Конъюгатные вакцины

Бьеман Ральф Леон, Деноэль Филипп,Пулман Ян, Приэль Жан Поль (BE) Представитель: Изобретение относится к области вакцин, представляющих собой конъюгаты капсульных сахаридов пневмококков. Конкретно, предложены мультивалентные иммуногенные композиции против Streptococcus pneumoniae с различными (например, 9 или более) конъюгированными капсульными сахаридами из разных серотипов S. pneumoniae, где композиция содержит конъюгированный капсульный сахарид 18 С, который О-ацетилирован менее чем на 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20,15 или 10%. 015551 Область изобретения Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине против Streptococcus pneumoniae. Предшествующий уровень техники Дети младше 2 лет не дают иммунный ответ на большинство полисахаридных вакцин, поэтому было необходимо сделать полисахариды иммуногенными с помощью химической конъюгации с белковым носителем. Сочетание полисахарида, Т-независимого антигена, с белком, Т-зависимым антигеном, придает полисахариду свойства Т-зависимости, в том числе изотипное переключение, созревание аффинности и индукцию памяти. Однако возможны проблемы с повторным введением конъюгатов полисахарид-белок или комбинаций конъюгатов полисахарид-белок, образующих мультивалентные вакцины. Например, сообщалось о тестировании вакцины, представляющей собой полисахарид (PRP) Haemophilus influenzae типа b с использованием столбнячного анатоксина (ТТ) в качестве белкового носителя, в диапазоне дозировок при одновременной иммунизации (свободным) ТТ и вакциной, представляющей собой конъюгат пневмококкового полисахарида с ТТ, в соответствии со стандартным режимом для младенцев. По мере увеличения дозы пневмококковой вакцины иммунный ответ на полисахаридную PRP-часть вакцины, представляющей собой конъюгат Hib снижался, что указывает на иммунную интерференцию с полисахаридом, возможно, по причине применения того же белка-носителя (Dagan et al, Infect Immun. (1998); 66: 2093-2098). Влияние дозировки белка-носителя на гуморальный ответ на сам белок также оказалось многосторонним. Сообщалось, что у младенцев увеличение дозировки четырехвалентного конъюгата столбнячного анатоксина приводило к уменьшению ответа на столбнячный носитель (Dagan et al., см. выше). Классический анализ этих эффектов комбинированных вакцин описан как индуцированное носителем эпитопное угнетение, что не вполне понятно, но считается результатом избыточного количества белканосителя (Fattom, Vaccine 17, 126 (1999. По видимому, это приводит к конкуренции В-клеток к белкуносителю и В-клеток к полисахариду за Th-клетки. Если преобладают В-клетки к белку-носителю, имеется недостаточно Th-клеток для осуществления необходимых хелперных функций по отношению к Вклеткам, специфичным к полисахариду. Однако наблюдаемые иммунологические эффекты были неустойчивыми, причем суммарное количество белка-носителя в некоторых случаях усиливало иммунный ответ, а в других случаях ослабляло иммунный ответ. Следовательно, существуют технические трудности в комбинировании множественных полисахаридных конъюгатов в едином эффективном вакцинном препарате.Streptococcus pneumoniae являются грамположительными бактериями, ответственными за значительную заболеваемость и смертность (особенно среди молодых и старых) и вызывающими инвазивные заболевания, такие как пневмония, бактериемия и менингит, и заболевания, связанные с колонизаций,такие как острый отит среднего уха. Заболеваемость пневмококковой пневмонией в США у лиц старше 60 лет оценивают как 3-8 человек на 100000. В 20% случаев она приводит к бактериемии и другим явлениям, таким как менингит, со смертностью, близкой к 30% даже при лечении антибиотиками. Пневмококк инкапсулирован в химически связанный полисахарид, который придает серотипическую специфичность. Известно 90 серотипов пневмококков, и капсула представляет собой главный детерминант вирулентности пневмококков, поскольку капсула не только защищает внутреннюю поверхность бактерий от комплемента, но сама является слабо иммуногенной. Полисахариды являются Тнезависимыми антигенами и не могут быть процессированы или презентированы на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС) для взаимодействия с Т-клетками. Однако они могут стимулировать иммунную систему по альтернативным механизмам, которые включают перекрестное связывание поверхностных рецепторов на В-клетках. В нескольких экспериментах показано, что защита против инвазивного пневмококкового заболевания наиболее сильно коррелирует с антителами, специфичными к капсуле, и эта защита специфична к серотипу.Streptococcus pneumoniae является наиболее распространенной причиной инвазивных бактериальных заболеваний и отита среднего уха у младенцев и детей младшего возраста. Аналогичным образом,пожилые люди дают плохие ответы на вакцины против пневмококка (Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], следовательно, заболеваемость бактериальной пневмонией в этой популяции повышена[Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285]. Главные клинические синдромы, вызываемые S. pneumoniae, широко известны и рассмотрены во всех стандартных медицинских учебниках (Fedson DS, Muscher DM. В: Plotkin SA, Orenstein WA, editors.Vaccines. 4rth edition. Philadelphia, WB Saunders Co, 2004a: 529-588). К примеру, инвазивное пневмококковое заболевание (ИПЗ) определяют как любую инфекцию, при которой S. Pneumoniae выделяют из крови или другого в норме стерильного места (Musher DM. Streptococcus pneumoniae. In Mandell GL,Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases (5th ed). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147). Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) известна как включающая в себя несколько состояний (обструкция прохождения воздуха, хронический бронхит, бронхиолит или заболевание мелких воздушных путей и эмфизема), которые часто сосуществуют. Пациенты страдают от обострений их состояния, которые обычно связаны с усилением одышки, и часто имеют усиленный ка-1 015551 шель, который может быть продуктивным слизевым или гнойным мокротным (Wilson, Eur Respir J 2001 17:995-1007). ХОБЛ определяют физиологически по присутствию необратимой или частично обратимой обструкции дыхательных путей у пациентов с хроническим бронхитом и/или эмфиземой (Standards forRespir Crit Care Med. 1995 Nov; 152(5 Pt 2):S77-121). Обострения ХОБЛ часто бывают вызваны бактериальными (например пневмококковыми) инфекциями (Sethi S, Murphy TF. Bacterial infection in chronicobstructive pulmonary diseases in 2000: a state-of-the-art review. Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63). Хотя на рынке имеется вакцина Prevnar, содержащая сахариды из серотипов 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, которые все конъюгированы с белком-носителем CRM197 (нетоксичный вариант дифтерийного токсина), мало известно о способе изготовления этой вакцины или характеристиках ее сахаридов. О- или N-ацетилирование, как известно, является важным замещением при образовании защитных эпитопов для различных антигенных сахаридов. Обычно нельзя предсказать, является ли присутствие ацетильных групп полезным или разрушительным для эпитопа. Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка улучшенного препарата вакцины, представляющей собой конъюгат полисахаридов множественных серотипов Streptococcus pneumoniae. В частности, предметом настоящего изобретения является разработка вакцины с полезными характеристиками ацетилирования. В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили,что де-О-ацетилирование капсульного сахарида серотипа 18 С может быть полезным в фокусировании иммунного ответа на скелет эпитопов, что может быть полезным в получении иммунного ответа, защищающего как против тех штаммов 18 С, которые сильно О-ацетилированы, так и против тех, которые слабо О-ацетилированы. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 - ингибирование объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использовании SP1008 или Prevnar, в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA); фиг. 2 - ингибирование объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использованииELISA. фиг. 3 - ингибирование, вызванное опсонофагоцитозом, объединенных сывороток из мышей, иммунизированных при использовании SP1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгатыPS18-DTAH или PS18-TTAH; фиг. 4 - ингибирование объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании SP1008 или Prevnar, в ELISA; фиг. 5 - ингибирование объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании SP1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгаты PS18-DTAH или PS18TTAH, в ELISA; фиг. 6 - ингибирование, вызванное опсонофагоцитозом, объединенных сывороток из морских свинок, иммунизированных при использовании SP1008 или экспериментальных препаратов, содержащих конъюгаты PS18-DTAH или PS18-TTAH; фиг. 7 - ингибирование объединенных сывороток из младенцев в исследовании 11PnPDDi007,иммунизированных при использовании SP1008 или Prevnar. Описание изобретения Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция против Streptococcus pneumoniae, содержащая 9 или более, 10 или более, 11 или более, или 13 или более капсульных сахаридов из разных серотипов S. pneumoniae, которые конъюгированы с белкомносителем, причем композиция содержит конъюгированный капсульный сахарид 18 С, который Оацетилирован менее чем на 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 или 10%.% О- или N-ацетилирования означает % ацетилирования данной пробы сахарида относительно 100% (причем каждая повторяющаяся единица полностью ацетилирована относительно ее ацетилированной структуры). Для облегчения ссылок структура различных повторяющихся единиц сахарида дана ниже. Известно, что PS1 О-ацетилирован либо по первой, либо по второй группе -ОН средней повторяющейся единицы сахара. Сахариды можно де-О-ацетилировать различными способами, известными в данной области. Измерение ацетилирования возможно различными способами, известными в данной области; к примеру,можно использовать ЯМР. В одном аспекте капсульный сахарид 18 С де-О-ацетилируют обработкой кислотой перед его конъюгацией. К примеру, обработка 1 М уксусной кислотой в течение 40 ч при 60 С(см. WO 96/05859, пример 4) дает сахарид 18 С, который О-ацетилирован приблизительно на 17% по данным ЯМР. Такая же обработка при 100 С в течение 5-6 ч дает 18 С, О-ацетилированный на 30-50%. Нативному 18 С из ацетилированного штамма 18 С свойственно быть сильно О-ацетилированным (90%). В одном воплощении сахарид С 18 по настоящему изобретению конъюгирован со столбнячным анатоксином (ТТ), причем возможно 18 С является единственным капсульным сахаридом S. pneumoniae,конъюгированным с ТТ. Капсульные сахариды из разных серотипов S. pneumoniae можно конъюгировать с 2 или более разными белками-носителями. В одном из воплощений 18 С не конъюгирован с пневмолизином. В еще одном воплощении 18 С не конъюгирован с CRM197. Капсульный сахарид 18 С по настоящему изобретению можно конъюгировать многими известными способами (см. ниже). В одном воплощении он не конъюгирован с использованием химии восстановительного аминирования, в дополнительном воплощении он конъюгирован с использованием химии восстановительного аминирования (см. ниже). В типичных случаях иммуногенная композиция (или вакцина) против Streptococcus pneumoniae по настоящему изобретению будет содержать антигены, представляющие собой капсульный сахарид (предпочтительно конъюгированный), причем сахариды получены по меньшей мере из 9 или по меньшей мере из десяти серотипов S. pneumoniae. Число капсульных сахаридов S. pneumoniae может быть в диапазоне от 9 или 10 разных серотипов (или "V", валентностей) до 23 разных серотипов (23V). В одном из воплощений имеют место 9, 10, 11, 13 или 15 разных серотипов. В еще одном воплощении этого изобретения вакцина может содержать конъюгированные сахариды S. pneumoniae и неконъюгированные сахариды S.pneumoniae. Предпочтительно, суммарное число серотипов сахарида меньше или равно 23. Например,это изобретение может содержать 10 конъюгированных серотипов и 13 неконъюгированных сахаридов. Таким же образом, вакцина может содержать 13 или 16 конъюгированных сахаридов, и 10 или 7 неконъюгированных сахаридов соответственно. В одном воплощении мультивалентная вакцина против пневмококков по этому изобретению должна быть выбрана из нижеследующих серотипов: 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В,17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F, хотя признано, что один или два других серотипа можно заменить в зависимости от возраста реципиента, получающего вакцину, и географического положения, где вакцину будут вводить. Например, 10-валентная вакцина может содержать полисахариды из серотипов 1,4, 5,6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F. 11-Валентная вакцина может также включать в себя капсульный сахарид из серотипа 3. Педиатрическая (для младенцев) 12- или 13-валентная вакцина может также включать в себя серотипы 6 А и 19 А, или 6 А и 22F, или 19 А и 22F, или 6 А и 15 В, или 19 А и 15 В, или 22F и 15 В (для 10- или 11-валентного препарата соответственно), тогда как 13-валентная вакцина для пожилых людей может включать в себя серотипы 8 и 12F, или 8 и 15 В, или 8 и 19 А, или 8 и 22F, или 12F и 15 В, или 12F и 19 А, или 12F и 22F, или 15 В и 19 А, или 15 В и 22F (для 11-валентного препарата). Педиатрическая 14 валентная вакцина может включать в себя 10-валентный препарат, описанный выше, с добавлением серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F; серотипов 6 А, 8, 19 А и 22F; серотипов 6 А, 12F, 19 А и 22F; серотипов 6 А, 15 В,19 А и 22F; серотипов 3, 8, 19 А и 22F; серотипов 3, 12F, 19 А и 22F; серотипов 3, 15 В, 19 А и 22F; сероти-4 015551 пов 3, 6 А, 8 и 22F; серотипов 3, 6 А, 12F и 22F; или серотипов 3, 6 А, 15 В и 22F. Композиция в одном из воплощений включает в себя капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F (предпочтительно конъюгированные). В дополнительном воплощении этого изобретения включены по меньшей мере 11 антигенов, представляющих собой сахариды(предпочтительно конъюгированные), например капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4,5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F. В дополнительном воплощении этого изобретения включены по меньшей мере 12 или 13 антигенов, представляющих собой сахариды; например, вакцина может содержать капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F и 23F, или капсульные сахариды, полученные из серотипов 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19 А, 19F, 22F и 23F, хотя дополнительные сахаридные антигены, например 23-валентные (такие как серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6 В, 7F,8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F), также предусмотрены этим изобретением. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 4, он N-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 9V, он N-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60,70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 14, он Nацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 1, он N-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 5,он N-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Если в одном из воплощений присутствует капсульный сахарид из серотипа 7F, он N-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90% и/или О-ацетилирован более чем на 50, 60, 70, 80, 90%. Вакцина по настоящему изобретению может содержать белок D (PD) из Haemophilus influenzae (см. например ЕР 0594610) - в частности, из нетипируемого Haemophilus influenzae (ntHi). ntHi является ключевым патогенным организмом отита среднего уха, и авторы настоящего изобретения показали, что включение этого белка в вакцину против Streptococcus pneumoniae должно обеспечить некоторый уровень защиты против связанного с Haemophilus influenzae отита среднего уха (Prymula et al. 2006 The Lancet 367:740-748). В одном из воплощений вакцинная композиция содержит белок D. В одном из аспектовPD присутствует в качестве белка-носителя для одного или более чем одного сахарида. В другом аспекте белок D может присутствовать в вакцинной композиции в виде свободного белка. В дополнительном аспекте белок D присутствует в качестве как белка-носителя, так и свободного белка. Белок D можно использовать в виде полноразмерного белка или в виде фрагмента (WO 0056360). В дополнительном аспекте белок D присутствует в качестве белка-носителя для большинства сахаридов, например, с белкомD можно конъюгировать 6, 7, 8, 9 или более сахаридов. В этом аспекте белок D может также присутствовать в виде свободного белка. Вакцина по настоящему изобретению может содержать два или более разных типа белка-носителя. Каждый тип белка-носителя может действовать в качестве носителя для более чем одного сахарида, причем эти сахариды могут быть одними и теми же или разными. Сахариды можно конъюгировать с одним и тем же носителем в одном и том же взаимодействии или можно индивидуально конъюгировать с одним и тем же белком-носителем. Например, серотипы 3 и 4 можно конъюгировать при использовании одного и того же белка-носителя либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. В одном из воплощений два или более чем два разных сахарида можно конъюгировать при использовании одного и того же белка-носителя либо с одной и той же молекулой белка-носителя, либо с разными молекулами одного и того же белка-носителя. Каждый/любой капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae можно конъюгировать с белкомносителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С белка ТТ,PhtD, продуктов слияния PhtDE (особенно тех, что описаны в WO 01/98334 и WO 03/54007), детоксифицированного пневмолизина и белка D. В одном из аспектов капсульный сахарид из серотипа 19F можно конъюгировать с DT или CRM 197, предпочтительно с DT. Более полный перечень белковых носителей,которые можно использовать в конъюгатах по этому изобретению, представлен ниже. Белок-носитель, конъюгированный с один или более чем одним капсульным сахаридом S. pneumoniae в конъюгатах, присутствующих в иммуногенной композиции по этому изобретению, возможно представляет собой белки семейства полигистидиновой триады (Pht), их фрагменты или слитые белки. Белки PhtA, PhtB, PhtD или PhtE могут иметь аминокислотную последовательность, общую на 80, 85, 90,95, 98, 99 или 100% с последовательностью, раскрытой в WO 00/37105 или WO 00/39299 (например с аминокислотной последовательностью 1-838 или 21-838 по SEQ ID NO: 4 в WO 00/37105 для PhtD). Например, слитые белки состоят из полноразмерных или частичных 2, 3 или 4 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Примерами слитых белков являются PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E, PhtD/A, PhtD/B, PhtD/E,PhtE/A, PhtE/B и PhtE/D, причем эти белки связаны с первым из указанных на N-конце (см., например,WO 01/98334). При использовании фрагментов белков Pht (в отдельности или в качестве части слитого белка), каждый фрагмент возможно содержит один или более чем один мотив гистидиновой триады и/или биспи-5 015551 ральный участок таких полипептидов. Мотив гистидиновой триады представляет собой часть полипептида, которая имеет последовательность НххНхН, где Н представляет собой гистидин, и х представляет собой аминокислоту, отличную от гистидина. Биспиральный участок представляет собой область, предсказанную алгоритмом "Coils" в Lupus, A et al (1991) Science 252; 1162-1164. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент включает в себя один или более из мотивов гистидиновой триады, а также по меньшей мере один биспиральный участок. В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 мотивов гистидиновой триады (возможно, с нативной последовательностью Pht между 2 или более триадами или со внутри-триадной последовательностью, которая более чем на 50, 60, 70, 80, 90 или 100 % идентична нативной пневмококковый внутритриадной последовательности Pht, например внутри-триадной последовательности, показанной в SEQ IDNO: 4 в WO 00/37105 для PhtD). В одном воплощении определенный или каждый фрагмент содержит ровно или по меньшей мере 2, 3 или 4 биспиральных участка. В одном воплощении белок Pht, раскрытый здесь, включает в себя полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например 20 аминокислот на N-конце),встречающиеся в природе варианты белка Pht и иммуногенные фрагменты белка Pht (например фрагменты, описанные выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в WO 00/37105 или WO 00/39299, причем указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный для указанной аминокислотной последовательности в WO 00/37105 или WO 00/39299). В частности, термин "PhtD" при использовании здесь включает в себя полноразмерный белок с присоединенной сигнальной последовательностью, зрелый полноразмерный белок с удаленным сигнальным пептидом (например 20 аминокислот на N-конце), встречающиеся в природе варианты PhtD и иммуногенные фрагменты PhtD (например фрагменты, как описано выше, или полипептиды, содержащие по меньшей мере 15 или 20 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности PhtD в WO 00/37105 или WO 00/39299, причем указанный полипептид способен вызывать иммунный ответ, специфичный к указанной аминокислотной последовательности PhtD в WO 00/37105 или WO 00/39299 (например для PhtD, SEQ ID NO: 4 в WO 00/37105). Если белковый носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белкового носителя (причем молекула носителя имеет еще 2 разных сахарида, конъюгированных с ней) [см. к примеру WO 04/083251]. Или же, сахариды можно каждый отдельно конъюгировать с разными молекулами белкового носителя (причем каждая молекула белкового носителя имеет только один тип сахарида, конъюгированный с ней). Примерами белков-носителей, которые можно использовать в настоящем изобретении, являютсяNicholls and Youle "Genetically Engineered Toxins", Ed: Frankel, Marcel Dekker Inc, 1992; делеция или мутация Glu-148 в Asp, Gin или Ser и/или Ala 158 в Gly и другие мутации, раскрытые в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более чем одного остатка Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/илиLys 534 и другие мутации, раскрытые в US 5917017 или US 6455673; или фрагмент, раскрытый в US 5843711, пневмококковый пневмолизин [Ply] (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), включая ply,который детоксифицирован каким-либо образом, например химическим: dPLY-GMBS (WO 04081515,РСТ/ЕР 2005/010258) или dPLY-формол; или генетически мутированный для меньшей токсичности (например, при использовании мутаций, известных в данной области), PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE и слитые с Pht белки, например продукт слияния PhtDE, продукт слияния PhtBE (WO 01/98334 и WO 03/54007) (Pht А-Е раскрыт более подробно ниже), ОМРС (белок менингококковой внешней мембраны,обычно экстрагированный из серогруппы В N. meningitidis - ЕР 0372501), PorB (из N. meningitidis), PD(белок D Haemophilus influenzae - см., например, ЕР 0594610 В) или его иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (ЕР 0378881, ЕР 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712,WO 94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, ростовые факторы или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы для человеческих Т-клеток типа CD4+ из различных антигенов, получаемых из патогенов (Falugi et al (2001) Eur JImmunol 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки, поглощающие железо, (WO 01/72337), токсин А или В из С. difficile (WO 00/61761).Nurkka et al Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11)-, 1008-14, 2004 Nov. описали 11-валентную пневмококковую вакцину, у которой все серотипы конъюгированы с PD. Однако настоящие авторы изобретения показали, что опсонофагоцитозная активность была лучше у антител, индуцированных конъюгатами, имеющими 19F, конъюгированный с DT, при сравнении с 19F, конъюгированным с PD. Вдобавок, настоящие авторы изобретения показали, что более высокая перекрестная реактивность с 19 А наблюдается, когда 19F конъюгирован с DT. Поэтому отличительным признаком композиции по настоящему изобретению является то, что серотип 19F конъюгирован с DT или CRM 197. В одном из аспектов-6 015551 серотип 19F конъюгирован с DT. Остальные серотипы сахаридов иммуногенной композиции могут быть все конъюгированы с одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой DT(то есть, только 19F конъюгирован с DT), или могут быть распределены между одним или более чем одним белком-носителем, который не представляет собой DT или CRM197, и DT или самим CRM197. В одном из воплощений 19F конъюгирован с DT или CRM 197, и все остальные серотипы конъюгированы с PD. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM 197, и остальные серотипы распределены между PD и ТТ, или DT, или CRM 197. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован сDT или CRM 197, и не более чем один (или два или три) сахарид(а) конъюгирован(ы) с ТТ. В одном из аспектов этого воплощения указанный(е) один (или два) сахарид(а) представляет(ют) собой 18 С и/или 12F. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM 197, и не более чем два сахарида конъюгированы с ТТ. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM 197, и остальные серотипы распределены между PD, ТТ и DT или CRM 197. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM 197, и остальные серотипы распределены между PD, ТТ и пневмолизином. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM 197, и остальные серотипы распределены между PD, ТТ и CRM 197. В дополнительном воплощении 19F конъюгирован с DT или CRM197, и остальные серотипы распределены между PD, ТТ, пневмолизином и возможно PhtD. В дополнительном аспекте этого изобретения капсульный сахарид 18 С конъюгирован с ТТ [причем возможно один или два других сахарида конъюгирован(ы) с ТТ], и остальные серотипы распределены между PD, DT (илиCRM197), пневмолизином и возможно PhtD. В одном из воплощений иммуногенная композиция по этому изобретению содержит белок D изHaemophilus influenzae. В этом воплощении, если PD не является одним из белков-носителей, использованных для конъюгации каких-либо сахаридов, то PD может присутствовать в вакцинной композиции как свободный белок. Если PD является одним из белков-носителей, использованных для конъюгации сахаридов в композиции по этому изобретению, то возможно PD может присутствовать в вакцинной композиции как свободный белок. Термин "сахарид" во всем этом описании может обозначать полисахарид или олигосахарид и включает в себя оба. Полисахариды выделяют из бактерий, и их размеры можно уменьшать до некоторой степени известными способами (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525; Szu et al. - Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986, предпочтительно микрофлюидизацией. Размеры полисахаридов можно уменьшать для того, чтобы снижать вязкость полисахаридных проб и/или улучшать фильтруемость конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют малое число повторяющихся единиц (в типичных случаях 5-30 повторяющихся единиц) и в типичных случаях представляют собой гидролизованные полисахариды. Капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae содержат повторяющиеся олигосахаридные единицы, которые могут содержать до 8 остатков сахаров. Обзор по олигосахаридным блокам ключевых серотипов Streptococcus pneumoniae см. в JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An, Acad, Bras. Cienc, June 2005, vol.77, No.2, p. 293-324. ISSN 0001-3765. В одном из воплощений антиген, представляющий собой капсульный сахарид, может быть нативным или полноразмерным полисахаридом (то есть, полисахаридом, как он получен из S. pneumoniae без какойлибо стадии уменьшения размеров или гидролиза), однако в других воплощениях он может представлять собой один или несколько повторяющихся единиц (олигосахаридов) или быть короче, чем полисахарид с нативной длиной или олигосахаридная цепь повторяющихся единиц. В одном из воплощений все сахариды, присутствующие в вакцине, представляют собой полисахариды. Полноразмерные полисахариды можно "уменьшать" то есть, их размер можно уменьшать различными способами, такими как обработка кислым гидролизом, обработка пероксидом водорода, определение размера при использованииemulsiflex с последующей обработкой пероксидом водорода для получения олигосахаридных фрагментов или микрофлюидизация. Авторы настоящего изобретения также отметили, что основной направленностью данной области является использование олигосахаридов для облегчения получения конъюгатов. Авторы изобретения обнаружили, что путем использования конъюгатов нативных полисахаридов или полисахаридов со слегка измененным размером можно реализовать одно или более из нижеследующих преимуществ: (1) конъюгат, имеющий высокую иммуногенность, который является фильтруемым, (2) соотношение полисахарида и белка в конъюгате можно изменять так, что соотношение полисахарида и белка (мас.) в конъюгате можно повышать (что может влиять на эффект супрессии носителем), (3) иммуногенные конъюгаты, подверженные гидролизу, можно стабилизировать применением сахаридов большего размера для конъюгации. Применение полисахаридов большего размера может приводить к большему перекрестному связыванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из конъюгата. Конъюгатные вакцины, описанные в известном уровне техники, имеют тенденцию к деполимеризации полисахаридов перед конъюгацией для улучшения конъюгации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вакцины, представляющие собой конъюгат сахарида, которые сохраняют больший размер сахарида, могут обеспечивать хороший иммунный ответ против пневмококкового заболевания. Таким образом, иммуногенная композиция по этому изобретению может содержать один или более-7 015551 конъюгатов сахарида, причем средний размер (усредненная по массе молекулярная масса; мол. масс.) каждого сахарида до конъюгации выше, чем 80103, 100103, 200103, 300103, 400103, 500103 или 1000103 (например, от 80103 до 1000103; от 90103 до 500103; от 100103 до 400103; от 200103 до 300103). В одном из воплощений один или более чем один конъюгат сахарида по этому изобретению должен иметь средний размер сахарида до конъюгации 50-1600, 80-1400, 100-1000, 150-500 или 200-400 кДа (надо иметь в виду, что, если средний размер представляет собой мол. масс, единицы "кДа" надо заменять здесь на "103"). В одном из воплощений конъюгат после конъюгации должен быть легко фильтруемым через 0,2-микронный фильтр так, что после фильтрования при сравнении с пробой до фильтрования получают выход более чем 50, 60, 70, 80, 90 или 95%. Для целей этого изобретения "нативный полисахарид" относится к сахариду, который не подвергали процессу (например, последующей очистке), целью которого является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может стать слегка уменьшенным в размере во время нормальных процедур очистки. Такой сахарид является все еще нативным. Только если полисахарид подвернут методикам определения размера, полисахарид нельзя считать нативным. Для целей этого изобретения "уменьшать размер в кратности до 2" означает, что сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера сахарида, но сохраняют размер более чем в половину размера нативного полисахарида. 3, 4 и т.д. надо интерпретировать таким же образом, то есть, сахарид подвергают процессу, предназначенному для уменьшения размера полисахарида, но сохраняют размер более чем в треть, четверть и т.