Живая аттенуированная антиротавирусная вакцина для перорального введения

012046 Область техники Настоящее изобретение относится к новым жидким антиротавирусным препаратам, которые полезны в качестве фармацевтических композиций и вакцин, к способу их получения и к их применению для предупреждения ротавирусных, в частности ассоциированных с ротавирусом, заболеваний человека. Технические предпосылки Острая, инфекционная диарея является главной причиной заболевания и смерти во многих областях мира. В развивающихся странах влияние диарейного заболевания является очень важным. Для Азии,Африки и Латинской Америки оценили, что каждый год регистрируют от 3 до 4 биллионов случаев диареи и примерно 5-10 миллионов из этих случаев приводят к смерти (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med.,301:967-974 (1979. Ротавирусы признаны в качестве одной из наиболее важных причин тяжелой диареи у детей грудного и младшего возраста (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition,edited by Fields at al., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Оценивают, что ротавирусное заболевание ответственно за более чем 600000 смертей ежегодно. Болезнь, индуцированная ротавирусами, чаще всего поражает детей в возрасте от 6 до 24 месяцев, и максимальная распространенность заболевания обычно наблюдается во время более холодных месяцев в умеренных климатах и круглогодично в тропических областях. Ротавирусы типично передаются от человека человеку фекально-оральным путем с инкубационным периодом от примерно 1 до примерно 3 суток. В отличие от инфекции в 6-24-месячной возрастной группе новорожденные обычно не обнаруживают симптомов заболевания или у них наблюдается лишь легкое заболевание. В отличие от тяжелого заболевания, с которым обычно сталкиваются дети младшего возраста, большинство взрослых защищены в результате предшествующей ротавирусной инфекции, поэтому большинство инфекций у взрослых являются легкими или бессимптомными (Offit, P.A.et al. Comp. Ther, 8(8):21-26, 1982). Ротавирусы являются сферическими, и их название происходит от их характерной наружной и внутренней, или двухслойной структуры капсида. Типично, двухслойная структура капсида ротавируса окружает внутреннюю белковую оболочку или сердцевину, которая содержит геном. Геном ротавируса состоит из 11 сегментов двухцепочечной РНК, которые кодируют по меньшей мере 11 индивидуальных вирусных белков. Два из этих вирусных белков, обозначенные как VP4 (Р-белок) и VP7 (G-белок), представляют собой структурные белки, расположенные на наружной поверхности двухслойной структуры капсида. Внутренний капсид ротавируса представлен одним белком, который представляет собой ротавирусный белок, обозначенный как VP6. Относительная важность этих трех конкретных ротавирусных белков в вызывании иммунного ответа, который следует после ротавирусной инфекции, до сих пор не ясна. Тем не менее, белок VP6 определяет групповой и подгрупповой антиген, а белки VP4 и VP7 являются детерминантами серологической специфичности. До настоящего времени были идентифицированы по меньшей мере 14 G-серотипов ротавируса и 11 Р-серотипов ротавируса (Linhares А.С.Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330). Среди них 10 G-серотипов и 6 P-серотипов были идентифицированы среди человека ротавирусов. Белок VP7 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой (MW) 38000 (MW 34000, когда негликозилирован), который является трансляционным продуктом геномного сегмента 7, 8 или 9, в зависимости от штамма. Этот белок стимулирует образование основного нейтрализующего антитела после ротавирусной инфекции. Белок VP4 представляет собой негликозилированный белок с MW приблизительно 88000, который является трансляционным продуктом геномного сегмента 4. Этот белок также стимулирует нейтрализующее антитело после ротавирусной инфекции. Поскольку белки VP4 и VP7 представляют собой вирусные белки, против которых направлены нейтрализующие антитела, они, как полагают, являются главными кандидатами для разработки антиротавирусных вакцин, обеспечивающих защиту против ротавирусного заболевания. Естественная ротавирусная инфекция в раннем детстве, как известно, вызывает защитный иммунитет. Первые разработки вакцины для предупреждения ротавирусных инфекций начались в 1970-е годы после открытия вируса. В начале исследовали аттенуированные штаммы из животных и людей, тогда как современные попытки сфокусированы на химерных человеческих-животных вирусах. Разработка новых антиротавирусных препаратов должна соответствовать многим требованиям,включая потенциал распространения во всем мире и стабильность в широком диапазоне условий окружающей среды и хранения. В частности, стабильность препарата, особенно фармацевтической или вакцинной композиции, будет в общем лучше при более низких температурах по сравнению с комнатной или более высокими температурами. Поэтому один способ стабилизации заключался в создании вакцинных препаратов, которые могут храниться замороженными (от -20 до -70 С), или, альтернативно, в создании лиофилизированных вакцин, которые могут храниться в течение длительного периода времени при температуре, приближающейся к температуре холодильной камеры (2-8 С). Однако известно, что процесс лиофилизации имеет ограниченную производительность и связан с высокой стоимостью производства. Более того, лиофили-1 012046 зированные вакцины имеют более сложную технологическую обработку для введения, поскольку они могут требовать более сложных и, следовательно, относительно дорогостоящих устройств, такие как многокамерные/ампульные вакцины с активным ингредиентом в одной камере и жидкостью для растворения в другой камере. Лиофилизированные вакцины также связаны с более высокой стоимостью транспортировки и хранения. Эти условия могут быть неподходящими для некоторых развивающихся стран,где устройство для введения должно быть доступным с финансовой точки зрения и где инфраструктура производства и хранения может не соответствовать современным требованиям или является ненадежной. Поскольку ротавирус обычно вводят перорально человеческим детям, то этот путь приводит к некоторым проблемам с иммуногенными антиротавирусными композициями. Ротавирус быстро инактивируется в кислотном окружении, например, при воздействии кислого буфера или кислого желудочного сока (С. Weiss and H.F. Clark, 1985, J. Gen. Virol., 66, 2725-2730; T. Vesikari et al., 1984, The Lancet, p. 700; R.H. Foster and A.J.Wagstaff, 1998, BioDrugs Feb: 9(2) 155-178). Поэтому желательно, чтобы антиротавирусные композиции были приготовлены так, чтобы они были стабильными во время хранения и после введения в хозяина-реципиента. Антиротавирусные вакцины в основном предназначены для введения грудным детям уже в возрасте 4 недель. Небольшой дозовый объем вакцины, например меньше 2 мл или даже меньше 1,5 мл дозового объема, будет благоприятным для этой популяции. Поэтому желательно, чтобы антиротавирусные композиции были приготовлены в небольшом дозовом объеме. Стабилизирующие препараты для жидких противовирусных вакцин известны. Например, в ЕР 0065905 раскрыты в общем стабилизирующие композиции, подходящие для группы вирусов, таких как вирусы, вызывающие корь или грипп, и, в частности, в нем раскрыты стабилизирующие растворы, содержащие фосфатный буфер, подходящие для живого аттенуированного вируса. Другие стабилизирующие препараты раскрыты в WO 98/13065 и в Clark et al. (Pediatr Infect Dis J. 2003 Oct; 22(10):914-20). Такие препараты также требуют, среди прочих компонентов, присутствия фосфата, действующего в качестве забуферивающего агента для нейтрализации кислотности желудочного сока. Однако эти препараты не совместимы с требованиями, изложенными выше для успешной разработки антиротавирусного препарата, конкретно они не совместимы с уменьшенным объемом вакцинной дозы, который лучше подходит для человеческого ребенка. В частности, автор настоящего изобретения обнаружил, что адаптация этого препарата из уровня техники к устройству маленького объема, такому как 1,5 мл или меньше, хотя и поддерживает эффективную антацидную способность, приводит к проблемам, происходящим из несоответствия концентрации компонентов препарата, в частности фосфатного буфера. Поэтому необходимо разработать альтернативные антиротавирусные препараты, в частности альтернативные жидкие препараты, которые могут выдерживать кислотность желудочного сока и стабильны в холодильной камере, несмотря на отсутствие фосфата. Кроме того, необходимо, чтобы такие альтернативные препараты были также успешно приготовлены в минимально возможном объеме вакцинной дозы. Поэтому в настоящем изобретении предложены не только альтернативные стабильные иммуногенные композиции, которые не содержат фосфата или содержат лишь минимальные количества фосфата,но также обеспечена возможность приготовления ротавируса в малом дозовом объеме, который подходит для перорального введения человеческому ребенку. Описание графических материалов Фиг. 1 - стандартные кривые кислотно-основного титрования для четырех карбоксилатов. Фиг. 2 А - антацидная способность различных адипатсодержащих препаратов. Фиг. 2 Б - экспериментальная установка для анализа Россетт-Райса у грудных детей (BRR от англ.Baby Rossett-Rice). Фиг. 3 - коэффициент преломления адипатсодержащих препаратов. На фиг. 3 А показано, что на стадии адипатного буфера целевым значением является 58,5% сахарозы (мас./мас.), которое дает коэффициент преломления 1,4578 в смеси. На фиг. 3 Б показано, что на стадии конечного препарата целевым значением является 55% сахарозы (мас./мас.), которое дает коэффициент преломления 1,4480. Фиг. 4 - обзор схемы клинического испытания фазы II. Изложение сущности изобретения Соответственно, в первом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция, которая подходит для перорального введения человеческому ребенку, содержащая ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет pH от примерноpH 5,0 до примерно pH 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата. Предпочтительно, концентрация фосфата в заявленной композиции не превышает 1 мМ. В конкретном аспекте изобретения подходящая вакцинная доза будет обычно составлять 1,5 мл или предпочтительно любой объем меньше 2,5 мл, такой как объем 2 мл или меньше, который подходит для перорального введения грудным детям или детям младшего возраста. В частности, дозовый объем будет таким, чтобы стало возможным техническое осуществление препарата и не было вреднего воздействия на иммуногенный потенциал препарата. Заявленные композиции дают преимущество над фосфатсодер-2 012046 жащими препаратами из уровня техники в том, что они могут выдерживать кислотность желудочного сока, остаются иммуногенными и стабильными в течение длительного срока хранения и в то же время совместимыми с препаратом в меньшем, чем обычно, дозовом объеме, таком как меньше 2,0 мл, или даже совместимыми с дозовым объемом 1,5 мл или меньше. В конкретном воплощении жидкая иммуногенная композиция по изобретению обладает антацидной способностью от 6 и 23 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей(модифицированного, как подробно описано в примере III.2.2, относительно стандартного теста РоссеттРайса). Предпочтительно антацидная способность будет составлять по меньшей мере 8 мин, типично по меньшей мере 12 мин, а подходящий диапазон составляет от 12 до 20 мин. Неожиданно заявленные композиции продемонстрировали не только приемлемую, но более высокую антацидную способность даже в меньшем дозовом объеме, по сравнению с фосфатсодержащими препаратами из уровня техники. В другом аспекте предложен способ получения указанной жидкой антиротавирусной иммуногенной композиции, включающий смешивание ротавирусного антигена, сахара и карбоксилата с фармацевтически приемлемым разбавителем. Изобретение также охватывает в другом аспекте применение ротавирусного антигена в смеси с карбоксилатом и сахаром для изготовления пероральной иммуногенной композиции для предупреждения или лечения у людей заболеваний, ассоциированных с ротавирусом, где указанная композиция не содержит более чем 5 мМ фосфата и имеет pH от примерно pH 5,0 до примерно pH 8,0. В еще одном аспекте также предложен способ лечения или предупреждения ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей путем введения человеку-субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества указанной жидкой иммуногенной композиции. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны дополнительно в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений. Подробное описание Автор настоящего изобретения разработал новые жидкие антиротавирусные композиции, которые являются иммуногенными, стабильными при температуре холодильной камеры (от 2 до 7 С, типично при 4 С), которые могут выдерживать внутреннюю кислотную природу желудка при пероральном введении и которые совместимы с маленьким дозовым объемом. Жидкая композиция предназначена для обозначения препарата в жидкой форме, в противоположность сухой форме, объем которого является постоянным при постоянных конкретных услових (например, при комнатной температуре или температуре холодильной камеры, при атмосферном давлении) и форма которого определяется сосудом, который он заполняет. Объект и информация, раскрытые в публикациях и патентах или заявках на патент, упомянутых в этом описании, включены в данное описание путем ссылки. Термины "содержащий", "содержат" и "содержит" в данном описании, как предполагает автор, могут быть заменены соответственно терминами "состоящий из", "состоят из" и "состоит из" в каждом случае. В настоящем изобретении предложена жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция, содержащая ротавирусный антиген, сахар и карбоксилат, где указанная композиция имеет pH от примерноpH 5,0 до примерно pH 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата. Композиции по изобретению демонстрируют очень хороший профиль стабильности при сравнении с фосфатсодержащими препаратами, в то же время поддерживается профиль иммуногенности. Эти композиции являются, по меньшей мере, такими же стабильными, как их фосфатсодержащие прототипы. Другое преимущество композиций по настоящему изобретению состоит в том, что они могут быть получены в маленьком дозовом объеме, таком как меньше 2,0 мл, типично, например, 1,5 мл, по сравнению с препаратами из уровня техники, в которых присутствует фосфат. В конкретном воплощении концентрация фосфата в иммуногенной композиции не превышает 5 мМ, предпочтительно 1 мМ, в частности она не превышает 0,5 мМ. Фосфат относится к соли фосфорной кислоты (также известной как ортофосфорная кислота (Н 3 РО 4, обычно используют натриевые или калиевые соли или смесь натриевых и калиевых солей (например: Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, K3PO4,K2HPO4, KH2PO4). Предпочтительно, концентрация фосфата составляет 0,4 мМ или ниже, типично 0,2 мМ или ниже, идеально 0,1 мМ или ниже. В другом конкретном воплощении композиция, как заявлено в данном патенте, не содержит фосфата. Типично, фосфат, когда присутствует, поступает из среды для клеточных культур или солевого буфера, используемых в качестве разбавителя, таких как DMEM(среда игла в модификации Дульбекко), минимальная питательная среда игла ВМЕ или PBS. Концентрация фосфата, о которой идет речь в данном описании, будет представлять собой вычисленную концентрацию, которую определяют из количеств(а) фосфатсодержащих реагентов, используемых при получении заявленной(ых) композиции(й). Альтернативно, концентрация фосфата, присутствующего в композиции, как заявлено в данном описании, может быть измерена экспериментально с использованием аналитических рутинных методик. Одной из подходящих методик является колориметрический анализ, названный "Наноцвет" ("Nano-3 012046color"), продаваемый фирмой Macherey-Nagel (каталожный 91878). Этот способ основан на фотометрическом определении желтого комплекса, образованного фосфорной кислотой-молибдатом-ванадатом в кислотном растворе. Предел количества для данного анализа составляет 2 мкг/мл фосфата или 0,02 мМ. Альтернативный способ представляет собой дозирование фосфора (Р) с помощью методики атомно-эмиссионной спектроскопии, такой как атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy, ICP-AES) (BossFredeen, в Concepts,Instrumentation, and Techniques in Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy, Perkin Elmereds, second edition, 1997 - см. Методологию на с. 72 и далее). Предел количества для данного анализа составляет 0,030 мкг/мл фосфора, соответствующего концентрации фосфата 0,00032 мМ. В одном из воплощений pH композиции составляет от pH 5,0 до 8,0. В другом конкретном воплощении pH заявленной композиции составляет от примерно pH 5,5 до примерно pH 7,5. Под "примерноpH" подразумевают в пределах 0,2 ед. от заданного значения pH. В частности, pH композиции составляет от pH 5,5 до 7,5. Например, pH композиции составляет от примерно pH 6,0 до примерно pH 7,0, в частности от pH 6,0 до 7,0, типично от pH 6,2 до 6,8 или от pH 6,2 до 6,6. Подразумевается pH примерно 6,4, в частности 6,4. Известно, что кислый pH, такой как pH ниже 4,0, отрицательно влияет на ротавирус, и ожидают, что максимальная стабильность будет получена при нейтральном или даже слегка щелочномpH, т.е. диапазоне pH от 7,0 до 8,0, который получают, например, в забуференных фосфатом препаратах из уровня техники. Как показано в экспериментальной части, композиции по изобретению, несмотря на отсутствие фосфата, продемонстрировали хороший профиль стабильности в заявленном диапазоне pH и,более того, неожиданно продемонстрировали приемлемый профиль стабильности и иммуногенности даже в слабокислотных условиях, т.е. около pH от 6,0 до 7,0, при таком pH, как, например, около 6,4. Жидкая композиция, как заявлено в данном описании, содержит карбоксилат. Карбоксилат ("-COO-") представляет собой диссоциированную форму карбоновой кислоты, полученную в результате нейтрализации кислотной функциональной группы ("-СООН") щелочным веществом. Карбоновая кислота представляет собой соединение, содержащее карбоксильную группу: "-СООН",которую формально получают путем объединения карбонильной группы ("-СО-") и гидроксильной группы ("-ОН"). Однако взаимодействие между этими двумя частями так модифицирует их химические свойства, что целая группа рассматривается как новая функциональная группа с присущими ей характерными свойствами (Organic Chemistry by J.B. Hendrickson, D.J. Cram, and G.S. Hammond, McGraw-Hill BookCompany, third edition, 1970, p. 131). Хотя Международный союз теоретической и прикладной химии(IUPAC) рекомендует для применения номенклатуру алкановых кислот (монокарбоновых кислот) и алкандикарбоновых кислот (дикарбоновых кислот), в этом тексте использовали в основном тривиальные названия карбоновых кислот, поскольку эти продукты хорошо известны специалисту в данной области. Например, название уксусной кислоты согласно IUPAC соответствует этановой кислоте, а для адипиновой кислоты название будет соответствовать гександикарбоновой кислоте. В конкретном воплощении используют карбоксилатную соль из неорганической кислоты или предпочтительно из органической кислоты. В конкретном воплощении указанный карбоксилат получают из слабой кислоты. Например, указанный карбоксилат представляет собой карбоксилатную соль, выбранную из группы, состоящей из адипата, цитрата, малата, ацетата, сукцината, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, малеата, гликолята, лактата, глюконата, фумарата, тартрата, пимелата и любой комбинации двух или более из них. Подходящие карбоксилаты представляют собой карбоксилаты, полученные из карбоновой кислоты с pKa больше 4, или карбоксилаты, полученные из ди- или трикарбоновой кислоты (ди- или трикарбоксилаты) с численным средним pKa больше 4 (табл. 9). Примеры первого класса включают в себя карбоксилаты, полученные из пропионовой, масляной и уксусной кислоты. Примеры второго класса включают в себя карбоксилаты, полученные из лимонной, малеиновой, малоновой, янтарной, адипиновой, глутаровой и яблочной кислоты. В конкретном воплощении указанный карбоксилат относится к перечню GRAS, т.е. к карбоксилатам, которые "признаны полностью безопасными Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США" (Food and Drug Administration, FDA), и выбран из перечня, включающего в себя ацетат, пропионат, малат, глутарат, адипат, лактат, фумарат и тартрат. Предпочтительно, карбоксилат представляет собой соль адипиновой кислоты, т.е. мононатриевую соль адипиновой кислоты, монокалиевую соль адипиновой кислоты, предпочтительно динатрия адипат, или дикалия адипат, или кальция адипат. В конкретном воплощении предпочтительно используют концентрацию карбоксилата от 50 мМ до 2 М в жидкой антиротавирусной композиции. Следует понимать, что концентрация карбоксилата в диапазоне, упомянутом выше, может быть соответственно адаптирована, посредством рутинного экспериментирования, в соответствии с природой карбоксилата, антацидной способностью, которую нужно достичь, и объемом вакцинной дозы. Например, высокие концентрации карбоксилата выше 1 М могут быть использованы, когда требуется высокий антацидный потенциал, такой как выше 8 мин, предпочтительно выше 10 мин или выше 12 мин при определении с помощью тест Россетт-Райса у грудных детей для дозового объема 1,5 мл. Типично используют концентрации 1 М или ниже, такие как концентрации от 100 мМ до 1 М, обычно концентрации от 200 до 800 мМ. Подходящие концентрации карбоксилата нахо-4 012046 дятся от примерно 300 до примерно 800 мМ, предпочтительно от 400 до 700 мМ. В частности, когда карбоксилат представляет собой адипат, подходящий диапазон концентраций составляет от 400 до 500 мМ. Однако специалист поймет, что подходящими могут быть концентрации в пределах 10-20% от заданных значений, т.