Пептиды механо-фактора роста и их применение

013230 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к биологически активным полипептидам, полученным из Е-домена,который образует С-конец сплайсингового варианта инсулинподобного фактора роста (IGF-I), известного как механо-фактор роста (MGF). Эти пептиды модифицированы для улучшения их стабильности в сравнении с природным пептидом Е-домена. Уровень техники Полипептиды IGF-I млекопитающих имеют ряд изоформ, которые возникают в результате альтернативного сплайсинга мРНК. В общих чертах, существуют два типа изоформ, изоформы печеночного типа и изоформы непеченочного типа. Изоформы печеночного типа могут экспрессироваться в печени или в другом месте, но при их экспрессии в другом месте они являются эквивалентными изоформам,экспрессируемым в печени. Они обладают системным действием и являются основными изоформами у млекопитающих. Изоформы непеченочного типа являются менее распространенными, и считается, что они имеют аутокринное/паракринное действие. Изоформа MGF, к которой относится это изобретение,является изоформой последнего типа. В MGF (Yang et al., 1996; McKoy et al., 1999) альтернативный сплайсинг вводит вставку, которая изменяет рамку считывания С-концевой части молекулы. Эта вставка имеет длину 49 п.н. в MGF человека. В MGF крысы и кролика подобное действие имеет вставку из 52 п.н. Результатом является то, чтоMGF является немного длиннее, чем IGF-I печеночного типа (так как терминирующий кодон появляется позднее вследствие сдвига рамки считывания), и то, что С-концевой Е-домен имеет отличающуюся последовательность. Он также является в целом меньшим, так как он лишен гликозилирования. В MGF человека С-конец образован Е-доменом из 24 аминокислот, иногда называемым Еспептидом (SEQ ID NO:27). В MGF крысы и кролика соответствующие домены Е, иногда называемые Ebпептидами, имеют длину 25 аминокислот (SEQ ID NO:13/14). Вместо этого IGF-I печеночного типа содержит Еа-пептид на С-конце. Последовательности Еа- и Ec/Eb-пептидов не являются родственными друг другу вследствие обсуждаемого выше сдвига рамки считывания. Присутствие сплайсингового варианта с тем, что, как видно теперь, является С-концом MGF, было впервые замечено Chew et al (1995),которые идентифицировали его в ткани печени во время исследований на пациентах, страдающих от рака печени, но не исследовали его вообще в отношении потенциальной функции или терапевтической значимости.Goldspink и сотрудники уже идентифицировали MGF для применения против нарушений скелетной мышцы, особенно мышечной дистрофии; для применения против нарушения сердечной мышцы, особенно в профилактике или ограничении повреждения миокарда в ответ на ишемию или механическую перегрузку сердца; для лечения неврологических нарушений в целом и для восстановления (репарации) нервов, в частности, WO 97/33997; WO 01/136483; WO 01/85781; WO 03/066082. Становится все яснее, чтоIGF-I печеночного типа и MGF имеют разные роли и функции. Так, Hill and Goldspink (2003) показали,что в передней большеберцовой мышце крысы MGF экспрессируется быстро в ответ на механическое повреждение, вызванное электрической стимуляцией или вследствие инъекции бупивакаина, но что его экспрессия затем снижается в пределах нескольких дней. Напротив, IGF-I печеночного типа активируется более медленно, и его увеличение соответствует снижению экспрессии MGF. Кроме того, Yang andGoldspink (2002) показали с использованием линии мышечных клеток С 2 С 12 мыши в качестве модели invitro, что пептид из 24 аминокислот, сходный с Ес-пептидом из С-конца MGF человека, но с гистидином в предпоследнем положении, а не с природным аргинином, и с дополнительным С-концевым цистеином,имеет активность в сравнении с активностью зрелого IGF-I, отличающуюся тем, что он увеличивает пролиферацию миобласта, но ингибирует образование мышечных трубочек. Dluzniewska et al., (September 2005) показали также сильное нейрозащитное действие родственного пептида, опять с гистидином в предпоследнем положении, а не с природным аргинином, и некоторыми модификациями вследствие превращения L-аргинина в D-аргинин в положениях 14 и 15 плюс С-концевым амидированием и ПЭГилированием. Сущность изобретения Однако авторы данного изобретения обнаружили, что природный С-концевой Ес-пептид MGF человека имеет короткий период полувыведения в плазме человека. Таким образом, стабилизирующие модификации могут увеличивать его потенциал для применения в качестве фармацевтического вещества. Авторы данного изобретения показали также, что стабилизированные С-концевые Е-пептиды MGF обладают нейрозащитными и кардиозащитными свойствами, а также способностью увеличивать силу нормальной и дистрофической скелетной мышцы. Таким образом, данное изобретение обеспечивает полипептид, содержащий до 50 аминокислотных остатков; причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Епептида изоформы механо-фактора роста (MGF) инсулинподобного фактора роста I (IGF-I); причем указанный полипептид включает в себя одну или несколько модификаций, которые придают ему увеличенную стабильность в сравнении с немодифицированным Е-пептидом MGF; и причем указанный полипептид обладает биологической активностью.-1 013230 Это изобретение обеспечивает также удлиненный полипептид, содержащий полипептид данного изобретения, удлиненный аминокислотной последовательностью не дикого типа, N-концевой и/или Сконцевой относительно указанного полипептида. Это изобретение обеспечивает также композицию, содержащую полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения и носитель. Это изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, содержащую полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Это изобретение обеспечивает также полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения для применения в способе лечения человека или животного. Это изобретение обеспечивает также способ лечения мышечного нарушения введением пациенту,нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения. Указанным мышечным нарушением может быть, например, нарушение скелетной мышцы или нарушение сердечной мышцы. Это изобретение обеспечивает также способ лечения неврологического нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения. Это изобретение обеспечивает также применение полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения в приготовлении лекарственного средства для применения в описанном выше лечении. Это изобретение обеспечивает также способ лечения неврологического нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества: полипептида, содержащего до 50 аминокислотных остатков, причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Е-пептида изоформы механо-фактора роста (MGF) инсулинподобного фактора роста I (IGF-I); или удлиненного полипептида, содержащего указанный полипептид и удлиненного аминокислотной последовательностью не дикого типа, Nконцевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида; причем указанный полипептид или удлиненный полипептид обладает биологической активностью. Это изобретение обеспечивает также способ лечения нарушения сердечной мышцы введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества: полипептида, содержащего до 50 аминокислотных остатков, причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Е-пептида изоформы механо-фактора роста (MGF) инсулинподобного фактора роста I (IGF-I); или удлиненного полипептида, содержащего указанный полипептид и удлиненного аминокислотной последовательностью не дикого типа, Nконцевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида; причем указанный полипептид обладает биологической активностью. Это изобретение обеспечивает также применение полипептида, содержащего до 50 аминокислотных остатков, причем указанный полипептид содержит последовательность аминокислот, полученную из С-концевого Е-пептида изоформы механо-фактора роста (MGF) инсулинподобного фактора роста I (IGFI); или удлиненного полипептида, содержащего указанный полипептид и удлиненного аминокислотной последовательностью не дикого типа, N-концевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида; причем указанный полипептид обладает биологической активностью в приготовлении лекарственного средства для применения в лечении неврологического нарушения или нарушения сердечной мышцы. Краткое описание фигур Фиг. 1: Выравнивание последовательностей, показывающее последовательности, кодируемые частью последовательности каждого из MGF человека, крысы и кролика и IGF-I печеночного типа человека, крысы или кролика (аминокислоты 26-110 SEQ ID NO:2 и до 26-111 SEQ ID NO:4 и 6: см. ниже), и выделяющее различия между MGF и IGF-I на С-конце; созданные вставкой 49 п.н. в MGF человека и вставкой 52 п.н. в MGF крысы/кролика, приводящие к сдвигу рамки считывания и дивергенции на Сконце. Фиг. 2: Действие замещения аланина и С-концевого и N-концевого укорочения на стабильность и биологическую активность - дополнительное выравнивание последовательностей, сравнивающее модифицированные последовательности пептидов 1-6 (SEQ ID NO:15-20) и коротких пептидов 1-4 (SEQ IDNO:21-24) и детализация влияния изменений на стабильность, измеренную инкубированием в плазме человека, и биологическую активность, измеренную тестированием линии мышечных клеток (см. примеры в отношении подробностей тест-процедур). На этой фигуре первые два столбца слева идентифицируют эти пептиды и дают их последовательности, идентифицирующие изменения, сделанные путем замещения. Третий столбец дает результаты тестов на стабильность (см. пример 5 в отношении подробностей) и последний столбец справа дает результаты тестов на биологическую активность (опять см. пример 5 в отношении подробностей). Фиг. 3: Увеличение силы дистрофической мышцы мыши после инъекции стабилизированного пептида спустя 3 недели(A) процентное изменение тетанической силы в дистрофической мышце мышей mdx после инъекции стабилизированного пептида (левый столбец) и IGF (правый столбец).(B) процентное изменение тетанической силы в дистрофической мышце мышей mdx после инъекции стабилизированного пептида (левый столбец) и контроля-носителя PBS (правый столбец). Фиг. 4: Кардиозащита после введения стабилизированного пептида - сравнение фракций выброса,достигаемых после введения в овечье сердце с инфарктом стабилизированного пептида (третий столбец,названный Ес-доменом), полноразмерного MGF (четвертый столбец), зрелого IGF-I (второй столбец) и контрольного препарата (первый столбец). Фиг. 5: Результаты петли давление/объем, показывающие сохранение функции после инфаркта миокарда (MI) - для нормального (наверху слева) и поврежденного (MI) (наверху справа) желудочка мыши, и показывающие действие стабилизированного пептида, доставляемого системно в MI-сердце(внизу справа, названное пептид MGF и нормальное сердце (внизу слева). Все панели показывают давление (мм рт. ст.) на Y-оси и Относительные Единицы Объема на Х-оси. Фиг. 6: Нейрозащитные действия в системе срезов головного мозга крысы - слева направо, процент мертвых клеток после обработки стабилизированным пептидом (обозначенным MGF), IGF-I, ТВН,ТВН + стабилизированный пептид (24 ч), ТВН + IGF-I (24 ч), ТВН + стабилизированный пептид (48 ч),ТВН + IGF-I (48 ч). Фиг. 7: Вестерн-блоты, демонстрирующие более высокую стабильность стабилизированного пептида, который включает в себя превращение аргинина из L- в D-форму и N-концевое ПЭГилирование стабильность стабилизированного пептида в сравнении с соответствующим пептидом, лишенным превращения L- в D-форму и N-концевого ПЭГилирования, исследовали инкубированием в свежей плазме человека в течение диапазона различных временных интервалов. Затем использовали Вестерн-блоттинг для оценки выживания каждого пептида на протяжении временных интервалов: А=0 мин; В=30 мин; С=2 часа; D=24 ч. Результаты для пептида с L-D-превращением и N-концевым ПЭГилированием показаны справа; результаты для пептида, лишенного превращений L-формы в D-форму и N-концевого ПЭГилирования, находятся слева. Фиг. 8: Действие С-концевых пептидов из 8-аминокислот на пролиферацию мышечных клеток С 1 С 12:(A) DMGF- и CMGF-пептиды: Клетки С 2 С 12 получали при 2000 клеток на лунку в среде, содержащей DMEM (1000 мг/л глюкоза),плюс BSA (100 мкг/мл), плюс IGF-I (2 нг/мл), и инкубировали в течение 36 ч. Затем пролиферацию клеток оценивали с использованием анализа с красителем Аламаровым синим. Левая группа показателей показывает результаты для экспериментов с концентрациями DMGF-пептида (см. пример 1.3.1 в отношении подробностей) 2, 5, 50 и 100 нг/мл. Средняя группа показателей показывает результаты для экспериментов с концентрациями CMGF-пептида (см. пример 1.3.1 в отношении подробностей) 2, 5, 50 и 100 нг/мл. Левая группа показателей показывает результаты для экспериментов с концентрациями одногоIGF-I (см. пример 1.5 в отношении подробностей) 2, 5, 50 и 100 нг/мл. Величины Y-оси являются флуоресценцией (длина волны возбуждения 535 нм, измерения при 590 нм; среднее плюс стандартная ошибка) в анализе с красителем Аламаровым синим.BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл пептидов А 2, А 4, А 6 и А 8 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I (см. серию результатов справа). Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, не содержащие клеток, только среду, 5%FBS и без BrdU. Величины на Y-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первый столбец слева относится к контролю без присутствующих клеток. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А 2 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А 4 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Центральные три столбца относятся к контролям, содержащим только среду (med), 5% FBS) и не содержащим BrdU. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А 6 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Следующие четыре столбца относятся к пептиду А 8 в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Правая группа результатов относится к IGF-I (см. пример 1.5) в концентрациях 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл. Фиг. 9: Действие на пролиферацию на клетках HSMM(А) Пептид А 5: Клетки HSMM при 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% FBS с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А 5 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I. ВключениеBrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие только среду, без клеток (BLK), окрашивание фона (BG) и 10% FBS. Величины на Y-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А 5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий-3 013230 столбец относится к контролю, содержащему только среду. Следующие три столбца относятся к IGF-I(см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% FBS, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно.