Способ рефолдинга рекомбинантных антител

012162 Настоящая заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на патент США 60/621295,поданной 22 октября 2004, и предварительной заявки на патент США 60/701762, поданной 22 июля 2005. Каждая из вышеуказанных заявок в полном объеме включена здесь для сведения. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение в общем относится к способам обеспечения повышенного продуцирования и/или выхода предпочтительных [пространственных] форм белков. Конкретнее изобретение относится к способам рефолдинга рекомбинантных антительных белков. Уровень техники С развитием генной инженерии появилась перспектива доступного получения больших количеств биологически активных полипептидов, экспрессирующихся в функциональной форме в микроорганизмах, полученных с помощью генной инженерии. Во многих случаях предусматривается применение прокариотов для достижения экспрессии рекомбинантных белков. Однако эта возможность не реализуется в полной мере в силу ряда причин. Например, во многих случаях, когда полипептид продуцирован и остается в цитоплазме микроорганизма-хозяина, образуются тельца включения, требующие денатурации и ренатурации белка, зачастую с незначительным успехом. Многие важные белки-мишени в лучшем случае неэффективно экспрессируются в прокариотических клетках в растворимой форме, по меньшей мере,частично за счет сложности процесса укладки белка в условиях in vivo (Houry et al., Nature, 402: 147-154,1999). Для восстановления биологически активных эукариотических белков из телец включения требуется развертывание и рефолдинг белка при использовании жестких условий, которые включают в себя применение хаотропных агентов и восстанавливающих тиолов. В других случаях экспрессированный белок или пептид в основном подвергается деградации, что приводит не только к низкому выходу, но также и к образованию сложных смесей, которые трудно разделить и очистить. Образование дисульфидных связей в белках в условиях in vivo представляет собой сложный процесс, который определяется редокс-потенциалом окружающей среды и активностью особых ферментов,катализирующих обмен тиолов на дисульфиды (Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984; HoueeLevin, Methods Enzymol. 353, 35-44, 2002; Ritz and Beckwith, Roles of thiol-redox pathways in bacteria,Annu. Rev. Microbiol., 55, 21-48, 2001). Дисульфидные связи образуются в клетках во время секреции появляющихся цепей в эндоплазматическом ретикулуме или вскоре после нее (Creighton, Methods Enzymol. 107, 305-329, 1984). Можно получить несколько конформационных изоформ одного и того же белка,но с различными дисульфидными структурами, во время продуцирования рекомбинантного белка в клетках млекопитающих за счет нарушения процесса образования дисульфидных связей, тесной близости трех или более остатков цистеина в структуре белка или поверхностной экспрессии непарных остатков цистеина. Как правило, остатки цистеина в белках (включая антитела, IgG-антитела, IgG1-антитела и связывающий IgG1-антитело человеческий IL-15) либо уже участвуют в образовании дисульфидных связей цистеин-цистеин, либо стерически защищены от образования дисульфидных связей, в том случае, когда они являются частью уложенной области белка. Когда у остатка цистеина отсутствует пара в структуре белка и он не защищен стерически укладкой, то он может образовать дисульфидную связь со свободным цистеином из раствора (цистеинилирование). Обычно в ферментационной среде имеются остатки свободного цистеина вместе с другими аминокислотами, строительным материалом белков. Цистеинилирование является нежелательной посттрансляционной модификацией в фармацевтических белках, которое может привести к появлению конформационной изоформы с нежелательными свойствами, такими как низкая эффективность связывания, низкая биологическая активность и низкая стабильность. Данное изобретение относится к способу элиминации цистеинилирования и повышения относительного количества желаемой конформационной изоформы без цистеинилирования. Непарные остатки цистеина можно подвергнуть цистеинилированию, которое может привести к существенным изменениям свойств и функции белков. Сообщалось о цистеинилировании белков в условиях in vivo (Craescu et al., J. Biol. Chem., 261, 14710-14716, 1986; Dormann et al., J. Biol. Chem., 1993, 268,16286-16292; Davis et al., Biochemistry 1996, 35, 2482-2488; Lim et al., Anal. Biochem., 2001, 295, 45-56;Bondarenko et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 2002, 219, 671-680). Модификации остатков цистеина изменяют активность белка. Например, ковалентное связывание глутатиона с гемоглобином повышает связывающие кислород свойства у данного белка (Craescu et al., J. Biol. Chem., 261, 14710-14716, 1986). В другом примере связывающие жирные кислоты белки печеночного типа (LABP) теряют аффинность связывания после цистеинилирования и глутатионилирования (Dormann et al., J. Biol. Chem., 1993, 268,16286-16292). Активность протеазы ВИЧ-1 регулируется посредством цистеинилирования и глутатионилирования (Davis et al., Biochemistry 1996, 35, 2482-2488). Имеются сообщения, что существует фракция человеческих антител в крови, которая содержит непарный цистеин. Например, в одной работе было показано, что легкая цепь иммуноглобулина лямбда-типа имеет свободный цистеин в положении 33, так что легкая цепь в целом имеет шесть остатков цистеина (Buchwald et al., Can. J. Biochem., 1971, 49, 900902). Указывалось, что данный свободный цистеин является характерным признаком легких цепей, относящихся к подклассу III лямбда. Несмотря на имеющиеся сообщения о наличии непарных цистеинов в молекулах IgG, отсутствуют-1 012162 сообщения о цистеинилировании непарных цистеинов. Детектирование цистеинилирования может быть аналитически трудным, и отсутствие наблюдений цистеинилирования в более ранних работах может быть результатом использования восстановления на одной из стадий анализа (восстановление будет элиминировать цистеинилирование). Цистеинилирование, когда имеется в CDR-области, может оказывать влияние ка биологическую активность, как это имеет место в случае 146 В 7, полностью человеческого антитела против человеческого IL-15. Элиминация цистеинилирования посредством рефолдинга способствует сведению до минимума гетерогенности, поскольку при этом повышается гомогенность продукта. Элиминация цистеинилирования посредством рефолдинга также приводит к повышению эффективности продукта. Имеется существенная вероятность того, что цистеинилирование имеет место в других молекулах IgG, содержащих один или более непарных цистеинов, и элиминация цистеинилирования может быть ключом для фармацевтической жизнеспособности таких продуктов. В публикации РСТ WO 02/68455 раскрывается способ рефолдинга гибридного белка Fc-рецептора фактора некроза опухолей. Белок был создан путем генно-инженерного слияния Fc-области IgG1 антитела и двух рецепторов фактора некроза опухолей (TNFr), и он не существует в природе. Работа не относится к белкам, которые имеют гетерогенные структуры за счет присутствия по меньшей мере одного свободного или непарного цистеина, т.е. цистеина, который не принимает участия в образовании дисульфидной связи. Известно, что существуют сложные белки, несущие свободные цистеины, и, по меньшей мере, некоторые иммуноглобулины представляют собой пример таких промышленно доступных белков. В частности, следует отметить, что в WO 02/68455 не приводятся примеры процессинга природных молекул, таких как иммуноглобулины, и не обсуждаются или упоминаются проблемы укладки крупных сложных белков, которые содержат свободные или непарные цистеины. В условиях in vitro укладка белковых телец включения, продуцируемых клетками микроорганизмов(Е. coli), хорошо описана в литературе, и она включает в себя две стадии. Первая заключается в том, что белковые тельца включения солюбилизируются в присутствии высоких концентраций хаотропного агента и восстановителя для разрыва всех дисульфидных связей (Middelberg A.P. Preparative protein refolding.Trends Biotechnol., 2002, 20, 437-443). Например, раствор для солюбилизации телец включения содержит 6 М гуанидингидрохлорида и 100 мМ DTT, как представлено в обзоре Rudolph R.; Lilie H. In vitro foldingof inclusion body proteins. FASEB J. 1996, 10, 49-56. Второй стадией является укладка белка в присутствии средней концентрации гуанидингидрохлорида (0,5-1,0 М) и низкого редокс-потенциала в окружении(Middelberg A.P. Preparative protein refolding. Trends Biotechnol. 2002, 20, 437-443). Данное изобретение не включает в себя стадию солюбилизации белка посредством полной денатурации и восстановления всех дисульфидных связей в присутствии высоких концентраций хаотропного агента и восстановителя. В способе согласно изобретению отсутствует денатурация белка или имеет место только денатурация и восстановление/окисление (перегруппировка) нескольких дисульфидов. Данное изобретение относится к белкам, которые продуцируются в клетках млекопитающих. Продуцирование клетками млекопитающих включает в себя укладку белка и образование дисульфидных связей в условиях in vivo, в то время как клетки микроорганизмов синтезируют белки в виде нерастворимых, развернутых, плотных белковых агломератов со смешанными дисульфидами (тельца включения). Поскольку в клетках млекопитающих большая часть дисульфидных связей связана правильно, то нет необходимости в полной денатурации белка и восстановлении всех дисульфидных связей. В патенте США 4766205 констатируется, что продукция рекомбинантных белков сдерживается образованием не соответствующих внутримолекулярных дисульфидных связей, что приводит к образованию ненативных конформаций рекомбинантного белка, которые являются замороженными в том смысле, что они не могут легко превращаться в нативную конформацию. Такие ненативные продукты по меньшей мере частично являются биологически неактивными. В имеющем к этой проблеме отношение патенте США 4766205 раскрывает способ, который включает в себя воздействие на белок восстановителя, добавление образующего аддукт дисульфидного соединения, с последующим добавлением окислителя при координированном во времени удалении восстановителя. В подробном описании изобретения указано, что белки подвергаются солюбилизации при полной денатурации и восстановлении дисульфидных связей. Число используемых стадий и количество необходимых соединений делают данный подход громоздким. Следует отметить, что в патенте США 4766205 не обсуждается применение раскрытого способа для рефолдинга продуцируемых млекопитающими белков и крупных сложных белков,которые образуются при межмолекулярном связывании, таких как иммуноглобулины. В приведенном выше обсуждении показано, что остается большая потребность и интерес в разработке систем для эффективного и экономичного продуцирования, очистки и анализа активных крупных полипептидов, где желаемый полипептид продуцируется, например, рекомбинантными способами, так что продуцируемый в результате полипептид обеспечивается в активной конформации или, соответственно, легко подвергается процессингу и ренатурации в функциональное состояние. Кроме того, не смотря на тот факт, что имеются способы, которые широко применяются в анализе низкомолекулярных белков, таких как инсулин, или низкомолекулярных переваров более крупных белков, остается потребность в дополнительных способах и методах получения последовательности и подробной информации по конформации более крупных белков, в частности, белков, имеющих более чем одну субъединицу, которые-2 012162 образуются при межмолекулярном взаимодействии. Настоящее изобретение относится к поиску решений, направленных на удовлетворение данных потребностей. