Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
Формула / Реферат
1. Способ получения иммуногенного конъюгата, включающий:
(а) введение реактивной группы в аминокислотный остаток пептидного иммуногена;
(б) дериватизацию одной или более функциональных групп белкового носителя с образованием активированной функциональной группы на белковом носителе;
(в) реакцию пептидного иммуногена со стадии (а) с белковым носителем со стадии (б) в таких условиях, при которых образуется конъюгат, при этом реактивная группа пептидного иммуногена ковалентно присоединена к активированной функциональной группе белкового носителя; и
(г) последующую реакцию конъюгата со стадии (в) с "кэпирующим" реагентом для инактивации оставшихся активированных функциональных групп на белковом носителе, с получением иммуногенного конъюгата и защитой функциональности носителя, так что он сохраняет свою способность выявлять заданный иммунный ответ на пептидный иммуноген.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (KLH), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, PADRE полипептида, circumsporozite (CS, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (HBSAg19-28), белка теплового шока (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка CRM197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной Streptococcal C5a пептидазы, Streptococcus piogenes ORF1224, Streptococcus piogenes ORF1664, Streptococcus piogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, столбнячного токсоида, ВИЧ gp120 T1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (MSCRAMMS), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что белковый носитель представляет собой CRM197.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового носителя дериватизируется с помощью сшивающего реагента.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что белковый носитель дериватизируется с галогенацетилирующим агентом.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что кэпирующий реагент, который применяют для инактивации активированных функциональных групп на белковом носителе, выбирают из группы реагентов, состоящей из цистеамина, N-ацетилцистеамина, этаноламина, гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой добавление аминокислотного остатка, имеющего реактивную группу.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что аминокислотный остаток представляет собой цистеин, а реактивная группа содержит -SH, или аргинин, с реактивной группой, содержащей гуанидильную группу, или глютамат или аспартат с реактивной группой, содержащей -СООН, или лизин с реактивной группой, содержащей -NH2.
10. Способ по п.8, отличающийся тем, что аминокислотный остаток вводят в пептидный иммуноген добавлением во время синтеза пептида.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой генерирование боковой тиольной группы у аминокислотного остатка путем его модификации при помощи тиолирующего реагента.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что тиолирующий реагент представляет собой N-ацетилгомоцистеин тиолактон.
13. Способ по пп.8, 10 или 11, отличающийся тем, что аминокислотный остаток расположен на аминоконце пептидного иммуногена или карбоксиконце пептидного иммуногена.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что белковый носитель дополнительно содержит один или несколько полипептидных линкеров, ковалентно связанных с белковым носителем, а одна или несколько функциональных групп содержит заместитель одного или более полипептидных линкеров.
15. Иммуногенный конъюгат, содержащий пептидный иммуноген, ковалентно связанный с белковым носителем, отличающийся тем, что белковый носитель имеет формулу
где С обозначает белковый носитель, а
X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на носителе,
m обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и
иммуногенный конъюгат имеет формулу
где С обозначает белковый носитель, a
Xd обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя,
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный через реактивную группу аминокислотного остатка пептидного иммуногена с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,
R обозначает "кэпирующую" молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя;
n обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и
р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
16. Конъюгат по п.15, отличающийся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (KLH), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, PADRE полипептида, circumsporozite (CS, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (HBSAg19-28), белка теплового шока (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка CRM197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной Streptococcal C5a пептидазы, Streptococcus piogenes ORF1224, Streptococcus piogenes ORF1664, Streptococcus piogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, столбнячного токсоида, ВИЧ gp120 T1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (MSCRAMMS), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
17. Конъюгат по п.16, отличающийся тем, что белковый носитель представляет собой CRM197.
18. Конъюгат по п.15, отличающийся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
19. Иммуногенный конъюгат, полученный способом по п.1 и имеющий формулу
где С обозначает белковый носитель, а
Xd обозначает дериватизированную функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя,
Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный через реактивную группу аминокислотного остатка пептидного иммуногена с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,
R обозначает "кэпирующую" молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя;
n обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и
р обозначает целое число больше 0, но меньше 85.
20. Конъюгат по п.19, отличающийся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (KLH), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, PADRE полипептида, circumsporozite (CS, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (HBSAg19-28), белка теплового шока (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка CRM197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной Streptococcal C5a пептидазы, Streptococcus piogenes ORF1224, Streptococcus piogenes ORF1664, Streptococcus piogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, столбнячного токсоида, ВИЧ gp120 T1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (MSCRAMMS), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
21. Конъюгат по п.20, отличающийся тем, что белковый носитель представляет собой CRM197.
22. Конъюгат по п.19, отличающийся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
23. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что реактивная группа аминокислотного остатка пептидного иммуногена представляет собой свободную сульфгидрильную группу.
24. Конъюгат по п.23, отличающийся тем, что свободная сульфгидрильная группа представляет собой боковую цепь цистеинового остатка, или тиольную боковую цепь лизинового остатка.
25. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что реактивная группа аминокислотного остатка пептидного иммуногена представляет собой гуанидильную группу, карбоксильную группу или e-аминогруппу.
26. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что белковый носитель дополнительно содержит полипептидный линкер, ковалентно связанный с белковым носителем, а функциональная группа содержит заместитель полипептидного линкера.
27. Конъюгат по п.15 или 19, отличающийся тем, что аминокислотный остаток пептидного иммуногена, содержащий реактивную группу, расположен на аминоконце пептидного иммуногена или карбоксиконце пептидного иммуногена.
28. Иммуногенная композиция, содержащая иммуногенный конъюгат пептидного иммуногена с белковым носителем, полученный способом по п.1, совместно с одним или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей и/или адъювантов.
29. Иммуногенная композиция по п.28, отличающаяся тем, что белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки (KLH), молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина, овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, PADRE полипептида, circumsporozite (CS, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (HBSAg19-28), белка теплового шока (HSP) 65, Mycobacterium tuberculosis (туберкулезной микобактерии), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка CRM197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной Streptococcal C5a пептидазы, Streptococcus piogenes ORF1224, Streptococcus piogenes ORF1664, Streptococcus piogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, столбнячного токсоида, ВИЧ gp120 T1, поверхностных компонентов микробных клеток, узнающих адгезивные матричные молекулы (MSCRAMMS), факторов/гормонов роста, цитокинов и хемокинов.
30. Иммуногенная композиция по п.29, отличающаяся тем, что белковый носитель представляет собой CRM197.
31. Иммуногенная композиция по п.28, отличающаяся тем, что пептидный иммуноген выбирают из группы, состоящей из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразитарного белка и эукариотического белка.
32. Иммуногенная композиция по п.28, отличающаяся тем, что один или более адъювантов выбирают из группы, состоящей из GM-CSF, 529 SE, IL-12, фосфата алюминия, гидроксида алюминия, Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis, бактериальных липополисахаридов, аминоалкилглюкозаминфосфатов, MPLÔ(3-O-деацетилированного монофосфориллипида А), полипептида, Quil A, STIMULONÔ QS-21, коклюшного токсина (РТ), Е.coli термолабильного токсина (LT), IL-1a, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, интерферона-a, интерферона-b, интерферона-g, G-CSF, TNF-aи TNF-b.
33. Иммуногенный конъюгат по п.26, отличающийся тем, что один или более пептидных линкеров представляют собой полилизин.
34. Способ по п.11, отличающийся тем, что тиолирующий реагент выбирают из реагента Траута (2-иминотиолан), SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонилметил-2-пиридилтиотолуол), Sulfo LC SPDP (сульфосукцинимидил пиридилдитио пропион-амидогексаноат) и SPDP (сукцинимидилпиридил дитиопропионат).
35. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образуют из белкового антигена бактерии, полученного из организма, выбранного из группы, состоящей из Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Haemophilus influenzae, Esherichia coli, Klebsiella enterobacter, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Clostridium perfingens, Clostridium botulinum, видов Pseudomonas, Salmonella typhimurium, Borrelia burgdorferi, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella dysentriae, Alloicoccus otitidis и группы В стрептококков.
36. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образуют из белкового антигена вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV), вируса герпеса (HSV), человеческого вируса папилломы, вируса парагриппа (PIV), вируса везикулярного стоматита (VSV), респираторно-синцитиального вируса (РСВ, RSV), вируса Эпстайна-Барр (EVB), коронавируса, вируса коровьей оспы, ротавируса, вируса бешенства, вируса гепатита С (HCV) и вируса гепатита В (HBV).
37. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образован из белкового антигена грибов, выбранных из группы, состоящей из вида Candida, вида Cryptococcus, вида Coccidioides, вида Histoplasma и вида Aspergillus.
38. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образован из белкового антигена паразита, выбранного из группы, состоящей из плазмодия, трипаносом, шистосом и лейшмании.
39. Иммуногенный конъюгат по п.18 или 22, отличающийся тем, что пептидный иммуноген образован из белкового антигена, полученного от человека.
40. Иммуногенный конъюгат по п.39, отличающийся тем, что пептидный иммуноген человеческого происхождения берут из злокачественной опухоли.
41. Иммуногенный конъюгат по п.40, отличающийся тем, что пептидный иммуноген получают из карциноэмбрионального антигена или опухолевого антигена, полученного из опухоли, выбранной из почечно-клеточного рака, рака молочной железы, меланомы и рака простаты.
Текст
012984 Предпосылки создания изобретения Сущностью приобретенного иммунитета является способность организма реагировать на присутствие чужеродных веществ и продуцировать компоненты (антитела и клетки), способные специфически взаимодействовать с ними и защищать хозяина от их инвазии. "Антиген" или "иммуноген" представляет собой вещество, способное вызывать этот тип иммунного ответа, а также способное взаимодействовать с сенсибилизированными клетками и антителами, которые вырабатываются против них. Антигены или иммуногены обычно представляют собой макромолекулы, которые содержат определенные антигенные сайты или "эпитопы", узнаваемые различными компонентами иммунной системы и взаимодействующие с ними. Они могут существовать в виде отдельных молекул, представляющих собой синтетические органические вещества, белки, липопротеины, гликопротеины, РНК, ДНК или полисахариды, или они могут представлять собой часть клеточных структур (бактерии или грибки) или вирусов (Harlow and Lane 1988a, b, с; Male et al., 1987). Малые молекулы, такие как короткие пептиды, несмотря на то что обычно способны реагировать с продуктами иммунного ответа, часто не могут вызвать ответ на себя самих. Эти пептидные иммуногены или "гаптены", как их также называют, на самом деле являются неполными антигенами и, хотя не способны сами по себе вызвать иммуногенность или продуцирование антител, их можно сделать иммуногенными, связывая их с подходящим носителем. Носителями обычно являются более высокомолекулярные белковые антигены, способные вызывать иммунологический ответ при введении in vivo. При иммунном ответе антитела продуцируются и секретируются В-лимфоцитами вместе с Тхелперными (ТН) клетками. В большинстве систем гаптен-носитель В-клетки продуцируют антитела,специфические как к гаптену, так и к носителю. В этих случаях Т лимфоциты имеют домены специфического связывания на носителе, но не распознают один гаптен. Проявляя своего рода синергизм, В- и Тклетки кооперируются, индуцируя гаптен-специфический антительный ответ. Если после того как возникает такой иммунный ответ, хозяина заражают только гаптеном, обычно он отвечает, продуцируя гаптен-специфические антитела с помощью клеток памяти, образовавшихся после начальной иммунизации. Синтетические гаптены, имитирующие некоторые важные эпитопные структуры на макромолекулах с более высокой молекулярной массой, часто конъюгируются с носителями, обеспечивая иммунный ответ на более высокомолекулярную "родительскую" молекулу. Например, короткие пептидные сегменты можно синтезировать из известных последовательностей белка и связать с носителем, чтобы индуцировать иммуногенность к нативному белку. Этот тип синтетического подхода к получению иммуногена стал основой многих современных исследований по созданию вакцин. Однако во многих случаях создание только лишь В-клеточного ответа с применением синтетических конъюгатов пептид-носитель, как бы ни был хорош их дизайн, не всегда является гарантией абсолютного защитного иммунитета к интактному антигену. Иммунного ответа, выработанного коротким пептидным эпитопом из вирусной частицы большего размера или бактериальной клетки, может быть достаточно только для того, чтобы формировать память на В-клеточном уровне. В этих случаях общепринято в настоящее время, что ответ цитотоксических Т-клеток является более важным показателем защитного иммунитета. Создание пептидных иммуногенов с подходящими эпитопными сайтами связывания для узнавания как В-клеток, так и Тклеток является одним из наиболее перспективных областей современной иммунологии. Десятилетиями успешно применялся способ повышения иммуногенности малых или слабо иммуногенных молекул конъюгацией этих молекул с большими молекулами "носителей" (см., например, Goebelet al. (1939) J. Exp. Med. 69: 53). Например, описаны многие иммуногенные композиции, в которых очищенные капсулированные полимеры конъюгируют с белковыми носителями, образуя более эффективные композиции с использованием этого "эффекта носителя" (Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582591). Также было показано, что конъюгация позволяет преодолеть (обойти) слабый антительный ответ,обычно наблюдаемый у детей, иммунизированных свободным полисахаридом (Anderson et al. (1985) J.Pediatr. 