Ротавирусная вакцина, индуцирующая гетеротипический перекрестный иммунитет
Номер патента: 14328
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Де Во Беатриса Арсен Виржиния, Коло Брижитт Дезире Альберта
Формула / Реферат
1. Способ индукции иммунного ответа против штамма ротавируса типа G2P[4], включающий введение субъекту композиции, содержащей ослабленный штамм ротавируса типа G1P[8].
2. Применение ослабленного штамма ротавируса типа G1P[8] в изготовлении лекарственного средства для индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной штаммом ротавируса типа G2P[4].
3. Способ по п.1, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген VP4, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: основание аденин (А) в позиции 788, основание аденин (А) в позиции 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.
4. Способ по п.3, где ген VP4 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую основание аденин (А) в позициях 788 и 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона.
5. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген VP7, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) в позиции 897 и гуанин (G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.
6. Способ по п.5, где ген VP7 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую тимин (Т) в позиции 605 и аденин (А) или гуанин (G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.
7. Способ по любому из пп.1 или 3-6, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген VP4, содержащий в нуклеотидной последовательности аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона; и где ген VP7 содержит в нуклеотидной последовательности тимин (Т) в позиции 605 и аденин (А) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона.
8. Способ по любому из пп.1 или 3-7, где композиция дополнительно индуцирует иммунный ответ против G1 и против по меньшей мере одного из серотипов, не являющихся G1, выбранных из группы, состоящей из серотипов G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 и G14.
9. Способ по п.8, где по меньшей мере один из серотипов, не являющихся G1, выбран из группы, состоящей из G3, G4 и G9.
10. Способ по любому из пп.1 или 3-9, где композицию используют для того, чтобы дополнительно индуцировать иммунный ответ против Р[8] и против по меньшей мере одного из типов, не являющихся Р[8], выбранных из группы, состоящей из типов Р[1], Р[2], Р[3], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19].
11. Способ по любому из пп.1 или 3-10, где композиция, содержащая ослабленный штамм ротавируса типа G1P[8], обеспечивает иммунитет против тяжелого вызванного ротавирусом гастроэнтерита, вызванного инфекцией штаммом ротавируса типа G2P[4].
12. Способ по любому из пп.1 или 3-11, где композиция, содержащая ослабленный штамм ротавируса типа G1P[8], является по меньшей мере на 40% защитной в популяции индивидуумов, прошедших вакцинацию, против диареи, вызванной штаммом ротавируса, относящимся к типу G2P[4].
13. Способ по п.12, где композиция является по меньшей мере на 50% защитной.
14. Способ по любому из пп.1 или 3-13, где композиция является по меньшей мере на 60% защитной.
15. Способ по любому из пп.11-14, где композиция является защитной в степени от 40 до 80%.
16. Способ по п.15, где композиция является защитной в степени от 50 до 70%.
17. Способ по любому из пп.1 или 3-16, где композиция содержит штамм ротавируса G1P[8] и является защитной в степени от 40 до 75% в популяции индивидуумов, прошедших вакцинацию, против тяжелого гастроэнтерита, вызванного инфекцией ротавирусом с серотипом G2P4.
18. Способ по любому из пп.1 или 3-17, где штамм ротавируса в указанной композиции представляет собой штамм, депонированный в ЕСАСС под номером 99081301, либо получен из штамма, депонированного в ЕСАСС под номером 99081301, или происходит от него.
19. Способ по любому из пп.1 или 3-18, где композицию вводят в 2-дозовом режиме.
20. Способ по любому из пп.1 или 3-18, где ослабленный штамм ротавируса приготавливают в виде препарата с подходящим фармацевтическим носителем, или с буфером, нейтрализующим кислоту, или и с тем, и с другим.
Текст
РОТАВИРУСНАЯ ВАКЦИНА, ИНДУЦИРУЮЩАЯ ГЕТЕРОТИПИЧЕСКИЙ ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНИТЕТ Коло Брижитт Дезире Альберта, Де Во Беатриса Арсен Виржиния (BE) Представитель: Согласно изобретению предложен способ индукции иммунного ответа против штамма ротавируса, включающий введение субъекту композиции, содержащей ослабленный штамм ротавируса типа GxPy, причем указанная композиция вызывает иммунный ответ против штамма ротавируса,который не представляет собой ни тип Gx, ни тип Ру. 014328 Область изобретения Данное изобретение относится к препаратам ротавирусной вакцины. Изобретение относится к применению ослабленной популяции ротавируса одного типа в предупреждении заболевания, связанного с инфекцией ротавируса другого типа. Предшествующий уровень техники Острая инфекционная диарея является основной причиной заболеваний и смерти во многих районах мира. В развивающихся странах влияние диареи поразительно. По оценкам в Азии, Африки и Латинской Америке наблюдают 3-4 биллиона случаев диареи каждый год, и из этих случаев около 5-10 миллионов приводят к смерти (Walsh, J.A. et al.: N.Engl. J. Med., 301:967-974 (1979. Ротавирусы известны как одна из наиболее важных причин тяжелой диареи у младенцев и маленьких детей (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, третье издание, под редакцией Fields et al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Установлено, что ротавирусные заболевания лежат в основе более одного миллиона смертей ежегодно. Болезни, вызванные ротавирусами,наиболее часто поражают детей в возрасте между 6 и 24 месяцами, и максимальное распространение заболевания обычно наблюдается во время более холодных месяцев в зоне умеренного климата и круглый год в тропических областях. Ротавирусы обычно передаются от человека к человеку фекально-оральным способом с инкубационным периодом примерно от 1 до 3 дней. В отличие от инфекции в возрастной группе от 6 месяцев до 24 месяцев, инфекция у новорожденных обычно протекает бессимптомно или заболевание имеет легкую степень тяжести. В отличие от тяжелого заболевания, обычно встречающегося у маленьких детей, большинство взрослых имеют иммунитет в результате предыдущей ротавирусной инфекции, вследствие чего большинство инфекций у взрослых имеют легкую степень тяжести или протекают бессимптомно (Offit, P.A. et al. Соmр. Ther., 8(8):2126, 1982). Ротавирусы обычно имеют сферическую форму, и их название является производным от их уникальной внешней и внутренней или двухслойной структуры капсида. Обычно двухслойная структура капсида ротавируса окружает внутреннюю белковую оболочку или ядро, которое содержит геном. Геном ротавируса составлен из 11 сегментов двуцепочечной РНК, которая кодирует по меньшей мере 11 различных вирусных белков. Два из этих белков, обозначаемые VP4 и VP7, расположены на наружной стороне двухслойной капсидной структуры. Внутренний капсид ротавируса представлен одним белком, который является ротавирусным белком, обозначаемым VP6. Относительная значимость этих трех конкретных ротавирусных белков в индукции иммунного ответа, который вызывает ротавирусная инфекция, пока неясна. Тем не менее, белок VP6 определяет групповой и подгрупповой антиген, а белки VP4 и VP7 являются определителями серотипической (типы,определяемые посредством реакции нейтрализации) и генотипической (типы, определяемые не с помощью серологического анализа) специфичности. Обозначение для G серотипов и G генотипов идентично. В отличие от этого, номера, присвоенные Р серотипам и генотипам, отличаются (SantosN. Et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56). Поэтому Р серотип обозначают как Р,за которым следует присвоенный номер, а Р генотип обозначают как Р, за которым следует присвоенный номер в скобках. На сегодняшний день идентифицировано по меньшей мере 14 G серотипов ротавируса и 14 Р серотипов ротавируса (Santos N. Et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56). Среди них 10 G серотипов (G1-6, G8-10 и G12) и 9 P серотипов (Р 1, Р 2 А, Р 3, Р 4, Р 5 А, Р 7, Р 8, Р 11 и Р 12) были идентифицированы среди ротавирусов человека. Было описано двадцать три Р генотипа, десять из которых выделены из человека (Р[3]-[6], Р[8]-[11], Р[14] и Р[19]). Белок VP7 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 38000 (в негликозилированном состоянии 34000), который является продуктом трансляции сегмента генома 7, 8 или 9 в зависимости от штамма. Данный белок стимулирует образование нейтрализующих антител после ротавирусной инфекции. Белок VP4 представляет собой негликозилированный белок с молекулярной массой около 88000, который является продуктом трансляции сегмента генома 4. Данный белок также стимулирует нейтрализующие антитела после ротавирусной инфекции. Поскольку белки VP4 и VP7 являются вирусными белками, против которых направлены нейтрализующие антитела, полагают, что они являются главными кандидатами для развития ротавирусных вакцин, обеспечивающих иммунитет против ротавирусных заболеваний. Известно, что естественная ротавирусная инфекция в раннем детстве вызывает защитный иммунитет. Таким образом, крайне предпочтительной является живая ослабленная ротавирусная вакцина. Удобно, если это будет пероральная вакцина, так как это естественный путь инфицирования вирусом. Ранняя разработка вакцины для предупреждения ротавирусных инфекций началaсь в 1970-е после открытия вируса. Вначале изучали ослабленные штаммы из животных и человека и получали противоречивые или неутешительные результаты. Более недавние попытки были сосредоточены на реассортантных штаммах вирусов человека и животных, которые были более успешны. Ротавирусный штамм, известный как 89-12, был описан Ward, см. патент США 5474773, иBernstein, D.L. et al., Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998. Штамм 89-12 был выделен из образца кала, полученного от 14-месячного ребенка с естественным ротавирусным заболеванием в 1988. Согласно патенту США 5474773 ротавирус человека HRV 89-12 был затем адаптирован к выращиванию в культуре с помощью 2 пассажей в первичных клетках почки африканской зеленой мартышкиMicrobiol., 19, 748-753, 1984. Затем его очищали выделением из бляшек 3 раза в клетках МА-104 (до 9 пассажа) и выращивали после 2 дополнительных пассажей в данных клетках. Был проведен один дополнительный пассаж (пассаж 12) для помещения в американскую коллекцию типовых культур(АТСС, American Type Culture Collection) под инвентарным номером АТСС VR 2272. Помещенный в коллекцию штамм также известен как 89-12 С 2. На статью Bernstein et al. в Vaccine в 1988 году ниже ссылаются как на статью в Vaccine (1998). Статья описывает безопасность и иммуногенность кандидата на живую человеческую ротавирусную вакцину, вводимого перорально. Данная вакцина была получена из штамма 89-12, атеннуированного посредством пересева без очищения выделением из бляшек 26 раз в первичных клеткахAGMK и затем еще 7 раз в постоянной клеточной линии AGMK (всего 33 пассажа). В дальнейшем на вышеуказанный материал, который прошел 26 последовательных пассажей,будут ссылаться как на Р 26, а на материал, который прошел 33 последовательных пассажа, будут ссылаться как на Р 33. В целом, на ротавирус, полученный посредством пересева штамма 89-12 n раз будут ссылаться как на Рn. В приведенных ниже примерах для материала Р 33 были проведены 5 дополнительных пассажа в клетках Vero. На этот материал ссылаются как на Р 38. Выделенные культуры Р 26 и Р 33, описанные в статье в Vaccine (1998), не были депонированы в коллекции культур, также они не были проанализированы для установления их генетической характеристики. Было обнаружено, что популяция Р 26, описанная в литературе, содержит смесь вариантов. Это было установлено посредством генетической характеристики, как описано ниже (смотри примеры). Таким образом, Р 26 не