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к обеспечению эффективного и экономичного продуцирования,очистки и анализа активных полипептидов, которые обладают доказанной устойчивостью к существующим способам рекомбинантной продукции за счет присутствия беспорядочных дисульфидных связей и свободных или непарных остатков цистеина. Конкретнее изобретение относится к способам рефолдинга белков с улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами. Как будет подробно описано ниже, добавление связующих окислительно-восстановительных реагентов (редокс-реагентов) может способствовать образованию подобных нативным дисульфидных связей в рекомбинантных белках и, таким образом, получению структурно гомогенных, более активных форм молекулы. В одном аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантного IgG-антитела (например, IgG1 и IgG2, IgG3 или IgG4 антитела), включающему в себя приведение полипептида, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающих, в контакт со связующим окислительно-восстановительным реагентом при значении рН в пределах примерно от 5 до примерно 11. Способ может необязательно включать в себя взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до,после или одновременно с указанным взаимодействием со связующим окислительно-восстановительным реагентом. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой рекомбинантныйIgG1. Конкретнее, IgG1 является IgG1, имеющим по меньшей мере один свободный остаток цистеина. Примером такого антитела является антитело, обозначенное как 146 В 7 в публикациях патентов США 2003/0138421; 2003/023586 и 2004/0071702, которые в полном объеме включены в данное описание в виде ссылки. В других предпочтительных вариантах осуществления IgG представляет собой молекулуIgG2. Предпочтительно способ уменьшает гетерогенность молекулы IgG2. Другие варианты осуществления включают в себя способы рефолдинга молекул IgG4 с целью снижения количества полумолекулIgG4 (называемых здесь полумерами). Следовательно, способы согласно изобретению относятся, в частности, к рефолдингу рекомбинантных форм IgG-антител. Примером получения такого IgG-антитела является получение рекомбинантного антитела путем рекомбинантной экспрессии такого антитела в клетках СНО. Пример IgG-антитела описан в вышеуказанных публикациях патентов США, антитело 146 В 7 представляет собой полностью человеческое антитело, т.е. IgG1, против человеческого IL-15. Как уже указывалось выше, некоторые варианты осуществления изобретения относятся к рекомбинантному IgG-антителу, которое имеет свободный или непарный остаток цистеина. Подразумевается, что антитело с непарным цистеином содержит один или более свободных остатков цистеина, где свободный остаток цистеина определяется как аминокислота в тяжелой цепи или легкой цепи полипептида антитела, которая, как правило, не принимает участия в образовании дисульфидной связи, но находится вблизи дисульфидной пары цистеинов, и если дисульфидная связь данной пары разорвана, то свободный цистеин способен образовывать другую дисульфидную связь с одним из ранее парных цистеинов. Также подразумевается, что антитело со свободным цистеином может принимать более чем одну конформацию, в зависимости от того, какие именно цистеины подвергаются попарному связыванию. Понятно также, что антитело со свободным цистеином способно принимать более чем одну конформацию, в зависимости от того, является ли остаток цистеина цистеинилированным или глутатионилированным. В соответствии с вышепредставленным, один из аспектов изобретения относится к способу получения рекомбинантного IgG-антитела, включающему в себя взаимодействие молекулы IgG, которая продуцирована рекомбинантным путем в клетках млекопитающих, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11; и необязательно дополнительное взаимодействие молекулы IgG с хаотропным агентом до, после или одновременно с взаимодействием со связующим окислительно-восстановительным реагентом. Таким образом, способы включают получение препарата такой рекомбинантной молекулы IgG,включающее взаимодействие молекулы IgG, которая продуцирована рекомбинантным путем клетками млекопитающих (т.е. рекомбинантного IgG), со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11; необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием со связующим окислительно-восстановительным реагентом; и необязательно выделение фракции обработанного препарата рекомбинантной молекулы IgG, где IgG повторно уложен в желаемую конформацию. Конкретнее, значение рН связующего окислительно-восстановительного реагента находится в пределах примерно от 7 до примерно 10; еще конкретнее, значение рН связующего окислительно-восстановительного реагента находится в пределах примерно от 7,6 до примерно 9,6. В конкретных, неограничивающих примерных вариантах осуществления, значение рН связующего окислительно-восстановительного реагента равняется примерно 8,0; в других вариантах осуществления значение рН составляет примерно 8,6. Способ проводят при температуре от -20 до 37 С, конкретнее от -10 до +8 С. В конкретных вариантах осуществления способ проводят при 4 С. Реагент редокс-сопряжения может представлять собой любой реагент(ы) редокс-сопряжения. В не-3 012162 которых вариантах осуществления реагент редокс сопряжения включает восстановленный глутатион и окисленный глутатион. Конкретнее, в некоторых вариантах осуществления соотношение восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону в связующем окислительно-восстановительном реагенте составляет примерно от 1:1 до примерно 100:1. В других конкретных вариантах осуществления связующий окислительно-восстановительный реагент содержит смесь цистеин/цистин. В частности, связующий окислительно-восстановительный реагент содержит примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистеина и примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистина. В еще одних вариантах осуществления цистеин и цистин находятся в соотношении цистеин/цистин, равном примерно от 1:1 до примерно 10:1. В конкретных,неограничивающих примерных вариантах осуществления, связующий окислительно-восстановительный реагент содержит примерно 6 мМ цистеина и примерно 1 мМ или примерно 6 мМ цистина. В некоторых вариантах осуществления способ получения рекомбинантной молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) включает соотношение цистеин/цистин, равное примерно 6 мМ цистеина и примерно 6 мМ цистамина. Взаимодействие с редокс-реагентом можно проводить в течение любого подходящего периода времени, достаточного для того, чтобы имели место развертывание и рефолдинг. В некоторых вариантах осуществления стадию взаимодействия с реагентом редокс-сопряжения, и затем с или без хаотропного агента, проводят в течение примерно 30 мин или более. В некоторых вариантах осуществления стадия взаимодействия с реагентом редокс-сопряжения, с или без хаотропного агента проводят в течение примерно от 4 мин до примерно 48 ч. В других аспектах изобретения взаимодействие со связующим окислительно-восстановительным реагентом включает обеспечение связующего окислительно-восстановительного реагента в культуральной среде культуры клеток (т.е. в среде для культивирования клеток), из которой получают рекомбинантный IgG. В некоторых вариантах осуществления способа получения рекомбинантного IgG-антитела стадия взаимодействия включает в себя взаимодействие, по меньшей мере, частично очищенного (или частично выделенного) препарата рекомбинантного IgG со связующим окислительно-восстановительным реагентом. Вне зависимости от того, является оно частично очищенным или нет, предполагается, что концентрация рекомбинантного IgG находится в возрастающем порядке в пределах примерно от 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл. Способы согласно изобретению могут дополнительно включать в себя дополнительную стадию взаимодействия выделенного рекомбинантного белка, который подвергнут рефолдингу по способам,описанным выше, с дополнительной композицией, содержащей связующий окислительно-восстановительный реагент. Несмотря на то, что в некоторых вариантах осуществления используются восстановитель и окислитель, также предусматривается, что можно использовать один восстановитель. В еще одном аспекте изобретения способ получения рекомбинантного полипептида включает в себя взаимодействие полипептида с хаотропным агентом до, после или одновременно с взаимодействием полипептида со связующим окислительно-восстановительным реагентом. Хаотропный агент представляет любое хаотропное вещество или физическое состояние, известное в данной области. Примерный хаотропный агент выбран из группы, состоящей из мочевины, аргинина, додецилсульфата натрия и гуанидингидрохлорида. В конкретных вариантах осуществления хаотропный агент представляет собой гуанидингидрохлорид. Также хаотропный агент включает низкую температуру, где температура является достаточно низкой для того, чтобы вызвать структурную перестройку, например, IgG; в частности, предусматривается температура в пределах от нуля до -30 С. Концентрация любого из