107: 346; Insel et al. (1986) J. Exp. Med. 158:294). Конъюгаты гаптен-носитель успешно получали, используя различные сшивающие/связывающие реагенты, такие как сшивающие гомобифункциональные, гетеробифункциональные линкеры или сшивающие линкеры нулевой длины. В настоящее время имеются многие такие методы связывания сахаридов, белков и пептидов с пептидными носителями. В большинстве таких методов создают аминную,амидную, уретановую, изотиомочевинную или дисульфидную связи, или, в некоторых случаях, тиоэфирную. Недостатком применения связывающих агентов, которые вводят реактивные сайты (реакционные центры) в боковые цепи реактивных аминокислотных молекул в молекулах носителя и/или гаптена,является то, что реактивные сайты, если они не нейтрализованы, свободны для реакции с нежелательной молекулой либо in vitro (тем самым вредно влияя на стабильность конъюгата(ов, либо in vivo (тем самым вызывая повышенный риск побочных явлений у людей или животных, иммунизированных этими препаратами). Такие избыточные реактивные сайты могут реагировать, или их можно "кэпировать", так,чтобы инактивировать эти сайты, используя различные известные химические реакции, но, с другой стороны, эти реакции могут быть деструктивными для функциональности конъюгатов. Могут возникнуть особые сложности, когда пытаются создать конъюгат введением реактивных сайтов в молекулу носителя, так как более значительный размер и более сложная структура (по сравнению с гаптеном) могут сде-1 012984 лать конъюгат более восприимчивым к разрушительному действию химической реакции. В действительности, неизвестны примеры способов получения конъюгата, когда сначала активируют носитель, затем его конъюгируют с гаптеном и, наконец, "кэпируют" остальные реактивные сайты, при этом сохраняя способность полученного конъюгата функционировать как иммуногенная композиция, имеющая заданные свойства "эффекта носителя". Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к способам получения иммуногенного конъюгата пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, в котором пептидный иммуноген конъюгирован с носителем за счет дериватизированных функциональных групп аминокислотных остатков носителей,таких как остатки лизина, а любые неконъюгированные дериватизированные функциональные группы аминокислотных остатков инактивируют "кэпированием", блокируя их реакции с другими молекулами,включая белки/полипептиды, тем самым защищая функциональность носителя, так что он сохраняет способность вызывать заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, что в отсутствие носителя было бы невозможно. Кроме того, данное изобретение также относится к конъюгатам, полученным вышеописанными методами, и к иммуногенным композициям, содержащим такие конъюгаты. В одном варианте настоящее изобретение относится к первому способу конъюгации пептидного иммуногена за счет реакции реакционноспособной (реактивной) группы аминокислотного остатка пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, имеющим одну или более функциональных групп, причем данный способ включает стадии выделенной заявки:(а) введение реактивной группы в аминокислотный остаток пептидного иммуногена;(б) дериватизацию одной или более функциональных групп белкового носителя с образованием активированной функциональной группы на белковом носителе;(в) реакцию пептидного иммуногена со стадии (а) с белковым носителем со стадии (б) в таких условиях, при которых образуется конъюгат, при этом реактивная группа пептидного иммуногена ковалентно присоединена к активированной функциональной группе белкового носителя; и(г) последующую реакцию конъюгата со стадии (в) с "кэпирующим" реагентом для инактивации оставшихся активированных функциональных групп на белковом носителе, с получением иммуногенного конъюгата и защитой функциональности носителя, так что он сохраняет свою способность выявлять заданный иммунный ответ на пептидный иммуноген. В одном варианте изобретения белковый носитель выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина, гемоцианина лимфы улитки, молекул иммуноглобулина, тиреоглобулина,овальбумина, гемагглютинина вируса гриппа, PAN-DR связывающего пептида (PADRE полипептида),circumsporozite (CS, окружающего поры) белка возбудителя малярии, поверхностного антигена гепатита В (HBsAg19-28), белка теплового шока (HSP) 65, бациллы Кальметта-Герена (BCG), холерогена (холерного токсина), мутантов холерогена с пониженной токсичностью, дифтерийного токсина, белка CRM197, перекрестно-реактивного с дифтерийным токсином, рекомбинантной Streptococcal C5a пептидазы, Streptococcus piogenes ORF1224, Streptococcus piogenes ORF1664, Streptococcus piogenes ORF2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367, Chlamydia pneumoniae ORF T858, столбнячного токсоида, ВИЧ gp120 T1, компонентов, узнающих адгезивные матричные молекулы поверхности микробных клеток (MSCRAMMS), фактора/гормона роста, цитокинов и хемокинов. В предпочтительном варианте изобретения белковый носитель представляет собой CRM197. В одном варианте изобретения пептидный иммуноген выбирают из бактериального белка, вирусного белка, грибкового белка, паразиторного белка и эукариотического белка. В другом варианте изобретения пептидный иммуноген выбирают из бактериального белкового антигена из Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrheae, Haemophilus influenzae, Esherichia coli, Klebsiella enterobacter, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Clostridium perfingens, Clostridium botulinum, вида Pseudomonas, Salmonella typhimurium, Borrelia burgdorferi, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella dysentriae, Alloicoccus otitidis и группы В стрептококков. В другом варианте изобретения пептидный иммуноген выбирают из белкового антигена вируса,выбранного из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV), вируса герпеса(VSV), респираторно-синцитиального вируса (РСВ, RSV), вируса Эпстайна-Барр, коронавируса, вируса коровьей оспы, ротавируса, вируса бешенства, вируса гепатита С (HCV) и вируса гепатита В (HBV). Еще в одном варианте изобретения пептидный иммуноген представляет собой белковый антиген грибов, выбранный из вида Candida, вида Cryptococcus, вида Coccidioides, вида Histoplasma, вида Aspergillus. В другом варианте изобретения пептидный иммуноген является белковым антигеном паразита, выбранного из плазмодия, трипаносом, шистосом и лейшмании. В другом варианте изобретения пептидный иммуноген берут из белкового антигена эукариот. В предпочтительном варианте эукариот - это человек. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения пептидный иммуноген человеческого проис-2 012984 хождения берут из злокачественной опухоли. В еще более предпочтительном варианте изобретения пептидный иммуноген является опухолевым антигеном почечно-клеточного рака, рака молочной железы,меланомы и рака простаты. В другом предпочтительном варианте изобретения пептидный антиген является опухолевым антигеном, карциноэмбриональным антигеном (КЭА, РЭА, СЕА). В одном варианте изобретения функциональная группа одной или более аминокислотных молекул белкового носителя дериватизирована с применением сшивающего реагента. Еще в одном варианте изобретения дериватизирующий реагент представляет собой галогенацетилирующий агент. В предпочтительном варианте изобретения "кэпирующий" реагент, который используют для инактивации свободных реакционных функциональных групп на активированном белковом/полипептидном носителе, выбирают из группы реагентов, состоящих из цистеамина, N-ацетилцистеамина и этаноламина,из гидроксида натрия, карбоната натрия, бикарбоната аммония и аммиака. В одном варианте изобретения стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой добавление аминокислотного остатка, имеющего реактивную группу. При этом аминокислотный остаток представляет собой цистеин, а реактивная группа содержит -SH, или аргинин, с реактивной группой, содержащей гуанидильную группу, или глютамат или аспартат с реактивной группой,содержащей -СООН, или лизин с реактивной группой, содержащей -NH2. Аминокислотный остаток может быть введен в пептидный иммуноген добавлением во время синтеза пептида. В другом варианте изобретения стадия введения реактивной группы в пептидный иммуноген представляет собой генерирование боковой тиольной группы у аминокислотного остатка путем его модификации при помощи тиолирующего реагента. При этом тиолирующий реагент представляет собой Nацетилгомоцистеин тиолактон, реагент Траута (2-иминотиолан), SATA (N-сукцинимидил-Sацетилтиоацетат), SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонилметил-2-пиридилтиотолуол), Sulfo LC SPDP(сульфосукцинимидил пиридилдитио пропион-амидогексаноат) и SPDP (сукцинимидилпиридил дитиопропионат). В другом варианте изобретения одна или более функциональных групп расположены на линкере,который, необязательно (возможно), связан с белковым носителем. В предпочтительном варианте изобретения линкер представляет собой пептидный линкер, наиболее предпочтительной полилизин. В другом аспекте изобретение относится к иммуногенному конъюгату, содержащему пептидный иммуноген, ковалентно связанный с белковым носителем, имеющим структуруX обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя иm обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85. Иммуногенный конъюгат имеет формулуXd обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя и Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,R обозначает "кэпирующую" молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,n обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85. В одном варианте данное изобретение относится к иммуногенным конъюгатам, полученным способом в соответствии с настоящим изобретением и имеющим формулуXd обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового носителя и-3 012984 Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя,R обозначает "кэпирующую" молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя;n обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85. В другом аспекте изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим конъюгат пептидного иммуногена с белковым носителем, полученный способом по изобретению, вместе с одним или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей и адъювантов. Краткое описание фигур Фиг. 1. На схеме показан химический процесс, применяемый для конъюгации фрагментов А пептида с белковым/полипептидным носителем CRM197 с образованием конъюгата А/CRM197. Фиг. 2. На схеме показан процесс кислотного гидролиза, применяемый для количественного определения S-карбоксиметилцистеина и S-карбоксиметилцистеамина для оценки степени конъюгации конъюгатов пептидный иммуноген-белок/полипептид, таких как конъюгат А/CRM197. Фиг. 3. На этой фигуре изображена зависимость реакции конъюгации А пептид/CRM от pH. Фиг. 4. На этой фигуре изображена зависимость конъюгации А пептид/CRM от соотношения пептид:CRM. Фиг. 5. Верификация процесса "кэпирования" при конъюгации А-7/CRM. Значение pH реакционной смеси в ходе реакции 9,15. Время реакции с пептидом составляет 16 ч, "кэпирование" с помощью Nацетилцистеамина длится 8 ч. Фиг. 6. Конъюгация и "кэпирование" при различных отношениях CRM:пептид. pH реакционной смеси во время реакции 9,0. Время реакции с пептидом составляет 16 ч, "кэпирование" с помощью Nацетилцистеамина длится 8 ч. Фиг. 7. Титры сыворотки приматов на 36 день после иммунизации приматов конъюгатами А пептида с различными адъювантами. Фиг. 8. Титры сыворотки приматов на 64 день после иммунизации приматов конъюгатами А пептида с различными адъювантами. Фиг. 9. Титры сыворотки приматов по дням и по группам обработки. Приматов иммунизируют с помощью конъюгатов А 1-7 или А 1-5 CRM197 с соединением алюминия или RC529 в качестве адъювантов и титры антител против А определяют на день 29, 36, 57 и 64. Фиг. 10. Конъюгаты пептид-белок характеризуют с помощью SDS-PAGE Вестерн-блоттинга с применением готового геля с трис-трицином. Дорожки (полоски): маркер (дорожка 1); L-28375 24/01 (дорожка 2); L-28375 24/02 (дорожка 3); L-28375 24/03 (дорожка 4); L-28375 24/04 (дорожка 5); L-28375 24/05 (дорожка 6); L-28375 24/06 (дорожка 7); L-28375 24/07 (дорожка 8); L-28375 24/08 (дорожка 9); L28375 24/09 (проверочный, мнимый, имитация) (дорожка 10) и BrAcCRM197 (дорожка 11). Краткое описание последовательностей Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способам получения конъюгатов пептидный иммуногенноситель, в которых непрореагировавшие активные функциональные группы на носителе, образующиеся при активации, инактивируют, используя "кэпирующие" реагенты, такие как N-ацетилцистеамин, для того, чтобы предотвратить их последующие реакции. Настоящее изобретение относится также к конъюгатам "кэпированный" носитель-пептидный иммуноген, полученным этими способами, и к иммуногенным композициям, содержащим указанные конъюгаты. Способ повышения иммуногенности малых или слабо иммуногенных молекул, таких как сахариды,с использованием конъюгации успешно применялся десятилетиями (см., например, Goebel et al., (1939) J.Exp. Med. 69: 53), и описаны многие иммуногенные композиции, в которых очищенные капсулированные полимеры конъюгированы с белками-носителями с целью получения более эффективных иммуногенных композиций с использованием этого "эффекта носителя". Например, Schneerson et al. (J. Exp."наделяют"иммунитетом к инвазивным заболеваниям, вызванным этими микроорганизмами. Показано,что конъюгаты PRP (полирибозилрибитолфосфат, капсулированный полимер Н. influenzae b) являются более эффективными, чем иммуногенные композиции на основе одного полисахарида (Chu et al., (1983)Infect. Immun. 40: 245; Schneerson et al. (1984) Infect. Immun. 45: 582-591). Также было показано, что конъюгация позволяет преодолеть (обойти) слабый антительный ответ, обычно наблюдаемый у детей,иммунизированных свободным полисахаридом (Anderson et al. (1985) J. Pediatr. 107: 346; Insel et al.(1986) J. Exp. Med. 158: 294). Другим преимуществом применения в качестве белкового носителя бактериального токсина или токсоида, против которого обычная иммунизация людей (например, столбнячного или дифтерийного) является стандартной практикой, заключается в том, что заданный иммунитет к токсину или токсоиду индуцируется наряду с иммунитетом против патогенов, ассоциированных с капсулированным полимером. Конъюгаты антигенная детерминанта/гаптен-носитель также использовались для получения высокоспецифических моноклональных антител, которые могут узнавать дискретные химические эпитопы на связанном гаптене. Полученные моноклональные антитела часто используют для изучения эпитопной структуры и взаимодействий между нативными белками. Во многих случаях антигенные детерминанты/гаптены, используемые для получения этих моноклональных антител, являются малыми пептидными сегментами, представляющими ключевые антигенные сайты на поверхности белков большего размера. Критериями для хороших (удачных) носителей, используемых при получении конъюгата антигенная детерминанта/гаптен-носитель, являются потенциал для иммуногенности, наличие функциональных групп,подходящих для конъюгации с антигенной детерминантой/гаптеном, достаточная растворимость даже после дериватизации и отсутствие токсичности in vivo.