е. если задается 100 мМ, то диапазон от 80-90 до 110-120 мМ также раскрыт и подразумевается, что он охвачен. Иллюстративные концентрации приведены для различных карбоксилатов в табл. 1 ниже. Эти иллюстративные параметры приведены для дозового объема 1,5 мл и соответствуют номеру упомянутого примера, приведенному в табл. 1. Таблица 1 Антацидная способность карбоксилатов при конкретной концентрации определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2.pH жидкой антиротавирусной иммуногенной композиции, заявленной в данном изобретении, может быть получен путем смешивания карбоновой кислоты и карбоксилатной соли. В частности, карбоновая кислота может быть использована в смеси с другой карбоксилатной солью, например, цитрат объединяют с адипиновой кислотой. Это может быть полезным при использовании имеющихся в продаже реагентов, некоторые из которых могут не быть легко доступными, или для упрощения стадии приготовления препарата. Например, одна (или более) указанная карбоновая кислота(ы) может быть выбрана из перечня, состоящего из адипиновой кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, уксусной кислоты,янтарной кислоты, угольной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, малоновой кислоты,глутаровой кислоты, малеиновой кислоты, гликолевой кислоты, молочной кислоты, глюконовой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, пимелиновой кислоты, и смешана(ы) в подходящих пропорциях с одной (или более) карбоксилатной солью, выбранной из перечня, состоящего из адипата, цитрата,малата, ацетата, сукцината, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, малеата, гликолята, лактата, глюконата, фумарата, тартрата, пимелата. Жидкая композиция, как заявлено в данном изобретении, содержит сахар. Сахароза является особенно подходящей. Декстроза представляет собой другой подходящий сахар. Другие сахара или сахарные спирты также могут быть использованы вместо сахарозы или декстрозы, включая, например, глицерин, эритрозу, эритрит, ксилит, арабит, рибозу, ксилозу, арабинозу, глюкозу, тагалозу, маннозу, галактозу, фруктозу, инозит, сорбит, маннит, галактит, смесь глюкозы и фруктозы, мальтозу, софорозу, лактозу,целлобиозу, мелибиозу, трегалозу, сахарозу, палатинозу, мальтулозу, лактулозу, мальтит, лактит, рафинозу, мальтотриозу, мелезитозу, целлотриозу, циритол, мальтотетраозу, стахиозу, целлотетраозу, мальтопентаозу, целлопентаозу, мальтогексаозу, целлогексаозу, олигосахариды. Типичный диапазон концентраций сахара составляет от примерно 1 до примерно 70% мас./мас., например от примерно 25 до примерно 60% мас./мас. Однако специалисту будет понятно, что природа и концентрация сахара должна быть оптимизирована так, чтобы он обеспечивал удовлетворительную жизнеспособность вируса, поддерживая вязкость на уровне, который совместим со стадиями производства препарата, такими как фильтрация. В конкретном воплощении используют сахарозу. Типично, ее концентрацию поддерживают при минимальном значении 30% мас./мас. Более того, могут быть использованы более высокие, т.е. выше 30% мас./мас. концентрации сахарозы для обеспечения длительного хранения, поскольку ожидается, что высокое изоосмотическое давление таких препаратов будет предотвращать бактериальный рост. Соответственно, нижний предел для концентрации сахарозы в жидкой композиции, как заявлено в данном изобретении, составляет предпочтительно 30% мас./мас. или выше, такой как 35% мас./мас. или выше, предпочтительно 40% мас./мас. или выше. Подходящие диапазоны концентраций сахарозы составляют от примерно 40 до примерно 70% мас./мас. Например, подходящая концентрация сахарозы будет находиться между 45 и 60% мас./мас., предпочтительно между 50 и 55% мас./мас. В частности, используют сахарозу в концентрации примерно 50 или примерно 55% мас./мас. Конечные концентрации сахарозы 50 или 55% мас./мас. являются подходящими.-5 012046 Специалисту будет понятно, что когда сахарозу заменяют другим сахаром, может быть осуществлена рутинная оптимизация концентрации сахара для того, чтобы обеспечить стабильность вируса. Более того, заданные значения для сахаров могут быть слегка адаптированы с учетом параметров препарата/изготовления, таких как дозовый объем. Поэтому специалисту будет понятно, что концентрации в пределах 10% от заданных значений могут быть подходящими, т.е. когда задают 50% мас./мас. тогда диапазон от 45 до 55% мас./мас. также раскрыт и подразумевается, что он охвачен. Жидкая антиротавирусная иммуногенная композиция по настоящему изобретению также содержит ротавирусный антиген. В частности, жидкая композиция, как заявлено в данном изобретении, представляет собой иммуногенную композицию, например вакцинную композицию. Понятно, что ротавирусный антиген подразумевает любой ротавирусный антиген, который подходит для применения в вакцинном препарате. Главным образом рассматриваются пероральные живые ротавирусные антигены. Например,любой подходящий ротавирусный антиген может быть выбран из группы, состоящей из живого аттенуированного ротавируса животных или людей, в частности, живого аттенуированного ротавируса человека; химерного ротавируса, в частности, но не ограничиваясь этим, химерного ротавируса человека-человека,химерного ротавируса быка-человека или химерного ротавируса макака-резуса-человека. Все ротавирусные штаммы, человеческие или животные штаммы, рассматриваются в настоящем изобретении. Подходящими являются человеческие штаммы ротавирусов. В частности, ротавирусный антиген представляет собой в одном из воплощений аттенуированную популяцию ротавирусов человека,включающую один вариант или по существу один вариант, причем указанный вариант определен нуклеотидной последовательностью, кодирующей по меньшей мере один из основных вирусных белков,обозначенных как VP4 и VP7, как раскрыто в WO 01/12797, в частности, любой, включая один или более,из вариантов, охарактеризованных мутациями, изложенными в табл. 2, 3.1 и 3.2 из WO 01/12797. В конкретных воплощениях ротавирусный антиген представляет собой любой из следующих живых аттенуированных штаммов ротавируса человека: штамм HRV 89-12 С 2, депонированный под регистрационным номером АТСС VR 2272 (как описано в ЕР 0557427), его потомство, его химерные и иммунологически активные производные; штамм HRV P43, депонированный под регистрационным номером ЕСАСС 99081301 (как описано в WO 01/12797), его потомство, его химерные и иммунологически активные производные. Ротавирусные популяции, имеющие характеристики любого из вышеупомянутых депонированных штаммов, также представляют собой подходящие вакцинные штаммы. Производные из указанных депонированных штаммов могут быть получены путем подвергания указанных штаммов дополнительной обработке, например, путем их размножения с помощью дополнительного пассирования, клонирования или других методик с использованием живого вируса, или путем модификации указанных депонированных штаммов любым путем, включая методы генной инженерии или методы получения химер. Такие стадии и методы хорошо известны в данной области. Ротавирусные антигены, представляющие особый интерес, являются потомством любого из указанных депонированных штаммов и его иммунологически активными производными. Иммунологически активные производные представляют собой вещества, полученные из любого из депонированных штаммов или с любым из них, в частности, из штамма HRV Р 43,депонированного под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, или с ним, особенно вирусные антигены, которые способны вызывать иммунный ответ, который является активным против ротавируса при инъекции в хозяина-животного. Вещества, происходящие из депонированных штаммов, перечисленных выше, также представляют собой подходящие ротавирусные антигены, и включают в себя белок и генетический материал. Особый интерес представляют химерные ротавирусы, которые содержат по меньшей мере один антиген или по меньшей мере один сегмент любого из указанных депонированных штаммов, например химерные вирусы, которые содержат вирулентный штамм ротавируса, в котором один или часть одного из 11 геномных сегментов был(а) заменен(а) геномным сегментом или его частью из любого из указанных депонированных штаммов. Конкретно, ротавирусная химера, в которой сегмент или частичный сегмент, кодирующийNSP4, представляет собой сегмент или частичный сегмент любого из указанных депонированных штаммов, может иметь полезные свойства. Химерные ротавирусы и методики их получения хорошо известны(Foster, R.H. and Wagstaff, A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs,Gev, 9(2), 155-178, 1998). Ротавирусный антиген из заявленной композиции может быть получен согласно рутинным методикам получения. Типично, препараты ротавирусные антигенов могут быть получены с помощью способов культивирования тканей, используемых для размножения вируса или экспрессии рекомбинантных ротавирусных антигенов. Подходящие клеточные субстраты для выращивания вируса включают в себя, например, клетки почки собаки, такие как MDCK или клетки из клона MDCK, MDCK-подобные клетки,клетки почки обезьяны, такие как клетки AGMK, включая клетки Vero, которые являются особенно подходящими, другие клеточные линии, происходящие из почки обезьяны, такие как BSC-1, LLC-MK2 и МА 104, подходящие линии клеток свиньи, или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящий для получения ротавируса для вакцинных целей. Подходящие клеточные субстраты также включают в себя человеческие клетки, например клетки MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничива-6 012046 ются клеточными линиями; например, первичные клетки также включены. Также в пределах объема изобретения находятся смеси любого из вышеперечисленных депонированных штаммов с другими вариантами ротавируса, например, другими клонированными вариантами или другим химерным ротавирусом, или с другими вирусами, в частности, другими аттенуированными вирусами. В частности, композиция по изобретению содержит два ротавирусных антигена. В частности,один антиген в композиции представляет собой штамм HRV P43, депонированный под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, а другой антиген представляет собой его химерное производное или любое его иммунологически активное производное. Ротавирусный антиген для включения в заявленную композицию может представлять собой моновалентный ротавирусный штамм, т.е. содержащий один ротавирусный штамм, или поливалентный, т.е. содержащий по меньшей мере два или более чем два ротавирусных штамма. Специалисту будет понятно, что другие легко доступные аттенуированные штаммы человеческого или животного происхождения, которые получают из депозитарных учреждений, также являются подходящими и могут быть использованы в качестве заменителей перечисленных депонированных штаммов. Согласно настоящему изобретению, подходящая иммуногенная композиция содержит ротавирусный антиген, в частности, человеческий аттенуированный штамм Р 43 (депонированный под регистрационным номером ЕСАСС 99081301, см. WO 01/12797) в концентрации 105-106 БОЕ на дозу (или эквивалент 105,5-106,5, выраженный в CCID50 на дозу), 55% сахарозы мас./мас., 0,465 М динатрия адипата (соответствующих 132,74 мг на дозу), и имеет pH от примерно 6,2 до 6,6, в 1,5 мл дозовом объеме. Для этой композиции DMEM содержание составляет 6% мас./мас. и, следовательно, составляет менее 0,1 мМ фосфата. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать дополнительный антацидный компонент, такой как неорганический антацид, например гидроксид алюминия Al(OH)3 и гидроксид магния Mg(OH)2. Гидроксид алюминия является особенно подходящим. Другие имеющиеся в продаже антациды, которые являются подходящими для применения в изобретении, включают в себя Mylanta, который содержит гидроксид алюминия и гидроксид магния. Они нерастворимы в воде и представлены в суспензии. Другой особенно подходящий антацид, который может быть дополнительно использован в вакцинной композиции по настоящему изобретению, представляет собой нерастворимую неорганическую соль карбонат кальция (СаСО 3). Типичная концентрация СаСО 3 составляет 80 мг на дозу вакцины, например. Другие подходящие, нерастворимые в воде антациды представляют собой карбонат магния, карбонат алюминия, фосфат алюминия, смесь гидроксида алюминия и карбоната магния, гидрокарбонат алюминия-магния, гидроксид алюминия-карбонат магния-сорбит-маннит, гидроксиалюминия-натриякарбонат, дигидроксикарбонат алюминия-калия, магалдрат, гидротальцит, альмагцит, магния-алюминия силиката гидрат. Иммуногенная композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые соединения и/или носители, в частности соединения, которые, как известно в данной области, подходят для перорального введения, особенно у грудных детей. Такие носители включают в себя, но не ограничиваются этим, углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты, гидроксид алюминия, гидроксид магния, гидроксиапатит, тальк, оксид титана, гидроксид железа, стеарат магния,карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, желатин, растительный пептон, ксантан, каррагенан, гуммиарабик, -циклодекстрин. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать ионы кальция, которые были предложены для стабилизации ротавируса. Вязкие агенты могут быть дополнительно включены в композицию. Возможные вязкие агенты, которые могут быть использованы, включают в себя псевдопластические эксципиенты. Подходящие вязкие агенты включают в себя пропиленгликоль, гуммиарабик, трагантовую камедь, агар-агар, альгинат, пектин, натрий-карбоксиметилцеллюлозу (Tyloses С), метилцеллюлозу (Methocels A, Viscotrans MC, Tylose МН и MB), гидроксипропилметилцеллюлозу (Klucels),гидроксипропилцеллюлозу (Methocels E и K, Vicotrans MPHC), Carbopol, ксантановую камедь,Veegum (магния-алюминия силикат), Avicel (примерно 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% Na-карбоксиметилцеллюлозы). Ксантановая камедь или крахмал являются особенно подходящими вязкими агентами для дополнительного применения в жидкой композиции по изобретению. Также может быть выгодным включать в заявленную композицию носители на основе липидов, такие как виросомы или липосомы, эмульсии типа масло в воде или частицы носителя. Альтернативно или кроме того, в композицию могут быть включены иммуностимуляторы, такие как иммуностимуляторы,известные в данной области для пероральных вакцин. Такие иммуностимуляторы включают в себя бактериальные токсины, особенно холерный токсин (СТ) в виде голотоксина (целая молекула) или только Вцепи (СТВ) и термолабильный энтеротоксин из Е. coli (LT). Мутантные LT (mLT), которые меньше способны превращаться в свою активную форму, чем нативный LT, описаны в WO 96/06627, WO 93/13202 и-7 012046 Композиция по изобретению может дополнительно содержать адъювант или иммуностимулятор,такой как, но не ограничиваясь этим, детоксифицированный липид А из любого источника и нетоксичные производные липида А, сапонины и другие реагенты, способные стимулировать ответ ТН 1-типа. Уже давно известно, что энтеробактериальный липополисахарид (LPS) является мощным стимулятором иммунной системы, хотя его применение в адъювантах было ограничено из-за его токсических эффектов. Нетоксичное производное LPS, представляющее собой монофосфориллипид A (MPL), полученный путем удаления коровой углеводной группы и фосфата из редуцирующего концевого глюкозамина, было описано Ribi с соавт. (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p. 407-419) и имеет следующую структуру: Другой детоксифицированный вариант MPL получен путем удаления ацильной цепи из 3 положения дисахаридного скелета и называется 3-O-деацилированный монофосфориллипид A (3DMPL). Он может быть очищен и получен способами, описанными в GB 2122204 В, в котором также раскрыто получение дифосфориллипида А и его 3-О-деацилированных вариантов. Подходящая форма 3D-MPL находится в форме эмульсии, имеющей маленький размер частиц менее 0,2 мкм в диаметре, и способ ее изготовления раскрыт в WO 94/21292. Водные композиции, содержащие монофосфориллипид А и поверхностно-активное вещество, были описаны в WO 9843670A2. Адъюванты, происходящие из бактериального липополисахарида, которые будут включены в композиции по настоящему изобретению, могут быть очищены и обработаны из бактериальных источников,или альтернативно, они могут быть синтетическими. Например, очищенный монофосфориллипид А описан в Ribi et al. 1986 (выше), а 3-О-деацилированный монофосфорил- или дифосфориллипид А, происходящий из Salmonella sp., описан в GB 2220211 и US 4912094. Были описаны и другие очищенные и синтетические липополисахариды (Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al.,1987, Immunology, 60(1):141-6; и ЕР 0549074 B1). Особенно подходящим бактериальным липополисахаридным адъювантом является 3D-MPL. Соответственно, производные LPS, которые могут быть использованы в настоящем изобретении,представляют собой такие иммуностимуляторы, которые сходны по структуре с производными LPS, илиMPL, или 3D-MPL. В другом аспекте настоящего изобретения производные LPS могут представлять собой ацилированный моносахарид, который является субфрагментом вышеприведенной структуры MPL. Синтетические производные липида А также известны, включая, но не ограничиваясь этим ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоноОглюкопиранозил]-2-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]D-глюкопиранозилдигидрофосфат),(WO 95/14026); ОМ 294(3S,9R)-3-[(R)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(R)-[(R)-3 гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1,10-бис(дигидрофосфат) (WO 99/64301 и WO 00/0462); ОМ 197 МР-Ас DP (3S,9R)-3-[(R)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3 гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфата 10-(6-аминогексаноат) (WO 01/46127). Очищенные сапонины в качестве пероральных адъювантов описаны в WO 98/56415. Сапонины и монофосфориллипид А могут быть использованы раздельно или в комбинации (например, WO 94/00153) и могут быть приготовлены в адъювантных системах вместе с другими агентами. 3D-MPL представляет собой хорошо известный адъювант, производимый фирмой Ribi Immunochem, Montana, и его изготовление описано в GB 2122204. Другой предпочтительный иммуностимулятор для применения в настоящем изобретении представляет собой сапонин Quil А и его производные. Сапонины описаны в Lacaille-Dubois, M. and Wagner H.(1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, vol 2, p. 363-386). Сапонины представляют собой стероидные или тритерпеновые гликозиды, широко распространенные в-8 012046 растительном царстве и царстве морских животных. Сапонины, как известно, образуют коллоидные растворы в воде, которые пенятся при встряхивании, и осаждают холестерин. Когда сапонины находятся близко к клеточным мембранам, они порождают пороподобные структуры в мембране, которые являются причиной разрыва мембраны. Гемолиз эритроцитов является примером этого феномена, который является свойством некоторых, но не всех, сапонинов. Сапонины известны в качестве адъювантов в вакцинах для системного введения. Адъювантная и гемолитическая активность индивидуальных сапонинов широко исследовалась в данной области (Lacaille-Dubois and Wagner, выше). Например, Quil А (происходящие из коры южно-американского дереваQuillaja saponaria Molina) и его фракции описаны в US 5057540 и "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil,С. R., Crit Rev TherDrug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; и ЕР 0362279 B1. Структуры в виде частиц, названные иммунными стимулирующими комплексами (ISCOMS, Immune Stimulating Complexes), содержащие фракции Quil А, являются гемолитическими и были использованы в изготовлении вакцин(Morein, В., ЕР 0109942 В 1; WO 96/11711; WO 96/33739). Гемолитические сапонины QS21 и QS17 (фракции Quil А, очищенные с помощью ВЭЖХ) были описаны как мощные системные адъюванты, и способ их получения раскрыт в патенте US 5057540 и ЕР 0362279 В 1. QS-21 представляет собой природный сапонин, происходящий из коры Quillaja saponaria Molina, который индуцирует CD8+ цитотоксические Тклетки (CTL), Th1-клетки и преимущественный IgG2a антительный ответ и представляет собой подходящий сапонин в контексте настоящего изобретения. Другие сапонины, которые были использованы в исследованиях системной вакцинации, включают сапонины, происходящие из других видов растений,таких как Gypsophila и Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). Улучшенная система включает комбинацию нетоксичного производного липида А и производного сапонина, в частности, комбинацию QS21 и 3D-MPL, как раскрыто в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 гасится холестерином, как раскрыто в WO 96/33739. Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть выделены в форме мицелл или могут находиться в форме больших упорядоченных структур, таких как ISCOM (ЕР 0109942 В 1) или липосомы, когда приготовлены с холестерином и липидом, или в форме эмульсии типа масло в воде (WO 95/17210). Сапонины могут быть предпочтительно ассоциированы с солью металла, такой как гидроксид алюминия или фосфат алюминия (WO 98/15287). Особенно эффективная адъювантная композиция, включающая QS21 и 3D-MPL в эмульсии типа масло в воде, описана в WO 95/17210 и в WO 99/11241 и WO 99/12565, и представляет собой подходящие композиции. Общий обзор носителей и адъювантов для пероральной иммунизации можно найти в Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995. Вакцинная композиция по изобретению может содержать дополнительные компоненты, включая,например, корригенты (особенно для пероральной вакцины) и бактериостатические агенты. В конкретном воплощении жидкая композиция по изобретению обладает антацидной способностью от 6 до 23 мин при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей (модифицированного, как подробно описано в примере III.2.2, относительно стандартного теста Россетт-Райса). Согласно настоящему изобретению, под "антацидной способностью" подразумевают период времени, выраженный в минутах, в течение которого pH препарата в тесте остается выше 4, определяемый согласно экспериментальной методике, представленной в примере III.2.2. Предпочтительно антацидная способность будет составлять от 12 до 20 мин. Антацидная способность выше 23 мин, такая как 29-30 мин, например, также совершенно приемлема с точки зрения разработки вакцины, но такая высокая способность является чрезмерной. В частности, особенно рассматривается антацидная способность по меньшей мере 8 мин, по меньшей мере 10 мин, по меньшей мере 12 мин. Подходит антацидная способность по меньшей мере 12 мин, по меньшей мере 13 мин, по меньшей мере 14 мин, по меньшей мере 15 мин, по меньшей мере 16 мин. Известно, что желудок маленьких детей, которые не ели в течение трех часов, имеет очень кислую среду, и что такой кислый pH отрицательно влияет на ротавирус. В экспериментах автора изобретения при работе с препаратом маленького объема, который является желательным, невозможно было измерить антацидную способность классических фосфатсодержащих препаратов, поскольку растворимость фосфата легко превышалась и наблюдалась кристаллизация компонентов во время приготовления и/или кратковременного хранения. В противоположность этому, заявленные композиции неожиданно продемонстрировали приемлемую, но более высокую антацидную способность даже в меньшем дозовом объеме, по сравнению с фосфатсодержащими препаратами из уровня техники. В другом конкретном воплощении указанная жидкая иммуногенная композиция является стабильной при по меньшей мере одном из следующих условий: в течение 7 суток при 37 С, в течение одного года при 4 С, в течение 18 месяцев при 4 С, в течение двух лет при 4 С. Согласно настоящему изобретению, стабильность данной композиции определяется путем измерения вирусного титра (т.