является надежной единообразной популяцией для дальнейших пассажей, в частности для продуцирования серий вакцины. Аналогично Р 33 содержит смесь вариантов и не является надежно единообразной популяцией для продуцирования серий вакцины. Было обнаружено, что материал Р 26 является смесью по меньшей мере трех генных вариантовVP4. Аналогично Р 33 и Р 38 являются смесью двух вариантов. При оценке титров нейтрализующих антител в сыворотке, полученной от детей, вакцинированных Р 33 по сравнению с другими вариантами, оказалось, что эти варианты отличаются в антигеном отношении, в том, что касается нейтрализующих эпитопов, от штамма 89-12 С 2, хранящегося в АТСС. Кроме того, было обнаружено, что при введении материала Р 33 детям, реплицируются и выделяются два идентифицированных варианта. Из 100 вакцинированных детей только у 2 были признаки гастроэнтерита вследствие ротавирусной инфекции, в то время 20% плацебо группы были инфицированы. Эти данные предполагают, что идентифицированные варианты связаны с иммунитетом против ротавирусного заболевания.WO 01/12797 раскрывает способ разделения вариантов ротавируса и улучшенную живую ослабленную вакцину, полученную от клонированного (гомогенного) штамма ротавируса человека. Также раскрыта ослабленная ротавирусная популяция (культура), характеризуемая тем, что она содержит единственный вариант или преимущественно единственный вариант, который определяется нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один из основных вирусных белков, обозначаемых как VP4 и VP7. Были получены сообщения о защитной эффективности такой пероральной ослабленной человеческой ротавирусной вакцины по отношению к гетерологичному штамму G9 у детей в Латинской Америке (Perez et al. 42-я межотраслевая конференция по противомикробным агентам и химиотерапии (ICAAC 2002) 27-30 сентября 2002, Сан-Диего). WO 05/021033 раскрывает тот факт, что один серотип ротавируса может быть использован для защиты от заболевания, вызванного другим серотипом. В частности, WO 05/021033 раскрывает применение популяции ротавируса G1 [например, такой как помещенная в Европейскую коллекцию животных клеточных культур (ЕСАСС, European Collection of Animal Cell Cultures) Лабораторией по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, SPG4 0JG, Великобритания, 13 августа 1999 года под инвентарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора,также называемой Р 43 или RIX4414] для предупреждения заболевания, вызванного как серотипомG1, так и по меньшей мере одним из серотипов ротавируса, не являющимся G1, такими как серотипами ротавируса G2, G3, G4 и G9, но не ограничиваясь ими. Полное содержание WO 01/12797 и WO 05/021033 включено ниже посредством ссылки. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 А (SEQ ID NO:1) представлена нуклеотидная последовательность гена VP4 Р 43(RIX4414), включающая последовательность, кодирующую белок VP4 Р 43. Фиг. 1 В (SEQ ID NO:2) имеет дополнительные нуклеотиды на обоих концах гена и нуклеотидную замену (выделено жирным - G вместо С в позиции 18, что приводит к TCG вместо ТСА, не оказывая однако влияния на получаемый кодируемый белок) вследствие техники секвенирования. Малым регистром выделена некодирующая последовательность. Фиг. 1 В показывает правильную последовательность для штамма из коллекции Р 43. На фиг. 2 А (SEQ ID NO:3) представлена нуклеотидная последовательность гена VP7 Р 43(RIX4414), включающая последовательность, кодирующую белок VP7 Р 43. Фиг. 2 В (SEQ ID NO:4) имеет дополнительные нуклеотиды на обоих концах гена и нуклеотидную замену (выделено жирным - А вместо С в позиции 58, что приводит к АТТ, кодирующему лейцин, вместо СТТ, кодирующему изолейцин) вследствие техники секвенирования. Малым регистром выделена некодирующая последовательность. Фиг. 2 В показывает правильную последовательность для штамма из коллекции Р 43. На фиг. 3 (SEQ ID NO:5) представлена полипептидная последовательность VP4 RIX4414. На фиг. 4 (SEQ ID NO:6) представлена полипептидная последовательность VP7 RIX4414. На фиг. 5 (SEQ ID NO:7) показана полипептидная последовательность белка NSP4 RIX4414. На фиг. 6 (SEQ ID NO:8) показана нуклеотидная последовательность, кодирующая белок NSP4RIX4414. Некодирующая последовательность выделена малым регистром. На фиг. 7 (SEQ ID NO:9) показана полипептидная последовательность белка VP6 RIX4414. На фиг. 8 (SEQ ID NO:10) показана нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP6RIX4414. Некодирующая последовательность выделена малым регистром. Подробное описание изобретения В настоящем изобретении авторы изобретения определили, что ослабленная ротавирусная популяция, например, одна из охарактеризованных в W0 01/12797, может быть использована в качестве вакцины для обеспечения перекрестного иммунитета против заболеваний, вызванных ротавирусной инфекцией типа (серотипа и/или генотипа), отличного от того, который использовался в вакцине. Белок VP7 определяет G тип (серотип), а белок VP4 определяет Р тип штамма (серотип или генотип). В частности настоящее изобретение относится к применению ослабленной ротавирусной популяции одного Р типа в предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией другого Р типа, и особенно к применению ослабленной ротавирусной популяции или штамма GxPy типа в индукции иммунного ответа и/или предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией, вызванной штаммом ротавируса, который не относится ни к Gx, ни к Ру типу. Иммунитет может быть измерен по образованию нейтрализирующих антител на вакцину или по образованию антител IgA на ротавирус в сыворотке, например по фактору серологической конверсии (т.е. увеличение уровня антител IgA в сыворотке после вакцинациичем в 3 раза, как описано Ward et al., 1990, J. Infect. Disease, 161, 440-445). В контексте данного изобретения, а также в соответствии с общепринятым пониманием в области (Santos N. Et Hoshino Y., 2005, Reviews in medical Virology, 15, 29-56), Gx относится к определенному G типу, т.е. генотипу G или серотипу G (обе терминологии идентичны), в то время как терминология Ру обычно относится к определенному Р типу, либо серотипу Р (например Р 8, Р 4) либо генотипу Р (например Р[4], Р[8]). При ссылке на определенный генотип Р используется обозначение Р, за которым следует присвоенный номер в скобках; в другом случае тип Р означает либо серотип, либо генотип. На протяжении данной спецификации такие формулировки, как применение вакцинной композиции согласно изобретению в изготовлении вакцинной композиции для предупреждения ротавирусных заболеваний или как способы терапии, включающие применение указанной вакцинной композиции, будут взаимозаменяемы. Авторы изобретения определили, что ротавирусная популяция GxP[8] [например G1P[8], депонированная в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, SP4 0JG, Великобритания,13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора] может быть использована для предупреждения заболевания, вызванного как штаммом GxP[8] (например G1P[8]), так и по меньшей мере одним ротавирусным штаммом, не относящимся ни к Gx, ни к Ру типу. В частности, авторы изобретения определили, что ротавирусная популяция G1P[8] может быть использована для предупреждения заболевания, вызванного как однимG1P[8], так и по меньшей мере одним He-G1P[8] генотипом, таким как генотип ротавируса G2P[4]. Соответственно настоящее изобретение относится к применению ослабленной ротавирусной популяции одного типа ротавируса в предупреждении заболевания, связанного с ротавирусной инфекцией другого типа ротавируса, где тип надлежащим образом определяют посредством ссылки на последовательность белка ротавируса VP4 (Р тип).-3 014328 Изобретение также относится к применению ослабленной ротавирусной популяции одного штамма ротавируса (определяемого специфическим G и Р типом) в предупреждении заболевания,связанного с ротавирусной инфекцией другого штамма ротавируса, где штамм надлежащим образом определяют посредством ссылки на последовательность обоих белков ротавируса VP4 (Р тип) и VP7(G тип). Более конкретно, изобретение относится к применению ослабленного ротавирусного штамма типа GxPy в изготовлении лекарственного средства для индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной ротавирусным штаммом, не относящимся ни к Gx, ни к Ру типу. Другими словами, ротавирусный штамм по изобретению может быть использован в предупреждении заболевания, вызванного заражением другим ротавирусом, который отличается и по G, и по Р типу. В частности, во всех аспектах заявленного изобретения указанный иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ. Применимо, если ротавирусная популяция содержит вирусные белки VP4 и/или VP7 из популяции 99081301, хранящейся в ЕСАСС, пригодной для обеспечения перекрестного иммунного эффекта. На всем протяжении данного документа на перекрестный иммунитет будут ссылаться, как на иммунитет, обеспеченный одним типом ротавируса, против инфекции, вызванной другим типом ротавируса. Перекрестный иммунитет может быть гомотипическим или гетеротипическим. Гомотипический перекрестный иммунитет представляет собой иммунитет, обеспеченный штаммом ротавируса, против штамма либо G, либо Р типа, такой как, например, в случае штамма G1P[8], обеспечивающего перекрестный иммунитет против не-G1, Р[8] штамма (например, G2P[8]) через тип Р[8]. Другим примером гомотипического перекрестного иммунитет является тот, который обеспечен штаммом G1P[8] против штамма G1 не-Р[8] (например, G1P[4]) через тип G1. Гетеротипический перекрестный иммунитет представляет собой иммунитет, обеспеченный ротавирусным штаммом,против ротавирусного штамма других Р и G типов, такой как, например, иммунитет, обеспеченныйG1P[8], против штамма не-G1 не-Р[8] (например, G2P[4]) (гетеротипический иммунитет, обеспеченный через G и Р типы). Применимо, если серотип ослабленного ротавируса является G1 серотипом и способен обеспечить перекрестный иммунитет против заболевания, вызванного серотипами ротавируса G1 и не-G1,такими как серотипами, выбранными из группы, состоящей из G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10,G11, G12, G13 и G14. В частности применение ослабленной ротавирусной популяции G1 [например, как депонированная в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, SP4 0JG, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора] может быть использовано для предупреждения заболевания, вызванного серотипом G1 и по меньшей мере одним, применимо по меньшей мере двумя, применимо по меньшей мере тремя,применимо по меньшей мере четырьмя не-G1 серотипами ротавируса, выбранными из группы, состоящей из. G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 и G14. Соответственно предлагается применение ослабленного ротавирусного штамма G1 типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной штаммом ротавируса,не относящимся к G1 типу. В конкретном аспекте иммунный ответ индуцируют против по меньшей мере одного, по меньшей мере двух или более не-G1 серотипов ротавируса, обычно против любого серотипа, выбранного из группы, состоящей из G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 и G14. Обычно иммунный ответ индуцируют против по меньшей мере одного, применимо по меньшей мере двух, применимо по меньшей мере трех из следующих не-G1 типов: G2, G3, G4 и G9, в дополнение к гомотипическому (G1) иммунитету. Применимо, если композиция содержит штамм ротавируса G1 и применяется для индукции иммунного ответа против типов G1 и G2. Применимо, если ослабленный ротавирусный штамм имеет тип Р[8] и способен обеспечить перекрестный иммунитет против заболевания, вызванного типами ротавируса Р[8] и не-Р[8], такими как типами, выбранными из группы, состоящей из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[10],Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19]. В частности, применение ослабленной ротавирусной популяции Р[8] [например, как депонированная в Европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир, SPG4 0JG, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора] может быть использовано для предупреждения заболевания, вызванного типом Р[8] и по меньшей мере одним из не-Р[8] типов ротавируса, выбранных из группы, состоящей из Р[1], Р[2],Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[10], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19]. В частности, применимо, если иммунный ответ индуцируют против, по меньшей мере, Р[4] типа в дополнение к типу ротавируса Р[8].