-6 012984 Этим критериям отвечают конъюгаты, полученные способами по данному изобретению. Конъюгаты могут представлять собой любые стабильные конъюгаты пептидный иммуноген-носитель, полученный способом конъюгации по настоящему описанию. Конъюгаты получают, используя способ по настоящему изобретению, в котором белковый/полипептидный носитель, имеющий следующую структуру:X обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка на белковом/полипептидном носителе или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем,m обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85,ковалентно связан с пептидным иммуногеном и где конъюгат пептидный иммуногенбелковый/полипептидный носитель представлен следующей формулой:Xd обозначает дериватизируемую функциональную группу аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем,Р обозначает пептидный иммуноген, ковалентно связанный с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового носителя или, необязательно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидньм носителем,R обозначает "кэпирующую" молекулу, ковалентно связанную с дериватизированной функциональной группой аминокислотного остатка белкового/полипептидного носителя или, возможно, аминокислотного остатка пептидного линкера, ковалентно связанного с белковым/полипептидным носителем,тем самым защищается функциональность носителя, так что он сохраняет способность выявлять заданный иммунный ответ против пептидного иммуногена, иначе, без носителя, это было бы невозможно;n обозначает целое число больше 0, но меньше или равное 85, и р обозначает целое число больше 0, но меньше 85. Выбор носителей. Некоторые пептидные иммуногены содержат подходящий эпитоп для индуцирования иммунного ответа, но слишком малый для того, чтобы быть иммуногенным. В таком случае пептидные иммуногены связывают с подходящим носителем, что способствует выявлению иммунного ответа. В вышеприведенном схематическом изображении конъюгата пептидный иммуноген-носитель, получаемого способом по настоящему изобретению, С обозначает белковый/полипептидный носитель, с которым пептидные иммуногены конъюгируются непосредственно, за счет дериватизированных функциональных групп аминокислотных остатков на самих носителях, либо опосредованно, за счет дериватизированных функциональных групп на пептидных линкерах, ковалентно связанных с носителями. Подходящие белковые/полипептидные носители включают, но без ограничения, альбумин (включая человеческий сывороточный альбумин), гемоцианин лимфы улитки, молекулы иммуноглобулинов, тиреоглобулин, овальбумин, столбнячный токсоид (анатоксин) или токсоид других патогенных бактерий с пониженной токсичностью, включая мутанты, такой как дифтерийный, Е.coli, холерный или Н. pylori, или ослабленное производное токсина. Одним из таких носителей является белок CRM197 (SEQ ID NO: 40), перекрестно реактивный с дифтерийным токсином. Другие носители включают Т-клеточные эпитопы, которые связываются с множественными МНС аллелями, например по меньшей степени с 75% всех человеческих МНС аллелей. Такие носители в уровне техники иногда называют "универсальные Т-клеточные эпитопы". Типичные носители с универсальными Т-клеточными эпитопами включают Другие носители для стимулирования или повышения иммунного ответа, с которыми может конъюгироваться пептидный иммуноген или гаптен, включают цитокины, такие как IL-1, IL-l ипептиды,IL-2, INF, IL-10, GM-CSF, и хемокины, такие как MIP 1 ии RANTES. Иммуногенные пептиды могут также быть связаны с белковыми/пептидными носителями, которые повышают транспорт через ткани,как описано в O'Mahony, Международные заявки WO 97/17163 и WO 97/17614, которые вводятся в данное описание в качестве ссылки во всей полноте для любых целей. Другие носители включают Streptococcal C5a пептидазу, Streptococcus piogenes ORF1224, 1664 и 2452, Chlamydia pneumoniae ORF T367 и Т 858, факторы и гормоны роста. В одном предпочтительном варианте настоящего изобретения белок-носитель представляет собойCRM197, нетоксический мутант дифтерийного токсина с одной аминокислотной заменой в первичной последовательности. Глицин в аминокислотном положении 52 молекулы заменяется на глутаминовую кислоту в результате единичной замены нуклеотидного кодона. Вследствие этой замены белок не содержит ADP-рибозилтрансферазной активности и становится нетоксическим. Его молекулярная масса составляет 58408 Да. CRM197 получают в больших количествах при использовании рекомбинантной экспрессии в соответствии с патентом США 5614382, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Конъюгация сахаридов, а также пептидов с CRM197 осуществляется путем связывания за счет аминогрупп лизиновых остатков. На примере некоторых промышленных продуктов четко установлено,что CRM197 является прекрасным и безопасным носителем для В-клеточных эпитопов. Иммуногенные пептиды. Применяемый в данном описании термин "пептидный иммуноген" или "гаптен" представляет собой любой белок или образованные из него субъединичную структуру/фрагмент/аналог, которые, при введении млекопитающему, могут выявлять иммунный ответ, способствовать иммунному ответу или индуцироваться, вызывая иммунный ответ. В частности, термин применяется для обозначения полипептидной антигенной детерминанты из любого источника (бактерий, вируса или эукариот), которая может связываться с носителем способом по данному описанию. Такие полипептидный иммуноген/антигенные детерминанты могут происходить из вирусных, бактериальных клеток и клеток млекопитающих. Пептидные иммуногены из бактериальных клеток включают пептидные иммуногены, образованные из белков бактериальной клеточной поверхности или секретированных белков, которые можно использовать в белковых иммуногенных композициях. Типичные бактериальные штаммы включают Streptococcus aureus, Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae, вид Klebsiella, вид Pseudomonas, вид Salmonella,вид Shigella, Alloicoccus otitidis и группы В стрептококки. Типичные пептидные иммуногены вирусного происхождения включают пептидные иммуногены из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV), вируса герпеса (HSV), человеческого вируса папилломыHPV), вируса парагриппа (PIV), вируса везикулярного стоматита (VSV), респираторно-синцитиального вируса (РСВ, RSV), вируса Эпстайна-Барр (EBV), коронавируса, вируса коровьей оспы, ротавируса, вируса бешенства, вируса гепатита С (HCV) и вируса гепатита В (HBV). Типичные пептидные иммуногены вирусного происхождения включают пептидные иммуногены из грибов, выбранные из Candida albicans, Cryptococcus neoformans, вида Coccidioides, вида Histoplasma и вида Aspergillus. Антигены паразитов включают антигены из вида Плазмодия, вида Трипаносом, вида Шистосом, вида Лейшмании и т.д. Типичные пептидные иммуногены эукариот, которые можно конъюгировать с носителем для применения в качестве иммунотерапевтических средств для предупреждения, лечения или уменьшения ин-8 012984 тенсивности различных заболеваний человека, включают пептидные иммуногены, образованные из А пептида из 39-43 аминокислот, предпочтительно из 42 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера (AD) (см. патент США 4666829; GlennerWong(1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131; Hardy (1984) TINS 20: 1131; Hardy (197(9)7 TINS 20: 154), которые образуются из амилоидных пептидов амилина, полипептидного материала, продуцируемого островковыми клетками поджелудочной железы, непосредственно связанными с диабетом типа II,пептидов, образованных из генных продуктов липопротеинов низкой плотности, связанных с атеросклерозом, и антигенных пептидов из воспалительных цитокинов и факторов роста, таких как интерлейкин-6(IL-6), фактор некроза опухолей(TNF) и GDF-8. Такие эукариотические пептидные иммуногены могут включать либо Т-клеточный (CTL, ЦТЛ), либо В-клеточный эпитоп."CTL эпитоп" представляет собой эпитоп, образованный из выбранных эпитопных областей, таких как антигены, ассоциированные с опухолями, включая, но без ограничения, антигены почечноклеточного рака, рака молочной железы, карциноэмбриональные антигены, антигены меланомы (MAGE) и специфические антигены рака простаты, такие как простат-специфический мембранный антиген(PSMA) и поверхностный антиген стволовой клетки простаты (PSCA), антигены гепатита С. А, также известный как -амилоидный пептид, или А 4 пептид (см. патент США 4666829; GlennerWong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 1131 (1984, представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. А образуется при процессировании белка большего размера АРР под действием двух ферментов, называемых - и -секретазами (см. Hardy TINS 20: 154 (1997. Известные мутации в АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, происходят близ (проксимально) к сайту расщепления - или -секретазами или внутри А. Например, положение 717 находится проксимально к сайту расщепления АРР -секретазой при его процессировании в А, а положения 670/671 находятся проксимально к сайту расщепления секретазой. Полагают, что мутации вызывают AD путем взаимодействия в реакциях расщепления, в результате которых образуется А, так что повышается количество 42/43 аминокислотной формы образующегося A. А обладает необычным свойством, он может фиксировать и активировать как классические, так и альтернативные каскады комплемента. В частности, он связывается с Clq и, в конечном счете, с С 3bi. Эта ассоциация способствует связыванию с макрофагами, приводя к активации В-клеток. Кроме того, С 3bi далее разрушается, а затем связывается с CR2 на В-клетках в зависимости от Т-клеток, приводя к 10000 кратному увеличению активации этих клеток. Этот механизм заставляет А вырабатывать иммунный ответ в избытке этого или других антигенов. А имеет несколько природных форм. Человеческие формы А обозначаются А 39, А 40, А 41,А 42 и А 43. Последовательности этих пептидов и их связь с белком-предшественником APP иллюстрируется на фиг. 1 в Hardy et al., TINS 20: 155-158 (1997). Например, А 42 имеет последовательность А 41, А 40 и А 39 отличаются от А 42 тем, что в них отсутствуют Ala, Ala-Ile и Ala-Ile-Val, соответственно, на С-конце. А 43 отличается от А 42 присутствием треонинового остатка на С-конце. Пептидные иммуногены, которые представляют собой фрагменты А, имеют преимущества по сравнению с интактной молекулой для применения в способах по настоящему изобретению по нескольким причинам. Во-первых, так как только определенные эпитопы внутри А индуцируют иммуногенный ответ, полезный для лечения болезни Альцгеймера, доза фрагмента, содержащего такие эпитопы, дает более высокую молярную концентрацию полезных иммуногенных эпитопов, чем равная по массе доза интактного А. Во-вторых, некоторые пептидные иммуногены А вызывают иммуногенный ответ против амилоидных отложений, не вызывая заметного иммуногенного ответа против белка АРР, из которого образован А. В-третьих, пептидные иммуногены А проще получать, чем интактный А из-за их более короткой длины. В-четвертых, пептидные иммуногены А не агрегируются таким же образом, что и интактный А, это упрощает получение конъюгатов с носителями. Некоторые пептидные иммуногены А имеют последовательность по меньшей мере из 2, 3, 5, 6, 10 или 20 непрерывных аминокислот природного пептида. Некоторые пептидные иммуногены содержат не более 10, 9, 8, 7, 5 или 3 непрерывных остатков А. В предпочтительном варианте изобретения пептидные иммуногены N-концевой половины А используют для приготовления конъюгатов. Предпочтительные пептидные иммуногены включают A1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 1-11, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение A1-5, например, указывает на N-концевой фрагмент, включающий 1-5 аминокислотные остатки А. Особенно предпочтительны фрагменты А, начиная с N-конца и кончая остатком, входящим в остатки 7-11 А. Фрагмент A1-12 также может применяться, но он менее предпочтителен. В некоторых способах фраг-9 012984 мент представляет собой N-концевой фрагмент, иной, нежели А 1-10. Другие предпочтительные фрагменты включают А 13-28, 15-24, 1-28, 25-35, 35-40, 35-42 и другие внутренние фрагменты и фрагменты на С-конце. Некоторые А пептиды по изобретению являются иммуногенными пептидами, которые при введении их пациенту - человеку или животному - генерируют антитела, специфически связывающиеся с одним или более эпитопов между остатками 16 и 25 А. Предпочтительные фрагменты включают А 16-22,16-23, 17-23, 17-24, 18-24 и 18-25. Антитела, специфически связывающиеся с эпитопами между остатками 16 и 25, специфически связываются с растворимым А, не связываясь с бляшками А. Эти типы антитела могут специфически связываться с растворимым А в кровотоке пациента или животной модели,не связываясь специфически с бляшками из А отложений в мозге пациента или модели. Специфическое связывание антител с растворимым А ингибирует включение А в бляшки, тем самым ингибируя прогрессирование бляшек у пациента или ингибируя дальнейшее увеличение размера или частоты встречаемости бляшек, если такие бляшки уже появились до начала лечения (до введения препарата). Предпочтительно во вводимом фрагменте А отсутствует эпитоп, который вызывает Т-клеточный ответ на фрагмент. Обычно Т-клеточные эпитопы по размеру протяженнее, чем 10 непрерывных аминокислот. Поэтому размер предпочтительных фрагментов А составляет 5-10, или более предпочтительно 7-10 непрерывных аминокислот, или наиболее предпочтительно 7 непрерывных аминокислот; т.е. достаточная протяженность, чтобы вызвать антительный ответ, не вызывая Т-клеточный ответ. Отсутствие Тклеточных эпитопов является предпочтительным, так как эти эпитопы не нужны для иммуногенной активности фрагментов и могут вызвать нежелательный воспалительный ответ в субпопуляции пациентов(Anderson et al., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3). Фрагмент А 15-25 и его субфрагменты из 7-8 непрерывных аминокислот являются предпочтительными, так как эти пептиды постоянно генерируют (вырабатывают) высокий иммуногенный ответ на А пептид. Эти фрагменты включают А 16-22, А 16-23, А 16-24, А 17-23, А 17-24, А 18-24 и А 18-25. Особенно предпочтительные субфрагменты А 15-25 имеют протяженность 7 непрерывных аминокислот. Обозначение А 15-21, например, показывает, что фрагмент включает остатки 15-21 А и не содержит других остатков А и предпочтительно содержит 7-10 непрерывных аминокислот. Эти фрагменты могут вырабатывать антительный ответ, который включает антитела, специфические к концу. Пептидные иммуногены А требуют скрининга на активность клиринга или предупреждения амилоидных отложений (см. Международную заявку WO 00/72880). Введение N-концевых фрагментов А индуцирует продуцирование антител, которые узнают А отложения in vivo и in vitro. В некоторых способах применяются фрагменты, в которых отсутствует по меньшей мере один, а иногда по меньшей мере 5 или 10 С-концевых аминокислот, имеющихся в природных формах А. Например, фрагмент, в котором отсутствуют 5 С-концевых аминокислот А 43, включает первые N-концевые 38 аминокислот А. Если не указано иначе, ссылка на А включает природные человеческие аминокислотные последовательности, указанные выше, а также аналоги, включая аллельные, видовые и осуществляемые (индуцируемые) варианты. Аналоги обычно отличаются от природных пептидов в одном, двух или нескольких положениях, часто за счет консервативных замен. Обычно аналоги имеют последовательности, на 80 или 90% идентичные последовательностям природных пептидов. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации N- или С-концевых аминокислот в одном, двух или нескольких положениях. Например, остаток природной аспарагиновой кислоты в положении 1 и/или 7 А может быть замещен изоаспарагиновой кислотой. Примерами неприродных аминокислот являются D, альфа, альфа-дизамещенные аминокислоты, Nалкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, ипсилон-N,N,Nтриметиллизин, ипсилон-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3 метилгистидин, 5-гидроксилизин, омега-N-метиларгинин, -аланин, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, тироксин, гамма-аминомасляная кислота, гомосерин, цитруллин и изоаспарагиновая кислота. Иммуногенные пептиды также включают аналоги А и их фрагменты. Некоторые терапевтические агенты по изобретению представляют собой полностью-D пептиды, например полностью-D А,полностью-D А фрагмент, или аналоги полностью-D А или полностью-D А фрагмента. Можно проводить скрининг фрагментов и аналогов на профилактическую или терапевтическую эффективность на трансгенных животных моделях по сравнению с непролеченными или плацебо-контрольными животными, как описано в Международной заявке WO 00/72880. Пептидные иммуногены охватывают также более длинные полипептиды, которые включают, например, иммуногенный участок А пептида вместе с другими аминокислотами. Например, предпочтительные иммуногенные пептиды включают составные (химерные, гибридные) белки, содержащие сегмент А, связанный с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которая индуцирует Тхелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности и, тем самым, Вклеточный ответ против сегмента А. Такие полипептиды можно подвергать скринингу на профилактическую или терапевтическую эффективность на трансгенных животных моделях по сравнению с непро- 10012984 леченными или плацебо-контрольными животными, как описано в Международной заявке WO 00/72880. А пептид, аналог, иммуногенный фрагмент или другой полипептид можно вводить в дезагрегированной или агрегированной форме. Дезагрегированный А или его фрагменты означают мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный А или его фрагменты обычно являются растворимыми и способны к самоагрегации с образованием растворимых олигомеров, протофибрилл и ADDL. Олигомеры А и их фрагменты обычно являются растворимыми и существуют преимущественно в виде альфаспиралей или случайных спиралей. Агрегированный А или его фрагменты означают олигомеры А или их фрагменты, которые ассоциированы в нерастворимые ансамбли в виде бета-складок. Агрегированный А или его фрагменты также означают фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связывают либо растворимый А или его фрагменты, либо агрегированный А или его фрагменты. Некоторые антитела связывают как растворимый А или его фрагменты, так и агрегированный А или его фрагменты. Иммуногенные пептиды также включают мультимеры мономерных иммуногенных пептидов. Иммуногенные пептиды, отличные от А пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более перечисленных выше предпочтительных фрагментов А (например, А 1-3, 1-7, 1-10 и 37). Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению связываются с носителем по способу по настоящему изобретению с образованием конъюгата. Иммуногенный пептид может связываться по своему аминоконцу, по своему карбоксильному концу или по обоим концам с носителем с образованием конъюгата. Необязательно, в конъюгате могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида.N-концевой фрагмент А может связываться по своему С-концу с пептидом-носителем с образованием конъюгата. В таких конъюгатах N-концевой остаток фрагмента А является N-концевым остатком конъюгата. Соответственно, такие конъюгаты эффективно индуцируют антитела, связывающиеся с эпитопом, которому требуется свободный N-концевой остаток А. Некоторые иммуногенные пептиды по изобретению содержат множество повторов N-концевого сегмента А, связанного на С-конце с одной или более копий пептида-носителя с образованием конъюгата. N-концевой фрагмент А, включенный в такие конъюгаты, иногда начинается А 1-3 и заканчивается А 7-11, А 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 являются предпочтительными N-концевыми фрагментами А. Некоторые конъюгаты содержат отличающиеся Nконцевые А в тандеме (связанные последовательно). Например, конъюгат может содержать А 1-7 с последующим А 1-3, связанным с носителем. В некоторых конъюгатах N-концевой сегмент А связан по своему N-концу с носителем-пептидом. Можно использовать такое же множество N-концевых сегментов А, как и в случае С-концевого связывания. Некоторые конъюгаты содержат пептидный носитель, связанный с N-концом N-концевого сегмента А, который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительных N-концевых сегментов А в тандем (связанные последовательно). Предпочтительно такие иммуногенные А фрагменты, будучи связаны с подходящим носителем, индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на определенный А фрагмент, не будучи направлен на другие фрагменты А. Иммуногенные пептиды по изобретению включают иммуногенные гетерологичные пептиды. В некоторых иммуногенных пептидах А фрагмент связан с носителем с образованием иммуногенного гетерологичного пептида. Этот гетерологичный пептид связывается с носителем с применением способа по данному изобретению с образованием конъюгата. Некоторые из таких иммуногенных гетерологичных пептидов содержат фрагменты А, связанные с эпитопами столбнячного токсоида, такими как описанные в патенте США 5196512, Европейских патентах ЕР 378881 и ЕР 427347. Необязательно, иммуногенный пептид может быть связан с одной или множеством копий носителя, например, как по N-, так и по С-концу носителя, с образованием иммуногенного гетерологичного пептида. Другие такие иммуногенные гетерологичные пептиды содержат фрагменты А, связанные с носителями-пептидами, описанными в патенте США 5736142. Например, иммуногенный гетерологичный пептид может содержать А 1-7,связанный с последующим А 1-3, связанный с последующим носителем. Примеры таких иммуногенных гетерологичных пептидов включают- 12012984 Некоторые иммуногенные гетерологичные пептиды содержат мультимер иммуногенных пептидов,представленных формулой 2 х, в которой х обозначает целое число от 1 до 5. Предпочтительно х обозначает 1, 2 или 3, причем 2 является предпочтительным. Когда х равно 2, такой мультимер содержит четыре иммуногенных пептида, связанных в предпочтительной конфигурации, называемой МАР 4 (МАП 4, см. патент США 5229490). Такие иммуногенные пептиды затем связываются с носителем способом по настоящему изобретению с образованием конъюгата. Конфигурация МАР 4 показана ниже, где разветвленные структуры получают, инициируя пептидный синтез как по N-концевой аминогруппе, так и по аминогруппе боковой цепи лизина. В зависимости от того, сколько раз лизиновые остатки включаются в последовательность и имеют возможность разветвляться, в конечной структуре присутствуют множественные N-концы. В данном примере четыре идентичных N-конца дают разветвленное лизинсодержащее ядро. Такая мультиплетность значительно повышает отвечаемость родственных В клеток Примеры таких иммуногенных гетерологичных пептидов включают А пептид, аналог, активный фрагмент или другой полипептид можно вводить в ассоциированной или в мультимерной форме или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимеры или мономерные иммуногенные агенты. Агенты, отличные от А пептидов, должны индуцировать иммуногенный ответ против одного или более перечисленных выше предпочтительных фрагментов А (например, 1-10, 1-7, 1-3 и 3-7) и могут также конъюгироваться с носителем способом по настоящему изобретению. Предпочтительно такие агенты, конъюгированные с подходящим носителем,индуцируют иммуногенный ответ, который специфически направлен на один из этих фрагментов, не будучи направлен на другие фрагменты А. Для того чтобы облегчить конъюгацию пептидного иммуногена с носителем, к концам антигенных детерминант могут быть добавлены дополнительные аминокислоты. Дополнительные остатки можно также использовать для модификации физических или химических свойств пептидного иммуногена. Аминокислоты, такие как тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота и т.п., можно ввести на С- или N-конце пептидного иммуногена. Кроме того,можно также ввести пептидные линкеры, содержащие аминокислоты, такие как глицин и аланин. Помимо этого антигенные детерминанты могут отличаться от природной последовательности, будучи модифицированы ацилированием концевой NH2-группы, например, алканоил- или тиогликолилацилированием (ацилирование алкановыми (С 1-С 20) кислотами или тиогликолевой кислотой), амидированием по карбоксиконцу, например, аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых примерах эти модификации могут создать сайты связывания с подложкой или другой молекулой. Пептидные иммуногены, используемые для получения конъюгатов по настоящему изобретению способом по данному описанию, можно объединять, связывая с образованием полимеров (мультимеров),или из них можно готовить композиции без связывания, в виде смеси. Если пептид связан с идентичным пептидом, тем самым образуя гомополимер, то присутствует множество повторяющихся эпитопных единиц. Например, метод множественных антигенных пептидов (МАП, MAP) применяют для конструирования полимеров, содержащих как CTL эпитоп, так и/или пептиды антител и пептиды. Когда пептиды различаются, например, смесь, представляющая различные вирусные субтипы, различные эпитопы внутри субтипа, различные специфичности рестрикции ГКГ (HLA) или пептиды, которые содержат Тхелперные эпитопы, получают гетерополимеры с повторяющимися единицами. Помимо ковалентного связывания также рассматривается нековалентное связывание, с помощью которого могут образоваться межмолекулярные и внутриструктурные связи.- 13012984 Такие пептидные иммуногены и их аналоги синтезируют твердофазным пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией, или получают из природных источников. Автоматические пептидные синтезаторы можно получить от многих поставщиков, таких как Applied Biosystems, Foster City, California. Рекомбинантная экспрессия может осуществляться в бактериальных клетках (таких как Е.coli),клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны вSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, NY, 2nd ed., 1989). Некоторые иммуногенные пептиды также выпускаются промышленно (например, American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, CA, и California Peptide Research, Inc., Napa, CA). Можно также провести скрининг библиотек случайный пептидов или других соединений на пригодность их в качестве пептидных иммуногенов. Комбинаторные библиотеки можно создать для многих типов соединений, которые можно синтезировать постадийно. Такие соединения включают полипептиды, миметики бета-поворотов, гормоны, олигомерные N-замещенные глицины и олигокарбаматы и т.п. Большие комбинаторные библиотеки соединений можно создавать методом кодированных синтетических библиотек (ESL), описанным в Международных заявках WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051,WO 95/35503 и WO 95/30642. Пептидные библиотеки можно также получать методами фагового дисплея(см., например, Devlin, WO 91/18980). Дериватизация и конъюгация иммуногенного пептида с белком-носителем. Сайт соединения пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем и природа сшивающего агента, который используется для связывания пептидного иммуногена с носителем - оба фактора являются важными для специфичности полученного в результате антитела против него. Для корректного узнавания пептидный иммуноген должен быть связан с носителем в соответствующей ориентации. Для того чтобы антитело узнало затем свободные пептидные иммуногены без носителя, конъюгат пептидный иммуноген-белковый/полипептидный носитель должен презентировать пептидные иммуногены в экспонированной и доступной форме. Оптимальная ориентация часто достигается при направлении реакции сшивания на специфические сайты на пептидных иммуногенах. Один способ для пептидного иммуногена достигнуть этого заключается в присоединении конечного цистеинового остатка в процессе пептидного синтеза. Это создает на одном конце пептида сульфгидрильную группу для конъюгации с носителем. Сшивание (перекрестное связывание) с использованием этой группы обеспечивает присоединение пептидного иммуногена только на одном конце, тем самым гарантируя постоянную ориентацию. При конъюгации пептидный иммуноген-носитель целью является не сохранение исходного (нативного) состояния или устойчивости носителя, а презентация гаптена наилучшим возможным образом для иммунной системы. При достижении этой цели выбор химического метода конъюгации может регулировать полученный титр и специфичность антител, полученных против гаптена. В некоторых случаях может быть важно выбрать сшивающий агент, содержащий спейсерную "ножку", достаточно длинную для презентации антигена в нерестриктированной форме. Также может быть важно контролировать плотность пептидного иммуногена на поверхности носителя. Слишком маленькая замена в пептидном иммуногене может привести к малому ответу или к отсутствию ответа. Слишком высокая плотность пептидного иммуногена в действительности может вызвать иммунологическую супрессию и снижение ответа. Кроме того, сам сшивающий агент может вызывать нежелательный иммунный ответ. Это необходимо принимать во внимание при выборе не только подходящих сшивающих реагентов, но также соответствующих соотношений белкового/полипептидного носителя и пептидного иммуногена. Возможны различные способы связывания беловых/пептидных носителей с пептидными иммуногенами. Ионные взаимодействия возможны по концевым группам или по -аминогруппе лизина. Также возможно образование водородной связи между боковыми группами остатков и пептидным иммуногеном. Наконец, конформационные взаимодействия между белковыми/пептидными носителями и иммуногенным пептидом могут привести к стабильному связыванию. Конъюгаты пептидные иммуногены-носитель успешно получают, используя различные сшивающие реагенты, такие как нулевой длины, гомобифункциональные или гетеробифункциональные кросслинкеры (сшивающие реагенты). Наименьшие доступные реагирующие системы для биоконъюгации представляют собой так называемые кросс-линкеры нулевой длины. Эти соединения опосредуют конъюгацию двух молекул, образующих связь, не содержащую дополнительных атомов. Таким образом, один атом молекулы является спейсером. Во многих схемах конъюгации конечный комплекс связывается вместе с помощью химических компонентов, которые при сшивании вносят чужеродные структуры в вещества. В некоторых применениях присутствие этих промежуточных линкеров может быть вредным для предполагаемого применения. Например, при приготовлении конъюгатов пептидный иммуногенноситель образуется комплекс, предполагаемый для генерации иммунного ответа на присоединенный гаптен. Иногда (случайно) участок антител, продуцированных этим ответом, может иметь специфичность к сшивающему агенту (кросс-линкеру), применяемому при конъюгации. Сшивающие агенты(кросс-линкеры) нулевой длины исключают возможность такого типа кросс-реактивности (перекрестной реактивности), опосредуя прямое связывание двух веществ. Гомобифункциональные реагенты, которые были первыми сшивающими (перекрестно связывающими) реагентами, применяемыми для модификации и конъюгации макромолекул, состояли из биреак- 14012984 тивных соединений, содержащих по обоим концам одну и ту же функциональную группу (Hartman andWold, 1966). Эти реагенты могут связывать один белок с другим, связываясь ковалентной связью с одинаковыми общими группами в обеих молекулах. Так, -аминогруппы лизина или N-концевые аминогруппы одного белка могут сшиваться (перекрестно связываться) с одинаковыми функциональными группами на втором белке просто при их смешении в присутствии гомобифункционального реагента. Гетеробифункциональные реагенты для конъюгации содержат две различные реакционноспособные (реактивные) группы, которые могут связываться с двумя различными функциональными "мишенями" на белках и других макромолекулах. Например, один участок кросс-линкера может содержать аминореактивную группу, тогда как другой участок может состоять из сульфгидрил-реактивной группы. Результатом является способность