV) или MhuI (для репликона VEE и плазмид, кодирующих хэлпер VEE) или SwaI (для WNPIV). РНК синтезировали с помощью SP6 или Т 7 РНКполимеразы в присутствии аналога кэпа. Выход и целостность транскриптов анализировали методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. Аликвоты транскрипционной реакции использовали для электропорации без дополнительной очистки. Пример 4. Трансфекции РНК и анализ репликации PIV. Электропорация клеток BHK-21 проводили в условиях, описанных ранее (Liljestrom et al., 1991). Для получения пакующих клеточных культур в среду добавляли Pur в концентрации 10 г/мл через 24 ч после электропорации репликонов VEEV. Трансфекцию синтезированного in vitro генома YF PIV проводили 5 дней спустя, когда клетки, содержащие репликон, возобновляли результативный рост. Образцы собирали в моменты времени, указанные на чертежах, путем замены среды на такую же среду, содержащую Pur. Во многих экспериментах клетки, секретирующие PIV, рассаживали по достижении конфлюэнтного монослоя. Репликоны VEEV упаковывали в инфекционные вирионы VEEV путем коэлектропорации репликона, синтезированного in vitro, и 2 РНК-хэлперов (Volkova et al., 2006) в клетки BHK-21. Вирусные частицы, содержащие репликон, собирали через 24 ч после трансфекции и использовали для инфицирования наивных клеток BHK-21 с последующей селекцией Pur. В случае WN PIV, РНК PIV, синтезированную invitro, трансфицировали в клетки BHK, содержащие репликон VEErep/C-E-Pac, экспрессирующий WN С, prM и Е и Рас [клетки BHK(VEErep/C-E-Pac)]. Схема генома VEErep/C-E-Pac представлена на фиг. 5 А. Собранные PIV пассировались на эти клетки с использованием стандартных способов (Rossi etal., 2005). Пример 5. Измерение титров YF PIV. Для измерения титра вышедших YF PIV, клетки BHK-21 рассаживали в 6-луночные планшеты производства Costar в концентрации 5105 клеток на лунку. Через 4 ч клетки инфицировали различными разведениями упакованных репликонов и через 1 ч инкубации при 37 С и 5% CO2 клетки покрывали 2 мл среды MEM, содержащей 10% FBS. Количество инфицированных клеток определяли путем подсчета клеток, дающих положительную реакцию на GFP под инвертированным УФ-микроскопом. Долю инфицированных клеток от исходного количества определяли путем подсчета флуоресцирующих клеток в определенной области поля зрения микроскопа. Подсчеты по 5 различным полям усредняли и пересчитывали для титра, соответствующего каждому последовательному разведению. В последующих экспериментах титры также измеряли с помощью анализа бляшек на монослойных клетках BHK-21, несущих репликон VEErep/Copt-prM-E/Pac, в условиях, описанных ранее (Lemm et al., 1990), за исключением того, что клетки инкубировали под слоем агарозы в течение 5 дней для развития бляшек, затем фиксировали 2,5%-ным раствором формальдегида и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Пример 6. Пассирование YF PIV. Пакующие клеточные линии получали с помощью трансфекции синтезированной in vitro РНК репликона VEEV или инфекции клеток теми же репликонами, упакованными в структурные белки VEEV, с множественностью инфекции (MOI) 10 инф. ед. на клетку. После селекции Pur клетки инфицировали YFPIV при различных MOI. Образцы собирали в моменты времени, указанные на чертежах, путем смены среды. Пример 7. Анализ продукции YF SVP. Клетки BHK-21 рассаживали в концентрации 2106 клеток на 100-миллиметровую чашку. После 4 ч инкубации при 37 С клетки инфицировали YF PIV с MOI, равной 10 инф. ед. на клетку, и затем инкубировали в течение 24 ч в 10 мл MEM с добавлением 10% FBS. Далее среду заменяли на 10 мл бессывороточной среды VP-SF (производство Invitrogen), которую меняли раз в 24 ч для анализа выхода SVP. Собранные образцы VP-SF очищали путем центрифугирования на низких скоростях (5000 об/мин, 10 мин,4 С) и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования через 2 мл 10%-ного раствора сахарозы вPBS, в роторе SW-41 при 39000 об/мин, 4 С, в течение 6 ч. Осадочный материал растворяли в наносном буфере для SDS-полакриламидного гель-электрофореза в отсутствие -меркаптоэтанола (чтобы сохранить сайт связывания с моноклональными антителами D1-4G2) и анализировали далее методом Вестернблоттинга. После переноса белков нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с моноклональными антителами D1-4G2 и вторыми антителами осла против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена(HRP) (производство Santa Cruz Biotechology). Активность HRP определяли с использованием реагента Люминола для Вестерн-блотов согласно указаниям производителя (Santa Cruz Biotechnology). Чтобы получить образцы, служащие положительным контролем, YFV (2108 бляшкообразующих единиц) центрифугировали сквозь 10%-ную сахарозную подушку, как описано ранее для SVP. Для анализа YFV SVP методом градиента сахарозы клетки BHK-21 электропорировали синтезированной in vitro геномной РНК YF PIV. Через 24 ч после трансфекции полную среду MEM заменяли на- 10016490 среду VP-SF, которую собирали через 24 ч. К этому времени более 95% клеток имели положительную реакцию на GFP и не проявляли никаких признаков цитопатического эффекта. Собранные образцы очищали центрифугированием на низких скоростях (5000 об/мин, 10 мин, 4 С) и затем концентрировали центрифугированием в течение ночи в роторе SW-28 при 25000 об/мин, 4 С. Полученный осадок суспендировали в буфере TN (10 нМ Tris-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 0,1% BSA) и проводили дальнейший анализ по описанной ранее методике (Schalich et al., 1996). Вкратце, образцы объемом 0,5 мл помещали в прерывистый сахарозный градиент (1,5 мл 50%, 1,5 мл 35% и 1,5 мл 10%-ного раствора сахарозы в буфере PBS). Центрифугирование проводили в ротореSW-55 при 45000 об/мин и 4 С в течение 1 ч на ультрацентрифуге Optima MAX Ultracentrifuge (производство Beckman). Осадки растворяли в буфере для нанесения на SDS-полиакриламидный гель для проведения электрофореза без -меркаптоэтанола (чтобы сохранить связывание с моноклональными антителами D1-4G2) и анализировали методом Вестерн-блоттинга. После переноса белков, нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с моноклональными антителами D1-4G2 и вторыми антителами осла против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), приобретенными у Santa Cruz Biotechnology. Активность HRP определяли с помощью реагента люминола для Вестерн-блотов согласно рекомендациям производителя (SantaCruz Biotechnology). Параллельный градиентный анализ проводили на YFV(2108 бляшкообразующих единиц, PFU), подвергнутом процедурам, описанным выше для SVP, полученных из YFV-PIV. Пример 8. Анализ WN PIV. Титры WN PIV определяли путем инфицирования монослойных клеток Vero последовательными разведениями вируса, фиксацией спустя 24 ч и иммуногистохимического окрашивания