-4 014328 Соответственно, вакцинная композиция для применения согласно изобретению содержит штамм ротавируса G1P[8] и способна вызывать иммунный ответ против штамма ротавируса G2P[4]. В определенном аспекте изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против штамма ротавируса, который включает введение субъекту композиции, содержащей ослабленный ротавирусный штамм типа GxPy, где указанная композиция вызывает иммунный ответ против штамма ротавируса, не относящегося ни к Gx, ни к Ру типу. В частности, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против ротавируса серотипа G1 и не-G1, который включает введение субъекту композиции, содержащей ротавирусную вакцину серотипа G1. Применимо, если серотипы не-G1 выбирают из группы, состоящей из G2, G3,G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10. G11, G12, G13 и G14. Применимо, если композиция содержит штамм ротавируса G1 и применяется для индукции иммунного ответа против типов G1 и G2. Применимо, если вакцинная композиция для применения согласно изобретению содержит штамм ротавируса G1P[8] и способна вызывать иммунный ответ против штамма ротавируса G2P[4]. Применимо, если ротавирусная популяция в вакцинной композиции относится конкретно к штамму G1P1A (т.е. G1P[8] согласно современной номенклатуре). Применимо, если ротавирусная популяция содержит вирусные белки VP4 и/или VP7 из популяции 99081301, хранящейся в ЕСАСС,пригодной для индукции иммунного ответа и обычно для обеспечения перекрестного защитного эффекта. Применимо, если изобретение относится к штаммам ротавируса G1P[8] в методах или применениях, описанных выше. Обычно используемая ротавирусная вакцина относится к популяции 99081301, хранящейся в ЕСАСС, или является производной из данной популяции. В определенном аспекте изобретения вакцина индуцирует перекрестный защитный иммунный ответ или перекрестный иммунитет против гастроэнтерита у вакцинированного лица по сравнению с невакцинированным (из плацебо группы). Применимо, если вакцина обеспечивает перекрестный иммунитет против таких симптомов ротавирусной инфекции, как диарея или гастроэнтерит. Например, гастроэнтерит можно определить как диарею, характеризуемую водянистым или более жидким стулом, чем обычно, три или более раза в сутки или интенсивной рвотой наряду с определением ротавируса в исследованном образце кала. Как будет понятно специалистам в области, интенсивность заболевания и эффективность вакцинации в индукции защитного иммунного ответа у вакцинированного лица или у вакцинированного населения могут быть оценены несколькими способами. Под защитным иммунным ответом понимают иммунный ответ, который ведет к снижению выраженности клинических симптомов, связанных с ротавирусной инфекцией, или который ведет к снижению восприимчивости к ротавирусной инфекции. Интенсивность заболевания у лица, не прошедшего или прошедшего вакцинацию,может быть оценена в соответствии с опубликованными оценочными системами, такими как 20 балльная шкала Везикари или слегка измененная версия указанного способа (Ruuska T. et al. Scand.J. Infect. Dis. 1990, 22, 259-267) или в соответствии с любой другой подходящей системой, описывающей и оценивающей специфичные симптомы ротавирусной инфекции (такой как методология,описанная у Clark H.F., Borian E.F., Bell L.M. Protective effect of WC3 vaccine against rotavirus diarrheain infants during a predominantly serotype 1 rotavirus season. J. Infect Dis. 1988:570-86). В соответствии с методом Везикари, тяжелый ротавирусный гастроэнтерит (RVGE, rotavirus gastroenteritis) обычно определяют баллом 11. Эффективность защиты можно оценить на уровне населения или группы по эффективности вакцины (VE). Эффективность вакцины рассчитывают по следующей формуле:ARU = уровень приступов заболевания среди населения, не прошедшего вакцинацию (оценивается по плацебо группе) = число пациентов, сообщающих по меньшей мере об одном эпизодеARV = уровень приступов заболевания в группе, прошедшей вакцинацию = число пациентов,сообщающих по меньшей мере об одном эпизоде RVGE/общее число пациентов в группе вакциныHRV (ротавирус человека, human rotavirus). Соответственно в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ или применение,как описано выше, где композиция, содержащая ослабленный ротавирусный штамм типа GxPy, индуцирует перекрестный защитный иммунный ответ и/или иммунитет против гастроэнтерита, вызванного ротавирусом, применимо против тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусом, вызванного заражением штаммом ротавируса, не относящимся ни к Gx, ни к Ру типу. В определенном воплощении указанный защитный иммунный ответ способен снизить интенсивность заболевания или устранить заболевание, вызванное ротавирусом, по оценке в соответствии с любой подходящей оценочно системой. В еще одном воплощении предложен способ или применение композиции согласно изобретению для снижения интенсивности заболевания, например, гастроэнтерита, или для устранения заболевания, вызванного ротавирусом, где указанную интенсивность заболевания или заболевание опи-5 014328 сывают в соответствии с любой подходящей оценочной системой, как указано выше. В определенном воплощении указанная композиция является до 60% защитной, применимо до 81% защитной в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к диарее, вызванной заражением ротавирусом другого типа, чем ослабленный ротавирус, присутствующий в композиции. В другом определенном воплощении указанная композиция является по меньшей мере на 40% защитной, применимо по меньшей мере на 45% защитной, применимо по меньшей мере на 50% защитной,применимо по меньшей мере на 60% защитной в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к диарее, вызванной штаммом ротавируса, не относящимся ни к Gx, ни к Ру типу. В определенном аспекте указанная композиция является от 40 до 80% защитной, применимо от 50 до 70% защитной по отношению к диарее, вызванной штаммом ротавируса, не относящимся ни к Gx, ни к Ру типу. В определенном аспекте указанная композиция содержит штамм ротавируса G1P[8], который обеспечивает уровень защиты, как описано выше, по отношению к гастроэнтериту, вызванному заражением штаммом ротавируса типа G2P[4]. Применимо, если уровень защиты по отношению к диарее и/или гастроэнтериту и/или тяжелому гастроэнтериту, достигаемый в популяции лиц, прошедших вакцинацию, зараженных ротавирусным штаммом, не относящимся ни к Gx, ни к Ру типу, составляет от 10 до 90%, применимо от 20 до 80%, применимо от 40 до 80%, применимо от 45 до 75%. Обычно уровень защиты по отношению к гастроэнтериту составляет по меньшей мере 40%, применимо по меньшей мере 50%. В определенном аспекте указанная композиция содержит штамм ротавируса G1P[8], который является защитным в степени от 40 до 80%, применимо от 45 до 75% в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к тяжелому гастроэнтериту по оценке в соответствии со шкалой Везикари, вызванному заражением ротавирусом серотипа G2P[4]. Применимо, если используется режим применения вакцины в 2 дозы или 3 дозы. Ротавирусная вакцина, используемая для обеспечения перекрестного иммунитета, имеет следующие применимые характеристики. В одном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет генVP4, содержащий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одно из следующего: основание аденин (А) в позиции 788, основание аденин (А) в позиции 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона. В еще одном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет ген VP7, содержащий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере одно из следующего: тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) в позиции 897, гуанин (G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона. Применимо, если в позиции 897 находится аденин (А). В определенном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона, в последовательности гена VP4. В другом определенном аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет тимин (Т) в позиции 605 и аденин/гуанин (A/G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона, в последовательности VP7. Наиболее применимо, если в последовательности VP7 в позиции 897 находится аденин (А). В особенно применимом аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению имеет аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона, в последовательности гена VP4 и тимин (Т) в позиции 605 и аденин/гуанин (A/G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона, в последовательности VP7. Применимо, если в последовательности VP7 в позиции 897 находится аденин (А). В другом аспекте ротавирус из композиции для применения согласно изобретению содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP4, где нуклеотидная последовательность является такой, как изображена в фиг. 1 А (SEQ ID NO:1) или фиг. 1 В (SEQ ID NO:2), и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP7, где нуклеотидная последовательность является такой, как изображена в фиг. 2 А (SEQ ID NO:3) или фиг. 2 В (SEQ ID NO:4). В альтернативном воплощении ротавирус из композиции для применения согласно изобретению содержит белок VP4,такой как изображено в фиг. 3 (SEQ ID NO:5), и/или белок VP7, такой как изображено в фиг. 4 (SEQID NO:6). В другом воплощении указанная ротавирусная популяция для применения согласно изобретению дополнительно содержит белок NSP4, такой как изображено в фиг. 5 (SEQ ID NO:7) или кодируемый нуклеотидной последовательностью, такой как изображено в фиг. 6 (SEQ ID NO:8),и/или белок VP6, такой как изображено в фиг. 7 (SEQ ID NO:9) или кодируемый нуклеотидной последовательностью, такой как изображено в фиг. 8 (SEQ ID NO:10). Применимые ротавирусные популяции для применения в настоящем изобретении могут быть получены посредством способа, включающего: перепрививание препарата ротавируса в пригодном типе клеток; возможно, выбор гомогенной культуры, используя стадии либо: а) предельного разбавления, либо-6 014328 б) выделения индивидуальной бляшки; и проверка на присутствие преимущественно единственного варианта посредством выполнения определения последовательности соответствующей области последовательности гена VP4 и/илиVP7. Применимо, если ротавирусная популяция является производной из штаммов Р 43 (RIX4414),Р 33 или Р 26, как описано выше. Определение последовательности может быть подходящим образом выполнено с помощью количественной или полуколичественной методики гибридизации, такой как блот-гибридизация или гибридизация бляшек. Полученная клонированная вирусная популяция, полученная методом согласно изобретению,может быть амплифицирована посредством дальнейшего перепрививания в подходящей клеточной линии. Подходящие типы клеток для перепрививания ротавирусной популяции в вышеописанном методе включают клетки AGMK (почки африканской зеленой мартышки), которые могут представлять собой постоянные клеточные линии или первичные клетки AGMK. Подходящие клеточные линииAGMK включают, например, Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ЕСАСС 85011422) и CV-1 (ATCC CCL-70). Также применимыми являются клеточные линии МА-104 (макак-резус) и MRC-5 (человека - ATCC CCL-171). Клетки Vero особенно подходят для целей амплификации. Перепрививание в клетках Vero дает высокий выход вируса. Методики для проверки того, присутствует ли в вирусной популяции, полученной методом по изобретению, единственный вариант, и для определения природы этого единственного варианта включают стандартные процедуры секвенирования или