д. размера нативного полисахарида. В одном из аспектов этого изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды Streptococcus pneumoniae по меньшей мере из 9 или 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или каждый из сахаридов S. pneumoniae представляет(ют) собой нативный полисахарид. В одном из аспектов этого изобретения иммуногенная композиция содержит сахариды Streptococcus pneumoniae по меньшей мере из 9 или 10 серотипов, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере у 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или каждого из сахаридов S. pneumoniae размер уменьшен в кратности до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном из воплощений этого аспекта большинство сахаридов, например 6, 7, 8 или больше, уменьшены в кратности до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса (или размер) сахарида здесь относится к усредненной по массе молекулярной массе (Mw, мол. масс.) сахарида, измеренной до конъюгации и измеренной при использовании много-углового рассеяния лазерного света (multi-angle laser light scattering,MALLS). Методика MALLS хорошо известна в данной области (например, описана в примере 2). ДляMALLS-анализа пневмококковых сахаридов можно использовать две колонки (TSKG6000 и 5000PWxl) в комбинации, и сахариды элюируют водой. Сахариды обнаруживают при использовании детектора светорассеяния (к примеру, Wyatt Dawn DSP, снабженный 10-мВт аргонным лазером при 488 нм) и интерференционного рефрактометра (к примеру, Wyatt Otilab DSP, снабженного ячейкой Р 100 и красным фильтром при 498 нм). В одном из воплощений сахариды S. pneumoniae представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, которые уменьшены в размере во время нормального процесса экстракции. В одном из воплощений сахариды S. pneumoniae уменьшены механическим расщеплением, к примеру микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Микрофлюидизация и обработка ультразвуком имеют преимущество в том, что уменьшают размер больших нативных полисахаридов достаточно для получения фильтруемого конъюгата. Уменьшение размера происходит в кратности не более чем 20,10, 8, 6, 5, 4, 3 или 2. В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит конъюгаты S. pneumoniae, которые получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, размер которых уменьшен в кратности не более чем 20. В одном из аспектов этого воплощение размер большинства сахаридов, например 6, 7, 8 или более сахаридов уменьшен в кратности до 2, 3, 4, 5 или 6. В одном из воплощений сахарид Streptococcus pneumoniae конъюгирован с белком-носителем через линкер, к примеру бифункциональный линкер. Линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, например имеющим активную аминогруппу и активную карбоксильную группу, 2 активных аминогруппы или две активных карбоксильных группы. Линкер имеет, например, от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10 атомов углерода. Возможным линкером является дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Другие линкеры включают в себя В-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин (Gever et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галогеноалкилгалогениды (US 4057685), гликозидные связи (US 4673574, US 4808700),гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US4459286). В одном из воплощений ADH используют в качестве линкера для конъюгации сахарида из серотипа 18 С. Конъюгаты сахаридов, присутствующие в иммуногенных композициях по этому изобретению,можно получать любой известной методикой сочетания. Способ конъюгации может быть основан на ак-8 015551 тивации сахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного эфира. Таким образом, активированный сахарид можно конденсировать прямо или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсером может быть цистамин или цистеамин с получением тиолированного (thiolated) полисахарида, который можно конденсировать с носителем через тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с малеимидактивированным белком-носителем (например, при использовании GMBS) или галогеноацетилированным белком-носителем (например при использовании йодацетимида [например, гидрохлорида этилйодацетимида] или N-сукцинимидилбромацетата или SIAB, или SIA, или SBAP). Предпочтительно, цианатный эфир (возможно полученный при использовании CDAP) подвергают сочетанию с гександиамином или ADH, и амино-дериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимида (например, EDAC или EDC) через карбоксильную группу на белковом носителе. Такие конъюгаты раскрыты в опубликованной в рамках РСТ заявки WO 93/15760 на Uniformed Services University и в WO 95/08348 и WO 96/29094. В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры,норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU. Многие раскрыты в WO 98/42721. В конъюгации можно использовать карбонильный линкер, который можно получить взаимодействием свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (карбонил-бис(имидазол-1-ил (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Это может включать в себя восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможно защиту первичной гидроксильной группы и снятие защиты с нее, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбамата CDI и сочетание этого промежуточного карбамата CDI с аминогруппой на белке. Конъюгаты можно также получать способами прямого восстановительного аминирования как описано в US 4365170 (Jennings), US 4673574 (Anderson) и WO 96/05859. Другие способы раскрыты в ЕР 0161188, ЕР 208375 и ЕР 0477508. Дополнительный способ включает сочетание активированного цианогенбромидом (или CDAP) сахарида, дериватизированного гидразидом адипиновой кислоты (ADH), с белковым носителем карбодиимидной конденсацией (Chu С. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), например при использовании EDAC. В одном из воплощений гидроксильная группа (предпочтительно активированная гидроксильная группа, например гидроксильная группа, активированная с получением цианатного сложного эфира [например при использовании CDAP]), на сахариде связана с аминогруппой или карбоксильной группой на белке либо прямо, либо опосредованно (через линкер). Если присутствует линкер, гидроксильную группу на сахариде предпочтительно связывают с аминогруппой на линкере, например, конъюгацией при использовании CDAP. Дополнительную аминогруппу в линкере (например ADH) можно конъюгировать с карбоксильной группой на белке, например, использованием карбодиимида, например, использованиемEDAC. В одном из воплощений пневмококковый(е) капсульный(е) сахарид(ы) конъюгирован(ы) с линкером сначала, перед конъюгацией линкера с белком-носителем. Или же, линкер можно конъюгировать с носителем перед конъюгацией с сахаридом. Также можно применять комбинацию методик, причем некоторые конъюгаты сахарид-белок получают использованием CDAP, и некоторые конъюгаты сахарид-белок получают восстановительным аминированием. В общем, для сочетания/конъюгации можно применять нижеследующие типы химических групп на белковом носителе:A) карбоксил (к примеру, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном из воплощений эту группу связывают с аминогруппами на сахаридах прямо или с аминогруппой на линкере использованием карбодиимида, например использованием EDAC; Б) аминогруппа (к примеру, через лизин). В одном из воплощений эту группу связывают с карбоксильными группами на сахаридах прямо или с карбоксильной группой на линкере использованием карбодиимида, например использованием EDAC. В еще одном воплощении эту группу связывают с гидроксильными группами, активированными использованием CDAP или CNBr, прямо на сахаридах или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами, имеющими группу, представляющую собой сложный эфир сукцинимида;B) сульфгидрил (к примеру, через цистеин). В одном из воплощений эту группу связывают с бромили хлорацетилированным сахаридом или линкером, используя малеимид. В одном из воплощений эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином; Г) гидроксильная группа (к примеру, через тирозин). В одном из воплощений эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином; Д) имидазолильная группа (к примеру, через гистидин). В одном из воплощений эту группу активируют/модифицируют бис-диазобензидином; Е) гуанидильная группа (к примеру, через аргинин); Ж) индолильная группа (к примеру, через триптофан).-9 015551 На сахариде, в общем, для сочетания можно использовать нижеследующие группы: ОН, СООН илиNH2. Альдегидные группы можно генерировать после разных обработок, известных в данной области,таких как: при использовании перйодата, кислого гидролиза, пероксида водорода и т.д. Способы прямого сочетания: Сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный сложный эфир + NH2-белокконъюгат Сахарид-альдегид + NH2-белокоснование Шиффа + NaCNBH3 конъюгат Сахарид-СООН + NH2-белок + EDACконъюгат Сахарид-NH2 + СООН-белок + EDACконъюгат Способы непрямого сочетания через спейсер (линкер): Сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный сложный эфир + NH2NH2 сахаридNH2 + СООН-белок + EDACконъюгат Сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный сложный эфир + NH2 SHсахаридSH + SHбелок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка использованием SPDP, к примеру)сахарид-S-S-белок Сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный сложный эфир + NH2SHсахаридSH + малеимид-белок (модификация аминогрупп)конъюгат Сахарид-ОН + CNBr или CDAPцианатный сложный эфир + NH2 SHсахарид-SH + галогеноацетилированный-белокконъюгат Сахарид-СООН + EDAC + NH2NH2 сахаридNH2 + EDAC + СООН-белокконъюгат Сахарид-СООН + EDAC+ NH2SHсахаридSH + SH-белок (нативный белок с экспонированным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка с использованием SPDP, к примеру)сахарид-S-S-белок Сахарид-СООН + EDAC+ NH2SHсахаридSH + малеимид-белок (модификация аминогрупп)конъюгат Сахарид-СООН + EDAC + NH2SHсахарид-SH + галогеноацетилированный-белокконъюгат Сахарид-альдегид + NH2NH2 сахаридNH2 + EDAC + СООН-белокконъюгат Примечание: вместо вышеуказанного EDAC можно использовать любой подходящий карбодиимид. Таким образом, типами химической группы на белковом носителе, которые обычно можно использовать для сочетания с сахаридом, являются аминогруппы (к примеру, на лизиновых остатках), СООНгруппы (к примеру, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислоты) и SH-группы (если доступны)(мас./мас.). В одном из воплощений у большей части конъюгатов, например 6, 7, 8, 9 или более, соотношение белка-носителя и сахарида больше чем 1:1, например 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 или 1,6:1. В одном из воплощений по меньшей мере один сахарид S. pneumoniae конъюгирован с белкомносителем через линкер (например ADH) при использовании CDAP и EDAC. Например, 18 С можно конъюгировать с белком через линкер (например, имеющий две группы гидразино на его концах, такой как ADH) при использовании CDAP и EDAC как описано выше. Когда используют линкер, CDAP можно использовать для конъюгации сахарида с линкером, и EDAC можно затем использовать для конъюгации линкера с белком, или альтернативно EDAC можно использовать сначала для конъюгации линкера с белком, после чего CDAP можно использовать для конъюгации линкера с сахаридом. В общем, иммуногенная композиция по этому изобретению может содержать дозу каждого конъюгата сахарида между 0,1 и 20 мкг, 1 и 10 мкг или 1 и 3 мкг сахарида. В одном из воплощений иммуногенная композиция по этому изобретению содержит каждый капсульный сахарид S. pneumoniae в дозе 0,1-20 мкг; 0,5-10 мкг; 0,5-5 мкг или 1-3 мкг сахарида. В одном из воплощений капсульные сахариды могут присутствовать в разных дозировках, например некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе ровно 1 мкг, или некоторые капсульные сахариды могут присутствовать в дозе ровно 3 мкг. В одном из воплощений сахариды из серотипов 3, 18 С и 19F (или 4,18 С и 19F) присутствуют в более высоких дозах, чем дозы других сахаридов. В одном из аспектов этого воплощения серотипы 3, 18 С и 19F (или 4, 18 С и 19F) присутствуют в дозе приблизительно или ровно 3 мкг, в то время как другие сахариды в иммуногенной композиции по этому изобретению присутствуют в дозе приблизительно или ровно 1 мкг."Около" или "приблизительно" определяют как в пределах 10% больше или меньше величины, заданной для целей этого изобретения. В одном из воплощений по меньшей мере один капсульный сахарид из S. pneumoniae конъюгирован непосредственно с белком-носителем (например, использованием одного из химических способов,описанных выше). Предпочтительно по меньшей мере один капсульный сахарид S. pneumoniae конъюгирован непо- 10015551 средственно при использовании CDAP. В одном из воплощений большинство капсульных сахаридов,например 5, 6, 7, 8, 9 или более, связано непосредственно с белком-носителем при использовании CDAP(см. WO 95/08348 и WO 96/29094) Иммуногенная композиция может содержать белки Streptococcus pneumoniae, называемые здесь как белки Streptococcus pneumoniae по этому изобретению. Такие белки можно использовать в качестве белков-носителей, или они могут присутствовать как свободные белки, или они могут присутствовать и как белки-носители, и как свободные белки. Белки Streptococcus pneumoniae по этому изобретению либо находятся на поверхности, по меньшей мере, во время части жизненного цикла пневмококка, либо представляют собой белки, которые пневмококк секретирует или высвобождает. Предпочтительно, белки по этому изобретению выбраны из следующих категорий, таких как: белки, имеющие мотив LXXC сигнальной последовательности типа II (где X представляет собой любую аминокислоту, например семейство полигистидиновой триады (PhtX, холинсвязывающие белки (CbpX), белки, имеющие мотив сигнальной последовательности типа I (например Sp101), белки, имеющие мотив LPXTG (где X представляет собой любую аминокислоту, например, Sp128, Sp130), и токсины (например Ply). Предпочтительными примерами в этих категориях (или мотивах) являются следующие белки или их иммунологически функциональные эквиваленты. В одном из воплощений иммуногенная композиция по этому изобретению содержит по меньшей мере 1 белок, выбранный из группы, состоящей из семейства полигистидиновой триады (PhtX), семейства холин-связывающих белков (CbpX), усеченных форм CbpX, семейства LytX, усеченных форм LytX,химерных (или слитых) белков усеченный CbpX-усеченный LytX, пневмолизина (Ply), PspA, PsaA,Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 и Sp133. В дополнительном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белков, выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновой триады(PhtX), семейства холин-связывающих белков (CbpX), усеченных форм CbpX, семейства LytX, усеченных форм LytX, химерных (или слитых) белков усеченный CbpX - усеченный LytX, пневмолизина (Ply),PspA, PsaA и Sp128. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит 2 или более белков,выбранных из группы, состоящей из семейства полигистидиновой триады (PhtX), семейства холинсвязывающих белков (CbpX), усеченных форм CbpX, семейства LytX, усеченных форм LytX, химерных(или слитых) белков усеченный CbpX - усеченный LytX, пневмолизина (Ply) и Sp128. Семейство Pht (полигистидиновой триады) содержит белки PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. Это семейство отличается последовательностью липидизации, двумя доменами, которые разделяет богатый пролином участком, и несколькими гистидиновыми триадами, возможно участвующими в связывании металла или нуклеозида или в ферментативной активности, (3-5) биспиральными участками, консервативным Nконцом и гетерогенным С-концом. Оно присутствует во всех тестированных штаммах пневмококков. Гомологичные белки также найдены в других Streptococci и в Neisseria. В одном из воплощений этого изобретения белком Pht по этому изобретению является PhtD. Однако надо понимать, что термины Pht А,В, D и Е относятся к белкам, имеющим последовательности, раскрытые в документах, цитированных ниже, а также их встречающиеся в природе (и получаемые человеком) варианты, у которых гомология последовательностей соответствует по меньшей мере 90%-ной идентичности эталонным белкам. Предпочтительно она является 95%-ной и наиболее предпочтительно она является 97%-ной. Что касается белков PhtX, PhtA раскрыт в WO 98/18930 и также обозначен как Sp36. Как отмечено выше, он является белком из семейства полигистидиновой триады и имеет сигнальный мотив LXXC типаII. PhtD раскрыт в WO 00/37105 и также обозначен как Sp036D. Как отмечено выше, он также является белком из семейства полигистидиновой триады и имеет сигнальный мотив LXXC типа II. PhtB раскрыт вWO 00/37105 и также обозначен как Sp036B. Другим членом семейства PhtB является С 3-расщепляющий полипептид, раскрытый в WO 00/17370. Этот белок также входит в семейство полигистидиновой триады и имеет сигнальный мотив LXXC типа II. Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок Sp42, раскрытый в WO 98/18930. В WO 99/15675 раскрыт усеченный PhtB (приблизительно 79 кДа), который также считают членом семейства PhtX. PhtE раскрыт в WO 00/30299 и обозначен как BVH-3. Упоминание здесь любого белка Pht означает, что можно использовать иммуногенные фрагменты или продукты слияния этого белка Pht. Например, ссылка на PhtX включает в себя иммуногенные фрагменты или продукты слияния любого белка Pht. Ссылка на PhtD или PhtB также является ссылкой на продукты слияния PhtDE или PhtBE, какие найдены, например, в WO 0198334. Пневмолизин представляет собой мультифункциональный токсин с характерными цитолитическими (гемолитическими) и комплементактивирующими свойствами (Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med,153:1339-1346 (1996. Этот токсин не секретируется пневмококками, но высвобождается при лизисе пневмококков под влиянием автолизина. Его эффекты включают в себя, например, стимуляцию продукции воспалительных цитокинов человеческими моноцитами, ингибирование мерцания ресничек на респираторном эпителии человека и снижение бактерицидной активности и миграции нейтрофилов. Наиболее очевидным эффектом пневмолизина является лизис эритроцитов, который включает в себя связывание с холестерином. Поскольку он является токсином, его надо детоксифицировать (то есть, сделать нетоксичным для человека при предоставлении в дозировке, подходящей для защиты) перед тем, как его можно вводить in vivo. Экспрессия и клонирование пневмолизина дикого типа или нативного пневмоли- 11015551 зина известны в данной области. См., например, Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987,Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) и Mitchell et al (NAR, 18:4010 (1990. Детоксификацию ply можно осуществлять химическими способами, например обрабатывать его формалином или глутаральдегидом или их комбинацией (WO 04081515, РСТ/ЕР 2005/010258). Такие способы хорошо известны в данной области для различных токсинов. Или же, ply можно детоксифицировать генетически. Таким образом, это изобретение охватывает производные пневмококковых белков, которые могут быть,например, мутированными белками. Термин "мутированный" использован здесь для обозначения молекулы, которую подвергли делеции, добавлению или замене одной или более чем одной аминокислоты при использовании хорошо известных методик направленного мутагенеза или любого другого общепринятого способа. Например, как описано выше, мутантный белок ply можно изменить так, что он будет биологически неактивным, при этом с сохранением его иммуногенных эпитопов, см., например, WO 90/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67:981-985 (1999 и WO 99/03884. Понятно, что при использовании здесь термин "Ply" относится к мутированному или детоксифицированному пневмолизину, подходящему для медицинского применения (то есть, нетоксичному). Что касается семейства холин-связывающих белков (CbpX), то члены этого семейства исходно были идентифицированы как пневмококковые белки, которые можно очищать холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки нековалентно связаны с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и связанной с мембраной липотейхоевой кислоты. В структурном отношении они имеют несколько областей, общих для всего семейства, хотя точная природа этих белков(аминокислотная последовательность, длина, и т.д.) может варьировать. В общем, холинсвязывающие белки содержат N-концевой участок (N), участки консервативных повторов (R1 и/или R2), богатый пролином участок (Р) и консервативный холин-связывающий участок (С), состоящий из многочисленных повторов, которые составляют приблизительно одну половину белка. При использовании в этой заявке термин "семейство холин-связывающих белков (CbpX)" выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, идентифицированных в WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD и CbpG.PbcA раскрыт в WO 98/21337. SpsA представляет собой холин-связывающий белок, раскрытый в WO 98/39450. Предпочтительно, холинсвязывающие белки выбраны из группы, состоящей из CbpA, PbcA,SpsA и PspC. Другое предпочтительное воплощение представляет собой усеченные CbpX, где "CbpX" является таким, как определено выше, и "усеченный" относится к белкам CbpX, лишенным 50% или более холинсвязывающего участка (С). Предпочтительно, такие белки лишены всего холинсвязывающего участка. Более предпочтительно такие усеченные белки лишены (1) холинсвязывающего участка и (2) также части N-концевой половины белка, но сохраняют по меньшей мере один участок повторов (R1 или R2). Еще более предпочтительно, этот усеченный белок имеет 2 участка повторов (R1 и R2). Примерами таких предпочтительных воплощений являются NR1xR2 и R1xR2, проиллюстрированные в WO 99/51266 илиWO 99/51188, однако другие холинсвязывающие белки, лишенные такого же холинсвязывающего участка, также входят в объем этого изобретения. Семейство LytX представляет собой связанные с мембраной белки, ассоциированные с лизисом клеток. N-Концевой домен содержит холинсвязывающий(е) домен(ы), однако семейство LytX не имеет всех признаков вышеуказанного семейства CbpA, и, таким образом, для настоящего изобретения семейство LytX считается отличным от семейства CbpX. В отличие от семейства CbpX, С-концевой домен содержит каталитический домен белка семейства LytX. Это семейство содержит Lyt А, В и С. Что касается семейства LytX, LytA раскрыт в Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB раскрыт в WO 98/18930 и также обозначен как Sp46. LytC также раскрыт в WO 98/18930 и обозначен еще и как Sp91. Предпочтительным членом этого семейства является LytC. Другим предпочтительным воплощением являются усеченные LytX, причем "LytX" является таким,как определено выше, и "усеченный" относится к белкам LytX, лишенным 50% или более холинсвязывающего участка. Предпочтительно, такие белки лишены всего холинсвязывающего участка. Еще одним предпочтительным воплощением этого изобретения являются химерные (или слитые) белки усеченный CbpX-усеченный LytX. Предпочтительно, оно включает в себя NR1xR2 (или R1xR2) из CbpX и С-концевую часть (Cterm, то есть лишенную холин-связывающих доменов) из LytX (например, LytCCterm или Sp91 Cterm). Более предпочтительно CbpX выбран из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA иPspC. Еще более предпочтительно он представляет собой CbpA. Предпочтительно LytX представляет собой LytC (также обозначаемый как Sp91). Другим воплощением настоящего изобретения является усеченный PspA или PsaA, лишенный холинсвязывающего домена (С) и экспрессирующийся в виде белка,слитого с LytX. Предпочтительно, LytX представляет собой LytC. Что касается PsaA и PspA, то оба известны в данной области. Например, PsaA и его варианты с делецией трансмембранного участка описаны в BerryPaton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62. PspA и его варианты с делецией трансмембранного участка раскрыты, например, в US 5804193, WO 92/14488 иSp128 и Sp130 раскрыты в WO 00/76540. Sp125 представляет собой пример пневмококкового по- 12015551 верхностного белка с мотивом LPXTG для закрепления с клеточной стенкой (где X представляет собой любую аминокислоту). Как было обнаружено, любой белок в этом классе пневмококковых поверхностных белков является полезным в контексте этого изобретения и поэтому считается дополнительным белком по этому изобретению. Сам Sp125 раскрыт в WO 98/18930 и также известен как ZmpB - цинксодержащая металлопротеиназа. Sp101 раскрыт в WO 98/06734 (где он имеет обозначениеу 85993). Он характеризуется сигнальной последовательностью типа I. Sp133 раскрыт в WO 98/06734 (где он имеет обозначениеу 85992). Он также характеризуется сигнальной последовательностью типа I. Примерами предпочтительных белковых антигенов Moraxella catarrhalis, которые можно включать в комбинированную вакцину (особенно для предотвращения отита среднего уха) являются: ОМР 106 [WO 97/41731 (Antex) и WO 96/34960 (PMC)]; OMP21 или его фрагменты (WO 0018910); LbpA и/или LbpBD15 (PCT/EP 99/03822); OmplA1 (PCT/EP 99/06781); Hly3 (PCT/EP 99/03257) и OmpE. Примеры нетипируемых антигенов Haemophilus influenzae или их фрагментов, которые можно включать в комбинированную вакцину (особенно для предотвращение отита среднего уха), включают в себя: белок фимбрин [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] и продукты слияния, содержащие пептиды из него [например,слитые пептиды LB1(f); US 5843464 (OSU) или WO 99/64067]; ОМР 26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [ЕР 281673 (State University of New York)]; TbpA и/или TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3;Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2 и Р 5 (WO 94/26304). Также может быть полезно комбинировать белки по этому изобретению. Комбинирование означает,что иммуногенная композиция содержит все белки из нижеследующих комбинаций либо в качестве белков-носителей, либо свободных белков, либо смеси тех и других. Например, в комбинации двух белков,как указано здесь ниже, оба белка можно использовать как белки-носители, или оба белка могут присутствовать как свободные белки, или оба могут присутствовать как в качестве носителя, так и в качестве свободного белка, или один может присутствовать в качестве белка-носителя и свободного белка, в то время как другой присутствует только в качестве белка-носителя или только в качестве свободного белка, или один может присутствовать в качестве белка-носителя, а другой в качестве свободного белка. Если имеет место комбинация трех белков, существуют такие же возможности. Предпочтительные комбинации включают в себя, без ограничения ими: PhtD + NR1xR2, PhtD + химерные или слитые белкиNR1R2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + химерные или слитые белки NR1R2-Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1R2+ LytC, NR1R2 + PspA, NR1R2 + PsaA, NR1R2 + Sp128, R1R2 + LytC, R1R2 + PspA, R1R2 + PsaA,R1R2 + Sp128, R1R2 + PhtD, R1R2 + PhtA. Предпочтительно, NR1R2 (или R1R2) получен из CbpA или PspC. Более предпочтительно, он получен из CbpA. Другие комбинации включают в себя комбинации 3 белков, такие как PhtD + NR1R2 + Ply и PhtA + NR1R2 + PhtD. В одном из воплощений, вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtDE в качестве белковносителей. В дополнительном воплощении вакцинная композиция содержит детоксифицированный пневмолизин и PhtD или PhtDE в качестве свободных белков. В настоящем изобретении дополнительно предложена вакцина, содержащая иммуногенные композиции по этому изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Вакцины по настоящему изобретению могут содержать адъювант, особенно когда они предназначены для применения у пожилых людей. Подходящие адъюванты включают в себя соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия, но могут также представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированные сахара, дериватизированные катионным или анионным путем сахариды или полифосфазины. Предпочтительно адъювант выбран в качестве преимущественного индуктора ответа типа ТН 1. Такие высокие уровни цитокинов Th1-типа имеют тенденцию к преимущественной индукции опосредованных клетками иммунных ответов на данный антиген, в то время как высокие уровни цитокинов Th2-типа имеют тенденцию к преимущественной индукции гуморальных иммунных ответов на антиген. Различие Th1- и Th2-типа иммунного ответа не является абсолютным. В реальности, индивид будет поддерживать иммунный ответ, который описывают как представляющий собой преимущественно Th1 или преимущественно Th2. Однако часто удобно рассматривать семейства цитокинов в терминах, которые представлены для мышиных CD4-позитивных Т-клеточных клонов в Mosmann and Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 и ТН 2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, p145-173). Ответы Th1-типа традиционно ассоциируются с продукцией Т-лимфоцитами цитокинов INF- и IL-2. Другие цитокины, такие как IL-12,часто прямо ассоциированные с индукцией иммунных ответов Th1-типа, не продуцируются Т-клетками,Напротив, ответы Th2-типа ассоциированы с секрецией IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Подходящие адъювантные- 13015551 системы, которые способствуют преимущественно Th1-ответу, включают в себя: монофосфорил липид А или его производное (или детоксифицированный липид А, в общем см., к примеру, WO 2005107798), в частности, 3-де-О-ацилированный монофосфорил липида A (3D-MPL) (его получение см. в GB 2220211 А); и комбинации монофосфорила липида А, предпочтительно 3-де-О-ацилированного монофосфорила липида А, либо с солью алюминия (к примеру фосфатом алюминий или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло в воде. В таких комбинациях антиген и 3D-MPL содержатся в одних и тех же структурах, представляющих собой частицы, что делает возможной более эффективную доставку антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3D-MPL способен дополнительно усиливать иммуногенность антигена, адсорбированного на квасцах [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В 1]. Усиленная система включает в себя комбинацию монофосфорила липида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, конкретно, комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто вWO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 гасят холестерином, как раскрыто в WO 96/33739. Особенно сильнодействующий адъювантный препарат, включающий в себя QS21, 3D-MPL(или детоксифицированный липид А) и токоферол в эмульсии масла в воде, описан в WO 95/17210. В одном из воплощений иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, которым может быть QS21. Препарат может также содержать эмульсию масло в воде и токоферол (WO 95/17210). Олигонуклеотиды, содержащие неметилированные CpG, (WO 96/02555), и другие иммуномодулирующие олигонуклеотиды (WO 0226757 и WO 03507822) также являются преимущественными индукторами ТН 1-ответа и подходят для применения в настоящем изобретении. Конкретные адъюванты выбраны из группы солей металла, эмульсий масло в воде, агонистов Tollподобных рецепторов (в частности, агониста Toll-подобного рецептора 2, агониста Toll-подобного рецептора 3, агониста Toll-подобного рецептора 4, агониста Toll-подобного рецептора 7, агониста Tollподобного рецептора 8 и агониста Toll-подобного рецептора 9), сапонинов или их комбинаций. Адъюванты, которые можно использовать с вакцинными композициями по этому изобретению,представляют собой препарат пузырька или везикулы внешней мембраны из грамотрицательных бактериальных штаммов, таких как раскрыты в WO 02/09746, конкретно, пузырьков N. meningitidis. Адъювантные свойства этих пузырьков можно улучшить сохранением ЛОС (липоолигосахарида) на его поверхности (например, при использовании экстракции низкими концентрациями детергента [например 00,1% дезоксихолата]). ЛОС можно детоксифицировать мутациями msbB(-) или htrB(-), рассмотренными вWO 02/09746. Адъювантные свойства можно также улучшить сохранением PorB (и возможно удалениемPorA) из менингококковых пузырьков. Адъювантные свойства можно также улучшить усечением структуры сахаридного ядра внешних ЛОС на менингококковых пузырьках, к примеру, мутацией IgtB(-), рассмотренной в WO 2004/014417. Или же, указанные ЛОС (например, изолированные из штамма msbB(-) и/или IgtB(- можно очистить для использования в качестве адъюванта в композиции по этому изобретению. Дополнительный адъювант, который можно использовать с композициями по этому изобретению,можно выбрать из группы: сапонин, липид А или его производное, иммуностимулирующий олигонуклеотид, фосфат алкилглюкозамина, эмульсия масло в воде или их комбинации. Дополнительным предпочтительным адъювантом является соль металла в комбинации с другим адъювантом. Предпочтительным является то, что этот адъювант является агонистом Toll-подобного рецептора, в частности, агонистомToll-подобного рецептора 2, 3, 4, 7, 8 или 9, или сапонином, в частности, Qs21. Дополнительно предпочтительным является то, что адъювантная система содержит два или более чем два адъюванта из указанного перечня. В частности, эти комбинации предпочтительно содержат адъювант сапонин (в частности,Qs21) и/или агонист Toll-подобного рецептора 9, такой как CpG-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Другие предпочтительные комбинации содержат сапонин (в частности, QS21) и агонистToll-подобного рецептора 4, такой как монофосфорил липида А или его 3-деацилированное производное,3D-MPL, или сапонин (в частности, QS21) и лиганд Toll-подобного рецептора 4, такой как алкилглюкозаминидфосфат. Особенно предпочтительными адъювантами являются комбинации 3D-MPL и QS21 (ЕР 0671948 В 1), эмульсии масло в воде, содержащие 3D-MPL и QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), или 3D-MPL,приготовленные с другими носителями (ЕР 0689454 В 1). Другие предпочтительные адъювантные системы содержат комбинацию 3D MPL, QS21 и CpG-олигонуклеотидов как описано в US 6558670, US 6544518. В одном из воплощений адъювант представляет собой (или содержит) лиганд Toll-подобного рецептора (TLR) 4, предпочтительно агонист, такой как производное липида А, конкретно, монофосфорил липид А или, более конкретно, 3-деацилированный монофосфорил липид А (3D-MPL). 