Антитело или его фрагменты, связывающиеся с nogo-a человека, и применение антитела и фрагментов

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С NOGO-A ЧЕЛОВЕКА, И ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА И ФРАГМЕНТОВ Настоящее изобретение относится к антителам к NOGO, содержащим их фармацевтическим композициям и к применению таких антител в лечении и/или профилактике неврологических заболеваний/расстройств. Клегг Стефани Джейн, Эллис Джонатан Генри, Гермашевски Фолькер, Хэмблин Пол Эндрю (GB),Копсидас Георг (AU), Макадам Рут,Принджха Рабиндер Кумар (GB) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB) 015536 Область изобретения Настоящее изобретение относится к иммуноглобулинам, в частности к антителам, которые связываются с NOGO и нейтрализуют его активность, к кодирующим такие антитела полинуклеотидам, к содержащим указанные антитела фармацевтическим композициям и к применению таких антител в лечении и/или профилактике неврологических заболеваний. Другие аспекты, задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из приведенного ниже описания. Предшествующий уровень техники Инсульт является основной причиной смерти и нетрудоспособности в странах Запада. Не существует другой утвержденной терапии для лечения инсульта, кроме тканевого плазминогена (t-PA), который должен быть введен в течение 3 ч от начала после проведения компьютерной томографии для исключения кровоизлияния. К настоящему времени большинство терапевтических агентов, направленных на лечение острого инсульта (т.е. на нейропротекцию), преимущественно были нацелены на глутаматные рецепторы и их нисходящие сигнальные пути, которые, как известно, вовлечены в острую гибель клеток. Однако к настоящему времени эти стратегии признаны неудачными в клинических испытаниях и часто ассоциированы с ограничивающими дозу побочными эффектами (HillHachinski, The Lancet, 352:(suppl III), 10-14 (1998. Поэтому существует потребность в новых подходах, направленных на уменьшение гибели клеток после прекращения кровотока. Нейропротекция представляет собой способность лечения предупреждать или уменьшать потерю нервных клеток в ответ на инсульт или патологический процесс. Этого можно достичь путем нацеливания непосредственно на нейроны или опосредованно путем предупреждения гибели глиальных клеток (включая олигодендроциты). После начала инсульта у многих пациентов наблюдается некоторая степень спонтанного функционального восстановления, что позволяет предположить, что мозг обладает (хотя и ограниченно) способностью к восстановлению и/или ремоделированию после повреждения. Поэтому агенты, способные усиливать такое восстановление, могут сделать возможным осуществление вмешательства в гораздо более поздние сроки (потенциально, сутки) после начала церебоальной ишемии. Агенты, способные обеспечивать как экстренную нейропротекцию, так и усиление функционального восстановления, могут обеспечить значительные преимущества по сравнению с современными потенциальными нейропротективными стратегиями. Болезнь Альцгеймера (AD) характеризуется наличием двух диагностических признаков патологии. Это амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки, состоящие из агрегировавшего бетаамилоидного пептида (А 40 и А 42) и гиперфосфорилированного тау соответственно (DawnbarnAllen 2001, Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP). В комплексном исследовании у пациентов была показана строгая связь между накоплением бетаамилоида и снижением когнитивных способностей (Naslund et al., JAMA, March 22/29, 2000, Vol. 283,No.12, p. 1571-1577). Это соответствует генетическим и эпидемиологическим исследованиям, которые предполагают, что некоторые мутации в генах АРР (белок-предшественник амилоида) и пресенилина могут провоцировать раннее развитие AD, а также повышать уровни пептидов А 40 и А 42, включая их соотношение. Для образования бета-амилоидного пептида необходимо расщепление трансмембранного АРР типаI двумя различными протеазами, обозначенными как бета- и гамма-секретаза. Была подтверждена молекулярная идентичность бета-секретазы с аспартил-протеазой Asp2/BACE1 (Hussain et al. Mol. Cell.NeuroSci. 16, 609-619 (2000); Vassar et al., Science (1999), Oct. 22; 286 (5440): 735-741). Природа гаммасекретазы является источником некоторой дискуссии и, вероятно, состоит из высокомолекулярного комплекса, состоящего по меньшей мере из следующих белков: пресенилины, Aph1, Pen2 и никастрин (см. обзор в MedinaDotti Cell Signalling, 2003 15(9): 829-41). Процессинг АРР в ЦНС, вероятно, происходит во многих типах клеток, включая нейроны, олигодендроциты, астроциты и микроглию, хотя на общую скорость процессинга АРР в этих клетках будет влиять относительный уровень экспрессии АРР, BACE1/Asp2, пресенилина-1 и -2, Aph1, Pen2 и никастрина. Кроме того, дополнительные факторы, регулирующие внутриклеточную локализацию АРР, также могут влиять на его процессинг, как показано в результате обнаружения того, что мутация мотива YENP в цитоплазматическом домене АРР, блокирующая его эндоцитоз, снижает продукцию бета-амилоида(Perez et al. 1999, J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-6). Удерживание АРР-бета-CTF в ER посредством добавления KKQN-удерживающего мотива является достаточным для уменьшения продукции амилоида в трансфицированных клетках (Maltese et al. 2001, J. Biol. Chem. 276 (23,) 20267-20279). Наоборот, повышение эндоцитоза посредством сверхэкспрессии Rab5 является достаточным для повышения секреции амилоида из трансфицированных клеток (Grbovic et al. 2003, J. Biol. Chem. 278 (33), 31261-31268).-1 015536 В соответствии с этими открытиями дополнительные исследования показали, что снижение уровней клеточного холестерина (хорошо известный фактор риска AD) уменьшало образование бетаамилоида. Это изменение зависело от измененного эндоцитоза, как продемонстрировано с использованием доминантно-негативных динаминовых мутантов (K44A) и сверхэкспрессии Rab5 ГТФазаактивирующего белка RN-Tre (Ehehalt et al. 2003, J. Cell. Biol. 160 (1), 113-123). Обогащенные холестерином микродомены или рафты также представляют собой важный клеточный участок продукции бета-амилоида, и было показано, что АРР, ВАСЕ 1 и компоненты гаммасекретазного комплекса временно располагаются в пределах рафтов. Перекрестное связывание антителами АРР и ВАСЕ 1 с обогащенными холестерином рафтами способствовало повышению продукции бета-амилоида (Ehehalt et al. 2003 J. Cell. Biol. 160 (1), 113-123). Аналогично, экспрессия GPI-заякоренногоBACE1, который нацелен исключительно на обогащенные липидами рафты, способствует повышению расщепления АРР и продукции бета-амилоида (Cordy et al. 2003, PNAS 100(20), 11735-11740). Механизмы, лежащие в основе функционального восстановления после инсульта или другой ситуации или заболевания, сопровождающегося повреждением нервной ткани, в настоящее время неизвестны. В качестве одного из возможных механизмов было предложено прорастание поврежденных или неповрежденных аксонов. Однако, хотя исследования in vivo продемонстрировали, что лечение повреждения спинного мозга или инсульта нейротрофическими факторами приводит к усилению функционального восстановления и степени прорастания аксонов, они не доказывают наличие прямой связи между степенью прорастания аксонов и степенью функционального восстановления (Jakeman, et al. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94: 8179-8184, Ribotta, et al. 2000, J.Neurosci. 20: 5144-5152). Кроме того, прорастание аксонов требует наличия жизнеспособного нейрона. Поэтому при заболеваниях, таких как инсульт, которые ассоциированы с массовой гибелью клеток, усиление функционального восстановления, обеспечиваемое введенным агентом после инсульта, может происходить благодаря механизмам, отличным от прорастания аксонов, таким как дифференцировка эндогенных стволовых клеток, активация резервных путей, изменения в распределении рецепторов или возбудимости нейронов или глии (FawcettAsher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, HornerGage,2000, Nature 407 963-970). Ограниченную способность центральной нервной системы (ЦНС) восстанавливаться после повреждения связывают отчасти с молекулами в среде ЦНС, которые обладают ингибирующим эффектом на прорастание аксонов (нейритных отростков). Миелин ЦНС, как полагают, содержат ингибирующие молекулы (Schwab M.E. and Caroni P. (1988), J. Neurosci. 8, 2381-2193). Два миелиновых белка, миелинассоциированный гликопротеин (MAG) и NOGO, клонировали и идентифицировали в качестве предполагаемых ингибиторов нейритных отростков (Sato S. et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm. 163,1473-1480; McKerracher L. et al. (1994), Neuron, 13, 805-811; Mukhopadhyay G. et al. (1994), Neuron, 13,757-767; Torigoe K. and Lundborg G. (1997), Exp. Neurology, 150, 254-262; Schafer et al. (1996), Neuron, 16,1107-1113; WO 9522344; WO 9701352; Prinjha R. et al. (2000), Nature, 403, 383-384; Chen M.S. et al. (2000),Nature, 403, 434-439; GrandPre T. et al. (2000), Nature, 403, 439-444; US 005250414 A; WO 200005364 A1;WO 0031235). Идентифицированы три формы человеческого NOGO:NOGO-B, сплайс-вариант, в котором отсутствуют остатки с 186 по 1004 в предполагаемом внеклеточном домене (инвентарныйGenBank AJ251384); и более короткий сплайс-вариант, NOGO-C, в котором также отсутствуют остатки с 186 по 1004,а также имеется меньший альтернативный N-концевой домен (инвентарныйGenBank AJ251385)(Prinjha R. et al. (2000), выше). Ингибирование ингибиторных белков ЦНС, таких как NOGO, может обеспечить терапевтическое средство для уменьшения нейронального повреждения и стимуляции нейронального восстановления и роста, тем самым потенциально содействующее восстановлению после нейронального повреждения, такого, какое обеспечивается при инсульте. Примеры таких ингибиторов NOGO могут включать небольшие молекулы, пептиды и антитела. Сообщили, что мышиное моноклональное антитело, IN-1, полученное против NI-220/250,миелинового белка, который является потенциальным ингибитором роста нейритов (и, как было показано впоследствии, является фрагментом NOGO-A), стимулирует регенерацию аксонов (Caroni, P.Bregman, B.S. et al. (1995), Nature, 378, 498-501 and Thallmair, M. et al. (1998), Nature Neuroscience, 1, 124131). Также сообщили, что NOGO-A является антигеном для IN-1 (Chen et al. (2000) Nature 403 434-439). Введение Fab-фрагмента IN-1 или гуманизированного IN-1 крысам, подвергнутым перерезке спинного мозга, улучшало восстановление (Fiedler, M. et al. (2002), Protein Eng, 15, 931-941; Brosamle, С. et al.WO 2005028508. В WO 04/052932 раскрыто мышиное антитело 11 С 7, которое связывается с конкретными формами человеческого NOGO с высокой аффинностью.-2 015536 В заявке на патент WO 05/061544 также раскрыты моноклональные антитела с высокой аффинностью, включая мышиное моноклональное антитело 2 А 10, и в общем раскрыты их гуманизированные варианты, например H1L11 (последовательности для Н 1 и L11 представлены в SEQ ID NO:33 и 34 соответственно (только VH или VL последовательности. Раскрытые антитела связываются с человеческимNOGO-A с высокой аффинностью. Мышиное антитело 2 А 10 (и его CDR-трансплантированные гуманизированные варианты) характеризуются следующими последовательностями областей, определяющих комплементарность (CDR) (как определено с использованием методики Kabat (Kabat et al. (1991),"Sequences of proteins of immunological interest", Fifth Edition; US Department of Health and HumanServices; NIH publication, No 91-3242, в пределах вариабельных областей их легких и тяжелых цепей. Таблица 1CDR легкой цепи антитела 2 А 10CDR тяжелой цепи антитела 2 А 10 В WO 05/061544 также раскрыты "аналоги" антител, которые содержат CDR из вышеприведенных табл. 1 и 2; такие "аналоги" обладают такой же антигенсвязывающей специфичностью и/или нейтрализующей способностью, как и донорные антитела, из которых они получены. Несмотря на то что в предшествующем уровне техники предложены антитела против NOGO с высокой аффинностью, весьма желательной целью остается выделение и развитие альтернативных или улучшенных терапевтически полезных моноклональных антител, которые связывают и ингибируют активность человеческого NOGO. Процесс нейродегенерации лежит в основе многих неврологических заболеваний/расстройств,включая острые заболевания, такие как инсульт (ишемический или геморрагический), травматическое повреждение головного и спинного мозга; а также хронические заболевания, включая болезнь Альцгеймера, лобно-височные деменции (тауопатии), периферическую невропатию, болезнь Паркинсона, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), шизофрению, боковой амиотрофический склероз (ALS), рассеянный склероз, болезнь Гентингтона, рассеянный склероз и миозит с тельцами включения. Поэтому моноклональные антитела против NOGO и т.п. по настоящему изобретению могут быть полезны в лечении этих заболеваний/расстройств. В настоящем изобретении предложены и подробно описаны антитела для лечения вышеупомянутых заболеваний/расстройств. Краткое описание графических материалов Фиг. 1. GST-человеческий NOGO-A56 наносили в концентрации 1,0 мкг/мл на очищенные антитела в ELISA. Фиг. 2. GST-человеческий NOGO-A56 наносили в концентрации 0,5 мкг/мл на очищенные антитела в ELISA. Фиг. 3. GST-человеческий NOGO-A56 наносили в концентрации 1,0 мкг/мл на очищенные антитела в ELISA. Фиг. 4. GST-человеческий NOGO-A56 наносили в концентрации 0,5 мкг/мл на очищенные антитела в ELISA. Фиг. 5. Картирование эпитопов с использованием 2 А 10. Фиг. 6. Картирование эпитопов с использованием H28L16. Фиг. 7 и 8. Сравнение связывающей активности Hc(G95M)Lc и HcLc в ELISA. Фиг. 9. Варианты группы 1. Фиг. 10. Варианты группы 2. Фиг. 11. ELISA с прямым связыванием антител пула предварительных кандидатов с рекомбинантным человеческим NOGO-A (GST-NOGO-A 5+6). Рекомбинантный GST-NOGO-A 5+6 наносили на планшеты в концентрации А) 1,0 мкг/мл и Б) 0,05 мкг/мл. Связывание антител определяли с использованием конъюгата HRP с антителами против человеческого IgG (Sigma A7340X). В качестве отрицательного контроля использовали антитело против -амилоида (H2L1). Значения ЕС 50 получали с использованием Robosage. На каждом из графиков ниже представлена типичная кривая для трех независимых анализов.-3 015536 Фиг. 12. Обратный формат ELISA связывания антител пула предварительных кандидатов с рекомбинантным человеческим NOGO-A (GST-NOGO-A 5+6). Антитела против NOGO-A иммобилизовали с антителами против человеческого IgG (Sigma I9764). Связывание рекомбинантного GST-NOGO-A 5+6 определяли с использованием конъюгата анти-CST-HRP (Sigma A7340). В качестве отрицательного контроля использовали неродственное антитело. Значения ЕС 50 получали с использованием Robosage. На графике ниже представлена типичная кривая для трех независимых анализов. Фиг. 13. Конкурентный ELISA антител пула предварительных кандидатов с родительским антителом 2 А 10. Рекомбинантный человеческий NOGO-A (GST-NOGO-A 5+6) наносили на планшеты. 