гибридизации, известные специалистам, и описаны ниже. В определенном аспекте метод по изобретению осуществляют, используя соответствующий ротавирус, особенно ротавирус, имеющий характеристики штамма 89-12, или перевиваемое производное из этого штамма. Особенно применимой популяцией с единственным вариантом является Р 43, которая получена из Р 33 (выделенный ротавирус человека, прошедший 33 пассажа в культуре подходящих типов клеток) с помощью серий конечных разведений в качестве шагов клонирования, за чем следовало перепрививание клонированного материала в клетках Vero для амплификации. Популяция Р 43 была депонирована в Европейской коллекции животных клеточных культур(ЕСАСС), Лаборатория по исследованию и продуцированию вакцин, Лабораторная служба здравоохранения, Центр прикладной микробиологии и исследований, Портон Даун, Солсбери, Уилтшир,SPG4 0JG, Великобритания, 13 августа 1999 года под депозитарным номером 99081301, в соответствии с условиями Будапештского договора, и раскрыта в WO 01/12797. Несмотря на то, что указанный общий доступ представляет собой наиболее простой способ получения ротавируса человека Р 43, похожие и практически идентичные в функциональном плане ротавирусы могут быть получены с помощью других способов, лежащих в области рассмотрения данного изобретения. Такие практически идентичные в функциональном отношении ротавирусы считаются биологически эквивалентными ротавирусу человека Р 43 по данному изобретению и, следовательно, относятся к общему объему настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что изобретение охватывает популяции ротавируса, имеющие характеристики варианта Р 43, как описано здесь. Также следует понимать, что изобретение охватывает материалы, полученные на основе размещенного в ЕСАСС Р 43 под номером 99081301 посредством дальнейшей обработки, такой как размножение путем дальнейшего перепрививания, клонирования или других процедур, используя живой вирус, или путем модификации Р 43 любым способом, включая методики генной инженерии или реассортантные методики. Такие действия и методики общеизвестны в области. Материалы, полученные на основе хранящегося в коллекции Р 43, охватываемые изобретением,включают белковый и генетический материал. Особенный интерес представляют реассортантные ротавирусы, которые содержат по меньшей мере один антиген или по меньшей мере один сегмент Р 43, например, реассортанты, которые содержат вирулентный штамм ротавируса, в котором один из или часть одного из 11 сегментов генома была заменена на сегмент генома или его часть из Р 43. Более конкретно, реассортант ротавируса, в котором сегмент или часть сегмента, кодирующегоNSP4, является сегментом или частью сегмента Р 43, может иметь полезные характеристики. Реассортантные ротавирусы и методики их получения общеизвестны (Foster, R.H. and Wagstaff, A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998). Материалами, представляющими особенный интерес, являются продукты Р 43 или иммунологически активные производные Р 43. Под иммунологически активными производными понимают материалы, полученные из или на основе вируса Р 43, особенно антигены вируса, которые при инъекции животному-хозяину способны вызывать иммунный ответ, направленный против ротавирсуа. При проведении адаптации ротавируса к соответствующей клеточной линии, например к клет-7 014328 кам Vero, может быть необходимо проведение обработки вируса с целью избавления от возможных загрязнителей, таких как адвентициальные агенты, которые могут присутствовать и которые в противном случае могли бы вызвать контаминацию. В случае адвентициальных вирусов, чувствительных к эфиру, это можно осуществить с помощью обработки эфиром, как описано ниже. Настоящее изобретение также относится к включению такой обработки эфиром в качестве дополнительной стадии в общей процедуре получения ослабленного живого ротавируса или препарата вакцины на его основе. Ротавирусный штамм по настоящему изобретению, обеспечивающий перекрестный иммунитет, может быть комбинирован с другими ротавирусными штаммами для обеспечения дополнительного иммунитета или перекрестного иммунитета против ротавирусной инфекции или заболевания. Настоящее изобретение также предлагает живую ослабленную вакцину, способную обеспечить перекрестный иммунитет, как определено выше, смешанную с подходящим адъювантом или фармацевтическим носителем. В одном воплощении ротавирусная вакцина для применения согласно изобретению представляет собой моновалентную вакцину, содержащую единственный ротавирусный штамм, такой как штамм G1P[8]. Настоящее изобретение является особенно эффективным, если предложена живая ротавирусная вакцина, в которой живой ослабленный ротавирус является ротавирусом человека и не вызывает интуссусцепции. Подходящие фармацевтические носители для применения с ослабленным ротавирусным штаммом согласно изобретению включают общеизвестные в области, пригодные для перорального введения, особенно для введения детям. Такие носители включают углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты, гидроксид алюминия, гидроксид магния, гидроксиапатит, тальк, оксид титана,гидроксид железа, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу,микрокристаллическую целлюлозу, желатин, растительный пептон, ксантан, каррагенан, аравийскую камедь, -циклодекстрин, но не ограничиваются ими. Согласно изобретению также предложен способ получения ротавирусной вакцины, например,путем лиофилизации вируса в присутствии подходящих стабилизаторов или путем смешивания вируса согласно изобретению с подходящим адъювантом или фармацевтическим носителем. Также может быть полезно получение препарата вируса по изобретению в носителе на основе жиров, таком как виросомы или липосомы, в масляной или водной эмульсии или с частицами носителя. В качестве альтернативы или дополнительно в препарат могут быть включены иммуностимуляторы, известные в области для пероральных вакцин. Такие иммуностимуляторы включают бактериальные токсины, особенно токсин холеры (СТ, cholera toxin) в форме голотоксина (целая молекула) или только В цепи (СТВ, cholera toxin В chain) и термолабильный энтеротоксин E.coli (LT). Мутированные LTs (mLTs), для которых менее вероятно превращение в активную форму, чем для нативных LT, описаны в WO 96/06627, WO 93/13202 и US 5182109. Другими иммуностимуляторами, которые могут быть эффективно включены, являются производные сапонина, такие как QS21 и монофосфорил-липид А, особенно 3-де-О-ацилированный монофосфорил-липид A (3D-MPL). Очищенные сапонины в качестве пероральных адъювантов, как описано в WO 98/56415. Сапонины и монофосфорил-липид А могут применяться по отдельности или в комбинации (например, WO 94/00153) и могут составлять препараты адъювантных систем вместе с другими агентами. 3D-MPL представляет собой общеизвестный адъювант производстваRibi Immunochem, Монтана, и его изготовление описано в GB 2122204. Общее обсуждение носителей и адъювантов для пероральной иммунизации можно найти вVaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, под редакцией Powell and Newman, Plenum Press,New York, 1995. Согласно изобретению также предложен способ вакцинирования субъектов-людей, особенно детей, с помощью введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вакцинной композиции согласно изобретению. Применимо, если живую ослабленную вакцину вводят пероральным путем. В определенном аспекте ослабленный ротавирусный штамм согласно изобретению входит в состав препарата вместе с нейтрализующим кислоту средством для минимизации инактивации вакцины желудочной кислотой. Применимые компоненты, нейтрализующие кислоту, включают неорганические антациды, например, гидроксид алюминия Al(OH)3 и гидроксид магния MG(OH)2. Коммерчески доступные антациды, пригодные для применения в изобретении, включают Mylanta (товарный знак), которая содержит гидроксид алюминия и гидроксид магния. Они нерастворимы в воде и представлены в виде суспензии. Гидроксид алюминия представляет собой особенно применимый компонент вакцинной композиции согласно изобретению, так как он может обеспечить не только эффект нейтрализации кислоты, но также эффект адъювантности. Также пригодными веществами для применения в качестве антацидов в вакцине по изобрете-8 014328 нию являются органические антациды, такие как соли карбоновых кислот. Подходящий антацид в вакцинной композиции по изобретению содержит соль карбоновой кислоты, более конкретно соль лимонной кислоты, такую как цитрат натрия или цитрат калия. Особенно пригодным антацидом, который может применяться в вакцинной композиции по настоящему изобретению, является нерастворимая неорганическая соль, карбонат кальция (СаСО 3). Карбонат кальция может взаимодействовать с ротавирусом, и во время взаимодействия с карбонатом кальция сохраняется ротавирусная активность. Для предупреждения осаждения карбоната кальция во время стадии наполнения, применимо,если в препарате присутствуют вязкие агенты. Возможные вязкие агенты, которые могут использоваться, включают псевдопластические эксципиенты. Псевдопластический раствор определяют, как раствор, имеющий более высокую вязкость в неподвижном положении по сравнению с его вязкостью при перемешивании. Эксципиентами этого типа являются природные полимеры, такие как аравийская камедь, трагантовая камедь,агар-агар, альгинаты, пектины, или полусинтетические полимеры, например карбоксиметилцеллюлоза (Tylose С), метилцеллюлоза (Methocels A, Viscontrans MC, Tylose МН и MB), гидроксипропилцеллюлоза (Klucels) и гидроксипропилметилцеллюлоза (Methocels E и К, ViscontransMPHC). Обычно данные псевдопластические эксципиенты используются вместе с тиксотропными агентами. Альтернативными вязкими агентами, которые могут применяться, являются псевдопластические эксципиенты с низкой текучей способностью. Эти полимеры при достаточной концентрации способствуют появлению структурной организации жидкости, результатом чего является раствор с высокой вязкостью, имеющий низкую текучую способность при неподвижном положении. Для того чтобы раствор мог течь и перемещаться, системе необходимо сообщить определенное количество энергии. Для временного разрушения структурной организации жидкости с целью получения жидкого раствора, необходима внешняя энергия (перемешивание). Примерами таких полимеров являются Carbopols и ксантановая камедь. Тиксотропные эксципиенты формируют гелевую структуру при неподвижном положении, в то время как при перемешивании они образуют жидкий раствор. Примерами тиксотропных эксципиентов являются: Veegum (магний-алюминий силикат) и Avicel RC (около 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы). Применимо, если вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит вязкий агент,выбранный из ксантановой камеди или крахмала. Таким образом, обычно вакцинная композиция по настоящему изобретению входит в состав препарата с комбинацией карбоната кальция и ксантановой камеди. Другие подходящие компоненты композиции для применения в изобретении включают сахара,например сахарозу и/или лактозу. Вакцинная композиция согласно изобретению может содержать дополнительные компоненты,включая, например, корригенты (особенно для пероральной вакцины) и бактериостатические агенты. Предусмотрены различные представления вакцинной композиции согласно изобретению. В одном применимом воплощении вакцину вводят в виде жидкого препарата. Применимо, если жидкий препарат восстанавливают перед введением из по меньшей мере двух следующих компонентов: 1) вирусный компонент; 2) жидкий компонент. В данном воплощении вирусный компонент и жидкий компонент обычно находятся в отдельных контейнерах, которые могут для удобства представлять собой раздельные отделения одного сосуда или отдельные сосуды, которые могут быть соединены таким образом, чтобы восстановление конечной вакцинной композиции происходило без воздействия воздуха. Перед восстановлением вирус может находиться в сухой форме или в жидкой форме. Применимо, если вирусный компонент