Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СУБСТАНЦИИ НА ОСНОВЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОАДРЕСОВАННЫХ АНТИОКСИДАНТОВ Изобретение относится к областям фармацевтики, медицины и, в частности, касается получения и использования фармацевтических субстанций на основе митохондриально-адресованных соединений. Изобретение обеспечивает способы получения митохондриально-адресованных антиоксидантов в виде и качестве, которые соответствуют требованиям, предъявляемым к действующим веществам лекарственных препаратов - фармацевтическим субстанциям.(умер), Ташлицкий Вадим Неронович,Ягужинский Лев Сергеевич,Коршунова Галина Анатольевна,Сумбатян Наталья Владимировна,Антоненко Юрий Николаевич,Северина Инна Исааковна, Черняк Борис Викторович (RU) Агуреев А.П. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к областям фармацевтики, медицины и, в частности, касается получения и использования фармацевтических субстанций на основе митохондриально-адресованных соединений. Предшествующий уровень техники Опубликованные к настоящему моменту данные убедительно демонстрируют перспективность применения в медицине нового класса биологически активных веществ (см. Skualchev V.P. (2005),IUBMB Life., 57:305-10; Skulachev V.P. (2007), Biochemistry (Mosc)., 72:1385-96; Antonenko Yu.N. et al.in mitochondria", 1974, Biochem. Biophys. Acta., 346:27-78). Однако в приведенных выше источниках раскрываются результаты изучения MAA в лабораторных условиях - in vitro или на животных моделях. При этом, для того чтобы какое-либо соединение могло быть применено в качестве действующего вещества лекарственного средства (так называемой фармацевтической субстанции), оно должно соответствовать определенным требованиям, а именно: 1. Полностью соответствовать требованиям, предъявляемым национальными регулирующими органами их нормативной документацией, обобщенным в соответствующий фармакопейных статьях, основными из которых являются подлинность, содержание посторонних примесей, содержание тяжелых металлов, содержание воды, содержание остаточных органических растворителей, стерильность, метод количественного определения, способ упаковки, маркировки и транспортировки. 2. Сохранять в течение всего срока годности в пределах заложенных в нормативной документации показателям, а также фармацевтическую активность. Особое внимание должно быть обращено как на общее содержание посторонних примесей, так и на содержание одиночных примесей. В частности, одиночные примеси, которые не могут быть индивидуально выделены и всесторонне охарактеризованы, не должны составлять значительной доли (в большинстве случаев - более 1%) от общего содержания примесей. Определения Фармацевтическая субстанция - вещество, подготовленное к применению в составе лекарственного средства и отвечающее требованиям фармакопеи. Ионы Скулачева - липофильные катионы и анионы, способные проникать сквозь мембраны митохондрий. Митохондриально-адресовнные антиоксиданты (MAA) - соединения, способные адресно проникать в митохондрии и обладающие антиоксидантной активностью. Сущность изобретения Ниже приведены аспекты изобретения. Настоящее изобретение посвящено получению фармацевтических субстанций на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов (MAA), конструированию и выбору определенных MAA, наилучшим способом соответствующих клиническим задачам. Изобретение касается MAA, представляющих собой соединения, состоящие из антиоксиданта, присоединенного через линкерную группу к липофильному катиону ("иону Скулачева"). Предлагаемые MAA могут быть представлены общей структурой (I),приведенной ниже Общая структура (I)B - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; иA представляет собой антиоксидант общей формулы (II)L - линкерное звено, представляющее собой: а) либо незамещенную простую разветвленную или разветвленную углеводородную цепь или углеводородную цепь, содержащую одну или более двойную или тройную связь или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; или эта углеводородная цепь является замещенной одним или более заместителем, выбранным из алкила, алкокси, галогена, кетогруппы, аминогруппы; б) либо природную изопреноидную цепь; В представляет собой остаток берберина или палматина. Соединения, состоящие из липофильного катиона - иона Скулачева, соединенного с антиоксидантным остатком могут представлять собой: Серия соединений SkQB - с повышенной проникающей способностью, по сравнению с SkQ1. К этой серии относятся все соединения, в которых в качестве "иона Скулачева" используются природные соединения, например берберин. Соединения из серии SkQB (например, SkQB1, формула которого приведена ниже) обладают повышенной проникающей способностью и, следовательно, более перспективны с фармацевтической точки зрения, имеют большую способность по преодолению гематоэнцефалического и гематоофтальмологического барьеров. Также соединения серии SkQB должны обладать менее выраженными побочными эффектами, так как берберин (также как и пальматин) является природными соединениями растительного происхождения. В общем виде SkQB на основе берберина могут быть представлены общей формулой где m - число от 0 до 3 (предпочтительно 2, т.