соединений хаотропных агентов, таких как гуанидингидрохлорид, может варьировать в зависимости от конкретных состояний,однако, в некоторых вариантах осуществления концентрация агента, например, гуанидингидрохлорида, в реакционной смеси находится в пределах примерно от 0,1 М до примерно 1 М, и в других вариантах осуществления реакционная смесь содержит примерно от 0,1 М до примерно 1,5 М. В конкретных вариантах осуществления концентрация в реакционной смеси составляет примерно 0,5 М. В еще одних примерных вариантах осуществления концентрация агента, например, гуанидингидрохлорида, в реакционной смеси равняется примерно 0,9 М. Известно, что высокое давление (1000-3000 бар), повышенная температура (примерно 55 С), спирт (до 30%), низкое значение рН (ниже 3,5) приводят к частичному развертыванию IgG-антител и могут выполнять роль хаотропного агента. Можно использовать два или более из данных нарушающих укладку элементов. Другой аспект изобретения относится к способу получения рекомбинантного полипептида, как описано выше, дополнительно включающему выделение взаимодействующего полипептида или выделение фракции взаимодействующего полипептида, имеющего после рефолдинга желаемую конформацию. Стадия выделения, использованная здесь, может представлять любую стадию выделения, обычно применяемую для выделения белков. Стадия выделения может включать в себя один или более методов, выбранных из группы, состоящей из обращенно-фазовой хроматографии (например, ВЭЖХ), гельхроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии и электрофореза, например, капиллярного электрофореза. В вариантах осуществления, в которых применяется ВЭЖХ, выделение включает в себя нанесение образца препарата рекомби-4 012162 нантного IgG рекомбинантного белка на колонку для обращенно-фазовой хроматографии; отделение рекомбинантного IgG от других компонентов, препарата элюированием молекулы рекомбинантного IgG обращенно-фазовой ВЭЖХ, где колонку для ВЭЖХ нагревают до температуры примерно от 50 С до примерно 90 С; и где подвижная фаза при обращенно-фазовой ВЭЖХ включает смешиваемый с водой органический растворитель, имеющий коэффициент элюотропной силы для C18, равный по меньшей мере 6,0, где способ дает гомогенную популяцию молекул IgG по сравнению с аналогичным способом,проводимом при отсутствии связующего окислительно-восстановительного реагента, или параметрах разделения ВЭЖХ. Рекомбинантный IgG можно также выделить с использованием катионообменной хроматографии. Гомогенная популяция антитела означает популяцию антитела, которая включает в себя в основном одну форму антитела, например, по меньшей мере 90% антитела в растворе или композиции находится в правильно уложенной форме. Аналогично гомогенная популяция полипептида,имеющего свободный или непарный цистеин, означает популяцию указанного полипептида, которая включает в основном одну, правильно уложенную форму. Концентрация рекомбинантного IgG в способах согласно изобретению может представлять любую концентрацию IgG, которая доступна для рефолдинга. При этом концентрация IgG может быть промышленного порядка (в отношении массы в г) дляIgG (например, промышленное количество конкретного IgG) или альтернативно может представлять миллиграммовые количества. В конкретных вариантах осуществления концентрация молекулы рекомбинантного IgG в реакционной смеси составляет примерно от 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл, конкретнее 10 мг/мл или 15 мг/мл. В частности, предусматриваются молекулы рекомбинантного IgG1 в данных концентрациях. В некоторых вариантах осуществления молекулы рекомбинантного IgG взаимодействуют со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН, равном примерно 8,0. В других аспектах изобретения способы согласно изобретению отличаются тем, что взаимодействие со связующим окислительно-восстановительным реагентом дает по меньшей мере 2-кратное повышение биологической активности рекомбинантного IgG-антитела (например, IgG1-, IgG2-, IgG3- илиIgG4-антитела) по сравнению с тем же IgG-антителом, которое не подверглось рефолдингу, за счет обеспечения увеличения концентрации активной формы IgG в препарате, полученном способом на основе обработки связующим окислительно-восстановительным реагентом. В других аспектах изобретения взаимодействие с хаотропным агентом дает по меньшей мере двукратное повышение биологической активности препарата IgG по сравнению с тем же антителом, которое не подвергалось рефолдингу, за счет обеспечения увеличения концентрации активной формы IgG в препарате, полученном способом на основе обработки хаотропным агентом. В еще одних вариантах осуществления взаимодействие рекомбинантного полипептида со связующим окислительно-восстановительным реагентом и затем взаимодействие с хаотропным агентом дает полипептид, имеющий по меньшей мере двукратное повышение биологической активности полипептида по сравнению с тем же полипептидом, который не подвергался взаимодействию. В еще одних вариантах осуществления суммарный эффект взаимодействия с хаотропным агентом и со связующим окислительно-восстановительным реагентом дает по меньшей мере 3-кратное повышение биологической активности препарата IgG по сравнению с тем же антителом, которое не подвергалось рефолдингу, за счет обеспечения увеличения концентрации активной формы IgG в препарате, полученном способом на основе обработки комбинацией связующего окислительно-восстановительного реагента и хаотропного агента. При использовании рефолдинга в способах, описанных здесь, возрастает концентрация желаемой конформационной формы белка (обогащенное или повышенное количество). Во время проведения стадии выделения IgG после рефолдинга выделяют больше грамм желаемой конформационной формы. Во время проведения стадии выделения без рефолдинга выделяют меньше грамм желаемой конформационной формы. Способы, описанные здесь, обеспечивают по меньшей мере 2-кратное или 3 кратное повышение биологической активности посредством увеличения концентрации активной формы в пределах от 40% по меньшей мере до 80% или от 30% по меньшей мере до 90%. Способ рефолдинга превращает не активные (или менее активные) молекулы IgG в (более) активный IgG. В конкретном варианте осуществления изобретения хаотропный агент представляет собой гуанидингидрохлорид, присутствующий в реакционной смеси в конечной концентрации в пределах примерно от 0,1 М примерно до 1,5 М. Способы согласно изобретению дополнительно отличаются тем, что они обеспечивают более компактную структуру IgG, в которой рекомбинантный IgG, подвергшийся рефолдингу в присутствии связующего окислительно-восстановительного реагента и хаотропного агента, приводит к изменению компактности структуры белка IgG. При обработке рекомбинантного IgG редокс-реагентами и хаотропным агентом IgG становится менее компактным (по данным анализа эксклюзионной гель-хроматографии и ЖХ/МС) по сравнению с необработанным веществом, и IgG, обработанный только редокс-реагентами,становится более компактным. Способы согласно изобретению обеспечивают популяцию IgG, которую можно дополнительно обработать, разделив эту популяцию молекул IgG, полученных указанным способом, на части и поместив их в стерильные объемы. В других вариантах осуществления получают стерильную разовую лекарственную форму, содержащую популяции молекул IgG, полученных указанным способом.-5 012162 Также изобретение относится к способам лечения субъекта, нуждающегося в молекуле рекомбинантного IgG, включающим в себя введение субъекту гомогенной популяции молекулы IgG, полученной способами согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя внутривенное или подкожное введение молекулы IgG. Также настоящим изобретением предусматривается способ цистеинилирования белка IgG, имеющего свободный или непарный цистеин, и повышение относительного количества желаемой конформационной изоформы без цистеинилирования, включающий в себя взаимодействие данных белков со связующим окислительно-восстановительным реагентом. Такие белки включают, например, IgG1. Также настоящим изобретением предусматривается способ повышения стабильности при хранении,стабильности к нагреванию, гомогенности или кристаллических свойств белка, имеющего свободный или непарный цистеин, включающий в себя взаимодействие указанного белка со связующим окислительно-восстановительным реагентом. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок/антитело представляет собой высокомолекулярный белок с молекулярной массой, равной примерно 90 кДа. В близком аспекте изобретения способ получения рекомбинантного полипептида включает в себя стадию взаимодействия, где взаимодействие обеспечивает полипептид, который является более стабильным при хранении по сравнению с тем же полипептидом, не подвергшимся взаимодействию. Примерные варианты осуществления включают в себя способы, в которых взаимодействие обеспечивает полипептид, который является более термостабильным по сравнению с тем же самым полипептидом, не подвергшимся взаимодействию. В других вариантах осуществления способ получения рекомбинантного полипептида включает в себя стадию взаимодействия, где взаимодействие обеспечивает полипептид,который имеет повышенную способность к кристаллизации по сравнению с тем же полипептидом, не подвергшимся взаимодействию. Также настоящее изобретение включает популяцию рекомбинантных IgG-антител, полученных способами, описанными здесь. Например, изобретение включает препарат полипептида, имеющего по меньшей мере один свободный остаток цистеина, полученный способом получения рекомбинантного полипептида, описанным здесь, где препарат имеет гомогенную популяцию полипептида, такого как полипептид IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. В близком аспекте препарат содержит рекомбинантное IgG-антитело и дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель (т.е. препарат включает фармацевтическую композицию). Примерным вариантом осуществления данного аспекта изобретения является препарат рекомбинантного полипептида, содержащего по меньшей мере один свободный остаток цистеина. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит популяцию, например, гомогенную популяцию молекулы IgG, и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В изобретении предполагается любой известный путь введения препаратов, содержащих полипептид и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, такой как внутримышечная, парентеральная, внутривенная или подкожная инъекция или имплантация, введение через уретру, ректально или ретробульбарно и пр. Другие конкретные аспекты изобретения связаны со способами получения препарата IgG-антитела,включающими в себя взаимодействие очищенного препарата IgG-антитела, которое продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и необязательно дополнительное взаимодействие препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно со взаимодействием со связующим окислительновосстановительным реагентом. В таких способах IgG-антитело может быть выбрано из группы, состоящей из IgG1-, IgG2-, IgG3- иIgG4-антитела или его фрагментов, которые проявляют гетерогенность. Такая гетерогенность может быть результатом присутствия мономеров IgG, мультимеров IgG, полумолекул IgG иди других фрагментов молекулы IgG. В некоторых вариантах осуществления IgG-антитело представляет собой IgG2-антитело, которое элюируется в виде нескольких отдельных форм при ОФ-ВЭЖХ, и способ приводит к снижению количества форм, элюированных при ОФ-ВЭЖХ, или изменению относительного распределения нескольких отдельных форм при ОФ-ВЭЖХ. В таких конкретных вариантах осуществления способ предпочтительно повышает содержание по меньшей мере одной из нескольких отдельных форм в препарате по данным ОФ-ВЭЖХ. Конкретнее, предпочтительно обогащенная форма обладает фармацевтически желаемым свойством по сравнению с препаратом, не подвергшимся обработке указанным способом. Термин предпочтительно обогащенная означает повышение относительного содержания желаемой формы или повышение относительной доли желаемой формы. Фармацевтически желаемые свойства,в том смысле, в котором здесь используется данное выражение, включают в себя, но не ограничиваются этим, повышенную стабильность, пониженную вязкость, более длительный период полураспада в крови. Например, посредством применения способов согласно изобретению получают препарат, который является стабильным при температуре примерно 2-8 С по меньшей мере в течение 1 года; примерно при 25 С- по меньшей мере в течение 1 месяца; после замораживания и оттаивания. Кроме того, более стабиль-6 012162 ным препаратом является такой препарат, который образует меньшее количество димеров, агрегатов,фрагментов, частиц по сравнению с тем же IgG-антителом, не подвергшимся взаимодействию. Желаемый препарат, полученный способами согласно изобретению, представляет собой препарат IgG-антитела(или фрагмента IgG-антитела), который обладает более низкой вязкостью по сравнению с тем же IgGантителом (или фрагментом IgG-антитела), не подвергшимся взаимодействию со связующим окислительно-восстановительным реагентом и необязательным хаотропным агентом, описанными здесь. Другим желаемым препаратом IgG-антитела (или фрагмента IgG-антитела), полученным способами согласно изобретению, является таковой, который имеет более длительный период полураспада в крови по сравнению с IgG-антителом (или фрагментом IgG-антитела) того же класса, не подвергшимся взаимодействию с окислительно-восстановительным реагентом и необязательным хаотропным агентом, описанными здесь. В некоторых вариантах осуществления такой желаемый препарат имеет период полураспада в крови на 20% больше по сравнению с IgG-антителом (или фрагментом IgG-антитела) того же класса, не подвергшимся взаимодействию с окислительно-восстановительным реагентом и необязательным хаотропным агентом, описанными здесь. Термин период полураспада, в том смысле, в котором он здесь используется, означает время, в течение которого концентрация препарата в плазме крови (в настоящих примерах IgG-антитела или его фрагмента) достигала половины от исходного значения на нулевой период времени. В других вариантах осуществления IgG-антитело представляет собой рекомбинантное IgG1 антитело, содержащее по меньшей мере один свободный остаток цистеина, или фрагмент рекомбинантного IgG1-антитела, содержащего по меньшей мере один свободный остаток цистеина. В других вариантах осуществления IgG-антитело представляет собой IgG4-антитело, и способ приводит к снижению образования полумолекул IgG4. В конкретных вариантах осуществления предусматривается, что способ не включает взаимодействия препарата с хаотропным агентом. Значение рН связующего окислительно-восстановительного реагента находится в пределах примерно от 5 до примерно 10; например, от 7,6 до примерно 9,6 или конкретнее примерно от 8,0 до 8,6. Связующий окислительно-восстановительный реагент включает в себя восстановленный глутатион и окисленный глутатион. Например, соотношение восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону составляет примерно от 1:1 до примерно 100:1. В других вариантах осуществления связующий окислительно-восстановительный реагент содержит смесь цистеин/цистин. Например, смесь цистеин/цистин содержит примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистеина. В других примерах реагент редокс сопряжения включает примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистина, и экзогенный цистеин не вносится. В еще одних примерах смесь цистеин/цистин имеет соотношение цистеин:цистин, равное примерно от 1:1 до примерно 10:1. В других примерах смесь цистеин/цистин содержит примерно 6 мМ цистеина и примерно 1 мМ цистина. В еще одних примерах смесь цистеин/цистин включает примерно 6 мМ цистеина и примерно 6 мМ цистамина. Способы могут включать в себя стадию взаимодействия, которую проводят по меньшей мере в течение 30 мин. В других примерах стадию взаимодействия проводят в течение примерно от 4 до 48 ч. В конкретных примерах рекомбинантное IgG-антитело выделяют из среды, в которую оно было секретировано перед взаимодействием. В других вариантах осуществления взаимодействие имеет место,когда рекомбинантное IgG-антитело находится в среде, в которую оно было секретировано. В еще одних вариантах осуществления рекомбинантное IgG-антитело частично выделяют из среды, в которую оно было секретировано, т.е. например, клетки и другое вещество в виде частиц удаляют из среды перед взаимодействием. В конкретных вариантах осуществления способы согласно изобретению включают в себя множественные стадии взаимодействия рекомбинантного IgG-антитела со связующим окислительно-восстановительным реагентом. В конкретных вариантах осуществления способы согласно изобретению включают в себя выделение IgG-антитела из культуральной среды клеток млекопитающих в способе, включающем в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgGантитело или фрагмент IgG-антитела; добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из клетки. Такое выделение может включать одну или более стадий хроматографии. Способы согласно изобретению можно проводить в среде или другой композиции, которые имеют концентрацию рекомбинантного IgG-антитела в пределах примерно от 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл. Способы согласно изобретению являются таковыми, что в результате взаимодействия обеспечивается IgG-антитело, которое является более стабильным при хранении по сравнению с тем же IgGантителом, которое не подвергалось взаимодействию. Способы согласно изобретению являются таковыми, что в результате взаимодействия обеспечивается IgG-антитело, которое является более термостабильным по сравнению с тем же IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию. В других вариантах осуществления в результате взаимодействия обеспечивается IgG-антитело, которое обладает повышенной способностью к кристаллизации по сравнению с тем же IgG-антителом, которое не подвер-7 012162 галось взаимодействию. В том смысле, в котором он здесь используется, термин способность к кристаллизации относится к росту, морфологии, размеру, однородности кристаллов, выходу кристаллов, суспендируемости кристаллов или другому свойству кристалла IgG, которое способствует его приготовлению в виде фармацевтического препарата. Предпочтительно кристалл будут использовать в растворе, один или в комбинации с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или наполнителем. Взаимодействие со связующим окислительно-восстановительным реагентом (и необязательно хаотропом) обеспечивает популяцию IgG-антитела, которая является более гомогенной по сравнению с такой же популяцией IgG-антитела, которая не подвергалась взаимодействию. В других аспектах взаимодействие обеспечивает IgG-антитело, имеющее по меньшей мере двукратное повышение биологической активности по сравнению с таким же IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию. В конкретных вариантах осуществления в способе предусматривается взаимодействие IgG-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с взаимодействием со связующим окислительновосстановительным реагентом. Хаотропный агент может быть выбран из группы, состоящей из мочевины, аргинина, додецилсульфата натрия и гуанидингидрохлорида. В предпочтительных вариантах осуществления хаотропный агент включает гуанидингидрохлорид. В некоторых вариантах осуществления концентрация гуанидингидрохлорида находится в пределах примерно от 0,1 М до примерно 1,5 М. В других - концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно от 0,1 М до примерно 1 М. В конкретном варианте осуществления концентрация гуанидингидрохлорида равняется примерно 0,5 М. В других конкретных вариантах осуществления концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно 0,9 М. В конкретных вариантах осуществления взаимодействие со связующим окислительно-восстановительным реагентом и дополнительное взаимодействие с хаотропным агентом обеспечивает IgGантитело, имеющее по меньшей мере трехкратное повышение биологической активности по сравнению с таким же IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию. Способы согласно изобретению также могут включать в себя формуляцию IgG-антитела, полученного способами, в стерильную объемную форму. В других вариантах осуществления способы дополнительно включают формуляцию IgG-антитела, полученного способом, в стерильную разовую лекарственную форму. В еще одних вариантах осуществления способы дополнительно включают выделение фракции подвергшегося взаимодействию IgG-антитела, имеющего после рефолдинга желаемую конформацию. Такая методика выделения выбрана из группы, состоящей из обращенно-фазовой ВЭЖХ, гельхроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии и электрофореза. В конкретных вариантах осуществления методом