поликлональной гипериммунной мышиной асцитной жидкостью, специфичной к WNV, как описано ранее (Rossi et al.,2005). Инфицированные клетки подсчитывали и использовали для определения титра. Чтобы оценить способность WN PIV к формированию фокусов на клетках Vero или BHK(VEErep/C-E-Pac), монослойные культуры инфицировали разведениями WN PIV, покрывали полутвердым трагакантом, инкубировали при 37 С, затем фиксировали и окрашивали моноклональными антителами, специфичными кWNV NS1 (предоставлены Е. Konishi, Kobe, Japan) как описано выше. Пример 9. Исследования безопасности PIV. Безопасность PIV исследовали путем инокуляции различных доз вируса (инфекционные кДНК, полученные из родительских инфекционных штаммов YFV 17D или WNV TX02) или PIV мышам в возрасте 3-4 дней (аутбредные Swiss Webster, Harlam) интракраниально (i.c) (объем 20 мл) или самкам мышей в возрасте 4-5 недель (аутбредные Swiss Webster, Harlam) внутрибрюшинно (i.p.) (объем 100 мл). За признаками заболевания и смертностью мышей наблюдали в течение 14 дней, агонизирующих животных,которые очевидно не доживали до следующего дня, умерщвляли гуманным способом и засчитывали как мертвых на следующий день. Пример 10. Исследования действенности и эффективности PIV WN. Выбранных животных, инокулированных WN PIV, как описано выше, умерщвляли и спускали кровь через 21 день после инокуляции. У животных собирали сыворотку, смешивали и проверяли на способность ослаблять образование фокусов WNV на монослойных клетках Vero, используя методы,описанные выше. Остальных животных инокулировали 1000 инф. ед. (определено с помощью теста на образование фокусов на клетках Vero), что соответствовало примерно 100 LD50 штамма ND99 WNV(Xiao et al., 2001), и животных наблюдали в течение 14 дней, как описано выше. Пример 11. Кассеты, экспрессирующие как YFV С, так и YFV С-prM-E, могут комплементировать репликацию YFV PIV. Общая стратегия комплементации дефекта, вызванного делецией С в геноме флавивируса, приведена на фиг. 1. Эта стратегия основана на получении геномов с отсутствующим геном С и размножении этих псевдоинфекционных вирусных геномов (PIV-геномы) в клетках, экспрессирующих С (или все вирусные структурные белки), но не в нормальных клетках. Репликация в последних клетках, продуцирующих невирусные структурные белки, необходимые для транс-комплементации дефекта генома PIV,приводит к высвобождению SVP, содержащих критический защитный иммуноген Е, но не содержащих нуклеокапсид, содержащий С и генетический материал. Был создан рекомбинантный геном YFV (геном YFV PIV), содержащий GFP вместо аминокислотных остатков 26-93 С, клонированный в той же рамке считывания, что и остальная часть полипептида(фиг. 2 А). Экспрессия GFP предоставляет удобный способ экспериментального определения титров PIV,содержащих геном. Ожидалось, что делеция последовательности, кодирующей С, из этого генома PIV ликвидирует способность С к образованию функционального нуклеокапсида, но не повлияет на продукцию функциональных форм prM и Е. Таким образом, клетки, экспрессирующие этот геном, продуцирующие флуоресценцию GFP, неспособны к высвобождению инфекционного вируса. Однако ожидалось,что "пакующие" клетки, экспрессирующие С на высоком уровне, будут производить инфекционное потомство. Для быстрого получения клеточных линий для эффективной продукции PIV использовали систему- 11016490 экспрессии, основанную на геноме вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV) (репликоны)(Petrakova et al., 2005). Репликоны VEEV обладают меньшим цитопатическим эффектом, чем репликоны,полученные из других альфавирусов, и в некоторых клеточных линиях, полученных от позвоночных и насекомых, легко устанавливается их персистирующая репликация. Кассеты экспрессии были разработаны в виде двойных субгеномных конструкций (см. фиг. 2 В), в которых один из субгеномных промоторов регулировал экспрессию Рас, предоставляя, таким образом, эффективный способ элиминации клеток, не содержащих репликона VEEV, экспрессирующего Рас, из трансфицированных культур. Второй субгеномный промотор регулировал транскрипцию субгеномной РНК, кодирующей структурные белки YFV. Для определения наиболее эффективных пакующих кассет репликоны VEEV, кодирующие i) YFV С с сигнальным пептидом prM, также известный как заякоренный в мембране С (Lindenbach and Rice, 2001)(VEErep/C2/Pac), или iii) все структурные белки YFV (VEErep/C-prM-Е/Рас). Дизайн этих кассет основывался на сохранении в кассетах, кодирующих С, сигнального пептида, предположительно необходимого для направления С в надлежащий клеточный компартмент. РНК репликонов VEEV, синтезированные in vitro, трансфицировали в клетки BHK-21, и стабильные клеточные линии, устойчивые к Pur, селектировались в течение 4-5 дней в среде, содержащей Pur. В течение первых 2-3 дней после трансфекции репликация полученной из РНК VEEV приводила к остановке роста, затем, как было описано ранее (Petrakova et al., 2005), эффективность репликации снижалась, и клетки возобновляли рост. Полученные Pur-резистентные культуры трансфицировали синтезированными in vitro РНК репликонов YF PIV и определяли титры вышедших инфекционных частиц, содержащих GFP-экспрессирующие геномы, в различные моменты времени после инфекции (фиг. 2 С). Как оказалось, присутствие двух различных реплицирующихся РНК (специфичных для YFV и VEEV) в клетках BHK-21 не приводило к цитопатическому эффекту (СРЕ) и обуславливало как резистентность к Pur,так и высокий уровень экспрессии GFP, что подтверждало репликацию обоих репликонов VEEV и РНКYF PIV. Как показано на фиг. 2 С, культуры, экспрессирующие оба этих маркерных гена, были способны к росту и требовали пересадки (в разведении 1:5 каждые 4 дня), чтобы предотвратить образование конфлюэнтного монослоя. Результаты экспериментов, представленные на фиг. 2, показывают, что все три репликона VEEV оказались способны продуцировать YFV С на уровне, достаточном для образования инфекционных PIV; наивные клетки BHK-21, трансфицированные РНК YF PIV в отсутствие репликоновVEEV, не продуцировали инфекционных частиц (не показано). Однако клетки, экспрессирующие эти пакующие кассеты, различались по своей способности продуцировать PIV. Конструкции, экспрессирующие С с сигнальным пептидом prM (заякоренный в мембране С; VEErep/C1/Pac), продемонстрировали самый низкий уровень упаковки РНК YF PIV по сравнению с кассетами, экспрессирующими более длинные белковые последовательности. Причина более низкой пакующей эффективности конструкции С 1 остается неясной, но этот феномен может объясняться необходимостью в специфическом порядке расщепления по двум близлежащим сайтам расщепления (NS2/NS3 и сигнальной пептидазой)(Yamshchikov and Compans, 1994) и/или разницей в распределении и стабильности белка С, продуцированного в двух разных контекстах стабильности этого белка. Таким образом, после проведения этих экспериментов VEErep/C1/Pac был исключен из всех дальнейших экспериментов. Оба репликонаVEErep/C2/Pac и VEErep/C-prM-E/Pac упаковывали YF PIV до сходных титров, достигавших более 107 инф.