направлять реакцию сшивания на выбранные участки целевых молекул, тем самым лучше осуществляется контроль над процессом конъюгации. Гетеробифункциональные реагенты используют для сшивания (перекрестного связывания) белков и других молекул в двух- или трехстадийном процессе, который ограничивает степень полимеризации,часто достигаемую при использовании гомобифункциональных кросс-линкеров. В настоящее время имеется множество методов связывания пептидных иммуногенов с белковыми/полипептидными носителями с помощью кросс-линкеров нулевой длины, гомобифункциональных или гетеробифункциональных кросс-линкеров. С помощью большинства методов создают аминные,амидные, уретановые, тиоизомочевино или дисульфидные связи, или, в некоторых случаях, тиоэфирные связи. В более общем методе связывания белков используются бифункциональные сшивающие реагенты. Они представляют собой малые спейсерные молекулы, содержащие на каждом конце активные группы. Спейсерные молекулы могут иметь идентичные или различные активные группы на каждом конце. Наиболее обычные активные функциональности, связывающие группы и образующиеся связи представлены ниже. Реактивность данного белка-носителя, с точки зрения его способности модифицироваться сшивающим агентом таким образом, чтобы конъюгироваться с пептидным иммуногеном, определяется аминокислотным составом и локализацией в последовательности отдельных аминокислот в трехмерной структуре молекулы, а также аминокислотным составом пептидного иммуногена. Для линкеров ("L") между белковыми/пептидными носителями и другими пептидами (например,между белковыми/пептидными носителями и пептидным иммуногеном) спейсеры обычно выбирают изAla, Gly или других нейтральных спейсеров из неполярных аминокислот или нейтральных полярных аминокислот. В некоторых вариантах изобретения нейтральный спейсер представляет собой Ala. Следует понимать, что возможно присутствующий спейсер не обязательно состоит из одинаковых остатков и,следовательно, может быть гетеро- или гомоолигомером. Типичные спейсеры включают гомоолигомерыAla. В случае присутствия спейсера он обычно состоит по меньшей мере из двух остатков, более обычно из трех-шести остатков. В других вариантах изобретения белковый/полипептидный носитель конъюгируется с пептидным иммуногеном, предпочтительно с белковым/пептидным носителем, позиционированным на аминоконце. Пептид может соединяться нейтральным линкером, таким как Ala-Ala-Ala или подобным ему, и предпочтительно содержит липидный остаток, такой как остаток пальмитиновой кислоты или т.п., который связан с альфа- или ипсилон-аминогруппами Lys остатка PAM)2Lys), связанного с аминоконцом пептидного конъюгата, как правило, Ser-Ser связью или т.п. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой А фрагмент, выбранный из группы, состоящей из A1-5-L, А 1-7-L, А 1-9-L и А 1-12-L. В некоторых аспектах изобретения линкер представляет собой GAGA (SEQ ID NO: 10). Для того чтобы упростить конъюгацию пептидного иммуногена с носителем, можно по концам антигенных детерминант добавить дополнительные аминокислоты. Дополнительные остатки можно также использовать для модификации физических или химических свойств пептидного иммуногена. Аминокислоты, такие как тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая или аспарагиновая кислота и т.п., можно ввести на С- или N-конце пептидного иммуногена. Кроме того, можно также вводить пептидные линкеры,содержащие аминокислоты, такие как глицин и аланин. Помимо этого, антигенные детерминанты могут отличаться от природной последовательности модификацией концевой NH2-группы ацилированием, на- 15012984 пример ацилированием с помощью (С 1-С 20)алкановой или тиогликолевой кислот, амидированием по карбоксиконцу, например, аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых примерах эти модификации могут создать сайты связывания с подложкой или другой молекулой. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой А фрагмент, выбранный из группы, состоящей из А 1-5-C, A1-7-C, А 1-9-C и А 1-12-C, где С представляет собой цистеиновый аминокислотный остаток. В некоторых аспектах изобретения пептидный иммуноген представляет собой А фрагмент, выбранный из группы, состоящей из A1-5-L-C, A1-7-L-C, A1-9-L-C и А 112-L-C. Пептидный иммуноген связан с белковым/пептидным носителем либо непосредственно, либо через линкер либо по амино- или по карбоксиконцу пептидного иммуногена. Аминоконец либо пептидного иммуногена, либо белкового/пептидного носителя может быть ацилированным. Кроме того, конъюгат пептидный иммуноген-белковый/пептидный носитель может быть связан с некоторыми алканоил (С 1 С 20) липидами через один или более связывающих остатков, таких как Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser, как описано ниже. Другие применяемые липиды включают холестерин, жирные кислоты и т.п. Пептидные иммуногены могут связываться с носителем химическим сшиванием. Методы связывания иммуногена с носителем включают образование дисульфидных связей с помощью N-сукцинимидил 3-(2-пиридилтио)пропионата (SPDP) (Carlsson, J. et al. (1978) Biochem J., 173: 723) и сукцинимидил 4-(Nмалеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (если пептид не содержит сульфгидрильную группу, ее можно ввести добавлением цистеинового остатка к гаптену). Эти реагенты образуют дисульфидную связь между ними и пептидным цистеином, расположенным на одном белке, и амидную связь за счет -аминогруппы лизина или другой свободной аминогруппы в других аминокислотах. Различные такие дисульфид/амид-образующие агенты описаны в Immuno. Rev. 62: 85 (1982). Другие бифункциональные связывающие агенты образуют скорее тиоэфирную, нежели дисульфидную связь. Агенты, образующие тиоэфир, включают реакционноспособный эфир 6-малеинимидкапроновой кислоты, 2 бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты, 4-(N-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы можно активировать, объединяя их с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты. Лизиновые остатки являются наиболее распространенными аминокислотными остатками на белкахносителях, и эти остатки модифицируют с помощью сшивающих реагентов для получения нуклеофильных сайтов, которые затем связывают с гаптеном. Это соединение проводят за счет любых химически активных гидрофильных боковых цепей на молекулах гаптена. Такие химические активные боковые группы включают гуанидильную группу аргинина, карбоксильные группы глутамата и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильную группу цистеина и -аминогруппу лизина, еще некоторые. Модификацию белка таким образом, чтобы они в конечном счете могли связываться с другими частицами, проводят,сшивая реагенты, которые реагируют с любой из боковых цепей молекул белка-носителя или гаптена. В одном аспекте настоящего изобретения белок-носитель с молекулой линкера или без нее функционализируют (или дериватизируют) реагентом, который вводит реактивные сайты в молекулу белканосителя, способные к дальнейшей модификации с введением нуклеофильных групп. В одном варианте изобретения носитель реагирует с галогенацетилирующим реагентом, который предпочтительно реагирует с рядом функциональных групп на аминокислотных остатках белков, такими как сульфгидрильная группа цистеина, первичная -аминогруппа лизинового остатка, а конец -аминов, тиоэфир метионина и оба азота имидазолильной боковой цепи гистидина (Gurd, 1967). В предпочтительном варианте изобретения первичные -аминогруппы лизиновых остатков белка-носителя дериватизируют с помощью Nгидроксисукцинимидил бромацетата с целью получения бромацетилированного носителя. Конъюгацию пептидного иммуногена и активированного белка-носителя проводят, медленно добавляя активированный носитель к раствору, содержащему пептидный иммуноген. Применяя способ по данному изобретению можно конъюгировать пептидные иммуногены, обсуждавшиеся выше, с любыми носителями, обсуждавшимися выше. Конъюгаты, получающиеся по способу по данному изобретению, используются в качестве иммуногенов для получения антител против А с целью применения их в пассивной/активной иммунотерапии. Кроме того, А или А фрагмент, связанный с носителем, можно вводить лабораторным животным при получении моноклональных антител к А. В одном аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из A1-7-CRM197, (А 1-73)-CRM197 и (A1-75)-CRM197. В одном аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из CRM197-A1-5, CRM197-A1-7,CRM197-A1-9 и CRM197-А 1-12. В другом аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат,выбранный из группы, состоящей из A1-5-C-CRM197, А 1-7-C-CRM197, А 1-9-C-CRM197 и A1-12-CCRM197, A16-23-C-CRM197, A17-24-C-CRM197, A18-25-C-CRM197, CRM197-C-Ap16-23, CRM197-C-Ap1724, CRM197-C-AP18-25, A16-22-C-CRM197, А 17-23-C-CRM197, A18-24-C-CRM197, CRM197-C-Ap16-22,CRM197-C-Ap17-23 и CRM197-C-Ap18-24. Еще в одном аспекте изобретения конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из А 1-5-L-C-CRM197, A1-7-L-C-CRM197, A1-9-L-C- 16012984"Кэпирование". Недостаток применения связывающих агентов, которые вводят реактивные сайты в боковые цепи реактивных молекул аминокислот на молекулах носителя и/или молекулах гаптенов, заключается в том,что эти реактивные сайты, если они не нейтрализованы, могут реагировать с любой нежелательной молекулой либо in vitro, либо in vivo. В способе по настоящему изобретению "кэпирование" непрореагировавших функциональных групп осуществляют реакцией конъюгатов с боковыми реактивными группами с реагентами, которые инактивируют/"кэпируют" реактивные группы. Типичные инактивирующие/"кэпирующие" реагенты для применения со способом конъюгации по настоящему изобретению включают цистеамин, N-ацетилцистеамин и этаноламин. Или же "кэширование" осуществляют реакцией с аммиаком или бикарбонатом аммония, каждый из которых переводит галогенацетильные группы в аминоацетильные группы. "Кэпирование" также выполняют в щелочной среде (pH 9,0-9,8) с применением гидроксида натрия или карбоната натрия, в результате чего галогенацетильные группы гидролизуются до гидроксиацетильных групп. Одним потенциальным преимуществом превращения галогенацетильных групп в аминоацетильные или гидроксиацетильные группы, в отличие от реакции с производными цистеамина, этаноламином и т.д., является введение по реакции с аммиаком или гидроксидом/карбонатом химических функциональностей (функциональных групп) сравнительно меньшего размера. Полученные в результате "кэпированные" функциональные группы, например, аминоацетильная или гидроксиацетильная, вызывают значительно меньшие нарушения на участке белка-носителя конъюгата. "Кэпированный" конъюгат пептидный иммуноген-белок-носитель при необходимости очищают известными методами, такими как хроматография (гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобное взаимодействие или аффинная), диализ, ультрафильтрация-диафильтрация, селективная преципитация с применением сульфата аммония или спирта, и т.п. Иммуногенные конъюгаты и композиции."Кэпированные" конъюгаты пептидный иммуноген-белок-носитель вводят в виде иммуногенных композиций млекопитающим, в частности людям, в профилактических и/или терапевтических целях. Конъюгаты по настоящему изобретению применяются для выявления и/или повышения иммунного ответа против иммуногенов. Например, конъюгаты CTL-носитель применяют для лечения и/или предупреждения вирусной инфекции, амилоидогенных заболеваний, рака и т.д. Или используют также конъюгаты полипептидный иммуноген-носитель, которые индуцируют антительный ответ. Примеры заболеваний,которые можно лечить, используя конъюгаты по настоящему изобретению, включают различные бактериальные инфекции, вирусные инфекции, грибковые инфекции, паразитарные инфекции и рак. При терапевтическом применении конъюгат по настоящему изобретению вводят индивидууму, уже страдающему амилоидогенным заболеванием, таким как болезнь Альцгеймера, или инфицированному патогенным микроорганизмом. Больным в инкубационном периоде или в острой фазе заболевания можно вводить конъюгат по настоящему изобретению отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, в зависимости от ситуации. При терапевтическом применении иммуногенную композицию по настоящему изобретению вводят пациенту в количестве, достаточном для выявления (выработки) эффективного CTL (Т-клеточного) ответа или гуморального ответа на микроорганизм, амилоидную бляшку или на опухолевый антиген, экспрессированный на раковой клетке, и для лечения, или, по меньшей мере, частичного прекращения прогрессирования заболевания, симптомов и/или осложнений. Количество, достаточное для достижения такого результата, определяется как "терапевтически эффективная доза". Эффективное для этого количество частично зависит от пептидной композиции, способа введения, стадии и тяжести подвергаемого лечению заболевания, веса и общего состояния здоровья пациента и мнения лечащего врача. Терапевтически эффективные количества иммуногенных композиций по настоящему изобретению для начальной иммунизации с целью терапии или профилактики обычно находятся в пределах примерно,от 0,1 мкг, примерно до 10000 мкг пептида для пациента весом 70 кг, обычно около 0,1-8000 мкг, предпочтительно около 0,1-5000 мкг и наиболее предпочтительно около 0,1-1000 мкг. После этих доз следуют бустерные дозы около 0,1-1000 мкг пептида по схеме повторной иммунизации в течение от недель до месяцев в зависимости от реакции пациента и состояния, определяемых специфическим иммунным ответом. Помимо этого, настоящее изобретение применяется в целях профилактики для предупреждения и/или уменьшения интенсивности бактериальных инфекций, вирусных инфекций, грибковых инфекций,паразитарных инфекций, амилоидогенного заболевания и рака. Эффективные количества описаны выше. Кроме того, специалист в данной области техники также знает, как корректировать или модифицировать профилактическое лечение в зависимости от ситуации, например, повторной иммунизацией и корректируя дозы и схемы лечения. Терапевтическое лечение можно начинать при первых признаках заболевания или после обнаружения или хирургического удаления опухолей, или сразу после диагностирования острой инфекции. После этого следуют бустерные дозы до прекращения прогрессирования или до реверсирования заболевания,или до заметного ослабления симптомов и в последующий период. При хронической инфекции после- 17012984 начальных высоких доз могут потребоваться бустерные дозы. Лечение инфицированных индивидуумов композициями по изобретению может ускорить прекращение инфекции у индивидуумов с острой инфекцией. У индивидуумов, чувствительных (или предрасположенных) к развитию хронической инфекции, композиции особенно пригодны в способах предупреждения перехода (развития) от острой к хронической инфекции. Если чувствительных индивидуумов идентифицируют до инфекции или в процессе инфекции, например, по данному описанию, композицию можно нацелить на них, что сведет к минимуму необходимость во введении композиции большей популяции. Конъюгаты по настоящему изобретению также используют для лечения хронической инфекции и для стимуляции иммунной системы с целью элиминации инфицированных вирусом клеток у индивидуумов с латентными инфекциями. Важно обеспечить количество иммуногенной композиции по настоящему изобретению в такой рецептуре и используя такой способ введения, которые достаточны для того, чтобы эффективно выявить (выработать) и/или повысить иммунный ответ. Так, типичная доза для лечения хронической инфекции находится в интервале примерно от 0,1 мкг примерно до 10000 мкг пептида, обычно около 0,1-8000 мкг, предпочтительно около 0,1-5000 мкг и наиболее предпочтительно около 0,1-1000 мкг для пациента весом 70 кг. После этих доз иммунизации для эффективной иммунизации индивидуума может потребоваться введение бустерных доз через определенные интервалы, например, от одной до четырех недель, возможно, в течение продолжительного времени. При хронической инфекции введение следует продолжать, по меньшей мере, до тех пор, пока клинические симптомы или лабораторные тесты не укажут, что вирусная инфекция прекращена или практически отступила, и в течение некоторого последующего периода. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению для терапевтического или профилактического лечения можно вводить парентеральным, топическим, внутривенным, оральным, подкожным,внутриартериальным, интракраниальным, интраперитонеальным, интраназальным или внутримышечным способом. Типичным способом введения иммуногенного агента является подкожный, хотя другие способы одинаково эффективны. Другим обычным способом является внутримышечная инъекция. Этот вид инъекции, как правило, осуществляют в мышцы руки или ноги. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в конкретную ткань, в которой аккумулированы отложения, например, интракраниальная (внутричерепная) инъекция. Внутримышечная инъекция или внутривенная инфузия (вливание) предпочтительны для введения антитела. В некоторых способах конкретные терапевтические антитела инъецируют непосредственно в череп. Из-за простоты введения иммуногенные композиции по изобретению особенно пригодны для орального применения. Кроме того, изобретение включает иммуногенные композиции для парентерального применения, которые содержат раствор пептидов или конъюгатов, растворенных или суспендированных в приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Можно применять различные разбавители, эксципиенты и буферы, например воду, забуференную воду, фосфатный буфер, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Эти композиции можно стерилизовать обычными общеизвестными методами стерилизации или можно стерильно фильтровать. Полученные водные растворы можно упаковывать для применения как есть или лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат перед применением объединяют со стерильным раствором. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требующиеся для приближения к физиологическим условиям, такие как буферизующие агенты, агенты, корректирующие тонус, увлажнители и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция,сорбитан монолаурат, триэтаноламина олеат и т.д. Для твердых композиций можно использовать обычные нетоксические твердые носители. Эти носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрий, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и т.д. - все фармацевтической степени чистоты. Для орального применения фармацевтически приемлемую нетоксическую композицию готовят, включая любые обычные эксципиенты, такие как выше перечисленные носители, и обычно 10-95% активного ингредиента, т.е. одного или более конъюгатов по изобретению, и более предпочтительно в концентрации 2575%. Концентрация иммуногенных композиций по настоящему изобретению в фармацевтических препаратах может варьироваться в широких пределах, т.е. обычно от менее чем 0,1 вес.% или, по меньшей мере, около 2 вес.% до 20-50 или более вес.%, и выбирается прежде всего по объему, вязкости жидкостей и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Конъюгаты по настоящему изобретению можно также вводить в липосомах, которые служат для нацеливания конъюгатов на конкретную ткань, такую как лимфоидная ткань, или нацеливать селективно на инфицированные клетки, они также служат для повышения периода полужизни пептидной композиции. Липосомы включают эмульсии, пены, мицеллы, нерастворимые монослои, жидкие кристаллы, дисперсии фосфолипидов, ламеллярные слои и т.п. В этих препаратах доставляемую композицию включают как часть липосомы, самостоятельно или в сочетании с молекулой, которая связывается, например, с рецептором, преобладающим среди лимфоидных клеток. Эти молекулы включают моноклональные антитела, которые связываются с CD45 антигеном или с другими терапевтическими или иммуногенными- 18012984 композициями. Так, липосомы, заполненные заданной композицией по настоящему изобретению, можно направить на сайт лимфоидных клеток, куда липосомы затем доставляют выбранные терапевтические/иммуногенные пептидные композиции. Липосомы для применения по изобретению готовят из липидов, образующих стандартные везикулы, эти липиды обычно включают нейтральные или отрицательно заряженные фосфолипиды и стерин(ол), такой как холестерин. При отборе липидов обычно руководствуются соображениями размера частиц, лабильности или устойчивости липосом к кислоте в кровотоке. Известны различные способы получения липосом, описанные, например, в Szoka, et al., Ann. Rev.Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), патенты США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369. Для нацеливания на иммунные клетки лиганд, который включен в липосому, может включать антитела или их фрагменты, специфические к детерминантам клеточной поверхности заданных клеток иммунной системы. Липосомную суспензию, содержащую композицию по настоящему изобретению, можно вводить локально, топически и т.д. в дозе, которая варьируется, среди прочего, в соответствии со способом введения, доставляемой композицией и стадией заболевания, подлежащего лечению. Для введения в виде аэрозолей композиции по настоящему изобретению применяют предпочтительно в тонко измельченном виде вместе с поверхностно-активным веществом и газом-вытеснителем. Обычно процентное содержание композиции составляет 0,01-20 вес.%, предпочтительно 1-10%. Естественно, поверхностно-активное вещество должно быть нетоксическим и предпочтительно растворимым в газе-вытеснителе. Типичными такими агентами являются эфиры или частичные эфиры жирных кислот,содержащих 6-22 углеродных атома, таких как капроновая, октановая, лауриновая, пальмитиновая, стеариновая, линолевая, линоленовая и олеиновая кислоты, и алифатического многоатомного спирта, или их циклического дегидратированного производного (циклического ангидрида). Можно применять смешанные сложные эфиры, такие как смешанные или природные глицериды. Поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-20 вес.% от веса композиции, предпочтительно 0,25-5%. Остальное содержимое композиции обычно составляет газ-вытеснитель. При необходимости можно также включать носитель,такой как лецитин для интраназальной доставки. Композиции по настоящему изобретению можно также применять для получения моноклональных антител. Такие антитела могут применяться в качестве потенциальных диагностических или терапевтических агентов. Композиции по настоящему изобретению также могут находить применение в качестве диагностических реагентов. Например, композиция по изобретению может использоваться для определения чувствительности конкретного индивидуума к схеме лечения, в которой применяются полипептидные иммуногены, и тем самым может быть полезна при модификации существующего протокола лечения или при установлении прогноза для пораженного индивидуума. Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно также применять для того, чтобы прогнозировать, какие индивидуумы имеют повышенный риск развития хронической инфекции. Конъюгаты по настоящему изобретению можно, необязательно, применять в комбинации с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны для лечения и/или облегчения заболевания и/или его симптомов. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых амилоидные отложения наблюдаются в мозге, конъюгаты по изобретению можно применять в сочетании с другими агентами, которые повышают прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер. Иммуногенная композиция обычно содержит адъювант. Адъювант представляет собой вещество,которое повышает иммунный ответ при введении вместе с иммуногеном или антигеном. Показано, что ряд цитокинов или лимфокинов обладают иммуномодулирующей активностью и, следовательно, могут использоваться в качестве адъювантов, включая, но без ограничения, интерлейкины 1-, 1-, 2, 4, 5, 6, 7,8, 10, 12 (см., например, патент США 5723127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы), интерфероны-,и , гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (см., например, патент США 5078996), макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, GSF и фактор некроза опухолейи . Другие адъюванты, применимые по данному изобретению, включают хемокин, в том числе, без ограничения МСР-1, MIP-, MIP- и RANTES. Адгезивные молекулы, такие как селектин, например L-селектин, Р-селектин и Е-селектин, также могут применяться в качестве адъювантов. Другие применяемые адъюванты включают, без ограничения, муциноподобную молекулу, например, CD34, GlyCAM-1 и MadCAM-1, члена семейства интегринов, такого какCD40L, факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервной ткани, фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, В 7.2, PDGF, BL-1 и эндотелиальный фактор роста сосудов, рецепторные молекулы, включая Fas, TNF рецептор, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR,LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 и DR6. Другая молекула адъюванта включает каспазу (ICE). См. также Международные патентные заявки WO98/17799 и WO99/43839. Подходящие адъюванты, применяемые для повышения иммунного ответа, включают, без ограничения, MPL (3-О-деацилированный монофосфорил-липид А; Corixa, Hamilton, MT), который описан в- 19012984 патенте США 4120914. Также пригодны для применения в качестве адъювантов аналоги синтетического липида А или аминоалкил глюкозамин фосфаты (AGP) или их производные или аналоги, поставляемыеCorixa (Hamilton, MT) и описанные в патенте США 6113918, вводимом в данное описание в качестве ссылки. Один такой AGP представляет собой 2-[(R)-3-тетрадеканоилокси-тетрадеканоиламино]этил 2 дезокси-4-О-фосфоно-3-О-[(S)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, который известен как 529 (также известный как RC529;Corixa). Этот адъювант 529 готовят в виде водного раствора (529 AF) или в виде стабильной эмульсии(529 SE). Другие адъюванты включают эмульсии в минеральном масле и в воде, соли кальция, такие как фосфат кальция, соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия и т.д., амфиген, авридин, L121/сквален, D-лактид-полилактид/гликозид, поверхностно-активные кислоты, полиолы, мурамил-дипептид, убитая бацилла Bordetella, сапонины, такие как стимулон (Stimulon QS-21, Antigenics, Framingham, MA), описанный в патенте США 5057540, и полученные из него частицы, такие какCpG (патент США 6207646), коклюшный токсин (РТ) или Е.coli термолабильный токсин (LT), в частности LT-K63, LT-R72, РТ-K9/G129; см., например, Международные заявки WO 93/13302 и WO 92/19265. Также применимы в качестве адъювантов токсины холеры и их мутанты, включая описанные в Международной заявке WO 00/18434 (в которых глутаминовая кислота в аминокислотном положении 29 заменена другой аминокислотой (отличной от аспарагиновой кислоты, предпочтительно гистидином). Аналогичные СТ токсины или мутанты описаны в Международной заявке WO 02/098368 (в них изолейцин в аминокислотном положении 16 заменен на другую аминокислоту, либо индивидуально, либо в сочетании с заменой серина в аминокислотном положении 68 на другую аминокислоту; и/или в них валин в аминокислотном положении 72 заменен на другую аминокислоту). Другие СТ токсины описаны в Международной заявке WO 02/098369 (в них аргинин в аминокислотном положении 25 заменен другой аминокислотой; и/или аминокислота встроена (инсерция) в аминокислотное положение 49; и/или вводятся(инсерция) две аминокислоты в аминокислотные положения 35 и 36). Следует понять, что ссылка в данном описании на любую теорию для объяснения описанных результатов не ограничивает объем изобретения. Независимо от способа по изобретению результатов и преимуществ по данному описанию можно достичь со ссылкой на нижеприведенные примеры изобретения. Для рядового специалиста в данной области техники очевидно, что можно сделать многие модификации, не отходя от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании, вводятся ссылкой во всей полноте для любых целей в той степени, как если бы в отношении каждой отдельной публикации, каждого отдельного патента или каждой отдельной патентной заявки конкретно и отдельно указано, что она (он) вводится ссылкой. Пример 1. Конъюгация CRM197 с А пептидом. Конъюгацию гаптенов/антигенных пептидов проводят реакцией активированного носителя CRM197,содержащего тридцать девять остатков лизина, с гаптеном/антигенным пептидом, содержащим тиольную группу в боковой цепи, описанными ниже методами (фиг. 1). Все А пептиды содержат цистеиновый остаток на карбоксиконце для того, чтобы упростить конъюгацию этих пептидов за счет сульфгидрильной группы цистеина с белком-носителем. Эти пептиды получают твердофазным синтезом.I. Активация. Свободные аминогруппы CRM197 бромацетилируют избытком эфира N-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Bernatowicz and Matsueda, 1986). К охлаждаемому льдом раствору CRM197 (15 мг) прибавляют 10% (об./об.) 1,0 М NaHCC3 (pH 8,4). Эфир Nгидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты в количестве, равном по весу количеству CRM197, растворяют в 200 мл диметилформамида (ДМФА), медленно прибавляют к CRM197 и осторожно перемешивают при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч. Полученный бромацетилированный (активированный) белок очищают, пропуская через обессоливающую колонку (Р 6-DG), используя в качестве элюента PBS/1 мМ EDTA (pH 7,0). После очистки фракции, соответствующие активированному CRM197, собирают и концентрацию белка определяют анализом белка с реактивом ВСА. Как до, так и после обработки эфиром N-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты, проводят реакцию аминогрупп белка с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBSA), которая служат индикатором бромацетилирования (Means et al., 1972).II. Конъюгация. Перед конъюгацией пептиды реагируют с 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой) [реагент Эльмана] для проверки содержания свободных -SH-групп (около 62-88% восстановленных). Для первых четырех А пептидов (аминокислоты 1-7 без линкера, аминокислоты 1-12 с GAGAC линкером, аминокислоты 1-9 с GAGAC линкером и аминокислоты 1-7 с GAGAC линкером) около 8,0-10,0 мг пептида- 20012984 растворяют в стерильной дистиллированной воде до примерной концентрации 20 мг/мл. Пептид медленно добавляют к холодному активированному CRM197 в отношении 1:1 (вес./вес.) и pH доводят, примерно,до 7,0-7,2, добавляя 20-36 мкл 1N NaOH. Полученный материал осторожно перемешивают в течение ночи при 4 С в темноте с последующим диализом в темноте против двух 1 л смен PBS, pH 7,2. Для следующих четырех А пептидов (аминокислоты 1-5 без линкера, аминокислоты 1-9 без линкера, аминокислоты 1-12 без линкера и аминокислоты 1-5 с линкером) используют реакцию с реагентом Эльмана для проверки свободных - SH групп. CRM197 бромацетилируют, очищают и проводят реакцию с TNBSA,как описано ранее. pH каждого пептида доводят до 7,0, добавляя 0,1 М NaPO4 (pH 8,5) в 2,2 объеме растворенного пептида. Пептид медленно добавляют к холодному активированному CRM197 в отношении 1:1 и реакцию оставляют на ночь при 4 С в темноте. Полученный материал подвергают диализу. Конечный контрольный пептид (1-12-мер в обратной ориентации) конъюгируют с CRM197, как описано выше с последующей модификацией. Предпочтительнее довести pH активированного CRM197 примерно до 7,5,добавляя 20% (об./об.) 0,5 М NaPO4 (pH 8,0), чем корректировать pH пептида до 7,0. Каждый конъюгат после диализа переносят в стерильную пробирку на 15 мл из полипропилена, закрывают (обертывают) алюминиевой фольгой и хранят при 4 С. Затем методом масс-спектрометрии последовательно проверяют активацию реактивных аминокислотных остатков на носителе.CRM197 (100 мг) в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, 0,9% NaCl, pH 7,0, в атмосфере аргона реагирует с эфиром N-гидроксисукцинимида и бромуксусной кислоты (растворенным в ДМСО с концентрацией 20 мг/мл) в весовом отношении 1:1. Реакционную смесь титруют, так как необходимо поддерживать pH 7,0. Смесь перемешивают в темноте в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы UF/DF (Millipore LabscaleTFF, Billerica, MA). Очистку проводят на мембране 10 К или 30 К диафильтрацией (30-кратной) против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% NaCl, pH 7,0. Бромацетилированный CRM197 фильтруют через фильтр 0,2 мкм. Степень бромацетилирования определяют реакцией активированного CRM197 с цистеином с последующим аминокислотным анализом и количественным определением полученного карбоксиметилцистеина (CMC). Конъюгация А пептида и бромацетилированного CRM197 и "кэпирование" N-ацетилцистеамином. Бромацетилированный CRM197 (50 мг) переносят в реакционную колбу. К раствору при перемешивании при температуре 2-8 С прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия. Титруют в атмосфере аргона до достижения pH 9,0. Отдельно взвешивают 50 мг пептида А и растворяют в воде для инъекций (WFI, ВДИ) с концентрацией 20 мг/мл. К этому раствору прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия до pH 9,0. Раствор пептида прибавляют к раствору бромацетилированного CRM197 и смесь перемешивают при 2-8 С в течение 14-18 ч. Оставшиеся бромацетильные группы "кэпируют" 20 кратным молярным избытком N-ацетилцистеамина в течение 3-6 ч при 2-8 С. Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы UF/DF (Millipore XL) и конъюгат очищают при комнатной температуре 30-кратной диафильтрацией на мембране 10 К или 30 К MWCO (Millipore) против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% NaCl, pH 7,0. Ретентат собирают, фильтруют через фильтр 0,2 мкм и анализируют на содержание белка (колориметрический анализLowry или Micro-BCA), методом SDS-PAGE, аминокислотным анализом, и на иммуногенность на мышах.- 21012984 Пример 3. Превращение непрореагировавших бромацетильных групп в аминоацетильные группы с помощью"кэпирования". Бромацетилированный CRM197 (50 мг), полученный, как описано выше, в примере 2, переносят в реакционную колбу. К раствору при перемешивании при температуре 2-8 С прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия. Титруют в атмосфере аргона до достижения pH 9,0. Отдельно взвешивают 50 мг пептида А и растворяют в WFI (ВДИ) с концентрацией 20 мг/мл. К этому раствору прибавляют 1 М раствор карбоната/бикарбоната натрия до pH 9,0. Раствор пептида прибавляют к раствору бромацетилированного CRM197 и смесь перемешивают при 2-8 С в течение 14-18 ч. Оставшиеся бромацетильные группы "кэпируют" 20-кратным молярным 8% раствором бикарбоната аммония течение 4 ч при 2-8 С. Реакционную смесь фильтруют через фильтр 1,2 мкм в сосуд для концентрации системы UF/DF(Millipore XL) и конъюгат очищают при комнатной температуре 30-кратной диафильтрацией на мембране 10 К или 30 К MWCO против 0,01 М натрий-фосфатного буфера/0,9% NaCl, pH 7,0. Ретентат собирают,фильтруют и анализируют через фильтр 0,2 мкм и анализируют на содержание белка (колориметрический анализ Lowry или Micro-BCA), методом SDS-PAGE, аминокислотным анализом, и на иммуногенность на мышах. Пример 4. Количественное определение S-карбоксиметилцистеина и S-карбоксиметилцистеамина как оценка степени конъюгации и "кэпирования" конъюгатов пептидный иммуноген-белок/полипептид. Кислотный гидролиз пептид-пептидных конъюгатов, полученных с помощью бромацетильной активации, приводит к образованию устойчивого к кислоте S-карбоксиметилцистеина (CMC) из цистеинов в конъюгированных сайтах и образованию устойчивого к кислоте S-карбоксиметилцистеамина (СМСА) из цистеинов в "кэпированных" сайтах (фиг. 2). Все конъюгированные и "кэпированные" лизины превращают обратно в лизин и детектируют в виде лизина. Все другие аминокислоты гидролизуются до свободных аминокислот, за исключением триптофана и цистеина, которые в условиях гидролиза разрушаются. Аспарагин и глутамин превращаются в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно. Образцы конъюгатов разводят деионизированной водой до общей концентрации белка менее 1 мг/мл. Аликвоты 10 мкг каждого конъюгата сушат и ресуспендируют в 100 мкл 6N HCl [Pierce], 5 мкл расплавленного фенола [Sigma-Aldrich] и 1 мкл 2-меркаптоэтанола [Sigma-Aldrich]. Затем образцы инкубируют в вакууме (100 миллитор) при 110 С в течение 22 ч. Полученные гидролизаты сушат, ресуспендируют в 250 мкл Beckman Na-S буфера цитрата натрия для разведения образцов (pH 2,2) [Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA] и фильтруют, используя 0,2 мкм нейлоновые мундштучные фильтрыWhatman и шприцы на 1 мл. Каждый образец затем вносят в петлю для жидких образцов аминокислотного анализатора Beckman 6300 и помещают в анализатор. Аминокислоты из каждого гидролизованного образца и контрольного образца разделяют ионообменной хроматографией с последующей реакцией с раствором нингидринаBeckman Ninhydrin NinRX при 135 С. Дериватизированные аминокислоты затем детектируют в частотном интервале видимого излучения при 570 и 440 нм (см. табл. 1). В каждой серии анализов наряду с образцами и контрольными образцами используют стандартный набор аминокислот [Pierce Amino Acid- 22012984 Таблица 1 Время удерживания аминокислот, определенное с помощью Gradient Program 1 на аминокислотном анализаторе Beckman 6300 Площади каждого стандартного пика используют как количественный эквивалент для пропорциональной оценки каждого образца. Пролин определяют от 440 нм и превращают в эквивалент при 570 нм,используя глутаминовую кислоту, ближайшую аминокислоту. Каждое из этих значений в пикомолях превращают в молярное отношение аминокислотных остатков, используя сравнение пикомолей лизина с теоретической величиной лизина в белке. Для такой оценки выбирают лизин, исходя из его ковалентного связывания с цистеином и цистеамином и ожидаемым аналогичным гидролизом. Полученное число молей аминокислот сравнивают затем с аминокислотным составом белка и сообщают наряду с величинами для CMC и СМСА. Величину CMC применяют непосредственно для оценки степени конъюгации, а величину СМСА применяют непосредственно для оценки степени "кэпирования". Пример 5. Характеристики и оптимизация пептидных конъюгатов А-CRM197. Для проверки конъюгации все конъюгаты пептид-СКМ 197 анализируют аминокислотным анализом и время - пролетной масс-спектрометрией с лазерной десорбцией и ионизацией пробы (MALDI-TOF). Для каждого конъюгата моли пептида, конъюгированного с каждым молем CRM197, определяют аминокислотным анализом (число S-карбоксиметилцистеиновых остатков) и MALDI-TOF спектрометрией. В целом значения, полученные каждым методом, согласуются друг с другом.I. Эксклюзионная хроматография по размеру частиц. Образцы партий концентрата берут из места хранения и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Образец конъюгата А пептида осторожно перемешивают для того, чтобы гарантировать однородность препарата. Образец конъюгата А пептида центрифугируют на микроцентрифуге от Эппендорфа для удаления всех частиц. Супернатант хроматографируют на колонке TosoHaas TSK-GelG3000SW (TosoHaas, Stuttgart, Germany). Колонку TosoHaas TSK-Gel G3000SW соединяют с ВЭЖХ системой и предельное давление повышают до 1,4 МПа. Колонку уравновешивают, используя по меньшей мере 30 мл PBS (10 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,20,1), при скорости потока 0,75 мл/мин. Образец конъюгата А пептида наносят на колонку TosoHaas TSK-Gel G3000SW, используя следующие показатели: Концентрация образца конъюгата А пептида: 1,51,0 мг/мл Скорость потока: 0,75 мл/мин Объем образца: 0,1 мл Время прогона: 30 мин Оптическую плотность определяют как при 280 нм, так и при 210 нм. Для продолжительного хранения колонку TosoHaas TSK-Gel G3000SW уравновешивают по меньшей мере 50 мл 20% этанола при скорости потока 0,5-1,0 мл/мин.(заводской) полиакриламидной мини-гель системой и рабочим буфером NuPAGE MES SDS. Аликвоту 8 мкг каждого активированного CRM или конъюгата смешивают с буфером для восстановления образца и нагревают при 100 С в течение 5 мин. Конъюгаты и стандарты молекулярных масс (MB) (Invitrogen,Carlsbad, CA) наносят на 10% (вес./об., акриламид) гель NuPage (Novex) на основе системы, забуференной Bis-Tris-HCl, и проводят электрофорез в рабочем буфере MES SDS-PAGE (Laemmli). После SDSPAGE гель окрашивают с помощью Pierce Gel Code Blue (Pierce, Rockford, IL). Конъюгат А пептидCRM197 представлен основной полосой около 66 кДа, выше полосы нативного CRM и полосы димера около 120 кДа, наряду с полосами минорных мультимеров (данные не показаны).III. Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF конъюгатов пептид-CRM197. Масс-спектрометрические измерения проводят для непосредственного определения примерной степени конъюгации. Соответствующие аликвоты активированного CRM197 и образцов конъюгатов анализируют с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии с 3,5-диметокси-4-гидроксикоричной кислотой(синапиновой кислотой) в качестве матрицы. Молекулярная масса активированного CRM197, определенная методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (масс-спектрометр Finnigan MAT Lasermat 2000, Ringoes,NY), составляет около 60,5 кДа, а для конъюгатов варьируется от 65 до 74 кДа в зависимости от степени конъюгации (данные не показаны). Найдено, что до 22 лизиновых остатков (50%) в CRM197 модифицировано в отношении 1:1.IV. Эксперименты по оптимизации. Степень активации и степень конъюгации являются функцией отношения реагент:белок, температуры реакции и pH реакционного буфера. Ниже даны некоторые примеры для иллюстрации оптимальных условий конъюгации, проведенные с целью определения оптимальной величины pH для получения воспроизводимых контрольных показателей процесса в реакциях конъюгации. Результаты (фиг. 3) показывают, что реакция конъюгации с А 5-мером (DAEFRC) (SEQ ID NO:1), так же как с А 7-мером(DAEFRHDC) (SEQ ID NO:2), зависит от pH, и более высокую степень модификации/конъюгации получают при повышенном значении pH. При использовании ТФК (TFA) соли 5-мерного и 7-мерного пептидов, меняя пептидную нагрузку, оценивают степень конъюгации при pH 9,0 (фиг. 4). Из этих результатов видно, что пептидные конъюгаты с определенным числом пептидных копий на молекулу CRM можно получать, меняя в процессе конъюгации отношение пептид/активированный CRM. Аналогичные эксперименты проводят с ацетатом (уксуснокислой солью) А 7-мерного пептида. При конъюгации А 1-7/CRM процесс "кэпирования" оценивают, сравнивая число молей СМСА наCRM с числом молей CMC на CRM. Когда сумма CMC и СМСА для каждого тестированного соотношения пептид:CRM остается постоянной, предполагают, что процесс "кэпирования" закончен (фиг. 5). Общая (тотальная) модификация в конъюгате остается между 19 и 21, что сравнимо с числом бромацетилированных лизиновых остатков (фиг. 5). Эти эксперименты проводят с ТФК (TFA) в качестве противоиона для пептида. Конъюгацию А 1-7/CRM повторяют, предпочтительно используя не ТФК соль, а ацетат,и эти данные показаны на фиг. 5 и 6. Процесс "кэпирования", очевидно, закончен, при этом общее числоCMC и СМСА для каждой точки остается между значениями 20 и 22. Условия реакции конъюгации ACRM оптимизируют при pH 9,0, причем степень конъюгации в ходе реакции регулируется отношением пептида к CRM. Варьируя отношения от 0,1 до 1,5, можно менять степень конъюгации (фиг. 6). Степень активации и степень конъюгации являются функцией отношения реагент:белок, температуры реакции и pH реакционного буфера. Степень модификации (конъюгации) для каждого конъюгата рассчитывают, вычитая величину массы активированного CRM197 из величины массы каждого конъюгата, а затем делят на массу пептида, использованного для получения конъюгата. Степень модификации(конъюгации) для всех конъюгатов дана в табл. 2. Степень конъюгации также сравнивают со значениями, полученными при определении числа образовавшихся S-карбоксиметилцистеиновых остатков на моль CRM197 (также показано в табл. 2) Пример 6. Исследование иммуногенности конъюгатов А пептида. Пептиды, охватываемые N-концевыми остатками 1-5, 1-7, 1-9 и 1-12 А (с линкерной последовательностью GAGAC или без нее), и пептид, соответствующий N-концу А в обратной последовательности от аминокислоты двенадцать до аминокислоты один (1-12-мер в обратной последовательности), каждый из них конъюгирован с CRM197, применяют для иммунизации мышей наряду с неконъюгированным А 1-12-мерным пептидом в композиции со STIMULON QS-21. Каждую группу мышей иммунизируют подкожно дозой либо 30 мкг, либо 5 мкг одного из образцов, приготовленных с 20 мкг адъювантаSTIMULON QS-21, в начале исследования (неделя 0) и затем через 3 и 6 недель. Протокол исследования представлен в табл. 3. Как показано в табл. 3, пептиды, охватывающие N-концевые остатки 1-5, 1-7, 1-9 и 1-12 A (с линкерной последовательностью GAGAC или без нее), и пептид, соответствующий N-концу А в обратной последовательности от аминокислоты двенадцать до аминокислоты один (1-12-мер в обратной последовательности), конъюгированные с CRM197, применяют для иммунизации мышей наряду с неконъюгированным А 1-12-мерным пептидом в композиции с QS-21. Каждую группу мышей вакцинируют подкожно дозой либо 30 мкг, либо 5 мкг одного из образцов, приготовленных с 20 мкг адъюванта QS-21, в начале исследования (неделя 0) и затем через 3 и 6 недель. Для полного исследования берут мышей SwissWebster, по 5 мышей в каждой группе. Объем инъекции=100 мкл; В=взятие пробы крови; V=вакцинация; Е=кровопускание. Титры антител против А определяют методом ELISA против А и CRM197, как описано далее. В нескольких словах: на 96-луночных планшетах Costar (3591) в течение ночи при комнатной температуре иммобилизуют 2 мкг/мл А 1-42 в стерильном карбонат/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Планшеты опорожняют и блокируют в течение 2 ч при комнатной температуре с помощью 200 мкл/лунка 0,05% BSA в 1X PBS/0,05% Tween 20. Блокированные планшеты выгружают и отмывают с помощью устройства для промывки, содержащего TBS, 0,1% Brij-35 (не содержащий азида) буфер для отмывания. Все первичные антисыворотки стерильно разводят с 0,05% BSA в 1X PBS, содержащем 0,05% Tween 20/0,02% азид, и 100 мкл каждого разведения затем переносят в соответствующие лунки планшета и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше. Вторичное антитело козы против мышиного IgG, конъюгированное со щелочной фосфатазой, от SouthernBiotech (город, штат), разводят 1:1000 с 0,05% BSA в PBS, содержащем Tween 20/0,02% азид, и 100 мкл переносят в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше, и, наконец, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч со 100 мкл/лунка 1 мг/мл раствора субстрата п-нитрофенилфосфата, приготовленного в диэтаноламине/MgCl2, pH 9,8. Проявление цвета прекращают, добавляя 50 мкг/лунка 3N раствора NaOH. Планшеты считывают при 405 нм с эталоном 690 нм. Конечные титры рассчитывают при O.D. (оптической плотности) 0,1 AU (Ед.).- 25012984 Таблица 3 Протокол исследования иммунизации мышей Метод ELISA для CRM197. 