2 А 10 и гуманизированные антитела предварительно смешивали и определяли связывание 2 А 10 с использованием конъюгата антител против мышиного IgG с HRP (Dakocytomation, P0260). В качестве положительного контроля использовали HcLc. Значения IC50 получали с использованием Robosage. На графике ниже представлена типичная кривая для трех независимых анализов. Фиг. 14. Связывание гуманизированных антител против NOGO-A с человеческим NOGO-A, экспрессирующимся на клеточной поверхности. Для экспрессии человеческого NOGO-A сконструировали клетки СНО-K1. Клетки окрашивали в двух повторностях 100 мкг/мл гуманизированных антител противNOGO-A с последующим разведением 1:100 РЕ-меченого вторичного антитела против человеческогоIgG (Sigma, P8047). В качестве отрицательного контроля включали неродственное антитело. Представленные данные являются типичным примером одной из повторностей. Фиг. 15. Связывание гуманизированных антител против NOGO-A с внутриклеточным человеческимNOGO-A. Клетки IRM32 подвергали пермеабилизации, фиксировали и окрашивали 3-90 мкг/мл гуманизированных антител против NOGO-A, затем 30 мкг/мл РЕ-меченого вторичного антитела против человеческого IgG (Sigma, P-9047). В качестве отрицательного контроля включали неродственное антитело(-ve Ab). Представленные данные являются типичными для трех независимых экспериментов. Фиг. 16. Сравнение гуманизированных антител против NOGO-A в анализе роста нейритов. H28L16,H27L16 и H20L16 сравнивали с родительскими антителами (2 А 10, HcLc), антителом 11 С 7 и различными контрольными антителами (контрольный IgG и Campath). Повышенный рост нейритов наблюдали только для антител против NOGO-A. Эффекты были дозозависимыми и статистически значимыми. Фиг. 17. ELISA с прямым связыванием H28L16 с рекомбинантным полноразмерным сплайсвариантом человеческого NOGO-A (GST-NOGO-A-Biocat 113015). Рекомбинантный сплайс-вариантNOGO-A наносили на планшеты в концентрации 1,0 мкг/мл. Связывание антител определяли с использованием конъюгата антител против человеческого IgG с HRP (Sigma, A7340X). В качестве отрицательного контроля использовали антитело против -амилоида. Значения ЕС 50 получали с использованиемRobosage. На графике ниже представлена типичная кривая для двух независимых анализов. Фиг. 18. H28L16 демонстрирует пониженное связывание с C1q. Планшеты ELISA покрывали очищенными гуманизированными и контрольными антителами в фиксированной концентрации (1 мкг/мл).C1q человека (Sigma, С 0660) инкубировали с антителами и связанный C1q определяли количественно с использованием конъюгата антител против человеческого C1q с HRP (The Binding Site, PP020X). Контрольные антитела представляют собой Campath IgG1, Campath IgG4 и Campath IgG1 Fc-. Фиг. 19. ELISA с прямым связыванием H28L16, HcLc и 11 С 7 с GST-NOGO-A56: А) крысы, Б) макака, В) мартышки и Г) беличьей обезьяны. HcLc включали для сравнения. В качестве отрицательного контроля включали неродственное антитело. На графиках ниже представлена типичная кривая для трех независимых анализов. Фиг. 20. Конкурентный ELISA для сравнения связывания эпитопов H28L16 и 11 С 7. Рекомбинантный человеческий NOGO-A (GST-NOGO-A 5+6) наносили на планшеты. 2 А 10 и либо 11 С 7, либо H28L16 предварительно смешивали и определяли связывание 2 А 10 с использованием конъюгата антител против мышиного IgG с HRP (Dakocytomation, P0260). Значения IC50 получали с использованием Robosage. На графике ниже представлена типичная кривая для трех независимых анализов. Фиг. 21. Конкурентный ELISA для сравнения связывания NOGO-5+6 (GST-NOGO-A 5+6) и пептидных фрагментов с H28L16. На графике ниже представлена типичная кривая для двух независимых анализов. Фиг. 22. Данные ELISA для варианта G101S/Q37R в сравнении с H6L13 и H27L16.-4 015536 Краткое изложение сущности изобретения Согласно изобретению предложены конкретные вариабельные области тяжелой цепи и антитела или их фрагменты, содержащие указанные конкретные вариабельные области тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи, которые позволяют, при спаривании с вариабельными областями тяжелой цепи, Fv-димеру связывать с высокой аффинностью человеческий NOGO-A и, таким образом, нейтрализовать активность человеческого NOGO-A. Вариабельные области тяжелой цепи по настоящему изобретению могут быть отформатированы вместе с вариабельными областями легкой цепи для обеспечения связывания с человеческим NOGO-A в форме стандартного иммуноглобулина (например, человеческий IgG, IgA, IgM и т.д.) или любого другого его фрагмента, или в "антитело-подобном" формате, который связывается с человеческим NOGO-A(например, одноцепочечный Fv, диатела, Tandabs и т.д. (краткое описание альтернативных "антительных" форматов см. в Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23, No. 9, 1126-1136. Вариабельная область тяжелой цепи содержит третью CDR, состоящую, по существу, из аминокислотных остатков GQGY, где указанная CDR содержит по меньшей мере одну замену в коровой последовательности GQGY, выбранную из следующих замен: где G в первом положении заменен на R, I, W или М; Q во втором положении заменен на D, I, A, L, V или S; G в третьем положении заменен на W, N, Y, S,L или F и Y в четвертом положении заменен на W. В другом воплощении третья CDR тяжелой цепи (CDR H3) содержит только одну замену с получением следующих CDR Н 3:RQGY (SEQ ID NO:75), IQGY (SEQ ID NO:76), MQGY (SEQ ID NO:45), GDGY (SEQ ID NO:77),GIGY (SEQ ID NO:78), GSGY (SEQ ID NO:79), GQNY (SEQ ID NO:80), GQYY (SEQ ID NO:81),GQSY (SEQ ID NO:62), GQLY (SEQ ID NO:82), GQFY (SEQ ID NO:83), GQGW (SEQ ID NO:84),WQGY (SEQ ID NO:86), GAGY (SEQ ID NO:87), GLGY (SEQ ID NO:88), GVGY (SEQ ID NO:89),GQWY (SEQ ID NO:90). В еще одном воплощении вышеупомянутые вариабельные области тяжелой цепи дополнительно содержат другие CDR, перечисленные в табл. 2, т.е. CDR H1 (SEQ ID NO:1) и CDR H2 (SEQ ID NO:2). Антитела по настоящему изобретению или их фрагменты сохраняют активность связывания с человеческим NOGO антител, содержащих CDR Н 3 (GQGY), в контексте их активности, измеренной в ELISA(твердофазный иммуноферментный анализ) и Biacore экспериментах, а в некоторых случаях активность в этих экспериментах повышается. Человеческие или гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи, содержащие G95M(нумерация замен по Kabat) В одном воплощении настоящего изобретения вариабельные области тяжелой цепи по настоящему изобретению содержат CDR, определенные в табл. 3 (как определено по Kabat). Таблица 3 Согласно одному воплощению настоящего изобретения предложена человеческая или гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи, содержащая каждую из CDR, перечисленных в табл. 3. Согласно другому воплощению настоящего изобретения предложена гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи, содержащая CDR, перечисленные в табл. 3, в пределах большей последовательности человеческой вариабельной области тяжелой цепи. Согласно еще одному воплощению гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR, перечисленные в табл. 3, в пределах рамки акцепторного антитела, имеющей более чем 40%-ную идентичность по рамочным областям, или более чем 50%, или более чем 60%, или более чем 65%-ную идентичность с вариабельной областью тяжелой цепи мышиного донорного антитела 2 А 10 (SEQ ID NO:7). В тех случаях, когда используют все CDR из табл. 3, в одном воплощении последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой последовательность Н 98, предложенную в видеCDR Н 3 в Н 98 представляет собой MQGY вместо GQGY, обнаруженного в Н 1). Согласно одному аспекту настоящего изобретения антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:66 (вариабельная область Н 98),дополнительно содержащую ряд замен по одному или более положениям: 38, 40, 48, 67, 70, 72, 74 и 79; где каждый замещенный аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток, находящийся в эквивалентном положении в SEQ ID NO:7 (вариабельная область тяжелой цепи донорного антитела 2 А 10), и число замен составляет от 1 до 9. В других воплощениях число замен составляет 1, или 2, или 3,или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9.-5 015536 В этом контексте описанные замены эквивалентны по своему характеру "обратным мутациям", где аминокислотные остатки человеческой рамки в конкретных положениях в пределах последовательности Н 98 подвергают обратной мутации до аминокислотных остатков, находящихся в эквивалентном положении в пределах последовательности донорного антитела 2 А 10. Если не указано иначе в противоположность описанному в данном изобретении, когда числовое положение аминокислотного остатка, находящегося в конкретной последовательности, упомянуто в данном документе, например "положение 12", то предполагают, что квалифицированный читатель присваивает первой аминокислоте в последовательности положение "1" и начинает отсчет от положения "один" и определяет аминокислоту, которая находится в желаемом положении, в этом примере - двенадцатый аминокислотный остаток в последовательности. Квалифицированный читатель заметит, что эта система нумерации не соответствует системе нумерации Kabat, которую часто используют для определения положений аминокислот в последовательностях антител. При гуманизации мышиного антитела 2 А 10 (VH для которого представляет собой SEQ ID NO:7) обнаружено, что для оптимальной аффинности связывания пара аминокислотных остатков в положениях 48 и 68 должна представлять собой I и А соответственно (как они находятся в 2 А 10) или М и V соответственно (как они находятся в Н 98). Ожидают, что вышеупомянутое открытие также важно для гуманизации G95 М-варианта 2 А 10. Следующая таблица включает фрагменты трех различных вариабельных областей (VH) тяжелой цепи, которые могут образовывать часть антител по настоящему изобретению. Каждая из раскрытых VH основана на VH H98 (SEQ ID NO:66), дополнительно включая замены, указанные в табл. 4, где остаток Н 98 в соответствующем положении замещен остатком 2 А 10 в этом положении (в таблице "-" означает,что в этом положении замены нет, и, таким образом, остаток остается таким же, как в последовательности Н 98). Таблица 4 Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения вариабельные области (VH) тяжелой цепи по настоящему изобретению представляют собой Н 26 VH (SEQ ID NO:47), Н 27 VH (SEQ ID NO:48) и Н 28 VH (SEQ ID NO:49). Человеческие или гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи, содержащие G101S(нумерация замен по Kabat) Согласно другому воплощению настоящего изобретения предложена человеческая или гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи, содержащая CDR, определенные в табл. 5. Таблица 5-6 015536 В одном воплощении в последовательность человеческой вариабельной области тяжелой цепи включены CDR из табл. 5. В другом воплощении гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR, перечисленные в табл. 5, в пределах рамки акцепторного антитела с более чем 40%-ной идентичностью рамочных областей, или более чем с 50%, или более чем с 60%, или более чем с 65%-ной идентичностью вариабельной области тяжелой цепи мышиного донорного антитела 2 А 10 (SEQ ID NO:7). В другом воплощении CDR из табл. 5 включены в человеческую вариабельную область тяжелой цепи с получением следующей последовательности (Н 99):GQGTLVTVSS (SEQ ID 61: гуманизированная конструкция Н 99 VH 2A10). В других воплощениях в последовательность Н 99 VH добавлены дополнительные обратные мутации по любому одному из положений (указанных числовым положением остатка) 38, 40, 48, 67, 68, 70,72, 74 или 79; где каждый замещенный аминокислотный остаток заменен на аминокислотный остаток,находящийся в эквивалентном положении в SEQ ID NO:7 (вариабельная область тяжелой цепи донорного антитела 2 А 10), и число замен составляет от 1 до 9. В других воплощениях число замен составляет 1,или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, или 8, или 9. Н 99 VH представляет собой эквивалент Н 1 VH(SEQ ID NO:33), отличающийся только тем, что CDR H3 в Н 99 представляет собой GQSY вместо GQGY,обнаруженного в Н 1. При гуманизации мышиного антитела 2 А 10 (VH для которого представляет собой SEQ ID NO:7) обнаружено, что для оптимальной аффинности связывания пара аминокислотных остатков в положениях 48 и 68 должна представлять собой I и А соответственно (как они существуют в 2 А 10) или М и V соответственно (как они существуют в Н 98). Ожидают, что вышеуказанное открытие также важно для гуманизации G95 М-варианта 2 А 10. В одном воплощении обратные мутации находятся в положениях, указанных в табл. 6, где остаток Н 99 в соответствующем положении замещен остатком 2 А 10 в этом положении (в таблице "-" означает,что в этом положении замены нет, и, таким образом, остаток сохраняется, как в последовательности Н 1). Таблица 6 Антитела или фрагменты, содержащие человеческие или гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепиVH-конструкции по настоящему изобретению могут быть спарены с легкой цепью с образованием связывающейся с человеческим NOGO-A (Fv) единицы в любом формате, включая формат стандартногоIgG антитела, имеющего полноразмерные (FL) последовательности вариабельного и константного доменов тяжелой цепи. Примерами полноразмерных (FL) последовательностей тяжелой цепи IgG1, содержащих VH-конструкции по настоящему изобретению и инактивирующих мутации в положениях 235 и 237(нумерация EU Index) для придания антителу устойчивости к лизису, являются SEQ ID NO:53, 54 и 55. Последовательность вариабельной области легкой цепи, которая образует Fv с последовательностями вариабельной области тяжелой цепи по настоящему изобретению, может представлять собой любую последовательность, которая позволяет Fv связываться с человеческим NOGO-А. В одном воплощении настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи представляет собой легкую цепь 2 А 10 (см. WO 05/061544), вариабельная область легкой цепи которого предложена в данном изобретении как SEQ ID NO:8, или ее гуманизированные варианты. Гуманизированные варианты легкой цепи 2 А 10 предпочтительно содержат все CDR вариабельной области легкой цепи, которые описаны в табл. 1, перенесенные (grafted) на акцепторную рамку человеческой вариабельной области легкой цепи. В одном воплощении гуманизированные вариабельные области легкой цепи представляют собойL11 (SEQ ID NO:34), L13 (SEQ ID NO:13) или L16 (SEQ ID NO:14). Альтернативные вариабельные области легкой цепи на основе L13 и L16, содержащие конкретные замены в положениях 37 и/или 45 по-8 015536 В другом воплощении полноразмерные (FL) последовательности легкой цепи