ед./мл. Кроме того, выход PIV-частиц продолжался до окончания эксперимента, при этом каждая клетка высвобождала около 20 YF PIV за период времени, равный 24 ч. Вероятно, что эти клетки высвобождали также SVP, содержащие prM/Е и не содержащие нуклеокапсид и геном, но эта возможность далее не исследовалась. Пример 12. YF PIV с дефектным геномом могут производиться в больших масштабах. В конечном счете, применимость PIV в качестве вакцин-кандидатов зависит от возможности получения этих частиц в количестве, необходимом, например, для коммерческого производства. Уверенность в системе, основанной на транскомплементации РНК (репликоны VEEV), для производства вакцин требует выработки дальнейших стандартов, поскольку существует возможность накопления мутаций в гетерологичных генах, клонированных в геномы РНК-вирусов. Использование клеточных линий ранних пассажей является одним из возможных вариантов решения этой проблемы. С другой стороны, аккумуляция мутаций в геномах VEErep может быть сведена к минимуму с помощью повторных трансфекций репликона в наивные клетки или с помощью продукции упакованных репликонов VEEV и последующей инфекции наивных клеток. Использование пакующих репликонов VEE считалось самым простым и эффективным способом получения пакующих клеточных линий. Для эффективной продукции PIV использовали технологию получения культур клеток, экспрессирующих репликоны альфавируса, в предварительно упакованых репликонах VEEV. Вкратце, репликоныVEEV упаковывались в инфекционные вирионы VEEV при помощи описанной ранее системы двух хэлперов (Volkova et al., 2006), в препараты, содержащие титры, достигающие 109 инф. ед./мл. Клетки BHK21, инфицированные этими частицами и селектированные в присутствии Pur, могли использоваться для получения клеточных культур, кодирующих структурные белки YFV, через 3-5 дней. После получения клеточные линии, содержащие VEErep/C2/Pac и VEErep/C-prM-E/Pac, инфицировали ранее полученными- 12016490 образцами YF PIV с высокой (10 инф.ед. на клетку) и низкой (0,1 инф. ед. на клетку) величиной MOI. В всех случаях дефектные YFV реплицировались продуктивно (см. фиг. 3) и инфицировали все клетки монослоев, производящих высокие титры PIV. Таким образом, получение пакующих клеточных линий путем инфекции клеток упакованными репликонами VEEV с последующей инфекцией PIV производит впечатление простой и эффективной системы, подходящей для широкомасштабного производства PIV с делетированной последовательностью С в геноме. Пример 13. YF PIV, использующие репликоны VEEV, содержащие кодон-оптимизированную форму гена YFV С. Еще одна вероятная проблема, связанная с использованием пакующих систем для поддержки репликации дефектных вирусов, заключается в рекомбинации дефектного вирусного генома и РНК, кодирующей транс-комплементирующий ген (гены). Такая рекомбинация может привести к возникновению инфекционных вирусов. В экспериментах, описанных в настоящем изобретении, тест на образование бляшек ни разу не выявил инфекционных YFV, но было необходимо исключить возможность появления живого вируса в этих клетках. Кроме того, считается, что эволюция белков, кодируемых многими вирусами, переносимыми членистоногими, была направлена на использование трансляционного аппарата двух весьма различных хозяев. Следовательно, нельзя ожидать использования кодона, оптимального для экспрессии в одном из хозяев. Таким образом, последовательность, кодирующая С в кассетах экспрессии, была модифицирована для двух целей: i) повысить уровень продукции С и ii) понизить вероятность гомологичной рекомбинации между геномом YF PIV и последовательностью, кодирующей С, в составе субгеномной РНК репликонов VEE. YFV С синтезировали с использованием частот кодонов, обнаруженных в наиболее эффективно транслирующихся генах млекопитающих (фиг. 4 А). Такие молчащие мутации также нарушали последовательность циклизации, необходимую для репликации генома флавивируса, таким образом,снижая вероятность образования способного к репликации YFV в результате рекомбинации между геномом YF PIV и РНК, кодирующей С, в составе репликона VEEV. Ген Copt клонировали в конструкции VEErep, VEErep/Copt/Pac и VEErep/Copt-prM-E/Pac, используя ту же стратегию, что при получении VEErep/C2/Pac и VEErep/C-prM-E/Pac, и транскомплементирующие Pur-резистентные клеточные линии получали путем трансфекции РНК или инфекции клеток упакованными РНК. Трансфекция этих клеток синтезированной in vitro геномной РНК PIV позволяла получить PIV с эффективностью, сравнимой с таковой у клеток, экспрессирующих репликоныVEEV, экспрессирующие неоптимизированный ген С (фиг. 4 В). Однако клетки, экспрессирующие кодон-оптимизированный С, оказались удобным реагентом из-за своей склонности к развитию цитопатического эффекта и формированию хорошо заметных бляшек при инфекции YF PIV и покрывании агарозой,содержащей среду с низкой концентрацией FBS (фиг. 4 С). Таким образом, хотя кодон-оптимизация гена С YFV не приводила к изменениям продукции PIV этими клетками, клетки, экспрессирующие кодоноптимизированный YFV С, представляют собой очень удобную систему для оценки YF PIV, особенно не экспрессирующих флуоресцентные маркеры. В дополнительных экспериментах наблюдалась очень хорошая корреляция между титрами одних и тех же образцов, определенными с помощью анализа формирования бляшек и с помощью анализа фокусов клеток, положительных на GFP. Бляшки, образованные YF PIV, были меньшего размера, чем бляшки, образованные YFV, показывая, что структурные белки, продуцируемые in cis, по всей вероятности, являются более эффективными для построения вирусных частиц. Каким образом достигается способность образовывать бляшки, до сих пор полностью не выяснено. Однако предполагается, что YFV С обладает некоторым уровнем цитотоксичности, поскольку клеточные линии, содержащие репликоны VEEV, экспрессирующие кодоноптимизированную версию данного белка, имели более низкие показатели роста, чем аналогичные клетки с репликоном, содержащим природный ген С. Таким образом, репликация генома YF PIV может приводить к дополнительным изменениям во внутриклеточном пространстве, достаточным для возникновения цитопатического эффекта. Пример 14. PIV могут быть получены из других флавивирусов. Чтобы доказать, что PIV могут быть легко получены из других флавивирусов, стратегию, описанную выше, применяли к WNV. Для этого был сконструирован геном WN PIV с белком С, состоящим из 35 аминокислотных остатков (фиг. 5 А). Для упаковки этого генома WN PIV использовалась пакующая клеточная