е. левая часть формулы представляет собой остаток пластохинона);L - линкерное звено длиной от 1 до 50 звеньев, представляющее собой: 1) простую или разветвленную углеводородную цепь, содержащую одну или более двойную или тройную связь или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; и замещенную или незамещенную одним или более заместителем, являющимся алкилом, алкокси, галогеном, кетогруппой, аминогруппой; или 2) природную изопреноидную цепь. Предпочтительно L является остатком декана. Правая часть формулы соединения представляет собой остаток берберина, присоединенный по одному из входящих в его состав атомов к линкеру L. Соединение может быть осуществлено через C-C,C-O, C-N, C-S связи, в том числе сложноэфирную связь, пептидную связь, дисульфидную связь. В том числе присоединение может быть осуществлено в виде просто-эфирной связи, замещая одну из метоксильных групп береберина. В соединениях серии SkQB вместо берберина возможно использование пальматина. Также предпочтительными соединениями на основе берберина и пальматина являются следующие соединения: Способы синтеза и описание химических свойств и биологической активности приведенных выше соединений приведены в разделе "Экспериментальные примеры". Другим аспектом изобретения является применение соединения с кето- или хиноноподобной группой, обладающего окислительно-восстановительным потенциалом не менее 0,2 В при нейтральных значениях pH, в качестве "молекулярной ловушки" восстановленной формы митохондриальноадресованного антиоксиданта общей формулы (I)B - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; иA представляет собой антиоксидант общей формулы (II)L - линкерное звено, представляющее собой: а) либо незамещенную простую разветвленную или разветвленную углеводородную цепь, или углеводородную цепь содержащую одну или более двойную или тройную связь или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; или эта углеводородная цепь является замещенной одним или более заместителем, выбранным из алкила, алкокси, галогена, кетогруппы, аминогруппы; б) либо природную изопреноидную цепь;Z- - фармацевтически приемлемый анион. Еще одним аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая субстанция на основе митохондриально-адресованного антиоксиданта общей формулы (I)B - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; иA представляет собой антиоксидант общей формулы (II)L - линкерное звено, представляющее собой: а) либо незамещенную простую разветвленную или разветвленную углеводородную цепь, или углеводородную цепь, содержащую одну или более двойную или тройную связь или эфирную, или сложноэфирную, или C-S, или S-S, или пептидную связи; или эта углеводородная цепь является замещенной одним или более заместителем, выбранным из алкила, алкокси, галогена, кетогруппы, аминогруппы; б) либо природную изопреноидную цепь; В представляет собойZ- - фармацевтически приемлемый анион,в которой соотношение окисленной и восстановленной форм составляет от 80 до 99,8% окисленной формы и в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение всего срока годности при соблюдении установленных условий хранения. Предпочтительно в фармацевтической субстанции соотношение окисленной и восстановленной форм составляет более предпочтительно от 97,5 до 99,5% окисленной формы. Предпочтительно в фармацевтической субстанции по изобретению соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 1 месяца. Более предпочтительно, когда это сохраняется в течение не менее 6 месяцев. Еще более предпочтительно, когда оно сохраняется в течение не менее 2 лет. Подробное описание изобретения Фармацевтические субстанции на основе митохондриально-адресованных антиоксидантов. Одним из аспектов настоящего изобретения являются параметры нормативной документации, позволяющей применять в медицинской практике фармацевтическую субстанцию на основе MAA, и, в частности, включающие в себя следующие показатели. 1. Подлинность, определяемая, в частности, при помощи:a) спектрофотометрии в заданном диапазоне длин волн и сравнению с определенными результатами спектрофотометрического исследования образца MAA;b) ИК-спектрометрии. Инфракрасный спектр субстанции, снятый по методу нарушенного полного внутреннего отражения должен иметь совпадение полос поглощения с полосами поглощения прилагаемого спектра по положению и интенсивности полос;c) реакция на бромиды. Хлороформный слой должен окраситься в желтый цвет. 2. Содержание посторонних примесей, определяемые с помощью метода ВЖХ. Содержание каждой отдельной примеси не более 1,5%. Суммарное содержание примесей не более 4,0%. 