Новый способ предупреждения или лечения инфекции, вызываемой m.tuberculosis

012576 Область изобретения Настоящее изобретение относится к способам предупреждения или лечения реактивации инфекции,вызываемой М.tuberculosis (Mtb или MTB), у млекопитающего и к способам сокращения продолжительности курса химиотерапии против инфекции, вызываемой М.tuberculosis. Предшествующий уровень техники Туберкулез представляет собой хроническое инфекционное заболевание, вызываемое инфекцией М.tuberculosis и другими видами Mycobacterium. Это заболевание является основным заболеванием в развивающихся странах, а также представляет собой нарастающую проблему в развитых частях света,приблизительно с 8 миллионами новых случаев и 3 миллионами смертей ежегодно. Несмотря на то что инфекция может быть бессимптомной в течение значительного периода времени, заболевание обычно проявляется как острое воспаление легких, приводящее к лихорадке и непродуктивному кашлю. При отсутствии лечения типичными результатами являются серьезные осложнения и смерть. Несмотря на то что туберкулез, как правило, можно контролировать с использованием обширной терапии антибиотиками, такое лечение не является достаточным для предупреждения распространения заболевания. Инфицированные индивидуумы могут в течение некоторого периода времени быть бессимптомными, но контагиозными. Кроме того, несмотря на то, что соблюдение схемы лечения является критическим, поведение пациента трудно контролировать. Некоторые пациенты не завершают курс лечения,что может приводить к неэффективности лечения и развитию лекарственной устойчивости. Даже если полный курс лечения пройден, инфекция М.tuberculosis не уничтожается в инфицированном индивидууме, а остается в виде латентной инфекции, которая может реактивироваться. Для того чтобы контролировать распространение туберкулеза, крайне необходимыми являются эффективная вакцинация и точный ранний диагноз заболевания. В настоящее время вакцинация живыми бактериями является наиболее эффективным способом индукции защитного иммунитета. Чаще всего для этой цели используют микобактерию Bacillus Calmette-Guerin (BCG), авирулентный штамм М.bovis. Однако безопасность и эффективность BCG являются предметом дискуссии, и в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты, широкую вакцинацию населения этим агентом не осуществляют. Диагностику туберкулеза обычно успешно выполняют, используя кожный тест, который включает внутрикожное введение очищенного от белка туберкулина (PPD). Антигенспецифические Т-клеточные ответы приводят к измеряемому уплотнению в месте инъекции через 48-72 ч после инъекции, что указывает на контакт с микобактериальными антигенами. Однако проблемами этого теста являются чувствительность и специфичность, и индивидуумов, вакцинированных BCG, невозможно отличить от инфицированных индивидуумов. Несмотря на то что показано, что макрофаги действуют в качестве главных эффекторов иммунитета к Mycobacterium, T-клетки являются преобладающими индукторами такого иммунитета. Существенная роль Т-клеток в защите против инфекции, вызываемой Mycobacterium, иллюстрируется частой встречаемостью инфекции Mycobacterium у пациентов со СПИДом вследствие истощения CD4+ Т-клеток, ассоциированных с инфекцией вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Показано, что Mycobacteriumреактивные CD4+ T-клетки являются мощными продуцентами -интерферона (IFN-), для которого, в свою очередь, показано, что он запускает антимикобактериальные эффекты макрофагов у мышей. Несмотря на то что роль IFN- у людей менее понятна, исследованиями показано, что 1,25-дигидроксивитамин D3 либо сам по себе, либо в комбинации с IFN- или фактором некроза опухолей-альфа активирует макрофаги человека для ингибирования инфекции, вызываемой М.tuberculosis. Кроме того, известно, что IFN- стимулирует макрофаги человека к продукции 1,25-дигидроксивитаминаD3. Аналогично показано, что интерлейкин-12 (IL-12) играет роль в стимуляции устойчивости к инфекции, вызываемой М.tuberculosis. Для обзора иммунологии инфекции, вызываемой М.tuberculosis, см.ChanKaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom ed., 1994), Tuberculosis (2nd ed.,Rom and Garay, eds., 2003) и Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed.,Braunwald, et al., eds., 2005). Сохраняется потребность в эффективных лечебных стратегиях для предупреждения реактивации инфекций, вызываемых Mycobacterium tuberculosis, как для активных, так и для латентных форм инфекций. Данное изобретение удовлетворяет этим и другим потребностям. Описание перечня последовательностей-1 012576 Краткое изложение сущности изобретения Согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса,например, вместе с одним или более чем одним адъювантом, включая AS01B и AS02A. Настоящее изобретение частично основано на открытии авторами изобретения того, что введение слитого белка Mtb72f или его иммуногенного фрагмента, например, вместе с одним или более чем одним адъювантом либо нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент, может предупреждать или лечить реактивацию активной или неактивной инфекции, вызываемой М.tuberculosis. В предпочтительном воплощении слитый белок Mtb72f или нуклеиновую кислоту вводят вместе с одним или более химиотерапевтическими агентами, эффективными против инфекции,вызываемой М.tuberculosis. В одном аспекте композиции используют в способах предупреждения или лечения реактивации туберкулеза у субъекта, включающих стадию введения млекопитающему, уже инфицированномуMycobacterium tuberculosis, иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции,содержащей слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса и адъювант, где слитый белок Mtb72f индуцирует иммунный ответ против М.tuberculosis,предупреждая или излечивая тем самым реактивацию туберкулеза. В другом аспекте композиции используют в способах предупреждения реактивации туберкулеза у субъекта, включающих стадию введения млекопитающему, уже инфицированному Mycobacteriumtuberculosis, иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из видаMycobacterium туберкулезного комплекса и адъювант, где экспрессируемый слитый белок Mtb72f индуцирует иммунный ответ против М.tuberculosis, предупреждая или излечивая тем самым реактивацию туберкулеза. В другом аспекте композиции используют в способах сокращения продолжительности курса химиотерапии против инфекции, вызываемой М.tuberculosis, включающих введение млекопитающему, уже инфицированному Mycobacterium tuberculosis, одного или более химиотерапевтических агентов, эффективных против инфекции, вызываемой М.tuberculosis, и иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса и адъювант, при этом указанный слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент индуцирует иммунный ответ против М.tuberculosis, обеспечивая тем самым сокращение продолжительности курса химиотерапии против инфекции, вызываемой М.tuberculosis. Кроме того, благодаря сокращению продолжительности курса химиотерапии против инфекции, вызываемой М.tuberculosis, настоящие способы эффективны для улучшения соблюдения индивидуумом, которого лечат от инфекции, вызываемой М.tuberculosis, режима и схемы лечения с целью полного завершения всего курса лечения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показано графическое представление модели реактивации М.tuberculosis на мышах SwissWebster (SWR/J). На фиг. 1 показаны временные точки для инфицирования, химиотерапии (50 мг рифампина/85 мг изониазида на 1 л питьевой воды), иммунизации и подсчета бактериальной нагрузки/колониеобразующих единиц (КОЕ). На фиг. 2 показаны иммунные ответы в виде IgG1 и IgG2a антительных ответов у мышей SWR/J,инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированных с помощью Mtb72f. Мышей оставляли без лечения, подвергали химиотерапии (50 мг рифампина/85 мг изониазида на 1 л питьевой воды) или подвергали химиотерапии и три раза иммунизировали внутримышечно, используя 8 мкг Mtb72f на дозу, приготовленную без адъюванта. Через 10 суток после последней иммунизации у мышей брали кровь и сыворотки тестировали с использованием ИФА (твердофазного иммуноферментного анализа, ELISA) на анти-Mtb72f антительный ответ как в отношении IgG1 (красный), так и в отношении IgG2a (черный) изотипических детерминант. На фиг. 3 показаны иммунные ответы в виде IgG1 и IgG2a антительных ответов у мышей SWR/J,инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированныхMtb72f. Мышей оставляли без лечения, подвергали химиотерапии (50 мг рифампина/85 мг изониазида на 1 л питьевой воды) или подвергали химиотерапии и три раза иммунизировали внутримышечно, используя 8 мкг Mtb72f на дозу, приготовленную с адъювантом AS01B. Через 10 суток после последней иммунизации у мышей брали кровь и сыворотки тестировали с использованием ИФА на анти-Mtb72f антительный ответ как в отношении IgG1 (красный), так и в отношении IgG2a (черный) изотипических детерминант. На фиг. 4 показаны ответы в виде интерферона-гамма (IFN-) у мышей SWR/J, инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированных Mtb72f. В различные временные точки у мышей брали клетки селезенки и стимулировали in vitro в течение 3 суток,используя 10 мкг/мл либо rMtb72f (реконбинантный Mtb72f), либо компонентов (Mtb32c и Mtb39), как будет указано. В качестве контроля также стимулировали культуры спленоцитов, используя или PPD(3 мкг/мл), BCG-лизат (10 мкг/мл), conA (3 мкг/мл) или тольку среду. Продуцирование IFN- затем измеряли с использованием ИФА. На фиг. 5 показаны ответы в виде IFN- у мышей SWR/J, инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированных Mtb72f. В различные временные точки у мышей брали клетки селезенки и стимулировали in vitro в течение 3 суток, используя 10 мкг/мл либо rMtb72f, либо компонентов (Mtb32c и Mtb39), как будет указано. В качестве контроля также стимулировали культуры спленоцитов, используя PPD (3 мкг/мл), BCG-лизат (10 мкг/мл), conA (3 мкг/мл) или только среду. Продуцирование IFN- затем измеряли с использованием ИФА. На фиг. 6 показаны CD4+ Т-клеточные и IFN- цитокиновые ответы у мышей SWR/J, инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированных Mtb72f. В различные временные точки у мышей брали клетки селезенки и стимулировали in vitro в течение ночи,используя 10 мкг/мл rMtb72f. Затем клетки окрашивали на CD4 и IFN-. В качестве контроля также стимулировали культуры спленоцитов, используя тольку среду. CD4+ Т-клеточное специфическое продуцирование IFN-+ затем измеряли с использованием внутриклеточного цитокинового окрашивания (ICS). На фиг. 7 показаны сведенные в таблицы величины CD4+ и CD8+ Т-клеточного специфического продуцирования IFN-+ на 120-е сутки после Mtb-инфекции. Спленоциты получали от групп мышей,оставленных без лечения, подвергнутых комбинированной химиотерапии в течение 30, 60 или 90 суток или подвергнутых комбинированной химиотерапии в дополнение к Mtb72f-вакцине. Спленоциты стимулировали in vitro в течение ночи, используя 10 мкг/мл rMtb72f. Затем клетки окрашивали на CD4, CD8 или IFN-. В качестве контроля культуры спленоцитов также стимулировали только средой. CD4+ иCD8+ Т-клеточное специфическое продуцирование IFN-+ затем измеряли с использованием внутриклеточного цитокинового окрашивания. На фиг. 8 показано выживание мышей SWR/J, инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированных Mtb72f. Мышей инфицировали, используя аэрозоль с 50-100 КОЕ MtbH37Rv, и химиотерапию (50 мг рифампина/85 мг изониазида на 1 л питьевой воды) у подгруппы мышей начинали спустя 30 суток. Химиотерапию продолжали в течение 60 суток. Половину мышей, получавших химиотерапию, три раза иммунизировали внутримышечно, используя 8 мкг Mtb72f на дозу, приготовленную с адъювантом AS01B. На фиг. 9 показано выживание мышей SWR/J, инфицированных М.tuberculosis, получавших химиотерапевтическое лечение и затем иммунизированных Mtb72f. Мышей инфицировали, используя аэрозоль с 50-100 КОЕ MtbH37Rv, и химиотерапию (50 мг рифампина/85 мг изониазида на 1 л питьевой воды) у подгруппы мышей начинали спустя 30 суток. Химиотерапию продолжали в течение 30, 60 или 90 суток в отдельных подгруппах мышей. Половину мышей, получавших химиотерапию, три раза иммунизировали внутримышечно, используя 8 мкг Mtb72f на дозу, приготовленную с адъювантом AS01B. Подробное описание конкретных воплощений Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим нуклеиновые кислоты или слитые белки Mtb72f и адъювант, полезные для лечения, предупреждения или замедления реактивации активной или неактивной (т.е. латентной) инфекции Mycobacterium, и к способам их применения. Более конкретно,композиции по настоящему изобретение содержат слитые полипептиды Mtb72f или их иммуногенные фрагменты либо нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые полипептиды Mtb72f или их иммуногенные фрагменты, имеющие компоненты из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса, например, таких видов, как М.tuberculosis, M.bovis или М. africanum, или видов Mycobacterium, которые присутствуют в окружающей среде или являются условно-патогенными и которые вызывают условно-патогенные инфекции, такие как легочные инфекции, у хозяев с ослабленным иммунитетом (например, у пациентов со СПИДом), например, BCG, M.avium, M.intracellulare, M.celatum, M.genavense, M.haemophilum,M.kansasii, M.simiae, M.vaccae, M.fortuitum и М.scrofulaceum (см., например, Harrison's Principles ofInternal Medicine, Chapter 150, p. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что композиции, содержащие слитые полипептиды Mtb72f, или нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые полипептиды Mtb72f или их иммуногенные фрагменты, полезны в лечении, предупреждении или замедлении реактивации инфекции, вызываемой М.tuberculosis. В предпочтительном воплощении слитый полипептид Mtb72f или нуклеиновую кислоту вводят с одним или более химиотерапевтическими агентами. Поэтому эти композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют, являются полезными для индукции иммунного ответа у млекопитающих, который является защитным против реактивации симптомов заболевания. Нуклеиновые кислоты и слитые полипептиды Mtb72f по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие компоненты, предназначенные для усиления их антигенности или для улучшения этих антигенов в других аспектах. Например, улучшенному выделению слитых полипептидных антигенов может способствовать добавление участка гистидиновых остатков к одному концу данного антигена. Композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать дополнительные копии антигенов или дополнительные гетерологичные полипептиды из Mycobacterium sp., такие как антиген MTB8.4, антиген MTB9.8, антиген MTB9.9, антиген MTB40, антиген MTB41, антиген ESAT-6,-3 012576 комплексный антиген MTB85, -кристаллический антиген или антиген NS1. Альтернативно или в дополнение к этому, композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать дополнительные копии других антигенов из Mycobacterium sp., таких как Ag85 В или МТСС 2. Композиции, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению также могут содержать дополнительные полипептиды из других источников. Например, композиции слитых белков по изобретению могут включать полипептиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие эти полипептиды, при этом данный полипептид, например белок вируса гриппа, усиливает экспрессию антигена, например NS1 (см., например,WO99/40188 и WO93/04175). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть сконструированы на основе предпочтения кодонов в выбранном виде, например, у людей. Композиции, содержащие слитый белок Mtb72f, обычно содержат один или более адъювантов, например AS01B (монофосфориллипид A (MPL) и QS21 в липосомном препарате; см. публикацию патента США 2003/0143240); AS02A (3D-MPL (3-де-О-ацилированный MPL) и QS21 и эмульсия типа масло-вводе; см. Bojang, et al., Lancet (2001), 358: 1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; сапонины, включая Quil А и его компоненты, например QS21 и имитаторы сапонинов; CWS; TDM; AGP; иммуностимуляторные олигонуклеопептиды, например CPG; Leif; и их производные. В предпочтительном воплощении слитый полипептид Mtb72f вводят с одним или более адъювантами, выбранными из группы, состоящей из 3D-MPL и QS21 в липосомном препарате, например AS01B, и MPL, и QS21, и эмульсии типа масло-вводе (например, AS02A). Адъюванты AS01B и AS02A также описаны в Pichyangkul, et al., Vaccine (2004),22: 3831-40. При доставке Mtb72f-антигена в виде нуклеиновой кислоты он может быть доставлен, например, в вирусном векторе (т.е. аденовирусном векторе) или в мутантной бактериальной клетке-хозяине (т.е. мутантной авирулентной клетке-хозяине Mycobacterium, Lactobacillus или Bacillus, включая BacillusCalmette-Guerin (BCG) и Lactococcus lactis). В одном аспекте композиции используют в способах предупреждения или лечения реактивации туберкулеза у субъекта, включающих стадию введения млекопитающему, уже инфицированномуMycobacterium tuberculosis, иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции,содержащей слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса и адъювант, где слитый белок Mtb72f индуцирует иммунный ответ против М.tuberculosis,тем самым предупреждая реактивацию туберкулеза. Используя способы по настоящему изобретению,реактивацию инфекции, вызываемой М.tuberculosis, можно замедлить (например, на месяцы, годы или на неограниченный срок). В одном аспекте композиции используют в способах предупреждения или лечения реактивации туберкулеза у субъекта, включающих стадию введения млекопитающему, уже инфицированномуMycobacterium tuberculosis, иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции,содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса, где экспрессируемый слитый белок Mtb72f индуцирует иммунный ответ против М.tuberculosis, тем самым предупреждая реактивацию туберкулеза. В одном воплощении нуклеиновую кислоту или слитый белок Mtb72f вводят индивидууму с активной формой инфекции, вызываемой М.tuberculosis. В одном воплощении нуклеиновую кислоту или слитый белок Mtb72f вводят индивидууму с неактивной или латентной формой инфекции, вызываемой М.tuberculosis. В одном воплощении нуклеиновую кислоту или слитый белок Mtb72f вводят индивидууму, инфицированному штаммом М.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. В одном воплощении нуклеиновую кислоту или слитый белок Mtb72f вводят индивидууму, который был предварительно иммунизирован Bacillus Calmette-Guerin (BCG). В некоторых воплощениях нуклеиновую кислоту или слитый белок Mtb72f вводят с одним или более химиотерапевтическими агентами, эффективными против инфекции, вызываемой М.tuberculosis. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, но не ограничиваются этим, амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид, рифамицины (т.е. рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны. Такая химиотерапия определяется решением лечащего врача, использующего предпочтительные комбинации лекарственных средств. Химиотерапевтические агенты "первой линии", используемые для лечения инфекции, вызываемой М.tuberculosis, которая не является устойчивой к лекарственным средствам, включают изониазид, рифампин, этамбутол,стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты "второй линии", используемые для лечения инфекции, вызываемой М.tuberculosis, которая демонстрирует устойчивость к одному или более лекарственным средствам "первой линии", включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин. Нуклеиновая кислота или слитый белок Mtb72f могут быть введены до, одновременно с или после введения одного или более химиотерапевтических агентов, эффективных против инфекции, вызываемой М.tuberculosis. В одном воплощении нуклеиновую кислоту или слитый белок Mtb72f вводят приблизительно через 2 недели после начала введения одного или более химиотерапевтических агентов. Один или более химиотерапевтических агентов обычно вводят в течение некоторого периода времени, составляю-4 012576 щего например, приблизительно 1, 2, 3 или 4 недели, 2, 3, 4, 5, 6 или 8 месяцев, 1 год или более длительного периода времени. В некоторых воплощениях эффект нуклеиновой кислоты или слитого белка Mtb72f усиливается посредством введения вместе с Bacillus Calmette-Guerin (BCG). В некоторых воплощениях за примированием или первым введением нуклеиновой кислоты или слитого полипептида Mtb72f следует одна или более "бустер-иммунизации" или последующих введений нуклеиновой кислоты или слитого полипептида Mtb72f (способ "примирования и бустер-иммунизации"). Например, за первым введением нуклеиновой кислоты или слитого полипептида Mtb72f следуют одно или более последующих введений нуклеиновой кислоты или слитого белка Mtb72f. В одном воплощении за первым введением нуклеиновой кислоты или слитого полипептида Mtb72f следует одно или более последующих введений слитого полипептида Mtb72f. В одном воплощении за первым введением нуклеиновой кислоты или слитого полипептида Mtb72f следует одно или более последующих введений нуклеиновой кислоты Mtb72f. Обычно первое или "примирующее" введение и второе или бустинг-введение выполняют с интервалом приблизительно 2-12 недель или вплоть до 4-6 месяцев. Последующие бустингвведения выполняют с интервалом приблизительно 6 месяцев или с интервалом 1, 2, 3, 4 или 5 лет. Традиционная бустинг-обработка (например, примирующее введение белка с последующим бустингвведением белка) также полезна для предупреждения или лечения реактивации М.tuberculosis. В другом аспекте композиции используют в способах уменьшения или сокращения продолжительности курса химиотерапии против инфекции, вызываемой М.tuberculosis, включающих введение млекопитающему, уже инфицированному Mycobacterium tuberculosis, одного или более химиотерапевтических агентов, эффективных против инфекции, вызываемой М.tuberculosis, и иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей слитый полипептид Mtb72f или его иммуногенный фрагмент из вида Mycobacterium туберкулезного комплекса и адъювант, где указанный слитый полипептид Mtb72f индуцирует иммунный ответ против М.tuberculosis, тем самым обеспечивая уменьшение или сокращение продолжительности курса химиотерапии против инфекции, вызываемой М.tuberculosis. В большинстве случаев введение нуклеиновой кислоты или слитого полипептида Mtb72f позволит осуществить эффективное химиотерапевтическое лечение инфекции, вызываемой М.tuberculosis, в течение 6, 5, 4, 3 месяцев или меньше.Mtb72f-содержащие композиции обычно вводят людям, но они эффективны и у других млекопитающих, включая домашних животных (т.е. собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, морских свинок, хомячков, шиншилл) и сельскохозяйственных млекопитающих (т.е. коров, свиней, овец, коз, лошадей). В наиболее общем отношении слитый белок Mtb72f по изобретению представляет собой белок, содержащий, по меньшей мере, иммуногенный фрагмент каждого из 3 антигенов Ra12-TbH9-Ra35. В соответствии с номенклатурой данного изобретения Ra35 относится к N-концу Mtb32A (Ra35FL(полноразмерный, содержащему по меньшей мере приблизительно первые 205 аминокислот Mtb32 А из М.tuberculosis, нуклеотидная и аминокислотная последовательность которого представлена на фиг. 4 заявки на патент США 09/597796, или соответствующему участку из другого вида Mycobacterium. В наболее типичных случаях Ra35 относится к участку SEQ ID NO: 2, раскрытому в настоящем описании,соответствующему остаткам 535-729. Альтернативно, он относится к варианту Ra35, в котором аминокислота Ser, соответствующая положению 710 в SEQ ID NO: 2, заменена на Ala.Ra12 относится к С-концу Mtb32A (Ra35FL), содержащему по меньшей мере примерно 132 последних аминокислоты Mtb32A из М.tuberculosis, последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 4(ДНК) и SEQ ID NO: 66 (предсказанная аминокислотая последовательность) в заявке на патент США 09/072967, или соответствующему участку из другого вида Mycobacterium. В наболее типичных случаях Ra12 относится к участку SEQ ID NO: 2, раскрытому в настоящем описании, соответствующему остаткам 8-139.SEQ ID NO: 106 (полноразмерная кДНК) и SEQ ID NO: 107 (полноразмерный белок) в заявках на патент США 08/658800, 08/659683, 08/818112 и 08/818111 и в заявках WO 97/09428 и WO 97/09429. Данная последовательность также раскрыта как SEQ ID NO: 33 (ДНК) и SEQ ID NO: 91 (аминокислотная последовательность) в заявке на патент США 09/056559. В наболее типичных случаях TbH9 относится к участку SEQ ID NO: 2, раскрытому в настоящем описании, соответствующему остаткам 143-532. Далее приведены последовательности некоторых индивидуальных антигенов, используемых в композициях, и слитых белков по изобретению:Mtb32A (TbRa35FL или Ra35FL), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 17(кДНК) и SEQ ID NO: 79 (белок) в заявках на патент США 08/523436, 08/523435, 08/658800,08/659683, 08/818112, 09/056556 и 08/818111 и в заявках WO 97/09428 и WO 97/09429, см. также Skeikyet al., Infection and Immunity, 67: 3998-4007 (1999); последовательности некоторых слитых белков по изобретению:TbH9-Ra35 (Mtb59F), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 23 (кДНК) иSEQ ID NO: 24 (белок) в заявке на патент США 09/287849 и в заявке PCT/US99/07717;Ra12-TbH9-Ra35 (Mtb72f), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 1 илиSEQ ID NO: 5 (ДНК) и SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6 (белок) в настоящем описании, а также в заявке на патент США 09/223040 и в PCT/US99/07717. Последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 включают His-метку в виде 6 остатков His. М 72, представляющий собой мутант Mtb72f, в котором остаток аминокислоты серина, соответствующий положению 710 в SEQ ID NO: 2, заменен на Ala (а также 4 остатка His удалены из His-метки наN-конце), и последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 3 (ДНК) и SEQ ID NO: 4 (белок) в настоящем описании. Вариант этих последовательностей, в которых белок имеет His-метку из 6 остатковHis, описан в заявке на патент США 09/597796 и в PCT/US01/19959. Считается, что благодаря заменеSer710 на Ala М 72 становится более устойчивым к аутолизу, чем Mtb72f. Далее приведены последовательности некоторых дополнительных антигенов, используемых в композициях, и слитых белков по изобретению:Mtb8.4 (DPV), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 101 (кДНК) иSEQ ID NO: 102 (белок) в заявках на патент США 08/658800, 08/659683, 08/818112 и 08/818111 и в заявках WO 97/09428 и WO 97/09429;Mtb9.8 (MSL), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 12 (ДНК), SEQ ID NO: 109SEQ ID NO: 110-124 (пептиды) в заявках на патент США 08/859381, 08/858998, 09/073009 и 09/073010 и в заявках PCT/US98/10407 и PCT/US98/10514;Mtb9.9A (MTI, также известный как MTI-A), последовательность которого раскрыта как(ORF) пептида для MTI) в заявках на патент США 08/859381, 08/858998, 09/073009 и 09/073010 и в заявках PCT/US98/10407 и PCT/US98/10514. Также существуют два других варианта MTI, обозначенных как MTI-B и MTI-C;Mtb40 (HTCC1), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 137 (кДНК) и 138 (предсказанная аминокислотная последовательность) в заявках на патент США 09/073009 и 09/073010 и в заявках PCT/US98/10407 и PCT/US98/10514;Mtb41 (MTCC2), последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 140 (кДНК) иSEQ ID NO: 142 (предсказанная аминокислотная последовательность) в заявках на патент США 09/073009 и 09/073010 и в заявках PCT/US98/10407 и PCT/US98/10514;ESAT-6, последовательность которого раскрыта как SEQ ID NO: 103 (ДНК) и SEQ ID NO: 104(предсказанная аминокислотная последовательность) в заявке на патент США 09/072967. Последовательность ESAT-6 также описана в патенте США 5955077;-кристаллический антиген, последовательность которого описана в Verbon et al., J. Bact. 174: 13521359 (1992); комплексный антиген MTB85, последовательность которого описана в Content et al., Infect.Immunol. 59: 3205-3212 (1991). Каждая из вышеупомянутых последовательностей также раскрыта в Cole et al. Nature 393: 537(1998) и может быть найдена, например, в http://www.sanger.ac.uk и http:/www.pasteur.fr/mycdb/. Вышеупомянутые последовательности раскрыты в заявках на патент США 08/523435, 08/523436,08/658800, 08/659683, 08/818111, 08/818112, 08/942341, 08/942578, 08/858998, 08/859381, 09/056556,09/072596, 09/072967, 09/073009, 09/073010, 09/223040, 09/287849 и в патентных заявкахWO 97/09429, WO 98/16645, WO 98/16646, каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки. Антигены, приведенные в данном описании, включают полиморфные варианты и консервативно модифицированные варианты, а также межштаммовые и межвидовые гомологи Mycobacterium. Кроме того, антигены, приведенные в данном описании, включают подпоследовательности или укороченные последовательности. Слитые белки также могут содержать дополнительные полипептиды, возможно гетерологичные пептиды из Mycobacterium или других источников. Эти антигены могут быть модифицированы, например, путем добавления линкерных пептидных последовательностей, как описано ниже. Эти линкерные пептиды могут быть встроены между одним или более компонентами, входящими в состав каждого из слитых белков. Определения Термин "реактивация туберкулеза" относится к более позднему проявлению симптомов заболевания у индивидуума, который имеет положительные результаты в тесте на туберкулин, но не имеет очевидных симптомов заболевания. Индивидуум инфицирован М.tuberculosis и может иметь или не иметь ранее проявлявшиея активные симптомы заболевания, которые были подвергнуты лечению в достаточной степени, для того чтобы перевести туберкулез в неактивное или латентное состояние. Тем не менее,способы предупреждения или лечения реактивации туберкулеза могут быть инициированы у индивидуума, демонстрирующего активные симптомы заболевания."Первичный туберкулез" относится к клинической форме заболевания (проявлению симптомов заболевания), следующей непосредственно за инфекцией М.tuberculosis. См. Harrison's Principles of Internal"Вторичный туберкулез", или "постпервичный туберкулез", относится к реактивации скрытой, неактивной или латентной инфекции, вызываемой М.tuberculosis. См. Harrison's Principles of Internal Medicine, выше."Неактивная, скрытая или латентная инфекция, вызываемая М.tuberculosis", относится к инфекции М.tuberculosis без проявляющихся симптомов заболевания."Устойчивая к лекарственным средствам" инфекция, вызываемая М.tuberculosis, относится к инфекции М.tuberculosis, при которой инфицирующий штамм не останавливается в развитии или не убивается (является устойчивым к) одним или более так называемыми химиотерапевтическими агентами "первой линии", эффективными в лечении инфекции, вызываемой М.tuberculosis (например, изониазидом,рифампином, этамбутолом, стрептомицином и пиразинамидом). Инфекция, вызываемая М.tuberculosis "с множественной лекарственной устойчивостью", относится к инфекции М.tuberculosis, при которой инфицирующий штамм устойчив к двум или более химиотерапевтическим агентам "первой линии", эффективным в лечении инфекции, вызываемой М.tuberculosis."Химиотерапевтический агент, эффективный в лечении инфекции, вызываемой М.tuberculosis", относится к фармакологическим агентам, которые известны и используются в данной области для лечения инфекции М.tuberculosis. Примеры фармакологических агентов, используемых для лечения инфекции,вызываемой М.tuberculosis, включают амикацин, аминосалициловую кислоту, капреомицин, циклосерин,этамбутол, этионамид, изониазид, канамицин, пиразинамид, рифамицины (т.е. рифампин, рифапентин и рифабутин), стрептомицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитромицин, азитромицин и фторхинолоны, но этим не ограничиваются. Химиотерапевтические агенты "первой линии", используемые для лечения инфекции, вызываемой М.tuberculosis, не обладающей множественной лекарственной устойчивостью, включают изониазид, рифампин, этамбутол, стрептомицин и пиразинамид. Химиотерапевтические агенты "второй линии", используемые для лечения инфекции, вызываемой М.tuberculosis, демонстрирующей лекарственную устойчивость к одному или более лекарственным средствам "первой линии",включают офлоксацин, ципрофлоксацин, этионамид, аминосалициловую кислоту, циклосерин, амикацин, канамицин и капреомицин. Обзор таких фармакологических агентов приведен в главе 48 Goodman"FL" относится к полноразмерному полипептиду, т.е. полипептиду такой же длины, что и полипептид дикого типа."His-метка" относится к последовательности из остатков His, в типичном случае из 6 остатков, которые встроены на N-конце, обычно сразу же после инициирующего остатка Met, или же на С-конце. Они обычно являются гетерологичными в отношении нативной последовательности, но их вводят, поскольку они облегчают выделение путем улучшения связывания белка со смолами для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC). В сущности говоря, наличие или отсутствие His-метки не существенно с точки зрения индукции полезного иммунного ответа против антигенного белка. В том случае, когда неблагоприятная иммунная реакция индуцируется против самой His-метки, считается, что лучше всего минимизировать длину His-метки, например, до 4 или менее остатков, в частности до 2 остатков. Термин "его иммуногенный фрагмент" относится к полипептиду, содержащему эпитоп, который распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами, хелперными Т-лимфоцитами или В-клетками. Обычно иммуногенным фрагментом Mtb72f будет полипептид, содержащий 500 или более аминокислот, например 600 или более аминокислот, например 700 или более аминокислот. Данное изобретение также охватывает множество фрагментов, например перекрывающихся фрагментов, которые вместе охватывают всю или по существу всю (например, 500 или более аминокислот, например, 600 или более аминокислот,например, 700 или более аминокислот) последовательность слитого белка Mtb72f. Термин "виды Mycobacterium туберкулезного комплекса" включает в себя такие виды, которые традиционно считаются вызывающими заболевание туберкулез, а также присутствующие в окружающей среде, и условно-патогенные виды Mycobacterium, которые вызывают туберкулез и легочное заболевание у пациентов с ослабленным иммунитетом, таких как пациенты со СПИДом, например, М.tuberculosis,M.bovis или М.africanum, BCG, M.avium, М.intracellulare, M.celatum, M.genavense, M.haemophilum,M.kansasii, М.simiae, M.vaccae, M.fortuitum и М.scrofulaceum (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, p. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Адъювант относится к компонентам вакцинной или терапевтической композиции, которые усиливают специфический иммунный ответ на антиген (см., например, Edelman, AIDS Res. Hum. Retroviruses,8: 1409-1411 (1992. Адъюванты индуцируют иммунные ответы в виде ответа Th1-типа и Th2-типа. Цитокины Th1-типа (например, IFN-, IL-2 и IL-12) имеют тенденцию благоприятствовать индукции клеточно-опосредованного иммунного ответа на введенный антиген, в то время как цитокины Th2-типа (на-7 012576 пример, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и TNF-) имеют тенденцию благоприятствовать индукции гуморальных иммунных ответов. Адъюванты, способные к предпочтительной стимуляции Th1-клеточноопосредованного иммунного ответа, описаны в WO 94/00153 и WO 95/17209."Нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты,содержащие известные нуклеотидные аналоги или модифицированные остатки или связи в остове, которые являются синтетическими, природными и неприродными, которые имеют аналогичные связывающие свойства, что и ссылочная нуклеиновая кислота, и которые метаболизируются аналогично ссылочным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA). Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также полностью охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены кодонов на основе вырожденности генетического кода) и комплементарные последовательности, а также точно указанную последовательность. Конкретно, замены кодонов на основе вырожденности генетического кода могут быть получены путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов заменено на остатки из смеси оснований и/или дезоксиинозина (Batzer et al.,Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol.Cell. Probes 8: 91-98 (1994. Термин "нуклеиновая кислота" используется взаимозаменяемо с терминами ген, кДНК, мРНК, олигонуклеотид и полинуклеотид. Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном описании взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Данные термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или более чем один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам и неприродным аминокислотным полимерам. Термин "аминокислота" относится к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые подвергаются более поздним модификациям, например оксипролин, -карбоксиглутамин и О-фосфосерин. Термин "аминокислотные аналоги" относится к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, т.