линия, полученная путем трансфекции клеток BHK нецитопатическим репликоном VEEV,экспрессирующим WNV C/prM/E и Рас [BHK(VEErep/C-E-Pac)]. Чтобы минимизировать вероятность того, что рекомбинация между геномами WN PIV, реплицирующимися в этой клеточной линии, и белком С, кодируемым РНК VEErep, может привести к возникновению инфекционного WNV, ген, кодирующий С в составе репликона VEEV, был модифицирован так, чтобы он содержал кластеры молчащих мутаций в домене циклизации WNV. Среда, собранная с клеток BHK (VEErep/C-E-Pac), трансфицированных синтетическим геномомWN PIV, оказалась способна вызывать образование антиген-позитивных фокусов на пакующих клетках(фиг. 5 В), что подтверждало продукцию инфекционных WN PIV. Однако после инфекции монослойных клеток Vero теми же образцами обнаруживались только антиген-позитивные клетки (фиг. 5 С). Титр WNPIV в пакующих клетках достигал 1108 инф. ед./мл, и, как и ожидалось, на этой клеточной линии WNPIV может быть многократно пассирован. Таким образом, при использовании полученной клеточной линии могут быть легко получены стоки WN PIV с высоким титром с использованием такой же системы комплементации, как при работе с YFV. Интересно, что в случае подходящей для WNV пакующей клеточной линии и WN PIV было отмечено, что выход вируса достигал плато через некоторое время после инфекции одновременно с проявлением цитопатического эффекта (не показано), в то время как клетки,кореплицирующие геном YF PIV и репликоны VEEV продолжали продуцировать PIV в течение многих дней (фиг. 2). Пример 15. Клетки, инфицированные YF или WN PIV продуцируют SVP. Чтобы показать, что клетки, инфицированные PIV, продуцируют SVP, клетки BHK-21 трансфицировали синтезированной in vitro РНК YF PIV или инфицировали YF PIV, продуцированными клетками,экспрессирующими С. Частицы, полученные из клеток BHK-21, очищали с помощью ультрацентрифугирования и анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител (МАВ), специфичных к Е (D1-4G2) (Gentry et al., 1982). Как клетки, трансфицированные РНК, так и клетки, инфицированные PIV, продуцировали белок Е, осаждающийся из среды (фиг. 6 А), что показывает, что он находился в корпускулярной форме. Поскольку эти клетки не проявляют признаков цитопатического эффекта, а образцы очищались путем центрифугирования на низких скоростях перед ультрацентрифугированием, маловероятно, чтобы белок Е, обнаруженный в осадке, представлял из себя клеточный дебрис. Сходным образом, Вестерн-блот-анализ показал, что клетки Vero, инфицированные WNPIV, продуцировали (до проявления цитопатического эффекта) внеклеточные формы Е, неотличимые по размеру от продуцированных клетками Vero, инфицированными WNV (фиг. 6 В). Для дальнейшей оценки физической природы белка Е, высвобождаемого клетками, инфицированными PIV, среда, собранная с клеток, содержащих только реплицирующиеся геномы PIV, была проанализирована с помощью метода градиента плотности сахарозы в соответствии с опубликованными данными (Schalich et al., 1996). SVP обнаруживались во фракции, содержащей 2% сахарозы (фиг. 6 С). В том же самом эксперименте вирионы YFV демонстрировали высокую плотность и обнаруживались во фракции, содержащей 42% сахарозы. Также в культурах, инфицированных WNV PIV, были обнаружены частицы, содержащие белок Е, мигрирующие на уровне размера WNV SVP. Присутствие Е в среде клеток,инфицированных PIV, согласуется с продукцией SVP клетками, экспрессирующими только prM/Е илиTBEV РНК-вакцины, не содержащими функционального гена С. Пример 16. Безопасность, мощность и эффективность PIV для животных. Безопасность WN и YF PIV определяли путем интрацеребральной инокуляции пометов 3-4 дневных мышей. Эти исследования показали, что мыши, инокулированные WT YFV или WNV, быстро погибали, и 50%-ная летальная доза этих вирусов (LD50) для этих животных составила приблизительно 1PFU (табл. 1). Однако инокуляция мышат-сосунков WN и YF PIV в дозировке 2106 инф. ед. не приводила к смерти ни одного животного (табл. 1). Далее безопасность была подтверждена путем внутрибрюшинной инокуляции взрослым мышам вирусов дикого типа (wt) и WN PIV. Данные исследования показали, что WN PIV оказались абсолютно безопасными для взрослых мышей (табл. 2). Кроме того, wt WNT привел к гибели значительной части взрослых мышей, его LD50 составила менее 1 PFU, в то время как дозы до 3106 инф. ед. WN PIV не вызывали гибели животных (табл. 2). Наиболее же интересным был тот факт, что WN PIV оказались чрезвычайно мощными иммуногенами (титры нейтрализующих антител обнаруживались при инокуляции всего лишь 30000 инф. ед.), и 100% животных, вакцинированных 3104,3105 или 3106 инф. ед. при контрольном заражении 100 LD50 штамма NY99 WNV, оказались защищенными от вируса (табл. 2). Таблица 1 Безопасность PIV для мышат-сосунковb - введенный внутрибрюшинно в объеме 20 мл/животное,с - выживаемость через 14 дней после инокуляции (живых/мертвых),d - среднее время выживания животных, умерших от инфекции (стандартное отклонение),е - неприменимо. Таблица 2 Безопасность, мощность и эффективность PIV для взрослых мышей а - инокулируемый препарат, разведенный в культуральной среде, содержащей 10% FBS,b - введенный внутрибрюшинно в объеме 100 мл/животное,с - выживаемость через 14 дней после инокуляции (живых/мертвых),d - среднее время выживания животных, умерших от инфекции (стандартное отклонение),е - титр нейтрализующих антител в объединенной сыворотке крови 2 животных через 21 дней после инокуляции (приведенный титр - наибольшее разведение, дающее 80%-ное уменьшение образования фокусов WNV),f - защита от контрольного заражения 100LD50 штамма NY99 WNV, проиллюстрированная количеством выживших животных через 14 дней после контрольного заражения; единственное выжившее животное из группы, инокулированной разбавителем, проявляло признаки заболевания (сгорбленная спина,взъерошенная шерсть, общее недомогание) в дни 8-14. Ни одно из животных, инокулированных PIV, не проявляло признаков заболевания в течение 14-дневного наблюдаемого периода после контрольного заражения,g - неприменимо,h - титры нейтрализующих антител в сыворотке крови неиммунизированных мышей при параллельном анализе с сывороткой крови мышей, инокулированных PIV. Пример 17. Дальнейшие модификации с целью повышения выхода и безопасности PIV/RepliVAX. В настоящем изобретении продемонстрировано, что многократное пассирование RepliVAX не приводило к рекомбинации, но отбирались варианты, характеризующиеся более быстрым ростом: WNVRepliVAX многократно пассировали на клеточной линии, кодирующей белок С WNV. Этот белок С был получен путем слияния копии гена С WNV с геном Рас, регулируемым субгеномным промотором нецитопатического VEErep (Petrakova et al., 2005). В получившейся конструкции (VEErep/Pac-Ubi-C) ген убиквитина (Ubi) был вставлен