представляют собойL11FL (SEQ ID NO:36), L13FL (SEQ ID NO:17) или L16FL (SEQ ID NO:18). В еще одном воплощении антитела, их фрагменты или функциональные эквиваленты содержат последовательность VH, выбранную из Н 26, Н 27, Н 28, Н 100, Н 101 и Н 102; в комбинации с любой одной из следующих последовательностей VL: L11, L13, L16, L100, L101, L102, L103, L104 и L105. Предполагают, что все возможные комбинации перечисленных вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи конкретно раскрыты (например, H28L104 и др.). В конкретных воплощениях антитела, их фрагменты или функциональные эквиваленты содержат следующие пары вариабельных областей:H28L16 (SEQ ID NO:49 + SEQ ID NO:14). В другом воплощении антитела по настоящему изобретению содержат следующие полноразмерные последовательности:H28FL L16FL (SEQ ID NO:55 + SEQ ID NO:18). В одном воплощении антитело по настоящему изобретению содержит 27L16 (SEQ ID NO:48 + SEQ ID NO:14) или представляет собой полноразмерное антителоH28FL L16FL (SEQ ID NO:55 + SEQ ID NO:18). В другом воплощении антитело или его фрагмент связываются с таким же эпитопом человеческогоNOGO, что и H28L16, или конкурируют с H28L16 за связывание с человеческим NOGO, отличающиеся в обоих случаях тем, что конкурирующее антитело или его фрагмент не являются мышиным антителом 2 А 10 или его человеческим или гуманизированным вариантом, содержащим CDR Н 3, имеющую последовательность GQGY (SEQ ID NO:3) или последовательность, содержащую одну аминокислотную замену в CDR Н 3. В конкретных воплощениях антитела, их фрагменты или функциональные эквиваленты содержат следующие пары вариабельных областей:H102L16 (SEQ ID NO:65 + SEQ ID NO:14). Картирование эпитопов и дополнительные антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом Согласно другому воплощению предложено антитело или его фрагмент, которые способны связываться с человеческим белком NOGO или его фрагментом, таким как белок GST-NOGO-A56(SEQ ID NO:32), в ELISA анализе, где интенсивность связывания антитела или его фрагмента с человеческим белком NOGO или его фрагментом в ELISA анализе снижается в присутствии пептида, имеющего следующую последовательность: VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:60); и не снижается в присутствии нерелевантного пептида, например пептида из человеческого NOGO, который не перекрывается сSEQ ID NO:60 (такого как SEQ ID NO:85: YESIKHEPENPPPYEE), отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент не являются антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи,имеющий CDR Н 3, состоящую из аминокислотных остатков GQGY, или ее аналоги, имеющие одну аминокислотную замену в CDR Н 3. Альтернативно, конкурирующий пептид представляет собойTPSPVLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:73) или VLPDIVMEAPLNSAVP (SEQ ID NO:74). Кроме того, антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитела или их фрагменты, может представлять собой антитело, которое не содержит все CDR, перечисленные в табл. 1 и 2, или любое антитело, которое содержит набор CDR, имеющих 80%-ную или большую гомологию с CDR, перечисленными в табл. 1 и 2 вместе или в табл. 1 или 2 по отдельности. Согласно другому воплощению настоящего изобретения предложено антитело или его фрагмент,которые способны в ELISA анализе связываться с областью человеческого белка NOGO, состоящей из полипептидной последовательности VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:60), отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент не являются антителом, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи,имеющий CDR Н 3, состоящую из аминокислотных остатков GQGY, или ее аналоги, имеющие одну аминокислотную замену в CDR Н 3. Альтернативно, антитело или его фрагмент способны связываться сTPSPVLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:73) или VLPDIVMEAPLNSAVP (SEQ ID NO:74). Кроме того, антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитела или их фрагменты, может представлять собой антитело, которое не содержит все CDR, перечисленные в табл. 1 и 2, или любое антитело, которое содержит набор CDR, имеющих 80%-ную или большую гомологию с CDR, перечисленными в табл. 1 и 2 вместе или в табл. 1 или 2 по отдельности.-9 015536 Согласно еще одному воплощению настоящего изобретения предложен способ получения антитела или его связывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:60) человеческого NOGO, включающий иммунизацию млекопитающего указанным пептидом и выделение клеток, способных продуцировать антитело, которое связывается с указанным пептидом. Согласно другому воплощению настоящего изобретения предложен способ получения выделенного антитела или его связывающего фрагмента, которые связываются с эпитопом VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:60) человеческого NOGO, включающий скрининг библиотеки, которая содержит множество антител или их связывающих фрагментов, каждый из которых может быть выделен из данной библиотеки вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антитело или его связывающий фрагмент, посредством связывания антитела или его связывающего фрагмента с эпитопом VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:60) человеческого NOGO. Фармацевтические композиции. Согласно дополнительному аспекту данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против NOGO по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент или эквивалент вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики инсульта (особенно ишемического инсульта) и других неврологических заболеваний у человека, в частности болезни Альцгеймера, и лечения пациента, страдающего от механической травмы ЦНС (такой как повреждение спинного мозга), включающий введение указанному человеку, нуждающемуся в этом,эффективного количества антитела против NOGO по данному изобретению или его функциональных фрагментов. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение антитела противNOGO по данному изобретению или его функционального фрагмента в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инсульта (особенно ишемического инсульта) и других неврологических заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, и лечения пациента, страдающего от механической травмы ЦНС (такой как повреждение спинного мозга). Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ ингибирования нейродегенерации и/или стимуляции функционального восстановления у пациента-человека, страдающего от развития инсульта (особенно ишемического инсульта) или другого неврологического заболевания или имеющего риск развития инсульта (особенно ишемического инсульта) или другого неврологического заболевания, в частности болезни Альцгеймера, и лечения пациента, страдающего от механической травмы ЦНС (такой как повреждение спинного мозга), включающий введение указанному человеку, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела против NOGO по данному изобретению или его функционального фрагмента. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение антитела противNOGO по данному изобретению или его функционального фрагмента в изготовлении лекарственного средства для ингибирования нейродегенерации и/или стимуляции функционального восстановления у пациента-человека, страдающего от развития инсульта и другого неврологического заболевания или имеющего риск развития инсульта и другого неврологического заболевания, в частности болезни Альцгеймера, и лечения пациента, страдающего от механической травмы ЦНС (такой как повреждение спинного мозга). Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны далее в подробном описании и предпочтительных воплощениях. Подробное описание изобретения Вариабельные области тяжелой цепи по данному изобретению можно форматировать в структуру природного антитела или его функционального фрагмента или эквивалента. Поэтому антитело может содержать VH-области по изобретению, форматированные в полноразмерное антитело, (Fab)2-фрагмент,Fab-фрагмент или его эквивалент (такой как scFV, би-, три- или тетратела, Tandabs и т.д.) при спаривании с соответствующей легкой цепью. Антитело может представлять собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или IgM, IgA, IgE, IgD или его модифицированный вариант. Константный домен тяжелой цепи антитела может быть выбран соответствующим образом. Константный домен легкой цепи может представлять собой каппа- или лямбда-константный домен. Кроме того, антитело может содержать модификации всех классов, например IgG-димеры, Fc-мутанты, которые больше не связываются с Fc-рецепторами или не опосредуют Clq-связывание. Антитело может представлять собой также химерное антитело типа описанного в WO 86/01533, которое содержит антигенсвязывающую область и неиммуноглобулиновую область. Константную область выбирают согласно требуемой функциональности. Как правило, IgG1 будет демонстрировать литическую способность посредством связывания с комплементом и/или будет опосредовать ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность). Если требуется нецитотоксическое блокирующее антитело, то предпочтительным будет IgG4. Однако IgG4 антитела могут демонстрировать нестабильность при получении, и поэтому может быть более предпочтительной модификация обычно более стабильных IgG1. Предлагаемые модификации описаны в ЕР 0307434, предпочтительные модифи- 10015536 кации включают модификации по положениям 235 и 237. Поэтому согласно изобретению предложена литическая или нелитическая форма антитела по изобретению. Поэтому в предпочтительных формах антитело по изобретению представляет собой полноразмерное (т.е. Н 2L2-тетрамер) нелитическое IgG1 антитело, имеющее описанные в данном изобретении вариабельные области тяжелой цепи. Согласно другому аспекту изобретения предложены полинуклеотиды, кодирующие описанные в данном изобретении вариабельные области тяжелой цепи."NOGO" относится к любому полипептиду NOGO, включая вариантные формы. Они включают, но не ограничиваются этим, NOGO-A, имеющий 1192 аминокислотных остатка (инвентарныйGenBankAJ251383); NOGO-B, сплайс-вариант, который не содержит остатки с 186 по 1004 в предполагаемом внеклеточном домене (инвентарныйGenBank AJ251384); и более короткий сплайс-вариант, NOGO-C,который также не содержит остатки с 186 по 1004 и также имеет меньший альтернативный аминоконцевой домен (инвентарныйGenBank AJ251385) (Prinjha R. et al. (2000), см выше). Все ссылки на"NOGO" в данном описании подразумевают включение любой и всех различных форм NOGO, таких какNOGO-A и описанных сплайс-вариантов, если не указана конкретная форма."Нейтрализация" и грамматические варианты этого термина относятся к ингибированию, либо полному, либо частичному, функции NOGO, включая его связывание с нейронами и ингибирование нейритного роста. Термины Fv, Fc, Fd, Fab или F(ab)2 используют в их стандартных значениях (см., например, Harlow"Химерное антитело" относится к типичному образцу сконструированного антитела, которое содержит встречающуюся в природе вариабельную область (легких или тяжелых цепей), происходящую из донорного антитела в ассоциации с константными областями легких и тяжелых цепей, происходящих из акцепторного антитела."Гуманизированное антитело" относится к типу сконструированного антитела, имеющего CDR,происходящие из донорного иммуноглобулина, не являющегося человеческим, причем оставшиеся части иммуноглобулина происходят из одного (или более) человеческого иммуноглобулина(ов). Кроме того,поддерживающие рамку остатки могут быть изменены для сохранения аффинности связывания (см., например, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology,9:421 (1991. Подходящим человеческим акцепторным антителом может быть антитело, выбранное из стандартной базы данных, например базы данных KABAT, базы данных Los Alamos и базы данныхSwiss Protein, посредством определения гомологии с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями донорного антитела (в данном случае мышиного донорного антитела 2 А 10). Человеческое антитело, характеризующееся гомологией с рамочными областями донорного антитела (на аминокислотной основе), может быть подходящим для обеспечения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной рамочной области тяжелой цепи для вставки донорных CDR (см. табл. 1 для CDR 2A10 для вставки в акцепторную рамку). Подходящее акцепторное антитело, способное быть донором константных или вариабельных рамочных областей, может быть выбрано похожим образом. Следует отметить,что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не обязательно происходят из одного и того же акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описано несколько способов продукции таких гуманизированных антител - см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951. Термин "донорное антитело" относится к антителу, не являющемуся человеческим, которое вносит аминокислотные последовательности своих вариабельных областей, CDR или других функциональных фрагментов или их аналогов в гуманизированное антитело и обеспечивает тем самым гуманизированное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерной для донорного антитела. Термин "акцепторное антитело" относится к антителу, гетерологичному по отношению к донорному антителу, которое предоставляет аминокислотные последовательности рамочных областей их тяжелой и/или легкой цепи и/или константных областей их тяжелой и/или легкой цепи для гуманизированного антитела. Акцепторное антитело может происходить от любого млекопитающего при условии, что оно является неиммуногенным у людей. Предпочтительно акцепторное антитело представляет собой человеческое антитело. Альтернативно, гуманизации можно достичь с помощью процесса "маскировки" (veneering). Статистический анализ уникальных вариабельных областей тяжелых и легких цепей человеческих и мышиных иммуноглобулинов показал, что определенные паттерны поверхностных остатков различаются в человеческих и мышиных антителах, и большинство индивидуальных поверхностных положений имеют строгое предпочтение небольшого количества разных остатков (см. Padlan E.A. et al., (1991), Mol. Immunol. 