е. стабильности вируса) согласно методике, изложенной в примере III.1, после хранения препарата в течение определенного периода времени при данной температуре. Стабильность композиции может быть определена с помощью ускоренного теста на стабильность, например, после хранения препарата в течение одной не-9 012046 дели при 37 С. Стабильность композиции может быть альтернативно определена в течение более длительного периода времени, такого как в течение нескольких месяцев, или при температуре холодильной камеры (от 2 до 7 С, типично при 4 С), или при комнатной температуре (20-22 С). В этих условиях стабильной композицией является композиция, которая имеет максимальное снижение ротавирусного титра 1, выраженное в log10 БОЕ/дозу при определенных условиях тестирования. Особенно подходящие композиции представляют собой композиции, в которых происходит снижение максимум на 0,5 log10, например 0,4 или меньше, 0,3 или меньше, 0,2 или меньше или предпочтительно 0,1 log10 БОЕ на дозу вакцины в ускоренном тесте на стабильность при 37 С в течение одной недели. Альтернативно, жидкая иммуногенная композиция, как заявлено в данном изобретении, может быть заморожена и может храниться в замороженном состоянии при -20 С или ниже, или при -70 С в течение нескольких лет, и оставаться стабильной при 4 С в течение по меньшей мере одного года после оттаивания. Типично, замороженный препарат будет стабильным в течение по меньшей мере 6 месяцев,по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 лет или по меньшей мере 3 лет и будет оставаться стабильным при 4 С в течение по меньшей мере одного года, предпочтительно 18 месяцев или 2 лет после оттаивания. Композиция по настоящему изобретению представляет собой иммуногенную композицию, например вакцину. Например, заявленная иммуногенная композиция способна, обычно после одной, предпочтительно двух доз с интервалом в один или два месяца, вызывать иммунный ответ, например превосходное приживление вакцины (vaccine take) и сывороточный, специфический к ротавирусу IgA-ответ. "Приживление вакцины" определяют как процент субъектов, демонстрирующих или серологический ответ,например появление сывороточного IgA к ротавирусу в сыворотках после иммунизации при титре не менее 20 ед./мл (ELISA), и/или как шеддинг ротавируса (ELISA) в любом образце испражнений. Приживление вакцины может быть определен как шеддинг вакцинного вируса в любом образце испражнений, собранном между первой дозой и вплоть до 1-2 месяцев после второй дозы. В конкретном воплощении вакцина по изобретению способна снижать распространение любого, и предпочтительно тяжелого,ротавирусного гастроэнтерита по сравнению с плацебо. Типично, данная вакцина способна обеспечивать перекрестную защиту против иных, чем те, которые присутствуют в вакцине, циркулирующих штаммов. Типично, когда вакцина содержит штамм G1-типа, такой как штамм аттенуированного человеческого вируса Р 43, тогда иммунный ответ индуцируется к G1 и по меньшей мере одному из не-G1 серотипов,выбранных из группы, состоящей из G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 и G14 серотипов. Предпочтительно, вакцина, содержащая штамм G1, способна обеспечивать защиту как против G1,так и не-G1 штаммов, таких как штаммы G2, G3 и/или G4, и, в частности, против распространенного во всем мире серотипа G9. В конкретном воплощении указанный гастроэнтерит или тяжелый гастроэнтерит вызван ротавирусным штаммом другого серотипа, чем тот, который содержится в заявленной композиции. В частности, если ротавирусный штамм, присутствующий в заявленной композиции, представляет собой серотипG1, такой как, но не ограничиваясь этим, живой аттенуированный штамм ротавируса человека HRV P43(ЕСАСС 99081301), то обеспечивается профилактика против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом G1-серотипа, а также ротавирусным штаммом не-G1 серотипа,например ротавирусным штаммом, имеющим серотип, выбранный из перечня, состоящего из G2, G3, G4,G5, G6, G7, G8, G9, G10, G11, G12, G13 и G14. В конкретном воплощении иммуногенная композиция,заявленная в данном изобретении, способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих не-G1 серотипов: G2, G3, G4 и G9. В другом конкретном воплощении, если ротавирусный штамм, присутствующий в заявленной композиции, представляет собой ротавирус Р[8] типа, такой как, но не ограничиваясь этим, живой аттенуированный штамм ротавируса человека HRVP43 (ЕСАСС 99081301), то обеспечивается профилактика против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом Р[8] типа и не-Р[8] типа, например ротавирусным штаммом,имеющим серотип, выбранный из перечня, состоящего из Р 1, Р 2, Р 3, Р 4, Р 5, Р 6, Р 7, Р 9 и Р 11 типов. В частности, иммуногенная композиция, заявленная в данном изобретении, способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих не-Р[8] типов: Р 4, Р 6. В другом воплощении заявленная композиция способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом другого Gтипа и другого Р-типа, чем тот, который присутствует в композиции для введения. Конкретно, заявленная композиция содержит ротавирусный штамм G1P[8], а также способна индуцировать иммунный ответ и/или обеспечивать защиту против гастроэнтерита или тяжелого гастроэнтерита, вызванного ротавирусным штаммом G2P[4]. Предпочтительно, композицию по изобретению вводят пероральным путем. Предпочтительно композиция поставляется в однодозовом устройстве, таком как стеклянная или пластмассовая ампула или шприц, подходящая(ий) для доставки маленьким детям.- 10012046 Вакцины по изобретению могут быть приготовлены и введены известными способами с использованием подходящего количества живого вируса для обеспечения эффективной защиты против ротавирусной инфекции без значительных вредных побочных эффектов в типичных вакцинах. Соответственно, в настоящем изобретении предложен способ получения жидкого антиротавирусного препарата или иммуногенной композиции, как раскрыто в данном описании, включающий смешивание ротавирусного антигена, сахара и карбоксилата с фармацевтически приемлемым разбавителем. Подходящее количество живого вируса будет обычно составлять от 104 до 107 БОЕ на дозу. Типичная доза вакцины может содержать 105-106 БОЕ на дозу и может даваться в нескольких дозах в течение некоторого периода времени, например, в двух дозах, которые дают с двухмесячным интервалом. Ротавирусный титр также может выражаться в CCID50, и в контексте данного изобретения можно оценить,что CCID50 106,0 эквивалентно БОЕ 105,5 на дозу. Однако преимущества могут быть получены при использовании более чем 2 доз, например схемы из 3 или 4 доз, особенно в развивающихся странах. Первую дозу предпочтительно можно давать детям в возрасте от 4 недель до 14 или 15 недель, предпочтительно в возрасте от 6 до 14 недель. Интервал между дозами составляет по меньшей мере 4 недели, но может составлять более или менее двух месяцев, например для второй дозы, и любая последующая доза,если это целесообразно, может даваться через один месяц или три месяца после предыдущей дозы, в зависимости от местного графика иммунизации. Оптимальное количество живого вируса для однократной дозы или для схемы с введением многократных доз и оптимальное время для введения доз могут быть определены стандартными исследованиями, включающими наблюдение за титрами антител и другими ответами у субъектов. Типично, объем дозы вакцины по изобретению будет обычно составлять 2,5 мл или меньше, типично от 0,5 до 2,5 мл. В конкретном аспекте изобретения подходящая вакцинная доза будет обычно составлять 1,5 мл или предпочтительно любой объем меньше 2,5 мл, такой как объем 2 мл или меньше, который подходит для перорального введения грудным детям или детям младшего возраста. В частности,дозовый объем будет таким, чтобы стало возможным техническое осуществление препарата и не было вреднего воздействия на иммуногенный потенциал препарата. Заявленные композиции дают преимущество над фосфатсодержащими препаратами из уровня техники, поскольку они могут выдерживать кислотность желудочного сока, остаются иммуногенными и стабильными в течение длительного срока хранения и в то же время совместимыми с препаратом в меньшем, чем обычно, дозовом объеме, таком как меньше 2,0 мл или даже предпочтительно 1,5 мл или меньше. Типично, объем дозы вакцины по изобретению составляет от 0,5 до 2,0 мл, предпочтительно приблизительно от 1,0 до 1,5 мл, такой как приблизительно 1,3 мл, или приблизительно 1,4 мл, или приблизительно 1,5 мл. Типичный дозовый объем может также составлять 2 мл или меньше, такой как, например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 или 1,5 мл. Объемы 1 мл или объемы меньше чем 1 мл, например от 200 до 800 мкл, также рассматриваются в пределах объема настоящего изобретения. Объем жидкости, который может быть введен перорально, может быть также частично определен устройством для доставки вакцины. Иммуногенная композиция по изобретению может быть также приготовлена таким образом, чтобы содержать другие антигены, в частности антигены из других подходящих живых вирусов, для защиты против других заболеваний, например полиовирусных. Указанные дополнительные активные ингредиенты, подходящие для перорального введения, можно давать либо в смеси с антиротавирусной композицией, либо, альтернативно, можно совместно вводить (т.е. в отдельной дозе, но тогда же) с антиротавирусной композицией, заявленной в данном изобретении. Заявленную композицию можно давать также параллельно с другими непероральными вакцинами,например с парентеральными вакцинами, подходящими для вакцинированной педиатрической популяции, такими как вакцины DTPw или DTPa (вакцины против Bordetella pertussis - судорожный кашель,дифтерия, столбняк), вакцины против менингита, индуцированного Haemophilus influenza В, гепатита В,или кори, паротита, краснухи (MMR от англ. measles, mumps, rubella), вакцины против Streptococcuspneumoniae, для того, чтобы оптимизировать количество визитов к врачу. В другом воплощении в изобретении также предложен способ лечения или предупреждения ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей, особенно у маленьких детей, таких как грудные дети или дети младшего возраста, путем введения указанному человеку-субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества жидкого препарата, в частности, иммуногенной композиции или вакцины, заявленной в данном изобретении. В частности, заявленные композиции будут предотвращать ротавирусные инфекции. В конкретном воплощении композиции, заявленные в данном изобретении, способны обеспечивать защиту против ротавирусного гастроэнтерита, в частности против тяжелого гастроэнтерита. Тяжелый гастроэнтерит определяют как случай, требующий госпитализации и/или регидратационной терапии (эквивалентна плану Б или В ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения в медицинском учреждении, или случай с баллом более 11 по 20-бальной шкале Весикари (Ruuska T and Vesikari T. Rotavirusdisease in Finnish children: use of numerical scores for severity of diarrheal episodes. Scand J Infect Dis 1990,22:259-67). В еще одном воплощении в изобретении предложено применение ротавирусного антигена, карбоксилата и сахара в изготовлении иммуногенной композиции, например вакцины, для лечения или преду- 11012046 преждения ассоциированных с ротавирусом заболеваний у людей, где указанная иммуногенная композиция имеет pH от pH 5,0 до pH 8,0 и содержит менее 5 мМ фосфата. В частности, особенно рассматривается профилактика ротавирусных инфекций и/или защита против гастроэнтерита и более предпочтительно против тяжелого гастроэнтерита. В другом конкретном воплощении в изобретении также предложено применение живого аттенуированного ротавируса человека для изготовления иммуногенной композиции, заявленной в данном изобретении, для лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с ротавирусом, не вызывающих инвагинации кишечника. В частности, указанное лечение или предупреждение включает введение двух пероральных доз, или более, безопасного и эффективного количества композиции живого аттенуированного ротавируса человека ребенку в возрасте от 4 до 14 или 15 недель во время приема дозы 1. Типично, ребенок будет находиться в возрасте от 6 до 14 недель во время приема первой дозы. В контексте настоящего изобретения подразумевают, что человеческий ребенок представляет собой ребенка в возрасте от 4 до 14 или 15 недель после рождения. В другом воплощении в изобретении также предложена жидкая иммуногенная композиция, содержащая ротавирусный антиген, сахар, фосфат и карбоксилат, где указанная композиция имеет pH от примерно 5,0 до примерно 8,0, и где указанный карбоксилат выбран из перечня, состоящего из: адипата, малата, ацетата, пропионата, бутирата, малоната, глутарата, гликолята, глюконата, пимелата и любой комбинации двух или более из них. В конкретном воплощении указанный карбоксилат представляет собой адипат. Типично фосфат будет присутствовать в концентрации от 10 мМ до 1 М. Автор настоящего изобретения обнаружил, что эти конкретные карбоксилаты, которые не были связаны с разработкой пероральных вакцинных препаратов, удовлетворяют всем желаемым требованиям стабильности, кислотоустойчивости, иммуногенности и приготовления препарата в маленьком дозовом объеме, как изложено в настоящем описании, для разработки подходящей пероральной антиротавирусной вакцины для человеческих детей. В частности, указанные карбоксилаты не оказывают вредного воздействия на титр ротавируса в препарате. Эти карбоксилаты могут в достаточной степени действовать в качестве альтернатив традиционным карбоксилатам, таким как сукцинат, глутамат и цитрат, например, в фосфатсодержащих антиротавирусных препаратах. Все другие конкретные воплощения, описанные выше, в равной степени относятся к этому аспекту настоящего изобретения. Типично, диапазон pH композиции является таким,как определено в данном описании, как и антацидная способность и стабильность при хранении. В изобретении также предложен способ получения указанной композиции, применения и способы предупреждения или лечения человеческих детей с использованием указанной композиции. Изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. Пример I. Препарат живой аттенуированной человеческой антиротавирусной жидкой вакцины 1) в отсутствие добавленного фосфата и карбоксилата, и 2) в присутствии цитрата в качестве карбоксилата в отсутствие добавленного фосфата.DMEM составляет 5, 6 или 8% препаратов, подробно описанных в примере II. Это соответствует конечной концентрации фосфата 0,059, 0,071 и 0,094 мМ соответственно и конечной концентрации пирувата 0,065, 0,078 и 0,104 мМ соответственно. Раствор витаминов (концентрированный 500):I.1.2. Приготовление антиротавирусных препаратов в отсутствие добавленного фосфата и карбоксилата. Препарат 60, представленный в табл. 2, был приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Препарат 60. К 143 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) добавляют 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае дозовый объем составляет 1,5 мл. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примереDMEM составляет 6% мас./мас. Результаты в отношении антацидной способности, первоначального вирусного титра и стабильности вируса показаны в табл. 2-4. определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2. Таблица 3 Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при комнатной температуре месяц(ы); НО - не определено. Таблица 4 Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при 4 СI.1.3. Приготовление антиротавирусных препаратов, содержащих карбоксилат. Лимонную кислоту (когда присутствует) и цитратную соль смешивают в пропорциях и условиях,показанных в табл. 5 и 6. Стабильность ротавируса и антацидную способность препаратов измеряют согласно способам, представленным в примерах III.1 и III.2 соответственно. Получили препараты 110-115 и 128-130. Объем дозы составлял 2,5 мл для препаратов 110-115 и 1,5 мл для препаратов 128-130. Препараты 110-115, представленные в табл. 5, были приготовлены с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 100 дозам по 2,5 мл (3,25 г) каждая. Препарат 110 получали следующим образом. К 123,71 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 19,29 г тринатрия цитрата (Na3 цитрат 2 Н 2 О, Mw 294) (соответствующих конечной концентрации 262 мМ) и 162,50 г сахарозы(50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае однократный дозовый объем составляет 2,5 мл или 3,25 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере среда DMEM составляет 6% мас./мас., что соответствует конечной концентрации фосфата 0,059 мМ. Препараты 111-115 получают согласно методике, аналогичной той, которая описана для препарата 110, за исключением того, что используют количества ингредиентов, подробно описанные в табл. 5. Например, препарат 111 получили путем смешивания следующих ингредиентов: 123,73 г воды (количество,которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 19,07 г тринатрия цитрата (Na3 цитрат 2 Н 2 О, Mw 294) (соответствующих конечной концентрации 259 мМ), 0,197 г лимонной кислоты (Mw 192) (соответствующих конечной концентрации 4 мМ) и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальную часть данной методики осуществляли как для препарата 110. Результаты в отношении антацидной способности, первоначального вирусного титра и стабильности вируса показаны в табл. 5-8. Таблица 5 Дозовый объем 2,5 мл определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2. Препараты, представленные в табл. 6, были приготовлены с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: лимонная кислота 1H2O (Mw 210), Na3 цитрат 2 Н 2 О (Mw 294). Препарат 128 был получен путем смешивания 110,89 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) со следующими ингредиентами: 31,78 г тринатрия цитрата (Na3 цитрат 2 Н 2 О, Mw 294) (соответствующих конечной концентрации 432 мМ), 0,328 г лимонной кислоты(50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере среда DMEM составляет 6% мас./мас., что соответствует конечной концентрации фосфата 0,059 мМ. Препараты 129 и 130 были получены аналогично методике, описанной для препарата 128, путем адаптации количеств ингредиентов согласно табл. 6. Кратко, препарат 129 был получен путем смешивания 0,77 г лимонной кислоты (лимонная кислота 1 Н 2 О, Mw 210) (соответствующих конечной концентрации 15 мМ) и 31,36 г тринатрия цитрата (Na3 цитрат 2 Н 2 О (Mw 294) (соответствующих конечной концентрации 426 мМ). Препарат 130 был получен путем смешивания 2,75 г лимонной кислоты (лимонная кислота 1 Н 2 О, Mw 210) (соответствующих конечной концентрации 52 мМ) и 34,7 г тринатрия цитрата(Na3 цитрат 2 Н 2 О (Mw 294) (соответствующих конечной концентрации 472 мМ). Оставшаяся часть ингредиентов и пропорций приведена в табл. 6. Таблица 6 Дозовый объем 1,5 мл определено с помощью теста Россетт-Раиса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2. Таблица 7 Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при комнатной температуре месяц(ы); НО - не определено. Таблица 8 Дозовый объем 1,5 мл - стабильность вируса при 4 СI.2 Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере III.2. Результаты показаны в табл. 2-8.pH для контрольного препарата 60, который не содержал карбоксилата и добавленного фосфата, не имел антацидной способности и дополнительно демонстрировал pH, приближающийся к верхнему пределу pH 8,0 для стабильности вируса. Для всех экспериментальных препаратов, протестированных в табл. 5-8, pH поддерживали в диапазоне примерно 5,0-7,0, за исключением препарата 110, который демонстрировал pH выше 8,0. Как можно видеть из результатов в отношении вирусного титра и потери вируса, стабильность ротавируса в жидком препарате связана с pH этого препарата. В диапазоне от примерно pH 5,4 (т.е. препарат 115) до pH 7,0(т.е. препараты 111 и 128), потеря вируса через 7 суток при 37 С удерживалась на низком уровне (т.е. ниже 0,5 log), и это отличалось от результата, полученного для препарата 110 (pH 8, со снижением вирусного титра на 0,9 log). Кроме того, препараты 111-115 и 128-130 продемонстрировали похожую антацидную способность,что и препарат 110, при определении с помощью анализа Россетт-Райса у грудных детей (см.примерIII.2.2). Эта антацидная способность намного превышала нижний предел 8 мин для препаратов с дозовым объемом 2,5 мл, а также 1,5 мл, и фактически достигала минимального значения 12 мин и поэтому считалась весьма удовлетворительной. Альтернативные карбоксилаты также были протестированы, поскольку они могут представлять техническое осуществление альтернативных вариантов, когда могут быть желательными относительно низкие количества карбоксилатов, например, при работе с очень маленькими дозовыми объемами. Примеры препаратов, содержащие такие альтернативные карбоксилаты, приведены в примере II и табл. 10-39. Пример II. Препараты с альтернативной карбоксилатной солью в отсутствие добавленного фосфата. Следующие карбоксилатные соли были использованы для создания буферной способности: ацетат,малонат, сукцинат, глутарат, адипат и малат. В соответствии с pKa заданной карбоновой кислоты и в зависимости от ее молекулярной массы можно найти количества, которые необходимо добавить в препарат для достижения целевой антацидной способности по меньшей мере 8 мин, предпочтительно по меньшей мере 12 мин при определении с помощью теста BRR, в то время как окно pH составляет от pH 5,0 до pH 8,0. С химической точки зрения, "буферный" эффект получают при смешивании сильной кислоты (подобной HCl) и соли, происходящей из слабой кислоты (подобной ацетату натрия). Значение pH, соответствующее середине буферного плато, равно pKa слабой кислоты. pKa карбоновой кислоты является показателем кислотной силы, другими словами, индикатором эффективного диапазона буферного действия данного соединения. Поскольку ротавирус быстро разрушается при pH ниже 4 (С. Weiss and H.F. Clark, 1985 J. Gen.Virol., 66, 2725-2730), желательно буферное плато выше pH 4, т.