перед геном С, а за геном С следовал стоп-кодон. В таком контексте слитый белок Pac-Ubi будет продуцироваться вместе со зрелым белком С (не содержащим гидрофобного якоря, см. фиг. 9). Ген С в этом VEErep (обозначенный С) далее модифицировали путем вставки 36 мутаций, удаляющий сигнал последовательности циклизации, таким образом, этот регион, содержащий 11 нуклеотидов, превращался из GUCAAUAUGCU (SEQ ID NO: 2) в GUgAAcAUGuU (SEQ ID NO: 3),сохраняя при этом кодирующие способности С. Такое большое число мутаций резко снижает вероятность гомологичной рекомбинации и, кроме того, если рекомбинация между геномами все же имеет место, продукции генома, активного по репликации, не происходит из-за несовпадения кодирующих последовательностей РНК, что делает репликацию невозможной (фиг. 9). Чтобы исследовать маловероятную возможность продуктивной репликации, из клеток линии BHK21, экспрессирующих VEErep/Pac-Ubi-C BHK(VEErep/Pac-Ubi-C), была получена линия клеток клонального происхождения, и эту линию клеток использовали для десятикратного пассирования WNRepliVAX (в каждом случае при уровне инфекции MOI=0,01), и полученные RepliVAX были детально охарактеризованы. Чтобы определить, содержала ли популяция пассажа 10 (р 10) живые вирусы, монослойные клетки Vero инфицировали WN RepliVAX 10 пассажа при множественности инфекции, равной 0,1, 1 и 10, и тщательно отмывали от внеклеточных RepliVAX. Эти монослойные культуры промывали еще раз спустя 24 ч и собирали среду спустя 2 дня. При переносе культуральной жидкости от этих культур на свежие культуры клеток Vero не обнаруживалось иммунопозитивных клеток при окраске высокочувствительными поликлональными антителами к WNV, что показывало, что продуктивная рекомбинация RepliVAX с белком С, кодируемым пакующей клеточной линией, не имела место.- 15016490 Интересно, что при сравнении р 10 WN RepliVAX с р 0 RepliVAX на клеточной линииBHK(VEErep/Pac-Ubi-C), р 10 RepliVAX вызывали образование полиморфных фокусов инфекции, многие из которых были значительно больше фокусов, продуцируемых р 0 RepliVAX (фиг. 10). Кроме того,р 10 RepliVAX реплицируются в 10 раз больше чем р 0 RepliVAX в ранние моменты времени, и их конечный титр оказывается в два раза большим. Анализ продуктов PCR, полученных из кДНК, продуцированной клетками Vero, инфицированными этими р 10 RepliVAX, показал, что среди них не присутствовало ни одного продукта, содержащего полноразмерную область, кодирующую С. Однако анализ последовательности соединения С-prM в продукте, содержащем эту область, показал возникновение двух мутаций в процессе пассирования. Как и ожидалось, исходя из гетерогенной природы фокусов, продуцируемых p10 RepliVAX на пакующих клетках(фиг. 10), обе мутации присутствовали в виде смеси с исходной последовательностью RepliVAX. Одна из мутаций, обнаруженная в половине популяции нуклеиновых кислот в этих реакциях секвенирования (секвенированных в обоих направлениях), представляла собой мутацию AGCuGC (SC) в положении Р 4 перед сайтом расщепления сигнальной пептидазой (S (с)VGAVTLS (SEQ ID NO: 4) в геноме RepliVAX. Вторая мутация, присутствовавшая только в 30% амплифицированных последовательностей (опять в реакциях, завершенных в обоих направлениях), представляла собой AAGAuG (KM) в положении Р 3 позади сайта расщепления NS2B/NS3 (QKKRGGK (m)T) (SEQ ID NO: 5). Несмотря на то, что эти мутации находятся в положении делетированной SL5, они не меняют предсказанных структур РНК. Быстрый отбор лучше растущих RepliVAX (всего 10 циклов роста) вызывает исключительный интерес, поскольку указывает, что отбор вариантов, растущих лучше, является мощным методом усовершенствованияRepliVAX. Положения мутаций не являются неожиданными, поскольку известно, что изменение эффективности расщепления NS2B/NS3 по отношению к расщеплению сигнальной пептидазой может повлиять на уровень выхода и инфекционность флавивирусных частиц (Keelapang et al., 2004; Lee et al., 2000; Lobigs and Lee, 2004; Yamshchkov et al., 1997). Продолжаются исследования по отбору еще лучше растущих вариантов, и планируется вставка этих двух мутаций в конструкции RepliVAX второго поколения, чтобы подтвердить их способность положительно действовать вместе (или по отдельности) на выход RepliVAX и продукцию антигена. Тем не менее, данные, представленные в настоящей заявке, показывают, что при данных условиях пассирования: 1) рекомбинации не происходит; 2) может применяться положительный отбор для получения улучшенных RepliVAX. Слепой пассаж JE RepliVAX также привел к получению лучше растущих вариантов с мутациями в тех же областях генома. Возможность слепого пассажа RepliVAX для получения лучше растущих вариантов является ключевой особенностью настоящего изобретения и явным преимуществом по сравнению с традиционным методом LAV, где получение лучше растущих вариантов всегда сопряжено с проблемой того, что эти лучше растущие варианты могут потерять свою аттенуацию по отношению к человеку. Кроме того, мутированная, улучшенная кассета экспрессии С (VEErep/Pac-Ubi-C), для которой была показана стабильность и отсутствие рекомбинации при использовании в клеточных линиях BHK(не одобренных для получения человеческих вакцин), оказалась также стабильной и подходящей для размножения PIV при введении в клетки Vero (клеточная линия, одобренная для производства человеческих вакцин). В частности, РНК, соответствующую репликону VEE, вводили в клетки Vero из сертифицированной затравочной культуры с использованием тех же методов, что и для клеток BHK. После введения РНК в клетки Vero эти клетки велись в бессывороточной среде (важный момент для производства вакцины), содержащей пуромицин, и было показано, что такие клетки подходят для размножения PIV. Было показано, что в таких условиях размножения клетки продуцируют титры PIV немного ниже, чем клетки BHK, полученные сходным образом, но клетки VEErep/Pac-Ubi-C-Vero лучше выдерживают такие условия культивирования, что позволяет собирать материал многократно. На фиг. 11 проиллюстрирована возможность производства PIV этими клетками при многократном сборе материала в условиях бессывороточного культивирования. В целом, размножение PIV в клеточных линиях, экспрессирующих С (особенно кассеты экспрессии С, содержащие сигнальную последовательность prM или эту область плюс части генов prM и Е), теоретически может рекомбинировать с геномом PIV с получением живого вируса, способного вызывать заболевание, повышая риск способа получения вакцины. Для решения этой проблемы, в настоящем изобретении продемонстрировано, что клеточные линии, предназначенные для продуцирования WN PIV,могут быть получены с использованием белка С, который заканчивается точно на месте расщепленияNS2B/NS3, таким образом минимизируя вероятность рекомбинации в этой области генома PIV и давая преимущество перед другими методами размножения, в которых клеточные линии кодируют РНК, кодирующие часть якоря С (также известную как сигнальный пептид prM), которые также содержатся в PIV. Чтобы далее повысить безопасность кассеты экспрессии С, в настоящем изобретении продемонстрировано, что в часть кассеты, используемой для получения кодируемого VEErep С, который комплементирует с геномом PIV (т.