лиофилизован. Лиофилизованный вирус более стабилен, чем вирус в водном растворе. Лиофилизованный вирус может быть надлежащим образом восстановлен с помощью жидкой композиции антацидов для получения жидкого препарата вакцины. В качестве альтернативы лиофилизованный вирус может быть восстановлен с помощью воды или водного раствора, в таком случае применимо, если композиция лиофилизованного вируса содержит компонент,нейтрализующий кислоту. Применимо, если вакцинный препарат содержит вирусный компонент с карбонатом кальция и ксантановой камедью в одном отделении или сосуде, и его восстанавливают водой или водным раствором, находящимся во втором отделении или сосуде. В другом воплощении вакцинная композиция представляет собой твердый препарат, применимо, лиофилизованную лепешку, которая пригодна для непосредственного растворения при попадании в рот. Лиофилизованные препараты для удобства могут быть предложены в форме таблеток в-9 014328 фармацевтической блистерной упаковке. В другом аспекте согласно изобретению предложена ротавирусная вакцина в форме быстрорастворимых таблеток для перорального введения. В другом аспекте изобретение предлагает композицию, содержащую живой ослабленный ротавирусный штамм, более конкретно ротавирусный штамм человека, где композиция представляет собой лиофилизованную твердую фазу, способную к непосредственному растворению при попадании в рот. Применимо, если быстрорастворимая таблетка согласно изобретению растворяется во рту пациента достаточно быстро для предупреждения глотания нерастворенной таблетки. Данный подход особенно эффективен для педиатрических ротавирусных вакцин. Применимо, если вирус представляет собой живой ослабленный ротавирус человека, который входит в состав препарата с неорганическим антацидом, таким как карбонат кальция, и вязким агентом, таким как ксантановая камедь. В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен лиофилизованный препарат, где вирусный компонент представляет собой любой ротавирусный штамм, который входит в состав препарата с карбонатом кальция и ксантановой камедью. Вакцины по изобретению могут быть получены в виде препаратов и введены посредством известных методик, используя подходящее количество живого вируса для обеспечения эффективного иммунитета против ротавирусной инфекции без значительных нежелательных побочных эффектов у типичных вакцинируемых. Подходящее количество живого вируса обычно будет находиться в диапазоне от 104 до 107 бляшко-образующих единиц (БОЕ; ffu, focus forming unit) на дозу. Типичная доза вакцины может содержать 105-106 БОЕ на дозу и может быть введена несколькими дозами в течение периода времени, например двумя дозами, введенными с двухмесячным интервалом. Однако можно получить преимущество, если использовать более чем 2 дозы, например режим в 3 или 4 дозы, особенно в развивающихся странах. Интервал между дозами может быть больше или меньше,чем два месяца. Оптимальное количество живого вируса для одной дозы или для режима с многократными дозами и оптимальное расписание доз может быть уточнено с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение титров антител и других реакций у пациентов. Вакцина по изобретению может также содержать другие пригодные живые вирусы для защиты от других заболеваний, например, вирус полиомиелита. В качестве альтернативы другие пригодные живые вирусные вакцины для перорального введения могут быть введены отдельной дозой, но в то же время, что и ротавирусная вакцинная композиция согласно изобретению. Сыворотки от двенадцати детей в возрасте от 4 до 6 месяцев, вакцинированных материалом Р 33, были проанализированы на нейтрализацию Р 33, Р 38, Р 43 и 89-12 С 2, как описано в статье вVaccine (1998). Диапазон титров нейтрализующих антител всех проанализированных сывороток аналогичен для Р 33, Р 38 и Р 43. Статистический анализ не показывает значительной разницы в общих титрах нейтрализующих антител по отношению ко всем трем вирусам. Это предполагает, что конформационные и неконформационные нейтрализующие эпитопы Р 33, Р 38 и Р 43 одинаково хорошо распознаются анти-Р 33 сывороткой, полученной от детей, вакцинированных Р 33. Данное наблюдение непрямым образом предполагает, что нейтрализующие эпитопы, обнаруженные в этом анализе invitro, не различаются у Р 33, Р 38 и Р 43. Однако диапазон титров нейтрализующих антител для Р 89-12 С 2 значительно отличается от Р 33, Р 38 и Р 43. Данное наблюдение предполагает, что конформационные и неконформационные нейтрализующие эпитопы Р 33, Р 38 и Р 43 неодинаково хорошо распознаются анти-Р 33 сывороткой,полученной от детей, вакцинированных Р 33. Данное наблюдение непрямым образом предполагает,что нейтрализующие эпитопы, обнаруженные в этом анализе in vitro, различаются у 89-12 С 2 и у Р 33, Р 38 и Р 43. Особенно применимые воплощения настоящего изобретения включают: 1. Применение ослабленного ротавирусного штамма Р типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавируса Р типа, отличного от того, который использовался в указанной вакцинной композиции. 2. Применение ослабленного ротавирусного штамма Р[8] типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавируса, не относящегося к Р[8]. 3. Применение ослабленного ротавирусного штамма G1P[8] типа в изготовлении вакцинной композиции для индукции иммунного ответа против ротавируса, не относящегося к G1P[8]. 4. Применение по пп.1-3, где иммунный ответ дополнительно индуцируют против инфекции,вызванной ротавирусом G1P[8] типа. 5. Применение по пп.1-4, где иммунный ответ индуцируют против двух или более серотипов ротавируса, данные серотипы определяют ссылкой на G или Р типы. 6. Применение по пп.1-5, где серотип вакцинного штамма является G1 серотипом, а не-G1 серотип выбирают из списка, состоящего из G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G10, G11, G12, G13 и G14.- 10014328 7. Применение по п.6, где иммунный ответ индуцируют как против G1 типа, так и против G2 типа. 8. Применение по любому из пп.1-5, где тип вакцинного штамма является типом Р[8], а не-Р[8] тип выбирают из списка, состоящего из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9] и Р[11] типов. 9. Применение по п.8, где иммунный ответ индуцируют как против Р[8], так и против Р[4] типов. 10. Применение по любому из пп.1-9, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген VP4,содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: основание аденин (А) в позиции 788, основание аденин (А) в позиции 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона. 11. Применение по п.10, где ген VP4 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую основание аденин (А) в позициях 788 и 802 и основание тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона. 12. Применение по п.11, где композиция содержит ротавирус, имеющий ген VP7, содержащий в нуклеотидной последовательности по меньшей мере одно из следующего: тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) в позиции 897 и гуанин (G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона. 13. Применение по п.12, где ген VP7 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую тимин (Т) в позиции 605, аденин (А) или гуанин (G) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона. 14. Применение по любому из пп.1-13, где композиция содержит ротавирус, имеющий генVP4, содержащий в нуклеотидной последовательности аденин (А) в позициях 788 и 802 и тимин (Т) в позиции 501, начиная с инициирующего кодона; и где ген VP7 содержит в нуклеотидной последовательности тимин (Т) в позиции 605 и аденин (А) в позиции 897, начиная с инициирующего кодона. 15. Применение по любому из пп.1-14, где композиция способна ослаблять или защищать от гастроэнтерита и/или диареи, вызванных заражением ротавирусом типа, определяемого посредством ссылки на G и/или на Р тип и отличного от типа ослабленного ротавируса, присутствующего в композиции. 16. Применение по п.15, где композиция является по меньшей мере на 40% защитной в популяции лиц, прошедших вакцинацию, по отношению к тяжелому гастроэнтериту, вызванному заражением ротавирусами по меньшей мере двух штаммов, определенных посредством ссылки на G и/или Р тип, данные типы отличаются от G1P[8] типа ослабленного ротавируса, присутствующего в композиции. 17. Применение по п.16, где тяжелый гастроэнтерит вызван заражением ротавирусом по меньшей мере трех, по меньшей мере четырех не-G1 серотипов. 18. Применение по п.17, где не-G1 серотипы являются серотипами G2, G3, G4 и G9. 19. Применение по п.18, где тяжелый гастроэнтерит вызван заражением ротавирусом по меньшей мере двух не-Р[8] типов. 20. Применение по п.9, где тяжелый гастроэнтерит вызван заражением ротавирусом Р[4] типа. 21. Применение по любому из пп.1-20, где штамм ротавируса представляет собой штамм, депонированный в ЕСАСС под номером 99081301, или получен из этого штамма, или является производным от штамма, депонированного в ЕСАСС под номером 99081301. 23. Применение по любому из пп.1-20, где вакцину применяют в 2-дозовом режиме. В другом аспекте изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа против ротавирусной инфекции, вызванной штаммом ротавируса, который включает введение пациенту композиции, содержащей ослабленную ротавирусную вакцину, полученную из другого штамма. Более конкретно, изобретение относится к способу индукции иммунного ответа против ротавируса одного Р типа и/или для предупреждения заболевания, связанного с инфекцией, вызванной ротавирусом одного Р типа, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту ослабленной ротавирусной популяции другого Р типа. В определенном аспекте изобретения предложен способ индукции иммунного ответа против ротавируса Р[8] типа и по меньшей мере одного из не-Р[8] типов, выбранных из группы, состоящей из Р[1], Р[2], Р[3], Р[4], Р[5], Р[6], Р[7], Р[9], Р[11], Р[12], Р[14] и Р[19], применимо против ротавируса типа Р[4], причем способ включает введение пациенту композиции, содержащей вакцину ротавируса типа Р[8]. В другом аспекте изобретения предложена 1) изолированная последовательность неструктурного белка 4 NSP4, non-structural protein 4), как изображена в фиг. 5 SEQ ID NO:7), или ее иммуногенный фрагмент; 2) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид NSP4, или ее иммуногенный фрагмент; 3) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как изображено в фиг. 6 (SEQ ID NO:8). В еще одном аспекте изобретения предложена 1) изолированная последовательность ротави- 11014328 русного белка 6 (VP6), как изображена в фиг. 7 (SEQ ID NO:9), или ее иммуногенный фрагмент; 2) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид VP6, или ее иммуногенный фрагмент; 3) изолированная полинуклеотидная последовательность, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как изображено в фиг. 8 (SEQ ID NO:10). Иммуногенные фрагменты можно определить в контексте данного изобретения, как фрагменты, которые при введении в эффективной дозе (либо по отдельности, либо в виде гаптена, связанного с носителем) вызывают защитный иммунный ответ против ротавирусной инфекции. Следующие не ограничивающие примеры иллюстрируют изобретение. Примеры Пример 1. Демонстрация того, что штамм 89-12 на пассаже 26 (Р 26) представляет собой смесь вариантов. Секвенирование генов VP4 и VP7 из партий, прошедших различное число пассажей. Было выполнено секвенирование генов VP4 и VP7 из пассажа Р 26 (первичные клетки AGMK),пассажа Р 33 (постоянная (в отличие от первичной) клеточная линия AGMK), пассажа Р 41 и пассажа Р 43. Для всего экстракта РНК была проведена обратная транскрипция и амплификация посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) в одной пробирке/одной стадии. Для амплификации целого гена VP4 использовали праймеры Rota 5bis и Rota 29bis, и для амплификации целого гена VP7 использовали праймеры Rota 1 и Rota 2bis. Материал ПЦР был секвенирован с использованием различных праймеров (см. табл. 1). Последовательность пассажа Р 26 отличалась от последовательности пассажа Р 33 на 3 основания (в позициях 501, 788 и 802 пар оснований от инициирующего кодона) в VP4 и на три основания в VP7 (108, 605 и 897 пара оснований от инициирующего кодона). Сканограммы последовательности пассажа Р 26 для VP4 и VP7 демонстрируют наличие последовательности пассажа Р 33 в качестве фона в позициях с мутациями. Таким образом, можно увидеть, что пассаж Р 26 представляет собой смесь по меньшей мере 2 вариантов. Сканограммы последовательности пассажа Р 33 представляются гомогенными для VP4 и гетерогенными для VP7 (см. табл. 2). Пассаж Р 38 (полученный от пассажа 33) прошел 5 перепрививаний в клетках Vero и демонстрировал тот же набор последовательностей VP4 и VP7, что и пассаж Р 33 (клеточная линия AGMK). Следовательно, не было больших изменений в популяциях между Р 33 и Р 38. Таблица 1. Олигонуклеотиды, используемые для ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) и секвенирования Основания, выделенные жирным в табл. 2, являются сайтами специфической вариации последовательности в VP4 и VP7. Таблица 3. Вариация последовательности генов VP4 и VP7 Таблица 3.1 Примечание: Во втором клоне из 3 клонов, которые были развиты до уровня производственной партии, нуклеотидом в позиции 897 п.