обозначает Р 0,05 в сравнении с контролем только со средой.(В) Пептид А 5: Клетки HSMM при 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% FCS с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А 5 в комбинации с 2 нг/мл IGF-I, вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I. Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие среду, дополненную 2 нг/мл IGF-I, без клеток (BLK), и 10% FBS. Величины на Y-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А 5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующие три столбца относятся к IGF-I (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл. Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% FBS, среду, дополненную 2 нг/мл IGF-I, и без клеток, соответственно.обозначает Р 0,01 иобозначает Р 0,001 в сравнении с контролем со средой, содержащей 2 нг/мл IGF-I. Фиг. 10: Действие на пролиферацию на клетках HSMM(А) Пептид А 5: Клетки HSMM при 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 часов в 10% FCS с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 часов и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А 5 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I. Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие только среду, без клеток (BLK), окрашивание фона (BG) и 10% FBS. Величины на Y-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А 5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду. Следующие три столбца относятся кIGF-I (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% FBS, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно.обозначает Р 0,05 в сравнении с контролем только со средой.(В) Пептид А 5: Клетки HSMM при 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% FCS с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А 5 в комбинации с 2 нг/мл IGF-I, вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I. Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие среду, дополненную 2 нг/мл IGF-I, без клеток (BLK), фоновое окрашивание (Bg) и 10% FBS. Величины на Y-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А 5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду, дополненную 2 нг/мл IGF-I. Следующие три столбца относятся к IGF-I (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10%FBS, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно.обозначает Р 0,1 в сравнении с контролем со средой, содержащей 2 нг/мл IGF-I. Фиг. 11: Действие на пролиферацию на клетках HSMM(А) Пептид А 5: Клетки HSMM при 1000 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% FBS с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А 5 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I. Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие только среду, без клеток (BLK), окрашивание фона (BG) и 10% FCS. Величины наY-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм; среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А 5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду. Следующие три столбца относятся к IGF-I (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл). Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10% FCS, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно.(В) Пептид А 5: Клетки HSMM при 1000 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% FCS с последующими двумя промывками в бессывороточной среде, стимуляцией в течение 48 ч и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл пептида А 5 в комбинации с 2 нг/мл IGF-I, вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I. Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации. Обеспечивали также контроли, содержащие среду, дополненную 2 нг/мл IGF-I, без клеток (BLK), фоновое окрашивание (BG) и 10% FBS. Величины на Y-оси являются флуоресценцией (оптическая плотность при 370 нм;-4 013230 среднее плюс стандартная ошибка для 4 лунок). Первые пять столбцов относятся к пептиду А 5 в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл. Следующий столбец относится к контролю, содержащему только среду, дополненную 2 нг/мл IGF-I. Следующие три столбца относятся к IGF-I (см. пример 1.5) одному в концентрациях 100, 10 и 0,1 нг/мл. Следующие три столбца относятся к контролям, содержащим 10%FBS, фоновое окрашивание и отсутствие клеток, соответственно.обозначает Р 0,1 в сравнении с контролем со средой, содержащей 2 нг/мл IGF-I. Информация о последовательностях ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности MGF человека, крысы и кролика приведены в Списке последовательностей в виде SEQ ID NO:1/2, 3/4 и 5/6, соответственно. Их называют полноразмерными последовательностями MGF, так как они представляют зрелый MGF, кодируемый экзонами 3/4/5/6 гена IGF-I, включающими в себя вставку 49/52 п.н., который изменяет рамку считывания и создает характерный С-конец MGF. Экзоны 1 и 2 являются альтернативными лидерными последовательностями. Для сравнения, соответствующие ДНК-последовательности и аминокислотные последовательности из IGF-I печеночного типа человека, крысы и кролика приведены в виде SEQ ID NO:7/8, 9/10 и 11/12, соответственно. Сравнение этих шести аминокислотных последовательностей от начала последовательности, кодируемой экзоном 4, и далее, сделано на фиг. 1. Последовательность нативного Eb-пептида крысы (25 аминокислот; аминокислоты 87-111 SEQ IDID NO:2) от С-конца MGF человека приведена в виде SEQ ID NO:27. Модифицированные последовательности, полученные из пептида SEQ ID NO:27, приведены в видеSEQ ID NO:28-32. В SEQ ID NO:28 серин заменен аланином в положении 5. В SEQ ID NO:29 серин заменен аланином в положении 12. В SEQ ID NO:30 серин заменен аланином в положении 18. В SEQ ID NO:31 аргинин заменен аланином в положении 14. В SEQ ID NO:32 аргинин заменен аланином в положении 14 и аргинин заменен также аланином в положении 15. Нативный Ес-пептид человека имеет аргинин в предпоследнем положении. Вариант этого нативного пептида с гистидином в предпоследнем положении был синтезирован и показан в SEQ ID NO:15. Этот пептид описан также как пептид 1 на фиг. 2. SEQ ID NO:26 представляет последовательность полноразмерного MGF человека, включающего в себя гистидин в предпоследнем положении вместо аргинина.SEQ ID NO:25 является кодирующей последовательностью ДНК для SEQ ID NO:26, в которой гистидин в предпоследнем положении кодируется САС, а остальная последовательность является такой же, что и вSEQ ID NO:1. Модифицированные последовательности, полученные из пептида SEQ ID NO:15, приведены в видеSEQ ID NO:16-24. Они сравниваются с пептидом SEQ ID NO:15 и другим пептидом на фиг. 2. В пептиде 2 (SEQ ID NO:16) серин заменен аланином в положении 5. В пептиде 3 (SEQ ID NO:17) серин заменен аланином в положении 12. В пептиде 4 (SEQ ID NO:18) серин заменен аланином в положении 18. В пептиде 5 (SEQ ID NO:19) аргинин заменен аланином в положении 14. В пептиде 6 (SEQ ID NO:20) аргинин заменен аланином в положении 14 и аргинин также заменен аланином в положении 15. В коротком пептиде 1 (SEQ ID NO:21) аргинин заменен аланином в положении 14 и две С-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 2 (SEQ ID NO:22) аргинин заменен аланином в положении 14 и четыре Сконцевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 3 (SEQ ID NO:23) аргинин заменен аланином в положении 14 и три Nконцевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 4 (SEQ ID NO:24) аргинин заменен аланином в положении 14 и пять Nконцевых аминокислот удалены. Четыре содержащие 8 аминокислот последовательности пептидов также включены в Список последовательностей.SEQ ID NO:33 является 8 С-концевыми аминокислотами вариантной последовательности SEQ IDSEQ ID NO:36 является последовательностью SEQ ID NO:34 с серином в положении 2, замещенным аланином. Таким образом, она соответствует 8 С-концевым аминокислотам SEQ ID NO:30. Для облегчения ссылки эти последовательности описаны также в следующей таблице. Подробное описание изобретения Полипептиды и удлиненные полипептиды изобретения Полипептиды изобретения Полипептиды данного изобретения имеют длину до 50 аминокислотных остатков. Например, они могут иметь длину до 10 аминокислот, до 30 аминокислот, например длину 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислот или до 35, 40, 45 или 50 аминокислот. Предпочтительно, они имеют длину 15-30 аминокислот, более предпочтительно 20-28, наиболее предпочтительно 22, 23, 24 или 25 аминокислот. Предпочтительными являются также полипептиды с длиной 5-10 аминокислот, т.е. 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, особенно полипептиды с длиной 8 аминокислот.-7 013230 Полипептид данного изобретения содержит последовательность аминокислот, полученную из Сконцевого Е-пептида изоформы MGF IGF-I. Изоформа MGF является, как обсуждалось выше, изоформой, в которой альтернативный сплайсинг вводит в мРНК вставку, которая удлиняет и изменяет рамку считывания С-концевого Е-пептида, обнаруженного в С-конце IGF-I, с образованием Ec- или Eb-пептида. Изоформа MGF будет обычно иметь по меньшей мере 80%, предпочтительно 85% или 90% идентичность последовательности с одним из MGF SEQ ID NO:2, 4 или 6. В MGF человека (SEQ ID NO:1 и 2) эта вставка состоит из 49 п.н., и С-концевой Е-пептид известен как Ес-пептид (SEQ ID NO:27), который имеет длину 24 аминокислот. В MGF крысы и кролика (SEQ ID NO:3-6) эта вставка состоит из 49 п.н., и Сконцевые Е-пептиды известны как Eb-пептиды, которые имеют длину 25 аминокислот (SEQ ID NO:13 и 14). Последовательность данного изобретения может быть получена из любого из этих С-концевых Епептидов MGF или из другого С-концевого Е-пептида из MGF любых других видов. Последовательность, содержащаяся в полипептиде данного изобретения и полученная из Сконцевого Е-пептида изоформы MGF, может быть получена из указанного С-концевого Е-пептида любым путем, пока удовлетворяются требования в отношении биологической активности и стабильности(см. ниже). В частности, эта последовательность может быть получена из С-концевого Е-пептида MGF в том смысле, что она имеет точно последовательность С-концевого Е-пептида (например, SEQ ID NO:13,14, 27 или 34) и только не присутствует в полноразмерной молекуле MGF. Она может быть получена из С-концевого Е-пептида MGF в том смысле, что ее последовательность является измененной (см. раздел Модификации ниже), опять, пока удовлетворяются требования в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). До максимальной длины 50 аминокислот этот полипептид может также содержать нативную последовательность MGF, N-терминальную относительно последовательности, полученной из С-концевого Епептида. Альтернативно, любая дополнительная последовательность может быть не получена из MGF,т.е. она может быть любой последовательностью, опять-таки, пока она соответствуют требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Последовательность, полученная из С-концевого Е-пептида MGF, может включать в себя по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20 аминокислот, например 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23 или 24 аминокислоты в случае С-концевого Ес-пептида MGF человека или 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в случае С-концевого Eb-пептида MGF крысы или кролика. Альтернативно, она может включать в себя до 10 аминокислот, предпочтительно 5-10 аминокислот, т.е. 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, особенно 8 аминокислот. Полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть собраны вместе с образованием больших структур, содержащих два или более полипептидов данного изобретения, например множественные копии одного и того же полипептида или удлиненных полипептидов данного изобретения, или смеси различных полипептидов. В зависимости от природы полипептидов и, в частности, от того, содержат ли они любые L-D-превращения (см. ниже), эти структуры могут быть получены в виде слитых белков, обычно рекомбинантной экспрессией стандартными способами из кодирующей ДНК, или собраны синтетически, или экспрессированы в виде слитых белков и затем подвергнуты подходящим химическим модификациям. Удлиненные полипептиды изобретения Удлиненный полипептид данного изобретения содержит полипептид данного изобретения, удлиненный последовательностью не дикого типа. Под этим имеется в виду, что любая удлиненная последовательность не является последовательностью MGF в том смысле, что, если N-конец или С-конец полипептида данного изобретения представляет нативную последовательность MGF, то эта последовательность может быть просто не присоединена к любой последовательности, которая соседствует с ней в нативном MGF. Кроме того, удлинение может иметь любую оследовательность. Таким образом, полипептиды данного изобретения могут быть удлинены на любом конце или на обоих С-и N-концах аминокислотной последовательностью любой длины. Например, удлинение может содержать до 5, до 10, до 20, до 50 или до 100 или 200 или более аминокислот. Обычно любое такое удлинение будет коротким, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот в длину. Удлинение может содержать аминокислоты Dформы, или даже может состоять целиком из аминокислот D-формы (см. ниже), например для уменьшения атаки экзопептидаз. Например, полипептид может быть удлинен 1-5 аминокислотами D-формы на одном конце или на обоих концах. Например, в некоторых вариантах осуществления на С-конце может быть включен дополнительный остаток цистеина. Модификации Полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения может быть модифицирован любым способом, который увеличивает его стабильность в сравнении с немодифицированным Е-пептидом, из которого получена их последовательность. Стабильность может быть увеличена различными путями. Например, ожидается, что модификации (например, ПЭГилирование или другие химические модификации или превращения аминокислот L-D-форм) в отношении С- и/или N-концов этого белка будут защищать от против атаки экзопептидаз, как и циклизация, и что внутренние модификации (например, замещение, делеция, инсерция и внутреннее превращение L-D-форм) будут защищать его от расщепления-8 013230 эндопептидазами вследствие разрушения их сайтов расщепления. Например, полипептид может быть ПЭГилирован предпочтительно на N-конце до такой степени,что местоположение ПЭГилирования может регулироваться, хотя также предполагается ПЭГилирование в других сайтах, таких как С-конец и между С- и N-концами. ПЭГилирование включает в себя ковалентное присоединение ПЭГ к этому полипептиду. Любой подходящий