е. -углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и группу R, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид,метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру,как у природной аминокислоты. Термин "аминокислотные миметики" относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично природной аминокислоте. Обозначение аминокислот в настоящем описании может быть приведено либо в соответствии с их общеизвестными трехбуквенными символами, либо в соответствии с однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре (Biochemical Nomenclature Commission) Международного союза по теоретической и прикладной химии/Международного биохимического союза(IUPAC-IUB). Аналогично, нуклеотиды могут быть обозначены в соответствии с их общепринятыми однобуквенными кодами. Термин "консервативно модифицированные варианты" применяется как к аминокислотным, так и к нуклеиновокислотным последовательностям. Что касается конкретных нуклеиновокислотных последовательностей, то термин "консервативно модифицированные варианты" относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности или когда нуклеиновая кислота не кодирует какую-либо аминокислотную последовательность, по существу, к идентичным последовательностям. Ввиду вырожденности генетического кода любой заданный белок кодируется большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в любом положении,где аланин задается кодоном, данный кодон может быть изменен на любой из соответствующих кодонов,которые описаны как не вызывающие изменения в кодируемом полипептиде. Такие нуклеиновокислотные варианты представляют собой "молчащие варианты", которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая приведенная в данном описании нуклеиновокислотная последовательность, которая кодирует полипептид, также описывает каждый возможный молчащий вариант нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой кодон только для метионина, и TGG, который обычно представляет собой кодон только для триптофана) может быть модифицирован с получением-8 012576 функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности. Что касается аминокислотных последовательностей, то специалисту будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, приводящие к изменению, добавлению или делеции одной аминокислоты или небольшого процента аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой "консервативно модифицированный вариант", когда данное изменение приводит к замене аминокислоты химически аналогичной аминокислотой. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих получение функционально аналогичных аминокислот, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты, в дополнение к полиморфным вариантам и не исключая полиморфных вариантов, представляют собой внутривидовые гомологи и аллели по изобретению. Каждая из следующих ниже восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (T); и 8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins (1984. Термин "гетерологичный", когда он используется в отношении участков нуклеиновой кислоты, означает, что нуклеиновая кислота содержит две или более подпоследовательностей, которые не встречаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе. Например, нуклеиновую кислоту обычно получают рекомбинантно в виде кислоты, имеющей две или более последовательностей из неродственных генов, расположенных так, чтобы создать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор взят из одного источника, а кодирующий участок из другого источника. Аналогично, термин "гетерологичный белок" означает, что белок содержит две или более подпоследовательностей, которые не встречаются в таком же взаимном расположении относительно друг друга в природе(например, слитый белок). Термины "слитый полипептид" или "слитый белок" относятся к белку, имеющему по меньшей мере два гетерологичных полипептида из Mycobacterium sp., связанных ковалентно либо непосредственно,либо через аминокислотный линкер. Полипептиды, образующие слитый белок, обычно связаны С-концом с N-концом, хотя они также могут быть связаны С-концом с С-концом, N-концом с N-концом или N-концом с С-концом. Полипептиды слитого белка могут располагаться в любом порядке. Этот термин также относится к консервативно модифицированным вариантам, полиморфным вариантам, аллелям, мутантам, подпоследовательностям и межвидовым гомологам антигенов, из которых составлен слитый белок. Антигены Mycobacterium tuberculosis описаны в работе Cole et al., Nature 393: 537 (1998), в которой описан целиком геном Mycobacterium tuberculosis. Полную последовательность Mycobacteriumtuberculosis также можно найти по адресу http://www.sanger.ac.uk и http://www.pasteur.fr/mycdb/ (MycDB). Антигены из другого вида Mycobacterium, соответствующие антигенам М.tuberculosis, можно идентифицировать, например, используя алгоритмы сравнения последовательностей, которые приведены в данном описании, или другие методы, известные специалистам в данной области, например гибридизационные анализы и анализы связывания антител. Типичные слитые белки Mtb72f для применения в настоящем изобретении включают в себя белки, содержащие остатки 8-729 из последовательности SEQ ID NO: 2; белки, содержащие последовательность SEQ ID NO: 2 (соответствует Mtb72f) или состоящие из нее,возможно без образующих His-метку остатков 2-7 из указанной последовательности или с His-меткой разной длины; слитые белки, содержащие последовательность SEQ ID NO: 2, возможно без образующих His-метку остатков 2-7 из указанной последовательности или с His-меткой разной длины (например, белок, содержащий остатки 8-729 из последовательности SEQ ID NO: 2), вместе с одним или более антигенами М.tuberculosis, например с одним или более белками, перечисленными выше, или с иммуногенным фрагментом любого из них; белки, содержащие остатки 4-725 из последовательности SEQ ID NO: 4 (соответствует М 72); белки, содержащие последовательность SEQ ID NO: 4 (соответствует М 72) или состоящие из нее,возможно без образующих His-метку остатков 2-3 из указанной последовательности или с His-меткой разной длины и слитые белки, содержащие последовательность SEQ ID NO: 4, возможно без образующих His-метку остатков 2-3 из указанной последовательности, или с His-меткой разной длины (например, белок, содержащий остатки 4-725 из последовательности SEQ ID NO: 4), вместе с одним или более антигенами М.tuberculosis, например одним или более белками, перечисленными выше, или иммуногенным фраг-9 012576 ментом любого из них. Типичные иммуногенные фрагменты слитых белков Mtb72f для применения в настоящем изобретении включаютв себя белки, содержащие последовательность TbH9-Ra35 (Mtb59F), или TbH9, или Ra35, или Ra12 либо состоящие из нее; и слитые белки, содержащие указанные последовательности вместе с одним или более антигенами М.tuberculosis, например с одним или более белками, перечисленными выше, или с иммуногенным фрагментом любого из них. Следующие типичные иммуногенные фрагменты слитых белков Mtb72f для применения в настоящем изобретении включают в себя белки, содержащие последовательности TbH9-Ra35 (Mtb59F) или Ra35, в которых положение, соответствующее Ser710 в SEQ ID NO: 2, заменено на Ala, или состоящие из нее; и слитые белки, содержащие указанные последовательности вместе с одним или более антигенами М.tuberculosis, например с одним или более белками, перечисленными выше, или с иммуногенным фрагментом любого из них. Более конкретно Mtb72f представляет собой полипептид, содержащий остатки 8-729 из SEQ ID NO: 2; или полипептид, состоящий из остатков 1 и 8-729 из SEQ ID NO: 2, возможно с His-меткой, встроенной после инициирующего остатка Met; или полипептид SEQ ID NO: 2; или полипептид, содержащий остатки 4-725 из SEQ ID NO: 4; или полипептид, состоящий из остатков 1 и 4-725 из SEQ ID NO: 4, возможно с His-меткой, встроенной после инициирующего остатка Met; или полипептид SEQ ID NO: 4; или полипептид SEQ ID NO: 6. Другие типичные слитые белки Mtb72f и их иммуногенные фрагменты включают упомянутые выше белки, в которых N- и/или С-конец укорочены, например, на 5, или 4, или 3, или 2, или 1 аминокислотный остаток. Другие типичные слитые белки Mtb72f и их иммуногенные фрагменты включают упомянутые выше белки, в которых вплоть до 10% аминокислот, например, вплоть до 5% аминокислот (например,вплоть до 10, например, вплоть до 5 аминокислот) заменены консервативными заменами, как они определены в данном описании. Типичные нуклеиновые кислоты Mtb72f для применения в настоящем изобретении включают нуклеиновые кислоты (например, молекулы ДНК), кодирующие вышеупомянутые типичные слитые белкиMtb72f и их иммуногенные фрагменты. Один набор конкретных молекул ДНК, который может быть упомянут, содержит нуклеотиды 63-2228 из SEQ ID NO: 1. Другой набор конкретных молекул ДНК, который может быть упомянут, содержит нуклеотиды 10-2175 из SEQ ID NO: 3. Конкретные молекулы ДНК, которые могут быть упомянуты, содержат или состоят из SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 3, илиSEQ ID NO: 5. Термин "слитый" относится к ковалентной связи между двумя полипептидами в слитом белке. Обычно полипептиды соединены посредством пептидной связи либо непосредственно друг с другом,либо через аминокислотный линкер. Возможно, пептиды могут быть соединены посредством непептидных ковалентных связей, известных специалистам в данной области. Фраза "селективно (или специфически) гибридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, когда данная последовательность присутствует в сложной смеси (например, в смеси с общей клеточной или библиотечной ДНК или РНК). Фраза "жесткие условия гибридизации" относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей подпоследовательностью-мишенью, обычно в сложной смеси нуклеиновой кислоты, а ни с какими-либо другими последовательностями. Жесткие условия зависят от самой последовательности и в разных обстоятельствах будут различаться. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Как правило,жесткие условия выбирают так, чтобы температура была приблизительно на 5-10 С ниже, чем температурная точка плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и pH. Tm представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью при равновесии (поскольку последовательности-мишени присутствуют в избытке, то при Tm 50% зондов в равновесии находятся в связанном состоянии). Жесткими условиями будут такие, при которых концентрация соли ниже приблизительно 1,0 М для ионов натрия, в типичном случае составляет приблизительно 0,01-1,0 М концентрации ионов натрия (или других солей) при 7,0-8,3,- 10012576 а температура равна по меньшей мере приблизительно 30 С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60 С для длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путеом добавления дестабилизирующих агентов,таких как формамид. Для селективной и специфической гибридизации положительный сигнал должен по меньшей мере в два раза превышать фоновую гибридизацию, возможно в 10 раз превышать фоновую гибридизацию. Типичные жесткие условия гибридизации могут быть следующими: 50% формамида,5 SSC (раствор хлорида и цитрата натрия) и 1% SDS (додецилсульфат натрия), инкубация при 42 С или 5 SSC, 1% SDS, инкубация при 65 С с промывкой в 0,2 SSC и 0,1% SDS при 65 С. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизуются друг с другом в жестких условиях, остаются попрежнему по существу идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, по существу идентичны. Это имеет место, например, когда копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом. В таких случаях нуклеиновые кислоты обычно гибридизуются в умеренно жестких условиях гибридизации. Типичные "умеренно жесткие условия гибридизации" включают гибридизацию в буфере, состоящем из 40% формамида, 1 М NaCl,1% SDS при 37 С, и промывку в 1 SSC при 45 С. Положительная гибридизация должна по меньшей мере в два раза превышать фон. Средним специалистам будет понятно, что для обеспечения условий аналогичной жесткости могут быть использованы альтернативные условия гибридизации и промывки."Антитело" относится к полипептиду, содержащему каркасную область из иммуноглобулинового гена или его фрагментов, которая специфически связывает и распознает антиген. Известные иммуноглобулиновые гены включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также несметное количество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как либо каппа, либо лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну "легкую" (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область приблизительно из 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. Термины "вариабельная легкая цепь (VL)" и "вариабельная тяжелая цепь (VH)" относятся, соответственно, к этим легким и тяжелым цепям. Антитела существуют, например, в виде интактных иммуноглобулинов или в виде множества хорошо охарактеризованных фрагментов, полученных в результате расщепления различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области с получением F(ab)'2, димера Fab, который сам по себе представляет собой легкую цепь, соединенную с VH-CH1 посредством дисульфидной связи. F(ab)'2 можно восстановить в мягких условиях с разрывом дисульфидной связи в шарнирной области, превращая при этом димер F(ab)'2 в мономер Fab'. Мономер Fab', по существу, представляет собой Fab с частью шарнирной области (см. Fundamental Immunology (Paul ed, 3rded. 1993. Несмотря на то что различные фрагменты антитела определяют в терминах расщепления интактного антитела, специалисту будет очевидно, что такие фрагменты могут быть синтезированы de novo или химически, или с использованием методологии рекомбинантной ДНК. Таким образом, термин "антитело", как он использован в данном описании, также включает в себя фрагменты антител, либо полученные в результате модификации целых антител, либо синтезированные de novo с использованием методологий рекомбинантной ДНК (например, одноцепочечный фрагмент Fv), либо идентифицированные с использованием библиотек, полученных с использованием фагового дисплея (см., например,McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990. Для получения моноклональных или поликлональных антител можно использовать любую известную в данной области методику (см., например, KohlerMilstein, Nature, 256: 495-497 (1975); Kozbor et(1985. Методики получения одноцепочечных антител (патент США 4946778) могут быть адаптированы для получения антител к полипептидам по настоящему изобретению. Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител могут быть использованы трансгенные мыши или другие организмы, такие как другие млекопитающие. Альтернативно, для идентификации антител и гетеромерныхFab-фрагментов, которые специфически связывают выбранные антигены, может быть использована технология фагового дисплея (см., например, McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Marks et al.,Biotechnology, 10: 779-783 (1992. Фраза "специфически (или селективно) связывается" с антителом или "специфически (или селективно) иммунореактивен в отношении", когда касается белка или пептида, относится к реакции связывания, которая определяет присутствие белка в гетерогенной популяции белков и других биологических молекул. Таким образом, в разработанных условиях иммуноанализа специфические антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раза большем количестве по сравнению с фоном и, по существу, не связываются в значительном количестве с другими белками, присутствующими в образце.- 11012576 Для специфического связывания с антителом в таких условиях может потребоваться антитело, отобранное по его специфичности к конкретному белку. Например, среди поликлональных антител, индуцированных в ответ на слитые белки, могут быть отобраны только те поликлональные антитела, которые специфически иммунореактивны к слитому белку, а не к индивидуальным компонентам слитых белков. Этот отбор может быть осуществлен путем исключения антител, дающих перекрестную реакцию с индивидуальными антигенами. Для отбора антител, специфически реагирующих с конкретным белком, можно использовать ряд иммуноаналитических форматов. Например, для отбора антител, специфически иммунореактивных к белку, обычно используют твердофазные ИФА иммуноанализы (см., например,HarlowLane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) и Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998) для описания иммуноаналитических форматов и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности). Обычно специфическое или селективное взаимодействие должно по меньшей мере в два раза превышать фоновый сигнал или шум и в наболее типичных случаях превышать фон в 10-100 раз. Полинуклеотиды могут содержать природную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует индивидуальный антиген или его участок) или могут содержать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, добавлений,делеций и/или вставок, так что биологическая активность кодируемого слитого полипептида не уменьшается по сравнению со слитым полипептидом, содержащим природные антигены. Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере приблизительно 70%-ную идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%-ную идентичность и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%-ную идентичность полинуклеотидой последовательности, которая кодирует природный полипептид или его участок. Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы или имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичны на 70%, возможно на 75, 80, 85, 90 или 95% в определенной области), при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или внутри указанной области, что измеряется с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или посредством выравнивания вручную и визуального просмотра. О таких последовательностях далее говорится, что они "по существу идентичны". Это определение также относится к комплементу тестируемой последовательности. Возможно, идентичность существует в области,длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 25 до приблизительно 50 аминокислот или нуклеотидов, или в области длиной 75-100 аминокислот или нуклеотидов. При сравнении последовательностей типично одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, при необходимости указывают координаты подпоследовательностей и задают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию или можно задать альтернативные параметры. С использованием алгоритма сравнения последовательностей, на основании параметров программы, далее рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности. Термин "окно сравнения", как он использован в данном описании, включает ссылку на сегмент любого из числа смежных положений, выбранных из группы, состоящей из 25-500, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 200, более обычно от приблизительно 100 до приблизительно 150, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с тем же числом смежных положений, после того как две последовательности оптимально выравнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии по SmithWaterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма гомологичного выравнивания поNeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), с помощью поиска (вариантов) согласно методу подобия по PearsonLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных воплощений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) или с помощью выравнивания вручную и визуального просмотра (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (приложение к Ausubel et al., eds. 1995. Одним из примеров полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP формирует множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивного попарного выравнивания с целью выявления взаимосвязи и процента идентичности последовательностей. Он также производит построение дерева или дендрограммы, показывающего(ей) соотношения между кластерами, используемые для выравнивания. PILEUP использует упрощение метода прогрессивного выравнивания по FengDoolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). Используемый метод аналогичен методу, описанному HigginsSharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989). Программа может выравни- 12012576 вать до 300 последовательностей включительно, каждая с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот. Процедура множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее родственных последовательностей с образованием кластера из двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравниваются путем простого удлинения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Окончательное выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. Программа действует путем определения специфических последовательностей и их аминокислотных или нуклеотидных координат для сравнения участков последовательностей и путем указания программных параметров. Используя PILEUP, сравнивают эталонную последовательность с другими тестируемыми последовательностями с целью определения соотношения процента идентичности последовательностей,используя следующие параметры: вес бреши по умолчанию (3,00), вес длины бреши по умолчанию (0,10) и взвешенные концевые бреши. PILEUP можно взять из пакета программ для анализа последовательности GCG, например версию 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395 (1984). Другими примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) соответственно. Программное обеспечение для проведения анализа с использованием BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм на первом этапе включает идентификацию пар последовательностей с высоким баллом (HSP) посредством идентификации коротких "слов" длиной W в анализируемой последовательности, которые или соответствуют, или удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому баллу Т при выравнивании со "словом" той же длины в последовательности из базы данных. Т обозначает пороговый балл для соседнего "слова" (Altschul et al., выше). Эти изначальные соседние удачные "слова" действуют в качестве затравок для инициирования поиска вариантов с целью нахождения более длинных HSP, содержащих их. Удачные "слова" удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен кумулятивный балл выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей кумулятивные баллы рассчитывают с использованием параметров М (балл-вознаграждение за пару соответствующих остатков; всегда 0) и N (штрафной балл за ошибочно спаренные остатки; всегда 0). Для расчета кумулятивного балла в отношении аминокислотных последовательностей используют матрицу баллов. Удлинение удачных "слов" в каждом направлении останавливается, когда кумулятивный балл выравнивания падает на величину X от его максимально достигнутой величины; кумулятивный балл доходит до нуля или ниже вследствие аккумуляции одного или более выравниваний с отрицательными баллами или при достижении конца любой из обеих последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину "слова" (W), равную 11; математическое ожидание (Е), равное 10,М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию длину "слова", равную 3; и математическое ожидание (Е), равное 10; и выравнивания (В) по матрице баллов BLOSUM62 (см. HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915(1989, равные 50; математическое ожидание (Е), равное 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства двух последовательностей(см., например, KarlinAltschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787 (1993. Одной из мер сходства, предоставляемых алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N, которая дает указание на вероятность того, что совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет случайным. Например, считается, что нуклеиновая кислота аналогична эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой меньше приблизительно 0,2, более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001. Полинуклеотидные композиции. Как они использованы в данном описании, термины "сегмент ДНК" и "полинуклеотид" относятся к молекуле ДНК, выделенной в свободном от общей геномной ДНК состоянии из конкретного образца. Поэтому сегмент ДНК, кодирующий полипептид, относится к сегменту ДНК, который содержит одну или более кодирующих последовательностей, уже, по существу, изолированному или очищенному от общей геномной ДНК видов, из которых получен данный сегмент ДНК. В термины "сегмент ДНК" и "полинуклеотид" включены сегменты ДНК и более мелкие фрагменты таких сегментов, а также рекомбинантные векторы, в том числе, например, плазмиды, космиды, фагмиды, фаги, вирусы и т.п. Как будет понятно специалистам в данной области, сегменты ДНК по этому изобретению могут включать геномные последовательности, дополнительные геномные и кодируемые плазмидой последовательности и более мелкие генно-инженерные сегменты, которые экспрессируют или которые могут быть адаптированы, для того чтобы экспрессировать белки, полипептиды, пептиды и т.п. Такие сегменты могут быть выделены из природных источников или синтетически модифицированы человеком.- 13012576 Термин "выделенный", как он использован в данном описании, означает, что полинуклеотид, по существу, свободен от других кодирующих последовательностей и что сегмент ДНК не содержит больших порций неродственной кодирующей ДНК, таких как большие хромосомные фрагменты или другие функциональные гены или полипептидкодирующие участки. Несомненно, это относится к сегменту ДНК, который выделен изначально и не исключает генов или кодирующих участков, позже добавленных к данному сегменту человеком. Как будет понятно специалисту, полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной,кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают гяРНК (гетерогенная ядерная РНК) молекулы, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК по типу "один-к-одному" ("one-toone"), и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, находиться в пределах полинуклеотида по настоящему изобретению, и полинуклеотид может быть, но не обязательно, соединен с другими молекулами и/или веществами-носителями. Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует антиген Mycobacterium или его участок) или могут содержать вариант или биологический или антигенный функциональный эквивалент, такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут содержать одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, что также описано ниже, предпочтительно таких, чтобы иммуногенность кодируемого полипептида относительно нативного опухолевого белка не уменьшалась. Обычно влияние кодируемого полипептида на иммуногенность можно оценить, как изложено в данном описании. Термин "варианты" также охватывает гомологичные гены ксеногенного происхождения. В дополнительных воплощениях настоящего изобретения предложены выделенные полинуклеотиды и полипептиды, содержащие различные отрезки смежных участков последовательности, идентичной или комплементарной одной или более последовательностям, раскрытым в данном описании. Например,согласно этому изобретению предложены полинуклеотиды, которые содержат по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более смежных нуклеотидов одной или более последовательностей, раскрытых в данном описании, а также все находящиеся между ними промежуточные отрезки. Легко понять, что "промежуточные отрезки" в этом контексте означают любую длину, находящуюся между приведенными величинами, например 16, 17, 18, 19 и т.д.; 21, 22, 23 и т.д.; 30, 31, 32 и т.д.; 50, 51, 52, 53 и т.д.; 100, 101, 102, 103 и т.д.; 150, 151, 152, 153 и т.д.; в том числе все целочисленные значения в диапазонах 200-500; 500-1000 и т.п. Что касается длины самой кодирующей последовательности, то полинуклеотиды по настоящему изобретению или их фрагменты могут быть объединены с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты для рестриктаз, сайты множественного клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., так что их общая длина может значительно варьировать. Поэтому предполагается, что может быть использован нуклеиновокислотный фрагмент почти любой длины, предпочтительно общей длины, которая ограничивается легкостью получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК. Например, предполагается, что иллюстративные сегменты ДНК общей длиной приблизительно 10000, приблизительно 5000, приблизительно 3000, приблизительно 2000, приблизительно 1000, приблизительно 500, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50 пар оснований и т.п. (в том числе все промежуточные отрезки) должны быть полезны во многих воплощениях этого изобретения. Более того, специалистам в данной области будет очевидно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид,раскрытый в данном описании. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Однако в настоящем изобретении особенно рассматриваются полинуклеотиды, которые варьируют вследствие различий при использовании кодонов,например полинуклеотиды, которые оптимизированы для отбора кодонов человека и/или приматов. Аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, предложенные в данном описании,также находятся в пределах объема настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из базы данных). Идентификация и характеристика полинуклеотидов. Полинуклеотиды могут быть идентифицированы, получены и/или изменены с использованием любого из множества общеизвестных методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован,как описано более подробно ниже, путем скрининга кДНК на микрочипах в отношении опухолеассоциированной экспрессии (т.е. экспрессии, которая по меньшей мере в два раза больше в опухоли, чем в нормальной ткани, как определено с использованием репрезентативного анализа, приведенного в данном описании). Такие скрининги могут быть проведены, например, с использованием микрочипов Syntenial., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10614-10619 (1996) и Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 21502155 (1997. Альтернативно, полинуклеотиды могут быть амплифицированы с кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих белки, раскрытые в данном описании, таких как клетки М.tuberculosis. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого подхода на основании предложенных в данном описании последовательностей могут быть сконструированы последовательность-специфические праймеры и их можно приобрести или синтезировать. Амплифицированный участок полинуклеотида по настоящему изобретению может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК М.tuberculosis) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу, используя один или более полинуклеотидных зондов или праймеров,подходящих для амплификации. Предпочтительно, чтобы библиотека была отобрана по размеру для включения молекул большего размера. Для идентификации 5'- и расположенных выше участков генов также могут быть предпочтительны библиотеки, полученные с использованием случайных праймеров. Геномные библиотеки являются предпочтительными для получения интронов и протяженных 5'-последовательностей. Что касается методов гибридизации, то неполная последовательность может быть мечена (например, посредством "ник"-трансляции или мечения концов с помощью 32 Р) с использованием хорошо известных методов. Обычно тогда подвергают скринингу бактериальную или бактериофаговую библиотеку посредством гибридизации на фильтрах, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газонах, содержащих фаговые бляшки), с меченным зондом (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2000. Гибридизующиеся колонии или бляшки отбирают и размножают и выделяют ДНК для дальнейшего анализа. Клоны кДНК могут быть проанализированы с целью определения количества дополнительной последовательности посредством, например, ПЦР с использованием праймера из неполной последовательности и праймера из вектора. Для идентификации одного или более перекрывающихся клонов могут быть созданы рестрикционные карты и частичные последовательности. Затем с использованием стандартных методов может быть определена полная последовательность, что может вовлекать создание ряда делеционных клонов. Полученные перекрывающиеся последовательности затем могут быть собраны в единую непрерывную последовательность. Полноразмерную молекулу кДНК можно создать путем лигирования подходящих фрагментов с использованием хорошо известных методов. Альтернативно, существуют многочисленные методы амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно осуществляют с помощью ПЦР. Для осуществления стадии амплификации может быть использован любой из множества имеющихся в продаже наборов. Праймеры можно конструировать с использованием, например, программного обеспечения, хорошо известного в данной области. Праймеры предпочтительно имеют длину 22-30 нуклеотидов, имеют содержание GC по меньшей мере 50% и отжигаются с последовательностью-мишенью при температурах приблизительно 68-72 С. Амплифицированный участок может быть секвенирован, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности собраны в непрерывную последовательность. Одной такой методикой амплификации является обращенная ПЦР (см. Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186 (1988, в которой для создания фрагмента в известном участке гена используют рестриктазы. Затем этот фрагмент подвергают циркуляризации посредством внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с использованием дивергентных праймеров, полученных из известного участка. Согласно альтернативному подходу последовательности, примыкающие к частичной последовательности, могут быть восстановлены путем амплификации с использованием праймера к линкерной последовательности и праймера, специфического к известному участку. Обычно амплифицированные последовательности подвергают второму раунду амплификации с использованием того же самого линкерного праймера и второго праймера, специфического к известному участку. Вариант этой процедуры, в котором используют два праймера, инициирующие удлинение сегмента в противоположных направлениях от известной последовательности, описан в WO 96/38591. Другая такая методика известна как "быстрая амплификация концов кДНК" или RACE. Эта методика включает применение внутреннего праймера и внешнего праймера, который гибридизуется с поли-А участком или векторной последовательностью, для идентификации последовательностей, расположенных в 5'- и 3'-направлениях от известной последовательности. Дополнительные методики включают ПЦР с захватом (Lagerstrom et al., PCRMethods Applic. 1: 111-19 (1991 и ПЦР-"прогулку" (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60 (1991. Для получения полноразмерной последовательности кДНК также могут быть использованы другие способы, использующие амплификацию. В некоторых случаях существует возможность получения полноразмерной последовательности кДНК путем анализа последовательностей, приведенных в базе данных экспрессируемых маркерных последовательностей (EST от англ. Expressed Sequence Tag), таких как те, которые доступны из GenBank. Поиски перекрывающихся EST обычно могут быть осуществлены с использованием хорошо известных программ (например, поиски по NCBI BLAST) и такие EST могут быть использованы для создания не- 15012576 прерывной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК также можно получить путем анализа геномных фрагментов. Экспрессия полинуклеотидов в клетках-хозяевах В других воплощениях изобретения полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, кодирующие полипептиды по изобретению или слитые белки либо их функциональные эквиваленты, могут быть использованы в молекулах рекомбинантной ДНК, для того чтобы направить экспрессию полипептида в соответствующих клетках-хозяевах. Вследствие природной вырожденности генетического кода могут быть получены другие последовательности ДНК, которые кодируют, по существу, такую же или функционально эквивалентную аминокислотную последовательность, и эти последовательности могут быть использованы для клонирования и экспрессии указанного полипептида. Как будет очевидно специалистам в данной области, в некоторых случаях может иметь преимущество получение полипептидкодирующих нуклеотидных последовательностей, имеющих кодоны неприродного происхождения. Например, для увеличения скорости экспрессии белка или для продуцирования транскрипта рекомбинантной РНК, имеющего такие желаемые свойства, как время полужизни, которое продолжительнее такового у транскрипта, созданного из последовательности природного происхождения, могут быть выбраны предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина кодоны. Более того, можно конструировать полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению с использованием способов, общеизвестных в данной области, для того чтобы изменять полипептидкодирующие последовательности по ряду причин, включая, но этим не ограничиваясь, изменения,которые модифицируют клонирование, процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, для конструирования нуклеотидных последовательностей можно использовать перестановку ДНК в результате случайной фрагментации и вторичной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с использованием ПЦР. В дополнение к этому, сайт-специфический мутагенез можно использовать для вставки новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтения кодонов, получения сплайс-вариантов или введения мутаций и т.д. В другом воплощении изобретения природные, модифицированные или рекомбинантные нуклеиновокислотные последовательности могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью, для того чтобы кодировать слитый белок. Например, скрининг пептидных библиотек в отношении ингибиторов полипептидной активности может быть полезным для кодирования химерного белка, который может распознаваться имеющимся в продаже антителом. Кроме того, слитый белок может быть сконструирован таким образом, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между полипептидкодирующей последовательностью и гетерологичной белковой последовательностью, так чтобы полипептид можно было отщепить и очистить от гетерологичной группировки. Последовательности, кодирующие желаемый полипептид, можно синтезировать, целиком или частично, используя химические способы, хорошо известные в данной области техники (см. Caruthers, M.H.