е. первые 30 кодонов, кодирующие аминокислотную последовательность,необходимую для производства реплицирующегося генома PIV из-за элементов РНК, необходимых для репликации вируса), могут быть внесены специфические мутации для получения кассеты, отличающейся- 16016490 от генома PIV по 36 нуклеотидным позициям (введение которых не меняет белковый продукт), таким образом, вероятность рекомбинации получившегося гена С с геномом PIV резко снижается. (фиг. 9). Далее в этот мутантный ген были внесены три мутации в сигнале циклизации (CS), который должен быть комплементарен CS в 3'UTR генома PIV для успешной вирусной репликации, обеспечивая еще одну меру безопасности для предотвращения рекомбинации (фиг. 9). Кроме того, этот ген С был вставлен в репликон VEE вслед за селективным маркерным геном (рас) с использованием гена убиквитина к интактному продукту С полученного полипротеина (альтернативные последовательности саморасщепления, такие как автопротеиназа 2 А или FMDV или другие родственные последовательности могут быть легко заменены на убиквитин). Создание такой кассеты, кодирующей единый полипротеин, дает преимущество за счет получения генетически более стабильного репликона VEE, уменьшения вероятности рекомбинации в размножающих клеточных линиях, элиминации кассеты экспрессии С и уменьшения выхода PIV. Получившаяся конструкция (VEErep/Pac-Ubi-C, фиг. 9) была введена в клетки BHK, и эти клетки использовали для получения клеточной линии клональной природы, экспрессирующей репликон VEE, путем стандартных методик (Fayzulin et al., Virology, 2006). Была проанализирована одна клональная линия через 18 пассажей после клонирования из одной клетки, и анализ не выявил признаков какой-либо генетической делеции кассет С (методом RT-PCR), а также не было обнаружено никаких мутаций в кассете экспрессии С. Наиболее важно, что эта клеточная линия продемонстрировала сходные способности к размножению WNV PIV на уровне пассажа 41. И наконец, после 10 пассажей PIV на этой клеточной линии не было выявлено признаков рекомбинации, ведущей к появлению PIV, способных к продуктивной репликации в клетках, не экспрессирующих кассету С (таких как клетки WT Vero), и не было выявлено признаков введений последовательностей, кодирующих С, в геном PIV с помощью RT-PCR. Кроме того, чтобы решить проблему возможной рекомбинации PIV с флавивирусами вакцин в момент вакцинации, ведущей к появлению новых вирулентных флавивирусов, в настоящем изобретении продемонстрировано, что возможно синтезировать геномы WNV, содержащие неприродные сигналы циклизации (CS), присутствующие во всех известных флавивирусах в естественной циркуляции, и эти геномы будут реплицироваться на высоком уровне. В нескольких лабораториях было показано, что двеCS, обнаруженные на 5'- и 3'-концах геномов всех флавивирусов, должны быть комплементарны на 100% для обеспечения продуктивной репликации вируса (Khromych et al., J. Virol., 2001; Lo et al., J. Virol.,2003; Alvarez et al., Virol., 2003). Эти исследования также показали, что неприродные CS могут продуцировать реплицирующиеся геномы, если эти CS комплементарны на 100%. Однако исследователи указали,что у всех геномов с неприродными последовательностями CS имелись дефекты репликации. Путем систематического анализа CS в геномах WNV, в особенности анализа способности к обеспечению репликации на высоком уровне тщательно отобранных замен одного основания, были идентифицированы замены одного основания и последующие замены двух оснований, дающие геному возможность реплицироваться на высоком уровне (фиг. 12 А). На фиг. 12 В показано, что возможен высокий уровень репликации генома WNV с заменой двух оснований, и что геномы, в которые намеренно ввели несовпадающие последовательности CS (такие как WT и мутант по двум основаниям), не являются репликационно активными. Таким образом, эта мутация и другие, подобные ей, могут быть использованы для получения PIV с повышенным уровнем безопасности, поскольку любой рекомбинантный вирус, полученный в результате одноточечной генетической рекомбинации между вакциной на основе PIV с модифицированной CS и вирусом, циркулирующим в областях, где население проходит вакцинацию, не будет репликационно активным и, следовательно, не сможет вызвать заболевания. Пример 18. Клетки BHK, экспрессирующие ген С WNV, сохраняют свой фенотип в течение многих пассажей. Исследования клональной клеточной линии, экспрессирующей WNV С, полученной из клетокBHK, трансфицированных VEErep/Pac-Ubi-C, продемонстрировали ее продолжительную стабильность,а также удобство для получения RepliVAX по нескольким причинам. Во-первых, эти клетки подходят для многократного пассирования RepliVAX. Во-вторых, параллельный анализ образования фокусов на клетках двух разных уровней пассажей (пассажи 8 и 24 после клонирования из одной клетки) не показал заметных различий в титрах RepliVAX WN и размерах фокусов. И, наконец, при прямом анализе последовательности кассеты, кодирующей С, в этих клетках на уровне 24 пассажа не обнаружилось никаких отличий от исходной последовательности VEErep. В сумме эти данные указывают на то, что клетки, содержащие VEErep, экспрессирующие С, являются достаточно стабильными для использования в общепринятом формате маточной серии клеток для производства человеческих вакцин. Кроме того, поскольку VEErep уже использовали в испытаниях на людях, применение технологии VEErep-клеток к клеткамVero не должно встретить неожиданных препятствий при получении разрешения контролирующего органа. Пример 19. Направление WNV VPL в лимфоидную ткань. Как указано выше, WNV VLP сходны с RepliVAX за исключением того, что вместо белка флавивируса prM/Е, они могут кодировать репортерный ген, или могут просто содержать флавивирусный репликон без репортера. VLP легко продуцируются в пакующих клетках, экспрессирующих все три структур- 17016490 ных белка WNV, описано получение высоких титров VLP (Fayzulin et al., 2006). При инокуляции 107 единиц VLP в мышей, через 24 ч после инокуляции в сыворотке крови животных содержалось 1000-1500 ед./мл интерферона I типа (IFN). Как внутрибрюшинная, так и подкожная инъекция в подушечку лап вызывала IFN-ответ. Кроме того, подколенные лимфатические узлы, вскрытые через 24 ч после прививки в подушечку лап VLP, экспрессирующими -галактозидазу, содержали большое количество клеток,положительных по -галактозидазе, что показывает, что VLP, входящие в клетку таким же образом, как и RepliVAX, направляются в важнейшие лимфатические органы. Этот результат хорошо согласуется со высоким уровнем IFN, вызванным инфекцией VLP, и предполагает, что подобное направление обеспечивает высокий потенциал и эффективность RepliVAX. Список процитированных источников.Zuker, 2003, Nucleic Acid Res 31: 3406-3415. Все патенты или публикации, упомянутые в настоящем описании, указывают на уровень специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, эти патенты и публикации являются включенными в настоящее изобретение путем ссылки в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация включена путем ссылки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, содержащий делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания prM/М, или их комбинацию, где указанный дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Flaviviridae. 2. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.1, где указанный вирус представляет собой Flavivirus, Hepacivirus или Pestivirus или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты prM-Е других вирусов с кассетой prM-Е псевдоинфекционного вируса. 3. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.2, где указанный Flavivirus является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге,вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей. 4. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.3, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного Flavivirus, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С. 5. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.2, где указанный Hepacivirus является вирусом гепатита С. 6. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.2, где указанный Pestivirus является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней. 7. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.1, где указанный делетированный ген заменен на ген, кодирующий маркерный белок или антиген. 8. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae по п.7, где маркерный белок является зеленым флуоресцентным белком. 9. Популяция клеток, экспрессирующих белок С или С, prM, белок оболочки, мутантный белок С,мутантный prM, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Flaviviridae, эффективно поддерживающая размножение дефектного по репликации вируса по п.1 в подходящих условиях,где ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства Flaviviridae в составе репликона, заменен на кодоноптимизированную версию гена, кодирующую белок (белки) указанного вируса, так что эта замена снижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae. 10. Популяция клеток по п.9, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами. 11. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семействаFlaviviridae. 12. Популяция клеток по п.10, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной рекомбинации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами. 13. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения C-prM таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода SVP, содержащихprM/E, in vivo или их комбинацию. 14. Популяция клеток по п.10, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства Flaviviridae, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных in vitro РНК- 19016490 репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки. 15. Популяция клеток по п.10, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы. 16. Популяция клеток по п.15, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (EEEV), вирус западного энцефалита лошадей (WEEV) или вирус лихорадки реки Росс. 17. Способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae, включающий инфицирование популяции клеток по п.9 дефектным по репликации псевдоинфекционным вирусом семейства Flaviviridae, который содержит делецию в капсидном гене таким образом, что эта делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка prM, необходимую для правильного созревания prM/М, или их комбинацию, получая таким образом дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae. 18. Способ по п.17, где указанный вирус представляет собой Flavivirus, Hepacivirus или Pestivirus или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты prM-Е других вирусов с кассетой prM-Е псевдоинфекционного вируса. 19. Способ по п.18, где указанный Flavivirus является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса,вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей. 20. Способ по п.19, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного Flavivirus, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С. 21. Способ по п.18, где указанный Hepacivirus является вирусом гепатита С. 22. Способ по п.18, где указанный Pestivirus является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней. 23. Способ по п.17, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса,получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами. 24. Способ по п.23, где ген, кодирующий мутантный белок (белки) вируса семейства Flaviviridae в составе репликона, заменен на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок (белки) указанного вируса, так что эта замена понижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства Flaviviridae. 25. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства Flaviviridae. 26. Способ по п.24, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами. 27. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-prM таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода SVP, содержащих prM/E, invivo или их комбинацию. 28. Способ по п.23, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства Flaviviridae, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных in vitro РНК репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки. 29. Способ по п.23, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы. 30. Способ по п.29, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей(VEEV), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (EEEV), вирус западного энцефалита лошадей (WEEV) или вирус лихорадки реки Росс. 31. Фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, полученный способом по п.17. 32. Способ защиты индивидуума от инфекций, возникающих в результате контакта с Flaviviridae,включающий введение в организм индивидуума иммунологогически эффективного количества фармацевтической композиции по п.31, которая индуцирует у индивидуума иммунный ответ против Flaviviridae, защищая таким образом индивидуума от инфекций. 33. Способ по п.32, где указанное введение производится внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно,внутримышечно, перорально или интраназально. 34. Способ по п.32, где индивидуумом является человек или животное.