выделения является ионообменная хроматография. Также здесь предусматривается препарат IgG-антитела, полученный способами, описанными здесь,где препарат имеет гомогенную популяцию IgG-антитела. Препарат может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. Также предусматривается композиция, содержащая гомогенную популяцию рекомбинантного IgGантитела и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. Композиция может содержать IgG1-антитело, IgG2-антитело, IgG4-антитело или IgG-мономеры IgG1, IgG2 или IgG4, IgGмультимеры полумолекул IgG1, IgG2 или IgG4 или другие фрагменты таких молекул IgG. Предусматриваются также способы лечения субъекта такими гомогенными популяциями. В таких способах введение может быть, например, подкожным или внутривенным введением. Также предусматривается способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного IgGантитела во время его производства, формуляции и/или хранения, включающий в себя: а) взаимодействие препарата IgG, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающих, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11, и необязательно дополнительное взаимодействие препарата с хаотропным агентом до,после или одновременно с взаимодействием со связующим окислительно-восстановительным реагентом;b) расщепление молекулы IgG, которая была обработана на стадии а) на фрагменты; иc) проведение хроматографического анализа интактного IgG и/или фрагментов со стадии b), тем самым детектирования или мониторинга качества молекулы IgG. В таких способах IgG-антитело представляет собой IgG1-антитело, и мониторинг качества включает в себя мониторинг статуса определение состояния свободного или непарного цистеина IgG1-антитела. В других таких способах IgG-антитело представляет собой IgG2-антитело, и мониторинг качества включает в себя мониторинг числа форм IgG2 с целью определения гетерогенности препарата. В других таких способах молекула IgG представляет собой молекулу IgG4, и мониторинг качества включает в себя мониторинг присутствия полумолекул IgG4. В некоторых аспектах хроматография включает анализ ЖХ/МС. В конкретных аспектах детектирование или мониторинг проводят во время стадии очистки молекулы IgG, где очистка включает в себя колоночную хроматографию. Также обеспечиваются способы получения рекомбинантного IgG-антитела или фрагмента IgGантитела, включающие в себя взаимодействие IgG-антитела или фрагмента IgG-антитела, которые были-8 012162 продуцированы рекомбинантным путем клетками млекопитающих, со связующим окислительновосстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11; и необязательно дополнительное взаимодействие IgG-антитела или фрагмента IgG-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с взаимодействием со связующим окислительно-восстановительным реагентом. В некоторых вариантах осуществления перед проведением таких способов IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела выделяют из культуральной среды клеток млекопитающих в способе, включающем в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела; добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из клетки. Очевидно, понятно, что рекомбинантное IgG-антитело может представлять собой IgG1, IgG2 илиIgG4. Способы согласно изобретению обеспечивают получение кристаллической формы интактного рекомбинантного IgG-антитела проведением способов рефолдинга, описанных здесь, и получение кристаллической формы рекомбинантного IgG-антитела. В некоторых вариантах осуществления перед получением таких кристаллов способы могут включать выделение рекомбинантного IgG-антитела, полученного способами, описанными здесь. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантное IgG-антитело присоединено к стационарной фазе хроматографической колонки и редокс-реагенты и хаотропные агенты являются частью подвижной фазы. В других вариантах осуществления связующий окислительно-восстановительный реагент является ферментом. В еще одних вариантах осуществления связующий окислительно-восстановительный реагент включает ионы двухвалентного металла и кислород. Также описанное здесь представляет способ получения препарата IgG-антитела, включающий в себя взаимодействие выделенного препарата IgG-антитела, которое было получено рекомбинантным путем клетками млекопитающих, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11; и необязательно дополнительное воздействие на препарат денатурации под высоким давлением до, после или одновременно со взаимодействием со связующим окислительно-восстановительным реагентом. Настоящее изобретение включает способ получения IgG-антитела или его фрагмента, включающий в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует или секретирует в культуральную среду IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела; и добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11; и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из клетки; и тем самым получение IgG-антитела или фрагментаIgG-антитела, имеющего улучшенные фармацевтические и кристаллизационные свойства по сравнению с IgG-антителом или его фрагментом, которое не было подвергнуто воздействию связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента. Описанное здесь представляет усовершенствование опосредованного клетками млекопитающих способа получения рекомбинантного IgG-антитела или фрагмента рекомбинантного IgG-антитела, где усовершенствование включает в себя добавление в культуральную среду, использованную для получения IgG-антитела или фрагмента IgG-антитела, связующего окислительно-восстановительного реагента при рН в пределах примерно от 5 до примерно 11; и необязательно хаотропного агента при секрецииIgG-антитела или фрагмента IgG-антитела в среду. Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из последующего подробного описания. Очевидно, понятно, что подробное описание и конкретные примеры, несмотря на описание некоторых вариантов осуществления изобретения, представлены только в качестве иллюстрации, поскольку из данного подробного описания специалистам в данной области станут понятными возможные различные изменения и модификации, которые находятся в пределах сущности и объема изобретения. Краткое описание фигур Последующие фигуры составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной иллюстрации аспектов настоящего изобретения. Изобретение будет легче понять при обращении к фигурам в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных здесь. На фиг. 1 представлены ОФ-хроматограммы двух рекомбинантных моноклональных антител человека с одинаковыми CDR и обеспеченных в виде IgG1 и IgG2. Имеется 95% аминокислотная гомология между двумя молекулами, но существует значительное различие в гомогенности препаратов антител в зависимости от того, являются ли они антителами IgG1 или IgG2. На фиг. 2 представлена (А) катионообменная хроматограмма цельного образца IgG2 и (В) обращенно-фазовые хроматограммы того же цельного образца IgG2 и собранных фракций при катионообменной хроматографии. На фиг. 3 представлена обращенно-фазовая хроматограмма IgG2 при детектировании по поглощению в УФ-свете при 215 нм и общему ионному току (TIC) масс-спектрометра. На фиг. 3 В представлены масс-спектры с использованием электрораспылительной ионизации структурных вариантов IgG2, элюированных с ОФ-колонки в виде пиков 1, 2, 3 и 4 с фиг. 3 А.structure and function. На фиг. 5 представлены предполагаемые структуры IgG1 и IgG4. Примечательно, что структураIgG4 является более компактной по сравнению со структурой IgG1. На фиг. 6 представлены данные по осаждению химерных IgG1, 2, 3 и 4 антител (взято из Phillips etal., Mol. Immunol., v.31, pp.1201-1210, 1994). Описание фигуры у Phillips et al. показывает, что на данной фигуре представлено осаждение химерных иммуногобулинов, содержащих области различных человеческих подклассов в присутствии и отсутствии бис-дансилкадаверина. (А) интегральные сканы иммуноглобулинов в отсутствие бивалентного гаптена. Условия центрифугирования: IgG1 - 20 С, 52000 об/мин последовательные интегральные сканы (280 нм) при 12 мин интервалах; IgG2 - 21,7C, 52000 об/мин последовательные интегральные сканы при 8 мин интервалах; IgG3 - 21,6 С, 52000 об/мин последовательные интегральные сканы при 8 мин интервалах; IgG4 - 20,7 С, 52000 об/мин последовательные интегральные сканы при 8 мин интервалах; (В) интегральные сканы иммуноглобулинов в присутствии эквимолярного количества бис-дансилкадаверина. Условия центрифугирования: IgG1 - 21,7 С, 42000 об/мин,при 12 мин интервалах; IgG2 - 21,4C, 44000 об/мин, при 8 мин интервалах; IgG3 - 21,7 С, 44000 об/мин,при 12 мин интервалах; IgG4 -21,7 С, 44000 об/мин при 12 мин интервалах; (С) распределение коэффициентов осаждения (без поправки на диффузию) различных подклассов в отсутствие (-) и присутствии(+) эквимолярного количества бис-дансилкадаверина. На фиг. 7 представлена структура IgG1-антитела в сравнении с предполагаемой структурой IgG2 антител. На фиг. 8 представлены ОФ-хроматограммы двух подвергшихся рефолдингу IgG2-антител. Примечательно, что подвергшаяся рефолдингу нативная форма и подвергшаяся рефолдингу в присутствии 0,89 М денатурирующего вещества, гуанидингидрохлорида, дают одинаковые хроматограммы с контрольным веществом IgG2. Когда рефолдингу подверглось четыре различных IgG2-антитела, то вновь получены одинаковые хроматограммы, когда присутствие смеси цистеин/цистин в течение 48 ч при комнатной температуре дает однородный один пик, также применение гуанидингидрохлорида в присутствии смеси цистеин/цистин в течение 48 ч при комнатной температуре дает один пик, который элюируется позднее,чем пик после обработки одной смесью цистеин/цистин, в то время как обработка смесью цистеин/цистин приводит к образованию гетерогенной смеси, имеющей много пиков, связанных с препаратомIgG2. Фиг. 9 - ОФ-хроматограмма интактного IgG1 из примера 9. Фиг. 10 - развернутый масс-спектр с использованием электрораспылительной ионизации (ESI) интактного IgG1 из примера 4. Фиг. 11 - ОФ-хроматограмма IgG1 из примера 1 после ограниченного протеолиза с участием Lys-Cпротеазы. Фиг. 12 - развернутые ESI масс-спектры пиков 1, 2 и 3 из фиг. 11. Фиг. 13 - развернутые ESI масс-спектры пиков 5 и 7 с ОФ-хроматограммы из фиг. 11. Фиг. 14 - ОФ-хроматограмма образцов IgG1 из примера 4 после ограниченного протеолиза. Фиг. 15 - развернутые масс-спектры пиков Fab с фиг. 14 для меченого