(1980. Альтернативно, сам белок можно получить с использованием химических способов синтеза аминокислотной последовательности полипептида или его участка. Например, пептидный синтез может быть осуществлен с использованием различных твердофазных методов (Roberge et al., Science, 269: 202204 (1995, а автоматизированного синтеза можно достичь, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA). Вновь синтезированный пептид можно в значительной степени очистить с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, Creighton, Proteins, Structures and MolecularPrinciples (1983 или с помощью других сравнимых методов, доступных в данной области. Состав синтетических пептидов может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием (например, процедурой деградации по Эдману). В дополнение к этому, аминокислотная последовательность полипептида или любого его участка может быть изменена в процессе прямого синтеза и/или скомбинирована с использованием химических способов с последовательностями из других белков или любого их участка с целью продуцирования вариантного полипептида. Для того чтобы экспрессировать желаемый полипептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие этот полипептид или его функциональные эквиваленты, можно вставить в соответствующий экспрессирующий вектор, т.е. вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности. Способы, хорошо известные специалистам в данной области, могут быть использованы для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие интересующий полипептид, и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные элементы. Эти способы включают методы рекомбинантной ДНК in vitro,методы синтеза и методы генетической рекомбинации in vivo. Такие методы описаны в Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (обновляемые ежегодно).- 16012576 Для содержания в себе и экспрессии полинуклеотидных последовательностей можно использовать ряд систем экспрессирующий вектор/хозяин. Они включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантными бактериофаговыми, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессирующими векторами; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусными); растительные клеточные системы, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмидами Ti или pBR322); или животные клеточные системы."Контрольные элементы" или "регуляторные последовательности", присутствующие в экспрессирующем векторе, представляют собой нетранслируемые участки вектора - энхансеры, промоторы, 5'- и 3'-нетранслируемые участки, которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Такие элементы могут варьировать по своей эффективности и специфичности. В зависимости от используемых векторной системы и хозяина может быть использовано любое количество подходящих транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, при клонировании в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор IacZ фагмиды PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla, Calif.) или плазмиды PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) и т.п. В клеточных системах млекопитающих обычно предпочтительны промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Если необходимо создать клеточную линию, которая содержит множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущество в использовании имеют векторы на основеSV40 (обезьяньего вируса 40) или EBV (вируса Эпштейна-Барра) с соответствующим селектируемым маркером. В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов может быть выбрано в зависимости от применения, предполагаемого для экспрессируемого полипептида. Например, если требуются большие количества, например, для индукции антител, могут быть использованы векторы, которые контролируют высокий уровень экспрессии слитых белков, которые легко очистить. Такие векторы включают, но не ограничиваются этим, многофункциональные клонирующие и экспрессирующие в Е.coli векторы, такие как BLUESCRIPT (Stratagene), в которых последовательность, кодирующая интересующий полипептид, может быть лигирована в вектор в рамке с последовательностями для аминоконцевого Met и последующих 7 остатков -галактозидазы, так что продуцируется гибридный белок; векторы pIN (VanHeekeSchuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989 и т.п. Векторы pGEX (Promega, Madison, Wis.) также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST). Обычно такие слитые белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток путем адсорбции на глутатион-агарозных гранулах с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, можно конструировать с включением в них сайтов расщепления протеазами гепарином, тромбином или фактором ХА, с тем чтобы при желании интересующий клонированный полипептид можно было освободить от GST-группировки. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae могут быть использованы различные векторы, содержащие конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как промоторы фактора альфа, алкогольоксидазы и PGH. В качестве обзоров см. Ausubel et al (выше) и Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987). В случаях использования растительных экспрессирующих векторов экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может управляться любым из множества промоторов. Например, вирусные промоторы, такие как промоторы CaMV 35S и 19S, могут быть использованы по отдельности или вместе с омега-лидерной последовательностью из TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987. Альтернативно, могут быть использованы растительные промоторы, такие как промоторы малой субъединицыRUBISCO (рибулозобифосфаткарбоксилаза/оксигеназа) или промоторы белков теплового шока (CoruzziCell Differ. 17: 85-105 (1991. Эти конструкции могут быть введены в растительные клетки путем прямой трансформации ДНК или путем патогенопосредованной трансфекции. Такие методы описаны в ряде обычно доступных обзоров (см., например, Hobbs в McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, p. 191-196 (1992. Систему (клеток) насекомых также можно использовать для экспрессии интересующего полипептида. Например, в одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клеткахSpodoptera frugiperda или в Thchoplusia larvae используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в несущественный участок вируса, например полиэдриновый ген, и поместить под контроль полиэдринового промотора. Успешная вставка полипептидкодирующей последовательности будет делать полиэдриновый ген неактивным и давать рекомбинантный вирус, в котором отсутствует белок оболочки. Затем рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования, например, клеток S.frugiperda или Trichoplusialarvae, в которых может экспрессироваться интересующий полипептид (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad.- 17012576 В клетках-хозяевах млекопитающих обычно доступен ряд экспрессирующих систем на основе вирусов. Например, в случаях использования аденовируса в качестве экспрессирующего вектора, последовательности, кодирующие интересующий полипептид, могут быть лигированы в аденовирусный транскрипционный/трансляционный комплекс, содержащий поздний промотор и трехкомпонентную лидерную последовательность. Вставку в несущественный участок Е 1 или E3 вирусного генома можно использовать для получения жизнеспособного вируса, способного экспрессировать полипептид в инфицированных клетках-хозяевах (LoganShenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3655-3659 (1984. В дополнение к этому, для увеличения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать транскрипционные энхансеры, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV). Обзоры способов и протоколов для работы с аденовирусными векторами приведены в Wold, Adenovirus Methods and Protocols,1998. Дополнительные ссылки, касающиеся применения аденовирусных векторов, можно найти вAdenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004. Специфические сигналы инициации также могут быть использованы для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих интересующий полипептид. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG и примыкающие последовательности. В тех случаях, когда последовательности, кодирующие полипептид, его инициирующий кодон и расположенные выше последовательности, встроены в соответствующий экспрессирующий вектор, никаких дополнительных транскрипционных или трансляционных контрольных сигналов может не потребоваться. Однако в случаях, когда встроены только кодирующая последовательность или ее участок, необходимо обеспечить экзогенные трансляционные контрольные сигналы, включая инициирующий кодон ATG. Кроме того, инициирующий кодон должен находиться в правильной рамке считывания, для того чтобы гарантировать трансляцию всей вставки. Экзогенные трансляционные элементы и инициирующие кодоны могут быть различного происхождения: как природные, так и синтетические. Эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, соответствующих конкретной используемой клеточной системе, которые описаны, например, в литературе (Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162 (1994. В дополнение к этому, может быть выбран штамм клеток-хозяев в отношении его способности модулировать экспрессию встроенных последовательностей или осуществлять процессинг экспрессируемого белка желаемым образом. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются этим,ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Посттрансляционный процессинг, при котором происходит расщепление "препро"-формы белка,также можно использовать для облегчения правильной вставки, фолдинга и/или функции. Разные клетки-хозяева, такие как CHO, HeLa, MDCK, HEK293 и WI38, которые имеют специфический клеточный аппарат и специфические механизмы для таких посттрансляционных активностей, могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка. Для продолжительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом обычно предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют интересующий полинуклеотид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные точки инициации (origins) репликации и/или эндогенные экспрессирующие элементы и селектируемый маркерный ген в том же или в отдельном векторе. После введения вектора клетки можно оставить расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, перед тем как перевести их в селективную среду. Задача селектируемого маркера заключается в том, чтобы придать устойчивость к селекции, и его присутствие делает возможным рост и выделение клеток, успешно экспрессирующих введенные последовательности. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток могут быть размножены с использованием методов культивирования тканей, соответствующих данному типу клеток. Для получения трансформированных клеточных линий можно использовать любое количество систем селекции. Они включают, но не ограничиваются этим, гены тимидинкиназы (Wigler et al., Cell 11: 223-32 (1977 и аденинфосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Lowy et al., Cell 22: 817-23(1990, которые могут быть использованы, соответственно, в tk.sup.-или aprt.sup.- клетках. Кроме того, в качестве основы для селекции можно использовать устойчивость к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 77: 3567-70 (1980; npt, который придает устойчивость к аминогликозидам, неомицину иG-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981; и als или pat, которые придают устойчивость,соответственно, к хлорсульфурону и фосфинотрицинацетилтрансферазе (Murry, выше). Были описаны дополнительные селектируемые гены, например trpB, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина(HartmanMulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8047-51 (1988. Недавно применение видимых маркеров сделало популярным использование таких маркеров, как антоцианины, -глюкуронидаза и ее субстрат GUS, люцифераза и ее субстрат люциферин, причем их широко используют не только для идентификации трансформантов, но также для количественного определения величины временной или стабильной экспрессии белка, определяющейся конкретной векторной системой (Rhodes et al., Methods Mol.- 18012576 Хотя наличие/отсутствие экспрессии маркерного гена предполагает, что интересующий ген также присутствует, его присутствие и экспрессия могут нуждаться в подтверждении. Например, если последовательность, кодирующую полипептид, встраивают в последовательность маркерного гена, рекомбинантные клетки, содержащие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген можно разместить в тандеме с полипептидкодирующей последовательностью под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно также указывает на экспрессию тандемного гена. Альтернативно, клетки-хозяева, содержащие и экспрессирующие желаемую полинуклеотидную последовательность, можно идентифицировать различными методами, известными специалистам в данной области. Эти методы включают, но не ограничиваются этим, ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации и методы биоанализа или иммуноанализа белков, которые включают мембранные технологии, технологии в растворах или технологии на основе чипов для детекции и/или количественного определения нуклеиновой кислоты или белка. В данной области техники известны различные протоколы детекции и измерения экспрессии полинуклеотид-кодируемых продуктов с использованием либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфических к данному продукту. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ(ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и разделение клеток с активацией флуоресценции (FACS). Для некоторых применений предпочтительным может быть двухстадийный, основанный на моноклональных антителах иммунологический анализ, в котором используются моноклональные антитела, реагирующие с двумя неперекрывающимися эпитопами на указанном полипептиде, но также можно использовать анализ конкурентного связывания. Эти и другие анализы описаны, среди прочего, в Hampton et al.,Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) и Maddox et al., J. Exp. Med. 158: 1211-1216 (1983). Большое разнообразие меток и методов конъюгирования известны специалистам в данной области и их можно использовать в различных анализах нуклеиновых кислот и аминокислот. Способы получения меченых гибридизационных или ПЦР-зондов для детекции последовательностей, относящихся к полинуклеотидам, включают олигомечение, "ник"-трансляцию, концевое мечение или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. Альтернативно, последовательности или любые их участки можно клонировать в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области,имеются в продаже и их можно использовать для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, например Т 7, T3 или SP6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры могут быть проведены с использованием различных имеющихся в продаже наборов. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые могут быть использованы, включают радиоактивные изотопы, ферменты,флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Клетки-хозяева, трансформированные интересующей полинуклеотидной последовательностью,можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии и выделения белка из клеточной культуры. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может секретироваться или оставаться внутри клетки в зависимости от используемых последовательности и/или вектора. Как будет очевидно специалистам в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут быть сконструированы содержащими в себе сигнальные последовательности, которые направляют секрецию кодируемого полипептида через мембрану прокариотических или эукариотических клеток. Другие рекомбинантные конструкции могут быть использованы для присоединения последовательностей, кодирующих интересующий полипептид, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который будет облегчать очистку растворимых белков. Такие облегчающие очистку домены включают, но не ограничиваются этим, металлхелатирующие пептиды, такие как гистидинтриптофановые модули, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, позволяющие осуществлять очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAGS удлинения/аффинной очистки (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как линкеры, специфические к фактору ХА или энтерокиназе (Invitrogen, San Diego, Calif.), между доменом очистки и кодируемым полипептидом может быть использовано для облегчения очистки. Один такой экспрессирующий вектор предложен для экспрессии слитого белка, содержащего интересующий полипептид, и этот вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 гистидиновых остатков, находящихся перед тиоредоксиновым или энтерокиназным сайтом расщепления. Гистидиновые остатки облегчают очистку на IMIAC (аффинная хроматография с использованием иммобилизованных ионов металлов), как описано в Porateh et al., Prot. Exp. Purif. 3: 263-281 (1992), в то время как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство очистки желаемого полипептида из слитого белка. Обсуждение векторов, кодирующих слитые белки, приведено в Kroll et al., DNA Cell Biol. 12: 441-453 (1993. В дополнение к способам рекомбинантного получения, полипептиды по изобретению и их фрагменты могут быть получены прямым пептидным синтезом с использованием твердофазных методов(Merrifield, J. Am. CHem. Soc. 85: 2149-2154 (1963. Синтез белков может быть осуществлен вручную или с применением автоматизации. Автоматизированного синтеза можно добиться, например, используя- 19012576 пептидный синтезатор Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Альтернативно, различные фрагменты могут быть химически синтезированы по отдельности и объединены с использованием химических способов для получения полноразмерной молекулы. Методы доставки полинуклеотидов in vivo. В дополнительных воплощениях генетические конструкции, содержащие один или более полинуклеотидов по изобретению, вводят в клетки in vivo. Этого можно достичь с использованием любого из различных хорошо известных подходов; некоторые из них приведены ниже с целью иллюстрации. 1. Аденовирус. Один из предпочтительных способов доставки in vivo одной или более нуклеиновокислотных последовательностей включает применение аденовирусного экспрессирующего вектора. Подразумевается,что "аденовирусный экспрессирующий вектор" включает такие конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для (а) поддержания упаковки конструкции и (б) для экспрессии полинуклеотида, клонированного в нем в смысловой или антисмысловой ориентации. Конечно, в контексте антисмысловой конструкции экспрессия не подразумевает, что продукт гена синтезируется. Экспрессирующий вектор содержит генноинженерную форму аденовируса. Знание генетической организации аденовируса, представляющего собой вирус с линейной двухцепочечной ДНК, 36 т.