тип ПЭГ, например любой подходящей молекулярной массы, может быть использован, пока полученный ПЭГилированный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Для достижения стабилизации или для другой цели полипептид данного изобретения может также включать в себя другие химические модификации наряду с ПЭГилированием или вместо него. Такие модификации включают в себя гликозилирование, сульфатирование, амидирование или ацетилирование. В частности, полипептиды могут быть ацетилированы на N-конце или амидированы на С-конце или на обоих концах. Альтернативно или дополнительно может быть добавлена одна или несколько групп гексановой или аминогексановой кислоты, предпочтительно одна группа гексановой или аминогексановой кислоты, обычно на N-конце. Наряду с этим или альтернативно, этот полипептид или удлиненный полипептид может включать в себя одну или несколько аминокислот в D-форме. В природе аминокислоты находятся в L-форме. Встраивание аминокислот D-формы может улучшать стабильность. Обычно могут быть использованы несколько, например 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот D-формы. Однако может быть также использовано большее количество, например 5-10, 10-15, 15-20 или 20 или более, пока полученный ПЭГилированный полипептид соответствует всем требованиям в отношении биологической активности и стабильности(см. ниже). Если он удовлетворяет этим требованиям, даже весь этот полипептид может быть синтезирован с использованием аминокислот в D-форме. Аминокислоты в D-форме могут быть использованы в любом положении в этом полипептиде. В Сконцевом Е-пептиде MGF человека SEQ ID NO:27 предпочтительно заменять один или оба аргинина в положениях 14 и 15 аминокислотами в D-форме. Соответствующие изменения являются также предпочтительными в последовательностях SEQ ID NO:13 и 14 крысы и кролика (положения 14, 15 и 16, так как последовательности крысы/кролика содержат три аргинина последовательно, тогда как Е-пептид человека содержит только два аргинина) и в вариантной последовательности SEQ ID NO:15. Стереохимические и/или направленные пептидные изомеры могут быть также использованы. Например, могут быть использованы ретро (RE)-пептиды, в которых последовательность данного изобретения собрана из L-аминокислот, но в обращенном порядке. Альтернативно, могут быть использованы ретро-инверсо (RI)-пептиды, в которых последовательность является обращенной и синтезированной изD-аминокислот. Дополнительно или альтернативно, D-аминокислоты могут быть включены на одном конце или на другом конце, или на обоих концах этого полипептида. Предполагается, что это поможет защитить от воздействия экзопептидаз. Это может быть достигнуто превращением концевых аминокислот, например концевых 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот на одном или на обоих концах последовательности, полученной из С-концевого Е-пептида MGF в D-форму. Альтернативно или дополнительно, это может быть достигнуто добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных аминокислот D-формы на одном или на обоих концах этого полипептида. Такие дополнительные аминокислоты могут соответствовать или могут не соответствовать аминокислотам, которые граничат с последовательностью, полученной из С-концевого Е-пептида MGF,в нативном MGF. Такие дополнительные аминокислоты могут быть любыми аминокислотами. Одной возможной аминокислотой для добавления в D-форме таким образом является аргинин. Например, остаток аргинина в D-форме может быть добавлен на N-конце, на С-конце или на обоих концах. В одном варианте осуществления последовательность нативного С-концевого Е-пептида MGF человека SEQ ID NO:27 сохраняют, но аргинины в положениях 14 и 15 SEQ ID NO:27 превращают в Dформу и обеспечивают N-концевое ПЭГилирование. Может быть также обеспечено С-концевое амидирование. В другом варианте осуществления последовательность варианта С-концевого Е-пептида MGF человека SEQ ID NO:15 сохраняют, но аргинины 14 и 15 в SEQ ID NO:15 превращают в D-форму и обеспечивают N-концевое ПЭГилирование. В некоторых дополнительных вариантах осуществления используют последовательность из 8 Сконцевых аминокислот из SEQ ID NO:15 или 27, т.е. последовательность SEQ ID NO:33 или 34, и обеспечивают N-концевое ПЭГилирование или на С-конце добавляют группу гексановой или аминогексановой кислоты. Может быть также обеспечено С-концевое амидирование. Альтернативно или дополнительно, полипептиды данного изобретения могут также включать в себя другие модификации, например укорочение, инсерцию, внутреннюю делецию или замещение. Что касается укорочения, было обнаружено, что более короткие пептиды, основанные на Сконцевых восьми аминокислотах SEQ ID NO:15, являются активными. Однако результаты в примере 5 ниже предполагают, что активность более длинных пептидов, связанных с С-концом MGF, может быть вполне чувствительной к укорочению, в частности N-конца этих пептидов. На N-конце пептида SEQ IDNO:15 укорочение на 3 аминокислоты приводило к потере активности в модели мышечных клеток, ис-9 013230 пользованной в примере 5. На С-конце пептида SEQ ID NO:15 укорочение на четыре аминокислоты приводило к потере активности в модели мышечных клеток, хотя укорочение на две аминокислоты не приводило к потере активности. Таким образом, в случае нативных последовательностей Е-пептида человека, крысы и кролика и в вариантном Е-пептиде SEQ ID NO:15 и других пептидах данного изобретения,которые имеют длины, сравнимые с длинами нативных пептидов (например, 18 или более аминокислот),ожидается, что можно будет удалять 1, 2 или 3 аминокислоты на С-конце без потери активности. Ожидается также, что можно будет удалять 1 или 2 аминокислоты на N-конце без потери активности. Что касается инсерции, короткие отрезки аминокислот могут быть инсертированы в последовательность, полученную из последовательности С-концевого Е-пептида MGF человека, пока полученный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже) и содержит менее чем 50 аминокислот. Каждая инсерция может содержать, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Могут быть одна или более, например 2, 3, 4 или 5 таких инсерции. Что касается делеции, короткие отрезки аминокислот могут быть делетированы из внутренней последовательности, полученной из последовательности С-концевого Е-пептида MGF, пока полученный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Одна или несколько таких делеций, например, 1, 2, 3, 4 или 5 делеций, могут быть получены, например, до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот в целом. Что касается замещения, любая из аминокислот в этом полипептиде может быть, в принципе, замещена любой другой аминокислотой, пока полученный полипептид соответствует требованиям в отношении биологической активности и стабильности (см. ниже). Одно или несколько таких замещений могут быть получены, например, до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, до 15 или до 20 замен в целом. Предпочтительно в последовательности, полученной из С-концевого Е-пептида MGF, будут выполняться не более чем 10 замещений, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замещений. Предпочтительно, в последовательности,полученной из С-концевого Е-пептида MGF, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% аминокислотных остатков будут такими же,что и аминокислотные остатки в нативном С-концевом Е-пептиде MGF, из которого получена эта последовательность. В одном предпочтительном подходе замещены остатки на одном конце или на обоих концах этого полипептида (концевые остатки). Ожидается, что это будет защищать от атаки экзопептидаз. Таким образом, может быть предпочтительной замещение остатков в N-концевых и С-концевых положениях или в положениях, непосредственно смежных с концевыми положениями, или до 3, 4, или 5 положений от одного конца или обоих концов. Замещения могут увеличивать стабильность или биологическую активность. Например, результаты,обсуждаемые в примере 5 и на фиг. 2 ниже, указывают на то, что замещение в одном или нескольких положениях 5, 12, 14 и 18 пептида SEQ ID NO:15 может увеличивать стабильность. Те же самые результаты показывают, что замещения в положениях 12, 14 и 18 могут также увеличивать биологическую активность. Таким образом, предпочтительными являются замещения в положениях 5, 12, 14 и 18 пептидовNO:15 и 27). Предпочтительными являются также соответствующие замещения в положениях 5, 12, 15 и 19 С-концевых Е-пептидов MGF крысы/кролика SEQ ID NO:13 и 14. Независимо от того, находится ли она в положениях 5, 12, 14 или 18 SEQ ID NO:27 или 15, положении 2 SEQ ID NO:33 и 34, положениях 5, 12, 15 и 19 SEQ ID NO:13 и 14 или в другом месте, замещение нативной аминокислоты аланином является предпочтительной возможностью, как показано в примере 5 и на фиг. 2. Однако равным образом могут быть использованы и другие аминокислоты. Альтернативно или дополнительно, этот полипептид может включать в себя замещения, которые не имеют значимого действия на стабильность или биологическую активность. Они обычно будут консервативными замещениями. Консервативные замещения могут быть выполнены, например, в соответствии со следующей таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и предпочтительно в одном и том же ряду в третьем столбце могут замещать друг друга. Обычно модификации аминокислотных последовательностей, такие как L-D-превращения, замещения, инсерции и делеции, в полипептидах данного изобретения будут обнаружены в последовательности аминокислот, которая получена из С-концевого Е-пептида MGF. Однако, если этот полипептид содержит дополнительную MGF-последовательность, они могут быть альтернативно или дополнительно обнару- 10013230 жены в этой дополнительной последовательности. Например, если полипептид данного изобретения содержит дополнительную MGF-последовательность, которая является N-концевой относительно последовательности этого Е-пептида (например, SEQ ID NO:13, 14 или 27) в нативном MGF, в этой последовательности могут быть обнаружены модификации. Альтернативно или дополнительно, стабильность может быть также увеличена циклизацией полипептидов или удлиненных полипептидов данного изобретения. Ожидается, что это будет защищать от атаки экзопептидаз. Предпочтительные полипептиды данного изобретения включают в себя следующие полипептиды.(i) Пептид, который имеет длину 24 аминокислот и имеет последовательность SEQ ID NO:15, но стабилизирован превращением двух аргининов SEQ ID NO:15 (положения 14 и 15) из L-формы в Dформу и N-концевым ПЭГилированием.(ii) Пептид, как в (i) выше, т.е. имеющий последовательность SEQ ID NO:15, но стабилизированный превращением двух аргининов SEQ ID NO:15 (положения 14 и 15) из L-формы в D-форму.(iv) Пептид, описанный в примере 5 и на фиг. 2 в виде короткого пептида 1 (SEQ ID NO:21), который имеет последовательность SEQ ID NO:19 (в которой аргинин в положении 14 заменен аланином), но укорочен на 2 аминокислоты в С-конце.(v) Пептид, соответствующий пептиду (i), приведенному выше, но основанный на нативном Сконцевом пептиде человека SEQ ID NO:27, который содержит аргинин, а не гистидин в предпоследнем положении, т.е. пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:27, но стабилизированный превращением двух аргининов в положениях 14 и 15 SEQ ID NO:27 из L-формы в D-форму и N-концевым ПЭГилированием.(vi) Пептид, как в (v), приведенному выше, но лишенный ПЭГилирования, т.е. имеющий последовательность SEQ ID NO:27, но стабилизированный превращением двух аргининов в положениях 14 и 15(vii) Пептиды, соответствующие пептидам (iii), приведенным выше, но основанные на нативном Сконцевом пептиде человека SEQ ID NO:27, которые содержат аргинин, а не гистидин в предпоследнем положении; показанные здесь в виде SEQ ID NO:28-31.(viii) Пептиды любой из SEQ ID NO:33-36 с N-концевым ПЭГилированием или присоединением Nконцевой группы гексановой или аминогексановой кислоты.(ix) Любой из пептидов (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii) или (viii), приведенный выше с С-концевым амидированием, особенно пептиды (ii) и (vi), приведенные выше с С-концевым амидированием, т.е. пептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO:15 и 27, с превращением L-аргинина в D-аргинин в положениях 14 и 15 и С-концевым амидированием, но не имеющие ПЭГилирования.(х) Любой из пептидов (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) или (ix), приведенных выше, с дополнительным остатком цистеина на С-конце.(xi) Любой из пептидов (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) или (ix), приведенных выше с дополнительным остатком аргинина D-формы на N-конце. Модификации в соответствии с этим изобретением могут придавать дополнительные преимущества, а также увеличенную стабильность. Например, они могут придавать увеличенную терапевтическую активность или быть предпочтительными с иммунологической точки зрения (например, вследствие уменьшенной иммуногенности). Это относится, в частности, к модификациям, которые включают в себяL-D-превращение и/или стереохимическую и/или направленную изомерию (см. выше). Биологическая активность Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения обладают биологической активностью. Эта активность может быть выбрана из следующего. Способность увеличивать мышечную силу в дистрофической и/или недистрофической мышце у мышей, людей или других млекопитающих (см. пример 2 ниже). Предпочтительно полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет способен увеличивать мышечную силу (например,измеренную по максимальной полученной тетанической силе) по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 100% в дистрофической и/или недистрофической мышце. Кардиозащитная способность у овец, мышей, людей или других животных (см. пример 3 ниже). Предпочтительно, полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет способен предотвращать или ограничивать повреждение миокарда в имеющем инфаркт или механически перегруженном сердце. Это может быть измерено по петлям давление/объем или ссылкой на способность увеличивать фракцию выброса в сравнении с поврежденным сердцем, в которое не вводят полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения. Предпочтительно, полипептид или удлиненный полипептид этого изобретения будет способен увеличивать фракцию выброса по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9% или по меньшей мере на- 11013230 10% или более. Нейрозащитная способность in vitro или in vivo у мышей, песчанок, людей или других млекопитающих (см. пример 4 ниже). Предпочтительно полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет иметь способность уменьшать смертность клеток в органотипических