и немеченого IgG1 из примера 4. Фиг. 16 - ОФ-хроматограммы подвергшегося стрессу и контрольного интактного IgG1 из примера 4. Фиг. 17 - схематичные клипы, обнаруженные в образце IgG1, инкубированном в буфере A5S в течение 1 месяца при 45 С. Фиг. 18 - сравнение различных молекул IgG1 обращенно-фазовой хроматографией после ограниченного протеолиза с участием Lys-C-протеазы. Фиг. 19 - катионообменная хроматограмма интактного контрольного и нативного подвергшегося рефолдингу IgG1 через 24 ч после рефолдинга. Фиг. 20 - ОФ-хроматограмма образцов интактного контрольного IgG1, продуцированного клетками СНО [далее во всех фигурах], после нативного рефолдинга и после рефолдинга при воздействии GuHCl через 24 ч инкубации. Фиг. 21 - ESI масс-спектры пика 1 (А) и пика 2 (В), разделенного на ОФ-хроматограмме веществаIgG1. Развернутые ESI масс-спектры пика 1 (С) и пика 2 (D). Фиг. 22 - развернутые ESI масс-спектры контрольного вещества IgG1 СНО (А), подвергшегося рефолдингу при воздействии GuHCl (В) и после нативного рефолдинга (только со связующим окислительно-восстановительным реагентом) (С). Фиг. 23 - схема ограниченного протеолиза с использованием Lys-C-протеазы с получением одногоFc-фрагмента, ММ=53488 Да и двух Fab-фрагментов, каждый с ММ=47282. Фиг. 24 - ОФ-хроматограмма IgG1 СНО после ограниченного протеолиза с использованием Lys-C: контрольное (обычное) вещество; после рефолдинга под действием GuHCl и образец после нативного рефолдинга. Фиг. 25 - развернутые ESI масс-спектры образцов Fab-фрагментов IgG1 СНО после ограниченного- 10012162 протеолиза с использованием Lys-C: (А) контрольное (обычное) вещество; (В) после рефолдинга под действием GuHCl и (С) образец после нативного рефолдинга. Фиг. 26 - пептидные карты Glu-C IgG1 CHO: (А) контрольное вещество и (В) образец после нативного рефолдинга. Фиг. 27 - гель-хроматограммы IgG1: контрольное вещество СНО, гибридомный и после рефолдинга, СНО. Фиг. 28 - определение CD и флуоресценции IgG1: контрольное вещество СНО, гибридомный и после рефолдинга, СНО. Фиг. 29 - обращенно-фазовые хроматограммы гибридомного IgG1 и продуцированного СНО после ограниченного протеолиза. Разделяли и количественно определяли цистеинилированные (Fab-Cys) и нецистеинилированные (Fab) фрагменты. Фиг. 30 - обращенно-фазовые хроматограммы IgG1 до и после рефолдинга после ограниченного протеолиза. Разделяли и количественно определяли цистеинилированные (Fab-Cys) и нецистеинилированные (Fab) фрагменты. Фиг. 31 - невосстановительное картирование пептидов IgG1 с использованием трипсина после мечения свободных цистеинов с помощью NEM при рН, равном 5. Установлена локализация цистеинилирования в положении С 104 тяжелой цепи. Фиг. 32 - идентификация окисления метионина 48 в CDR2-области тяжелой цепи. Небольшой процент М 48 в CDR2-области тяжелой цепи окисляли согласно данным невосстановительного пептидного картирования. Фиг. 33 - хроматограммы восстановленных ионов (сверху) и масс-спектры фрагментов (внизу) по данным невосстановительного пептидного картирования IgG1, показывающие идентификацию окисления метионина 48 в CDR2-области тяжелой цепи с использованием анализа МС/МС. Окислению подверглось примерно 10% метионина 48. Окисленный пептид выходит на 98 мин, неокисленный - на 110 мин. Фиг. 34 - спектр сканирующей дифференциальной калориметрии (DSC) IgG1 до и после обработки редокс-реагентом или рефолдинга. Фиг. 35 - SEC-ВЭЖХ хроматография на протеин А-колонке для аффинной хроматографии IgG1,выделенного из клеточной культуральной среды с обработкой редокс-реагентом или без обработки редокс-реагентом. Фиг. 36 - равновесная денатурация под действием GdnHCl контрольного и обработанного редоксреагентом, полученного из клеток СНО IgG1-антитела 146 В 7 по данным определения эмиссии флуоресценции при 360 нм. Обработанное редокс-реагентом IgG1-антитело 146 В 7 является более стабильным к химической денатурации, что показано сдвигом в значениях см примерно при концентрации GdnHCl,равной 0,7 М. Линии приведены в качестве ориентира для глаза и не представляют пределы значений. Фиг. 37 - данные гель-хроматографии (SEC) для сравнительного анализа контрольного и обработанного редокс-реагентом IgG1-антитела 146 В 7. Блок А представляет данные за три месяца по процентному снижению количества мономеров основного пика при хранении при температуре -80, 4, 29, 37 и 45 С. Блок В представляет данные за три месяца по процентному увеличению количества премономерных агрегатов при хранении при температуре -80, 4, 29, 37 и 45 С. Фиг. 38 - обращенно-фазовые (ОФ) хроматограммы трех антител с одинаковыми CDR в виде IgG1,IgG2 и IgG4. Для IgG2-антитела установлены множественные пики за счет структурной гетерогенности,о которой сообщалось ранее. IgG4 также является гетерогенным в структурном отношении. При денатурирующих условиях PR полумолекулы (1/2 IgG4) отделялись от ковалентно связанной молекулы IgG4(IgG4). Фиг. 39 - масс-спектры, полученные с использованием электрораспылительной ионизации (ESI),полумолекулы IgG4 (А) и ковалентно связанного IgG4 (В). Развернутые ESI масс-спектры полумолекулыIgG4 (С) и ковалентно связанного IgG4 (D). Данные точных масс-спектрометрических определений указывают на массу, составляющую 1/2 от массы IgG4 (73398 Да), точно соответствующую половине массыIgG4 (146796 Да), на основании чего можно предположить, что изменение дисульфидных связей приводит к образованию полумолекул. Изменение дисульфидных связей с находящихся между цепями на таковые внутри цепи теоретически будет приводить к образованию полумолекулы с массой, точно соответствующей половине, что экспериментально наблюдали в данном тесте. Фиг. 40 - фотография кристаллов IgG2, образовавшихся в условиях: 50 мг/мл IgG2, 50 мМ хлорида калия, рН 2,0, 20% ПЭГа 3350. Фиг. 41 - фотография кристаллов IgG2, образовавшихся в условиях: 50 мг/мл IgG2, 50 мМ хлорида калия, рН 2,0, 24% ПЭГа 3350. Фиг. 42 - фотография кристаллов IgG2, образовавшихся в условиях: 50 мг/мл IgG2, 50 мМ MES, рН 6,0, 20% ПЭГ 3350. Фиг. 43 - схематичное изображение IgG1- и IgG2-антител. IgG2 имеют уникальное соединение легкой цепи и двух дополнительных дисульфидов между цепями в шарнирной области. Цветовые обозначения: зеленый = тяжелая цепь (НС); синий = легкая цепь (LC); желтая пунктирная линия = внутренние- 11012162 дисульфидные связи; красный = дисульфидные связи между цепями; красные ромбики со стрелками = остатки цистеина, склонные к беспорядочному взаимодействию. Фиг. 44 - хроматограммы ОФ-ВЭЖХ интактных антител. Два подкласса IgG показывают существенно различающиеся хроматограммы при использовании данного метода. Для человеческого очищенного IgG2 производства Sigma характерен такой же гетерогенный профиль, как и для всех IgG2 производства Amgen. Фиг. 45(А) - обращенно-фазовая хроматограмма IgG2-антитела против IL-1R. (В) Развернутый масс-спектр, полученный с использованием электрораспылительной ионизации, множества изоформ,элюированных с колонки для обращенно-фазовой хроматографии в виде пиков 1, 2, 3 и 4. Значения MM для четырех пиков равняются: 147256; 147253; 147254; 147261 Да. Фиг. 46 - обращенно-фазовая хроматограмма IgG2-антитела до (А) и после (В) восстановления и алкилирования. Легкая цепь (LC) и тяжелая цепь (НС), элюированные в виде одного пика, после восстановления дисульфидных связей. Фиг. 47 - кривые биологического теста для IgG2-антитела против IL-1R, нативный редокс (форма 1) и GuHCl редокс (форма 3). Отмечали существенные различия в биологической активности окисленного,подвергшегося рефолдингу вещества. Тесты повторяли каждые 3 суток с обеспечением хорошей статистической значимости. Фиг. 48 - обращенно-фазовые хроматограммы других IgG2-антител, которые были обработаны в тех же условиях окислительного рефолдинга, как и IgG2-антитело. Все IgG2-антитела существенно отличались по ОФ-ВЭЖХ, что совпадало с данными предыдущих исследований по рефолдингу IgG2 антитела. Фиг. 49 - изображение кристаллической структуры шарнирной области человеческого моноклонального IgG1-антитела с использованием PDB координат входа 1 HZH. Цветовые обозначения: синим обозначены тяжелые цепи (НС) в шарнирной области; красным обозначена петля тяжелой цепи, включающая остаток S131; зеленым обозначены легкие цепи (LC). Пунктирные линии проведены к примерным положениям двух гибких областей, координаты которых не были определены кристаллографией за счет их гибкости: петля НС между S127 и Т 137, содержащая остаток S131 (красная пунктирная линия) и участок НС в шарнирной области между С 127 и С 226 (синия пунктирная линия). Фиг. 50 - обращенно-фазовые хроматограммы, показывающие эффект редокс-обработки на IgG2 антитело (против IL-1R) в присутствии различных концентраций GuHCl. Фиг. 51 - обращенно-фазовые хроматограммы, показывающие эффект редокс-обработки на IgG2 антитело (против IL-1R) в присутствии различных концентраций аргинина HCl. Фиг. 52 - обращенно-фазовые хроматограммы, показывающие эффект температуры инкубации во время редокс-обработки IgG2-антитела (против IL-1R). Подробное описание изобретения Окислительный рефолдинг белков, находящихся в состоянии включений, представляет собой распространенное явление при получении рекомбинантных белков с использованием прокариотов, но обычно это не характерно для способов получения рекомбинантных белков с применением эукариотических клеток. Это имеет место потому, что, как полагают, эукариотические клетки имеют достаточное количество клеточных механизмов для правильного рефолдинга продуцируемых рекомбинантных белков. Однако, как описано в заявках на патент США 60/548302, Dillon et al., поданной 27 февраля 2004,и 60/538982, Bondarenko et al., поданной 23 января 2004 (каждая включена здесь в полном объеме для сведения), в результате последних достижений в разделении и детектировании ОФ-ВЭЖХ было показано, что существует значительная конформационная гетерогенность в высокомолекулярных белках, полученных рекомбинантным путем, которые, как полагали ранее, являются гомогенными. Как обсуждалось в вышеуказанных заявках, причина гетерогенности по меньшей мере частично относится к беспорядочному взаимодействию дисульфидных связей. Недавно возродился интерес к структуре и функции молекул IgG в фармацевтической промышленности белков. Подклассы IgG1 и IgG2 привлекают особый интерес, поскольку они имеются в наибольшем количестве, являются длительно сохраняющимися и