96-луночные планшеты Greiner (650011) при 37 С в течение 90 мин покрывают пленкой 5,0 мкг/мл(100 мкл/лунка) CRM197 в стерильном карбонат/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Планшеты выгружают и отмывают с помощью устройства для промывки, содержащего 1X TBS, 0,1% Brij-35 буфер для отмывания. Все первичные антисыворотки стерильно разводят в 1X PBS, содержащем 0,3% Tween 20/ EDTA, и 100 мкл каждого разведения переносят затем в соответствующие лунки планшета и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше. Вторичное антитело козы против мышиного IgG, конъюгированное со щелочной фосфатазой, от Southern Biotech (город, штат),разводят 1:1000 с 1X PBS, содержащем 0,05% Tween 20/0,02% азид, и 100 мкл переносят в каждую лунку и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем планшеты выгружают/отмывают, как описано выше, и, наконец, инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч со 100 мкл/лунка 1 мг/мл раствора субстрата п-нитрофенилфосфата, приготовленного в диэтаноламине/MgCl2, pH 9,8. Проявление прекращают,добавляя 50 мкг/лунка 3N раствора NaOH. Планшеты считывают при 405 нм с эталоном 690 нм. Конечные титры рассчитывают при O.D. (оптической плотности) 0,1 AU (Ед.). Табл. 4-6 иллюстрируют ELISA титры в конечной точке против А. После первичной иммунизации все восемь конъюгатов (исключая негативный контроль) индуцируют заметный (измеримый) IgG иммунный ответ против А. Однако, доза 30 мкг, но не доза 5 мкг, А вызывает позитивный ответ на 3-ей неделе после первичной иммунизации. Среди всех конъюгатов, по-видимому, пептид А 1-7, конъюгированный без линкера, вызывает такой же или лучший ответ, чем другие изученные конъюгаты. В дозе 5 мкг А 1-5 С лучше действует на 8-16 неделях. А 1-7 С является лучшим в дозе 30 мкг. Анализ титров антител после второй и третьей иммунизации в дозе как 5, так и 30 мкг показывает, что максимальный иммунный ответ на А для большинства конъюгатов наблюдается после второй иммунизации. По меньшей мере, у мышей третья иммунизация, по-видимому, не повышает иммунный ответ. Однако в случае А пептида требуются три иммунизации в дозе 30 мкг для достижения максимального иммунного ответа против пептида (табл. 5). Что касается распада антитела через продолжительный период времени, уровень антител в группах, иммунизированных конъюгатами, понижается в 2-3 раза по сравнению с наивысшим уровнем в этой группе. Отдельный образцы в группах на 6 и 8 неделях анализируют для расчетаGMT (среднегеометрических титров антител) против А для каждой группы (табл. 6), чтобы узнать, действительно ли какой-либо конъюгат значительно лучше других. Статистический анализ титров на неделе- 26012984 6 в группах конъюгатов А 1-5 С, А 1-7 С и А 1-9 С показывает, что конъюгат А 1-7 индуцирует значительно более высокий титр. Также из этого эксперимента очевидно, что линкерная последовательностьGAGAC не способствует повышению иммунного ответа на пептид. Таблица 4 Табл. 4. Конечные титры антител против А на 0, 3, 6, 8, 13 и 16 неделе, полученные методомELISA при использовании антисыворотки в результате введения дозы 5 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих N-концевые амилоидные А пептиды различной протяженности. Эталон: гипериммунная поликлональная сыворотка Elan 592=3073307. Конечная точка при O.D. 0,1 AU (Ед.). Мышей SwissWebster иммунизируют SC-N (подкожно) дозой 5 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг STMULON QS-21 на 0, 3 и 6 неделях. Таблица 5 Табл. 5. Конечные титры антител против А на 0, 3, 6, 8, 13 и 16 неделе, полученные методомELISA при использовании антисыворотки в результате введения дозы 30 мкг пептидных конъюгатов,охватывающих N-концевые амилоидные А пептиды различной протяженности. Эталон: гипериммунная поликлональная сыворотка Elan 592=3073307. Конечная точка при O.D. 0,1 AU (Ед.). Мышей SwissWebster иммунизируют SC-N (подкожно) дозой 30 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг STIMULON QS-21 на 0, 3 и 6 неделях. Таблица 6- 27012984 Табл. 6. Конечные GMT (среднегеометрические титры) антител против А через 6 и 8 недель, полученные методом ELISA при использовании антисыворотки в результате введения дозы 30 мкг пептидных конъюгатов, охватывающих N-концевые пептиды амилоида-А различной протяженности. Эталон: гипериммунная поликлональная сыворотка Elan 592=3073307. Конечная точка при O.D. 0,1 AU (Ед.). Мышей Swiss-Webster иммунизируют SC-N (подкожно) дозой 30 мкг вышеуказанных антигенов, приготовленных вместе с 20 мкг STIMULON QS-21 на 0, 3 и 6 неделях.a. Статистический анализ титров антител на 6 неделе после введения 1-5 С, 1-7 С и 1-9C с применением критерия Тьюки-Крамера показывает статистическую разницу только между 1-5 С по сравнению с 1-7 С, тогда как анализ с применением Т-теста Стьюдента показывает статистическую разницу между 15 С по сравнению с 1-7 С и между 1-5 С по сравнению с 1-9 С.b. Статистический анализ титров антител на 8 неделе после введения 1-5 С, 1-7 С и 1-9 С не показывает статистической разницы между этими тремя группами. Однако, очевидно, имеется тенденция, которая может указывать на разницу между 1-5 С по сравнению с 1-7 С. Окрашивание тканей мозга мышей линии PDAPP. Анализ окрашивания тканей мозга мышей линии PDAPP указывает на функциональность конъюгатов А пептида и/или А 1-42 антисыворотки. Образцы сыворотки отдельных групп мышей анализируют отдельно на их способность узнавать бляшки, содержащие амилоидный пептид, в тканях мозга мышейPDAPP. Результаты показаны в табл. 7 А и 7 В. За исключением антисывороток в результате введения конъюгата А 5-мера, наблюдается зависящий от дозы (доза-эффект) ответ узнавания бляшек. Вне зависимости от линкера антисыворотки, полученные в результате введения 30 мкг конъюгата, имеют лучший паттерн реактивности по сравнению с антисыворотками, полученными в результате введения 5 мкг конъюгата. Однако в случае антисывороток, полученных в результате введения конъюгата А 5-мера,наблюдается, по-видимому, сходная или лучшая реактивность в группе, получавшей дозу 5 мкг. Сравнение всех этих результатов приводит к выводу, что конъюгаты, полученные из А 1-5-мера по А 1-9-мер,достаточны для выявления распознающего бляшки иммунного ответа у мышей и присутствие линкера не является существенным. Из данного исследования можно сделать следующие заключения.(а) Все пептидные конъюгаты индуцируют высокие титры антител против белка-носителя CRM197, с равными или более высокими уровнями по сравнению с контрольным неконъюгированным CRM197 (не показано).(б) Конъюгаты с линкером GAGAC не повышают иммуногенность или функциональность по сравнению с конъюгатами без линкера.(в) Данные по иммуногенности и окрашиванию тканей мозга мышей PDAPP (первичный показатель функционального антитела) показывают, что конъюгаты А 1-5-мера и А 1-7-мера, очевидно, являются предпочтительными иммуногенами для дальнейшей разработки. Таблица 7 А Окрашивание тканей мозга мышей линии PDADD Всю антисыворотку разводят 1:1000 для окрашивания.- 28012984 Таблица 7 В Окрашивание тканей мозга мышей линии PDADD Всю антисыворотку разводят 1:1000 для окрашивания. Пример 7. Изучение иммуногенности на обезьянах. Группы из 6 обезьян получают 30 мкг конъюгата 7-мера (тотальный конъюгат) с адъювантом, в качестве которого берут STIMULON QS-21, соли алюминия (alum) или препарат RC529SE, в дни 0, 29 и 58. Дополнительные группы получают 30 мкг конъюгата 5-мера либо с соединением (гидроксидом) алюминия (alum, Al(ОН)3), либо с RC529SE, 75 и 300 мкг А со STIMULON QS-21 в качестве позитивного контроля. Позитивный контроль вводят каждые две недели. На 36 и 64 день определяют титры антител против А (фиг. 7-9). На 36 день GMT титры антител, вырабатываемых конъюгатами 7-мер/CMR плюс(фиг. 7). Напротив, А 1-42 плюс STIMULON QS-21 выявляют GMT антител 223 и 1734 при уровнях доз 75 и 300 мкг соответственно. Конъюгат А 5-мера дает титр 2134 с соединением алюминия и 15980 сRC529SE. На 64 день, т.е. после 3 доз, конъюгаты либо со STIMULON QS-21, либо с RC529SE индуцируют значительно более высокие титры, чем после второй дозы (GMT 69910 для конъюгата 7 мер/RC529 SE; 21640 для конъюгата А 5-Mep/RC529 SE и 30310 для конъюгата А 7-мер/STIMULONQS-21) (фиг. 8). Конъюгаты с соединением алюминия индуцируют пониженные титры после третьей иммунизации по сравнению с результатами после второй иммунизацией. По-видимому, конъюгат А 7 мера вызывает лучший (более высокий) ответ по сравнению с конъюгатом А 5-мера. У обезьян введение конъюгата А 7-мера с RC529 SE или со STIMULON QS-21 в качестве адъюванта вызывают самый высокий ответ (фиг. 9). Ответ на конъюгат А 7-мера с соединением алюминия умеренный и сходен с ответом на введение 300 мкг А 1-42 плюс STIMULON QS-21. Из данного примера можно сделать несколько выводов. Во-первых, оба конъюгата являются в высокой степени иммуногенными в отношении приматов. Во-вторых, присутствие адъювантов в препарате для иммунизации заметно влияет на иммунный ответ. В-третьих, за исключением алюминиевого адъюванта, RC529 SE и STIMULON QS-21 повышают иммунный ответ после каждой вводимой при иммунизации дозы, по меньшей мере, вплоть до трех доз (фиг. 9). В целом конъюгат А 7-мера вызывает более высокий антительный ответ в присутствии 529, а затем следует STIMULON QS-21. Пример 8. Получение конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП, MAP) и изучение их иммуногенности. Имеется несколько методов получения множественных антигенных сайтов на носителях. В предыдущих примерах каждый антигенный сайт по отдельности конъюгировался с носителем с помощью описанных реакций конъюгации и "кэпирования". В данном примере множественные антигенные сайты создают твердофазным синтезом тандемных повторов А 1-7-мера. Или же эти тандемные повторы могут связываться с Т-клеточными эпитопами с соединением или без соединения через лизиновое ядро, как описано в другом месте. Эти множественные антигенные пептиды синтезируют с дополнительным цистеиновым остатком для конъюгации с белком-носителем. Синтезируют пептиды, содержащие одну единицу повтора (1-7), три единицы повтора (1-7)3 и пять единиц повтора (l-7)5 с дополнительным цистеи- 29012984 нильным остатком на карбоксильном конце. Эти пептиды ковалентно связывают с бромацетилированным CRM в течение ночи через С-концевые цистеиновые остатки. Реакцию проводят при pH 9,0-9,2 при соотношениях пептид:CRM, приведенных в табл. 8. Бромацетильные группы, не прореагировавшие с пептидом, "кэпируют" N-ацетилцистеамином. Эти группы представляют собой конъюгаты, содержащие,соответственно, одну единичную копию, три тандемных копии и пять тандемных копий пептида А 1-7,конъюгированные с CRM. В табл. 8 коротко показаны свойства образцов. Таблица 8 Образцы конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП, MAP) Пептидная нагрузка (среднее число А 1-7 пептидов на носитель) и число "кэширований" (табл. 9) представляют собой число уникальных аминокислот (CMC или СМСА) на носитель, определенное аминокислотным анализом. Величины CMC и СМСА отнесены к лизину. Таблица 9 Степень конъюгации и "копирования" каждого конъюгата Мышей Swiss-Webster (по 10 в группе) иммунизируют, вводя подкожно 1 или 0,1 мкг конъюгированного пептида Ap/CRM. Половину мышей иммунизируют композицией, приготовленной со 100 мкг адъюванта Al(ОН)3, а половину иммунизируют без адъюванта. Иммунизацию проводят на 0 и 3 неделе. Отбор проб крови проводят на 0, 3 и 6 неделе. Образцы сыворотки анализируют на антительный ответ против А 1-42-мерного пептида. Результаты показаны в табл. 10. Таблица 10 Конечные титры антител против А для конъюгатов множественных антигенных пептидов (МАП) Все конъюгаты индуцируют титр антитела против А 1-42 после первичной иммунизации, и уровни заметно повышаются после бустерной дозы. В отсутствие алюминиевого адъюванта разница доза-эффект очевидна в пробах крови как на 3, так и на 6 неделе. Более высокая доза вызывает антительный ответ с высоким титром. Алюминиевый адъювант вызывает значительно более высокий антительный ответ на 3 неделе в случае обоих уровней доз (0,1 и 1 мкг) по сравнению с группами, не получающими адъюванта. После вторичной иммунизации конъюгаты в дозе 1 мкг вызывают 5-10-кратное повышение уровней антител. В таком уровне доз пептидные конъюгаты с 3 и 5 повторами индуцируют более высокий антительный ответ, чем конъюгат, содержащий одиночный (однократный) повтор. Также определяют титры против носителя CRM, они представлены в табл. 11.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/38, A61K 39/00
Метки: пептидных, конъюгаты, получения, носителей, иммуногенных, способы
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-12984-konyugaty-immunogennyh-peptidnyh-nositelejj-i-sposoby-ih-polucheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения</a>
Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
Номер патента: 10060
Опубликовано: 30.06.2008
Авторы: Арумугхам Расаппа Г., Прасад А.Кришна
МПК: A61K 39/00, A61K 39/38
Метки: носителей, получения, иммуногенных, пептидных, конъюгаты, способы
Формула / Реферат:
1. Способ конъюгации пептидного иммуногена с белковым/полипептидным носителем, имеющим одну или более функциональных групп, содержащий следующие стадии: (а) дериватизация одной или более функциональных групп белкового/полипептидного носителя или, необязательно, полипептидного линкера, связанного с белковым/полипептидным носителем, с образованием дериватизированного носителя с реактивными сайтами; (б) реакция дериватизированного...
Конъюгаты aβ иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
Номер патента: 9559
Опубликовано: 28.02.2008
Авторы: Арумугхам Расаппа Г., Прасад А.Кришна
МПК: C07K 1/00, A61P 37/00
Метки: а&beta, получения, конъюгаты, пептидных, иммуногенных, носителей, способы
Формула / Реферат:
1. Способ конъюгации пептидного иммуногена, содержащего Ab-пептид, или фрагменты Ab, или его аналоги, с белковым/полипептидным носителем, имеющим одну или более функциональных групп, содержащий стадии: а) дериватизации одной или более функциональных групп белкового/полипептидного носителя или, необязательно, связанного с белковым/полипептидным носителем полипептидного линкера с образованием дериватизированной молекулы с реактивными сайтами; б)...
Конъюгаты aβ иммуногенных пептидных носителей и способы их получения
Номер патента: 11239
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Прасад А.Кришна, Арумугхам Расаппа Г.
МПК: C07K 1/00
Метки: носителей, пептидных, а&beta, конъюгаты, получения, иммуногенных, способы
Формула / Реферат:
1. Способ получения иммуногенного конъюгата, включающий стадии: (а) введение реакционноспособной группы в аминокислотный остаток пептидного иммуногена, причём пептидный иммуноген представляет собой Ab пептид, или его фрагмент, или аналог; (б) дериватизацию одной или более функциональных групп белка-носителя с целью получения активированной функциональной группы на белке-носителе; (в) реакцию пептидного иммуногена стадии (а) с белком-носителем...
Полимерные конъюгаты с пониженными антигенными свойствами, способы их получения и применения
Номер патента: 9122
Опубликовано: 26.10.2007
Авторы: Вильямс Л.Дэвид, Сейфер Марк Г.П., Шерман Мерри Р., Мартинес Алекса Л.
МПК: A61K 38/18, A61K 38/22, A61K 38/16...
Метки: конъюгаты, применения, способы, полимерные, свойствами, пониженными, получения, антигенными
Формула / Реферат:
1. Конъюгат, содержащий один или несколько биологически активных компонентов, ковалентно присоединенных не менее чем к одному линейному или разветвленному полиалкиленгликолю, который не содержит алкоксильной группы на каком бы то ни было конце и который присоединен к единственному биологически активному компоненту на единственном своем участке. 2. Конъюгат по п.1, который характеризуется пониженной или существенно пониженной антигенностью по...
Полимерные реагенты, способы их получения, а также содержащие их конъюгаты и фармацевтические препараты
Номер патента: 11351
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Харрис Дж.Милтон, Козловски Энтони, Чарлз Стивен А., Бентли Майкл Д., Макманус Сэмуел П.
МПК: C08G 65/329, A61K 47/48
Метки: препараты, полимерные, реагенты, получения, содержащие, конъюгаты, фармацевтические, также, способы
Формула / Реферат:
1. Полимерный реагент, включающий часть расположенную между водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, и реактивной группой, выбранной из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната, ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата,...
Предыдущий патент: Замещенные пирролпиридины, способ их получения и применение
Следующий патент: Способ получения сорбента на основе гидрогеля метилкремниевой кислоты
Случайный патент: Силовая схема возбуждения для управления ультразвуковым преобразователем с переменной нагрузкой