28, 489-498 и Pedersen J.T. et al. (1994), J. Mol. Biol. 235; 959-973). Следовательно, можно уменьшить иммуногенность Fv, не являющегося человеческим, путем замены экспонированных на поверхности остатков в его рамочных областях, которые отличаются от тех, которые обычно обнаруживаются в человеческих антителах. Поскольку антигенность белка может коррелировать с доступностью поверхности,замена поверхностных остатков может быть достаточной для придания "невидимости" мышиной вариа- 11015536 бельной области для иммунной системы человека (см. также Mark G.E. et al. (1994) в Handbook ofExperimental Pharmacology, vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, p. 105134). Такую методику гуманизации называют "маскировкой", поскольку изменяют только поверхность антитела, оставляя нетронутыми поддерживающие остатки. Другой альтернативный подход изложен вWO 04/006955. Термин "CDR" определяют как аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей антитела, которые представляют собой гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of immunological Interest, 4thEd., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987. В вариабельной области иммуноглобулина есть три CDR (или области CDR) тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Таким образом, "CDR" в данном описании используют в отношении всех трех CDR тяжелой цепи или трехCDR легкой цепи (или всех CDR тяжелой и всех CDR легкой цепи, если уместно). Структура и фолдинг белка антитела могут подразумевать, что другие остатки рассматриваются как часть антигенсвязывающей области, и это должно подразумеваться квалифицированным специалистом (см., например, Chothiaet al. (1989), Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature, 342, p. 877-883). Биспецифическое антитело представляет собой антитело, обладающее специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными эпитопами. Способы получения таких антител известны в уровне техники. Традиционно рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на коэкспрессии двух пар иммуноглобулиновых Н-цепи-L-цепи, где две Н-цепи обладают различной специфичностью связывания (см. Millstein et al., Natur,e 305, 537-539 (1983), WO 93/08829 и Traunecker et al. EMBO, 10,1991, 3655-3659). Вследствие случайной реаранжировки Н- и L-цепей получают потенциальную смесь из десяти различных структур антитела, из которых только одна обладает желаемой специфичностью связывания. Альтернативный подход включает слияние вариабельных доменов с желаемой специфичностью связывания с константной областью тяжелой цепи, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, СН 2- и СН 3-областей. Предпочтительно наличие по меньшей мере в одном из слияний СН 1 области, содержащей участок, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующую эти слияния, и, при желании, L-цепь вставляют в отдельные экспрессирующие векторы и затем котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Однако можно вставлять кодирующие последовательности для двух или всех трех цепей в один экспрессирующий вектор. Согласно одному предпочтительному подходу биспецифическое антитело состоит из Н-цепи с первой специфичностью связывания в одном плече и пары HL-цепей, обеспечивающей вторую специфичность связывания в другом плече (см. WO 94/04690, см. также Suresh et al. Methods in Enzymology. 121, 210, 1986). Согласно одному воплощению данного изобретения предложено биспецифическое терапевтическое антитело, где по меньшей мере одна специфичность связывания указанного антитела относится к связыванию с человеческим NOGO в эпитопе, описанном в SEQ ID NO:60. В другом воплощении настоящего изобретения биспецифическое антитело содержит последовательность MQGY (SEQ ID NO:45) CDR Н 3 вариабельной области тяжелой цепи. В другом воплощении биспецифическое антитело содержит следующие пары вариабельных областей тяжелой и легкой цепи:H28L16 (SEQ ID NO:49 + SEQ ID NO:14). Антитела по настоящему изобретению могут быть получены посредством трансфекции в клеткухозяина экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность для антител по изобретению. Экспрессирующий вектор или рекомбинантную плазмиду получают, помещая эти кодирующие последовательности для антитела в функциональную ассоциацию со стандартными регуляторными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в клетке-хозяине и/или секрецию из клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности, например промотор CMV, и сигнальные последовательности, которые могут происходить из других известных антител. Аналогично можно получить второй экспрессирующий вектор, имеющий последовательность ДНК, которая кодирует комплементарную легкую или тяжелую цепь антитела. Предпочтительно этот второй экспрессирующий вектор идентичен первому, за исключением того, что рассматриваются кодирующие последовательности и селективные маркеры, обеспечивающие, насколько это возможно, функциональную экспрессию каждой полипептидной цепи. Альтернативно, последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь, для измененного антитела могут располагаться в одном векторе. Выбранную клетку-хозяин подвергают котрансфекции первым и вторым векторами (или просто трансфекции одним вектором) с помощью стандартных методик для получения трансфицированной клетки-хозяина по изобретению, содержащей обе рекомбинантные или синтетические легкую и тяжелую цепи. Затем трансфицированную клетку культивируют с помощью стандартных методик с получением сконструированного антитела по изобретению. Антитело, которое включает ассоциацию обеих рекомбинантных тяжелой цепи и/или легкой цепи, отбирают из культуры с помощью подходящего анализа, такого как ELISA или RIA (радиоиммуноанализ). Похожие стандартные методики можно использовать для конструирования других измененных антител и молекул.- 12015536 Одна используемая экспрессирующая система представляет собой глутаматсинтетазную систему(такую как продается фирмой Lonza Biologics), особенно когда клетка-хозяин представляет собой СНОNS0 (см. ниже). Полинуклеотид, кодирующий антитело, без труда выделяют и секвенируют с использованием стандартных методик (например, олигонуклеотидные зонды). Векторы, которые могут быть использованы, включают плазмиды, вирусы, фаги, транспозоны, минихромосомы, из которых типичным воплощением являются плазмиды. Как правило, такие векторы дополнительно включают сигнальную последовательность, область начала репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции, функциональным образом связанные с полинуклеотидом легкой и/или тяжелой цепи для облегчения экспрессии. Полинуклеотид, кодирующий легкую и тяжелую цепи, может быть включен в отдельные векторы и введен(например, посредством электропорации) в одну и ту же клетку-хозяина или, при желании, и тяжелая цепь, и легкая цепь могут быть вставлены в один и тот же вектор для трансфекции в клетку-хозяина. Таким образом, согласно одному воплощению настоящего изобретения предложен способ конструирования вектора, кодирующего легкую и/или тяжелую цепи терапевтического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, включающий вставку в вектор полинуклеотида, кодирующего либо легкую цепь, либо тяжелую цепь терапевтического антитела по изобретению. Согласно другому воплощению предложен полинуклеотид, кодирующий вариабельную область гуманизированной тяжелой цепи, имеющий последовательность, представленную как SEQ ID NO:47, 48 или 49. Согласно еще одному воплощению предложен полинуклеотид, кодирующий гуманизированную тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную как SEQ ID NO:53, 54 или 55. Специалисту в данной области сразу же будет понятно, что благодаря избыточности генетического кода также доступны полинуклеотиды, альтернативные полинуклеотидам, описанным в данном изобретении , которые будут кодировать полипептиды по изобретению. Векторы, подходящие для стадий клонирования и субклонирования, используемых в способах и конструировании композиций по данному изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области. Например, можно использовать стандартные серии pUC векторов для клонирования. Один вектор, pUC19, коммерчески доступен от фирм, занимающихся снабжением, таких как Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom) или Pharmacia (Uppsala, Sweden). Кроме того, для клонирования можно использовать любой вектор, способный к быстрой репликации, имеющий множество участков клонирования и селективных генов (например, устойчивости к антибиотикам) и легкий в манипуляции. Таким образом, отбор вектора для клонирования не является ограничивающим фактором для данного изобретения. Другие предпочтительные векторные последовательности включают поли-А-сигнальную последовательность, такую как последовательность бычьего гормона роста (BGH) и промоторную последовательность бета-глобина (betaglopro). Экспрессирующие векторы, используемые в данном описании,можно синтезировать с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или (б) дополняют ауксотрофный дефицит или обеспечивают поступление питательных веществ, не доступных в сложной среде. Схема селекции может включать остановку роста клетки-хозяина. Клетки, успешно трансформированные генами, кодирующими терапевтическое антитело по настоящему изобретению, выживают благодаря,например, лекарственной устойчивости, обеспечиваемой селективным маркером. Другим примером является так называемый маркер DHFR-селекции, где трансформанты культивируют в присутствии метотрексата. Клетки СНО являются особенно используемой клеточной линией для DHFR-селекции. Способы селекции трансформированных клеток-хозяев и амплификации числа клеточных копий трансгена включают использование DHFR-системы (см. Kaufman R.J. et al. J. Mol. Biol. (1982), 159, 601-621, см. обзор Werner R.G., Noe W., Kopp K., Schluter M., "Appropriate mammalian expression systems forbiopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug.). Другим примером является глутаматсинтетазная экспрессирующая система (Lonza Biologics). Подходящим геном селекции для применения у дрожжей является ген trp1 (см. Stinchcomb et al. Nature, 282, 38, 1979). Компоненты таких векторов, например, репликоны, гены селекции, энхансеры, промоторы, сигнальные последовательности и т.п., могут быть получены из коммерческих или природных источников или синтезированы известными методами для применения в управлении экспрессией и/или секрецией продукта рекомбинантной ДНК в выбранном хозяине. Другие подходящие экспрессирующие векторы,множество типов которых известно в уровне техники для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибов, также могут быть выбраны для этой цели. Настоящее изобретение также охватывает клеточную линию, трансфицированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности антител или эквивалентов по настоящему изобретению. Клетки-хозяева, используемые для клонирования и других манипуляций с этими векторами клонирования, также являются стандартными. Однако наиболее желательно, чтобы для репликации векторов клонирования и других стадий конструирования измененных антител по данному изобретению использовали клетки из различных штаммов E.coli.- 13015536 Подходящие клетки-хозяева или клеточные линии-хозяева для экспрессии антитела по изобретению предпочтительно представляют собой клетки млекопитающих, такие как NS0, Sp2/0, СНО (например,DG44), COS, фибробласты (например, 3 Т 3) и миеломные клетки и более предпочтительно СНО или миеломные клетки. Можно использовать человеческие клетки, тем самым позволяя молекуле модифицироваться в соответствии с типами гликозилирования у человека. Альтернативно, можно использовать другие эукариотические клеточные линии. Выбор подходящих клеток-хозяев млекопитающих и способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и продукции и очистки продукта известны в уровне техники (см., например, Sambrook et al., процитированный выше). В качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии антител или их фрагментов (таких как рекомбинантные Fab или ScFv) по настоящему изобретению, могут оказаться полезными бактериальные клетки (см., например, Plckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992. Однако вследствие тенденции белков, экспрессирующихся в бактериальных клетках, находиться в развернутой или неправильно свернутой форме или в негликозилированной форме, любой рекомбинантный фрагмент, продуцируемый в бактериальной клетке, следует подвергать скринингу относительно сохранения антигенсвязывающей способности. Если молекула, экспрессирующаяся в бактериальной клетке, продуцировалась в правильно свернутой форме, то такая бактериальная клетка может быть желательным хозяином. Например, в области биотехнологии в качестве клеток-хозяев хорошо известны различные штаммы Е.coli, используемые для экспрессии. Различные штаммы В.subtilis, Streptomyces, другие палочки и т.п. также могут быть использованы согласно этому способу. При желании, штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области, также пригодны в качестве клеток-хозяев, а также клетки насекомых, например Drosophila и Lepidoptera, и вирусные экспрессирующие системы (см., например, Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press(1986) и ссылки, процитированные там). Все общие способы, с помощью которых можно конструировать векторы, способы трансфекции,необходимые для получения клеток-хозяев по изобретению, и способы культивирования, необходимые для продукции антитела по изобретению из такой клетки-хозяина, являются стандартными методиками. Типично способ культивирования по настоящему изобретению представляет собой бессывороточный способ культивирования, обычно путем культивирования клеток без сыворотки в суспензии. Аналогично, после продукции антитела по изобретению можно очистить от содержимого клеточной культуры согласно стандартным методикам из уровня техники, включая осаждение сульфатом аммония, колонки для аффинной хроматографии, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п. Такие методики известны специалисту в данной области и не ограничивают данное изобретение. Например, получение антител описано в WO 99/58679 и WO 96/16990. Согласно еще одному способу экспрессии антител можно использовать экспрессию в трансгенном животном, такую, как описано в патенте США 4873316. Этот способ относится к системой экспрессии с использованием животного казеинового промотора, который при трансгенном включении в организм млекопитающего позволяет самке продуцировать желательный рекомбинантный белок в ее молоке. Согласно другому аспекту изобретения предложен способ продукции антитела по изобретению,включающий стадию культивирования клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором, кодирующим легкую и/или тяжелую цепь антитела по изобретению, и выделение продуцируемого при этом антитела. Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела по изобретению, представляют собой прокариотические клетки, клетки дрожжей или высших эукариот. Подходящие прокариотические клетки включают в себя эубактерии, например, представители семействаAspergillus, такие как A.nidulans и A.niger. Несмотря на то что конкретные прокариотические и дрожжевые клетки-хозяева рассматриваются в данном изобретении, однако типично клетки-хозяева по настоящему изобретению представляют собой клетки позвоночных. Подходящие клетки-хозяева позвоночных включают в себя клетки млекопитающих, такие как COS-1 (ATCCCRL 1650), COS-7 (ATCCCRL 1651), линия эмбриональных клеток почки человека 293, клетки почки новорожденного хомячка (BHK) (ATCC CRL1632), BHK 570(ATCCCRL 10314), 293 (ATCCCRL 1573), клетки яичника китайского хомячка СНО (например,CHO-K1, АТССCCL 61, клеточная линия DHFR-CHO, такая как DG44 (см. Urlaub et al. (1986),Somatic Cell Mol. Genet. 