п.н.,позволяет производить замену больших кусков аденовирусной ДНК чужеродными последовательностями вплоть до 7 т.п.н. (GrunhausHorwitz, 1992). В противоположность ретровирусу, аденовирусная инфекция клеток-хозяев не приводит к хромосомной интеграции, потому что аденовирусная ДНК может реплицироваться в виде эписомы без потенциальной генотоксичности. Кроме того, аденовирусы структурно стабильны, и после активной амплификации не отмечено никакой геномной перестройки. Аденовирус может инфицировать фактически все эпителиальные клетки независимо от стадии их клеточного цикла. До сих пор аденовирусная инфекция была связана, по-видимому, только с легкой формой заболевания, такого как острое респираторное заболевание, у людей. Аденовирус особенно подходит для использования его в качестве вектора для переноса генов из-за среднего размера его генома, легкости манипулирования, высокого титра, широкого диапазона клетокхозяев и высокой инфекционности. Оба конца вирусного генома содержат инвертированные повторы длиной 100-200 пар оснований (ITR), которые представляют собой цис-элементы, необходимые для репликации и упаковки вирусной ДНК. Ранние (Е) и поздние (L) участки генома содержат разные транскрипционные единицы, которые разделены точкой начала репликации вирусной ДНК. Участок Е 1 (Е 1 А и Е 1 В) кодирует белки, отвечающие за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Экспрессия участка Е 2 (Е 2 А и Е 2 В) приводит к синтезу белков для репликации вирусной ДНК. Эти белки вовлечены в репликацию ДНК, экспрессию поздних генов и "отключение" клеткихозяина (Renan, 1990). Продукты поздних генов, включая большую часть капсидных вирусных белков,экспрессируются только после значительного процессинга одного первичного транскрипта под контролем главного позднего промотора (MLP). MLP (расположенный на 16,8 единиц карты) особенно эффективен в поздней фазе инфекции, и все мРНК, контролируемые этим промотором, содержат 5'трехкомпонентную лидерную последовательность (TPL), которая делает их предпочтительными мРНК для трансляции. В настоящей системе рекомбинантный аденовирус получают в результате гомологичной рекомбинации между "челночным" вектором и провирусным вектором. Вследствие возможной рекомбинации между двумя провирусными векторами в результате этого процесса может быть получен аденовирус дикого типа. Поэтому крайне необходимым является выделение единичного клона вируса из индивидуальной бляшки и проверка его геномной структуры. Получение и размножение существующих в настоящее время аденовирусных векторов, которые дефектны по репликации, зависит от уникальной линии хелперных клеток, обозначенной 293, которая представляет собой клетки почки эмбриона человека, трансформированные Ad5 ДНК-фрагментами, и которая конститутивно экспрессирует белки Е 1 (Graham et al., 1977). Поскольку из аденовирусного генома удален участок E3 (JonesShenk, 1978), существующие в настоящее время аденовирусные векторы с помощью клеток 293 несут чужеродную ДНК либо в участке Е 1, либо D3, либо в обоих этих участках (GrahamPrevec, 1991). В природе аденовирус может упаковывать приблизительно 105% генома дикого типа (Ghosh-CHoudhury et al., 1987), обеспечивая емкость приблизительно для 2 дополнительных т.п.н. ДНК. В сочетании с приблизительно 5,5 т.п.н. ДНК, которые могут быть заменены в участках Е 1 иE3, максимальная емкость существующих в настоящее время аденовирусных векторов составляет менее 7,5 т.п.н. или приблизительно 15% от общей длины вектора. Более 80% вирусного генома аденовируса остается в остове вектора и является источником трансмиссивной цитотоксичности. На этом дефектность по репликации Е 1-делетированного вируса не заканчивается. Например, при использовании доступных в настоящее время векторов с высокой множественностью заражения (MOI) наблюдалась утечка экспрессии вирусных генов (Mulligan, 1993). Хелперные клеточные линии могут происходить из клеток человека, таких как клетки почки эмбриона человека, мышечные клетки, гемопоэтические клетки или другие мезенхимальные или эпителиальные клетки эмбриона человека. Альтернативно, хелперные клетки могут происходить из клеток дру- 20012576 гих видов млекопитающих, пермиссивных для аденовируса человека. Такие клетки включают, например,клетки Vero (клетки почки зеленой мартышки) или другие эмбриональные мезенхимальные или эпителиальные клетки обезьяны. Как указано выше, в настоящее время предпочтительной хелперной клеточной линией является линия 293. Недавно Racher et al. (1995) описали улучшенные способы культивирования клеток 293 и размножения аденовируса. В одном из форматов агрегаты природных клеток выращивают путем инокуляции индивидуальных клеток в силиконизированные вращающиеся колбы объемом 1 л (Techne, Cambridge,UK), содержащие по 100-200 мл среды. После перемешивания при 40 об/мин оценивают жизнеспособность клеток с использованием трипанового синего. В другом формате используют микроносителиFibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 г/л) следующим образом. Клеточный инокулят, ресуспендированный в 5 мл среды, добавляют к носителю (50 мл) в колбе Эрленмейера объемом 250 мл и оставляют в стационарном состоянии на 1-4 ч с перемешиванием время от времени. Затем среду заменяют 50 мл свежей среды и начинают встряхивание. Для продуцирования вируса клетки оставляют расти до приблизительно 80%-ной конфлюентности, после чего среду меняют (до 25% конечного объема) и добавляют аденовирус при MOI 0,05. Культуры оставляют в стационарном состоянии на ночь, после чего объем увеличивают до 100% и начинают встряхивать в течение еще 72 ч. Кроме требования, чтобы аденовирусный вектор был дефектным или, по меньшей мере, условно дефектным по репликации, природа аденовирусного вектора, по-видимому, не является решающей для успешного практического применения изобретения. Аденовирус может представлять собой любой из 42 разных известных серотипов или подгрупп A-F. Аденовирус 5 типа подгруппы С является предпочтительным исходным материалом для получения условно дефектного по репликации аденовирусного вектора для применения в настоящем изобретении, поскольку аденовирус 5 типа является человеческим аденовирусом, о котором известно огромное количество биохимической и генетической информации, и исторически его используют для большинства конструкций, использующих аденовирус в качестве вектора. Как указано выше, типичный вектор по настоящему изобретению дефектен по репликации и не будет иметь аденовирусного участка Е 1. Таким образом, удобнее всего будет вводить полинуклеотид, кодирующий интересующий ген, в положение, из которого удалены Е 1-кодирующие последовательности. Однако положение вставки конструкции в аденовирусных последовательностях не критично для этого изобретения. Полинуклеотид, кодирующий интересующий ген, также может быть встроен вместо делетированного участка E3 в Е 3-замещающих векторах, как описано Karlsson et al. (1986), или в участок Е 4,когда линия хелперных клеток или хелперный вирус комплементирует отсутствие Е 4. Аденовирус легко выращивать, им легко манипулировать, и он демонстрирует широкий круг хозяевin vitro и in vivo. Эта группа вирусов может быть получена с высокими титрами, например, 109-1011 колониеобразующих единиц на мл, и они обладают высокой инфекционностью. Жизненный цикл аденовируса не требует интеграции в геном клетки-хозяина. Чужеродные гены, доставляемые посредством аденовирусных векторов, являются эписомными и, следовательно, имеют низкую генотоксичность в отношении клеток-хозяев. Не сообщалось ни о каких побочных эффектах при исследованиях вакцинации аденовирусом дикого типа (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), что демонстрирует их безопасность и терапевтический потенциал в качестве векторов для переноса генов in vivo. Аденовирусные векторы использовали в экспрессии эукариотических генов (Levrero et al., 1991;Gomez-Foix et al., 1992) и разработке вакцин (GrunhausHorwitz, 1992; GrahamPrevec, 1992). Недавно исследования на животных показали, что рекомбинантный аденовирус может быть использован для генной терапии (Stratford-PerricaudetPerricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Исследования при введении рекомбинантного аденовируса в разные ткани включают трахеальную инстилляцию (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), мышечную инъекцию (Ragot et al., 1993), периферические внутривенные инъекции (HerzGerard, 1993) и стереотактическую инокуляцию в головной мозг (Le Gal La Salle et al., 1993). Аденовирусные векторы могут происходить из человеческого аденовируса. Альтернативно, они могут происходить из аденовируса других видов, например шимпанзе, что может иметь преимущество в том, что вирусные векторы не нейтрализуются антителами против человеческого аденовируса, циркулирующего в крови многих человеческих субъектов (см., например, Tatsis N. et al. (2005) Gene Ther. Dec. 1;[в печати]). 2. Ретровирусы. Ретровирусы представляют собой группу вирусов, содержащих одноцепочечную РНК, характеризующихся способностью превращать свою РНК в двухцепочечную ДНК в инфицированных клетках посредством процесса обратной транскрипции (Coffin, 1990). Полученная ДНК затем стабильно интегрируется в клеточные хромосомы в виде провируса и направляет синтез вирусных белков. Интеграция приводит к удерживанию последовательностей вирусных генов в реципиентной клетке и ее потомках. Ретровирусный геном содержит три гена: gag, pol и env, которые кодируют, соответственно, капсидные белки,фермент полимеразу и оболочечные компоненты. Последовательность, обнаруженная выше гена gag,содержит сигнал для упаковки генома в вирионы. На 5'- и 3'-концах вирусного генома имеются две- 21012576 длинные концевые повторяющиеся (LTR) последовательности. Они содержат сильные промоторные и энхансерные последовательности и также необходимы для интеграции в геном клетки-хозяина (Coffin,1990). Для создания ретровирусного вектора нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или более интересующих олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, встраивают в вирусный геном в место расположения некоторых вирусных последовательностей для получения вируса, дефектного по репликации. Для получения вирионов конструируют "упаковывающую" клеточную линию, содержащую гены gag, pol и env, но не содержащую LTR и "упаковывающие" компоненты (Mann et al., 1983). Когда в эту клеточную линию вводят (например, путем осаждения фосфатом кальция) рекомбинантную плазмиду, содержащую кДНК, вместе с ретровирусными LTR и "упаковывающими" последовательностями,"упаковывающая" последовательность способствует упаковке транскрипта РНК рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду (NicolasRubenstein,1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, затем собирают,возможно, концентрируют и используют для переноса генов. Ретровирусные векторы способны инфицировать широкий спектр клеточных типов. Однако для интеграции и стабильной экспрессии необходим процесс деления клеток-хозяев (Paskind et al., 1975). Недавно был разработан новый подход для облегчения специфического мечения ретровирусных векторов, основанный на химической модификации ретровируса путем химического присоединения остатков лактозы к вирусной оболочке. Благодаря этой модификации смогли осуществить специфическое заражение гепатоцитов через сиалогликопротеиновые рецепторы. Был разработан другой подход для мечения рекомбинантных ретровирусов, в котором использовали биотинилированные антитела против ретровирусного оболочечного белка и против конкретного клеточного рецептора. Антитела соединяли друг с другом через биотиновые компоненты при использовании стрепавидина (Roux et al., 1989). С использованием антител против антигенов класса I и класса II главного комплеса гистосовместимости продемонстрировано, что имеет место инфекция различных человеческих клеток, несущих такие поверхностные антигены, экотропным вирусом in vitro (Roux et al., 1989). 3. Аденоассоциированные (AAV) вирусы.AAV (Ridgeway, 1988; HermonatMuzycska, 1984) представляет собой парвовирус, открытый в виде контаминации аденовирусных штаммов. Он является повсеместно распространенным вирусом (антитела имеются у 85% человеческой популяции в США), который не связан с каким-либо заболеванием. Кроме того, его классифицируют как зависимый вирус, поскольку его репликация зависит от присутствия хелперного вируса, такого как аденовирус. Были выделены пять серотипов, из которых лучше всего охарактеризован AAV-2. AAV имеет одноцепочечную линейную ДНК, которая заключена в капсидную оболочку с капсидными белками VP1, VP2 и VP3 с образованием икосаэдрического вириона диаметром 20-24 нм (MuzyczkaMcLaughlin, 1988). ДНК AAV имеет длину приблизительно 4,7 тыс. оснований. Она содержит две открытые рамки считывания и фланкирована двумя ITR. В геноме AAV имеются два основных гена: rep и cap. Ген rep кодирует белки, ответственные за вирусные репликации, тогда как cap кодирует капсидный белок VP1-3. Каждый ITR образует Т-образную шпилечную структуру. Эти концевые повторы являются единственными существенными cis-компонентами AAV для интеграции в хромосомы. Поэтому AAV может быть использован в качестве вектора со всеми вирусными кодирующими последовательностями, удаленными и замененными кассетой генов для доставки. Идентифицированы три вирусных промотора и они обозначены как р 5, р 19 и р 40 в соответствии с их положением на карте. Транскрипция с р 5 и р 19 приводит к продуцированию белков rep, а транскрипция с р 40 приводит к продуцированию капсидных белков(HermonatMuzyczka, 1984). Существует несколько факторов, которые стимулируют исследователей к изучению возможности использования rAAV в качестве экспрессирующего вектора. Один из них заключается в том, что необходимых условий для интегрирования доставляемого гена в хромосому хозяина удивительно мало. Для этого необходимо иметь ITR размером 145 п.н., что составляет только 6% генома AAV. Это оставляет место в векторе для составления вставки ДНК длиной 4,5 т.п.н. Несмотря на то что такая несущая емкость может препятствовать доставке больших генов с использованием AAV, она в достаточной степени подходит для доставки антисмысловых конструкций по настоящему изобретению. Кроме того, AAV представляет собой хороший выбор в качестве средств доставки ввиду своей безопасности. Существует относительно сложный механизм его "высвобождения": для мобилизацииrAAV требуются не только аденовирус дикого типа, но и гены AAV. Более того, AAV не является патогенным и не ассоциирован с каким-либо заболеванием. Удаление вирусных кодирующих последовательностей минимизирует иммунные ответы на экспрессию вирусных генов, и, следовательно, rAAV не индуцирует воспалительный ответ.- 22012576 4. Другие вирусные векторы в качестве экспрессирующих конструкций. Для доставки олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей в клетку-хозяина в качестве экспрессирующих конструкций в настоящем изобретении могут быть использованы другие вирусные векторы. Могут быть использованы векторы, происходящие из таких вирусов, как вирус осповакцины (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), лентивирусы, полиовирусы и герпесвирусы. Они обладают некоторыми привлекательными свойствами для различных клеток млекопитающих (Friedmann, 1989;Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990). Благодаря недавнему открытию дефектных вирусов гепатита В, было достигнуто новое понимание структурно-функциональной взаимосвязи разных вирусных последовательностей. Исследования in vitro показали, что вирус может сохранять способность к хелперзависимой упаковке и обратной транскрипции, несмотря на удаление вплоть до 80% его генома (Horwich et al., 1990). Это подтвердило, что большие участки генома могут быть заменены чужеродным генетическим материалом. Гепатотропизм и персистенция (интеграция) являлись особенно привлекательными свойствами для направленного в печень переноса генов. Chang et al. (1991) ввели ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в геном вируса гепатита В утки в место расположения последовательностей, кодирующих полимеразу, поверхностную и подповерхностную область. Осуществили его котрансфецию вместе с вирусом дикого типа в клеточную линию гепатомы птиц. Для инфицирования первичных утиных гепатоцитов использовали культуральные среды, содержащие высокие титры рекомбинантного вируса. Стабильную экспрессию гена CAT детектировали в течение по меньшей мере 24 суток после трансфекции (Chang et al., 1991). 5. Невирусные векторы. Для оказания влияния на экспрессию олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению экспрессирующая конструкция должна быть доставлена в клетку. Эта доставка может быть осуществлена in vitro, как в лабораторных методах трансформации клеточных линий, или in vivo или ex vivo, как при лечении некоторых болезненных состояний. Как описано выше,один из предпочтительных механизмов доставки осуществляется через вирусную инфекцию, когда экспрессирующая конструкция инкапсулируется в инфекционную вирусную частицу. После доставки экспрессирующей конструкции в клетку нуклеиновая кислота, кодирующая желаемые олигонуклеотидные или полинуклеотидные последовательности, может располагаться и экспрессироваться в разных сайтах. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, кодирующая конструкцию,может стабильно интегрироваться в геном клетки. Эта интеграция может осуществляться в специфическом положении и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замена генов), или она может интегрироваться в случайном, неспецифическом положении (генная аугментация). В других воплощениях нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие нуклеиновокислотные сегменты или "эписомы" кодируют последовательности, достаточные для поддержания и репликации независимо от клеточного цикла хозяина или синхронно с ним. То, каким образом экспрессирующая конструкция доставляется в клетку и где в клетке сохраняется нуклеиновая кислота, зависит от типа используемой экспрессирующей конструкции. В некоторых воплощениях изобретения экспрессирующая конструкция, содержащая одну или более олигонуклеотидных или полинуклеотидных последовательностей, может просто состоять из голой рекомбинантной ДНК или плазмиды. Перенос конструкции может быть осуществлен любым из упомянутых выше способов, с помощью которых физически или химически увеличивается проницаемость клеточной мембраны. Это особенно применимо для переноса in vitro, но также может быть использовано для применения in vivo. Dubensky et al. (1984) успешно инъецировали полиомавирусную ДНК в форме кальций-фосфатных преципитатов в печень и селезенку взрослых и новорожденных мышей, продемонстрировав активную вирусную репликацию и острую инфекцию. Benvenisty и Reshef (1986) также продемонстрировали, что прямая внутрибрюшинная инъекция осажденных фосфатом кальция плазмид приводит к экспрессии трансфицированных генов. Рассматривается возможность того, что ДНК, кодирующая интересующий ген, также может быть перенесена аналогичным образом in vivo и может экспрессировать генный продукт. Другое воплощение изобретения в отношении переноса конструкции, экспрессирующей голую ДНК, в клетки может включать бомбардировку частицами. Этот способ зависит от способности ускорять ДНК-покрытые микрочастицы до высокой скорости, что позволяет им пересекать клеточные мембраны и проникать в клетки, не вызывая их гибели (Klein et al., 1987). Разработано несколько устройств для ускорения небольших частиц. В основе одного такого устройства лежит высоковольтный разряд с целью генерирования электрического тока, что в свою очередь обеспечивает движущую силу (Yang et al., 1990). Используемые микрочастицы состоят из биологически инертных веществ, таких как вольфрамовые или золотые гранулы. Выбранные органы, включая печень, кожу и мышечную ткань крыс и мышей, подвергали бомбардировке in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Для этого может потребоваться хирургическое воздействие на ткань или клетки с целью исключения любой мешающей ткани, находящейся между пушкой и органом-мишенью, т.е. обработка ex vivo. Кроме того, ДНК, кодирующая конкретный ген, может быть доставлена с помощью этого способа и все еще включается настоящим изобретением.- 23012576 Полипептидные композиции. В других аспектах согласно настоящему изобретению предложены полипептидные композиции. Обычно полипептид по изобретению будет представлять собой выделенный полипептид (или его эпитоп,вариант или активный фрагмент), происходящий из видов млекопитающих. Предпочтительно полипептид кодируется полинуклеотидной последовательностью, раскрытой в данном описании, или последовательностью, которая гибридизуется в умеренно жестких условиях с полинуклеотидной последовательностью, раскрытой в данном описании. Альтернативно, полипептид может быть определен как полипептид,содержащий непрерывную аминокислотную последовательность из аминокислотной последовательности, раскрытой в данном описании, или как полипептид, содержащий всю аминокислотную последовательность, раскрытую в данном описании. Иммуногенные участки обычно могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных методов, таких как методы, просуммированные в Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(1993) и приведенных там ссылках. Такие методы включают скрининг полипептидов в отношении их способности взаимодействовать с антигенспецифическими антителами, антисыворотками и/или Т-клеточными линиями или клонами. Как использовано в данном описании, антисыворотки и антитела являются "антигенспецифическими", если они специфически связываются с антигеном (т.е. они взаимодействуют с белком в ELISA или другом иммуноанализе и не взаимодействуют на детектируемом уровне с неродственными белками). Такие антисыворотки и антитела могут быть приготовлены, как изложено в данном описании, и с использованием хорошо известных методов. Иммуногенный участок белкаMycobacterium sp. представляет собой участок, который взаимодействует с такими антисыворотками и/или Т-клетками на уровне, по существу, не меньшем, чем реактивность полноразмерного полипептида(например, в ELISA и/или анализе Т-клеточной реактивности). Такие иммуногенные участки могут реагировать в таких анализах на уровне, аналогичном или большем, чем реактивность полноразмерного полипептида. Такие скрининги обычно можно проводить, используя способы, хорошо известные средним специалистам в данной области, такие, как описаны в HarlowLane, Antibodies: A Laboratory Manual(1988) и Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998). Например, полипептид может быть иммобилизован на твердой подложке и приведен в контакт с сыворотками пациентов для обеспечения связывания антител в сыворотках с иммобилизованным полипептидом. Несвязавшиеся сыворотки могут быть затем удалены, а связавшиеся антитела определены с использованием, например, 125I-меченого белка А. Полипептиды могут быть получены с использованием любого из множества хорошо известных методов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые последовательностями ДНК, которые описаны выше,можно легко получить из последовательностей ДНК с использованием любого из различных экспрессирующих векторов, известных средним специалистам в данной области. Можно добиться экспрессии в любой соответствующей клетке-хозяине, которая трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки-хозяева включают прокариоты, дрожжи и высшие эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих и растительные клетки. Предпочтительно используемыми клетками-хозяевами являются Е.coli, дрожжи или клеточная линия млекопитающих, такая как COS или CHO. Супернатанты из подходящих систем хозяин/вектор, секретирующих рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, сначала могут быть сконцентрированы с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрирования концентрат может быть нанесен на подходящий для очистки матрикс, такой как аффинный матрикс или ионообменная смола. Наконец, для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида могут быть использованы одна или более стадий обращенно-фазной HPLC. Полипептиды по изобретению, их иммуногенные фрагменты и другие варианты, имеющие меньше чем приблизительно 100 аминокислот и обычно меньше чем приблизительно 50 аминокислот, могут быть также получены способами синтеза с использованием методов, хорошо известных средним специалистам в данной области. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любого коммерчески доступного твердофазного метода, такого как метод твердофазного синтеза по Меррифильду, в котором к растущей аминокислотной цепи последовательно добавляют аминокислоты. См. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Оборудование для автоматизированного синтеза полипептидов имеется в продаже у таких поставщиков, как Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City, CA), и на нем можно работать в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых конкретных воплощениях полипептид может представлять собой слитый белок, который содержит многочисленные полипептиды, приведенные в данном описании, или который содержит по меньшей мере один полипептид, приведенный в данном описании, и неродственную последовательность, такую как известный опухолевый белок. Партнер слияния может, например, содействовать обеспечению Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер слияния), предпочтительно Т-хелперных эпитопов, распознаваемых людьми, или может содействовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с более высокими выходами, чем у нативного рекомбинантного белка. Некоторые предпочтительные партнеры слияния являются и иммунологическими, и усиливающими экспрессию партнерами слияния. Другие партнеры слияния могут быть выбраны так, чтобы увеличивать растворимость белка или позволять белку достигать желаемых внутриклеточных компартментов. Другие партнеры слияния включают- 24012576 аффинные метки, которые облегчают очистку белка. Слитые белки в общем случае могут быть получены с использованием стандартных методов, включая химическое конъюгирование. Предпочтительно слитый белок экспрессируется в виде рекомбинантного белка, позволяя осуществлять продуцирование с повышенными уровнями относительно неслитого белка в экспрессирующей системе. Вкратце, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, могут быть собраны по отдельности и лигированы в соответствующий экспрессирующий вектор. 3'-конец последовательности ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируют с пептидным линкером или без него, с 5'-концом последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, так что рамки считывания последовательностей находятся в фазе. Это позволяет осуществлять трансляцию в виде единого слитого белка, который сохраняет биологическую активность обоих полипептидных компонентов. Пептидную линкерную последовательность можно использовать для отделения первого и второго полипептидных компонентов расстоянием, достаточным для того, чтобы гарантировать, что каждый полипептид будет сворачиваться в свою вторичную и третичную структуры. Такую пептидную линкерную последовательность встраивают в слитый белок, используя стандартные методы, хорошо известные в данной области. Подходящие пептидные линкерные последовательности могут быть выбраны на основании следующих факторов:(1) их способности принимать гибкую вытянутую конформацию;(2) их неспособности принимать вторичную структуру, которая могла бы взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и(3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могли бы взаимодействовать с полипептидными функциональными эпитопами. Предпочтительные пептидные линкерные последовательности содержат остатки Gly, Asn и Ser. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также могут быть использованы в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые можно успешно использовать в качестве линкеров, включают последовательности, раскрытые в Maratea et al., Gene, 40: 39-46(1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8258-8262 (1986); патентах США 4935233 и 4751180. Линкерная последовательность обычно может иметь длину от 1 до приблизительно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не требуются, когда первый и второй полипептиды имеют несущественные N-концевые аминокислотные участки, которые могут быть использованы для отделения функциональных доменов и предупреждения пространственного влияния. Лигированные последовательности ДНК функциональным образом связывают с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, располагаются только в 6'-положении относительно последовательности ДНК, кодирующей первый полипептид. Аналогично, стоп-кодоны, необходимые для окончания трансляции, и сигналы терминации транскрипции присутствуют только в 3'-положении относительно последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид. Также предложены слитые белки. Такие белки содержат полипептид, приведенный в данном описании, вместе с неродственным иммуногенным белком. Предпочтительно иммуногенный белок способен вызывать вторичный иммунный ответ. Примеры таких белков включают белки вирусов столбняка, туберкулеза и гепатита (см., например, Stoute et al., New Engl. J. Med. 336: 86-91 (1997. В предпочтительных воплощениях иммунологический партнер слияния происходит из белка D, поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza В (WO 91/18926). Предпочтительно, когда производное белка D содержит приблизительно первую треть белка (например, первыеN-концевые 100-110 аминокислот) и производное белка D может быть липидизировано. В некоторых предпочтительных воплощениях первые 109 остатков партнера слияния - липопротеина D - включены наN-конце для получения полипептида с дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и для увеличения уровня экспрессии в Е.coli (таким образом функционирующие как энхансер экспрессии). Липидный хвост обеспечивает оптимальное представление антигена антигенпредставляющим клеткам. Другие партнеры слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа NS1 (гемагглютинин). Обычно используют N-концевые 81 аминокислоту, хотя могут быть использованы разные фрагменты,которые включают Т-хелперные эпитопы. В другом воплощении иммунологическим партнером слияния является белок, известный как LYTA,или его участок (предпочтительно С-концевой участок). LYTA происходит из Streptococcus pneumoniae,который синтезирует N-ацетил-L-аланинамидазу, известную как амидаза LYTA (кодируемую геномLytA; Gene, 43: 265-292 (1986. LYTA представляет собой аутолизин, который специфически расщепляет некоторые связи в пептидогликановом остове. С-концевой домен белка LYTA отвечает за сродство к холину или некоторым аналогам холина, таким как DEAE. Это свойство использовали для разработки Е.coli C-LYTA-экспрессирующих плазмид, полезных для экспрессии слитых белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LYTA на аминоконце (см. Biotechnology, 10: 795-798(1992. В предпочтительном воплощении повторяющийся участок LYTA может быть включен в слитый белок. Повторяющийся участок обнаружен в С-концевой области, начиная с остатка 178. Особенно- 25012576 предпочтительный повторяющийся участок включает в себя остатки 188-305. В общем случае полипептиды (в том числе слитые белки) и полинуклеотиды, приведенные в данном описании, являются выделенными. "Выделенный" полипептид или полинуклеотид представляет собой полипептид или полинуклеотид, извлеченные из первоначального окружения. Например, природный белок является выделенным, если он отделен от некоторых или всех сопутствующих веществ в природной системе. Предпочтительно такие полипептиды являются чистыми по меньшей мере приблизительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 99%. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в вектор, не являющийся частью природного окружения.T-клетки. Иммунотерапевтические композиции могут также, или альтернативно, содержать T-клетки, специфические к антигену Mycobacterium. Такие клетки обычно могут быть получены in vitro или ex vivo с использованием стандартных процедур. Например, T-клетки могут быть выделены из спинного мозга,периферической крови, или фракции спинного мозга или периферической крови пациента, с использованием имеющейся в продаже системы для разделения клеток, такой как система Isolex, доступная отNexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; см. также патенты США 5240856 и 5215926; WO 89/06280;WO 91/16116 и WO 92/07243). Альтернативно, T-клетки могут быть получены от родственников или не родственников, от млекопитающих, не являющихся людьми, из клеточных линий или культур.T-клетки могут быть стимулированы полипептидом по изобретению, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или антигенпредставляющей клеткой (АРС), которая экспрессирует такой полипептид. Такую стимуляцию проводят в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы обеспечить продукцию Т-клеток, специфичных к полипептиду. Предпочтительно полипептид или полинуклеотид присутствует в средстве для доставки, таком как микросфера, для облегчения продуцирования специфических Т-клеток.T-клетки считаются специфическими к полипептиду по изобретению, если эти T-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или уничтожают клетки-мишени, покрытые полипептидом, или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Т-клеточную специфичность можно оценить,используя любую из множества стандартных методов. Например, в анализе с высвобождением хрома или анализе пролиферации увеличение индекса стимуляции более чем в два раза в лизисе и/или пролиферации по сравнению с отрицательными контролями указывает на Т-клеточную специфичность. Такие анализы могут быть осуществлены, например, как описано в Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070 (1994). Альтернативно, определение пролиферации Т-клеток может быть выполнено с помощью различных известных методов. Например, Т-клеточную пролиферацию можно определить путем измерения увеличивающейся скорости синтеза ДНК (например, с применением импульсно меченых культур Т-клеток с использованием меченого тритием тимидина и измерения количества меченого тритием тимидина, включенного в ДНК). Контакт с полипептидом по изобретению (100 нг/мл-100 мкг/мл, предпочтительно 200 нг/мл- 5 мкг/мл) в течение 3-7 суток должен приводить по меньшей мере к двукратному увеличению пролиферации Т-клеток. Описанный выше контакт в течение 2-3 ч должен приводить к активации Т-клеток, как измерено с использованием стандартных цитокиновых анализов, в которых двукратное увеличение в уровне высвобождения цитокина (например, TNF или IFN-) является индикатором Т-клеточной активации (см. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998. T-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид, полинуклеотид или полипептид-экспрессирующие АРС,могут быть определены как CD4+ и/или CD8+. Белок-специфические T-клетки могут быть размножены с использованием стандартных методов. В предпочтительных воплощениях T-клетки получают от пациента, донора-родственника или донора, не являющегося родственником, и их вводят пациенту после стимуляции и размножения. Для терапевтических целей CD4+ или CD8+ T-клетки, которые пролиферируют в ответ на полипептид, полинуклеотид или АРС, могут быть количественно размножены или in vitro, или in vivo. Пролиферацию таких Т-клеток in vitro можно осуществить различными способами. Например, T-клетки могут быть повторно экспонированы с полипептидом или коротким пептидом, соответствующим иммуногенному участку такого полипептида, с добавлением или без добавления Т-клеточных ростовых факторов,таких как интерлейкин-2, и/или стимуляторными клетками, которые синтезируют полипептид. Альтернативно, одна или более Т-клеток, которые пролиферируют в присутствии белка, могут быть размножены путем клонирования. Способы клонирования клеток хорошо известны в данной области и включают серийное разведение.- 26012576 Фармацевтические композиции. В дополнительных воплощениях настоящее изобретение относится к изготовлению одной или более полинуклеотидных, полипептидных, Т-клеточных, антительных и химиотерапевтических композиций, раскрытых в данном описании, в фармацевтически приемлемых растворах для введения в клетку или животному либо отдельно, либо в комбинации с одним или более чем одним другим вариантом терапии. Также следует понимать, что при желании нуклеиновокислотный сегмент (например, РНК или ДНК), экспрессирующий полипептид, раскрытый в данном описании, можно вводить также в комбинации с другими агентами, такими как, например, другие белки или полипептиды или различные фармацевтически активные агенты, включая химиотерапевтические агенты, эффективные против инфекции,вызываемой М.tuberculosis. На самом деле, фактически нет никакого ограничения в отношении других компонентов, которые также могут быть включены, при условии, что дополнительные агенты не вызывают значительного неблагоприятного эффекта при контакте с клетками-мишенями или тканями хозяина. Таким образом, композиции могут быть доставлены вместе с различными другими агентами, как необходимо в конкретном случае. Такие композиции могут быть очищены из клеток-хозяев или других биологических источников либо, альтернативно, могут быть химически синтезированы, как изложено в данном описании. Более того, такие композиции могут также включать композиции замещенных РНК или ДНК или их производных. Технология приготовления фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов-носителей хорошо известна специалистам в данной области, поскольку имеет отношение к разработке подходящих режимов дозирования и схем лечения для применения конкретных композиций, раскрытых в данном описании, в ряде схем лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение, и в изготовлении препаратов. Обычно с помощью препаратов,содержащих терапевтически эффективное количество, доставляют от приблизительно 2 до приблизительно 50 мкг полипептида Mtb72f за одно введение, в наболее типичных случаях от приблизительно 5 до приблизительно 40 мкг полипептида Mtb72f за одно введение. 