о. VP7 является G, в отличие от А в выбранном клоне Р 43. Это приводит к появлению метионина вместо изолейцина в аминокислотной последовательности. Варианты, соответствующие как выбранному Р 43 клону, так и клону, в котором в позиции 897 п.о. от инициирующего кодона в VP7 находится G, выделялись в кале детей, которые были вакцинированы материалом Р 33. В табл. 3.1, в местах, где имеются два альтернативных основания в определенной позиции,первое из двух представляет собой основание, которое имеется у большей популяции, а второе представляет собой основание, которое имеется у меньшей популяции. О популяциях с основным и минорным вариантом судят по силе сигнала при секвенировании. Таблица 3.2 демонстрирует аминокислотные замены в результате разницы в нуклеотидах между вариантами. Таблица 3.2- 13014328 Слот-блот гибридизация Изменение в популяциях между пассажами Р 26 и Р 33 в клетках AGMK было затем подтверждено посредством слот-блот гибридизации. Проводили гибридизацию фрагментов генов VP4 иVP7, полученных с помощью ПЦР с обратной транскрипцией, с олигонуклеотидными зондами, специфичными для каждого варианта (см. табл. 3.1 и 3.1). В отличие от Р 26, для которого гибридизацию проводили с Rota 16, Rota 35 и Rota 36 и не с Rota 15, для ПЦР фрагмента VP4 материала Р 33 в позициях 788 и 802 гибридизация была возможна только с Rota 16 и ни с Rota 15, ни с Rota 35, ни сRota 36. Эти результаты установили присутствие по меньшей мере 3 вариантов в Р 26 (см. табл. 4). Для ПЦР фрагмента VP7 материала Р 33 проводили гибридизацию позиции 897 с Rota 41 и Rota 42. Эти результаты установили присутствие по меньшей мере двух вариантов в материале Р 33. Пример 2. Выделение и характеристика клона Р 43. Для выделения компонентов Р 33 в виде гомогенной вирусной популяции было выполнено три конечных разведения P33/AGMK в клетках Vero, и полученный вирус был использован для инфицирования клеток Vero. Положительные лунки отбирали, используя два критерия: рост, демонстрируемый наибольшим количеством фокусов, определяемых в лунках, и большинством выделенных положительных лунок на планшетах, как это выполняют классически. После трех пассажей с конечным разведением в 96-луночных планшетах 10 положительных лунок успешно амплифицировали в клетках Vero и оценили их на выход продукта. На основании выхода продукта три клона были доведены с помощью перепрививаний до уровня производственной партии. Было показано, что иммунологическое распознавание поликлональными антителами одинаково для всех трех клонов и для Р 33. Гомогенность клонов оценивали с помощью слот-блот гибридизации. Окончательный выбор единственного клона основывался на выходе продукта и на последовательности. Выбранный клон амплифицировали посредством успешных перепрививаний в клетках Vero для получения исходного посевного материала, рабочего посевного материала и, наконец, производственных партий. Для выбранного клона была проведена генетическая характеристика на разных стадиях перепрививания путем секвенирования VP4 и VP7 (идентичность) и путем специфичной слот-блот гибридизации VP4 и VP7 (гомогенность) из материалов после ПЦР амплификации. Последовательности генов VP4 и VP7 из материала Р 43 представлены в фиг. 1 и 2 соответственно и идентичны Р 41. Гомогенность выбранного клона оценивали посредством селективной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов, распознавая нуклеотидные замены в областях VP4 и/или VP7 для каждого варианта, идентифицированные во время секвенирования Р 26/первичных клетокAGMK (см. табл. 4). Гибридизация фрагмента VP4 была возможна с Rota 16 и не с Rota 15, Rota 35 или Rota 36. Гибридизация фрагмента VP7 была возможна с Rota 41 и не с Rota 42. Данные результаты подтверждают, что Р 43 представляет собой гомогенную популяцию. Пример 3. Удаление возможного адвентициального вируса. К Р 33 (выращенным AGMK) добавляли эфир в конечной концентрации 20% на 1 ч. Затем эфир насыщали N2 в течение 35 мин. Не наблюдалось никакого эффекта на титр посевного материала Р 33. Пример 4. Приготовление препарата живой ослабленной вакцины. На основе производственных партий, описанных выше, получали препарат для перорального введения детям с помощью следующего метода. 1. Лиофилизированный вирус. Для получения доз вируса используют стандартные методики. Массу замороженного очищенного вируса оттаивают и разводят с помощью композиции соответствующей среды, в данном случае модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, до желательной стандартной концентрации вируса, в данном случае до 106.2 БОЕ/мл. Разведенный вирус затем разводят далее стабилизатором для лиофилизации (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до целевого титра вируса, в данном случае до 105.6 БОЕ/дозу. 0,5 аликвот композиции стабилизированного вируса асептически переносят в 3 мл пробирки. Каждую пробирку затем частично закрывают резиновой крышкой, пробу сушат при низкой температуре в вакууме, затем пробирку полностью закрывают и запечатывают алюминиевой крышкой вокруг пробирки для фиксации резиновой крышки. Для применения вирус восстанавливают с помощью одного из следующих антацидов.(а) Цитратный восстановитель. Цитрат натрия растворяют в воде, стерилизуют путем фильтрации и асептически переносят в контейнеры для восстановителя в 1,5 мл объемах при концентрации 544 мг Na3 Цитрат 2 Н 2 О на 1,5 мл дозу. Контейнеры для восстановителя могут представлять собой, например, 3 мл пробирки, или 4 мл пробирки, или 2 мл шприцы, или мягкие пластиковые выдавливаемые капсулы для перорального введения. В качестве альтернативы для поддержания стерильных компонентов в стерильных условиях конечный контейнер может быть автоклавирован.(б) Al(OH)3 восстановитель. Асептическую суспензию гидроксида алюминия (Mylanta - торговая марка) асептически разводят в стерильной воде, асептически переносят в контейнеры для восстановителя (например, 2 мл шприцы или мягкие пластиковые выдавливаемые капсулы) в 2 мл объемах, каждый содержит 48 мгAl(OH)3. Альтернативой использования стерильных компонентов в стерильных условиях является облучение суспензии гидроксида алюминия (предпочтительно на стадии после разведения). Для предупреждения осаждения суспензии включают стандартные ингредиенты. Такие стандартные ингредиенты включают, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и силиконовые полимеры. Также могут быть включены бактериостатические агенты, например, бутилпарабен, пропилпарабен или другие стандартные бактериостатические агенты, используемые в пище, и корригенты. 2. Лиофилизированный вирус с Al(OH)3 в жидком препарате. Для получения доз вируса используют стандартные методики. Массу замороженного очищенного вируса оттаивают и разводят с помощью композиции соответствующей среды, в данном случае модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, до желательной стандартной концентрации вируса, в данном случае до 106.2 БОЕ/мл. Добавляют суспензию гидроксида алюминия до достижения конечной концентрации 48 мг/дозу и композицию вируса разводят стабилизатором для лиофилизации (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до целевого титра вируса, в данном случае до 105.6 БОЕ/дозу. 0,5 аликвот композиции стабилизированного вируса асептически переносят в 3 мл пробирки. Лиофилизацию и закупорку пробирок производят так, как описано в части 1. 3. Лиофилизированный вирус с Al(OH)3 для блистерного представления. Для получения доз вируса используют стандартные методики. Массу замороженного очищенного вируса оттаивают и разводят с помощью композиции соответствующей среды, в данном случае модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, до желательной стандартной концентрации вируса, в данном случае до 106.2 БОЕ/мл. Добавляют суспензию гидроксида алюминия до достижения конечной концентрации 48 мг/дозу и композицию вируса разводят стабилизатором для лиофилизации, который может представлять собой сахарозу, декстран или 4% аминокислоту, или желатин, или растительный пептон, или ксантан до целевого титра вируса 105.6 БОЕ/дозу. Для переноса доз в 0,5 мл или предпочтительно меньше в углубления блистера применяют асептическую операцию наполнения. Производят лиофилизацию композиции, и углубления блистера запечатывают с помощью термического запечатывания. Возможно включение стандартных ингредиентов для предупреждения осаждения суспензии гидроксида алюминия. Такие стандартные ингредиенты включают, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и силиконовые полимеры. Также могут быть включены корригенты. Пример 5. Вирусная титрация ротавируса для различных препаратов. 5.1. Сравнение препаратов на основе лактозы и сахарозы. Таблица 5 Препарат ротавируса Р 43 получали либо с сахарозой, либо с лактозой, как показано в таблице выше. Титрация вируса до лиофилизации представляет собой титр вируса в законченном жидком препарате (содержащем сахарозу, декстран, сорбит, аминокислоты) без стадии лиофилизации. Хорошими результатами являются такие, где достигается 0,5 log снижение на стадии лиофилизации и 0,5 log снижение в течение "1 недели при 37 С" (тест на стабильность в форсированных условиях). Точность титрации вируса составляет около + или - 0,2 log.- 15014328 Результаты показывают, что сахароза может применяться вместо лактозы. 5.2. Эффект аргинина и замены сорбита на мальтит. Таблица 6 Результаты демонстрируют, что добавление аргинина (который известен тем, что улучшает стабильность вируса при лиофилизации и также обеспечивает основную среду с целью компенсации кислотности желудка) поддерживает титр вируса. Сорбит имеет тенденцию в значительной степени снижать температуру стеклования лиофилизованной лепешки. Это можно преодолеть посредством использования мальтита вместо сорбита,как показано выше, при чем также поддерживается титр вируса. 5.3. Композиции различных препаратов. Данные эксперименты демонстрируют тот факт, что возможен целый ряд препаратов.Al(OH)3 использовали в качестве антацида. Данные показывают, что ротавирус взаимодействует с нерастворимой неорганической солью (Al(OH)3), поскольку он осаждался вместе с Al(OH)3(снижение активности вируса в надосадочной жидкости). 5.5. Растворение антацида Al(OH)3 в цитрате натрия перед титрованием вируса. Таблица 9 При взаимодействии ротавируса с Al(OH)3 возможна полная лиофилизация (включая Al(OH)3). После лиофилизации можно восстановить ротавирус посредством растворения Al(OH)3 в цитрате натрия. Данная стадия не повреждает ротавирус и сохраняет его активность после стадии растворения. 