культурах гиппокампа и/или других сходных моделях in vitro. Предпочтительно после воздействия ТВН или другого агента, который индуцирует окислительный стресс или вызывает повреждение другими путями, полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет иметь способность уменьшать смертность клеток в таких моделях по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90% или более. Альтернативно или дополнительно, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь нейрозащитную способность. Кроме того, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь одно или несколько биологических свойств, характерных для полноразмерного MGF (например, SEQ ID NO:2,4 или 6). Например, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь функциональные свойства MGF, идентифицированные в WO 97/33997. В частности, они могут быть способны индуцировать рост скелетной мышечной ткани. Подобным образом, как обсуждалось здесь, они могут иметь способность положительно регулировать синтез белка, необходимый для восстановления(репарации) скелетных мышц, и/или активировать сателлитные (стволовые) клетки в скелетной мышце. В этом отношении одним способом оценки биологической активности является способ с использованием красителя Аламарового Синего, обсуждаемого в примере 5.2.2. Он включает в себя контактирование полипептида с мононуклеарными миобластными клетками и оценку степени, до которой он заставляет их пролиферировать. Это может оцениваться в баллах любым подходящим способом, например,по шкале 0-3, как обсуждается в примерах. Активность может быть также измерена с использованием циклинов, таких как циклин ID, которые являются ранними маркерами деления клеток. Активность может быть также измерена с использованием бромдезоксиуридина (BrdU). BrdU будет замещать собой тимидин во время репликации ДНК и, следовательно, может быть использован для идентификации клеток, ДНК которых подвергается репликации, и для количественного измерения репликации и клеточного деления, которые имеют место. Альтернативно или дополнительно, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь нейрологические свойства, ранее идентифицированные в WO 01/136483. Таким образом, они могут обладать способностью спасения мотонейронов. В частности, они могут быть способны уменьшать потерю мотонейронов после авульсии нерва на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% у лечащегося субъекта в сравнении с эквивалентной ситуацией у не получающего лечения субъекта. Предпочтительным является уменьшение потери мотонейронов на 70 или более или 80% или более (т.е. до 30% или менее или 20% или менее). Степень спасения может быть рассчитана с использованием любого подходящего способа, например, известного способа, такого как стереологический способ. В качестве конкретного теста могут быть использованы способы, использованные в WO 01/136483, которые основаны на измерении спасения мотонейронов в ответ на авульсию лицевого нерва у крыс. Альтернативно или дополнительно, полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь свойства, идентифицированные в WO 03/060882, одним из которых является, скажем,способность предотвращать или ограничивать повреждение миокарда после ишемии или механической перегрузки предотвращением смерти клеток, или апоптоза, мышечных клеток миокарда. Предпочтительно, полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет иметь способность полного предотвращения апоптоза в зоне сердечной мышцы, к которой он применен. Однако апоптоз может быть только частично предотвращен, т.е. ограничен. Повреждение является ограниченным, если достигается любое уменьшение повреждения в сравнении с повреждением, которое имело бы место без лечения по данному изобретению, например, если повреждение уменьшается на 1% или более, 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 50% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более,95% или более, 98% или более или 99% или более, как измерено количеством или долей клеток, которые погибают, или размером площади мышцы, которая теряет функцию, или общей способностью сердца нагнетать кровь. В частности, уменьшение повреждения может оцениваться in vivo определением минутного сердечного выброса, фракции выброса и т.д. с использованием минимально инвазивных способов. Могут быть также анализированы такие маркеры, как креатинкиназа и тропонин Т в сыворотке. Имеются параметры, используемые в клинических ситуациях для определения степени повреждения сердечной мышцы после повреждения. Способность предотвращать апоптоз может быть измерена любым подходящим способом. Например, со ссылкой на пример 4 и на фиг. 3 и 6, она может быть измерена по способности предотвращать апоптоз в клетке сердечной мышцы или клеточной линии, подобной сердечным мышечным клеткам, как показано фрагментацией ДНК. Способность предотвращать апоптоз, обнаруживаемая по фрагментации ДНК, может быть испытана обработкой этих клеток сорбитом или другим агентом, который помещает- 12013230 эти клетки под осмотический стресс в течение, например, до 1, 2, 4, 6, 12, 24 или 48 ч, предпочтительно 12-24 ч, более предпочтительно 24 ч, и исследованием, может ли наблюдаться характер фрагментации,ассоциированный с апоптозом. Полипептид MGF данного изобретения, экспрессируемый таким образом,обычно будет уменьшать, предпочтительно элиминировать фрагментацию ДНК в этих условиях, в сравнении с необработанной клеткой, после 6, 12 или 24 ч обработки сорбитом. Отсутствие экспрессии, или низкая экспрессия, генов, которые действуют в качестве маркеров апоптоза, может также действовать как указание предотвращения апоптоза. Одним подходящим маркером является ген Вах. Подобным образом, увеличенная экспрессия антиапоптотических маркеров вMGF-трансфицированных клетках в апоптотических условиях может быть принята за признак того, что полипептид данного изобретения предотвращает апоптоз. Одним подходящим антиапоптотическим маркерным геном является Bcl2. Способность предотвращать апоптоз может быть также измерена по способности полипептида MGF предотвращать уменьшение количества клеток в миоцитных клетках in vitro. Другим предпочтительным свойством полипептидов и удлиненных полипептидов данного изобретения является способность индуцировать гипертрофический фенотип в сердечных мышечных клетках. В частности, это может быть испытано оценкой способности индукции гипертрофического фенотипа в первичных культурах сердечных миоцитов in vitro. Предпочтительным способом определения этого является тестирование на увеличение экспрессии ANF (атриального натрийуретического фактора) и/илиbMHC (тяжелой цепи бета-миозина). ANF является эмбриональным маркерным геном, который положительно регулируется в гипертрофических условиях. bMHC является важным сократительным белком в мышце. Стабильность полипептидов и удлиненных полипептидов изобретения Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения имеют увеличенную стабильность в сравнении с нативными С-концевыми Е-пептидами MGF, из которых получены их последовательности. Такие сравнения выполняют между полипептидом или удлиненным полипептидом данного изобретения и нативным С-концевым Е-пептидом MGF в его выделенной, немодифицированной форме (например, в немодифицированной форме SEQ ID NO:13, 14, 27 или 34, отделенной от остальной молекулы MGF, и в выделенной форме в виде 24-мера (SEQ ID NO:27), 25-мера (SEQ ID NO:13/14) или 8-мера (SEQ IDNO:34. Сравнения могут выполняться также с гистидинсодержащими последовательностями SEQ IDNO:15 и 33. Стабильность может быть увеличена в любой степени посредством обсуждаемых здесь модификаций. Стабильность может оцениваться по периоду полувыведения в плазме человека или любым другим подходящим способом. В частности, стабильность может быть измерена оценкой чувствительности пептидов к протеолитическому расщеплению в свежей плазме человека в соответствии со способом примера 5.1 ниже, в котором эту плазму хранили до использования при -70 С, 10 мкг пептида добавляли к 2 мл плазмы, плюс 7 мл PBS и эту смесь инкубировали при 37 С в течение разных интервалов времени. Затем использовали Вестерн-блоттинг для детектирования каждого пептида на протяжении этих временных интервалов. (На фиг. 7: А=0 мин; В=30 мин; С=2 ч; D=24 ч. Результаты для пептида с L-D-превращением и N-концевым ПЭГилированием показаны справа; результаты для пептида, лишенного превращений Lформы в D-форму и N-концевого ПЭГилирования, показаны слева). Относительно малое количество пептида, лишенного L-D-превращения и ПЭГилирования, могло быть детектировано после 30 мин, очень мало после 2 ч и нисколько или почти нисколько после 24 ч. В отличие от этого, пептид с L-Dпревращением и ПЭГилированием мог быть детектирован в гораздо большем количестве при 2 и 24 ч. Другие меры стабильности могут быть основаны на определении потери биологической активности на протяжении времени. Это может быть выполнено любым подходящим способом, например, с использованием анализа in vitro на любой из критериев биологической активности, обсуждаемых здесь. Количественно, в относительных единицах, предпочтительные полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь периоды полувыведения в плазме, которые увеличены по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200% или по меньшей мере на 500% или более в сравнении с соответствующим немодифицированным Сконцевым Е-пептидом MGF. Количественно, в относительных единицах, предпочтительные полипептиды или удлиненные полипептиды данного изобретения могут иметь периоды полувыведения в плазме по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 8 ч, по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 24 ч или по меньшей мере 48 ч или более. Альтернативно, могут быть использованы количественные или полуколичественные измерения стабильности, как в примере 5 и на фиг. 2, например, балльной оценкой стабильности полипептидов и удлиненных полипептидов по шкале от 0 до 3. По этой шкале полипептид SEQ ID NO:15 имел оценку 1. Некоторые другие модифицированные полипептиды данного изобретения имели оценки 2 или 3. Полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения будет обычно иметь оценку, более высокую на такой шкале, чем соответствующий нативный С-концевой Е-пептид MGF.- 13013230 Дополнительные пептиды изобретения Хотя многие из пептидов данного изобретения будут стабилизированными, в определенных обстоятельствах можно использовать нестабилизированные полипептиды, в том числе нативные полипептидыSEQ ID NO: 13, 14, 27 и 34 или гистидинсодержащий вариант SEQ ID NO:15 и 33. В лечении неврологических и сердечных нарушений в соответствии с этим изобретением может быть желательной относительно быстрая деградация полипептида или удлиненного полипептида данного изобретения, т.е. проявление его действия в течение относительно короткого периода времени. Таким образом, стабилизация необязательно потребуется в контексте таких способов лечения. В случаях, когда стабилизации не требуется, предпочтительно использовать полипептиды SEQ IDNO:13, 14, 27 и 34 или гистидинсодержащий вариант SEQ ID NO:15 и 33 без стабилизирующих модификаций. Однако могут быть также использованы модифицированные полипептиды. Любая из обсужденных здесь модификаций может быть использована, за исключением того, что, в этом аспекте, не требуется, чтобы эти модификации приводили к увеличенной стабильности. Способы лечения в соответствии с изобретением Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть использованы для лечения ряда состояний. В широком смысле они разделяются на три категории: нарушения скелетной мышцы, нарушения сердечной мышцы и неврологические нарушения. Однако поскольку нервная и мышечная функции являются взаимозависимыми, между этими категориями может быть некоторое перекрывание, например, в категории нервно-мышечных нарушений. Неврологические нарушения могут быть обычно разделены на две категории, нейрогенные нарушения, где дефект лежит в самой нервной системе, и миогенные или связанные с мускулатурой неврологические нарушения. Обе категории могут лечиться в соответствии с этим изобретением. Нарушения скелетной мышцы, которые являются чувствительными к лечению в соответствии с этим изобретением, включают в себя мышечную дистрофию, в том числе, но не только, мышечную дистрофию Дюшенна или мышечную дистрофию Беккера, плече-лопаточно-лицевую мышечную дистрофию(FSHD), врожденную мышечную дистрофию (CMD) и аутосомные дистрофии, и родственные прогрессирующие слабость и истощение скелетной мышцы; мышечную атрофию; в том числе, но не только, ограниченную атрофию от неиспользования мышц, индуцированную глюкокортикоидом атрофию, мышечную атрофию в людях старшего возраста и мышечную атрофию, индуцированную повреждениями спинного мозга или нервно-мышечными заболеваниями; кахексию, например кахексию, ассоциированную с раком, СПИДом, хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD), хроническими воспалительными заболеваниями, ожоговым повреждением и т.д.; мышечную слабость, особенно в некоторых мышцах, таких как мочевой сфинктер, анальный сфинктер и мышцы диафрагмы таза; саркопению и хрупкость в пожилых людей. Это изобретение находит также применение в восстановлении (репарации) мышц после травмы. Что касается неврологических нарушений, одной из возможностей является лечение нейродегенеративных нарушений. Лечение нарушений мотонейронов, в частности нейродегенеративных нарушений мотонейронов, также является возможным. Примеры неврологических (в том числе нервно-мышечных) нарушений включают в себя боковой амиотрофический склероз; мышечную атрофию спинного мозга; прогрессирующую атрофию спинного мозга; мышечную атрофию детей младшего возраста или юношескую мышечную атрофию, полиомиелит или постполиосиндром; нарушение, вызванное подверганием действию токсина, травму мотонейронов,повреждение мотонейронов или повреждение нерва; повреждение, которое влияет на мотонейроны; и потерю мотонейронов, ассоциированную со старением; и аутосомную, а также связанную с полом мышечную дистрофию; болезнь Альцгеймера; болезнь Паркинсона; диабетическую невропатию; периферические невропатии; эмболический и геморрагический инсульт и связанное с алкоголем повреждение головного мозга. Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть также использованы для поддержания центральной нервной системы (ЦНС). Это изобретение находит также применение в восстановлении (репарации) нервов после травмы. Повреждения нервов могут также лечиться в соответствии с этим изобретением. В этом варианте осуществления полипептид или удлиненный полипептид будет обычно локализован около такого повреждения для осуществления репарации, например, посредством изоляционной трубки около двух концов разрезанного периферического нерва (см. WO 01/85781). Что касается сердечных нарушений, могут быть упомянуты заболевания, в которых стимуляция синтеза белка сердечной мышцы является полезным лечением; кардиомиопатии; острая сердечная недостаточность или острый инсульт, включающий в себя миокардит или инфаркт миокарда; патологическая гипертрофия сердца и застойная сердечная недостаточность. Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть также использованы для улучшения минутного сердечного выброса посредством увеличения ударного систолического объема сердца. В частности, полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть использованы для профилаклики миокардиального повреждения после ишемии и/или механической перегрузки. В этом случае их обычно вводят так быстро, как это только возможно, после возникновения ишемии или механической перегрузки в отношении сердца, например, так быстро, как только был диагно- 14013230 стирован сердечный приступ, вызванный ишемией. Предпочтительно их будут вводить в пределах 5, 10, 15, 30 или 60 мин или в пределах 2 или 5 ч. Предпочтительно ишемия или механическая перегрузка, в ответ на которые вводят полипептид или полинуклеотид MGF, являются временным состоянием. В особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения вводят в ответ на сердечный приступ. Способы лечения по данному изобретению будут особенно эффективными в оказании помощи страдающим от сердечных приступов людям для хорошего восстановления и для возвращения к нормальному, активному стилю жизни. При некоторых обстоятельствах может быть желательным применение полипептидов и удлиненных полипептидов данного изобретения в комбинации с другими фармацевтически активными агентами. Например, полипептиды и удлиненные полипептиды по данному изобретению могут быть использованы вместе IGF-I (см. примеры 1, 5, 7 и 8). Такие комбинированные применения могут включать в себя совместное введение полипептидов или удлиненных полипептидов по данному изобретению в едином фармацевтически приемлемом носителе или эксципиенте с другим фармацевтически активным агентом,или другими фармацевтически активными агентами, или они могут вводиться в виде отдельной, последовательной или одновременной инъекции в одно и то же время или в разных местах. Получение полипептидов и удлиненных полипептидов изобретения Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть получены стандартными способами. Обычно, их будут получать стандартными способами пептидного синтеза и подходящими химическими модификациями (например, ПЭГилированием) в отношении полученной аминокислотной последовательности, если необходимо. В том случае, если нет аминокислот D-формы, полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения могут быть вместо этого получены посредством рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине из подходящей кодирующей ДНК, опять с использованием стандартных способов. Выделение и очистка до любой желаемой степени могут также проводиться стандартными способами. Полипептиды и удлиненные полипептиды по данному изобретению будут обычно выделенными или очищенными, полностью или частично. Препарат выделенного полипептида или удлиненного полипептида является любым препаратом, который содержит полипептид или удлиненный полипептид в более высокой концентрации, чем препарат, в котором он был продуцирован. В частности, если полипептид или удлиненный полипептид получают рекомбинантно, этот полипептид или удлиненный полипептид будет обычно экстрагироваться из клетки-хозяина и основные клеточные компоненты будут удалены. Полипептид или удлиненный полипептид в очищенной форме будет обычно образовывать часть препарата, в котором более чем 90%, например до 95, до 98 или до 99% полипептидного материала в этом препарате являются полипептидом по данному изобретению. Выделенные или очищенные препараты часто будут водными растворами, содержащими полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения. Однако полипептид или удлиненный полипептид данного изобретения может быть выделен или очищен в других формах, например в виде кристаллов или других сухих препаратов. Композиции, готовые формы, введение и дозы Полипептиды и удлиненные полипептиды данного изобретения обеспечены предпочтительно в форме композиций, содержащих полипептид или удлиненный полипептид и носитель. В частности, такая композиция может быть фармацевтической композицией, содержащей полипептид или удлиненный полипептид и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Может быть использована любая подходящая фармацевтическая композиция. Например, подходящие готовые формы могут включать в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты,бактериальные антибиотики и растворенные вещества, которые делают эту готовую форму изотонической с жидкостями тела предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать в себя суспендирующие агенты и загущающие агенты. Эти готовые формы могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах. Например, запаянные ампулы и герметизированные флаконы могут храниться в замороженном или высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Должно быть понятно, что, наряду с конкретно упомянутыми выше ингредиентами, готовые формы данного изобретения могут включать в себя другие агенты, общепринятые в данной области, имеющие отношение к типу рассматриваемой готовой формы. Предпочтительными являются стерильные, апирогенные водные и неводные растворы. Готовые формы обычно приспосабливают стандартными способами приготовления готовых форм,к способам введения, обсуждаемым ниже. Полипептид данного изобретения может вводиться любым подходящим способом, приспособленным к состоянию, подлежащему лечению, например, местным, кожным, парентеральным, внутримы- 15013230 шечным, подкожным или чрескожным введением; или прямой инъекцией в кровоток или прямым нанесением на ткани слизистой оболочки. Инъекция является, по-видимому, предпочтительным способом во многих обстоятельствах, например подкожная, парентеральная, внутримышечная или внутривенная инъекция. Внутривенная инъекция будет часто предпочтительной во многих клинических обстоятельствах. В некоторых обстоятельствах будет возможной так называемая инъекция без иглы или чрескожное введение. В лечении нарушений скелетных мышц предпочтительными способами являются внутривенная и внутримышечная инъекция. Местное введение также предусматривается, например, посредством пластырей, для усиления мышц живота или для других целей. В лечении нарушений сердечной мышцы доставка будет обычно внутривенной. При подходящих клинических обстоятельствах (например, в специализированных кардиологических отделениях) может быть возможна прямая доставка в сердце, например, с использованием так называемой системы инъекции без иглы для доставки полипептида в сердце. Полипептиды и удлиненные полипептиды по данному изобретению могут быть доставлены в любой подходящей дозе и с использованием любой подходящей схемы введения доз. Лицам с квалификацией в данной области будет понятно, что дозовое количество и схема введения доз могут быть приспособлены для гарантии оптимального лечения конкретного подлежащего лечению состояния, в зависимости от многочисленных факторов. Некоторыми такими факторами могут быть возраст, пол и клиническое состояние подлежащего лечению субъекта. На основании собственного опыта авторы изобретения ожидают, что будут эффективными дозы в диапазоне 0,2-10 мг, например 0,2-0,8 мг, предпочтительно приблизительно 0,5 мг. Например, раствор,содержащий полипептид или удлиненный полипептид, в концентрации 1 мг/мл, может быть использован в количестве 0,1-1 мл. Могут предоставляться единственные дозы или множественные дозы, в зависимости от предполагаемого применения и клинических обстоятельств. Следующие примеры иллюстрируют это изобретение. Примеры 1. Пептиды 1.1 Пептиды примеров 2, 3, 4 и 6 Пептид, использованный в примерах 2, 3, 4 и 6, имел последовательность SEQ ID NO:15, в которой предпоследний аргинин нативной последовательности (см. SEQ ID NO:1, 2 и 27) заменен гистидином,стабилизированную с использованием D-формы аргинина вместо природно-встречающейся L-формы в положениях 14 и 15 и ковалентным присоединением N-конца к производному полиэтиленгликоля (ПЭГ)(О',О-бис-(2-аминопропил)полиэтиленгликоль 1900) (Jeffamino) мостиком янтарной кислоты и амидированную на С-конце. 1.2 Пептиды примера 5 Пептиды примера 5 получали из Alta Biosciences, Birmingham, UK, причем эти пептиды были синтезированы стандартными способами с использованием пептидного синтезатора. Эти пептиды являются не-ПЭГилированными и не имеют L-D-превращений и С-концевого амидирования. Кроме того, пептид, соответствующий пептидам 1.1., приведенным выше, с теми же самыми L-Dпревращениями, но без ПЭГилирования, также испытывали на стабильность (см. 5.2.3 ниже). Этот пептид синтезировали при помощи стандартных способов с использованием пептидного синтезатора. Продукт очищали ВЭЖХ и анализировали с использованием MALDI-MS. 2.3 Пептиды примера 7 1.3.1 Пептиды примера 7.1 Пептиды примера 7.1 имели последовательность из 8 аминокислот Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys(SEQ ID NO:33), плюс модификации для улучшения стабильности. В пептиде, называемом DMGF на фиг. 8, стабилизацию получали N-концевым ПЭГилированием, как в 1.1 выше. В пептиде, называемомCMGF на фиг. 8, стабилизацию получали N-концевым присоединением гексановой кислоты. Как DMGF,так и CMGF были также амидированы на С-концевой стороне. 1.3.2 Пептиды примера 7. 2 В примере 7.2, пептиды А 2, А 4 и А 6 имели последовательность Glu-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-Arg-Lys(SEQ ID NO:34). Пептиды А 2, А 4 и А 6 были амидированы на С-конце. Пептид А 2 не был модифицирован на N-конце. Пептид А 4 имел группу гексановой кислоты на N-конце. Пептид А 6 имел группу аминогексановой кислоты, присоединенную к N-концу. Пептид А 8 имел последовательность Glu-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys (SEQ ID NO:33), амидированную на С-конце и с гексановой кислотой, присоединенной к N-концу. 1.4 Пептид примера 8 Пептид, использованный в примере 8, имел последовательность SEQ ID NO:15, в которой предпоследний аргинин нативной последовательности (см. SEQ ID NO:1, 2 и 27) заменен гистидином, стабилизированную с использованием D-формы аргинина вместо природно-встречающейся L-формы в положениях 14 и 15 и амидированную на С-конце. Пептид, использованный в примере 8, не был ПЭГилированным.- 16013230 1.5 Пептид IGF-I Для сравнения использовали пептид IGF-I. Он является доменом связывания рецептора IGF-I, кодируемым экзонами 3 и 4, который является общим во всех сплайсинговых вариантах, и имеет длину приблизительно 70 аминокислот. В примерах 1-4 его получали из PeproTech, EC, UK. В примере 6 его получали из Sigma-Aldrich (ER2 IGF-I). Пептид IGF-I использовали также в примере 7. 2. Инъекция стабилизированного пептида в дистрофическую мышцу При помощи внутримышечных инъекций (инъекций дважды в неделю 25 мкл, содержащих 17 мкг химически стабилизированного пептида) мышечная сила увеличивалась более чем на 25%, в пределах нескольких недель в передней большеберцовой мышце недистрофических мышей. Эта мышца не является больной, подобно мышце мышей mdx (см. ниже), хотя возможно, что она была физически повреждена повторяющимися инъекциями. Более значительные увеличения, до приблизительно 35% (фиг. 3 А, 3 В), регистрировали для внутримышечных инъекций (дважды в неделю в течение трех недель) в дистрофических мышцах мыши mdx,которая имеет тот же самый тип мутации, что и тип мутации в мышечной дистрофии Дюшенна. Инъекции IGF-I приводили только к увеличению приблизительно 5%, как показано на фиг. 3 А. На той же основе результаты сравнения между стабилизированным пептидом и контролем только с носителем PBS показаны на фиг. 3 В. Эти данные, относящиеся к защите и восстановлению мышцы, показывают, что стабилизированный пептид является эффективным в увеличении силы дистрофической и недистрофической мышцы. 3. Кардиозащита и восстановление (репарация) миокарда стабилизированным пептидом Инфаркт миокарда (MI) индуцировали в овечьих сердцах катетеризацией маргинальной ветви огибающей коронарной (венечной) артерии и инъекцией небольшого болюса микросфер для индукции локализованной ишемии. Полноразмерный MGF (нативный С-концевой пептид плюс последовательность,кодируемая экзонами 3 и 4 и общая для MGF и IGF-I печеночного типа) или стабилизированный пептид инъецировали (200 нМ, интракоронарно) спустя 15 мин с использованием того же самого катетера, в то время как животное находилось все еще под анестезией. В качестве контроля использовали зрелый IGF-I печеночного типа. Было обнаружено, что использование одного стабилизированного пептида увеличивает процент жизнеспособного миокарда и фракцию выброса, измеренную эхокардиографией и комьютерным анализом функции выброса после MI. Полноразмерный MGF также имел значимое, хотя и меньшее действие. Зрелый IGF-I печеночного типа проявлял гораздо меньшее действие. Результаты приведены на фиг. 4, которая показывает процентное изменение фракции выброса в день 6 в сравнении с фракцией выброса в день 1, до проведения этой процедуры. Таким образом, стабилизированный пептид был очень эффективным в защите миокарда от ишемического повреждения. Дополнительные эксперименты проводили на мышах. В этих исследованиях MI индуцировали лигированием левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии мышиного сердца. Это вызывает расширение левого желудочка, прогрессирование которого приводит к сердечной недостаточности. Стабилизированный пептид, вводимый системно, заметно улучшает силу и функцию сердца, измеренную по петлям давление/объем (фиг. 5), которые демонстрируют способность сердца нагнетать кровь и расширение, которое происходит, когда поврежденное сердце уже не может справляться с возвратом венозной крови. Это явно улучшается системным введением стабилизированного пептида, посредством которого мышца миокардиальной стенки защищается и увеличивает толщину. Таким образом, имеется значительный потенциал для лечения пациентов сразу же после сердечного приступа. 