3D-MPL доступен от GlaxoSmithKline Biologicals North America и главным образом улучшает ответы Т-клеток типа CD4+ с фенотипом IFN- (Th1). Его можно получать в соответствии со способами, раскрытыми в GB 2220211 А. В химическом отношении он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфорила липида А с 3-, 4-, 5- или 6-ацилированными цепями. Предпочтительно, в композициях по настоящему изобретению используют мелкие частицы 3D-MPL. Мелкие частицы 3D-MPL имеют та- 14015551 кой размер частицы, что их можно стерилизовать фильтрацией через 0,22-мкм фильтр. Такие препараты раскрыты в международной заявке на патентWO 94/21292. Синтетические производные липида А известны и считаются агонистами TLR-4 в том числе, без ограничения: ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоноDглюкопиранозил]-2-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]D-глюкопиранозилдигидрофосфат)AGP), или фармацевтически приемлемые соли AGP, раскрытые в US 6764840. Некоторые AGP являются агонистами TLR4, а некоторые AGP являются антагонистами TLR4. И те, и другие считаются полезными в качестве адъювантов. Другим предпочтительным иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Quil А и его производные. Quil A представляет собой препарат сапонина, выделенного из южноамериканского дерева Quilaja saponaria Molina, и впервые описан как имеющий адъювантную активность в 1974 у Dalsgaard et al. ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag,Berlin, p. 243-254). При использовании ВЭЖХ были выделены очищенные фрагменты Quit А, которые сохраняют адъювантную активность без токсичности, ассоциированной с Quil А (ЕР 0362278), напримерQS7 и QS21 (также известные как QA7 и QA21). QS-21 является натуральным сапонином, полученным из коры Quillaja saponaria Molina, который индуцирует цитотоксические Т-клетки типа CD8+ (CTL), Th1 клетки и преимущественно ответ на lgG2 а-антитела и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения. Описаны конкретные препараты QS21, которые являются особенно предпочтительными, эти препараты дополнительно содержат стерол (WO 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл, смешанных мицелл (предпочтительно, но не исключительно, с солями желчных кислот), или могут быть в форме ISCOM-матриц (ЕР 0109942 В 1), липосом или родственных коллоидных структур, таких как червеобразные или кольцевидные мультимерные комплексы или липидные слоистые структуры и ламеллы, когда их приготавливают с холестерином и липидом,или в форме эмульсии масло в воде (например, как в WO 95/17210). Сапонины предпочтительно могут быть ассоциированы с солью металла, такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (WO 98/15287). Предпочтительно, сапонин предоставляют в форме липосомы, иммуностимулирующего комплексаISCOM или эмульсии масло в воде. Усиленные системы включают в себя комбинацию монофосфорила липида А (или детоксифицированного липида А) и производного сапонина, конкретно, комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 гасят холестерином, как раскрыто в WO 96/33739. Особенно сильнодействующий адъювантный препарат, включающий в себя токоферол в присутствии или в отсутствие QS21 и/или 3D-MPL в эмульсии масло в воде, описан в WO 95/17210. В одном из воплощений иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, которым может быть QS21. Также можно использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды или любой другой агонистToll-подобного рецептора (TLR) 9. Предпочтительные олигонуклеотиды для применения в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению представляют собой CpG-содержащие олигонуклеотиды,предпочтительно содержащие два или более динуклеотидных мотива CpG, разделенных по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. CpG-мотив представляет собой нуклеотид цитозин с последующим нуклеотидом гуанином. CpG-олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются в типичных случаях дезоксинуклеотидами. В предпочтительном воплощении межнуклеотидной группировкой в олигонуклеотиде является фосфородитиоат или, более предпочтительно, фосфоротиоатная связь, хотя в объем этого изобретения входят фосфодиэфиры и другие межнуклеотидные связи. Также в объем этого изобретения включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоатов раскрыты в US 5666153, US 5278302 и WO 95/26204. Примеры предпочтительных олигонуклеотидов имеют следующие последовательности. Эти последовательности предпочтительно содержат фосфоротиоатные модифицированные межнуклеотидные связи. ОЛИГО 1 (SEQ ID NO:1): ТСС ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) ОЛИГО 2 (SEQ ID NO:2): ТСТ ССС AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) ОЛИГО 3 (SEQ ID NO:3): АСС GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG ОЛИГО 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) ОЛИГО 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)- 15015551 ОЛИГО 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Альтернативные CpG-олигонуклеотиды могут содержать вышеуказанные предпочтительные последовательности, у которых есть непоследовательные делеции или добавления к ним.CpG-олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, можно синтезировать любым способом, известным в данной области (например см. ЕР 468520). Удобным является то, что такие олигонуклеотиды можно синтезировать при использовании автоматического синтезатора. Адъювант может представлять собой эмульсию масло в воде или может содержать эмульсию масло в воде в комбинации с другими адъювантами. Масляная фаза эмульсионной системы предпочтительно содержит метаболизируемое масло. Значение термина метаболизируемое масло хорошо известно в данной области. Метаболизируемое можно определить как "способное к трансформированию метаболизмом" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974. Это масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное или синтетическое масло, которое не является токсичным для реципиента и способно к трансформации посредством метаболизма. Орехи,семена и зерна представляют собой обычные источники растительных масел. Синтетические масла также являются частью этого изобретения и могут включать в себя имеющиеся в продаже масла, такие какNEOBEE и другие. Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаноат) представляет собой ненасыщенное масло, которое найдено в больших количествах в жире печени акулы и, в меньших количествах, в оливковом масле, в масле пшеничных зародышей, в масле рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло на основании того факта того, что он является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Merck index, 10th Edition, entry 8619). В адъювантах, представляющих собой эмульсии масло в воде, также часто используют производные токола (например витамин Е) (ЕР 0382271 В 1; US 5667784; WO 95/17210). Производные токола, используемые в масляных эмульсиях (предпочтительно, в эмульсиях масло в воде) по этому изобретению,можно приготавливать, как описано в ЕР 0382271 В 1, так как эти производные токола могут представлять собой дисперсии капелек токола, возможно содержащие эмульгатор, предпочтительно менее чем 1 мкм в диаметре. Альтернативно, производные токолов можно использовать в комбинации с другим маслом с образованием масляной фазы масляной эмульсии. Здесь раскрыты примеры масляных эмульсий,которые можно использовать в комбинации с токолом, такие как описанные выше метаболизируемые масла. Адъюванты, представляющие собой эмульсию масло в воде, были сами по себе предложены как полезные в качестве адъювантных композиций (ЕР 0399843 В), а также комбинации эмульсий масло в воде и других активных агентов были описаны в качестве адъювантов для вакцин (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Были описаны другие адъюванты, представляющие собой масляную эмульсию, такие как эмульсии вода в масле (US 5422109; ЕР 0480982 В 2) и эмульсии вода в масле в воде (US 5424067; ЕР 0480981 В). Все они образуют предпочтительные системы масляных эмульсий (в частности, когда включают в себя производные токола) для получения адъювантов и композиций по настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно, масляная эмульсия (к примеру, эмульсии масло в воде) дополнительно содержит эмульгатор, такой как TWEEN 80, и/или стерол, такой как холестерин. Предпочтительная масляная эмульсия (предпочтительно, эмульсия масло-в-воде) содержит метаболизируемое нетоксичное масло, такое как сквалан, сквален или токоферол, такой как альфа-токоферол (и, предпочтительно, как сквален, так и альфа-токоферол) и возможно эмульгатор (или поверхностно-активное вещество), такой как Tween 80. Также может быть включен стерол (предпочтительно холестерин). Способ получения эмульсий масло в воде хорошо известен специалисту в данной области. В общем, этот способ включает перемешивание масляной фазы, содержащей токол, с поверхностно-активным веществом, таким как раствор PBS/TWEEN80, при последующем гомогенизировании при использовании гомогенизатора, причем специалисту в данной области будет понятно, что этот способ, включающий пропускание этой смеси дважды через иглу шприца, должен быть подходящим для гомогенизирования малых объемов жидкости. В равной мере, способ эмульгации в микрофлюидизаторе (устройство M110S Microfluidics, максимум 50 прохождений за период 2 мин при максимальном входном давлении 6 бар (600103 Па) (выходное давление приблизительно 850 бар (850105 Па может быть адаптирован специалистом в данной области для получения меньших или больших объемов эмульсии. Эту адаптацию можно осуществить обычным экспериментированием, включающим проведение измерений получившейся эмульсии до достижения препарата с капельками масла требуемого диаметра. В эмульсии масло в воде масло и эмульгатор должны быть в водном носителе. Водным носителем может быть, например, забуференный фосфатом физраствор. Размер капелек масла, обнаруживаемых в стабильной эмульсии масла в воде, предпочтительно составляет менее чем 1 мкм, и он может быть в диапазоне, по существу, 30-600 нм, предпочтительно, по существу, около 30-500 нм в диаметре и наиболее предпочтительно по существу 150-500 нм в диаметре и, в частности, приблизительно 150 нм в диаметре при измерении фотонной корреляционной спектро- 16015551 скопией. В этом отношении быть в пределах предпочтительных диапазонов должно быть 80% капелек масла по числу, более предпочтительно в определенном диапазоне размеров находится более чем 90% и наиболее предпочтительно более чем 95% капелек масла по числу. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях по настоящему изобретению, удобным образом находятся в диапазоне 0,5-20% или от 2 до 10% масла (суммарный объем дозы), такого как сквален; и, когда он присутствует, от 2 до 10% альфа-токоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Предпочтительно соотношение масла (предпочтительно сквалена) и токола(предпочтительно -токоферола) равно или меньше чем 1, поскольку это дает более стабильную эмульсию. Эмульгатор, такой как Tween 80 или Span 85 также может присутствовать на уровне приблизительно 1%. В некоторых случаях преимуществом может быть то, что вакцины по настоящему изобретению должны дополнительно содержать стабилизатор. Примеры предпочтительных эмульсионных систем раскрыты в WO 95/17210, WO 99/11241 и WO 99/12565, которые раскрывают эмульсионные адъюванты на основе сквалена, -токоферола и TWEEN 80, возможно приготавливаемые с иммуностимуляторами QS21 и/или 3D-MPL. Таким образом, в особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения адъювант по этому изобретению может дополнительно содержать дополнительные иммуностимуляторы, такие как ЛПС или его производные и/или сапонины. Примеры дополнительных иммуностимуляторов раскрыты здесь и в "Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., andNewman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. В предпочтительном аспекте адъювант и иммуногенные композиции по этому изобретению содержат сапонин (предпочтительно QS21) и/или производное ЛПС (предпочтительно 3D-MPL) в масляной эмульсии, описанной выше, возможно со стеролом (предпочтительно холестерином). Масляная эмульсия(предпочтительно эмульсия масла в воде) может дополнительно содержать span 85, и/или лецитин, и/или трикаприлин. Адъюванты, содержащие эмульсию масла в воде, стерол и сапонин, раскрыты в WO 99/12565. В типичных случаях для введения человеку сапонин (предпочтительно QS21) и/или производное ЛПС (предпочтительно 3D-MPL) должны присутствовать в дозе иммуногенной композиции для человека в диапазоне от 1 до 200 мкг, таком как 10-100 мкг, предпочтительно 10-50 мкг на дозу. В типичных случаях масляная эмульсия (предпочтительно, эмульсия масла в воде) должна содержать от 2 до 10% метаболизируемого масла. Предпочтительно она должна содержать от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% альфатокоферола и от 0,3 до 3% (предпочтительно 0,4-2%) эмульгатора (предпочтительно tween 80 [моноолеат полиоксиэтиленсорбитана]). Если присутствуют оба, сквален и альфа-токоферол, соотношение сквален:альфа-токоферол предпочтительно является равным 1 или меньшим чем 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. В эмульсиях, используемых в этом изобретении, также может присутствовать Span 85 (триолеат сорбитана) на уровне от 0,5 до 1%. В некоторых случаях преимуществом может быть то, что иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению должны дополнительно содержать стабилизатор, например другие эмульгаторы/поверхностно-активные вещества, в том числе каприловую кислоту (Merck index 10th Edition, entry1739), из которых особенно предпочтительным является трикаприлин. При включении сквалена и сапонина (предпочтительно QS21) также полезно включать в препарат стерол (предпочтительно холестерин), поскольку это позволяет снизить суммарный уровень масла в эмульсии. Это приводит к снижению стоимости производства, к улучшению общего удобства вакцинации, а также к качественному и количественному улучшению получаемых иммунных ответов, таким как улучшение продукции IFN-. Соответственно, адъювантная система по настоящему изобретению в типичных случаях содержит соотношение метаболизируемое масло:сапонин (мас./мас.) в диапазоне от 200:1 до 300:1, также настоящее изобретение можно использовать в "низкомасляной" форме, предпочтительным диапазоном для которой является от 1:1 до 200:1, предпочтительно от 20:1 до 100:1 и наиболее предпочтительно большей частью 48:1, причем эта вакцина сохраняет полезные адъювантные свойства всех компонентов при гораздо более низком профиле реактогенности. Соответственно, особенно предпочтительные воплощения имеют соотношение сквален:QS21 (мас./мас.) в диапазоне от 1:1 до 250:1,также предпочтительным диапазоном является от 20:1 до 200:1, предпочтительно от 20:1 до 100:1 и, наиболее предпочтительно, большей частью 48:1. Предпочтительно, также включен стерол (наиболее предпочтительно, холестерин) в соотношении сапонин:стерол, как описано здесь. Эмульсионные системы по настоящему изобретению предпочтительно имеют малый размер капельки масла в субмикронном диапазоне. Наиболее предпочтительно, размеры капельки масла должны быть в диапазоне от 120 до 750 нм и, наиболее предпочтительно, 120-600 нм в диаметре. Особенно сильнодействующий адъювантный препарат (для конечной комбинации с AIPO4 в иммуногенной композиции по этому изобретению) содержит сапонин (предпочтительно QS21), производное ЛПС (предпочтительно 3D-MPL) и масляную эмульсию (предпочтительно сквален и альфа-токоферол в эмульсии масла в воде) как описано в WO 95/17210 или в WO 99/12565 (в частности, адъювантный препарат 11 в примере 2, табл. 1).- 17015551 Примеры агониста TLR2 включают в себя пептидогликан или липопротеин. Известными агонистами TLR7 являются имидазохинолины, такие как имиквимод и резиквимод. Одноцепочечная РНК также является известным агонистом TLR (TLR8 у людей и TLR7 у мышей), тогда как двухцепочечная РНК и поли-IC (полиинозиновая-полицитидиловая кислота - коммерческий синтетический имитатор вирусной РНК) являются примерами агонистов TLR3. 