12, 555-556, особенно клеточные линии СНО, адаптированные для суспензионной культуры, мышиные клетки Сертоли, клетки почки обезьяны, клетки почки африканской зеленой обезьяны (АТССCRL 1587), клетки HELA, клетки почки собаки (АТССCCL 34), клетки легкого- 14015536 человека (АТСС CCL 75), клетки Hep G2 и миеломы или лимфомы, например NS0 (см. US 5807715),Sp2/0, Y0. Таким образом согласно одному воплощению данного изобретения предложена стабильно трансформированная клетка-хозяин, содержащая вектор, кодирующий тяжелую цепь и/или легкую цепь терапевтического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в данном изобретении. Типично такие клетки-хозяева содержат первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий указанную тяжелую цепь. Клетки-хозяева, трансформированные векторами, кодирующими терапевтические антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, можно культивировать любым способом, известным специалистам в данной области. Клетки-хозяева можно культивировать во вращающихся флаконах, роллерных флаконах или системах полых волокон, но для крупномасшабного производства предпочтительно использовать реакторы с мешалкой, в частности, для суспензионных культур. Типично реакторы с мешалкой адаптированы для аэрации с использованием, например, распределителей, перегородок или лопастных мешалок с низкой скоростью сдвига. Для барботажных колонок и реакторов с подачей воздуха можно использовать прямую аэрацию пузырьками воздуха или кислорода. В тех случаях, когда клетки-хозяева культивируют в бессывороточных средах, предпочтительно, чтобы данные среды были дополнены агентом, защищающим клетки, таким как Pluronic F-68, для облегчения предотвращения клеточного повреждения в результате процесса аэрации. В зависимости от характеристик клетки-хозяина можно использовать либо микроносители в качестве ростовых субстратов для якорь-зависимых клеточных линий, либо клетки можно адаптировать к суспензионной культуре (что является типичным). При культивировании клеток-хозяев, особенно клеток-хозяев позвоночных, можно использовать различные режимы работы, такие как культивирование с подпиткой, циклическая периодическая обработка (см.Drapeau et al. (1994), Cytotechnology, 15: 103-109), продленная периодическая обработка или перфузируемая культура. Несмотря на то что рекомбинантно трансформированные клетки-хозяева млекопитающих можно культивировать в среде с сывороткой, такой как среда, содержащая фетальную телячью сыворотку (FCS), предпочтительно, чтобы такие клетки-хозяева культивировались в синтетических бессывороточных средах, таких как раскрыто в Keen et al. (1995), Cytotechnology, 17: 153-163, или в коммерчески доступных средах, таких как ProCHO-CDM или UltraCHO (Cambrex NJ, USA), дополненных, при необходимости, источником энергии, таким как глюкоза, и синтетическими факторами роста, такими как рекомбинантный инсулин. Бессывороточное культивирование клеток-хозяев может потребовать адаптации этих клеток к росту в бессывороточных условиях. Один подход адаптации состоит в культивировании таких клеток-хозяев в среде, содержащей сыворотку, и повторной замене 80% культуральной среды на бессывороточную среду для того, чтобы клетки-хозяева научились адаптироваться к бессывороточным условиям (см. Scharfenberg K. et al. (1995) в Animal Cell Technology: Developments towards the 21stcentury (Beuvery E.C. et al. eds), p. 619-623, Kluwer Academic publishers). Антитела по изобретению, секретируемые в среду, могут быть выделены и очищены из среды с использованием различных методик для обеспечения степени очистки, подходящей для предполагаемого применения. Например, применение терапевтических антител по изобретению для лечения пациентовлюдей типично требует по меньшей мере 95%-ной очистки, более типично 98- или 99%-ной очистки по сравнению с культуральными средами, содержащими терапевтические антитела. В первом случае клеточный дебрис из культуральных сред типично удаляют с использованием центрифугирования, затем стадии очистки супернатанта с использованием, например, микрофильтрации, ультрафильтрации и/или глубокой фильтрации. Доступны и многие другие методики, такие как диализ и гель-электрофорез, и хроматографические методики, такие как аффинная хроматография с гидроксиапатитом (НА) (возможно включающая систему аффинного мечения, такую как полигистидин) и/или хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC, см. US 5429746). В одном воплощении изобретения антитела по изобретению после различных стадий очистки иммобилизируют с использованием аффинной хроматографии с белком А или G, с последующими дополнительными хроматографическими стадиями, такими как ионообменная и/или НА-хроматография, анионо- или катионообменная хроматография, гель-фильтрация и осаждение сульфатом аммония. Типично также используют стадии удаления различных вирусов (например, нанофильтрация с использованием, например, фильтра DV-20). После этих различных стадий получают очищенный (типично моноклональный) препарат, содержащий по меньшей мере 75 мг/мл или более, например 100 мг/мл или более антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента,который, таким образом, образует воплощение изобретения. Соответственно, такие препараты, по существу, не содержат агрегированных форм антител по изобретению. Согласно настоящему изобретению предложен способ получения антитела против NOGO по настоящему изобретению, которое специфически связывается с активностью человеческого NOGO-A и нейтрализует активность человеческого NOGO-A, включающий стадии:(а) обеспечение первого вектора, кодирующего тяжелую цепь антитела;(б) обеспечение второго вектора, кодирующего легкую цепь антитела;(г) культивирование клетки-хозяина, полученной на стадии (в), в условиях, способствующих секреции антитела из указанной клетки-хозяина в указанные культуральные среды;(д) выделение секретируемого антитела со стадии (г). После экспрессии с помощью желательного способа антитело затем исследуют в отношении активности in vitro с использованием подходящего анализа. В настоящее время для оценки качественного и количественного связывания антитела с NOGO используют стандартные форматы ELISA анализа. Кроме того, можно использовать другие анализы in vitro для подтверждения нейтрализующей активности перед последующими клиническими исследованиями на людях, проводимыми для оценки персистенции антитела в организме, несмотря на обычные механизмы клиренса. Другие модификации антител по настоящему изобретению включают гликозилированные варианты антител по изобретению. Как известно, гликозилирование антител по консервативным положениям в их константных областях оказывает сильный эффект на функцию антител, особенно на эффекторные функции, такие как описано выше (см., например, Boyd et al. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318). Рассматриваются гликозилированные варианты терапевтических антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где добавлена, замещена, делетирована или модифицирована одна или более чем одна углеводная группировка. Введение мотива аспарагин-Х-серин или аспарагин-Х-треонин создает потенциальный сайт для ферментативного присоединения углеводных группировок и, следовательно, может быть использовано для управления гликозилированием антитела. В Raju et al. (2001),Biochemistry, 40, 8868-8876 концевое сиалирование иммуноадгезина TNFR-IgG усиливали с помощью процесса регалактозилирования и/или ресиалирования с использованием бета-1,4-галактозилтрансферазы и/или альфа-2,3-сиалилтрансферазы. Считают, что увеличение концевого сиалирования увеличивает период полувыведения иммуноглобулина. В природе антитела вместе с большинством гликопротеинов типично продуцируются в виде смеси гликоформ. Наличие этой смеси особенно очевидно при продукции антител в эукариотических клетках, особенно в клетках млекопитающих. Для изготовления описанных гликоформ был разработан ряд способов (см. Zhang et al. Science (2004), 303, 371, Sears etal., Science (2001), 291, 2344, Wacker et al. (2002), Science, 298, 1790, Davis et al. (2002), Chem. Rev., 102,579, Hang et al. (2001), Acc. Chem. Res., 34, 727). Таким образом, данное изобретение относится к множеству терапевтических (типично моноклональных) антител (которые могут представлять собой изотопIgG, например IgG1), как описано в данном изобретении, включающих определенное число (например, 7 или менее, например, 5 или менее, такое как две или одна) гликоформ указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Терапевтические агенты по данному изобретению можно вводить в качестве профилактики или после появления клинических симптомов события/начала инсульта или при другой необходимости. Доза и продолжительность лечения связаны с относительным пребыванием молекул по настоящему изобретению в кровотоке человека и могут быть установлены специалистом в данной области в зависимости от состояния, которое лечат, и общего состояния здоровья пациента. Предполагают, что может потребоваться повторное введение доз (например, один раз в неделю или один раз в две недели) в течение продолжительного периода времени (например, от четырех до шести месяцев) для достижения максимальной терапевтической эффективности. Способ введения терапевтического агента по изобретению может представлять собой любой подходящий путь, обеспечивающий доставку агента хозяину. Антитела и фармацевтические композиции по изобретению особенно применимы для парентерального введения, т.е. подкожно (п/к), интратекально,внутрибрюшинно (в/б), внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в) или интраназально (и/н). Терапевтические агенты по изобретению могут быть изготовлены в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антитела по изобретению в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. В профилактическом агенте по изобретению предпочтительным является водная суспензия или раствор, содержащие сконструированное антитело, предпочтительно забуференные при физиологическом рН, в форме, готовой для инъекции. Композиции для парентерального введения обычно будут содержать раствор антитела по изобретению или коктейль из него, растворенный в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в носителе на водной основе. Можно использовать ряд водных носителей, например 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин и т.п. Эти растворы являются стерильными и обычно не содержат твердых частиц. Эти растворы можно стерилизовать стандартными, хорошо известными методами стерилизации (например, фильтрация). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, регулирующие рН, и буферные агенты и т.д. Концентрация антитела по изобретению в такой фармацевтической композиции может широко варьировать,т.е. от менее чем примерно 0,5, обычно 1 или по меньшей мере 1, до 15 или 20 мас.%, и будет выбираться преимущественно на основе объемов, вязкости и т.п. жидких сред в соответствии с конкретным выбранным способом введения.- 16015536 Таким образом, можно приготовить фармацевтическую композицию по изобретению для внутримышечной инъекции, содержащую 1 мл стерильной забуференной воды и от примерно 1 нг до примерно 100 мг, например от примерно 50 нг до примерно 30 мг или более предпочтительно от примерно 5 до примерно 25 мг антитела по изобретению. Аналогично, можно приготовить фармацевтическую композицию по изобретению для внутривенной инфузии, содержащую примерно 250 мл стерильного раствора Рингера и от примерно 1 до примерно 30 мг, и предпочтительно от примерно 5 до примерно 25 мг сконструированного антитела по изобретению на 1 мл раствора Рингера. Существующие способы приготовления композиций для парентерального введения хорошо известны и будут очевидны специалистам в данной области и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed.,Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Для приготовления композиций с антителом по изобретению для внутривенного введения см. Lasmar U. и Parkins D. "The formulation of Biopharmaceuticalpolysorbate 80 and protein stability", J. Pharm. Sci, 91, 2252-2264 (2002), полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки и к которым специально отсылают читателя. Предпочтительно, чтобы терапевтический агент по изобретению в виде фармацевтической композиции был представлен в стандартных лекарственных формах. Подходящая терапевтически эффективная доза будет легко определена специалистами в данной области. Для эффективного лечения инсульта или других неврологических заболеваний у человека предусмотрена одна доза антитела по данному изобретению в диапазоне от 700 до 3500 мг на 70 кг массы тела для парентерального введения, предпочтительно п/к, в/в или в/м (внутримышечно). При необходимости введение такой дозы можно повторять через подходящие временные интервалы, выбранные в качестве подходящих врачом. Антитела, описанные в данном изобретении, можно лиофилизировать для хранения и растворения в подходящем носителе перед применением. Как показано, эта методика эффективна для стандартных иммуноглобулинов, и можно использовать известные в данной области методики лиофилизации и растворения. Согласно другому аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против NOGO по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения или профилактики инсульта и других неврологических заболеваний. Согласно еще одному аспекту изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело против NOGO по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель, для ингибирования нейродегенерации и/или стимулирования функционального восстановления у пациента-человека, страдающего от развития инсульта или другого неврологического заболевания или имеющего риск развития инсульта или другого неврологического заболевания. Согласно изобретению дополнительно предложен способ лечения или профилактики инсульта(особенно ишемического инсульта) и других неврологических заболеваний/расстройств, в частности болезни Альцгеймера, у человека, включающий введение указанному человеку, нуждающемуся в этом,эффективного количества антитела против NOGO по настоящему изобретению или его функционального фрагмента. Антитела по изобретению можно применять в способах лечения для замедления или прекращения развития и/или начала болезни Альцгеймера в дополнение к (или в качестве альтернативы) лечению установленного заболевания у пациента-человека. Кроме того, согласно изобретению предложено применение антитела против NOGO по настоящему изобретению или его функционального фрагмента