5.6. Инфекционность ротавируса после высвобождения из связи Al(OH)3-ротавирус. Механизм высвобождения вируса (посредством растворения носителя) может успешно происходить in vivo. Действительно, гидроксид алюминия становится полностью растворимым при рН ниже 6, и, таким образом, ротавирус может высвобождаться в желудке.regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999),58, 147-153). В кишечнике вследствие повышения уровня рН нерастворимые формы алюминия выпадают в осадок (Al(OH)3 или AlPO4) и удаляются естественным способом. Неизвестно, будет ли способен вновь образованный осадок Al(OH)3 (или AlPO4) на повторное взаимодействие со свободным ротавирусом. Это рождает вопрос об инфекционности самого комплекса Al(OH)3-ротавирус. Высвобождение ротавируса из комплекса Al(OH)3-ротавирус с помощью других механизмов- 18014328 также возможно. Лизин, например, препятствует адсорбции вируса на Al(OH)3. Известно, что другие анионы, такие как борат, сульфат, карбонат и фосфат, специфично адсорбируются на гидроксиде алюминия, таким образом, теоретически должна иметься возможность заместить (посредством конкуренции за сайты адсорбции) ротавирус в комплексе Al(OH)3-ротавирус. Таким образом, ротавирус может высвобождаться из комплекса Al(OH)3-ротавирус, и высвобожденный ротавирус сохраняет активность. Данное высвобождение может осуществляться либо посредством растворения Al(OH)3 с помощью HCl в желудке или с помощью Na3 Цитрата in vitro, либо посредством замещения ротавируса основной аминокислотой (лизином). 5.7. Инфекционность комплекса Al(OH)3-ротавирус. Одну дозу лиофилизованного ротавируса восстанавливали водой и разделяли на две части. В первую часть, считаемую контрольной, добавляли дополнительный объем воды. Во вторую часть добавляли 24 мг Al(OH)3, взвешенного в 0,240 мл воды (Доклинические титрования вируса). В присутствии Al(OH)3 ротавирус активен, и титр вируса выше по сравнению с контрольным образцом. Этот эксперимент был повторен без разделения лиофилизованной дозы с добавлением 12 мгAl(OH)3 или 24 мг Al(OH)3. Здесь контрольным образцом являлся образец, восстановленный с помощью цитратнобикарбонатного буфера. Таким образом, титр вируса снова был выше в присутствии Al(OH)3. Как в примере выше, ротавирус взаимодействует с частицами Al(OH)3, так как вирус удаляется при центрифугировании. DRVC003A46 представляет собой лиофилизованный препарат ротавирусаSDSAA = сахароза 2%, декстран 4%, сорбит 3%, аминокислоты 2%. В соответствии с титрованием вируса, проведенным для надосадочной жидкости, оказывается,что необходимо малое количество Al(OH)3 для адсорбции ротавируса (начиная с одной лиофилизованной дозы 5,7 log, постепенно повышая титр вируса): Таблица 10 Представляется, что для адсорбции ротавируса на Al(OH)3 необходим небольшой период вре- 20014328 мени. Одну дозу лиофилизованного ротавируса восстанавливали в присутствии 24 мг Al(OH)3 и центрифугировали через 0, 15, 60 мин и 24 ч. "Осадок" повторно суспендировали в SDSAA перед титрованием вируса. Таблица 11 5.8. Применение CaCO3 в качестве антацида. С целью избежать присутствия алюминия в вакцине антацид Al(OH)3 заменили другой нерастворимой неорганической солью: CaCO3 (карбонат кальция). Явления, наблюдаемые с CaCO3, соответствуют явлениям, описанным для Al(OH)3: взаимодействие ротавируса с неорганической солью; сохранение активности ротавируса при взаимодействии с неорганической солью; возможность высвобождения ротавируса из комплекса путем растворения неорганического основания кислотой; возможность совместной лиофилизации антацида и ротавируса. Взаимодействие CaCO3 и ротавируса В первом исследовании лиофилизованный ротавирус (титр вируса 5,7) восстанавливали с помощью суспензии CaCO3 в воде (50 мг в 1,5 мл); затем центрифугировали и сравнивали титры вируса в надосадочной жидкости и осадке. Это свидетельствует о том, что более 90% ротавируса связывается с CaCO3. Также после взаимодействия с вирусом было возможно выполнить титрование и восстановить изначальное количество вируса. Также титры вирусы немного выше, чем получаемые без CaCO3. Величина взаимодействия CaCO3 и ротавируса Лиофилизованный ротавирус восстанавливали с помощью суспензии CaCO3 в воде (1,5 мл): 10 мг; 50 мг;- 21014328 100 мг и затем центрифугировали и сравнивали титры вируса в надосадочной жидкости и осадке. Таблица 12 Таким образом, очевидно, что чем больше СаСО 3, тем больше вируса взаимодействует и тем меньше вируса обнаруживается в надосадочной жидкости. Однако полная доза не восстанавливается полностью (ожидалось по меньшей мере всего 5,3 или даже 5,8, как получали ранее - см. выше). Защита ротавируса CaCO3 во время титрования антацида, по методу Rossette-Rice,имитирующему детский желудок Было выполнено два типа титрования по методу Rossette-Rice, имитирующему детский желудок, с использованием 10 доз лиофилизованного ротавируса (DRVC003A46) и 50 мг CaCO3. В классическом титровании по методу Rossette-Rice, антацид смешивают с ротавирусом и наливают в данную смесь HCl. В "обратном" титровании по методу Rossette-Rice, имитирующему детский желудок, ситуация обратная: антацид по капле добавляют в объем HCl (как это происходит in vivo). Таблица 13 Таким образом, в данном эксперименте in vitro, карбонат кальция способен защищать около 20% ротавируса от присутствия HCl, в то время как гидроксид алюминия неспособен на это. 5.9. Лиофилизация ротавируса в присутствии антацида СаСО 3. Таблица 14 Это представляет собой "все в одном" - лиофилизацию ротавируса и антацида (CaCO3) вместе в одной пробирке. Для предупреждения осаждения CaCO3 во время стадии наполнения необходимы вязкие агенты. Примеры таких вязких агентов включают ксантановую камедь и крахмал. Активность ротавируса сохраняется даже в присутствии ксантановой камеди и крахмала. 5.10. Лиофилизированные таблетки для быстрой дезинтеграции при попадании в рот. Следующие препараты демонстрируют концепцию "lyoc" (препараты, не требующие воды для растворения). Это означает быстрое растворение лиофилизованной лепешки во рту. В концепции "lyoc" могут применяться и ксантан, и крахмал (сохраняя свойства быстрого растворения лиофилизованной лепешки). Пример 6. Применение карбоната кальция в качестве антацида для ротавирусной вакцинной композиции. При применении суспензии CaCO3 в воде в качестве антацида для ротавируса возникает проблема, состоящая в том, что частицы карбоната кальция быстро осаждаются при попадании в воду,поскольку величина плотности порошка приближается к 2,6, а средний размер частиц составляет 30 мкм. Это осаждение может быть замедлено с помощью: 1) увеличения плотности окружающей среды; 2) увеличения вязкости окружающей среды; 3) снижения размеров частиц; 4) удержания частиц на расстоянии друг от друга. 6.1. Увеличение плотности окружающей среды. При попадании суспензии CaCO3-вода (при нахождении в шприце) на лиофилизованную лепешку (содержащую сахарозу 2%, декстран 4%, сорбит 3%, аминокислоты 2%) плотность окружающей среды увеличивается, но скорость осаждения CaCO3 незначительно отличается по сравне- 24014328 нию с суспензией CaCO3-вода. 6.2. Увеличение вязкости окружающей среды. Псевдопластические эксципиенты Псевдопластический раствор определяют, как раствор, имеющий более высокую вязкость в неподвижном положении по сравнению с его вязкостью при перемешивании. Обычными эксципиентами этого типа являются природные полимеры, например аравийская камедь, трагантовая камедь, агар-агар, альгинаты, пектины; полусинтетические полимеры, например карбоксиметилцеллюлоза (Tylose С), метилцеллюлоза (Methocels A, Viscontrans MC, Tylose МН и MB), гидроксипропилцеллюлоза (Klucels), гидроксипропилметилцеллюлоза (Methocels E и K, Viscontrans МРНС). Обычно данные псевдопластические эксципиенты используются вместе с тиксотропными агентами. Псевдопластические эксципиенты с низкой текучей способностью Эти полимеры при достаточной концентрации способствуют появлению структурной организации жидкости, результатом чего является раствор с высокой вязкостью, имеющий низкую текучую способность при неподвижном положении. Для того чтобы раствор мог течь и перемещаться,системе необходимо сообщить определенное количество энергии. Для временного разрушения структурной организации жидкости с целью получения жидкого раствора необходима внешняя энергия (перемешивание). Примерами таких полимеров являются Carbopols и ксантановая камедь. Тиксотропные эксципиенты С помощью этих эксципиентов формируется гелевая структура при неподвижном положении,в то время как при перемешивании образуется жидкий раствор. Примерами тиксотропных эксципиентов являются: Veegum (магний-алюминий силикат) иAvicel RC (около 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы). 6.3. Снижение размеров частиц. Снижение размеров частиц CaCO3 приводило к снижению способности соединения к нейтрализации кислоты. 6.4. Удержание частиц на расстоянии друг от друга. Это имеет место для Veegum и Avicel, где нерастворимые частицы меньше (около 1 мкм),чем частицы CaCO3, помещают между частицами CaCO3 с целью предупреждения агрегации. Пример 7. Дизайн продукта. Следующие схемы демонстрируют примеры возможных дизайнов продукта. 7.1. CaCO3 в шприце. Имея клинические партии лиофилизованного ротавируса в пробирках, можно поместить антацид в жидкость для восстановления, содержащуюся в шприце. В данном представлении продукта осаждение CaCO3 должно находиться под контролем не только во время стадий наполнения, но также в течение всего срока хранения продукта (по меньшей мере 2 года). 7.2. CaCO3 в лиофилизованной пробирке. 7.3. Лиофилизация в блистере. В данном случае проводят совместную лиофилизацию ротавируса, CaCO3 и ксантановой камеди непосредственно в блистере. Пример 8. Лиофилизация различных штаммов ротавируса. Таблица 16 Штаммы DS-1, Р и VA70 описаны, как эталонные штаммы ротавируса человека для серотиповG2, G3 и G4 соответственно на странице 1361 "Fields" Raven press 1990, второе издание. В данном эксперименте различные штаммы ротавируса были лиофилизованы. Для всех штаммов было показано сохранение титра вируса во время лиофилизации и в тесте на стабильность при форсированных условиях (одна неделя при 37 С). Пример 9. Исследование безопасности I фазы одного перорального введения ротавирусной вакцины у взрослых. Было выполнено исследование I фазы для оценки безопасности и реактогенности единичной пероральной дозы в 106.0 БОЕ вакцины Р 43 у взрослых здоровых людей в возрасте от 18 до 45 лет. Клиническое исследование было двойным слепым и рандомизированным. Оно было плацебоконтролируемым и независимым. Исследование проводили в одном центре в Бельгии. 9.1. Исследуемая популяция. Всего в исследование было включено 33 пациента, 11 в группу плацебо и 22 в группу вакцины,и все пациенты завершили исследование. Все добровольцы были белой расы. Их средний возраст в момент вакцинации составлял 35,3 года, в диапазоне от 18 до 44 лет. Исследование началось в январе и продолжалось только в течение одного месяца. 9.2. Материал. Вакцина. Были произведены, очищены, сформированы в препараты и лиофилизованы клинические партии вакцины Р 43 в соответствии с надлежащей производственной практикой. Партии прошли контроль качества и получили гарантию качества. Каждый флакон вакцины содержал следующие ком- 26014328 поненты: Активный ингредиент: Эксципиенты, стабилизаторы: Плацебо. Флаконы плацебо были подготовлены и выпущены. Каждый флакон плацебо содержал следующие компоненты. Эксципиенты, стабилизаторы: Разбавитель. В качестве разбавителя для восстановления вакцины и плацебо использовали воду для инъекций. 