3D-MPL является примером агониста TLR4, в то время какCpG является примером агониста TLR9. Иммуногенная композиция может содержать антиген и иммуностимулятор, адсорбированный на соли металла. Вакцинные препараты на основе алюминия, где антиген и иммуностимулятор 3-де-Оацилированный монофосфорил липид A (3D-MPL) адсорбированы на одной и той же частице, раскрыты в ЕР 0576478 В 1, ЕР 0689454 В 1 и ЕР 0633784 В 1. В этих случаях на соль алюминия сначала адсорбируют антиген и затем на те же частицы соли алюминия адсорбируют иммуностимулятор 3D-MPL. Такие способы сначала включают суспендирование 3D-MPL обработкой ультразвуком в водяной бане до уменьшения размера частиц до 80-500 нм. Антиген в типичных случаях адсорбируют на соли алюминий в течение одного часа при комнатной температуре при перемешивании. Затем добавляют к адсорбированному антигену суспензию 3D-MPL и инкубируют препарат при комнатной температуре в течение 1 ч и затем хранят при 4 С до использования. В другом способе иммуностимулятор и антиген находятся на отдельных частицах металла, как описано в ЕР 1126876. Этот улучшенный процесс включает адсорбцию иммуностимулятора на частице соли металла с последующей адсорбцией антигена на другой частице соли металла с последующим смешиванием этих отдельных металлических частиц для получения вакцины. Адъювант для применения в настоящем изобретении может представлять собой адъювантную композицию, содержащую иммуностимулятор, адсорбированный на частице соли металла, отличающуюся тем, что частица соли металла является, по существу, свободной от другого антигена. Более того, в настоящем изобретении предложены вакцины, которые отличаются тем, что иммуностимулятор адсорбирован на частицах соли металла, которые являютс, по существу, свободными от другого антигена, и тем, что частицы соли металла, которые адсорбированы на антигене, являются, по существу, свободными от другого иммуностимулятора. Соответственно, в настоящем изобретении предложен адъювантный препарат, содержащий иммуностимулятор, который адсорбирован на частице соли металла, отличающийся тем, что эта композиция является, по существу, свободной от другого антигена. Более того, этот адъювантный препарат может быть промежуточным, таким что при использовании такого адъюванта, он требуется для изготовления вакцины. Соответственно, предложен способ получения вакцины, включающий смешивание адъювантной композиции, которая представляет собой один или более чем один иммуностимулятор, адсорбированный на частице металла с антигеном. Предпочтительно, антиген предварительно адсорбирован на соли металла. Указанная соль металла может быть такой же или похожей на соль металла, которая адсорбирована на иммуностимуляторе. Предпочтительно, соль металла представляет собой соль алюминия,например фосфат алюминия или гидроксид алюминия. В настоящем изобретении дополнительно предложена вакцинная композиция, содержащая иммуностимулятор, адсорбированный на первой частице соли металла, и антиген, адсорбированный на соли металла, отличающаяся тем, что первая и вторая частицы соли металла представляют собой отдельные частицы. Производные или мутации ЛПС или ЛОС или производные липида А, описанные здесь, разработаны так, чтобы быть менее токсичными (например 3D-MPL), чем нативные липополисахариды, и являются взаимозаменяемыми эквивалентами в том, что относится к любым применениям этих группировок,описанным здесь. Они могут быть лигандами TLR4, как описано выше. Другие такие производные раскрыты в WO 020786737, WO 9850399, WO 0134617, WO 0212258, WO 03065806. В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по этому изобретению, содержит носитель, представляющий собой липосому, (который получен известными способами из фосфолипидов(таких как диолеилфосфатидилхолин [DOPC]) и возможно стерола [такого как холестерин]). Такие носители, представляющие собой липосому, могут нести производные липида А [такие как 3D-MPL - см. выше] и/или сапонины (такие как QS21 - см. выше). В одном из воплощений адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,1-10 мг, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2 или 0,5-1 мг (например 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 или 1 мг) фосфолипида (к примеру, DOPC), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг (например 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерола (к примеру, холестерина), 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20,30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру, 3D-MPL) и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (к примеру, QS21). Этот адъювант является особенно подходящим для вакцинных препаратов для пожилых людей. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, получаемых, по меньшей мере, из всех нижеследующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5,7F (и могут также содержать один или более из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), причем GMC (геометрическое среднее концентрации, ГСК) титр антител, индуцированных против одного или более чем одного(или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F, незначительно ниже того, который индуцирует вакцина Prevnar у вакцинированных людей. В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по этому изобретению, содержит- 18015551 эмульсию масло в воде, полученную из метаболизируемого масла (такого как сквален), эмульгатор (такой как Tween 80) и возможно токол (такой как альфа-токоферол). В одном из воплощений адъювант содержит (на 0,5 мл дозы) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8 или 5-6 мг (например 2-3, 5-6 или 10-11 мг) метаболизируемого масла (такого как сквален), 0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4 или 2-3 мг (например 0,9-1,1, 2-3 или 45 мг) эмульгатора (такого как Tween 80) и возможно 0,5-20, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (например 11-13, 5-6 или 2-3 мг) токола (такого как альфа-токоферол). Этот адъювант возможно дополнительно может содержать 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру 3D-MPL). Эти адъюванты являются особенно подходящими для вакцинных препаратов для младенцев или пожилых людей. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, полученных по меньшей мере из всех нижеследующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14,18 С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А, 19 А, и 22F), причем ГСК титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F незначительно ниже того, что индуцировано вакцинойPrevnar у вакцинированных людей. Этот адъювант может содержать возможно 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3 или 0,125-0,25 мг(например 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 или 0,125 мг) стерола (к примеру, холестерина), 5-60, 10-50, или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру, 3D-MPL) и 5-60,10-50, или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) сапонина (к примеру, QS21). Этот адъювант является особенно подходящим для вакцинных препаратов для пожилых людей. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, полученных по меньшей мере из всех нижеследующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F, 23F, 1, 5,7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А, 19 А и 22F), причем ГСК титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6 В,9V, 14, 18 С, 19F и 23F незначительно ниже того, что индуцировано вакциной Prevnar у вакцинированных людей. В одном из воплощений адъювант, используемый для композиций по этому изобретению, содержит фосфат алюминия и производное липида А (такое как 3D-MPL). Этот адъювант может содержать (на 0,5 мл дозы) 100-750, 200-500 или 300-400 мкг Al в виде фосфата алюминия и 5-60, 10-50 или 20-30 мкг (например 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 или 50 мкг) производного липида А (к примеру, 3D-MPL). Этот адъювант является особенно подходящим для вакцинных препаратов для пожилых людей или младенцев. В одном из воплощений вакцинная композиция, содержащая этот адъювант, содержит конъюгаты сахаридов, полученных по меньшей мере из всех нижеследующих серотипов: 4, 6 В, 9V, 14, 18 С,19F, 23F, 1, 5, 7F (и может также содержать один или более чем один из серотипов 3, 6 А, 19 А, и 22F),причем ГСК титр антител, индуцированных против одного или более чем одного (или всех) компонента(ов) вакцины 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F незначительно ниже того, что индуцирует вакцина Prevnar у вакцинированных людей. Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно использовать для защиты или лечения млекопитающего, подверженного инфекции, введением указанной вакцины системным путем или через слизистую. Эти введения могут включать в себя инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным путем или введение через слизистую в ротовой/пищеварительный, дыхательный, мочеполовой тракты. Можно осуществлять интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или отита среднего уха (поскольку так можно более эффективно предотвращать носительство пневмококков в носоглотке, таким образом ослабляя инфекцию на ее самой ранней стадии). Хотя вакцину по этому изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты можно также вводить совместно в одно и то же время или в разные моменты времени (к примеру, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить раздельно, в одно и то же время или через 1-2 недели после введения любого компонента вакцины, представляющего собой бактериальный белок, для оптимальной координации иммунных ответов относительно друг друга). Для совместного введения возможный Th1-адъювант может присутствовать в любом или всех из числа разных введений. Вдобавок к единственному пути введения, можно использовать 2 разных пути введения. Например, сахариды или конъюгаты сахаридов можно вводить внутримышечным (IM) или внутрикожным(ID) путем, а бактериальные белки можно вводить интраназальным (IN) или ID путем. Вдобавок, вакцины по этому изобретению можно вводить IM путем для примирующих доз и IN путем для бустерных доз. Содержание белковых антигенов в вакцине в типичных случаях будет находиться в диапазоне от 1 до 100 мкг, предпочтительно от 5 до 50 мкг, в наиболее типичных случаях в диапазоне от 5 до 25 мкг. После исходной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные промежутки. Получение вакцин в общем описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсулирование в липосомах описано в Fullerton, Патент США 4235877.- 19015551 Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизировать. Предпочтительно, раствор лиофилизируют в присутствии сахара, такого как сахароза или лактоза. Еще более предпочтительным является то, что их лиофилизируют и восстанавливают непосредственно перед применением. Лиофилизация может приводить к более стабильной композиции (вакцине) и, возможно, приводить к повышенным титрам антител в присутствии 3D-MPL и в отсутствие адъюванта на основе алюминия. В одном из аспектов этого изобретения предложен вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по этому изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано здесь. Предусмотрено, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции. Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описанных вакцин в кожу (ID) образует одно из воплощений настоящего изобретения. Человеческая кожа содержит внешнюю "роговую" кутикулу, называемую роговым слоем, которая покрывает эпидермис. Ниже этого эпидермиса находится слой, который называют дермой, в свою очередь покрывающий подкожную ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу и, в частности, в дерму стимулирует иммунный ответ, что может также быть связано с множеством дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанными здесь вакцинами образует предпочтительный признак настоящего изобретения. Общепринятая методика внутрикожной инъекции, "процедура манту", включает стадии очистки кожи и затем, при оттягивании одной рукой и при том, что острие тонкой иглы (калибр 26-31) направлено вверх, введения иглы под углом 10-15. Когда острие иглы введено, стержень иглы опускают и дополнительно продвигают, прилагая легкое давление для того, чтобы приподнять ее под кожей. Затем очень медленно инъецируют жидкость, чем образуют пузырек или вздутие на поверхности кожи, и затем медленно извлекают иглу. Недавно были описаны устройства, которые специально предназначены для введения жидких агентов в или через кожу, например устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, а также описаны устройства для струйной инъекции, например, в WO 01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать общепринятые шприцы и иглы или устройства, предназначенные для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или чрескожные пластыри (WO 97/48440; WO 98/28037), или нанесение на поверхность кожи (чрезкожная или трансдермальная доставка WO 98/20734; WO 98/28037). Когда вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу или, более конкретно, в дерму, вакцина находится в малом объеме жидкости, конкретно, в объеме между приблизительно 0,05 и 0,2 мл. Содержание антигенов в кожных или внутрикожных вакцинах по настоящему изобретению может быть таким же, как общепринятые дозы во внутримышечных вакцинах (см. выше). Однако признаком кожных или внутрикожных вакцин является то, что эти препараты могут быть "низкодозовыми". Соответственно, белковые антигены в "низкодозовых" вакцинах предпочтительно присутствуют в таких малых количествах, как от 0,1 до 1 мкг, предпочтительно от 0,1 до 5 мкг на дозу; и сахаридные (предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне от 0,01 до 1 мкг и предпочтительно от 0,01 до 0,5 мкг сахарида на дозу. При использовании здесь термин "внутрикожная доставка" означает доставку вакцины в область дермы в коже. Однако вакцина не обязательно должна быть локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, локализованный между приблизительно 1,0 и приблизительно 2,0 мм от поверхности в коже человека, но между индивидами и в разных частях организма имеет место определенная степень варьирования. В общем, можно предполагать достижение дермы прохождением на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма находится между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и нижележащим подкожным слоем. В зависимости от способа доставки, вакцина может в конечном счете быть локализованной исключительно или главным образом в пределах дермы, или она может в конечном счете быть распределенной в пределах эпидермиса и дермы. В настоящем изобретении дополнительно предложена улучшенная вакцина для предотвращения или ослабления отита среднего уха, вызванного Haemophilus influenzae, добавлением белков Haemophilusinfluenzae (см. выше), например белка D в свободной или конъюгированной форме. Вдобавок, в настоящем изобретении дополнительно предложена улучшенная вакцина для предотвращения или ослабления пневмококковой инфекции у младенцев (например отита среднего уха) на основе добавления одного или двух пневмококковых белков (см. выше) в виде свободного или конъюгированного белка к композиции конъюгата S. pneumoniae по этому изобретению. Указанные пневмококковые свободные белки могут быть одинаковыми или иными, чем любые белки S. pneumoniae, использованные как белки-носители. Также в комбинированную вакцину можно включить один или более чем один белковый антиген Moraxella catarrhalis (см. выше) в свободной или конъюгированной форме. Таким образом, настоящее изобре- 20015551 тение представляет собой улучшенный способ вызывать (защитный) иммунный ответ против отита среднего уха у младенцев. В еще одном воплощении настоящее изобретение представляет собой улучшенный способ вызывать (защитный) иммунный ответ у младенцев (в возрасте 0-2 года) введением безопасного и эффективного количества вакцины по этому изобретению. Дополнительные воплощения настоящего изобретения заключаются в том, чтобы предложить антигенные композиции конъюгатов S. pneumoniae по этому изобретению для применения в медицине и применение конъюгатов S. pneumoniae по этому изобретению в изготовлении лекарства для предотвращения (или лечения) пневмококкового заболевания. В еще одном воплощении настоящее изобретение представляет собой улучшенный способ вызывать (защитный) иммунный ответ у пожилого населения (в контексте настоящего изобретения пациентов считают пожилыми, если их возраст равен 50 годам или превышает 50 лет, в типичных случаях превышает 55 лет и обычно превышает 60 лет) введением безопасного и эффективного количества вакцины по этому изобретению, предпочтительно, в сочетании с одним или двумя белками S. pneumoniae в виде свободного(ых) или конъюгированного(ых) белка(ов), причем свободные белки S. pneumoniae могут быть теми же или иными, чем любые белки S. pneumoniae, использованные как белки-носители. Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой способ иммунизации человекареципиента против заболевания, вызываемого инфекцией S. pneumoniae и возможно Haemophilus influenzae, включающий введение реципиенту иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины, или набора по этому изобретению. Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой иммуногенную композицию по этому изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого инфекциейS.pneumoniae и возможно Haemophilus influenzae. Дополнительный аспект этого изобретения представляет собой применение иммуногенной композиции или вакцины, или набора по этому изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией S. pneumoniae и возможно Haemophilusinfluenzae. В дополнительном аспекте этого изобретения предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по этому изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией штаммами Streptococcus pneumoniae O-ацетилированных серотипов 18 С и штаммами де-О-ацетилированных серотипов 18 С. В дополнительном аспекте этого изобретения предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по этому изобретению, содержащей конъюгат капсульного сахарида серотипа 19F, но не содержащей капсульный сахарид из серотипа 19 А, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфекцией штаммами Streptococcus pneumoniae серотипа 19 А. Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в каждом случае здесь предназначены авторами изобретения быть возможно взаимозаменяемыми с терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из" соответственно. Воплощения, относящиеся здесь к "вакцинной композиции" по этому изобретению, также являются применимыми к воплощениям, относящимся к "иммуногенной композиции" по этому изобретению, и наоборот. Все ссылки или заявки на патент, процитированные в этом описании патента, включены сюда посредством ссылки. Для лучшего понимания этого изобретения приведены нижеследующие примеры. Эти примеры представляют собой только иллюстрацию, и их не следует считать ограничивающими объем этого изобретения каким-либо образом. Примеры Пример 1. Экспрессия белка D. Белок D Haemophilus influenzae. Генетическая конструкция для экспрессии белка D. Исходные вещества. ДНК, кодирующая белок D. Белок D является весьма консервативным среди всех серотипов и нетипируемых штаммов Н. influenzae. Вектор рНIС 348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую полный ген белка D, был получен от д-ра A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Sweden. Последовательность ДНК белка D была опубликована в Janson et al. (1991) Infect.Immun. 59: 119-125. Экспрессионный вектор pMG1. Экспрессионный вектор pMG1 представляет собой производное pBR322 (Gross et al., 1985), в которое были введены происходящие из бактериофага- контрольные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных вставленных генов (Shatzman et al., 1983). Вдобавок, ген устойчивости к ампициллину заменен геном устойчивости к канамицину.- 21015551 Штамм Е. coli AR58. Штамм Е. coli AR58 получали трансдукцией N99 при использовании маточной культуры фага Р 1,ранее выращенной на производном SA500 (galETN10, lambdaKil" cl857 AH1). N99 и SA500 представляют собой штаммы Е. coli K12, полученные из лаборатории д-ра Martin Rosenberg в Национальном институте здравоохранения США (National Institute of Health). Экспрессионный вектор pMG 1. Для получения белка D кодирующую этот белок ДНК клонировали в экспрессионном векторе pMG 1. Эта плазмида использует сигналы из ДНК фага-лямбда для управления транскрипцией и трансляцией вставленных чужеродных генов. Вектор содержит промотор PL, оператор OL и два утилизационных сайта (NutL и NutR) для снятия эффектов транскрипционной полярности при наличии N-белка (Gross et al.,1985). Векторы, содержащие промотор PL, вводят в лизогенного хозяина, представляющего собой Е. coli,для стабилизации плазмидной ДНК. Штаммы лизогенного хозяина содержат ДНК фага-лямбда, дефективного по репликации, которая интегрирована в геном (Shatzman et al., 1983). Хромосомная ДНК фагалямбда направляет синтез репрессорного белка cl, который связывается с репрессором OL в векторе и предотвращает связывание РНК-полимеразы с промотором PL и тем самым транскрипцию вставленного гена. Ген cl экспрессионного штамма AR58 содержит температурочувствительный мутант, так что PL направляет транскрипцию, которую можно регулировать температурным сдвигом, то есть, увеличение температуры в культуре инактивирует репрессор и инициирует синтез чужеродного белка. Эта экспрессионная система позволяет контролировать синтез чужеродных белков, особенно тех, которые могут быть токсичными для клетки (ShimatakaRosenberg, 1981). Штамм AR58 Е. coli. Лизогенный штамм AR58 Е. coli, использованный для получения носителя, представляющего собой белок D, является производным стандартного для NIH штамма N99 Е. coli K12 (F- su- galK2, lacZ- thr-). Он содержит дефективный лизогенный фаг-лямбда (galETN10, lambdaKil- cl857 АН 1). Фенотип Kil предотвращает прекращение синтеза макромолекул хозяина. Мутация cl857 делает cl-репрессор температурочувствительным. Делеция АН 1 удаляет правый оперон фага-лямбда и локусы bio, uvr3 и chlA хозяина. Штамм AR58 генерировали трансдукцией N99 при использовании маточной культуры фага Р 1, ранее выращиваемой на производном SA500 (galETN10, lambdaKil-cl857 AH1). Введение дефективного лизогена в N99 осуществляли при использовании селекции с тетрациклином благодаря присутствию транспозона TN10, кодирующего устойчивость к тетрациклину в смежном гене galE. Конструирование вектора pMGMDPPrD. Для конструирования pMGMDPPrD использовали вектор pMG 1, который содержит ген, кодирующий неструктурный белок S1 вируса гриппа (pMGNSI). Ген белка D амплифицировали с помощью ПЦР из вектора pHIC348 (Janson et al. 1991 Infect. Immun. 59:119-125) с праймерами для ПЦР, содержащими рестрикционные сайты Ncol и Xbal на 5'- и 3'-концах соответственно. Затем вводили Ncol/Xbal-фрагмент в pMGNSI между Ncol и Xbal, таким образом получая слитный белок, содержащий 81 N-концевую аминокислоту белка NS1 и далее белок PD. Это вектор обозначили как pMGNSIPrD. На основании вышеописанной конструкции получали конечную конструкцию для экспрессии белкаD. Из pMGNSI PrD удаляли BamHI/BamHI-фрагмент. Этот гидролиз ДНК удаляет область, кодирующуюNS1, за исключением первых трех N-концевых остатков. При повтором лигировании векторного гена получали ген, кодирующий слитный белок с нижеследующей N-концевой аминокислотной последовательностью: Этот белок D не содержит лидерного пептида или N-концевого цистеина, к которому в норме присоединены липидные цепи. Поэтому белок ни экскретируется в периплазму, ни подвергается липидизации и остается в цитоплазме в растворимой форме. Конечный конструкт pMG-MDPPrD вводили в штамм-хозяин AR58 тепловым шоком при 37 С. Бактерии, содержащие плазмиду, подвергали селекции в присутствии канамицина. Присутствие вставки ДНК, кодирующей белок D, демонстрировали расщеплением изолированной плазмиды ДНК выбранными эндонуклеазами. Этот рекомбинантный штамм Е. coli обозначили как ECD4. Экспрессия белка D находится под контролем PL-промотора/OL-оператора фага-лямбда. Штаммхозяин AR58 содержит в геноме температурочувствительный ген cl, который при низкой температуре блокирует экспрессию с лямбда-PL связыванием с OL При повышении температуры cl высвобождается изOL, и белок D экспрессируется. Получение в малом масштабе. В конце ферментации клетки концентрируют и замораживают. Экстракцию из собранных клеток и очистку белка D осуществляли нижеследующим образом. Замороженный осадок клеточной культуры оттаивают и снова суспендируют в растворе для разрушения клеток (цитратный буфер рН 6,0) до конечного OD650=60. Эту суспензию дважды пропускают через гомогенизатор высокого давления при Р=1000 бар (100105 Па). Гомогенат клеточной культуры осветляют- 22015551 центрифугированием, и клеточные остатки удаляют фильтрованием. На первой стадии очистки фильтрованный лизат наносят на колонку для катионообменной хроматографии (SP Sepharose Fast Flow). PD связывается матриксом геля ионным взаимодействием и элюируется на стадии увеличения ионной силы элюционного буфера. На второй стадии очистки примеси удерживаются на анионообменном матриксе (Q Sepharose FastFlow). PD не связывается с гелем, и его можно собрать промыванием. На обеих стадиях колоночной хроматографии сбор фракций отслеживают по оптической плотности(OD). Поток с анионообменной хроматографической колонки, содержащий очищенный белок D, концентрируют ультрафильтрацией. Содержащий белок D материал на фильтре окончательно пропускают через 0,2-мкм мембрану. Получение в крупном масштабе. Экстракцию из собранных клеток и очистку белка D осуществляли нижеследующим образом. Собранный бульон охлаждают и дважды пропускают прямо через гомогенизатор высокого давления при давлении около 800 бар (80105 Па). На первой стадии очистки гомогенат клеточной культуры разбавляют и наносят на колонку для катионообменной хроматографии (SP Sepharose Big beads). PD связывается с гелевым матриксом ионным взаимодействием, и его элюируют на стадии увеличения ионной силы элюционного буфера и фильтруют. На второй стадии очистки примеси удерживаются анионообменным матриксом (Q Sepharose FastFlow). PD не связывается с гелем и может быть собран промыванием. На обеих стадиях колоночной хроматографии сбор фракций отслеживают по оптической плотности(OD). Поток с анионообменной хроматографической колонки, содержащий очищенный белок D, концентрируют и подвергают фильтрационному диализу ультрафильтрацией. Содержащий белок D материал на фильтре окончательно пропускают через 0,2-мкм мембрану. Пример 1 б. Экспрессия PhtD. Белок PhtD является членом семейства пневмококковых белков гистидиновой триады (Pht), которые характеризуются присутствием гистидиновых триад (мотив НХХНХН). PhtD представляет собой молекулу из 838 аминокислот (а-к.) и несет 5 гистидиновых триад (см. аминокислотную последовательность в Medlmmune WO 00/37105 SEQ ID NO: 4 и последовательность ДНК в SEQ ID NO: 5). PhtD также содержит обогащенный пролином участок в середине (аминокислотные позиции 348-380). PhtD имеет Nконцевую сигнальную последовательность из 20 а-к. с мотивом LXXC. Генетическая конструкция Последовательность гена зрелого белка Medlmmune PhtD (от а-к. 21 до а-к. 838) переносили рекомбинантным способом в Е. coli при использовании вектора рТСМР 14 собственного изготовления, который нес промотор фага-лямбда. Штаммом-хозяином Е. coli является AR58, который несет термочувствительный репрессор cl857, делающий возможным тепловую индукцию промотора. Для амплификации гена phtD полимеразную цепную реакцию осуществляли с плазмиды Medlmmune (несущей ген phtD из Streptococcus pneumoniae, штамм Norway 4 (серотип 4) - SEQ ID NO: 5, как описано в WO 00/37105). Для амплификации гена phtD в двух фрагментах использовали праймеры, специфичные только для гена phtD. Эти праймеры несут рестрикционные сайты либо Ndel и Kpnl, либо Kpnl и Xbal. Эти праймеры не гибридизуются с каким-либо нуклеотидом из вектора, но только с последовательностями, специфичными для гена phtD. Искусственный старт-кодон ATG вводили при использовании первого праймера, несущего рестрикционный сайт Ndel. Затем вставляли полученные продукты ПЦР в вектор для клонирования pGEM-T (Promega) и подтверждали последовательность ДНК. Затем осуществляли субклонирование фрагментов в экспрессионном векторе ТСМР 14 при использовании стандартных методик и трансформировали этим вектором Е. coli AR58. Очистка PhtD Очистку PhtD осуществляли следующим образом. Выращивание клеток E.coli в присутствии канамицина: рост в течение 30 ч при 30 С, затем индукция в течение 18 ч при 39,5 С. Разрушение клеток E.coli из цельной культуры при OD115 в присутствии 5 мМ ЭДТА и 2 мМ(100105 Па). Захват антигена и удаление клеточных остатков хроматографией при использовании Streamline QXL в режиме расширенного ложа при комнатной температуре (20 С); колонку промывают при использовании 150 мМ NaCl + 0,25% эмпигена при рН 6,5 и элюируют при использовании 400 мМ NaCl + 0,25% эмпигена в 25 мМ калий-фосфатном буфере при рН 7,4. Фильтрование на картридже Sartobran 150 (0,45 + 0,2 мкм). Связывание антигена IMAC-хроматографией на Zn-хелатирующей Сефарозе FF при рН 7,4 в присутствии 5 мМ имидазола при 4 С; колонку промывают при использовании 5 мМ имидазола и 1% эмпигена и элюируют 50 мМ имидазолом, в обоих случаях в 25 мМ калий-фосфатном буфере при рН 8,0.- 23015551 Слабо анионообменная хроматография в положительном режиме на Fractogel EMD DEAE при рН 8,0 (25 мМ фосфат калия) при 4 С; колонку промывают при использовании 140 мМ NaCl и элюируют при 200 мМ NaCl, тогда как примеси (белки и ДНК) остаются адсорбированными на ионообменнике. Концентрирование и ультрафильтрация при использовании 2 мМ фосфата Na/K при рН 7,15 на мембране для 50 кДа. Стерилизующая фильтрация очищенной массы на 0,2-мкм фильтровальном картридже Millipak-20. Пример 1 в. Экспрессия пневмолизина. Пневмококковый пневмолизин получали и детоксифицировали как описано в WO 2004/081515 иWO 2006/032499. Пример 2. Получение конъюгатов. В данной области хорошо известно, как получать очищенные пневмококковые полисахариды. Для целей этих примеров полисахариды получали в сущности как описано в ЕР 072513 или близкородственными способами. До конъюгации полисахаридов можно подгонять по размеру микрофлюидизацией, как описано ниже. Условия активация и сочетания являются специфическими для каждого полисахарида. Они приведены в табл. 1. Полисахариды с установленными размерами (за исключением PS5, 6 В и 23F) растворяли в 2 М NaCl, 0,2 М NaCl или воде для инъекций (ВДИ). Оптимальную концентрацию полисахарида оценивали для всех серотипов. Все серотипы, за исключением серотипа 18 С, конъюгировали прямо с белком-носителем как подробно описано ниже. Получали два альтернативных конъюгата серотипов 22F: один конъюгированный прямо, один конъюгированный через ADH-линкер. К раствору полисахарида добавляли CDAP (соотношение CDAP/PS 0,5-1,5 мг/мг PS) из 100-мг/мл маточного раствора в ацетонитриле или в растворе ацетонитрил/вода 50%/50%. Через 1,5 мин добавляли 0,2 М-0,3 М NaOH с получением специфического для активации значения рН. Активацию полисахарида осуществляли при этом рН за время 3 мин при 25 С. К активированному полисахариду добавляли очищенный белок (белок D, PhtD, пневмолизин или DT) (количество зависит от исходного соотношенияPS/белок-носитель), и сочетание осуществляли при специфическом рН в течение вплоть до 2 ч (в зависимости от серотипа) при контроле рН. Затем для гашения непрореагировавших цианатных сложноэфирных групп добавляли к смеси 2 М раствор глицина. Для гашения доводили значение рН до 9,0. Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25 С и затем в течение ночи при 2-8 С при использовании непрерывного медленного перемешивания. Получение 18 С. 18 С связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Перед конъюгацией полисахарид серотипа 18 С подвергали микрофлюидизации. Дериватизация столбнячного анатоксина при использовании EDAC. Для дериватизации столбнячного анатоксина (ТТ) разбавляли очищенный ТТ до 25 мг/мл в 0,2 МNaCl и добавляли спейсер ADH для достижения конечной концентрации 0,2 М. Когда спейсер полностью растворялся, значение рН доводили до 6,2. Затем добавляли EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид) до достижения конечной концентрации 0,02 М, и смесь перемешивали в течение 1 ч при контроле рН. Реакцию конденсации останавливали увеличением рН до 9,0 в течение по меньшей мере 30 мин при 25 С. Затем дериватизированный ТТ подвергали фильтрационному диализу(мембрана СО на 10 кДа) для удаления оставшихся реагентов ADH и EDAC. Наконец, стерилизовали массу ТТАН фильтрацией и перед стадией сочетания хранили при -70 С. Химическое сочетание ТТАН с PS 18C. Подробности параметров конъюгации можно найти в табл. 1. Разбавляли 2 г подвергнутого микрофлюидизации PS до определенной концентрации в воде и доводили до 2 М NaCl добавлением порошка NaCl. Добавляли свежеприготовленный раствор CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле/ВДИ 50/50 об./об.) для достижения надлежащего соотношения CDAP/PS. Повышали рН до активирующего значения рН 9,0 добавлением 0,3 М NaOH и стабилизировали этот рН, пока не добавляли TTAH. Через 3 мин добавляли дериватизированный TTAH (20 мг/мл в 0,2 М NaCl) для достижения соотношения TTAH/PS, равного 2; рН доводили до значения сочетания рН 9,0. Раствор оставляли на один час при контроле рН. Для гашения добавляли к смеси PS/TTAH/CDAP 2 М раствор глицина. Доводили рН до рН гашения(рН 9,0). Раствор перемешивали в течение 30 мин при 25 С и затем оставляли на ночь при 2-8 С при использовании непрерывного медленного перемешивания. Конъюгат PS22FAH-PhtD. Во втором способе конъюгации для этого сахарида (первый представляет собой способ прямой конъюгации PS22-PhtD, показанный в табл. 1) 22F связывали с белком-носителем через линкер дигидразид адипиновой кислоты (ADH). Полисахарид серотипа 22F перед конъюгации подвергали микрофлюидизации.