стабильными иммуноглобулинами в крови. Настоящее изобретение вызвано и относится к необходимости в способах получения рекомбинантных белков с более высокой гомогенностью в структурном отношении и конкретнее рекомбинантных IgGантител, продуцируемых клетками млекопитающих, и в частности, терапевтическим IgG1-, IgG2- и IgG4 антителам, с повышенной активностью. В нескольких предыдущих сообщениях высказывалось предположение, что молекулы IgG2 содержат свободные тиольные группы и в структурном отношении являются гетерогенными по сравнению с другими подклассами гамма-глобулинов. В одном сообщении приводятся данные по определению количества свободных тиольных групп для всех четырех человеческих IgG-антител взаимодействием с 5,5'дитио(2,2'-динитро)бензоатом (DTNB) (Schauenstein et al., 1986. Int. Arch. Allergy Immunol., v.80, pp.174179). Открытые свободные тиолы (примерно 0,24 на моль человеческого IgG) были отнесены к подклассу IgG2. Другие исследователи также сообщали, что все четыре подкласса человеческих IgG подверга- 12012162 лись восстановлению дисульфидных связей между цепями тиоредоксином с тиоредоксинредуктазой и НАДФН. Было установлено, что IgG2 отличается от других подклассов двумя свойствами: 1) он устойчив к восстановлению и 2) при нем расходуется реагент НАДФН. На основании последнего факта можно предположить, что реагент расходуется при восстановлении лабильных, расположенных между цепями или находящихся на поверхности смешанных дисульфидных связей. В еще одном исследовании были обнаружены ковалентно связанные димеры IgG2 в объединенной фракции человеческого гаммаглобулина и нескольких нормальных сыворотках (Yoo et al., 2003, J. Immunol., v.170, pp.3134-3138). Анализ расщепления димеров с помощью цианистого бромида указывал на то, что один или более остатков цистеина в шарнирной области участвуют в сборке димера, на основании чего вновь можно предположить о наличии свободных или лабильных цистеинов в шарнирной области IgG2. Phillips et al. (Mol. Immunol., v.31, pp.1201-1210, 1994) с использованием осаждения и электронной микроскопии установили наличие множественных форм молекул IgG2 и их комплексов с бивалентным гаптеном и только одну форму для трех других подклассов человеческих гамма-глобулинов. Согласно недавнему сообщению было установлено более чем 200 структур фрагментов антител, в основном Fab и Fab' (Saphire et al., 2002, J. Mol. Biol., v.319, pp.9-18). Имеется только десять сообщений о кристаллах интактных антител, и только семь из данных кристаллов имели частичную или полную структуру. Все эти структуры представляли собой мышиные IgG- или человеческие IgG1-антитела, но не человеческий IgG2 (Saphire et al., 2002, J. Mol. Biol., v.319, pp.9-18). Только три раза сообщалось о полных структурах IgG с полноразмерными шарнирными областями: mAb 231, мышиный IgG2a (Harris et al.,1992, Nature, v.360, pp.369-372; Larson et al., 1991, J. Mol. Biol., v.222, pp.17-19), mAb 61.1.3, мышиный(Saphire et al., 2001, Science, v.293, pp.1155-1159; Saphire et al., 2002, J. Mol. Biol., v.319, pp.9-18). Имеются фрагменты кристаллического изображения человеческого IgG1-антитела около шарнирной области изPDB ряда 1HZH (Saphire et al., 2001, Science, v.293, pp.1155-1159). Тот факт, что данные по кристаллической структуре человеческого IgG2 не отсутствуют, оставляет открытым вопрос о точной связи дисульфидов и также дает основание предположить, что данный подкласс IgG может быть гетерогенным, что делает его трудным объектом для кристаллизации. Также существует необходимость в новых способах структурного анализа. Заявители настоящего изобретения использовали новый, разработанный ими анализ интактных антител с использованием обращенно-фазовой хроматографии в комбинации с массспектрометрией для облегчения открытия и характеристики гетерогенности человеческих IgG2-антител(Dillon et al., 2004, J. Chromatogr. A., v.1053, pp.299-305). Установив, что имеется значительная конформационная гетерогенность у рекомбинантных IgG2 антител, экспрессированных клетками млекопитающих, заявители разработали способ рефслдинга для получения двух форм белка, как описано здесь в примерах 1-3. Обсуждалось влияние добавок, таких какGndHCl, глутатион, L-аргинин, на рефолдинг одноцепочечных уложенных иммуноглобулиновых белков(Umetsu et al., 2003, J. Biol. Chem., v.278, pp.8979-8987). Спонтанная укладка в 1M буфере GndHCl приводила к появлению структуры, в которой достигалось правильнее образование дисульфидных связей; однако добавление L-аргинина приводило к образованию частично уложенного промежуточного соединения без дисульфидных связей (Umetsu et al., 2003, J. Biol. Chem., v.278, pp.8979-8987). В другом конкретном примере заявители настоящего изобретения установили, что одно из антител против IL-15, описанное, например, в публикации патента США 2003/0138421, т.е. 146 В 7, содержит непарные остатки цистеина. Конкретнее, 146 В 7 имеет свободный цистеин в положении 104 CDR3 области тяжелой цепи. Данный свободный цистеин может быть источником ковалентной димеризации и приводить к проблемам со стабильностью во время формуляции или хранения. Наличие данного остатка увенчало успехом попытки получить однородный, активный образец данного рекомбинантного IgG1. Добавление редокс-реагентов облегчает получение структурно-гомогенной и более активной формы данной молекулы IgG1. Внесение редокс-реагентов проводят в сочетании с добавлением хаотропных агентов для облегчения продукции, подвергшихся рефолдингу молекул IgG1, которые являются более гомогенными по сравнению с молекулами, которые не подвергались обработке редокс-реагентом сопряжения и хаотропным агентом. Как обсуждается в примере 9, способы согласно изобретению также пригодны в получении однородных интактных молекул IgG4. Поскольку IgG4 не активирует комплемент, то вероятность развития иммуногенного ответа и воспаления за счет образования комплексов антиген-антитело-комплемент очень мала с молекулами IgG4. Это делает IgG4 очень привлекательным кандидатом для применения в терапии, поскольку предполагается, что он является безопасным лекарственным средством: IgG4 будет просто связываться с антигеном и не будет запускать какую-либо дополнительную ответную реакцию в организме человека. Основанная на IgG4 ответная реакция генерируется в ответ, например, на антигены, такие как имеются у клещей пыли, в пыльце растений или при укусе пчел. Как правило, данные антигены элиминируются без значительного иммунного ответа и воспаления. С другой стороны, за счет уникальной структуры шарнирной области IgG4, данный IgG находится в виде смеси интактных и полумолекул. Не стремясь связываться с какой-либо конкретной теорией или механизмом действия, необходимо отметить, что при- 13012162 сутствие полумолекул IgG4 может мешать разработке молекул IgG4 в качестве терапевтических композиций. Полумолекулы потенциально могут создавать проблему, поскольку они могут обмениваться между двумя различными молекулами IgG4. В таких обстоятельствах появляется молекула IgG4, которая будет связываться с двумя антигенами двумя половинами (плечами). Такой IgG4 является бифункциональным и моновалентным. Предусматривается, что такие бифункциональные и моновалентные свойства IgG4 будут делать гибридную молекулу IgG4, потенциально не безопасной при применении в качестве терапевтического средства. Например, можно разработать терапевтическое средство на основе IgG4 с целью связывания с рецептором, характерным для артрита. Если в месте инъекции или целом организме человека присутствуют другие полумолекулы IgG4, то это может привести к образованию бифункционального IgG4, который связывается как с рецептором, так и антигеном пыльцы растений. Это может привести к развитию иммунного ответа и воспаления. В настоящем изобретении обеспечиваются способы рефолдинга молекул IgG4. Такой рефолдинг будет использоваться для элиминации полумолекулIgG4, которые часто присутствуют вместе с интактными молекулами IgG4. В некоторых аспектах изобретения также предусматривается введение и оптимизация редокскомпонентов и/или хаотропных агентов непосредственно в ферментационную среду, на которой культивируют эукариотические клетки, таким образом, чтобы обеспечивался соответствующий редокспотенциал для рефолдинга IgG-продукта (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), секретируемого в среду. Таким образом, в среду добавляют или оптимизируют такими компонентами, как цистеин, цистин, цистамин,глутатион, медь и/или другие окислители-восстановители, для достижения соответствующего редокспотенциала. Оптимизация в отношении редокс-компонентов достигается варьированием компонентов в ферментационной среде. Можно оценить гетерогенность секретируемого IgG-продукта с использованием методов ВЭЖХ/МС или любого другого метода разделения белков, который предоставляет информацию о гетерогенности разделяемой композиции. Таким образом, можно легко определить редоксреагенты и/или хаотропные агенты, которые обеспечивают более однородный, гомогенный рекомбинантный продукт. Альтернативно этому или в комбинации с включением редокс-реагентов в ферментационную среду для продуцирующих рекомбинантный белок клеток-хозяев можно ввести отдельную, иную стадию процессинга, на которой достигается окислительный рефолдинг белка. На такой стадии дополнительного процессинга раствор для рефолдинга может содержать денатурирующие вещества, такие как гуанидингидрохлорид или мочевина; вещества, способствующие укладке, такие как полиолы, полимеры или детергенты и/или восстановители. Известны способы получения рекомбинантных антител в клетках млекопитающих. В таких способах продукция антител включает индукцию экспрессии белков. Нуклеиновые кислоты, кодирующие IgGантитело или фрагмент IgG-антитела, обычно делают экспрессивными при обеспечении оперативной связи с промотором, предпочтительно регулируемым промотором, функционирующим в клетках млекопитающих. Такие рекомбинантные конструкции создают для экспрессии белка IgG-антитела в подходящем хозяине (например, бактериях, мышах или у человека). Имеется большое количество подходящих промоторов для экспрессии белков и полипептидов, и они хорошо известны в данной области. Предпочтительными являются индуцируемые промоторы или конститутивные промоторы, которые связаны с регуляторными областями (например, энхансерами, операторами и связывающими областями для факторов транскрипции или трансляции). Индуцируемый промотор определяется здесь, как регулируемый промотор, включая промоторы, как правило, относящиеся к индуцируемым промоторам (т.