1. Пероральная доставка. В некоторых применениях фармацевтические композиции, раскрытые в данном описании, могут быть доставлены посредством перорального введения животному. По существу, эти композиции могут быть изготовлены с использованием инертного разбавителя или с использованием усваиваемого пищевого носителя, или они могут быть помещены в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой,или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть введены непосредственно с пищей при ее приеме. Активные соединения могут быть даже введены с эксципиентами и использованы в форме проглатываемых таблеток, трансбуккальных таблеток, лепешек, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного (Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; патенты США 5641515, 5580579 и 5792451, каждый из которых конкретно включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Таблетки, лепешки, пилюли, капсулы и т.п. могут также содержать следующее: связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; эксципиенты, такие как дикальцийфосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал,альгиновая кислота и т.п.; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и может быть добавлен подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или корригент, как, например, перечная мята,масло гаультерии или вишневый корригент. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, тогда она может содержать, в дополнение к веществам вышеприведенного типа, жидкий носитель. Различные другие вещества могут присутствовать в качестве покрытий или каким-либо иным образом модифицировать физическую форму лекарственной единицы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и тем, и другим. Сироп эликсира может содержать активное соединение сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и корригент, такие как вишневый или апельсиновый корригент. Конечно, любое вещество, используемое в изготовлении любой стандартной лекарственной формы, должно быть фармацевтически чистым и, по существу, нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, активные соединения могут быть включены в композицию и препараты с пролонгированным высвобождением. В типичном случае эти препараты обычно содержат от 2 до 50 мкг полипептида Mtb72f. Естественно, количество активного(ых) соединения(й) в каждой терапевтически полезной композиции, которая может быть приготовлена, делают таким, чтобы в любой указанной стандартной дозе соединения получить подходящую дозировку. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологическое время полужизни, путь введения, срок годности продукта, а также другие фармакологические полезные свойства, будут подразумеваться специалистом в области изготовления таких фармацевтических композиций,и, по существу, могут быть желательными различные дозировки и схемы лечения. Что касается перорального введения, композиции по настоящему изобретению могут быть альтернативно введены с одним или более эксципиентами в форме жидкости для полоскания рта, средства для чистки зубов, трансбуккальных таблеток, перорального спрея или сублингвального, вводимого в рото- 27012576 вую полость препарата. Например, жидкость для полоскания рта может быть приготовлена путем введения активного ингредиента в необходимом количестве в соответствующий растворитель, такой как раствор бората натрия (раствор Добелла (Dobell. Альтернативно, активный ингредиент может быть включен в пероральный раствор, такой как раствор, содержащий борат натрия, глицерин и бикарбонат калия,или диспергирован в средстве для чистки зубов, или добавлен в терапевтически эффективном количестве к композиции, которая может содержать воду, связующие вещества, абразивные вещества, корригенты,пенообразователи и увлажнители. Альтернативно, композиции могут быть изготовлены в форме таблетки или раствора, которые можно поместить под язык или каким-либо иным образом растворить во рту. 2. Доставка путем инъекции. В некоторых случаях будет желательно доставлять фармацевтические композиции, раскрытые в данном описании, парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже интраперитонеально, как описано в патентах США 5543158, 5641515 и 5399363 (каждый конкретно включен в данном описание во всей своей полноте посредством ссылки). Растворы активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемых солей могут быть приготовлены в воде, смешанной, соответственно,с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Также могут быть приготовлены дисперсии в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти композиции содержат консервант для предупреждения роста микроорганизмов. Фармацевтические формы, подходящие для применения путем инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий (патент США 5466468, конкретно включенный в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в такой степени, чтобы ее можно было легко вводить с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от контаминации такими микроорганизмами, как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), подходящие их смеси и/или растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Воздействие микроорганизмов можно предотвратить путем использования различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов,например сахара или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить путем применения в композициях агентов, замедляющих всасывание, например моностеарата алюминия и желатина. Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор должен быть, при необходимости, соответствующим образом забуферен и предпочтительно жидкий разбавитель должен быть приготовлен изотоническим с использованием достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Такие специфические водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и интраперитонеального введения. В связи с этим в свете настоящего описания специалистам в данной области будет известна стерильная водная среда, которая может быть использована. Например, одну из дозировок можно растворить в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавить к 1000 мл жидкости для введения в подкожную клетчатку, либо инъецировать в предполагаемое место инфузии (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, p. 1035-1038 и 1570-1580). Обязательно будет иметь место некоторая вариация в дозировке в зависимости от состояния субъекта, которого лечат. Лицо, ответственное за введение, в любом случае будет определять соответствующую дозу для индивидуального субъекта. Более того, для введения человеку препараты должны удовлетворять стандартам стерильности, пирогенности и общей безопасности и чистоты, как требуется FDA (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств) на основании стандартов для биопрепаратов. Стерильные инъекционные растворы приготавливают путем включения активных соединений в необходимом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии приготавливают путем введения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из тех,которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами изготовления являются методы вакуумной сушки и лиофилизации, с помощью которых получают порошок активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из их предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Композиции, раскрытые в данном описании, могут быть изготовлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислот (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, напри- 28012576 мер, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая,винная, яблочная и т.п. Кроме того, соли, образованные свободными карбоксильными группами, могут происходить из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония,кальция или трехвалентного железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После приготовления растворы будут вводиться способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции легко вводят в разнообразных лекарственных формах, таких как инъекционные растворы, капсулы с высвобождением лекарственного средства и т.п. Термин "носитель", как он использован в данном описании, включает каждый и все растворители,дисперсионную среду, наполнители, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтических активных веществ хорошо известно в данной области, за исключением случаев, когда любая традиционная среда или агент не совместимы с активным ингредиентом, его применение в терапевтических композициях предполагается. В композиции также могут быть включены дополнительные активные ингредиенты. Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным структурам и композициям, которые не дают аллергической или подобной неблагоприятной реакции при введении человеку. Приготовление водной композиции, содержащей белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области. Обычно такие композиции приготавливают в виде инъецируемых форм, в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Композиция также может быть эмульгирована. 3. Назальная и трансбуккальная доставка. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции можно доставлять посредством интраназальных спреев, трансбуккальных спреев, ингаляции и/или других приспособлений для доставки аэрозолей. Способы доставки генов, нуклеиновых кислот и пептидных композиций непосредственно в легкие,например, посредством назальных и трансбуккальных аэрозольных спреев, описаны, например, в патентах США 5756353 и 5804212 (каждый конкретно включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, в области фармацевтики также хорошо известна доставка лекарственных средств с использованием интраназальных смол в виде микрочастиц (Takenaga et al., 1998) и лизофосфатидилглицериновых соединений (патент США 5725871, конкретно включенный в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, доставка лекарственного средства через слизистую оболочку в форме основного вещества с носителем из политетрафторэтилена описана в патенте США 5780045 (конкретно включенном в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). 4. Доставка, опосредованная липосомами, нанокапсулами и микрочастицами. В некоторых воплощениях авторы изобретения предполагают применение липосом, нанокапсул,микрочастиц, микросфер, липидных частиц, везикул и т.п. для введения композиций по настоящему изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для доставки инкапсулированными либо в липидную частицу, липосому, везикулу,наносферу, либо наночастицу или т.п. Такие композиции могут быть предпочтительны для введения фармацевтически приемлемых композиций нуклеиновых кислот или конструкций, раскрытых в данном описании. Образование и использование липосом обычно известно специалистам в данной области (см. например, Couvreur et al., 1977;Couvreur, 1988; Lasic, 1998; где описано применение липосом и нанокапсул в терапии с направленной доставкой антибиотиков для внутриклеточных бактериальных инфекций и заболеваний). Недавно были разработаны липосомы с улучшенными стабильностью в сыворотке и периодами полувыведения из кровотока (GabizonPapahadjopoulos, 1988; Allen и Choun, 1987; патент США 5741516, конкретно включенный в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Кроме того, представлены обзоры различных способов приготовления липосомных и липосомоподобных композиций в качестве потенциальных лекарственных носителей (Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; патентыСША 5567434, 5552157, 5565213, 5738868 и 5795587, каждый из которых конкретно включен в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки). Липосомы были успешно использованы с различными типами клеток, которые в норме резистентны к трансфекции другими методами, включая Т-клеточные суспензии, первичные культуры гепатоцитов и клетки PC 12 (Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990). Кроме того, липосомы не имеют ограничений по длине ДНК, которые обычны для вирусным систем доставки. Липосомы были эффективно использованы для введения генов, лекарственных средств (Heath и Martin, 1986; Heath et al., 1986;Balazsovits et al., 1989; Fresta и Puglisi, 1996), радиотерапевтических агентов (Pikul et al., 1987), ферментов (Imaizumi et al., 1990 а; Imaizumi et al., 1990b), вирусов (Faller и Baltimore, 1984), транскрипционных факторов и аллостерических эффекторов (Nicolau и Gersonde, 1979) в различные культивируемые клеточные линии и животных. Кроме того, завершено несколько успешных клинических испытаний, в которых исследована эффективность опосредованной липосомами лекарственной доставки (Lopez-Beresteinet al., 1985 а; 1985b; Coune, 1988; Soulier et al., 1988). Кроме того, некоторыми исследованиями доказано,что применение липосом не ассоциировано с аутоиммунными ответами, токсичностью или гонадной локализацией, как после системной доставки (Mori и Fukatsu, 1992). Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергируются в водной среде и самопроизвольно образуют многослойные концентрические бислойные везикулы (также названные многослойными везикулами (MLV. Обычно MLV имеют диаметры от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию небольших однослойных везикул (SUV) диаметрами в диапазоне 200-500 ,содержащих водный раствор в сердцевине. Липосомы имеют сходство с клеточными мембранами и предложены для применения согласно настоящему изобретению в качестве носителей для пептидных композиций. Они подходят для широкого применения, поскольку могут захватывать вещества, растворимые как в воде, так и в липидах, т.е. в водных пространствах и внутри самого бислоя соответственно. Существует возможность использования липосом, несущих лекарственное средство, даже для сайт-специфической доставки активных агентов посредством селективной модификации липосомной композиции. В дополнение к учению Couvreur et al. (1977; 1988) для получения липосомных композиций может быть использована следующая информация. При диспергировании в воде фосфолипиды могут образовывать ряд структур, отличающихся от липосом, в зависимости от молярного соотношения липида и воды. При низких соотношениях предпочтительной структурой является липосома. Физические характеристики липосом зависят от pH, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов. Липосомы могут демонстрировать низкую проницаемость в отношении ионных и полярных веществ, но при повышенных температурах подвергаются фазовому переходу, который заметно влияет на их проницаемость. Фазовый переход включает изменение от плотно упакованной, упорядоченной структуры, известной как желеобразное состояние, до слабо упакованной, менее упорядоченной структуры, известной как жидкое состояние. Это происходит при характеристической температуре фазового перехода и выражается в увеличении проницаемости в отношении ионов, сахаров и лекарственных средств. Помимо температуры, проницаемость липосом может изменяться при экспозиции с белками. Некоторые растворимые белки, такие как цитохром, связываются с двойным слоем, деформируют его и проникают через него, вызывая при этом изменения в проницаемости. Холестерин ингибирует это проникновение белков, по-видимому, посредством более плотной упаковки фосфолипидов. Считается, что наиболее полезные липосомные препараты для доставки антибиотиков и ингибиторов будут содержать холестерин. Способность разных типов липосом захватывать растворенные вещества варьирует. Например,MLV умеренно эффективны в отношении захвата растворенных веществ, a SUV весьма неэффективны.SUV дают преимущество в гомогенности и воспроизводимости в распределении по размерам, однако компромисс между размером и эффективностью захвата обеспечивается при использовании больших однослойных везикул (LUV). Их получают путем упаривания из эфира, и они в три-четыре раза более эффективны в отношении захвата растворенных веществ по сравнению с MLV. В дополнение к липосомным характеристикам, важной детерминантой в захвате соединений являются физико-химические свойства самого соединения. Полярные соединения захватываются в водных пространствах, а неполярные соединения связываются с липидным бислоем везикулы. Полярные соединения высвобождаются благодаря проницаемости или при разрушении бислоя, а неполярные соединения остаются соединенными с бислоем до тех пор, пока он не разрушится под действием температуры или липопротеинов. Оба типа демонстрируют максимальные скорости истечения при температуре фазового перехода. Липосомы взаимодействуют с клетками посредством четырех разных механизмов: эндоцитоза фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, такими как макрофаги и нейтрофилы; адсорбции на клеточной поверхности либо под действием неспецифических слабых гидрофобных или электростатических сил, либо в результате специфических взаимодействий с компонентами клеточной поверхности; слияния с плазматической клеточной мембраной путем вставки липидного бислоя липосомы в плазматическую мембрану с одновременным высвобождением содержимого липосомы в цитоплазму; и путем переноса липосомных липидов в клеточные или субклеточные мембраны или, наоборот, без какой-либо ассоциации с содержимым липосом. Часто бывает трудно определить, какой механизм действует, и в одно и то же время может действовать более чем один механизм. Судьба и место размещения внутривенно инъецируемых липосом зависит от их физических свойств, таких как размер, текучесть и поверхностный заряд. Они могут персистировать в тканях в течение часов или суток в зависимости от своего состава, а полупериоды существования в крови изменяются в диапазоне от минут до нескольких часов. Большие по размеру липосомы, такие как MLV и LUV, быстро захватываются фагоцитарными клетками ретикулоэндотелиальной системы, однако физиология системы кровообращения ограничивает проникновение таких больших разновидностей в большинство мест. Они могут проникать только в места, где в эндотелии капилляров имеются большие отверстия или поры,такие как синусоидные капилляры печени или селезенки. Поэтому эти органы являются предпочтительным местом захвата. С другой стороны, SUV демонстрируют более широкое распределение в тканях, но