3. Содержание тяжелых металлов (не более 0,001%). 4. Содержание остаточных органических растворителей (такие как этанол, метанол и хлороформ). 5. Стерильность. 6. Количественное определение субстанции 7. Упаковка, маркировка и хранение 8. Установленный срок годности. На практике известные хинонсодержащие митохиндриально-адресованные соединения, включая вещества SkQ1, SkQR1, MitoQ и др. (см. выше), существуют, главным образом, в одной окисленной (хинонной) форме. При этом в обычных условиях окисленная форма способна частично восстанавливаться в хинольную форму (см. фиг. 1). Таким образом, при использовании MAA в качестве фармацевтических субстанций основной примесью, содержание которой может достигать 5-8% и более, является восстановленная форма MAA. Выделение и детальное исследование этой формы представляется трудноразрешимой задачей ввиду ее высокой химической лабильности и склонности к сложным окислительновосстановительным переходам. С другой стороны, получение фармацевтической субстанции MAA в хинонной форме, свободной от восстановленной (хинольной) формы стандартными методами хроматографической очистки, является затруднительным из-за схожести этих соединений. Вторая проблема, с которой приходится сталкиваться в процессе очистки вышеприведенной серии препаратов MAA, заключается в необходимости сохранения характеристического противоиона, например иона брома. Обычные условия проведения ионообменной или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) оказываются слишком жесткими по отношению к этим лабильным соединениям и не гарантируют сохранения противоиона в исходной структуре. Таким образом, существующие методы и приемы выделения и очистки препаратов серии MAA не обеспечивают необходимых параметров чистоты для такого рода фармацевтических субстанций. В рамках настоящего изобретения эта задача решается за счет следующих методов. Метод 1. Применение нестандартного метода ВЭЖХ в бессолевой безбуферной системе подвижной фазы, а на заключительной стадии - гель-фильтрация высококонцентрированного раствора препарата. Метод 2. Использование "молекулярной ловушки" для восстановленной формы MAA в виде агента в неполярном растворителе, который выполняет роль эффективного индуктора окисления или конкурентного заместителя хинонной формы в равновесии хинон-хинол. Таким образом, еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения MAA в форме, приемлемой для фармацевтических субстанций, и включающий в себя метод 1 и/или метод 2. Также аспектом настоящего изобретения является улучшенный метод синтеза MAA на основе хинонов. Улучшенная методика позволяет осуществлять промышленное получение (синтез) MAA из более дешевых и доступных компонентов, в частности в случае синтеза пластохинонилдецилтрифенифосфония(ПДТФ) бромида и других производных пластохинона она позволяет использовать в качестве исходного сырья не диметилгидрохинон, а 2,3-диметилфенол. Синтез включает в себя следующие стадии. 1. Окисление 2,3-диметилфенола (1) в 2,3-диметил-1,4-бензохинон (2) реактивом Джонса. 2. Присоединение 11-бромундекановой кислоты (3) к трифенилфосфину с образованием бромида(10-карбоксидецил)трифенилфосфина (4). 3. Образование целевого соединения (5) в результате реакции полученного соединения (4) с 2,3-диметил-1,4-бензохиноном (2) в присутствии нитрата серебра и персульфата аммония. Общая схема синтеза приведена на фиг. 2. Подробнее синтез описан в экспериментальном примере ЭП 2. Краткое описание фигур Фиг. 1. Равновесие хинонной и хинольной форм митохондриально-адресованных антиоксидантов.R - линкерная группа, соединенная с липофильным ионом ("ионом Скулачева"). Фиг. 2. Схема улучшенного метода синтеза митохондриально-адресованного антиоксиданта ПДТФ. Экспериментальные примеры Ниже приведены экспериментальные примеры (ЭП), которые призваны проиллюстрировать возможность применения настоящего изобретения. ЭП 1. Метод очистки митохондриально-адресованного антиоксиданта с использованием "молекулярной ловушки". 1. Исходный технический продукт ПДТФ (5 г) после предварительной очистки на силикагеле в системе этанол-хлороформ (1:9) имеет чистоту около 85%. Содержание восстановленной формы 8%. Для очистки от основной массы примесей использован метод ВЭЖХ. Колонка C18, 50045 мм. Подвижная фаза - бессолевой безбуферный водно-этанольный раствор. Режим градиентный. Система А 15% этанола, система Б - 40% этанола. После отбора центральных фракций чистота препарата составляет около 92%. Содержание восстановленной формы 6%. Сравнительная качественная реакция на бромиды исходного и очищенного продукта показывает сохранение иона брома после хроматографической очистки. Аналитическая ВЭЖХ на колонке C18, 2504,6 мм в системе 0,05% трифторуксусной кислоты в 65% ацетонитрила в воде также демонстрирует примерно одинаковую интенсивность пика иона брома (в начале хроматограммы) для исходного и очищенного продукта. 