в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инсульта и других неврологических заболеваний/расстройств, в частности болезни Альцгеймера. Согласно изобретению также предложен способ ингибирования нейродегенерации и/или стимулирования функционального восстановления у пациента-человека, страдающего от инсульта или другого неврологического заболевания/расстройства или имеющего риск развития инсульта или другого неврологического заболевания/расстройства, в частности болезни Альцгеймера, включающий введение указанному человеку, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела против NOGO по настоящему изобретению или его функционального фрагмента. Кроме того, согласно изобретению предложено применение антитела против NOGO по настоящему изобретению или его функционального фрагмента в изготовлении лекарственного средства для ингибирования нейродегенерации и/или стимулирования функционального восстановления у пациента- 17015536 человека, страдающего от инсульта и другого неврологического заболевания/расстройства или имеющего риск развития инсульта и другого неврологического заболевания/расстройства, в частности болезни Альцгеймера. Согласно изобретению дополнительно предложен способ лечения или профилактики инсульта или другого неврологического заболевания/расстройства, в частности болезни Альцгеймера, у человека,включающий стадию парентерального введения терапевтически эффективного количества антитела против NOGO по настоящему изобретению. Предпочтительно указанное антитело против NOGO вводят внутривенно. Неврологические заболевания или расстройства для применения в данном описании включают, но не ограничиваются этим, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга,лобно-височные деменции (тауопатии), периферическую невропатию, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и особенно болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз или боковой амиотрофический склероз(ALS). Согласно изобретению также предложен способ стимулирования прорастания аксонов, включающий стадию приведения в контакт человеческого аксона с антителом против NOGO по настоящему изобретению. Данный способ можно осуществлять in vitro или in vivo, предпочтительно способ осуществляют in vivo. Поэтому согласно еще одному аспекту предложен способ лечения инсульта (особенно ишемического инсульта), повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, лобно-височных деменций(тауопатий), периферической невропатии, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, рассеянного склероза и особенно болезни Альцгеймера у пациента-человека, включающий внутривенное введение терапевтически эффективного количества антитела против NOGO по изобретению. Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ стимулирования прорастания аксонов нейронов в центральной нервной системе субъекта-человека (например, пациента), включающий введение (например, внутривенное введение) терапевтически эффективного количества антитела против NOGO по настоящему изобретению. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение антитела противNOGO по настоящему изобретению (например, антитела против NOGO, содержащего изложенные в данном описании CDR) в изготовлении лекарственного средства для внутривенного введения для лечения инсульта (особенно ишемического инсульта), повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, лобно-височных деменций (тауопатий), периферической невропатии, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона и особенно болезни Альцгеймера, рассеянного склероза или бокового амиотрофического склероза (ALS) у пациента-человека. Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ регенерации аксональных процессов в нейронах центральной нервной системы у пациента-человека, страдающего от (или подверженного возникновению) инсульта (особенно ишемического инсульта), повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, лобно-височных деменций (тауопатий), периферической невропатии, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, рассеянного склероза и особенно болезни Альцгеймера, включающий стадию введения (например, внутривенно) терапевтически эффективного количества антитела противNOGO по настоящему изобретению. Согласно другому аспекту изобретения предложено применение антитела против NOGO по настоящему изобретению в изготовлении фармацевтической композиции для внутривенного введения для регенерации аксональных процессов в нейронах центральной нервной системы у пациента-человека,страдающего от (или подверженного возникновению) инсульта (особенно ишемического инсульта), повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, лобно-височных деменций (тауопатий), периферической невропатии, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, рассеянного склероза и особенно болезни Альцгеймера. Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ модулирования продукции амилоидогенного пептида, включающий приведение клетки, экспрессирующей предшественник, производным которого является амилоидогенный пептид, и полипептида NOGO (например, человеческого NOGO-A) в контакт с антителом против NOGO по настоящему изобретению. В типичных воплощениях предшественником является АРР. В других типичных воплощениях амилоидогенный пептид представляет собой А, наиболее предпочтительно А 40, А 42 или комбинацию обоих. Как использовано в данном описании, термин "функциональное восстановление" относится к моторному, и/или сенсорному, и/или поведенческому улучшению у субъекта после, например, ишемического события, или повреждения, или появления клинических симптомов. Функциональное восстановление у людей можно оценивать с помощью инструментов, предназначенных для измерения элементарных неврологических функций, таких как двигательная сила, восприятие и координация; когнитивных функций, таких как память, речь и способность следовать указаниям; и функциональных возможностей, таких как основные виды деятельности в повседневной жизни или виды инструментальной деятельности. Восстановление элементарных неврологических функций можно измерить с помощью инструментов, таких как шкала инсульта Национального института здоровья (NIH Stroke Scale, NIHSS), восстановление ког- 18015536 нитивных функций можно измерить с помощью нейропсихологических тестов, таких как Бостонский тест наименований (Boston Naming Test), тесты слежения (Trail-making Tests) и Калифорнийский тест вербального обучения (California Verbal Learning Test), а виды деятельности в повседневной жизни можно измерить с помощью инструментов, таких как шкала ADCS/ADL (клинические исследования болезни Альцгеймера/виды деятельности в повседневной жизни), или Бристольской шкалы видов деятельности в повседневной жизни; все тесты и шкалы известны в данной области. Следующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение. Пример 1. Конструирование и экспрессия гуманизированных антител против NOGO. Гуманизированные конструкции VH и VL получали de novo с помощью создания перекрывающихся олигонуклеотидов, включающих сайты рестрикции для клонирования в Rld и Rln экспрессирующие векторы млекопитающих (или любой другой подходящий экспрессирующий вектор для экспрессии белков в клетках млекопитающих), а также человеческую сигнальную последовательность. Сайты рестрикции дляHind III и Spe I вводили в рамку домена VH, содержащего сигнальную последовательность САМРАТН 1 Н для клонирования в Rld, содержащую человеческую 1-мутантную константную область для предотвращения активности ADCC или CDC (L235A и G237A - система нумерации EU Index). Сайты рестрикции для Hind III и BsiWI вводили в рамку домена VL, содержащего сигнальную последовательность САМРАТН-1H, для клонирования в Rln, содержащую человеческую каппа-константную область. Сигнальная последовательность CAMPATH-1H:MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:31). Получали плазмиды, кодирующие аминокислотные последовательности тяжелой цепи человеческого IgG, где CDR были такими, как описано в табл. 2. Плазмиды, кодирующие аминокислотные последовательности тяжелой цепи человеческого IgG, где CDR были такими, как описано в табл. 3, получали из уже существовавших ранее плазмид путем введения точечных мутаций, G95M (нумерация по Kabat), с использованием набора Quickchange (Stratagene). В следующей таблице раскрыто, какие полноразмерные белковые последовательности тяжелой цепи созданы в плазмидных векторах и какие из последовательностей спарены, в том смысле, что единственным отличием в аминокислотных последовательностях спаренных полноразмерных (FL) аминокислотных последовательностей была замена в G95M (нумерация по Kabat) в пределах CDR H3 вариабельной области. Таблица 8 Плазмиды, кодирующие тяжелые цепи, затем котрансфицировали в клетки СНО (для деталей см. пример 2) с одной из следующих полноразмерных последовательностей легкой цепи:(SEQ ID NO:9 и 10 - полноразмерные легкие цепи, содержащие VH (SEQ ID NO:7) и VL (SEQ ID NO:8) мышиного 2 А 10 и константные области человеческого IgG. Пример 2. Экспрессия антитела в клетках СНО. Плазмиды Rld или Rln (или другие векторы, подходящие для применения в клетках млекопитающих), кодирующие тяжелую и легкую цепи соответственно, временно котрансфицировали в клетки СНО и экспрессировали в малом или крупном масштабе для продукции антитела. Альтернативно, те же плазмиды котрансфицировали в клетки DHFR-CHO путем электропорации и стабильную поликлональную популяцию клеток, экспрессирующих подходящее антитело, отбирали с использованием среды без нуклеозидов (Rld содержит ген DHFR, Rln содержит неомициновый селективный маркер). В некоторых анализах антитела оценивали непосредственно в супернатанте тканевой культуры. В некоторых других анализах рекомбинантное антитело выделяли и очищали с помощью аффинной хроматографии на протеинА-сефарозе. Пример 3. Гуманизированное антитело против NOGO, связывающееся с NOGO.GST-человеческий NOGO-A56 (см. пример 5) в концентрации 0,05-1 мкг/мл PBS (забуференный фосфатами солевой раствор) наносили на планшеты Nunc Immunosorp (100 мкл на лунку) при 4 С в течение ночи. Лунки промывали один раз TBS+0,05% Tween (TBST), затем инкубировали с 2% БСА вTBST для блокирования сайтов неспецифического связывания при комнатной температуре в течение 1 ч. Антитела разбавляли в TBST+2% БСА до 10 мкг/мл и из этого получали разведения 1/2. Антитела добавляли в лунки в двух повторностях и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки про- 19015536 мывали три раза TBST, затем инкубировали с конъюгатом пероксидазы с антителами против человеческих каппа (1:2000) в течение 1 ч. Лунки промывали три раза TBST, затем инкубировали с 100 мкл субстрата для пероксидазы OPD (Sigma) на лунку в течение 10 мин. Цветную реакцию останавливали путем добавления 25 мкл концентрированной H2SO4. Оптическую плотность при 490 нм измеряли с использованием планшет-ридера. Фоновые значения, полученные для лунок без антитела, вычитали. На фиг. 1-4 проиллюстрировано дозозависимое связывание гуманизированных антител в сравнении с GST-человеческим NOGO-A56 (для деталей см. пример 5) в сравнении с химерой (названной HcLc,представляющей собой химеру 2 А 10 (содержащую VH (SEQ ID NO:7) и VL (SEQ ID NO:8) мышиного 2 А 10 и константные области человеческого IgG в ELISA анализе. По оси Y показана измеренная оптическая плотность (OD) при 490 нм - количественный показатель антитела, иммобилизованного в лунках. По оси X показана концентрация (мкг/мл) используемого антитела в лунке в каждой точке на графике. Вещество антитело, используемое на фиг. 1-4, представляет собой антитело, полученное либо с помощью поликлональной экспрессирующей системы, либо с помощью крупномасштабных временных трансфекций. В этих случаях уровни IgG количественно определяли с помощью ELISA или оптической плотности. Результаты экспериментов, показанные на фиг. 1-4, демонстрируют, что введение мутации G95M улучшает эффективность антитела. Единственным исключением является H27L16, показанный на фиг. 3 и 4, с очень низкой эффективностью. Авторы считают, что эти данные являются следствием неидентифицированной технической проблемы при проведении анализа с H27L16, поскольку при проведении других анализов (в ELISA, показанном на фиг. 1 и 2, и в Biacore анализах (табл. 9 и 10 эффективностьH27L16 была, напротив, всякий раз хорошей. Также было показано, что H27L16 работает очень хорошо в последующих экспериментах (см. фиг. 11 и 12). Пример 4. Протокол количественного определения антитела. Планшеты Nunc Immunosorp покрывали иммобилизованным козьим антителом против человеческих IgG цепей (Sigma 13382) в концентрации 2 мкг/мл в бикарбонатном буфере (Sigma C3041) и инкубировали при 4 С в течение ночи. Планшеты дважды промывали TBS, содержащим 0,05% Tween20(TBST), и блокировали 200 мкл TBST, содержащего 2% (или от 1 до 3%) БСА (блок-буфер), в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали TBST. Тканевые культуральные супернатанты, содержащие антитело, титровали поперек планшета на стадиях 2-кратного разведения в блок-буфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты трижды промывали TBST. HRPконъюгированное антитело Н 23 (козье антитело против человеческих каппа-цепей, Sigma A7164) разбавляли 1:2000 в TBST и добавляли по 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты трижды промывали TBST и добавляли 100 мкл субстрата Fast-OPD(Sigma P9187). Окрашиванию позволяли развиваться в течение 5-10 мин, после чего ELISA останавливали с помощью 25 мкл 3 М H2SO4. Регистрировали поглощение в планшете при 490 нм и определяли концентрацию антитела путем ссылки на стандартную кривую. Пример 5. Продукция фрагмента NOGO-A (NOGO-A56, SEQ ID NO:32). Последовательность кДНК, кодирующую полипептид, содержащий аминокислоты 586-785 и GSTметку (SEQ ID NO:32) человеческого NOGO-A, создавали путем клонирования кДНК, кодирующей аминокислоты NOGO-A 586-785, в BamHI-Xhol сайты pGEX-6P1 для получения GST-меченого слитого белка, обозначенного как GST-человеческий NOGO-A56. Плазмиду экспрессировали в клетках BL21 в среде 2XTY с 100 мкг/мл ампициллина после индукции с помощью IPTG до 0,5 мМ при температуре 37 С в течение 3 ч. Клеточные осадки лизировали путем обработки ультразвуком и слитый белок очищали с использованием глутатион-сефарозы (Amersham Pharmacia) согласно инструкциям производителя. Очищенный белок элюировали с использованием восстановленного глутатиона и подвергали интенсивному диализу против PBS, определяли количество с использованием БСА стандартов и анализа белков на основе BioRad coomassie и затем хранили в аликвотах при -80 С. Пример 6. Biacore анализ гуманизированных моноклональных антител против NOGO. Кинетику связывания моноклонального антитела (mAb) против NOGO с рекомбинантно экспрессирующимся GST-человеческим NOGO-A анализировали с использованием