4. Нейрозащита стабилизированным пептидом после ишемии и общего повреждения 4.1 Нейрозащитное действие in vitro Нейрозащитное действие стабилизированного пептида демонстрировали in vitro с использованием хорошо охарактеризованной модели селективной смерти нейронов в органотипических культурах гиппокампа в крысе. Срезы гиппокампа получали из 7-10-дневных крыс Wistar в соответствии со способом Stoppini et al(1991) с минорными модификациями в соответствии с Sarnowska (2002). Вкратце, крыс анестезировали Вебуталом, охлаждали на льду и обезглавливали. Головной мозг быстро извлекали в охлажденный на льду рабочий раствор с рН 7,2: 96% HBSS/HEPES-(без Са 2+ и Mg2+), содержащий 2 ммоль/л L-глутамина,5 мг/мл глюкозы, 1% амфотерицин В, 0,4% пенициллин-стрептомицин. Гиппокампы отделяли и нарезали на срезы 400 мкм с использованием измельчителя тканей McIlwain. Мембраны Millicell-CM (Millipore) в 6-луночных чашках предварительно уравновешивали 1 мл культуральной среды рН 7,2: 50% DMEM,25% HBSS/HEPES, 25% HS, 2 ммоль/л L-глутамина, 5 мг/мл глюкозы, 1% амфотерицина В, 0,4% пенициллин-стрептомицина, в увлажненной атмосфере воздуха и 5% СО 2 при 32 С в течение 30 мин. Четыре выбранных среза осаждали на каждой мембране. Срезы культивировали в течение двух недель при 32 С в атмосфере СО 2 со 100% влажностью. Жизнеспособность этих срезов проверяли ежедневно окрашиванием иодидом пропидия и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Zeiss Axiovert 25) с камерой МС-10095 (Carl Zeiss Jena GmbH) для регистрации начального поглощения PI (Sarnowska, 2002).- 17013230 Окислительный стресс индуцировали после 14 дней в культуре добавлением 30 мМ ТВН (третбутилпероксида) в течение 3 ч. После этого времени срезы переносили в свежую культуральную среду. Полученную смерть клеток оценивали спустя 24 и 48 ч после начала эксперимента. Стабилизированный пептид или, для целей сравнения, рекомбинантный IGF-I добавляли к культуральной среде до конечной концентрации 100 нг/мл в начале эксперимента, и он непрерывно присутствовал в среде. Для исследования пути, в котором действует MGF, специфическое в отношении IGF-I-рецептора(АВ-1) блокирующее антитело (Oncogene) включали в среду за 1 ч перед подверганием срезов действию ТВН и пептида MGF или IGF-I. Концентрацию антитела (1000 нг/мл) использовали в соответствии с рекомендацией изготовителя. Для получения детальных изображений этих срезов использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Zeiss LSM 510). Для возбуждения иодида пропидиума (PI) использовали гелийнеоновый лазер (543 нм). После получения изображения обрабатывали с использованием пакета программного обеспечения v.2.8 Zeiss LSM 510. Количественное измерение разрушения тканей выполняли с использованием анализатора изображений KS 300 (Carl Zeiss Jena GmbH). Повреждение клеток измеряли количественно на изображениях флуоресценции PI-окрашенных культур спустя 24 и 48 ч после воздействия ТВН. Относительную степень смерти клеток рассчитывали из каждого стандартизированного района СА 1 следующим образом: % мертвых клеток = (экспериментальная интенсивность флуоресценции (FI)-FI фона)/(максимальная FI -FI фона) х 100, где максимальную величину получают убиванием всех клеток воздействием 100 мМ глутамата. Все измерения повторяли для 5 независимых препаратов культур и использовали 8 срезов для каждого экспериментального условия. Статистическую значимость различий между результатами рассчитывали с использованием однофакторного Anova с последующим критерием Дуннета (GraphPad Prism 3.02). Срезы головного мозга крыс выделяли после индукции локализованного повреждения третбутилгидропероксидом (ТВН), как обсуждалось выше. Определяли результирующую гибель клеток в обработанных и необработанных средах мозга. Это иллюстрируется на фиг. 6. В отсутствие пептида обработки ТВН вызывал смерть приблизительно 60% клеток в пределах 24 ч, но после обработки стабилизированным пептидом (100 нг/мл) наблюдали 85% защиту. Пептид IGF-I-рецепторного домена (rIGF-I),который был также частью полноразмерного MGF, был также нейрозащитным (как сообщалось ранее). Однако эта защита была выражена в меньшей степени (72%), и защитное действие IGF-I было заметным только до 24 ч, тогда как стабилизированный пептид действовал значительно дольше, так как его нейрозащитное действие все еще явно наблюдали после 48 ч. 4.2 Нейрозащитное действие в модели песчанки Другие эксперименты проводили с использованием модели ишемии головного мозга песчанки. Для оценки нейрозащиты конфокальную микроскопию проводили на головном мозге после введения стабилизированного пептида или IGF-I-рецептор-связывающего домена. В головном мозгу песчанки билатеральное лигирование общих сонных артерий неизменно вызывает специфические повреждения гиппокампа: в области СА 1, пирамидальные нейроны начинают умирать спустя 3-4 дня после ишемии. Использовали самцов монгольских (когтистых) песчанок с массой 50-60 г. Ишемическое повреждение вызывали 5-минутным лигированием общих сонных артерий при анестезии галотаном в атмосфереN2O:O2 (70:30) в строго контролируемых нормотермических условиях, как описано ранее (DomanskaJanik et al., 2004). Мозговое кровообращение подвергали непрерывному мониторингу лазерной потокометрией Допплера (Muro, Inc.). Группа животных получала стабилизированный пептид или IGF-I (1 мкг/мкл в PBS) инъекцией в дозе 25 мкг непосредственно в левую сонную артерию сразу же после реперфузии. Ложнооперированных животных инъецировали той же самой дозой этого пептида. Обычно спустя 10-15 мин после этой процедуры обработанные животные стояли на ногах и вели себя, как необработанные животные. Животным предоставляли период восстановления в течение одной недели, затем их перфузировали охлажденным на льду 4% параформальдегидом в PBS при пентобарбитальной анестезии. Гистологическую оценку выполняли на залитых в парафин и фиксированных срезах толщиной 10 мм, окрашенных гематоксилином/эозином. Степень повреждения клеток в области СА 1 гиппокампа определяли количественно, под микроскопом (Zeiss Axioscop 2), в виде среднего числа стойких, интактных нейронов в относящихся к венечному шву срезах. По меньшей мере три определенных поля зрения 300 мкм области СА 1 гиппокампа охватывали с использованием камеры МС 10095 (CarlZeiss Jena GmbH) и считали в компьютеризованной системе анализа изображений (KS 300, Carl Zeiss JenaGmbH). У контрольных животных среднее число морфологически интактных нейронов на длину 300 мкм,оцениваемое в области СА 1, было равно 121,2512,5 (среднееSD, n=5). В противоположность необработанным животным, где только приблизительно 12% (15,25, n=7) нейронов выживали при ишемическом приступе, инъекция (единственный болюс 25 мкг) стабилизированного С-концевого пептида MGF в- 18013230 левую сонную артерию, сразу же после реперфузии, обеспечивала очень значительную нейрозащиту. 83,225 (n=10) нейронов были оценены на инъецированной стороне (74,5% величины неоперированной контрольной группы) и 65,830 (n=10) на контралатеральной стороне (54% величины неоперированной контрольной группы). Таким образом, обработка стабилизированным С-концевым пептидом MGF позволила высокой доле нейронов СА 1 гиппокампа выживать при ишемическом повреждении. В большинстве животных защитное действие было заметным билатерально, тогда как у малого количества оно было наиболее очевидным на инъецированной (левой) стороне. В противоположность этому, инъекция 25 мкг пептида IGF-I оказывала малое влияние на постишемическое выживание нейронов СА 1; спустя 7 дней после повреждения оставались 19,27,3 нейронов(n=5) свободными, что составляет только 15,8% числа нервных клеток в контроле и не является значимо отличающимся от необработанной постишемической группы. 5. Биологическая активность и стабильность модифицированных пептидов 5.1 Пептид, стабилизированный L-D-превращением и N-концевым ПЭГилированием Пептид, использованный в примерах 2, 3 и 4 выше, имел последовательность SEQ ID NO:15 (которая соответствует последовательности Ес-пептида MGF человека (SEQ ID NO:27), за исключением того,что аргинин в предпоследнем положении заменен гистидином), стабилизированную использованием Dформы аргинина в положениях 14 и 15 вместо природной L-формы и ковалентным присоединением Nконца к полиэтиленгликолю (ПЭГ) и амидидированную на С-конце. Биологическая активность этого пептида подтверждается в примерах 2, 3 и 4. Его стабильность демонстрируется фиг. 7. Стабильность пептидов с ПЭГилированием и L-Dпревращением аргинина в положениях 14 и 15 и без ПЭГилирования и L-D-превращения аргинина в положениях 14 и 15 исследовали оценкой чувствительности пептидов к протеолитическому расщеплению в свежей плазме человека. Плазму хранили до использования при -70 С. 100 мкг пептида добавляли к 2 мл плазмы, плюс 7 млPBS. Эту смесь инкубировали при 37 С в течение различных временных интервалов. Затем использовали Вестерн-блоттинг с поликлональным антителом, специфическим в отношении пептидов с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:15, для детектирования каждого пептида на протяжении этих временных интервалов (на фиг. 7: А=0 мин; В=30 мин; С=2 ч; D=24 ч. Результаты для пептида с L-Dпревращением и N-концевым ПЭГилированием показаны справа; результаты для пептида, лишенного превращений L-формы в D-форму и N-концевого ПЭГилирования, находятся слева). Относительно мало пептида, лишенного L-D-превращения и ПЭГилирования, можно было детектировать после 30 мин,очень мало после 2 ч и нисколько или почти нисколько - после 24 ч. В противоположность этому, пептид с L-D-превращением и ПЭГилированием мог детектироваться в изобилии даже после 24 ч. 5.2 Дополнительные пептиды - замена серина или аргинина аланином и С-концевым или Nконцевым укорочением 5.2.1 Дополнительные пептиды Здесь последовательность нативного ЕС-пептида человека из С-конца MGF человека приведена в виде SEQ ID NO:27. В пептиде SEQ ID NO:15 предпоследняя аминокислота, которая является аргинином в нативном пептиде (см. SEQ ID NO:2 и 27), заменена гистидином. Пептид SEQ ID NO: 15 описан в виде пептида 1 на фиг. 2. Дополнительно модифицированные последовательности, полученные из последовательности SEQID NO:15, приведены в виде SEQ ID NO:16-24 и сравниваются с последовательностью SEQ ID NO:15 на фиг. 2, где их называют пептидами 2-6 и короткими пептидами 1-4. В пептиде 2 (SEQ ID NO:16) серин заменен аланином в положении 5. В пептиде 3 (SEQ ID NO:17) серин заменен аланином в положении 12. В пептиде 4 (SEQ ID NO:18) серин заменен аланином в положении 18. В пептиде 5 (SEQ ID NO:19) аргинин заменен аланином в положении 14. В пептиде 6 (SEQ IDNO:20) аргинин заменен аланином в положении 14 и аргинин также заменен аланином в положении 15. В коротком пептиде 1 (SEQ ID NO:21) аргинин заменен аланином в положении 14 и две С-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 2 (SEQ ID NO:22) аргинин заменен аланином в положении 14 и четыре С-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 3 (SEQ ID NO:23) аргинин заменен аланином в положении 14 и три N-концевые аминокислоты удалены. В коротком пептиде 4 (SEQ IDNO:24) аргинин заменен аланином в положении 14 и пять N-концевых аминокислот удалены. 5.2.2 Биологическая активность дополнительных пептидов Биологическую активность измеряли с использованием системы in vitro измерением способности Сконцевых пептидов индуцировать мононуклеарные миобласты (сателлитные клетки) в отношении репликации. Количество клеток определяли при помощи способа с использованием красителя Аламарового синего. Оценку выполняли по шкале 0-3, и эти результаты показаны на фиг. 2. 0 = нет измеримого увеличения количества клеток при 6 ч. 1 = значимое увеличение количества клеток при 4 ч. 2 = значимое увеличение количества клеток при 2 ч. 3 = значимое увеличение количества клеток при 1 ч.- 19013230 Значимость была на уровне Р 0,05 при использовании Т-критерия. Пептид (пептид 1) SEQ ID NO:15 обнаруживал низкую активность или отсутствие активности вследствие его короткого периода полувыведения. Пептид 2 (SEQ ID NO:16) и короткий пептид 1 (SEQNO:20) и короткие пептиды 2, 3 и 4 (SEQ ID NO:22, 23 и 24) не обнаруживали измеримой активности(оценка 0). 5.2.3 Стабильность дополнительных пептидов Стабильность каждого пептида определяли введением его в свежую плазму человека и использованием Вестерн-блоттинга, как обсуждалось в примере 5.1 выше. Подобно биологической активности, стабильность оценивали в баллах по шкале 0-3. Результаты показаны на фиг. 2. Стабильность определяли в виде количества пептида, которое оставалось интактным и связывалось со специфическим антителом следующим образом: 1 = заметная потеря детектируемого связывания антитела при 1/2 ч. 2 = заметная потеря детектируемого связывания при 2 ч. 3 = отсутствие заметной потери связывания антитела при 24 ч. Пептид (пептид 1) SEQ ID NO:15 имел оценку 1. Пептид 6 (SEQ ID NO:20) также имел оценку 1. Пептиды 3 и 4 (SEQ ID NO:17 и 18) имели оценку 2. Пептиды 2 и 5 (SEQ ID NO:16 и 19) имели оценку 3. Пептиды примеров 1-4 также имели оценку 3 по этой шкале. Тот же самый пептид, но лишенный ПЭГилирования, также имел оценку 3 по этой шкале. Короткие пептиды 1-4 еще не были тестированы,хотя Короткие пептиды 2-4, по-видимому, так или иначе не имеют биологической активности. 6. Действие стабилизированного пептида на пролиферацию мышечных сателлитных клеток в дистрофической мышце, мышце при боковом амиотрофическом склерозе (ALS) и мышце здорового человека В этих экспериментах использовали стабилизированный пептид 1.1, приведенный выше. Сравнения выполняли с пептидом IGF-I 1.3, приведенным выше. 6.1 Резюме Первичные культуры мышечных клеток человека получали из биопсий пациентов с врожденной мышечной дистрофией (CMD), плече-лопаточно-лицевой дистрофией (FSHD) и заболеванием мотонейронов или боковым амиотрофическим склерозом (ALS), а также из здоровой мышцы с использованием анализов пролиферации/дифференцировки. Клеточные культуры обрабатывали двумя пептидами и использовали способы иммуноцитохимии для детектирования клеток, экспрессирующих маркер дифференцировки десмин, и общего количества ядер с использованием красителя DAPI. Анализы креатинфосфокиназы (СРК) и белка использовали для определения миогенной дифференцировки после обработки пептидами. Стабилизированный пептид значительно увеличивал пролиферацию стволовых (десминположительных) клеток для нормальной (без заболевания) мышцы (с 38,42,5% до 57,93,2%) в нормальной (без заболевания) конечности и с 49,82,4% до 68,83,9% для нормальных (без заболевания) биопсий черепно-лицевых мышц). Хотя начальные количества мышечных стволовых клеток были более низкими в пациентах с мышечным истощением, стабилизированный пептид все еще индуцировал увеличение (CMD с 10,41,7% до 17,511,6%; FSHD с 11,71,3% до 20,42,1% и ALS с 4,81,1% до 7,20,8%). Эти результаты подтвердили также, что стабилизированный пептид не влиял на образование мышечных трубочек, но показали, что он увеличивает пролиферацию клеток-предшественников миобластов, тогда как зрелый IGF-I усиливает дифференцировку. 