2. Продукт после очистки методом ВЭЖХ (3,8 г) отгона растворителя и сушки в высоком вакууме имеет вид густого прозрачного масла темно-коричневого цвета. Для минимизации содержания восстановленной формы в препарате использован один из вариантов метода "молекулярной ловушки". В колбу с маслом приливают 200 мл гексана, добавляют 5 мл ацетона и массу интенсивно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин. После этого осторожно декантируют слой растворителя. Производят хроматографический контроль слитой порции растворителя и оставшегося масла. На ВЭЖХ растворителя кроме небольшого пика ацетона есть только интенсивный пик восстановленной формы; основная окисленная форма отсутствует. На хроматограмме целевого продукта хорошо видно уменьшение содержания восстановленной формы. Для дальнейшей минимизации содержания восстановленной формы может потребоваться повторение данной процедуры несколько раз. Возможно проведение этой процедуры в автоматическом режиме с непрерывной подачей свежей порции растворителя и сливом отработанного раствора. Важно отметить, что при проведении данной методики совершенно отсутствуют потери основного вещества. Бром-ион сохраняется. Чистота получаемого продукта составляет около 97%. Доля восстановленной формы - не более 1%. 3. Гель-хроматография в растворе этанола. Данный способ очистки удобен как финальная стадия перед дозированным розливом концентрированного раствора препарата, сушки и постановки на хранение. Около 3,7 г препарата растворяют в 5-6 мл этанола и хроматогафируют на колонке 60010 мм с сефадексом LH-20, предварительно уравновешенной абсолютным этанолом для спектрофотометрии. Отбрасывают головные и хвостовые фракции. Чистота основной фракции - не менее 98%. Доля восстановленной формы - 0,8-0,9%. Концентрация препарата может достигать 150-200 мг/мл. С таким раствором удобно производить дозированный розлив и сушку готовой субстанции. ЭП 2. Синтез пластохинонилдецилтрифенилфосфония (ПДТФ) бромида. Синтез включает в себя следующие стадии. 1. Окисление 2,3-диметилфенола (1) в 2,3-диметил-1,4-бензохинон (2) реактивом Джонса; 2. Присоединение 11-бромундекановой кислоты (3) к трифенилфосфину с образованием бромида(10-карбоксидецил)трифенилфосфина (4) 3. Образование целевого соединения (5) в результате реакции полученного соединения (4) с 2,3-диметил-1,4-бензохиноном (2) в присутствии нитрата серебра и персульфата аммония. Схема синтеза приведена на фиг. 2. Синтез 2,3-диметил-1,4-бензохинона (2). К раствору 20 г (0.16 моль) 2,3 диметилфенола в 230 мл эфира и при перемешивании добавили реактив Джонса (раствор 110 г (0,37 моль) Na2Cr2O72H2O в смеси 157 мл воды и 70 мл конц. серной кислоты) и перемешивали смесь в течение 24 ч. Экстрагировали смесь эфиром, объединенные эфирные вытяжки промывали, а затем сушили прокаленным сульфатом магния, после удаления растворителя на роторном испарителе остаток подвергали флэш-хроматографии на силикагеле в хлороформе. Выход соединения 2 в виде желтого кристаллического вещества 8,7 г (40%).ESI MS: m/z вычислено для C8H8O2 136,15; найдено 136,2. Синтез бромида (10-карбоксидецил)трифенилфосфина (4). К 530 мг (2 ммоль) 11-бромундекановой кислоты добавили 588 мг (2.24 ммоль) трифенилфосфина и выдерживали смесь в запаянной ампуле при температуре 85C в течение 12 ч. После этого смесь подвергли разделению на колонке с силикагелем в системе хлороформ - метанол (9:1). Выход соединения 4 в виде прозрачного масла 895 мг (85%).ESI MS: вычислено для C29H36OP: 447,6; найдено m/z 448,2 (MH+; 100%). Синтез [10-(4,5-диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1-ил)децил]трифенилфосфониум бромида,ПДТФ бромида (5). К раствору 135 мг (1 ммоль) 2, 526 мг (1 ммоль) 4 и 85 мг (0,5 ммоль) азотнокислого серебра в 40 мл смеси ацетонитрила и воды (1:1) при температуре 80-90C добавляли раствор 228 мг (1 ммоль) персульфата аммония в 5 мл воды. Нагревали с перемешиванием при той же температуре 12 ч. Смесь разбавляли водой и экстрагировали дихлорметаном. После упаривания дихлорметана до небольшого объема продукт осаждали диэтиловым эфиром. Раствор с осадка декантировали, осадок переосаждали несколько раз. В конце осадок очищали на колонке силикагеля в смеси дихлорметан - этанол (в соотношении 9:1) Выход [10-(4,5-диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1-ил)децил]трифенилфосфониум бромида,( ПДТФ бромида) 35%. Соединение 1 получали, исходя из берберина бисульфата (5), который восстанавливали боргидридом натрия в пиридине в течение 30 мин при комнатной температуре и после кристаллизации из воды с выходом 91% получали соединение 6. Соединение 6 алкилировали метиловым эфиром бромуксусной кислоты (1 ч, 100C) с последующим восстановлением промежуточного соединения боргидридом натрия(30 мин, комнатная температура) с образованием соединения 7, которое выделяли экстракцией эфиром из водного раствора (выход 80%) и омыляли 1% водно-метанольным раствором гидроксида лития при кипячении в течение 1,5 ч с образованием соединения 8. Выход 8 составил после кристаллизации из воды 61%. Соединение 8 переводили в цезиевую соль, которую конденсировали с предварительно синтезированным производным 2,3-диметил-1,4-бензохинона 9 при 60C в течение 48 ч. Соединение 10 окисляли N-бромсукцинимидом (NBS) в растворе хлористого метилена в течение 1 ч, после удаления избыткаNBS путем промывки органической фазы водой и ее сушки смесь упаривали и конечное вещество 1 высаживали эфиром. Очистку соединения 1 осуществляли с помощью ВЭЖХ (C18) в градиенте ацетонитрила, содержащего 0,05% ТФА, в 0,05% водной ТФА от 30 до 80%. Общий выход после двух последних стадий составил 50%. Аналогичным образом получали соединения 2-4.ESI MS: m/z рассчитано для C35H38NO8 600,68; найдено 600,87. Также была проанализирована проникающая способность соединений SkQB1 и SkQBP1. Результаты анализа на искусственной билипидной мембране показали высокую проникающую способность этих соединений (не уступающую способности SkQ1). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Митохондриально-адресованные антиоксиданты, описываемые общей формулой (I)B - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии;A представляет собой антиоксидант общей формулы (II)L - линкерное звено, представляющее собой: а) либо незамещенную простую или разветвленную углеводородную цепь или углеводородную цепь, содержащую одну или более двойную или тройную связь или эфирную, или сложноэфирную, илиC-S, или S-S, или пептидную связи, или эта углеводородная цепь является замещенной одним или более заместителем, выбранным из алкила, алкокси, галогена, кетогруппы, аминогруппы; б) либо природную изопреноидную цепь; В - остаток берберина или палматина;Z- - фармацевтически приемлемый анион. 2. Применение соединения с кето- или хиноноподобной группой, обладающего окислительновосстановительным потенциалом не менее 0,2 В при нейтральных значениях pH, в качестве "молекулярной ловушки" восстановленной формы митохондриально-адресованного антиоксиданта общей формулы (I)B - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; иA представляет собой антиоксидант общей формулы (II)L - линкерное звено, представляющее собой: а) либо незамещенную простую или разветвленную углеводородную цепь или углеводородную цепь, содержащую одну или более двойную или тройную связь или эфирную, или сложноэфирную, илиC-S, или S-S, или пептидную связи, или эта углеводородная цепь является замещенной одним или более заместителем, выбранным из алкила, алкокси, галогена, кетогруппы, аминогруппы; б) либо природную изопреноидную цепь; В - представляет собойZ- - фармацевтически приемлемый анион. 3. Фармацевтическая субстанция на основе митохондриально-адресованного антиоксиданта общей формулы (I)B - адресующая группа, обеспечивающая адресную доставку всего соединения в митохондрии; иA представляет собой антиоксидант общей формулы (II)L - линкерное звено, представляющее собой: а) либо незамещенную простую или разветвленную углеводородную цепь, или углеводородную цепь, содержащую одну или более двойную или тройную связь, или эфирную, или сложноэфирную, илиC-S, или S-S, или пептидную связи; или эта углеводородная цепь является замещенной одним или более заместителем, выбранным из алкила, алкокси, галогена, кетогруппы, аминогруппы; б) либо природную изопреноидную цепь; В представляет собойZ- - фармацевтически приемлемый анион,в которой соотношение окисленной и восстановленной форм составляет от 80 до 99,8% окисленной формы и в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение всего срока годности при соблюдении установленных условий хранения. 4. Фармацевтическая субстанция по п.3, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм составляет от 97,5 до 99,5% окисленной формы. 5. Фармацевтическая субстанция по пп.3, 4, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 1 месяца. 6. Фармацевтическая субстанция по пп.3, 4, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 6 месяцев. 7. Фармацевтическая субстанция по пп.3, 4, в которой соотношение окисленной и восстановленной форм митохондриально-адресованного антиоксиданта сохраняется в течение не менее 2 лет.