- 24015551 Дериватизация PS 22F. Активацию и сочетание осуществляли при 25 С с непрерывным перемешиванием в термостатированной водяной бане. Подвергнутый микрофлюидизации PS22F разбавляли с получением конечной концентрации PS 6 мг/мл в 0,2 М NaCl, и раствор доводили до значения рН 6,050,2 при использовании 0,1 н. HCl. Добавляли свежеприготовленный раствор CDAP (100 мг/мл в ацетонитриле/ВДИ, 50/50) до достижения надлежащего соотношения CDAP/PS (1,5/1 об./об.). Повышали значение рН до активирующего рН 9,000,05 добавлением 0,5 М NaOH и стабилизировали при этом значении рН, пока не добавляли ADH. Через 3 мин добавляли ADH до достижения надлежащего соотношения ADH/PS (8,9/1 мас.); рН доводили до значения сочетания рН 9,0. Раствор оставляли на 1 ч при контроле рН. Производное PSAH концентрировали и подвергали фильтрационному диализу. Сочетание. Добавляли PhtD при 10 мг/ мл в 0,2 М NaCl к производному PS22FAH для достижения соотношенияPhtD/PS22FAH 4/1 (мас.). Доводили рН до 5,00,05 при использовании HCl. Добавляли вручную растворPS22FAH. Получившийся раствор инкубировали в течение 150 мин (хотя также использовали промежуток времени 60 мин) при 25 С при перемешивании и контроле рН. Раствор нейтрализовали добавлением 1 М Трис-HCl рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при 25 С. Перед элюцией на Sephacryl S400HR конъюгат осветляли с использованием 5-мкм фильтра Minisart. Получившийся конъюгат имеет конечное соотношение PhtD/PS 4,1 (мас./мас.), содержание свободного PS ниже чем 1%, и антигенность (-PS/-PS) 36,3% при антигенности против PhtD 7,4%. Очистка конъюгатов. Для удаления малых молекул (в том числе DMAP) и неконъюгированного PS и белка конъюгаты очищали гель-фильтрацией при использовании колонки для гель-фильтрации с Sephacryl S400HR, уравновешенной с 0,15 М NaCl (S500HR для 18 С). На основании разных молекулярных размеров компонентов этой реакционной смеси, первыми элюировали конъюгаты PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PS-пневмолизин или PS-DT и далее свободный PS, затем свободный PD или свободный DT и, наконец, DMAP и другие соли (NaCl, глицин). Фракции, содержащие конъюгаты, детектировали по УФ 280 нм. Фракции объединяли в соответствии с их Kd, стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм) и хранили при +2-8 С. В препаратах конъюгатов определяли соотношения PS/белок Специфические условия активации/сочетания/гашения для конъюгатов PS S. Pneumoniae-белокD/TT/DT/PhtD/Ply Наличие "флюид"в обозначении столбца указывает, что сахарид перед конъюгацией был подвергнут микрофлюидизации. Размеры сахаридов после микрофлюидизации даны в табл. 2. Таблица 1. Специфические условия активации/сочетания/гашения для конъюгатов PS S. pneumoniaeБелок D/TT /DT/PhtD/Ply Примечание: pHa,c,q соответствует рН для активации, сочетания и гашения соответственно.- 25015551 Описание. Каждый конъюгат был охарактеризован и отвечал спецификациям, описанным в табл. 2. Содержание полисахарида (мкг/мл) измеряли резорциновым методом, и содержание белка (мкг/мл) измеряли методом Лоури. Конечное соотношение PS/PD (мас.) определяли по соотношению этих концентраций. Содержание свободного полисахарида (%). Содержание свободного полисахарида конъюгатов, выдержанных при 4 С или хранившихся 7 дней при 37 С, определяли на супернатанте, полученном после инкубации с антителами против -белканосителя и насыщенным сульфатом аммония и последующего центрифугирования. Для количественного определения свободного полисахарида в супернатанте использовали ELISA на -PS/-PS. Отсутствие конъюгата также контролировали по ELISA на -белок-носитель/-PS. Антигенность. Антигенность тех же конъюгатов анализировали в сэндвич-ELISA, в котором захватывающими и детектирующими были антитела против PS и против белка соответственно. Содержание свободного белка (%). Неконъюгированный белок-носитель можно отделять от конъюгата на стадии очистки. Содержание свободного оставшегося белка определяли при использовании эксклюзионной хроматографии (TSK 5000-PWXL) с последующим УФ-детектированием (214 нм). Условия элюции позволяли разделять свободный белок-носитель и конъюгат. Затем определяли содержание свободного белка в массах конъюгата по калибровочной кривой (от 0 до 50 мкг/мл белка-носителя). Свободный белок-носитель в % получали нижеследующим образом: % свободного носителя = (свободный носитель (мкг/мл)/(суммарная концентрация соответствующего белка-носителя, измеренная по Лоури (мкг/мл)100%). Стабильность. Распределение молекулярных масс (Kav) и стабильность измеряли гель-фильтрацией при использовании ВЭЖХ-SEC (TSK 5000-PWXL) для конъюгатов, выдержанных при 4 С и хранившихся в течение 7 дней при 37 С. В табл. 2 (см. комментарий под ней) представлена 10/11/13/14-валентная характеристика. Конъюгаты белка можно адсорбировать на фосфате алюминия и объединять с получением готовой вакцины. Заключение. Были получены иммуногенные конъюгаты, которые, как потом было показано, являются компонентами перспективных вакцин. Таблица 2. Характеристики конъюгатовPS размер после микрофлюидизации нативного PS 10-Валентную вакцину получали смешиванием конъюгатов серотипов 1, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14, 18 С,- 26015551 19F и 23F (например, в дозе 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 мкг сахарида соответственно на дозу для человека). 11-Валентную вакцину получали дополнительным добавлением конъюгата серотипа 3 из табл. 5 (например, при 1 мкг сахарида на дозу для человека). 13-Валентную вакцину получали дополнительным добавлением вышеуказанных конъюгатов серотипов 19 А и 22F (причем 22F связан с PhtD либо прямо, либо альтернативно через ADH-линкер) [например, в дозе по 3 мкг каждого сахарида на дозу для человека]. 14-Валентную вакцину можно получать дополнительным добавлением вышеуказанного конъюгата серотипа 6 (например, в дозе 1 мкг сахарида на дозу для человека). Пример 3. Доказательство того, что включение белка D Haemophilus influenzae в иммуногенную композицию по этому изобретению может обеспечить улучшенную защиту против острого отита среднего уха (ОСУ). План исследования. В исследовании использовали вакцину 11Pn-PD, содержащую серотипы 1, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 9V, 14,18 С, 19F и 23F, причем каждый конъюгирован с белком D из Н. influenzae (см. табл. 5 в примере 4). Субъектов рандомизировали в две группы для получения четырех доз либо вакцины 11Pn-PD, либоHavrix в возрасте приблизительно 3, 4, 5 и 12-15 месяцев. Все субъекты одновременно получали вакцину(DTPa-HBV-IHY/Hib) Infanrix-hexa от GSK Biologicals в возрасте 3, 4 и 5 месяцев. Infanrix-hexa представляет собой комбинацию Pediarix и Hib, смешанных перед введением. Отслеживание эффективности для анализа "В соответствии с протоколом" начинали через 2 недели после введения третьей дозы вакцины и продолжали до достижения возраста 24-27 месяцев. Носоглоточное носительство S. pneumoniae и H. influenzae оценивали в выбранных подгруппах субъектов. Родителям предлагали обращаться к исследователю, если их ребенок заболевал, у него была боль в ухе, спонтанная перфорация барабанной перепонки или спонтанные выделения в ухо. Если исследователь подозревал эпизод ОСУ, ребенка немедленно направляли к специалисту отоларингологу для подтверждения диагноза. Клинический диагноз ОСУ был основан либо на внешнем виде барабанной перепонки (то есть, покраснение, вздутие, потеря светоотражения), либо на присутствии жидких выделений в среднем ухе (продемонстрированных простой или пневматической отоскопией или микроскопией). Вдобавок, должны присутствовать по меньшей мере два из нижеследующих признаков или симптомов: ушная боль, ушные выделения, потеря слуха, повышенная температура, сонливость, раздражительность,анорексия, рвота или диарея. Если отоларинголог подтвердил клинический диагноз, образец жидкости из среднего уха собирали пункций барабанной перепонки для бактериологического тестирования. Для субъектов с повторными визитами из-за болезни считали, что новые эпизоды ОСУ начинаются,если прошло более чем 30 дней с начала предыдущего эпизода. Вдобавок, эпизод ОСУ считали новым бактериальным эпизодом, если имели место отличия изолированной(ого) бактерии/серотипа от предыдущего изолята, независимо от интервала между двумя последовательными эпизодами. Результаты испытания. Всего в исследование были включены 4968 младенцев: 2489 в группу 11Pn-PD и 2479 в контрольную группу. Между двумя группами не было существенных отличий в демографических характеристиках или факторах риска. Определение клинических эпизодов и случаев ОСУ. Во время периода отслеживания по протоколу в сумме зарегистрировано 333 эпизода клинического ОСУ в группе 11 Pn-PD и 499 в контрольной группе. Таблица 3 показывает защитную эффективность вакцины 11 Pn-PD и обеих 7-валентных вакцин,ранее тестированных в Финляндии (Eskola et al N Engl J Med 2001; 344: 403-409 и Kilpi et a/Clin Infect Dis 2003 37:1155-64) против любого эпизода ОСУ и ОСУ, вызванного разными пневмококковыми серотипами, Н. influenzae, NTH7 и М. catarrhalis. Статистически достоверное и клинически значимое снижение на 33,6% груза всех заболеваний ОСУ достигнуто с 11 Pn-PD, независимо от этиологии (табл. 3). Суммарная эффективность вакцины 11 Pn-PD против эпизодов ОСУ из-за любого из 11 пневмококковых серотипов была 57,6% (табл. 3). Другим важным результатом в настоящем исследовании является защита на 35,6%, обеспеченная вакциной 11 Pn-PD против ОСУ, вызванного Н. influenzae (и конкретно, защита на 35,3%, обеспеченнаяNTHi). Этот результат имеет большое клиническое значение с учетом возросшей важности Н. influenzae в качестве главной причины ОСУ в эпоху пневмококковых конъюгатных вакцин. Вместе с защитой,обеспеченной против ОСУ, вакцина 11 Pn-PD также снижает носоглоточное носительство Н. influenzae после бустерной дозы на втором году жизни. Эти результаты контрастируют с предыдущими наблюдениями в Финляндии, где с обеими 7-валентными пневмококковыми конъюгатными вакцинами наблюдали увеличение эпизодов ОСУ из-за Н. influenzae (Eskola et al и Kilpi et al) в качестве свидетельства этиологического замещения. Отчетливую корреляцию между защитой против эпизодов ОСУ из-за Hi и уровнями антител против белка-носителя D установить не удалось, поскольку пост-первичные концентрации lgG-антител противPD у вакцинированных при использовании 11 Pn-PD, которые оставались без эпизодов Hi-ОСУ, были, по существу, такими же, что и постпервичные уровни lgG-антител против PD, измеренные у вакцинированных при использовании в 11Pn-PD, у которых в период отслеживания эффективности развивался по- 27015551 меньшей мере один эпизод Hi-ОСУ. Однако хотя и нельзя установить корреляцию между биологическим эффектом вакцины и постпервичной иммуногенности IgG против PD, разумно считать, что белокноситель PD, который является весьма консервативным среди штаммов Н. influenzae, внес большой вклад в индукцию защиты против Hi. Влияние на заболевание ОСУ сопровождалось влиянием на носоглоточное носительство, которое было таким же по величине для пневмококков вакцинного серотипа и для Н. influenzae (фиг. 1). Это снижение носоглоточного носительства Н. Influenzae у вакцинированных при использовании PDконъюгатных вакцин подтверждает гипотезу о прямом защитном эффекте PD-конъюгатной вакцины против Н. influenzae, даже если защитная эффективность может не коррелировать с иммунными lgGответами против PD при определении в ELISA. В следующем ниже эксперименте с объединенными в пул сыворотками от младенцев, иммунизированных 11-валентным препаратом по этому примеру или 10-валентной вакциной примера 2 (см. также табл. 1 и 2 и комментарии под ними), использовали модель отита среднего уха у шиншилл. Оба пула индуцируют значительное снижение процента животных с отитом среднего при сравнении с пулом доиммунной сыворотки. Отсутствует значительное различие между 10-и 11-валентными иммунными пулами. Это показывает, что обе вакцины имеют одинаковый потенциал индукции защиты против отита среднего уха, вызванного в этой модели нетипируемыми Н. influenzae. Таблица 3 НО = не опубликовано; N = число субъектов в когорте для определения эффективности "в соответствии с протоколом"; n = число эпизодов; ДИ = доверительный интервал; НУ = нижний уровень; ВУ = верхний уровень; Конт. = контроль; ЖСУ = жидкость в среднем ухе.Вакцинные пневмококковые серотипы: для 11Pn-PD = псеротипов; для Prevnar и 7v-OMP = 7 серотипов. Пример 4. Селекция белка-носителя для серотипа 19F. Использовали анализ ELISA. Способ ELISA при ингибировании 22F в сущности основан на анализе, предложенном в 2001 Concepcion and Frasch и описанным Henckaerts et al., 2006, Clinical and Vacine Immunology 13:356-360. Вкратце, очищенные пневмококковые полисахариды смешивали с метилированным человеческим сывороточным альбумином и адсорбировали на сильно связывающие микротитровальные планшеты Nunc Maxisorp(Roskilde, DK) в течение ночи при 4 С. Планшеты блокировали 10%-ной фетальной бычьей сывороткой (FBS) в забуференном фосфатом физрастворе (PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Пробы сывороток разбавляли PBS, содержащем 10% FBS, 10 мкг/мл полисахарида клеточной стенки (SSI) и 2 мкг/мл пневмококкового полисахарида серотипа 22F (АТСС), и дополнительно разбавляли на микротитровальных планшетах тем же буфером. Внутренний контроль, который калибровали по стандартной сыворотке 89-SF при использовании концентраций IgG в 89-SF, специфичных к серотипу, обрабатывали тем же путем и включали в каждый планшет. После промывки связанные антитела детектировали при использовании конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител против человеческих IgG (Stratech Scientific Ltd., Soham, UK), разбавленных в 10%-ной FBS (в PBS) и инкубируемых в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Окрашивание осуществляли при использовании готового к применению однокомпонентного набора для иммуноанализа с субстратом фермента пероксидазы тетраметилбензидином (BioRad, Hercules, CA, US) в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали с помощью 0,18 М H2SO4, и оптическую плотность считывали при 450 нм. Концентрации серотип-специфичных IgG (в мкг/мл) в пробах вычисляли по точкам оптической плотности в определенных пределах кривой для сыворотки внутреннего стандарта, которую моделировали 4-параметрическим лог-логистическим уравнением, рассчитанным при использовании программы- 28015551 всех серотипов с учетом предела выявления и предела количественного определения. Анализ опсонофагоцитоза. На консультационной встрече ВОЗ в июне 2003 было рекомендовано использовать анализ опсонофагоцитоза (ОФЦ), описанный в Romero-Steiner et alClin Diagn Lab Immunol 2003 10 (6): pp1019-1024. Этот протокол использовали для тестирования ОФЦ-активности серотипов в нижеследующих анализах. Получение конъюгатов. В исследованиях 11Pn-PDDi-001 и 11Pn-PDDi-007 включили три 11-валентных вакцинных препарата (таблица 4), в которых 3 мкг полисахарида 19F были конъюгированы с дифтерийным анатоксином (19FDT) вместо 1 мкг полисахарида, конъюгированного с белком D (19F-PD). Параметры конъюгации для исследований 11Pn-PD, 11 Pn-PDDi-001 и 11 Pn-PDDi-007 раскрыты в табл. 5, 6 и 7 соответственно. Ответы по антителам против пневмококков и по ОФЦ-активности против серотипа 19F через один месяц после первичной вакцинации этими препаратами 19F-DT показаны в табл. 8 и 9 соответственно. Табл. 10 показывает концентрации антител против 22F в ELISA и проценты субъектов, достигших порога в 0,2 мкг/мл до и после бустерной вакцинации 23-валентным простым полисахаридом. Показано, что опсонофагоцитозная активность отчетливо улучшалась для антител, индуцированных этими препаратами 19F-DT, как демонстрировано более высокими уровнями серопозитивности (опсонофагоцитозные титры не меньше чем 1:8) и геометрическим средним титров (ГСТ) ОФЦ через месяц после первичной вакцинации (табл. 9). Через один месяц после бустерной вакцинации 23-валентным простым полисахаридом опсонофагоцитозная активность антител против 19F оставалась значительно лучше у детей, получивших первичную вакцинацию препаратами 19F-DT (табл. 11). Табл. 12 представляет данные по иммуногенности после бустерной дозы 11Pn-PD у годовалых детей, ранее получивших первичную вакцинацию конъюгатами 19F-DT или 19F-PD, при сравнении с 4-й последовательной дозой Prevnar. С учетом случаев вспышек, о которых сообщалось после введенияPrevnar в США, улучшенная опсонофагоцитозная активность против серотипа 19F, когда он конъюгирован с белком-носителем DT, может быть достоинством для вероятно подходящей вакцины. Табл. 13 представляет данные по ELISA и ОФЦ для конъюгата 19F-DT с учетом перекрестной реактивности серотипа 19 А. Было найдено, что 19F-DT индуцирует низкую, но значительную ОФЦ-активность против 19 А. Таблица 4. Конъюгатные вакцинные препараты против пневмококков, использованные в клинических исследованиях