6.2 Выделение полученных из мышц человека клеток Первичные культуры мышечных клеток человека выделяли, как описано ранее [Lewis et al., 2000;Sinanan et al., 2004]. Вкратце, после информированного согласия биопсии черепно-лицевой мышцы (жевательной мышцы) получали от здорового взрослого и пациентов с CMD во время рекомендуемой хирургии в Eastman and Middlesex Hospitals, London, UK. Пробы мышцы нижней конечности человека (vastus lateralis) получали от давших информированное согласие взрослого здорового человека и пациентов сFSHD и ALS пункционной биопсией под местной анестезией в Royal Free Hospital, London, UK. Биопсии объединяли от нескольких пациентов с одним и тем же нарушением для получения достаточных количеств клеток в первичных культурах. Их промывали антибиотиком пенициллином, 100 Е/мл; стрептомицином, 100 мкг/мл; фунгизоном, 2,5 мкг/мл; Invitrogen), дополненным DMEM (высокая глюкоза; Invitrogen), измельчали ножницами и фрагменты ткани высевали в покрытые 0,2% желатином (SigmaAldrich) культуральные колбы Т 150 см 2 (Helena Biosciences). Культуры эксплантатов инкубировали в содержащей сыворотку среде для выращивания (sGM), составленной из DMEM, 20% FBS (PAA Laboratories), пенициллина (1000 Е/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) (Invitrogen), и поддерживали при 37 С в увлажненном воздухе (95%) с 5% СО 2. Первую волну миграции мононуклеарных клеток из эксплантата обозначали как D-волна, и эту популяцию использовали во всем этом исследовании. Мигрирующие мышечные клетки человека собирали ферментативно с использованием смеси трипсин-ЕДТА (Invitrogen) и субкультивировали в sGM до 70-80%-ной конфлюэнтности. Число пассажей(Рх) определяли как х-ый- 20013230 последовательный сбор клеток субконфлюэнтных клеток. Все эксперименты выполняли с использованием Р 3-5-когорт (поколений). Затем размноженные клетки хранили при криогенных условиях, пока их не использовали в описанных ниже экспериментах. Выполняли по меньшей мере 6 экспериментов для каждой из обработок, используемых для каждой культуры больной мышцы, а также для двух типов здоровой мышцы. 6.3 Определение популяции миогенных (стволовых) клеток-предшественников in vitro Оценку количества миогенных предшественников выполняли, как описано ранее (Sinanan et al.,2004). Клетки пересевали на покрытые желатином (0,2%) покровные стекла 13 мм при начальной плотности 4,5103 клеток/см 2. Во избежание приводящих к путанице действий IGF и родственного белка в(Trolox; 25 мкг/мл) (Sigma-Aldrich), албумаксом-1 (0,5 мг/мл) (Invitrogen), фетуином (500 мкг/мл) (Clonetics/BiohWittaker), пенициллином (100 Е/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) (Invitrogen). После предоставления возможности для прикрепления в течение 24 ч в dGM добавляли стабилизированный пептид(10 нг/мл) с rIGF-I и без rIGF-I (10 нг/мл), и с моноклональным антителом против IGF-I-рецептора или без моноклонального антитела против IGF-I-рецептора (Ab-1, 100 мкг/мл, Oncogene), по мере необходимости. Используемыми пептидами были (см. 1.1 и 1.3 выше) стабилизированный пептид, родственный Едомену MGF/Ec-пептиду IGF-I [24 аминокислотных ocтатка], синтезированные, как описано ранее[Dluzniewska et al., 2005] и пептид IGF-I человека [70 аминокислотных остатков] (Sigma-Aldrich ER2 IGFI). Все среды сменялись каждые 2-3 дня. Из культур брали пробы в различных временных точках для иммуноцитохимических анализов. 6.4 Иммуноцитохимия В подходящих временных точках клетки фиксировали метанолом в течение 10 мин (-20 С) с последующим увеличением проницаемости с использованием 0,5% Тритона X 100 в течение 10-15 мин. Затем клетки инкубировали в течение 60 мин с антидесмин-антителом (1:100; клон D33, DAKO, Glostrup, Denmark), разбавленным в растворе для разведения антител (ADS; PBS плюс 10% FBS, 0,025% азид натрия,0,1 М лизин). Класс-специфическое анти-IgG мыши-антитело, конъюгированное с FITC (1:200; JacksonImmunoResearch/Laboratories Stratech Scientific), использовали для визуализации. Ядра идентифицировали введением флуоресцентного связывающего ДНК малой бороздки зонда, DAPI (1,0 нг/мл; SigmaAldrich) в конечную стадию инкубирования антитела. Покровные стекла готовили с использованием агента на основе глицерина, препятствующего обесцвечиванию, Citifluor (Citifluor Ltd.), и заливали прозрачным лаком для ногтей. Ассоциированную с клетками флуоресценцию и морфологию визуализировали эпи-флуоресценцией и Leica Modulation Contrast (LMC)-микроскопией, соответственно, с использованием инвертированного микроскопа Leica DMIRB, оборудованного программным обеспечением для обработки изображений Leica FW4000. Для анализа пролиферации все синие и зеленые флуоресцентноположительные клетки считали в поле зрения. По меньшей мере 30 полей зрения в каждом покровном стекле считали последовательным образом; таким образом на каждом покровном стекле считали по меньшей мере 100 клеток. Количество клеток сравнивали в виде процента десмин-положительных клеток с общим количеством DAPI-положительных клеток. 6.5 Анализ креатинфосфокиназы (СРК) Этот анализ выполняли с использованием ранее опубликованных протоколов [Auluck et al., 2005]. Измерение СРК делает возможным количественное сравнение миогенеза [Goto et al., 1999], так как она является маркером образования мышечных трубочек. Фермент СРК катализирует обратимое фосфорилирование аденозин-5-дифосфата (АДФ) с образованием аденозин-5-трифосфата (АТФ) и свободного креатина. Эта реакция может быть прослежена в любом направлении измерением образования неорганического фосфора, конечного продукта реакции, которое пропорционально активности СРК. Эту активность измеряли с использованием колориметрического способа на основе процедуры генерирования неорганического фосфата [Fiske and Subbarow, 1925]. Затем ее выражали в виде содержания белка культуры. Предварительно размноженные первичные культуры мышечных клеток человека повторно высевали при 10104 клеток на лунку в покрытых 0,2% желатином 96-луночных планшетах. Клетки культивировали до 70/80% конфлюэнтности в sGM, затем эту среду заменяли средой для дифференцировки (DM;DMEM, 2% FBS, пенициллин (100 Е/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл, содержащей стабилизированный пептид (24 аминокислотных остатков), синтезированный, как описано ранее [Dluzniewska et al., 2005] и/или пептид IGF-I человека (70 аминокислотных остатков) (Sigma-Aldrich IGF-I ER2). Спустя 48 ч клетки промывали дважды охлажденным на льду PBS и затем хранили в замороженном виде в 0,5 мМ глициновом буфере (рН 6,75) при -70 С. Фиксированные клетки лизировали быстрым оттаиванием и набор для анализа СРК использовали в соответствии с инструкциями изготовителей (Sigma-Aldrich). Концентрацию белка каждой пробы определяли против калибровочной кривой альбумина с использованием набора- 21013230 6.6 Статистический анализ 1-факторный критерий Anova применяли с использованием StatView 4.51 (SAS Institute Inc., Cherwell Scientific Publishing Ltd, Oxford, UK) с последующим post hoc критерием PLSD Фишера. р 0,05 считали значимым. Данные объединяли для всех экспериментов (минимально 6) для 4 типов экспериментов для каждого условия, включающего в себя два типа здоровой мышцы, и представляли в виде среднего значенияSD (стандартное отклонение). 6.7 Доля миогенных предшественников в первичных культурах мышечных клеток человека Процент миогенных (десмин-положительных) клеток определяли из всех испытанных мышц (см. табл. ниже). Нормальная (без заболевания) мышца содержала значительную долю десминположительных клеток, тогда как больная мышца содержала гораздо меньшую долю миогенных клеток. Таблица. Первичные мышечные культуры, полученные из различных мышечных источников, которые содержат различающиеся доли миогенных (десмин-положительных) клеток перед добавлением пептидов 6.8 Действие на нормальные (без заболевания) первичные мышечные клетки-предшественники Стабилизированный пептид увеличивал значимо пролиферацию (изменения в доле десминассоциированных ядер относительно всех ядер) в первичных культурах клеток нормальных черепнолицевых (жевательных) мышц с 49,82,4% до 68,83,9%; р 0,0001). IGF-I также индуцировал умеренное увеличение (с 49,82,4% до 58,44,2%; р 0,0001). Интересно то, что, как было обнаружено, действие стабилизированного пептида на долю пролиферации десмин-положительных клеток ингибировалось при добавлении IGF-I (с 68,83,9% до 59,54,2%; р 0,0001). Это действие, наблюдаемое в нормальной нижней конечности (четырехглавой мышце ядра), было сходным с действием, наблюдаемым с черепнолицевой мышцей. Стабилизированный пептид увеличивал значимо пролиферацию мышечных клетокпредшественников (с 38,42,5% до 57,93,2%; р 0,0001). IGF-I имел только небольшое действие на пролиферацию (с 38,42,5% до 47,13,5%; р 0,0001), но IGF-I полностью уничтожал реакцию на стабилизированный пептид при добавлении этих двух пептидов в комбинации (с 57,93,2 до 38,80,6%; р 0,0001). 6.9 Действие на пролиферацию эмбриональных полученных из мышцы клеток человека в состоянии заболевания После наблюдения, что стабилизированный пептид мог воспроизводимо и значимо увеличивать количество десмин-положительных клеток в здоровой мышце, исследовали действие на мышцу в состоянии заболевания. В первичных культурах, полученных из мышц в случае врожденной мышечной дистрофии (CMD), стабилизированный пептид значимо увеличивал пролиферацию мышечных клетокпредшественников (с 10,41,7% до 17,51,6%; р 0,0001), тогда как IGF-I имел низкое действие (с 10,41,7% до 13,21,7%; р=0,005). При объединении обоих пептидов опять наблюдали ингибирующее действие, как и для здоровой мышцы, причем действие стабилизированного пептида уменьшалось до контрольных уровней (с 17,51,6% до 13,11,2%; р=0,0001). Действия стабилизированного пептида на клеточную пролиферацию мышечных клеток из мышц пациентов с боковым амиотрофическим склерозом - (ALS) и FSHD - давали сходные результаты. Стабилизированный пептид увеличивал количества десмин-положительных клеток заметным образом в этих нарушениях (ALS с 4,81,1% до 7,20,8%; р=0,0002, FSHD с 11,71,3% до 20,42,1%; р 0,0001). Как и в случае со здоровой мышцей, IGF-I опять имел незначительное действие (ALS с 4,81,1% до 4,71,4%, р=0,7719, FSHD с 11,71,3% до 14,11,6%; р=0,0107. При использовании обеих изоформ вместе MGF-индуцированное увеличение экспрессии десмина опять ингибировалось (ALS с 7,20,8% до 5,31,0%; р=0,0024, FSHD с 20,42,1% до 14,51,4%; р 0,0001). 6.10 Увеличенная пролиферация клеток-предшественников Е-доменом MGF относительно IGF-Iрецептора В здоровой мышце увеличение пролиферации, индуцированной стабилизированным пептидом, не ингибировалось присутствием анти-IGFIR-антитела (68,83,9% в MGF-обработанных и 71,16,2% вMGF+Ab-I-обработанных клетках; р=0,2472). То же самое действие наблюдали так же, как для мышцыCMD, так и для мышцы ALS (17,51,6% против 16,71,8%; р=0,4589 для CMD; 7,20,8% против 6,50,8%; р=0,2933 для ALS). Это указывает на то, что действие Е-домена MGF не включает в себя использование IGF-1-рецептора. 6.11 Действия Е-домена MGF на предотвращение терминальной дифференцировки В анализах СРК 6.4, приведенных выше, стабилизированный пептид не способствовал дифференцировке эмбриональных миобластов и образованию мышечных трубочек. В отличие от него, IGF-I в концентрации 10 нг/мл, по-видимому, стимулирует образование мышечных трубочек, так как количества клеток, экспрессирующих десмин, уменьшаются добавлением IGF-I на этой стадии миогенеза. Действительно, в присутствии 10 нг/мл IGF-I стабилизированный пептид действовал в качестве агониста и зависимым от дозы образом предотвращал дифференцировку в стадию, компетентную в отношении слияния миобластов. Уменьшение 100 нг/мл стабилизированного пептида 10 нг/мл системным IGF-I было более низким, чем 10 нг/мл MGF с той же дозой IGF-I. 6.12 Выводы Стабилизированный пептид индуцировал значимо пролиферацию клеток-предшественников в первичной культуре мышц от пациентов с CMD, FSHD и ALS, а также здоровых индивидуумов. Стабилизированный пептид не влиял на образование мышечных трубочек, т.е. на процесс, который значимо ускоряется IGF-I. Это показывает, что биологически активный Е-домен MGF имеет отличающуюся активность в сравнении со зрелым IGF-I. Открытия авторов данного изобретения показывают, что эти различные действия изоформ IGF-I, по-видимому, опосредованы различными рецепторами. Блокирование IGFI-рецептора доказывает, что Е-домен MGF увеличивает пролиферацию сателлитных (стволовых) клеток через другой путь передачи сигнала, чем IGF-I, и что начальная активация сателлитных клеток является другим процессом, отличающимся от процесса, на который влияет зрелый IGF-I. Было сделано предположение, что мышечное истощение в неврологических состояниях и при старении обусловлено потерей сателлитных клеток. Авторы данного изобретения продемонстрировали, что отношение клеток-предшественников (десмин-положительных) к общему числу миобластов из пациентов с CMD, FSHD и ALS является низким в сравнении с этим отношением миобластов из здоровых индивидуумов. Таким образом, вопрос о том, дегенерируются ли мышцы вследствие отсутствия сателлитнрых клеток или вследствие не способности экспрессировать некий фактор для активации сателлитных клеток, является дискуссионным. Авторы данного изобретения показали ранее, что пожилые люди неспособны экспрессировать MGF при уровнях, необходимых для поддержания мышц [Hameed et al.,2004], со сходными открытиями для пациентов с FSHD и ALS (неопубликованные данные). Мышечное истощение является одной из главных причин смерти в случае пациентов с некоторыми нервно-мышечными заболеваниями. Потеря мышц может быть связана с неспособностью экспрессииMGF, и мышцы дистрофической мыши mdx, модели мышечной дистрофии Дюшенна человека, не способны продуцировать MGF во время действия механических стимулов [Goldspink et al., 1996]. De Bari etal. нашли, что, когда мезенхимные стволовые клетки вводят в дистрофические мышцы мыши mdx, восстанавливается экспрессия дистрофина сарколеммой, а также экспрессия MGF [De Bari et al., 2003]. Таким образом, продуцирование MGF может зависеть от эластичности клеточной мембраны и, возможно,включать в себя некоторый тип механизма механотрансдукции, например комплекс дистрофина. В течение некоторого времени было известно, что IGF-I является нейротрофическим фактором и имеет потенциальные клинические применения для нейродегенеративных нарушений, в частности, ALS. С использованием моделей животных системную доставку рекомбинантного IGF-I человека (зрелогоIGF-I) использовали в моделях животных и для лечения пациентов с ALS. Недавно сообщалось, что физическая нагрузка при объединении с IGF-I-генотерапией с использованием вектора AAV2 проявляла некоторые синергические действия в лечении модели ALS животного [Kaspar et al., 2005]. Однако представленные здесь данные указывают на то, что именно активность MGF, а не активность обычного IGF-I, будет предпочтительно применяться в лечении мышечного истощения, так как применение MGF предоставляет эффективный способ пополнения пула мышечных сателлитных (стволовых) клеток, который является необходимым для поддержания и восстановления мышц. Это подтверждает применение пептидов данного изобретения в качестве терапевтических агентов для мышечной дегенерации в таких нарушениях, как CMD, FSHD и ALS, в которых имеется явное нарушение в экспрессии сплайсингового варианта MGF. Имеется также потенциал в отношении применения пептидов данного изобретения для размножения мышечных сателлитных клеток в культуре для клеточной терапии. 