е. предпочтительны карбоксилаты с pKa больше 4 или дикарбоксилаты со средним pKa больше 4. Подходящие карбоксилаты приведены в табл. 9. Приведены цифровые средние значения pKa. Таблица 9 Характеристики различных карбоксилатов Пять карбоновых кислот имеют статус "пищевой добавки": лимонная Е 330, уксусная Е 260, пропионовая Е 280, яблочная Е 296 и адипиновая Е 355. Стандартная кривая кислотно-основного титрования для четырех карбоксилатов (малата натрия,ацетата натрия, цитрата натрия и адипата натрия) показана на фиг. 1. Показано, что полезная антацидная- 16012046 способность от pH 4,0 до pH 7,0, например, составляет 72,50, 68,75, 57,70 и 41,25% для адипата натрия,ацетата натрия, цитрата натрия и малата натрия соответственно. Препараты были получены со следующими карбоксилатами: ацетатом, малонатом, сукцинатом,глутаратом, адипатом и малатом. Все препараты, представленные в этом примере, были получены в дозовом объеме 1,5 мл.II.1.1. Препараты, представленные в табл. 10, были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: Уксусная кислота (Mw 60),NaOH (Mw 40). Препарат 36. К 148,84 г воды (количество, достаточное для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 10,66 г NaOH, ледяную уксусная кислоту вплоть до pH 7,16 и 130 г сахарозы (40% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса, для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препараты 37 и 42. Методику осуществляют, как для препарата 36, но количества скорректированы согласно табл. 10. Препарат 87. К 75,00 г воды последовательно добавляют 8,00 г NaOH, 15,00 г ледяной уксусной кислоты, достаточное количество 1 н. раствора NaOH для достижения pH 7,00 (в этом случае добавляли 2 г 1 н. NaOH),дополнительное количество воды для достижения достаточного количества 325 г (в этом случае добавляли 43,00 г воды) и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальную часть данной методики осуществляют, как для препарата 36. Пример для препаратов 88-90. Методику осуществляли, как для препарата 87, за исключением того, что используют количества,упомянутые в табл. 10. Пример для препаратов 33-35. Методику осуществляли, как для препарата 36, за исключением того, что использовали количества,упомянутые в табл. 10, и NaOH заменяли на Са(ОН)2. Препараты 33-35 не были включены в исследование кратковременной стабильности из-за отклонения в тесте на стабильность в течение 1 недели при 37 С. Удовлетворительные результаты в присутствии дополнительных ионов кальция представлены, однако, в адипатной серии (см. пример 11.5.4 и табл. 26). Таблица 10 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2;- повторы.II.1.2. Препараты, представленные в табл. 11, были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: Ацетат натрия 3 Н 2 О (Mw 136). Пример для препарата 58. К 113,00 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 30,00 г ацетата натрия 3 Н 2 О и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препараты 59, 66, 69 и 70. Методику осуществляют аналогично для препарата 58 с скорректированными количествами (см. табл. 11). Таблица 11 как определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2;- повтор.II.1.3. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере III.2.2. Результаты показаны в табл. 10, 11, 12 и 13. В заключение, стабильность ротавируса в жидком ацетатном препарате связана с pH. Подходящий рабочий диапазон составляет от pH 6,0 до 7,5. Таблица 12 Стабильность вируса при комнатной температуре- 18012046 Таблица 13 Стабильность вируса при 4 С(Mw40). Препарат 54 (см. табл. 14) был приготовлен с общим выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: малоновая кислота (Mw 104), NaOH (Mw 40). Препарат 67. К 110,70 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 14,00 г NaOH, 18,230 г малоновой кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препарат 54. К 16,64 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г NaOH, 3,1213 г малоновой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Таблица 14 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2.Препарат 54 исключили из исследования долговременной стабильности, так как его первоначальный pH был выше 8,0.II.2.2. Препарат, представленный в табл. 15, был приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 147,7 дозам по 1,75 мл (2,20 г) каждая. Антацидное вещество: динатрия малонат (Mw 148). Препарат 62. К 138,50 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 23,00 г динатрия малоната и 144,00 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях к данному раствору добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для- 19012046 получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,20 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Таблица 15 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2.II.2.3. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты. В заключение, стабильность ротавируса в жидком малонатном препарате связана с pH: pH 6,5 дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37 С, тогда как при pH 8,2 наблюдается более чем 0,9 log потери.II.3.1. Препарат 127 (см. табл. 16) был приготовлен с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: янтарная кислота (Mw 118), NaOH (Mw 40). Препарат 51 (см. табл. 16) был приготовлен с выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: янтарная кислота (Mw 118), NaOH (Mw 40). Препарат 127. К 120,16 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 9,10 г NaOH, 13,74 г янтарной кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примереDMEM составляет 6% мас./мас. Препарат 51. К 16,22 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г NaOH, 3,5414 г янтарной кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Таблица 16 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2. оо Препарат 51 исключили из исследования долговременной стабильности, поскольку его антацидную способность определяли слишком долго.II.3.2. Препарат 56 представлен в табл. 17 и приготовлен с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: динатрия сукцинат (Mw 162). Препарат 56. К 122,50 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 20,50 г динатрия сукцината и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 62. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Таблица 17 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2;- повтор.II.3.3. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты. В заключение, стабильность ротавируса в жидком сукцинатном препарате связана с pH: pH 6,3 дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37 С, тогда как при pH 8,1 наблюдается 0,8 log потери.II.4.1. Препараты с глутаратом представлены в табл. 18. Препарат 65 был приготовлен с общим выходом 320,8 г (246 мл), соответствующим 164 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: глутаровая кислота (Mw 132), NaOH (Mw 40). К 114,1 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 320,8 г) последовательно добавляют 9,3 г NaOH, 15,40 г глутаровой кислоты и 162,5 г сахарозы (50,6% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6,08% мас./мас. Препарат 50 был приготовлен с общим выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл(2,2 г) каждая. Антацидные вещества: глутаровая кислота (Mw 132), NaOH (Mw 40). К 15,8 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 гNaOH, 3,964 г глутаровой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г средыDMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препараты 125 и 126 были приготовлены с общим выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: глутаровая кислота (Mw 132), NaOH (Mw 40). Препарат 125. К 100,35 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 9,10 г NaOH, 15,40 г глутаровой кислоты и 162,5 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препарат 126. Методику осуществляли, как для препарата 125, но с скорректированными количествами (см. табл. 18). Таблица 18 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2. оо Препарат 50 исключили из исследования долговременной стабильности из-за его первоначального pH (выше 8,0) и его антацидной способности (определяемой слишком долго).II.4.2. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты. В заключение, стабильность ротавируса в жидком глутаратном препарате связана с pH: pH 6,17 дает хорошую стабильность в течение 1 недели при 37 С, тогда как при pH 8,1 наблюдается 0,7 log потери.II.5.1 Адипатсодержащие препараты, представленные в табл. 19, были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая, за исключением препарата 45,который был получен с выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая, и препарата 63, который был получен с выходом 320,8 г (247 мл), соответствующим 164 дозам по 1,5 мл(1,95 г) каждая. Антацидные вещества: адипиновая кислота (Mw 146), NaOH (Mw 40). Препарат 45. К 15,38 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г NaOH, 4,3809 г адипиновой кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас.- 21012046 Препарат 63. К 112,50 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 320,8 г) последовательно добавляют 9,3 г NaOH, 17,00 г адипиновой кислоты и 162,5 г сахарозы. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6,08% мас./мас. Препарат 81. К 116,70 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 9,28 г NaOH, 17,00 г адипиновой кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примереDMEM составляет 6% мас./мас. Препараты 82, 83, 91-97, 100-109, 122-124, 131-134, 136-145, 147, 148. К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют NaOH, адипиновую кислоту и сахарозу в количествах, приведенных в табл. 19 и 23. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Полученную смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Некоторые параметры, показанные жирным шрифтом в табл. 19, варьировали для тестирования эффективности полученных препаратов в отношении антацидной способности и стабильности вируса. Таблица 19 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2; НО - не определено;- повтор. оо Препарат 45 исключили, поскольку определение антацидной способности было слишком долгим. оо Препараты 103, 104 и 108, 109 исключили, поскольку адипиновая кислота перекристаллизуется при стоянии при 4-8 С. оо Препараты 107, 141 и 142 исключили, поскольку они аналогичны препарату, уже находящемуся на апробации. оо Препараты 136-140 исключили, поскольку первоначальный pH был слишком высоким.II.5.2. Стабильность ротавируса и антацидная способность - результаты. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере III.2.2. Результаты показаны в табл. 19, 20, 21 и 22. Таблица 20 Стабильность вируса при комнатной температуре- 23012046 Таблица 21 Стабильность вируса при 4 С месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено. Антацидную способность препаратов 91-94 измеряли с помощью "способа Россетт-Райса у грудных детей" (см.