9.3. Введение. Примерно за 10-15 мин до введения вакцины или плацебо пациентам обоих групп давали 10 млMylanta перорально. Mylanta представляет собой зарегистрированный антацид. Антацид повышает уровень рН желудка и предупреждает инактивацию ротавируса во время его прохождения через желудок. Для получения вакцины 2 флакона лиофилизованного Р 43, содержащих 105.8 БОЕ на флакон были восстановлены с помощью 1,5 мл воды для инъекций в качестве разбавителя. Таким образом достигался вычисленный титр вируса 106.1 БОЕ на дозу. Восстановленную вакцину немедленно вводили в виде единичной пероральной дозы. Для получения плацебо два флакона лиофилизованного плацебо восстанавливали с помощью 1,5 мл воды для инъекций и вводили перорально в качестве единичной дозы. 9.4. Безопасность и реактогенность. Применяли следующие критерии безопасности и реактогенности. Ожидаемыми общими симптомами были лихорадка, диарея, рвота, тошнота, боль в области живота и потеря аппетита. Их регистрировали в течение восьми дней после введения. Неожидаемые симптомы регистрировали в течение 30 дней после введения. Серьезные нежелательные явления регистрировали в течение всего периода исследования. Забор образцов диареи должен был осуществляться в течение восьми дней после введения. Результаты. Во время соответствующих периодов наблюдения не было получено сообщений об ожидаемых симптомах, о неожидаемых симптомах и о серьезных нежелательных явлениях. Не было получено сообщений о случаях диареи. 9.5. Заключения. Р 43 вакцина SB Biologicals была безопасной по сравнению с плацебо при пероральном введении двойным слепым образом в виде единичной дозы в дозе 106.1 БОЕ здоровым взрослым добровольцам в возрасте от 18 до 44 лет. Пример 10. Эффективность двух доз моновалентной вакцины ротавируса человека, содержащей RIX4414, в предупреждении гастроэнтерита, вызванного ротавирусом G1 и не-G1 (G9). 10.1. Методы. Было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование II фазы в Латинской Америке для оценки защитной эффективности вакцины (штамм ротавируса человека RIX4414), полученной на основе штамма человека G1P[8] 89-12, для иммунизации детей. Вакцина RIX4414 содержит в качестве ротавирусного компонента ослабленный штамм человекаG1P[8], хранящийся в ЕСАСС под номером 99081301 (WO 01/12797). Вакцинная композиция (табл. 17) Вакцину HRV или плацебо подготавливали для введения путем инъекции всего содержимого одного предварительно заполненного шприца, содержащего буфер карбоната кальция, во флакон с лиофилизованным продуктом (вакциной или плацебо). Флакон встряхивали для повторного суспендирования вакцины/плацебо. Весь объем повторно суспендированного продукта извлекали в этот же шприц, удаляли иглу и повторно суспендированный продукт немедленно вводили в виде единичной- 27014328 пероральной дозы (примерно 1,0 мл). Таблица 17. Вакцинная композиция ротавируса RIX4414 Введение вакцины Здоровые дети в возрасте от 2 до 4 месяцев получали две дозы вакцины RIX4414-ротавируса при концентрации вируса 105.8 БОЕ на дозу (493) или плацебо (504) совместно с вакцинами DTP-wHBV (дифтерия-столбняк-коклюш, гепатит В) и Hib (Haemophilus influenzae тип b). Три дозы OPV(пероральная вакцина против вируса полиомиелита) давали с промежутком в 2 недели от введения исследуемой вакцины, т.е. их введение не должно было происходить во время периода, начинающегося с 2 недель до введения каждой дозы исследуемой вакцины и заканчивающегося через 2 недели после введения. Две другие группы получали 2 дозы вакцины PIX4414-ротавируса при различных концентрациях вируса: 104.7 БОЕ и 105.2 БОЕ. Образцы диареи тестировали на присутствие ротавируса (иммуноферментным анализом, ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) и серотипы, определяемые в положительных образцах (ПЦР с обратной транскрипцией). Сообщения об эпизодах диареи, начиная с двух недель после второй дозы, учитывали в анализе эффективности. Интенсивность определяли, используя 20-балльную шкалу (Ruuska and Vesikari, 1990). 20-балльную оценочную систему использовали для оценки интенсивности каждого эпизода диареи в данном исследовании, как показано ниже в табл. 18. Тяжелое заболевание определяли баллом 11. Таблица 18 Оценивали самую высокую зарегистрированную температуру. 10.2. Результаты. Промежуточный анализ эффективности выполняли для вышеупомянутой группы, и выделенными серотипами в основном были G1 и G9, распределенные почти равномерно. Общий уровень приступов в группе плацебо варьировал от 4,8% для G1 до 3,6% для G9 в течение 6-месячного периода наблюдения. Две дозы ротавирусной вакцины RIX4414 по 105.8 БОЕ защищали от всех типов диареи, вызванной G1 с эффективностью 83% [95% CI: 50,4-95,7] и от всех тяжелых гастроэнтеритов с эффективностью 92,1% [95% CI: 47,6-99,9]. Если диарея была вызвана G9, эффективность защиты от всех типов диареи составляла 60,2% [95% CI: 0,2-86,0] и 80,8% [95% CI: 33,0-96,4] от тяжелых гастроэнтеритов. Для каждого из этих критериев эффективности (любые и тяжелые случаи дляG1 и G9) наблюдалось статистически значимое уменьшение количества эпизодов диареи в группеHRV по сравнению с группой плацебо (р 0,05, двусторонний точный критерий Фишера). Результаты, полученные в двух других группах вакцины (с другими концентрациями ротавируса), соответствуют приведенным в примере и представлены в окончательном анализе (пример 11). Также были проанализированы данные по эффективности для G2, G3 и G4. Из данного исследования не было сделано выводов о перекрестном иммунитете G2, G3 и G4, так как были получены сообщения о слишком малом числе случаев. Однако данные по эффективности по отношению к G2,G3 и G4 представлены в окончательном анализе для более важного размера выборки (пример 11). 10.3. Заключение. Данные результаты в высокой степени подтверждают эффективность 2 доз моновалентнойHRV вакцины, ротавирусной вакцины RIX4414, в создании иммунитета у маленьких детей против штамма G1 и перекрестного иммунитета против штамма G9. Пример 11. Эффективность двух доз моновалентной вакцины ротавируса человека, содержащей штамм RIX4414, при введении с тремя различными концентрациями вируса в предупреждении гастроэнтерита, вызванного ротавирусом G1 и не-G1 (G2, G3, G4, G9). 11.1 Методы. Было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование II фазы в Латинской Америке для оценки защитной эффективности и эффективности по отношению к госпитализации вакцины, полученной на основе штамма человека G1P[8] 89-12, для иммунизации детей. Более конкретно используемая вакцина называется ротавирусная вакцина RIX4414 и содержит в качестве ротавирусного компонента ослабленный штамм человека G1, хранящийся в ЕСАСС под номером 99081301. Здоровые дети получали две дозы ротавирусной вакцины RIX4414 с использованием трех различных концентраций вируса. Когорта для анализа эффективности состояла из 1846 субъектов (468 субъектов в группе HRV вакцины с концентрацией 104.7 БОЕ, 460 субъектов в группе HRV вакцины с концентрацией 105.2 БОЕ, 464 субъекта в группе HRV вакцины с концентрацией 105.8 БОЕ и 454 субъекта в группе плацебо) в возрасте от 2 до 4 месяцев, вакцину применяли совместно с вакцинамиDTPw-HBV и Hib. Три дозы OPV давали с промежутком в 2 недели от введения исследуемой вакцины, т.е. их введение не должно было происходить во время периода, начинающегося с 2 недель до введения каждой дозы исследуемой вакцины и заканчивающегося через 2 недели после введения. Образцы диареи тестировали на присутствие ротавируса (иммуноферментным анализом) и серотипы, определяемые в положительных образцах (ПЦР с обратной транскрипцией). Сообщения об эпизодах диареи, начиная с двух недель после второй дозы и до достижения пациентами одного года,- 29
МПК / Метки
МПК: A61K 39/15, A61P 31/14, A61P 1/00
Метки: иммунитет, вакцина, перекрестный, гетеротипический, индуцирующая, ротавирусная
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-14328-rotavirusnaya-vakcina-induciruyushhaya-geterotipicheskijj-perekrestnyjj-immunitet.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Ротавирусная вакцина, индуцирующая гетеротипический перекрестный иммунитет</a>
Аттенуированный рекомбинантный вирус герпеса крупного рогатого скота типа i, вакцина на его основе и способ выявления животных, которым была введена такая вакцина
Номер патента: 5736
Опубликовано: 30.06.2005
Автор: Чоудхари Шефикл И.
МПК: C12N 7/01, C12Q 1/70, A61K 39/265...
Метки: скота, рекомбинантный, введена, рогатого, типа, вакцина, способ, герпеса, такая, животных, основе, крупного, была, вирус, аттенуированный, выявления, которым
Формула / Реферат:
1. Аттенуированный рекомбинантный вирус герпеса крупного рогатого скота типа I, представляющий собой вирус герпеса крупного рогатого скота типа I, в котором часть нативной кодирующей области гликопротеина E удалена и заменена генетической вставкой, включающей кодирующую область чужеродного гена b-галактозидазы и немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека, при этом данный рекомбинантный вирус способен экспрессировать b-галактозидазу в...
Вакцина для иммунизации позвоночных против бруцеллеза, вакцина для профилактики или лечения позвоночных от бруцеллеза и способ получения вакцинного штамма, аттенюированный или авирулентный вариант штамма бактерий в. abortus rb51, способ профилактики или лечения позвоночных от бруцеллеза
Номер патента: 5234
Опубликовано: 30.12.2004
Авторы: Корбил Лайнетт, Бойл Стивен М., Шуриг Герхард Г., Краверо Сильвио, Срирнаганатан Наммалвар, Вемулапалли Рамеш
МПК: C12N 15/00, A61P 37/02, A61K 39/00...
Метки: против, вакцинного, позвоночных, бактерий, вариант, бруцеллеза, способ, аттенюированный, rb51, abortus, иммунизации, получения, авирулентный, лечения, штамма, вакцина, профилактики
Формула / Реферат:
1. Вакцина для иммунизации позвоночных против бруцеллеза, отличающаяся тем, что она содержит аттенюированный или авирулентный штамм бактерий рода Brucella, который способен к сверхэкспрессии по меньшей мере одного гомологичного антигена, кодируемого по меньшей мере одним геном бактерий рода Brucella, причем указанный антиген способен индуцировать защитный иммунный ответ против бруцеллеза. 2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что аттенюированный...
Вакцина для профилактики эхинококкоза животных
Номер патента: 6309
Опубликовано: 27.10.2005
Авторы: Шодмонов Иброим Шодмонович, Муминов Абдулло, Ахметсадыков Нурлан Нуралдинович, Уразбекова Дурия Сембековна
МПК: A61K 39/00, A61P 33/10
Метки: вакцина, профилактики, животных, эхинококкоза
Формула / Реферат:
Вакцина для профилактики эхинококкоза животных, включающая эффективное количество ферментативно расщепленных сколексов, жидкости и герментативной оболочки эхинококка с последующим гидролизом, отличающаяся тем, что в ее состав кроме сколексов входят иммуноадъювант геля (гидроокись алюминия) и формалин.
Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма сейбина вируса полиомиелита
Номер патента: 10057
Опубликовано: 30.06.2008
Авторы: Чавла Анил, Кумрадж Ганеш, Джаин Раджеш
МПК: A61K 39/13
Метки: полученная, полиомиелита, вируса, сейбина, инактивированная, полиомиелитная, штамма, вакцина
Формула / Реферат:
1. Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита, являющаяся трехвалентной или двухвалентной, содержащей смесь всех трех типов или смесь любых двух типов вируса полиомиелита, а именно типа 1, типа 2 и типа 3, полученная из основной массы моновалентной суспензии штамма Сейбина или суспензии исходного штамма Сейбина, используемых для смешивания трехвалентной или двухвалентной...
Живая аттенуированная антиротавирусная вакцина для перорального введения
Номер патента: 12046
Опубликовано: 28.08.2009
Автор: Ванде Вельде Винсент
МПК: A61K 39/15, A61P 1/00
Метки: антиротавирусная, аттенуированная, перорального, живая, введения, вакцина
Формула / Реферат:
1. Жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция, подходящая для перорального введения человеческому ребенку, содержащая ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет pH от примерно 5,0 до примерно 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата, где указанный карбоксилат (1) получен из карбоновой кислоты с pKa больше 4, или из дикарбоновой кислоты со средним pKa больше 4, или (2) выбран из группы, состоящей из адипата, малата,...
Предыдущий патент: Модифицированные полипропилениминовые дендримеры, содержащая их фармацевтическая композиция и их применение для лечения злокачественных опухолей
Следующий патент: Пиридинаминосульфонил-замещенные бензамиды в качестве ингибиторов цитохрома р450 3а4 (cyp3a4)
Случайный патент: Способ пропитывания древесины