7. Анализы пролиферации клеток с использованием пептидов из 8 аминокислот 7.1 Пептиды DMGF и CMGF Пептиды из 8 аминокислот, описанные в 1.3.1 выше и упоминаемые на фиг. 8 А как DMGF и CMGF,испытывали на способность индукции пролиферации мышечных клеток С 2 С 12 при плотности 2000 клеток на лунку в среде, содержащей DMEM (1000 мг/л глюкоза, BSA (100 мкг/мл) и IGF-I (2 нг/мл). Испытывали концентрации 2, 5, 50 и 100 нг/мл DMGF и CMGF (см. серии результатов слева и в середине на фиг. 8), вместе с 2, 5, 50 и 100 нг/мл одного IGF-I (см. серию результатов справа на фиг. 8). После 36 ч- 23013230 инкубации анализ с использованием красителя Аламарового синего использовали для оценки достигнутой пролиферации клеток. Обеспечивали также контроль, содержащий только среду. Как DMGF, так и CMGF индуцировали пролиферацию клеток. Эти результаты показаны на фиг. 8 А в виде флуоресценции в анализе с Аламаровым синим. Все величины для DMGF и CMGF и величины для одного IGF-I были статистически отличающимися от контрольной величины только со средой. Увеличивающиеся уровни пролиферации наблюдали с увеличением концентрации DMGF/CMGF. 7.2 Пептиды А 2, А 4, А 6 и А 8 Пептиды из 8 аминокислот, описанные в 1.3.2 выше и упоминаемые на фиг. 8 В как А 2, А 4, А 6 и А 8,испытывали на способность индукции пролиферации мышечных клеток С 2 С 12 при плотности 500 клеток на лунку. Культивирование проводили в течение 24 ч в 10% FBS с последующим голоданием в течение 24 ч в 0,1% BSA, стимуляцией в течение 24 ч и затем обработкой BrdU в течение 5 ч. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл пептидов А 2, А 4, А 6 и А 8 вместе с 0,1, 1, 10 и 100 нг/мл IGF-I (см. серию результатов справа на фиг. 8 В). Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации клеток. Обеспечивали также контроли, не содержащие клеток, содержащие только среду, 5%FBS и не содержащие BrdU. Пептиды А 2, А 4, А 6 и А 8 индуцировали пролиферацию клеток. Эти результаты показаны на фиг. 8 в виде флуоресценции (оптической плотности при 370 нм; средние величины плюс стандартная ошибка для 4 лунок. 8. Анализы пролиферации миобластов скелетных мышц человека (HSMM) Пептид из 24 аминокислот, описанный в 1.4 выше и упоминаемый на фиг. 9-11 как А 5, испытывали на способность индукции пролиферации мышечных клеток-предшественников человека (Cambrex). Эти клетки являются коммерчески доступными эмбриональными мышечными клетками человека, т.е. мышечными стволовыми клетками (предшественниками) человека. Иногда они известны так же, как миобласты скелетных мышц человека (HSMM). Клетки получали из субъекта-мужчины 39 лет. Культивирование проводили в течение 24 ч в 200 мкл среды SkGM2, дополненной hEGF, L-Glut, дексаметазоном,антибиотиками и 10% FBS. Затем среду для культивирования удаляли и клетки промывали дважды в бессывороточной среде. А 5 тестировали на его способность индуцировать пролиферацию HSMM Cambrex при плотности 500 (фиг. 9 и 10) или 1000 (фиг. 11) клеток на лунку в среде SkGM2 Cambrex, дополненной hEGF, L-Glut,дексаметазоном и антибиотиками. Испытывали концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл А 5 (см. серию результатов на фиг. 9 А, 10 А и 11 А), вместе с 0,1, 10 и 100 нг/мл одного IGF-I (см. серию результатов слева на фиг. 9 А, 10 А и 11 А). Концентрации 0,1, 1, 10, 100 и 500 нг/мл А 5 испытывали также в присутствии 2 нг/мл IGF-I (см. серию результатов слева на фиг. 9 В, 10 В и 11 В). После 48 ч инкубации клетки обрабатывали BrdU в течение 5 ч. Включение BrdU измеряли для оценки уровня достигнутой пролиферации клеток. Обеспечивали также контроли, не содержащие клеток, содержащие только среду, 5% FBS и не содержащие BrdU.IGF-I один не оказывал значимого действия на пролиферацию HSMM в любой дозе (см. фиг. 9-11). После 48 ч пептид А 5 имел значимое действие (Р 0,1) на пролиферации HSMM при применении отдельно в дозах 10 нг/мл и ниже (фиг. 9 А и 10 А). Добавление 2 нг/мл IGF-I к среде в комбинации с А 5 приводило к значимому действию на пролиферации HSMM при более высоком уровне значимости (Р 0,001; фиг. 9 В, 10 В и 11 В). Поскольку эти клетки являются сравнительно медленно растущими, рекомендуется увеличение инкубационного периода с пептидом до 72 ч. Во-вторых, этот сигнал может быть усилен увеличением времени воздействием BrdU. Ссылки(a) до 50 аминокислотных остатков, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID(b) последовательность которого соответствует SEQ ID NO:33 или 34,включающий одну или несколько модификаций, которые придают ему увеличенную стабильность в сравнении с немодифицированной последовательностью, обладает биологической активностью, причем в последовательностях (а)(i) указанные модификации включают один или оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 SEQ ID(ii) указанные модификации включают замещение одной или нескольких аминокислот в положениях 5, 12, 14 или 18, причем, если замещена одна аминокислота в положении 18, указанное замещение представляет собой замещение серина на аланин в положении 18 SEQ ID NO:27 или 15; и в последовательностях (b)(i) модификации включают ПЭГилирование или добавление группы гексановой или аминогексановой кислоты на N-конце или(ii) модификации включают такое замещение, что последовательность соответствует SEQ ID NO:35 или 36. 2. Полипептид по п.1, где указанная биологическая активность выбрана из способности увеличивать мышечную силу, кардиозащитной способности и нейропротективной способности. 3. Полипептид по п.1(a)(i), где оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 SEQ ID NO:27 или 15 находятся в D-форме. 4. Полипептид по п.1(a)(ii), где указанным замещением аланина является одна или несколько из замен (а) серина на аланин в положении 5, (b) серина на аланин в положении 12, (с) аргинина на аланин в положении 14. 5. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, где указанные модификации дополнительно включают укорочение С-конца указанной последовательности на одну аминокислоту или на две аминокислоты. 6. Полипептид по п.1(а)(ii), последовательность которого соответствует полипептиду SEQ IDNO:16, 17, 18, 19, 28, 29, 30 или 31. 7. Полипептид по п.1(а)(i), последовательность которого соответствует SEQ ID NO:15 или 27, но которая ПЭГилирована на N-конце и в которой оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 SEQ IDNO:15 или 27 находятся в D-форме. 8. Полипептид по п.1(а)(i), последовательность которого соответствует SEQ ID NO:15 или 27, в которой оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 SEQ ID NO:15 или 27 находятся в D-форме и которая не является ПЭГилированной. 9. Полипептид по п.1(a)(i), последовательность которого соответствует SEQ ID NO:27, где один или оба из остатков аргинина в положениях 14 и 15 SEQ ID NO:27 находятся в D-форме. 10. Полипептид по п.9, где оба остатка аргинина в положениях 14 и 15 SEQ ID NO:27 находятся вD-форме. 11. Полипептид по п.1(b), последовательность которого соответствует SEQ ID NO:33, 34, 35 или 36. 12. Полипептид по пп.9, 10 или 11, дополнительно содержащий от одной до пяти дополнительных аминокислот на С-конце и/или от одной до пяти дополнительных аминокислот на N-конце. 13. Полипептид по п.12, где одна или несколько из указанных дополнительных аминокислот являются аминокислотами в D-форме. 14. Полипептид по п.13, где на N-конце присутствует одна дополнительная аминокислота в Dформе. 15. Полипептид по п.14, где указанная одна дополнительная аминокислота в D-форме является Dаргинином. 16. Полипептид по п.15, где на С-конце не присутствуют дополнительные аминокислоты. 17. Полипептид по любому из пп.10-13, где одна дополнительная аминокислота присутствует на Сконце и является цистеином. 18. Полипептид по п.17, где на N-конце не присутствуют дополнительные аминокислоты. 19. Полипептид по п.1(а)(i) или 3, последовательность которого соответствует SEQ ID NO:15 или 27 плюс один дополнительный остаток цистеина на С-конце, и необязательно от одной до четырех дополнительных аминокислот на С-конце, и/или от одной до пяти дополнительных аминокислот на N-конце. 20. Полипептид по п.19, где одна или несколько из указанных дополнительных аминокислот являются аминокислотами в D-форме. 21. Полипептид по п.20, где на N-конце присутствует одна аминокислота в D-форме. 22. Полипептид по п.21, где указанной одной аминокислотой в D-форме является D-аргинин. 23. Полипептид по любому из пп.9-22, который является ПЭГилированным.- 25013230 24. Полипептид по п.23, в котором указанное ПЭГилирование находится на N-конце. 25. Полипептид по любому из пп.9-24, который не является ПЭГилированным. 26. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, который амидирован на С-конце. 27. Удлиненный полипептид, содержащий полипептид по любому из предыдущих пунктов, удлиненный аминокислотной последовательностью не дикого типа, N-концевой и/или С-концевой относительно указанного полипептида по п.1. 28. Удлиненный полипептид по п.10, в котором указанное удлинение содержит остаток цистеина на С-конце и/или остаток D-аргинина на N-конце. 29. Полипептид или удлиненный полипептид по любому из предыдущих пунктов, стабильность которого, измеренная периодом полувыведения в плазме человека, по меньшей мере на 10% больше, чем стабильность немодифицированного Е-пептида. 30. Полипептид или удлиненный полипептид по п.29, стабильность которого, измеренная периодом полувыведения в плазме человека, по меньшей мере на 50% больше, чем стабильность немодифицированного Е-пептида. 31. Полипептид или удлиненный полипептид по п.30, стабильность которого, измеренная периодом полувыведения в плазме человека, по меньшей мере на 100% или более больше, чем стабильность немодифицированного Е-пептида. 32. Полипептид или удлиненный полипептид по любому из предыдущих пунктов, период полувыведения которого в плазме человека составляет по меньшей мере 2 ч. 33. Полипептид или удлиненный полипептид по п.32, период полувыведения которого в плазме человека составляет по меньшей мере 12 ч или по меньшей мере 24 ч. 34. Композиция, содержащая полипептид или удлиненный полипептид по любому из предыдущих пунктов и носитель. 35. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид или удлиненный полипептид по любому из пп.1-33 и фармацевтически приемлемый носитель. 36. Полипептид или удлиненный полипептид по любому из пп.1-33 для применения в способе лечения человека или животного. 37. Способ лечения мышечного нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида по любому из пп.1-33. 38. Способ по п.37, где указанным мышечным нарушением является нарушение скелетной мышцы. 39. Способ по п.38, где указанным мышечным нарушением является мышечная дистрофия, или родственная прогрессирующая слабость, или истощение скелетных мышц, мышечная атрофия, кахексия,мышечная слабость; саркопения или хрупкость у пожилого субъекта или где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью восстановления мышцы после травмы. 40. Способ по п.39, где указанной мышечной дистрофией является мышечная дистрофия Дюшенна или Беккера, плечелопаточно-лицевая мышечная дистрофия (FSHD) или врожденная мышечная дистрофия (CMD); указанной мышечной атрофией является атрофия от неиспользования мышц, атрофия, вызванная глюкокортикоидами; мышечная атрофия у пожилого субъекта или мышечная атрофия, индуцированная повреждением спинного мозга или нервно-мышечным заболеванием; указанная кахексия ассоциирована с раком, СПИДом, хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD), хроническим воспалительным заболеванием или ожоговым повреждением; или указанной мышечной слабостью является слабость в мышцах мочевого сфинктера, анального сфинктера и диафрагмы таза. 41. Способ по п.37, где указанным мышечным нарушением является нарушение сердечной мышцы. 42. Способ по п.41, где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью профилактики или ограничения миокардиального повреждения в ответ на ишемию или механическую перегрузку сердца; для стимуляции синтеза сердечной мышцы; для улучшения минутного сердечного выброса увеличением ударного систолического объема сердца; для лечения кардиомиопатии; в ответ на острую сердечную недостаточность или острую травму сердца; для лечения патологической гипертрофии сердца или для лечения застойной сердечной недостаточности. 43. Способ по п.42, где указанная острая сердечная недостаточность или острая сердечная травма включает миокардит или инфаркт миокарда. 44. Способ лечения неврологического нарушения введением пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида или удлиненного полипептида по любому из пп.1-33. 45. Способ по п.44, где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью профилактики потери нейронов, ассоциированной с нарушением, повреждением нервной системы или для поддержания центральной нервной системы (ЦНС). 46. Способ по п.45, где указанная потеря нейронов ассоциирована с нейродегенеративным нарушением, повреждением нервов или ишемией. 47. Способ по п.46, где указанным нарушением является боковой амиотрофический склероз; мышечная атрофия спинного мозга; прогрессирующая мышечная атрофия спинного мозга; мышечная атрофия детей младшего возраста или юношеская мышечная атрофия, полиомиелит или постполиосиндром; нарушение, вызванное воздействием токсина, травма мотонейронов, повреждение мотонейронов или- 26013230 повреждение нерва; повреждение, которое влияет на мотонейроны; потеря мотонейронов, ассоциированная со старением; аутосомная или связанная с полом мышечная дистрофия; болезнь Альцгеймера; болезнь Паркинсона; диабетическая невропатия; периферическая невропатия; эмболический или геморрагический инсульт; связанное с алкоголем повреждение головного мозга или где указанный полипептид или удлиненный полипептид вводят с целью восстановления нервов после травмы.