пример III.2.2) и показали возможность достижения 8, 12, 16, или 20 мин при pH больше 4. Результаты показаны в табл. 22 и на фиг. 2 А. Таблица 22 В заключение, как наблюдалали для других карбоксилатных препаратов, в адипатной серии высокое значение pH не дало данных о хорошей стабильности (смотри, например, препарат 124, который имеет pH 9,5 и демонстрирует более чем 2,85 log потери вируса после 1 недели хранения при 37 С). Максимальное приемлемое предельное значение pH составляет примерно 8,0 (смотри, например,значение pH 7,96, полученное для препарата 143), для которого наблюдается потеря вируса 0,5 log после 1 недели при 37 С. Подходящий диапазон pH для этих препаратов составляет от примерно pH 5,5 до примерно pH 8, с наиболее подходящим диапазоном от pH 6,0 до 7,7. Адипатный (пищевая добавка) препарат обеспечивает хороший компромисс с оптимальными значениями pKa (pKa1 5,4 и pKa2 4,43), которые позволяют достичь целевой антацидной способности (например, t=12 мин) с использованием допустимых количеств вещества (примерно 100 мг на дозу). Кроме того, эти количества совместимы с параметрами растворимости, обеспечивая при этом приготовление вакцины в дозовом объеме 1,5 мл. Это невозможно с классическими цитрат-фосфатными препаратами из-за технической неосуществимости, такой как кристаллизация фосфата (см. сравнительный пример IV). Они также совместимы с параметрами токсичности, поскольку данные по токсичности довольно низкие (пероральная LD50 у крыс: 5,7 г/кг) для адипата по сравнению с другими карбоксилатами.II.5.3. Эффект вирусного титра в вакцинной дозе на стабильность вируса. Следующий эксперимент осуществляли для оценки эффекта первоначального ротавирусного титра(106,0, 106,5, 105,2) в вакцинной дозе 1,5 мл на стабильность ротавируса. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере III.2.2. Результаты показаны в табл. 23, 24, и 25. Таблица 23 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2. Таблица 24 Стабильность вируса при комнатной температуре- 25012046 Таблица 25 Стабильность вируса при 4 С месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено. В заключение, в оцененном диапазоне стабильность ротавируса остается аналогичной и приемлемой, какой бы ни был первоначальный вирусный титр.II.5.4. Препараты с адипатом в присутствии ионов кальция. Сообщили, что кальций может влиять на стабильность и конформацию ротавирусного SA11 гликопротеина VP7, экспрессирующегося в Dictyostelium discoideum (K.R. Emslie et al., 1996, Journal of Biotechnology 50,149-159). Добавление ионов кальция к адипатсодержащему антиротавирусному жидкому препарату по изобретению может быть полезным, поскольку они могут способствовать стабилизации ротавируса в данном препарате. Соответственно, были протестированы различные количества ионов кальция в адипатном препарате (табл. 26). Протестировали два альтернативных варианта: CaCl2 и Са(ОН)2. Препараты 98, 116-118. К 9,28 г NaOH последовательно добавляют воду (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 17,00 г адипиновой кислоты, CaCl2, как указано в табл. 26 (происходит осаждение, но осадок снова растворяется после одного часа перемешивания при комнатной температуре, за исключением препарата 117), и 178,75 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям,описанным для препарата 82. В этом препарате DMEM составляет 6% мас./мас. Препарат 99. К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют Са(ОН)2, как указано в табл. 26,17,00 г адипиновой кислоты, 9,02 г NaOH и 178,75 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 82. В этом препарате DMEM составляет 6% мас./мас. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, приведенному в примере III.2.2. Результаты показаны в табл. 26, 27 и 28. Препараты 119-121. К CaCl2, как указано в табл. 26, последовательно добавляют воду (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г), 9,28 г NaOH (в этом случае происходит осаждение Са(ОН)2,но осадок снова растворяется после добавления адипиновой кислоты, за исключением препарата 121),17,00 г адипиновой кислоты и 178,75 г сахарозы. Остальные стадии приготовления идентичны стадиям,описанным для препарата 82. В этом препарате DMEM составляет 6% мас./мас. Таблица 26 определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2.oo Препараты 117 и 121 исключили, поскольку во время их получения осаждалось некоторое количество нерастворимого вещества.- 26012046 Таблица 27 Стабильность вируса при комнатной температуре месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено. Таблица 28 Стабильность вируса при 4 С месяц(ы); пустые прямоугольники - не определено. Заключение: показана стабильность ротавируса в присутствии ионов кальция: после 1 недели при 37 С наблюдалась потеря не более чем 0,3 log, что аналогично результату, полученному для препаратов,приготовленных в одних и тех же условиях и содержащих одни и те же ингредиенты, за исключением добавленных ионов кальция (см., например, препарат 83 в табл. 19-21).II.5.5 Препараты с адипатом в присутствии пероральных полиовирусов. Некоторые рутинные схемы иммунизации могут объединить одновременно пероральные вакцинации против полно- и ротавирусов. Цель следующего эксперимента состояла в том, чтобы оценить, совместимы ли обе вакцинации. Поэтому получали экспериментальную пероральную объединенную вакцину против полио/ротавирусов. Состав среды OPV (Oral Polio Virus), используемой для препаратов 149,151-155. Препараты 149-155. К воде (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют NaOH и адипиновую кислоту в количествах, указанных в табл. 29, и 178,75 г сахарозы. После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях и в соответствии с количествами, указанными в табл. 29, добавляли среду DMEM, содержащую необходимое количество ротавируса для получения 106,5 CCID50 на дозу и среду OPV, содержа- 27012046 щую необходимые количества полиовирусов для получения 106,6 типа I, 105,6 типа II, 106,1 типа IIICCID50 на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Полученную смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этих примерах DMEM составляет 6% мас./мас., сахароза составляет 55% мас./мас., NaOH составляет 0,92 М, адипиновая кислота составляет 0,466 М. Таблица 29 Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере III.2.2. Результаты показаны в табл. 30 (в этой таблице все вирусные титры в определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2.Можно оценить, что соответствие между БОЕ и CCID50 составляет примерно 0,5 log (например 106,0, выраженное в CCID50, эквивалентно приблизительно 105,5, выраженному в БОЕ на дозу). Пустые прямоугольники: не определено "нет" означают, что соответствующий вирус не был включен в формулу. Выводы. 1) Среда для полиовирусов совместима с антацидной способностью (BRR 12 мин в препарате 149). 2) Среда для полиовирусов совместима с ротавирусом (сравнение препарата 150 с препаратом 151,где можно видеть, что для обоих препаратов получены одни и те же титры, как при t=0 (4C), так и после одной недели при 37 С). 3) Антиротавирусная композиция совместима с полиовирусом (полученный ожидаемый полиовирусный титр в препарате 152).II.5.6 Стабильность адипатных препаратов в процессе замораживания.II. 5.6.1. Замораживание при -20 С. Антиротавирусный препарат 95 после 6 месяцев хранения при температуре от +4 до +8 С подвергали 3 последовательным замораживаниям (-20 С) согласно следующему графику (табл. 31)II. 5.6.2. Замораживание при -70 С. Антиротавирусный препарат 95 после 14 месяцев хранения при температуре от +4 до +8 С подвергали одному замораживанию при -70 С согласно следующему графику (табл. 31). Образцы анализировали и сравнивали с вирусным титром при t=0 (4C), a также с вирусным титром образцов с одинаковым сроком хранения при обычной температуре холодильной камеры (15 месяцев при В заключение, композиция препарата 95 (адипатный препарат) совместима с по меньшей мере 3 последовательными замораживаниями при -20 С. Она также совместима по меньшей мере с одним замораживанием при -70 С.II.6.1. Препараты, представленные в табл. 33 (за исключением препаратов 46, 64, 84, 85 и 86), были приготовлены с выходом 325 г (250 мл), соответствующим 166,6 дозам по 1,5 мл (1,95 г) каждая. Антацидные вещества: D,L-яблочная кислота (Mw 146), NaOH (Mw 40). Препарат 46 был приготовлен с выходом 44 г (35 мл), соответствующим 20 дозам по 1,75 мл (2,2 г) каждая. Антацидные вещества: D,L-яблочная кислота (Mw 146), NaOH (Mw 40). Препарат 46. К 15,74 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 44 г) последовательно добавляют 2,4 г NaOH, 4,0211 г яблочной кислоты и 19,5 г сахарозы (44% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 2,34 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,75 мл или 2,2 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препарат 64 был приготовлен с выходом 318,4 г (244,5 мл), соответствующим 163 дозам по 1,5 мл(1,95 г) каждая. Антацидные вещества: D,L-яблочная кислота (Mw 146), NaOH (Mw 40). Препарат 64. К 97,3 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 318,4 г) последовательно добавляют 14,6 г NaOH, 24,50 г яблочной кислоты и 162,5 г сахарозы (51% мас./мас.). После полного растворения данный раствор стерилизуют фильтрацией на 0,2 мкм мембране. В стерильных условиях добавляют 19,5 г среды DMEM, содержащей необходимое количество ротавируса для получения 106,0 БОЕ на дозу. В этом случае доза составляет 1,5 мл или 1,95 г. Смесь гомогенизируют и размещают в подходящем дозовом контейнере. В этом примере DMEM составляет 6,12% мас./мас.- 29012046 Препарат 71. К 103,9 г воды (количество, которое определено для достижения конечного препарата 325 г) последовательно добавляют 14,90 г NaOH, 25,00 г адипиновой кислоты и 162,5 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примереDMEM составляет 6% мас./мас. Препараты 72-77, 84-86: методику осуществляли, как для препарата 71, но с скорректированными количествами (см. табл. 33). Препарат 78. К 75,00 г воды последовательно добавляют 8,00 г NaOH, 25,00 г яблочной кислоты, достаточное количество 1 н. раствора NaOH для достижения pH 6,48, дополнительное количество воды для достижения 325 г и 162,50 г сахарозы (50% мас./мас.). Остальные стадии приготовления идентичны стадиям, описанным для препарата 67. В этом примере DMEM составляет 6% мас./мас. Препараты 79 и 80. Методику осуществляли, как для препарата 78, но с скорректированными количествами (см. табл. 33). Таблица 33 Определено с помощью теста Россетт-Райса у грудных детей (BRR), модифицированного согласно примеру III.2.2;- повтор.oo Препарат 73 исключили из-за трудностей в процессе стерильной фильтрации из-за высокой вязкости раствора.oo Препарат 75 исключили из-за медленного растворения сахарозы. Титрование ротавируса в различные моменты времени оценивали согласно методике, представленной в примере III.1, а антацидную способность препарата оценивали согласно протоколу, представленному в примере III.2.2. Результаты показаны в табл. 33, 34 и 35. Таблица 34 Стабильность вируса при комнатной температуре