МПК / Метки
МПК: C12N 7/00, A61K 39/12, C12N 5/00
Метки: flavivirus, псевдоинфекционный, применение
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-16490-psevdoinfekcionnyjj-flavivirus-i-ego-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Псевдоинфекционный флавивирус и его применение</a>
Рекомбинантный флавивирус и его применение
Номер патента: 15907
Опубликовано: 30.12.2011
Авторы: Каталан Джон А., Монат Томас П., Пугачев Константин В., Гуйраху Фаршад, Лю Цзянь
МПК: A61K 39/12, C12Q 1/70
Метки: flavivirus, применение, рекомбинантный
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантный флавивирус для применения в профилактике или лечении флавивирусной инфекции, содержащий мутацию в трансмембранном домене мембранного белка, которая представляет собой замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 60, 61, 62, 63, 64, 65 и 66 мембранного белка вируса японского энцефалита или вируса Западного Нила.2. Флавивирус по п.1, где мутация...
Клонированный штамм вируса осповакцины, способ его получения и применение штамма в качестве вакцины
Номер патента: 7656
Опубликовано: 29.12.2006
Авторы: Монат Томас П., Вельцин Рихард А.
МПК: A61P 31/12, C12N 7/00, A61K 39/285...
Метки: применение, качестве, осповакцины, клонированный, вируса, штамм, штамма, вакцины, способ, получения
Формула / Реферат:
1. Штамм вируса осповакцины, полученный клонированием штамма DryvaxR в клеточной системе или культивированием клона, выделенного из DryvaxR, в клеточной системе, который при введении человеку в количестве, эффективном для индукции защитного или терапевтического иммунного ответа против вируса натуральной оспы у указанного человека, оказывается в достаточной степени ослабленным и который обладает, в основном, такими же вирулентностью,...
Применение модифицированного вируса осповакцины анкара для вакцинации новорожденных
Номер патента: 11233
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Хефти Ханс Петер, Сутер Марк, Чаплин Пол, Франкини Марко, Акерманн Матиас, Волльстедт Сабине
МПК: A61K 39/245, A61P 43/00, A61K 39/285...
Метки: осповакцины, модифицированного, вакцинации, применение, вируса, анкара, новорожденных
Формула / Реферат:
1. Применение модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) для получения лекарственного препарата для индукции или усиления созревания иммунной системы у животного, включая человека, в неонатальном периоде. 2. Применение по п.1, где MVA представляет собой штамм MVA-BN, депонированный в ЕСАСС под номером V00083008, и его производные, которые характеризуются (i) способностью к репродуктивной репликации в фибробластах куриных эмбрионов (CEF)...
Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение
Номер патента: 12723
Опубликовано: 30.12.2009
Авторы: Лейрер Соня, Хаули Пол
МПК: A61K 39/285, C12N 15/863, A61K 39/275...
Метки: оспы, два, вируса, меньшей, мере, промотора, поксвирус, применение, рекомбинантный, коровьей, содержащий
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантный поксвирус, содержащий в вирусном геноме по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ATI вируса коровьей оспы или его производное или субпоследовательность промотора ATI или ее производное и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности регулируется указанным промотором, производным или субпоследовательностью и где производное промотора ATI коровьей оспы является...
Бис-(2-галоидэтил)аминофенилзамещенные производные дистамицина и их применение в качестве противоопухолевого и противовирусного средства
Номер патента: 33
Опубликовано: 26.02.1998
Авторы: Францетти Кристина, Кополонго Лаура, Коззи Паоло, Берия Итало
МПК: A61K 31/40, C07D 207/34
Метки: средства, дистамицина, противовирусного, качестве, бис-(2-галоидэтил)аминофенилзамещенные, противоопухолевого, производные, применение
Формула / Реферат:
1.Бис-(2-галоидэтил) аминофенилзамещенные производные дистамицина формулы (I) в которой n обозначает 2, 3 или 4; один из R и R1 обозначает водород, С1-С4 -алкил, СF3 или С1-С4 -алкокси, а другой независимо обозначает СF3, С1-С4 -алкил или С1-С4 -алкокси; и Х обозначает галоген; и его фармацевтически приемлемые соли. 2. Соединение формулы (I) по п.1, в котором n обозначает 3; Х обозначает хлор; один из R и R1 обозначает водород или С1-С4...
Предыдущий патент: Переносное осветительное устройство и карманный электрический фонарь с видимой функцией мигания
Следующий патент: Поглощающее изделие
Случайный патент: Интерферон-бета при тяжелом остром респираторном синдроме (sars)