биосенсора Biacore 3000 илиGST-человеческий NOGO-A56 подвергали иммобилизации на чипе СМ 5 путем сочетания с первичным амином с использованием программы Biacore Wizard, предназначенной для направленных уровней иммобилизации. Сенсорную поверхность СМ 5 активировали путем пропускания раствора 50 мМN-гидроксисукцинимида (NHS) и 200 мМ N-этил-N'-диметиламинопропилкарбонида (EDC). Затем GSTчеловеческий NOGO-A56 в натрий-ацетатном буфере пропускали через чип и иммобилизовали. После завершения иммобилизации все еще активированные сложные эфиры блокировали путем инъекции 1 М этаноламин-гидрохлорида, рН 8,5.mAb против NOGO разбавляли в HBS-EP (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% поверхностно-активного вещества Р-20) для Biacore 3000 или в HBS-EP+ (10 мМ HEPES, рН 7,4,150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,05% поверхностно-активного вещества Р-20) в случае Т 100 и осуществля- 20015536 ли исследования связывания в диапазоне определенных концентраций антитела. Все опыты сравнивали с контрольной сенсорной поверхностью (которую активировали и блокировали, как описано ранее, но не добавляли лиганд). Анализ связывания осуществляли с использованием программного обеспечения дляBIA-оценочного кинетического анализа, версия 4.1, для Biacore 3000 и программного обеспечения для кинетического анализа, версия 1.0, для Т 100. Biacore-анализ других антител по изобретению, по существу, осуществляли в соответствии с тем же протоколом, описанным в данном изобретении. Если не указано иначе, то Biacore эксперименты осуществляли при 25 С. В следующем разделе "Результаты" в каждой таблице данных представлены результаты, полученные в отдельных экспериментах. Результаты. Таблица 9 Пример 7. BiaCore анализ гуманизированных моноклональных антител против NOGO с использованием ранжирования скорости диссоциации. Чип с GST-человеческим NOGO-A56 приготавливали, как для кинетического анализа. Клеточные супернатанты брали непосредственно от временно трансфицированных клеток CHO-K1. Их пропускали непосредственно через сенсорную поверхность и измеряли взаимодействие. Супернатант от ложно трансфицированных клеток использовали для двойного сравнения для устранения любых артефактов,обусловленных средой для тканевых культур. Все опыты сравнивали с контрольной сенсорной поверхностью (которую активировали и блокировали, как описано ранее, но не добавляли лиганд). Анализ связывания осуществляли с использованием программного обеспечения для BIA-оценочного кинетического анализа, версия 4.1. Пример 8. Картирование пептидов.- 21015536 Получали (из Mimotope) 47 перекрывающихся пептидов, охватывающих участок NOGO-A56 домена GST-человеческий NOGO-A56 (SEQ ID NO:32). Пептиды имеют длину 16 аминокислот с двенадцатью аминокислотами, перекрывающимися со смежным пептидом (кроме того, каждый пептид содержит на N-конце последовательность биотин-SGSG), за исключением первого пептида, который имеет на С-конце метку GSG-биоцитин. Пептиды использовали для картирования эпитопа сайта связывания 2 А 10 и H28L16. Способ картирования эпитопов. На планшеты Nunc Immunosorp наносили стрептавидин в концентрации 5 мкг/мл в стерильной воде(100 мкл на лунку) при температуре 37 С в течение ночи. Планшеты трижды промывали PBS, содержащим 0,05% Tween (PBST), затем блокировали 3% БСА в PBST при 4 С в течение ночи. Планшеты трижды промывали PBST. Затем в лунки добавляли пептиды в концентрации приблизительно 10 мкг/мл (разведенные в 3% БСА в PBST) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты трижды промывали PBST, затем инкубировали в течение 1 ч с антителами против NOGO, разведенными до концентрации 5 мкг/мл в 3% БСА в PBST. Планшеты трижды промывали PBST, затем инкубировали в течение 1 ч с конъюгатом пероксидазы с антителами против человеческих или мышиных каппа-цепей(1:1000, разведенный в 3% БСА в PBST). Планшеты трижды промывали PBST и затем инкубировали с 100 мкл субстрата для пероксидазы OPD (Sigma) на лунку в течение 10 мин. Цветную реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 3 М H2SO4. Поглощение при 490 нм измеряли, используя планшетридер. Результаты представлены на фиг. 5 (картирование эпитопов с использованием H28L16) и на фиг. 6(картирование эпитопов с использованием 2 А 10). На Фиг. 5 и 6 представлены результаты картирования эпитопов 2 А 10 и H28L16 соответственно. Представленные данные показывают, что 2 А 10 и H28L16 связываются с пептидами 6 и 7, NOGO-специфический участок которых представлен в SEQ ID NO:73 иSEQ ID NO:74 соответственно, которые обе содержат последовательность VLPDIVMEAPLN. Эти результаты показывают, что VLPDIVMEAPLN (SEQ ID NO:60) содержит связывающий эпитоп 2 А 10 иH28L16. Пример 9. Сравнение HcLc и HcLc, содержащих мутацию G95M в CDR Н 3. Модифицированный вариант HcLc конструировали из существующих экспрессирующих плазмид путем введения точечной мутации G95M (нумерация по Kabat) с использованием набора Quikchange(Stratagene). Белковая последовательность белка вариабельного домена тяжелой цепи Hc(G95M) представлена в SEQ ID NO:59.Hc(G95M)Lc экспрессировали в клетках СНО, как описано ранее. Количественное определение антитела осуществляли, как описано в примере 4. На фиг. 7 и 8 показано сравнение связывающей активности Hc(G95M)Lc и HcLc, как определено с использованием ELISA со связыванием человеческого NOGOA, когда NOGO наносили на планшеты Nunc Immunosorp в концентрации 0,05 (фиг. 7) и 1 мкг/мл (фиг. 8). В таблицах показано сравнение аффинностей связывания Hc(G95M)Lc и HcLc. Таблица 12 Скорость диссоциации, измеренная с помощью Biacore ранжирования на основании одного эксперимента Данные показывают, что замена G95M в пределах CDR Н 3 повышает связывающую активность не только гуманизированных антител (H6L13), но также и мышиного донорного антитела 2 А 10 (HcLc). Пример 10. Конструирование и тестирование антител против NOGO, содержащих замены в CDR Н 3. С помощью точечных мутаций в остатках, содержащихся в CDR Н 3, или в предшествующем лейцине создали панель из 90 вариабельных областей тяжелой цепи. Конкретно, векторы, кодирующие тяжелую цепь (на основе H6FL, SEQ ID NO:15), конструировали таким образом, чтобы они кодировали вариабельные области тяжелой цепи, где каждый аминокислотный остаток в CDR Н 3 и предшествующем лейцине замещали (с использованием набора Quikchange (Stratagene на все другие встречающиеся в природе аминокислоты, исключая цистеин, и экспрессировали вместе с легкой цепью (L13FL,SEQ ID NO:17) с получением 90 различных антител. Эти антитела анализировали в отношении связывания с NOGO в ELISA и Biacore экспериментах.- 22015536 На фиг. 9 и 10 показано сравнение связывающей активности вариантов H6FL в сравнении с H6FLL13FL. В табл. 14 и 15 показано сравнение кинетически скорости диссоциации, как измерено с помощьюBiacore - показаны результаты только для тех антител, которые имели измеряемую скорость диссоциации в Biacore анализе и имели сравнимую активность связывания с H6L13 в ELISA. Таблица 14 Выводы. Результаты показывают, что антителами, которые сохраняют связывающие свойства мышиного 2 А 10 и GQGY-содержащего антитела H6L13, представляют собой антитела, содержащие следующиеH28L13, и H28L16). Антитела, перечисленные в табл. 15, получали, как описано выше. Таблица 15 Гуманизированные антитела 2 А 10 против NOGO-A с общим числом обратных мутаций для полного антитела (2 тяжелые цепи + 2 легкие цепи) Характеристики связывания in vitro. В попытке ранжировать антитела исследовали их связывающие свойства в ряде анализов, включаяELISA, обратный формат ELISA, конкурентный ELISA анализ, Biacore и проточную цитометрию. 11.1. Связывание с рекомбинантным человеческим NOGO-A в ELISA. Способность антител связываться с рекомбинантным человеческим NOGO-A (GST-человеческийNOGO-A) исследовали с помощью различных схожих анализов ELISA (осуществленных по сходному, но немного отличающемуся протоколу, как тот, который описан в примере 3). В первом анализе рекомбинантный NOGO-A наносили непосредственно на планшет при различных концентрациях антигена. Результаты ELISA с прямым связыванием, когда концентрация антигена составляет 1 мкг/мл или 0,05 мкг/мл, представлены на фиг. 11 А и 11 Б соответственно. Эти данные подтверждают, что все антитела демонстрируют сравнимую активность связывания с рекомбинантным человеческим NOGO-A, которую сравнивали с химерной формой родительского антитела (HcLc). При повышенных концентрациях- 23015536 нанесенного антигена все антитела показали похожие значения ЕС 50. В противоположность этому, при более низкой концентрации нанесенного антигена в анализе можно было определить разницу между антителами. Несмотря на то что кривые насыщения не были получены, анализ тенденции изменения по линиям выявил следующий порядок ранжирования: H27L16H28L16, H28L13, H20L16. В параллельном эксперименте и формат анализа изменили на противоположный. В этом формате антитело иммобилизуют на планшете и определяют связывание с рекомбинантным человеческим NOGOA (GST-человеческим NOGO-A) с использованием GST метки. Результаты обратного формата ELISA представлены на фиг. 12. Эти данные подтверждают, что все антитела демонстрируют сравнимую активность связывания с рекомбинантным человеческим NOGO-A при сравнении с химерной формой родительского антитела (HcLc). Этот формат связывания ELISA не показал различий между антителами. 11.2. Конкурентный ELISA. Способность антител конкурировать непосредственно с родительским антителом за один и тот же эпитоп человеческого NOGO-A оценивали с использованием конкурентного ELISA. РекомбинантныйNOGO-A (GST-человеческий NOGO-A) наносили на планшеты. Родительское антитело 2 А 10 и гуманизированные антитела предварительно смешивали перед добавлением в планшеты. Связывание 2 А 10 определяли количественно с использованием конъюгата антимышиного IgG с HRP (Dakocytomation,P0260). Результаты, представленные на фиг. 13, подтверждают, что все антитела могут конкурировать с 2 А 10. Эти данные дают возможность предположить, что гуманизированные антитела и родительское антитело распознают перекрывающийся эпитоп на человеческом NOGO-A. Кроме того, активность гуманизированных антител сравнима или выше активности химеры HcLc. Результаты показывают, чтоBiacore использовали для определения аффинностей и ранжирования антител с использованием двух различных методологий. Согласно первому подходу рекомбинантный NOGO-A связывали с поверхностью чипа и антитела против NOGO-A пропускали через эту поверхность. Согласно второму подходу использовали белок А для иммобилизации антитела на поверхности чипа, через который пропускали рекомбинантный GST-человеческий NOGO-A56. Результаты, представленные в табл. 16, получали путем связывания антигена с поверхностью и подтверждения, что все четыре антитела продемонстрировали сравнимую/более высокую аффинность, чем родительское антитело (HcLc). На основе среднего шести независимых опытов антитела ранжировали в следующем порядке в контексте общей аффинности: H27L16H28L16H28L13H20L16, что соответствует порядку ранжирования ELISA с прямым связыванием (фиг. 11 Б). В случае H27L16 и H28L16 гуманизированные антитела демонстрируют в 2-3 раза более высокую аффинность, чем родительское антитело (HcLc). Таблица 16. Кинетика связывания гуманизированных антител против NOGO-A с рекомбинантнымNOGO-A (GST-человеческий NOGO-A56), как определено с использованием Biacore T100. Антиген связывали с чипом СМ 5 путем сочетания с первичным амином. Антитела пропускали через чип в различных концентрациях (0,125-8 нМ). Значения показывают среднее значение и стандартное отклонение (в скобках) для шести независимых опытов, осуществленных в двух повторностях. Каждую завершенную группу данных анализировали независимо перед вычислением среднего значения и стандартного отклонения. Только 11 групп данных, проанализированных для H20L16 в виде одной группы, невозможно было проанализировать. Таблица 16 Аналогичным с ELISA образом кинетику связывания антитела с рекомбинантным человеческимNOGO-A (GST-человеческим NOGO-A56) также оценивали в обратном формате (см. пример 11.1). В этом анализе гуманизированные антитела иммобилизовали на чипе СМ 5 с помощью белка А. Средние результаты для шести независимых опытов представлены в табл. 17. В соответствии с обратным форматом ELISA все гуманизированные антитела против NOGO-A продемонстрировали похожую с химерой (HcLc) кинетику связывания в обратном формате Biacore. Таблица 17. Обратный формат кинетики связывания гуманизированных антител против NOGO-A с рекомбинантным NOGO-A (GST NOGO-A 5+6), как определено с использованием Biacore T100. Белок А подвергали иммобилизации приблизительно при 4000 RU (относительные единицы) с помощью первичного амина и использовали для иммобилизации 200-300 RU анализируемых антител. Рекомбинантный человеческий NOGO-A пропускали через данный комплекс в различных концентрациях (0,125-8 нМ).- 24015536 Значения показывают среднее и стандартное отклонение (в скобках) для трех независимых опытов в двух повторностях. Каждую группу данных анализировали независимо перед вычислением среднего значения и стандартного отклонения. Таблица 17 11.4. Связывание с нативным человеческим NOGO. Для демонстрации того факта, что гуманизированные антитела связываются с нативным человеческим NOGO-A с профилем, сравнимым с родительским антителом, осуществляли два анализа на основе проточной цитометрии. В первом анализе получали клеточную линию на основе CHO-K1, экспрессирующую внеклеточный домен человеческого NOGO-A на клеточной поверхности. Связывание гуманизированных антител против NOGO-A оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием РЕ-меченого антитела против человеческого IgG (Sigma P8047). На фиг. 14 ниже показан типичный профиль для антител против NOGO-A на клеточной линии CHO-NOGO-A. Хотя данный анализ не является достаточно чувствительным для выявления различий между антителами, результаты подтверждают,что все четыре антитела могут распознавать экспрессирующийся на клеточной поверхности человеческий NOGO-A на уровнях, сравнимых с таковыми для химеры. Ни одно из антител не распознавало родительскую клеточную линию (CHO-K1 - данные не представлены). Во втором анализе оценивали способность гуманизированных антител связываться с нативнымNOGO-A с использованием клеточной линии нейробластомы человека IMR32. Эта клеточная линия характеризуется высокими внутриклеточными/низкими на клеточной поверхности уровнями белкаNOGO-A. В попытке увеличить сигнал связывания проводили анализ для определения внутриклеточногоNOGO-A (ER-резидент). Клетки IMR32 пермеабилизовали и фиксировали перед окрашиванием с гуманизированными антителами против NOGO-A. Связывание антител с NOGO-A определяли с использованием вторично меченого РЕ антитела против человеческого IgG (Sigma P8047). Результаты, представленные на фиг. 15 ниже, подтверждают, что все антитела связываются с внутриклеточным NOGO-A на сравнимых или более высоких уровнях, чем родительское антитело HcLc. Эти данные, в соответствии с результатами для клеточной линии CHO-NOGO-A, подтверждают, что гуманизированные антитела могут распознавать более нативную форму белка NOGO-A на сравнимых или более высоких уровнях, чем химера HcLc. Анализы не достаточно чувствительны для ранжирования панели антител. 11.5. Анализы роста нейритов. Гуманизированные антитела против NOGO-A исследовали на их способность нейтрализовать ингибирующую активность NOGO-A на рост нейритов (NO, neurite-outgrowth) в анализе, который основан на количественном определении NO, как описано ранее. Тестируемые в анализе антитела отбирали на основе кинетики их связывания с NOGO-A. Высокоаффинные гуманизированные антитела, а именно H28L16,H27L16, H20L16, и для сравнения их родительские антитела 2 А 10 (мышиное моноклональное) и HcLc(химера мышиного и человеческого) тестировали в отношении нейтрализации NOGO-A. Для сравнения в данном анализе также тестировали антитело 11 С 7 (см. пример 13). Для тестирования нейтрализующей активности отобранных гуманизированных антител лунки покрывали рекомбинантным человеческим GST-человеческим NOGO-A56 и обрабатывали различными концентрациями антител при 37 С за 1 ч перед добавлением нейронов зернистого слоя коры мозжечка(CGN). Контрольные лунки обрабатывали HBSS. Для каждой лунки измеряли среднюю длину нейритов на один нейрит. На фиг. 16 представлены результаты для гуманизированных антител, тестируемых в данном анализе. Для подтверждения специфичности активности использовали панель контрольных антител (контрольный IgG, очищенный мышиный IgG, Campath и другие неродственные гуманизированные антитела). В качестве дополнительного контроля те же гуманизированные антитела титровали на планшетах, покрытых GST. Результаты подтверждают, что H28L16, H27L16 и H20L16 обращают опосредованное NOGO-A ингибирование роста нейритов с аналогичной степенью, наблюдаемой для родительских антител (2 А 10 и HcLc). Эффекты, по-видимому, являются сильными и стабильными и наблюдаются с H28L16 в восьми из одиннадцати независимых экспериментов с ростом нейритов. В противоположность этому, гуманизированные антитела не увеличивают рост нейритов на планшетах, покрытыхGST, а панель контрольных антител не демонстрирует какого-либо дозозависимого обращения ингибирования, подтверждая, что эффект гуманизированных антител является специфическим для ингибирования, опосредованного NOGO-A. Данные, представленные для роста нейритов, отобраны из ряда повторных экспериментов. Хотя число повторов, которые не представлены, по-видимому варьирует в природе,полагают, что представленные данные отражают подлинную активность антител по настоящему изобре- 25015536 тению в снижении ингибирующего эффекта NOGO в анализе роста нейритов. Пример 12. Дополнительная характеристика H28L16. 12.1. Связывание с полноразмерным рекомбинантным NOGO-A. Способность антител связываться с полноразмерным внеклеточным доменом рекомбинантного человеческого NOGO-A (GST-человеческий NOGO-A-ECD) исследовали с помощью ELISA анализа с прямым связыванием. В этом случае ECD представлял собой сплайс-вариант, попадающий в пределы области из приблизительно 186-1004 положения человеческого NOGO-A (участок, начинающийся с DETFAL(SEQ ID NO:95) и заканчивающийся ELSKTS (SEQ ID NO:96. Рекомбинантный GST-человеческий NOGO-A-ECD наносили непосредственно на планшет в концентрации 1 мкг/мл. Данные, представленные на фиг. 17, подтверждают, что H28L16 может распознаватьGST-человеческий NOGO-A-ECD на сравнимых или более высоких уровнях, чем родительское антитело(HcLc) или H20L16. 12.2. Ингибирование Fc функциональности. Для улучшения профиля безопасности кандидата остатки L235 и G237 в СН 2-домене константной области тяжелой цепи (система EU Index) подвергали мутации до остатков аланина, снижая, таким образом, вероятность запуска антителоопосредованных иммунологических эффекторных функций. Пониженное связывание с человеческим C1q использовали в качестве имитации ингибирования Fc функциональности. На фиг. 18 ниже показано, что H28L16 демонстрирует значительно сниженную активность связывания с C1q по сравнению с Campath-IgG1 (дикий тип) и сравнимо с конструкцией Campath IgG1,несущей те же мутации (Fc-мутантное антитело (Fc-, и Campath IgG4. Эти данные позволяют предположить, что мутации в СН 2-домене, представленные в H28L16, будут значительно снижать вероятность запуска Fc-опосредованных эффекторных функций. 12.3. Связывание ортологов. Для подтверждения того факта, что H28L16 демонстрирует активность связывания в отношении различных ортологов NOGO-A, сравнимую с активностью родительского антитела (HcLc), провели серию анализов связывания. На фиг. 19 А-Г представлены результаты ELISA с прямым связыванием с рекомбинантным NOGO (GST-человеческим NOGO-A56) для крысы (SEQ ID NO:94), макака(SEQ ID NO:92), мартышки (SEQ ID NO:93) и беличьей обезьяны (SEQ ID NO:91) соответственно. Во всех случаях H28L16 показал сравнимую или более высокую активность, чем химерное антитело (HcLc). Вычисленные значения ЕС 50 очень похожи на вычисленные значения для связывания с человеческим рекомбинантным NOGO-A. Кинетику связывания H28L16 с различными ортологами NOGO-A в сравнении с HcLc и 11 С 7 определяли с использованием Biacore. В табл. 18 и 19 представлена кинетика связывания в двух различных форматах данного анализа. В тех случаях, когда рекомбинантный NOGO-A связывали непосредственно с чипом СМ 5 (табл. 18), кинетика связывания для крысы, макака, беличьей обезьяны и мартышки очень похожа на кинетику связывания для человека (диапазон = 0,33-0,67 нМ). В тех случаях, когда формат анализа меняли на противоположный и антитела подвергали иммобилизации на чипе с использованием белка А (табл. 19), аффинность связывания H28L16 с крысиным NOGO-A была приблизительно в 4 раза ниже, чем для человеческого NOGO-A. Похожую тенденцию наблюдают для NOGO-A макака (аффинность в 8,5 раз ниже, чем для человеческого) и для ортологов других приматов (аффинность в 12-17 раз ниже, чем для человеческого). Химерное антитело HcLc демонстрирует похожий профиль связывания для ортологов NOGO-A в обеих ориентациях анализа. Поскольку неясно, какой из двух форматов лучше отражает ситуацию in vivo, предварительные выводы, которые можно сделать на основании этого исследования, состоят в следующем: 1) H28L16 сохранял профиль перекрестного взаимодействия с ортологами, ассоциированный с химерным антителом HcLc;и 2) аффинность HcLc для NOGO-A крысы и макака составляет от 4- до 8,5-кратной аффинности для человеческого NOGO-A и в определенных условиях может быть очень похожей. Таблица 18. Кинетика связывания H28L16, 11 С 7 и HcLc с рекомбинантными ортологами человеческого NOGO-A, как определено с использованием Biacore T100. Приблизительно 140-180 RU различных ортологов NOGO-A подвергали иммобилизации на чипе СМ 5 с помощью связывания с первичным амином. Антитела пропускали через данный комплекс в различных концентрациях (0,125-8 нМ). Значения показывают среднее и стандартное отклонение (в скобках) для 1-2 независимых опытов, осуществленных в двух повторностях, с независимым анализом каждой группы данных перед вычислением среднего и стандартного отклонения. Одну группу кривых отбросили вследствие невозможности интерпретировать кривые для антитела 11 С 7. Таблица 19. Кинетика связывания H28L16, 11 С 7 и HcLc с рекомбинантными ортологами человеческого NOGO-A, как определено с использованием Biacore TWO, в обратном формате. Белок А подвергали иммобилизации на поверхности приблизительно при 4000 RU и антитела против NOGO-A связывали приблизительно при 300-400 RU. Рекомбинантные белки (CST-NOGO-A56) пропускали через данный комплекс в различных концентрациях (0,125-64 нМ) в зависимости от конструкции. Все опыты проводили в двух повторностях. Значения показывают среднее и стандартное отклонение (в скобках) для 1-3 независимых опытов, где каждый опыт осуществлен в двух повторностях и каждую группу данных анализировали независимо перед вычислением среднего и стандартного отклонения. Таблица 19- жидкостная хроматография высокого разрешения) и SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). SEC-HPLC проводили при скорости 1,0 мл/мин с использованием 100 мМ фосфата натрия, 400 мМ хлорида натрия, рН 6,8 и колонки из нержавеющей стали TSK G3000MDQ с использованием амфолинов с рН 3,5-10. Были получены следующие результаты. Показанные в табл. 20 значения представляют собой процент антител, отнесенных к одному из трех различных видов. Таблица 21 Показанные в табл. 21 значения представляют собой процент антител, обнаруженных в мажорных полосах. Данные SEC-HPLC позволяют предположить, что H20L16 более чувствительно к агрегации, чемH28L16 (H28L16). Если бы возникла необходимость повторить представленные здесь данные в крупном масштабе, то это могло бы повлиять на способность способа производства продуцировать материал приемлемого качества для клинического применения (95% мономеров). Данные SDS-PAGE показывают,что оба кандидата приемлемы и демонстрируют типичный профиль. Пример 13. Сравнение H28L16 с 11 С 7. Мышиное антитело против NOGO-A, обозначенное как 11 С 7, описано в WO 2004052932, которое получали к пептидному эпитопу. Химерное 11 С 7 было получено на основе информации о последовательности, представленной в WO 2004052932. Для сравнения эпитопов связывания 2 А 10 и 11 С 7 осуществляли конкурентный ELISA для определения, распознают ли 11 С 7 и 2 А 10 перекрывающийся эпитоп наNOGO-A. Как показано на фиг. 20, HcLc (химерная форма 2 А 10) оказалась способной конкурировать с 2 А 10 за связывание с человеческим рекомбинантным NOGO-A, тогда как 11 С 7 не продемонстрировало конкуренции с 2 А 10, даже в концентрациях вплоть до 100 мкг/мл. Пример 14. Конкурентный ELISA для демонстрации способности пептидов конкурировать непосредственно с человеческим NOGO-5+6 за связывание с NOGO H28L16. Способ осуществления конкурентного ELISA. Способность пептидов конкурировать непосредственно с NOGO-A (CST-человеческий NOGO-A56) за связывание с NOGO H28L16 оценивали с использованием конкурентного ELISA. Кроличье антитело против человеческого IgG (Sigma, I-9764) в концентрации 5 г/мл в бикарбонатном буфере наносили на планшеты Nunc Immunosorp (100 мкл на лунку) при 4 С в течение ночи. Планшеты трижды промывалиTBS, содержащим 0,05% Tween (TBST), затем блокировали 1% БСА в TBST при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем на планшете иммобилизовали H28L16 (1 мкг/мл, разведенный в 1% БСА в TBST,50 мкл на лунку) при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты трижды промывали TBST. Пептиды (от 0 до 100 г/мл) и CST-человеческий NOGO-A56 в концентрации 1 мкг/мл (разведенный в 1% БСА вTBST) предварительно смешивали перед добавлением в лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты трижды промывали TBST и затем инкубировали в течение 1 ч с конъюгатом для кроличьих анти-GST и пероксидазы (Sigma А 7340, 1:2000, разведенный в 1% БСА в TBST). Планшеты трижды промывали TBST и затем инкубировали с 50 мкл субстрата для пероксидазы OPD(Sigma) на лунку в течение 10 мин. Цветную реакцию останавливали путем добавления 25 мкл концентрированной H2SO4. Поглощение при 490 нм измеряли, используя планшет-ридер. Результаты, представленные на фиг. 21, подтверждают, что пептиды 6 и 7, положительные при картировании эпитопов с помощью ELISA (пример 8), могут конкурировать с CST-человеческимNOGO-A56 за связывание с H28L16. Эти данные позволяют предположить, что пептиды, положительные при исследовании картирования эпитопов, содержат эпитоп для связывания H28L16. Пептиды 16 и 17(которые содержат пептиды NOGO, но не перекрываются с пептидами 6 и 7), которые не содержат предполагаемого эпитопа, не конкурируют с NOGO-5+6.- 28015536 Пример 15. Анализ ELISA гуманизированного моноклонального антитела против NOGO на основе варианта G101S/Q37R антитела против NOGO.G101S (также известный как Н 100 (SEQ ID NO:63, модифицированный вариант вариабельной области тяжелой цепи Н 6 (SEQ ID NO:11) получали путем введения одиночной замены, G101S (нумерация по Kabat), в CDR Н 3, как описано выше. Аналогично, получали модифицированный вариант (Q37R) вариабельной области легкой цепи L13 (SEQ ID NO:13) путем введения одиночной замены (нумерация поKabat Q37R) в рамочную область (с образованием L100). Белковая последовательность вариабельного домена легкой цепи Q37R представлена в SEQ ID NO:67. Гены, кодирующие полноразмерные версии тяжелой и легкой цепей, содержащих заменыG101S/Q37R, экспрессировали в клетках СНО, как описано ранее, и анализировали в ELISA с прямым связыванием, как описано ранее. Результаты ELISA с прямым связыванием, когда антиген наносят в концентрации 0,05 мкг/мл,представлены на фиг. 22. Данные подтверждают, что антитело H100L100 демонстрирует сравнимую сH27L16 активность связывания с рекомбинантным CST-человеческим NOGO-A56 и что H100L100 обладает улучшенным профилем связывания при сравнении с H6L13. Соответствующие значения ЕС 50 представлены в табл. 22. Таблица 22 Измерения ЕС 50 для варианта G101S/Q37R в сравнении с H6L13 и H27L16 Пример 16. Biacore-анализ гуманизированных моноклональных антител против NOGO на основеH100 - модифицированный вариант вариабельной области тяжелой цепи Н 6 (SEQ ID NO:11) получали путем введения одиночной замены G101S (нумерация по Kabat) в CDR Н 3. Белковая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи белка Н 100 представлена в SEQ ID NO:63. Аналогично,L100 и L101, модифицированные варианты вариабельной области легкой цепи L13 (SEQ ID NO:13), получали путем введения одиночной замены (Q37R и Q45R соответственно, нумерация по Kabat) в рамочную область. Белковые последовательности вариабельных доменов легких цепей белков L100 и L101 представлены в SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:68 соответственно. Полноразмерные версии H100L100 и H100L101 экспрессировали в клетках СНО, как описано ранее. В табл. 23 представлено сравнение аффинности связывания H6L13 с H100L100 и H100L101 и показано,что H100L100 и H100L101 обладают улучшенной аффинностью связывания по сравнению с H6L13. В этом примере, по существу, использовали способ, описанный в примере 6, где чип СМ 5 активировали путем пропускания растворов NHS и EDC над чипом в концентрации 5 мкл/мл в течение 7 мин и перед пропусканием над чипом суспендировали NOGO в 10 нМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5). Таблица 23 Измерения Biacore для вариантов G101S вариабельной области тяжелой цепи Н 6 в комбинации с вариантами вариабельной области легкой цепи L13 в сравнении с H6L13