е. подвергающимся положительной регуляции, которые, будучи не активными, становятся активными или индуцируются в присутствии активатора или индуктора) или дерепрессируемым промоторам (т.е. подвергающимся отрицательной регуляции, которые будучи активными, если только не присутствует репрессор, при удалении репрессора или депрессора, что приводит к повышению промоторной активности). Предусматриваемые здесь промоторы включают, например, но не ограничиваются этим, trp-, lpp-,tac- и lac-промоторы, такие как lacUV5 из Е. coli; P10 или промотор гена полигедрина в экспрессирующих системах клеток бакуловирусов/насекомых (см., например, патенты США 5243041, 5242687,5266317, 4745051 и 5169784) и индуцируемые промоторы из других эукариотических экспрессирующих систем, которые известны в данной области. Для экспрессии белков такие промоторы вставляют в плазмиду в оперативной связи с регулирующей областью, такой как оператор trp-оперона. Предпочтительными промоторными областями являются таковые, которые подвергаются индукции и являются функциональными, например, в клетках млекопитающих. Примеры подходящих индуцируемых промоторов и промоторных областей для экспрессии в бактериях включают, но не ограничиваются этим, lac-оператор Е. coli, реагирующий на изопропилD-тиогалактопиранозид (IPTG; см. Nakamura etal., 1979, Cell 18: 1109-1117); регулирующиеся металлами промоторные элементы металлотионеина, реагирующие на индукцию тяжелыми металлами (например, цинк) (см., например, патент США 4870009); Т 71 ас-промотор фага, реагирующий на IPTG (см., например, патент США 4952496; и Studieret al., 1990 Meth. Enzymol. 185: 60-89) и ТАС-промотор. В зависимости от используемой экспрессирующей системы-хозяина вектор (например, плазмида, фагемид, космида, искусственная хромосома, вирус) может необязательно включать селективный маркерный ген или гены, которые функционируют у хозяи- 14012162 на. Таким образом, например, селективный ген-маркер включает любой ген, который придает фенотип клетке-хозяину, который позволяет трансформированным клеткам-хозяевам выживать в определенных условиях, таких как воздействие антибиотика. Также предусматриваются подвергающиеся скринингу маркеры для включения в вектор, с поддающимися скринингу маркерами, придающими трансформированным клеткам различаемый фенотип. Подходящие селективные гены-маркеры для хозяев включают,например, ген устойчивости к ампициллину (Ampr), ген устойчивости к тетрациклину (Tcr) и ген устойчивости к канамицину (Kanr). В различных экспрессирующих системах векторы (например, плазмиды) могут включать ДНК, кодирующую сигнал секреции оперативно связанного белка. Сигналы секреции, подходящие для применения, широко распространены и известны в данной области. Предпочтительными являются эукариотические сигналы секреции, функционирующие в клетках млекопитающих. Специалистам в данной области известны различные эукариотические сигналы секреции, которые все предусматриваются для применения (см., например, von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). В конкретных вариантах осуществления предусматривается, что редокс-реагент вводят в культуральную среду для клеток, экспрессирующих и секретирующих рекомбинантные антитела на той точке, когда в данных клетках индуцирована экспрессия рекомбинантного IgG-антитела или его фрагмента. Редокс-реагент можно вносить одной болюсдозой или можно добавлять в виде многих доз. Например, в случае смеси цистеин/цистин в качестве связующего окислительно-восстановительного реагента, может быть желательным иметь много доз смеси цистеин/цистин, добавляемой для поддержания соответствующего количества смеси цистеин/цистин в среде для рефолдинга. В еще одном аспекте редокс-реагент вводят непосредственно в растворы для кристаллизации белка,так, чтобы неправильно уложенный белок мог подвергнуться рефолдингу в растворе и прикрепиться к растущему кристаллу белка, приводя к повышенным выходам кристаллизованного белка. Стадию кристаллизации можно объединить с любыми усовершенствованиями, которые достигаются посредством применения белкового вещества, которое уже подверглось рефолдингу с использованием редокс-условий в ферментационной среде, и/или посредством дополнительных стадий процессинга. При проведении белка во время ферментации, на отдельной стадии процессинга или в растворе для кристаллизации, настоящее изобретение обеспечивает продукты с улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами, включая повышенную гомогенность, активность/эффективность, стабильность, рост кристаллов и выход кристаллизации. В данном подходе для улучшения фармацевтических и кристаллизационных свойств рекомбинантных белков предпочтительно использовать катионообменную хроматографию, поскольку для последнего метода требуется отбор только активного компонента из всей смеси рекомбинантного белка, что является более дорогостоящим и приводит к существенной потере вещества. В некоторых других аспектах настоящего изобретения обеспечиваются способы получения человеческих или гуманизированных IgG-антител таких как, например, полностью человеческий IgG1 противIL-15 или IgG2 против IL-1R, где данные способы включают стадию рефолдинга IgG, продуцированного рекомбинантным путем клетками яичника китайского хомяка (СНО), и получения структурно гомогенных, активных форм молекулы IgG. В данных обстоятельствах, когда IgG представляет собой IgG2, то структурно гомогенными формами является одна из форм 1, 2, 3 и 4, идентифицированных ВЭЖХ, описанной здесь, так, что продуцируется, например, только одна форма 3 или продуцируется только форма 1 и т.д. В данных обстоятельствах, когда IgG представляет собой IgG1, то предусматривается, что любые непарные свободные цистеины обрабатывают таким образом, что они не приводят к отрицательной димеризации. В случае IgG4 антител, то способы согласно изобретению обеспечивают препараты IgG4, которые в большей степени являются интактными, а не полумолекулами. Для достижения такого положительного выхода рефолдинг можно проводить с использованием смеси цистеин-цистин, цистеин-цистамин, глутатион, медь, молекулярный кислород, и хапероны и сочетания другого буфера, температуры и времени. Типичные условия для рефолдинга включают, например, инкубирование молекулы рекомбинантного IgG в концентрации 315 мг/мл в двух буферах 1) 200 мМ Трис-буфер при рН 8,0 (нативный рефолдинг); 2) 200 мМ Трис-буфер при рН 8,0 с 0,9 М GuHCl (рефолдинг под действием GuHCl). Комбинацию цистеин:цистин вносят в примерном молярном соотношении 6 мМ : 1 мМ соответственно. Образцы помещают при температуре 2-8 С на 48 ч. Через 24 и 48 ч отбирают аликвотные порции для анализа. Рефолдинг молекулы рекомбинантного IgG с использованием таких типичных условий рефолдинга в присутствии редокс-реагента и хаотропного агента обеспечивает единичную структурную форму с трехкратным повышением активности на г белка. В некоторых вариантах осуществления стадия рефолдинга увеличивает в три раза продукцию молекулы IgG и в три раза уменьшает концентрацию белка, необходимую для формуляции растворов для достижения такой же активности. Очевидно, понятно, что способы согласно изобретению можно использовать для получения композиции белка для применения у пациента, например, IgG1, такого как IgG1, направленного против IL-15,или IgG2 против IL-1R, где получение включает в себя продукцию клетками млекопитающих белка, очистку белка из культуры клеток млекопитающих, рефолдинг очищенного белка с использованием способов рефолдинга, описанного здесь, обмен буфера композиции, полученной таким образом, на буфер- 15012162 композиции и получение разовой лекарственной формы, которую можно использовать у пациента. Альтернативно получение композиции включает в себя стадии продукции белка клетками млекопитающих,очистки белка после рефолдинга белка, описанной выше, с последующим выделением желаемой формы белка, после чего буфер композиции, полученной таким образом, заменяют на буфер композиции и получения разовой лекарственной формы, которую можно использовать у пациента. Изобретение относится к способам повышения выделения активных рекомбинантных белков. Кроме того, в изобретении используется обработка хаотропными агентами (такими, например, как денатурирующие реагенты, такие как додецилсульфат натрия, гуанидингидрохлорид или мочевина) для дополнительного процессинга белков. Способы получения соответствующим образом подвергшегося рефолдингу белка объединяют с преимущественными способами ЖХ для выделения белка, как подробно описано ниже. Данные комбинированные способы рефолдинга и очистки белка согласно изобретению являются особенно преимущественными, когда рекомбинантный белок предназначен для применения в условияхin vivo в качестве лекарственного или биологического препарата. Использование ЖХ методов позволит специалистам в данной области определить такие конкретные условия рефолдинга, которые обеспечивают желаемую конформацию белка для любого данного рекомбинантного белка. Также можно использовать другие методы очистки и выделения. Желаемая конформация рекомбинантного белка может иметь или может не иметь различное расположение дисульфидных связей, хотя предпочтительно конформация содержит нативные дисульфидные связи. Было установлено, что способы, описанные здесь, представляют мягкий и эффективный способ усовершенствования процесса получения рекомбинантных IgG-антител или их фрагментов, которые могут принимать множественные конформации. В одном аспекте способы согласно изобретению можно использовать на препаратах рекомбинантных IgG-антител или их фрагментов, где препарат IgG-антитела или его фрагмента представляет гетерогенную смесь, которая содержит стабильную и нестабильную конформации IgG-антитела или его фрагмента. Термины стабильная и нестабильная применяются в качестве условных терминов. Например, стабильная конформация будет иметь более высокую температуру плавления (Тпл.) по сравнению с нестабильной конформацией при определении в одном и том же растворе. Конформация является стабильной по сравнению с другой конформацией, когда различие в значениях Тпл. составляет по меньшей мере примерно 2 С, более предпочтительно примерно 4 С, еще более предпочтительно примерно 7 С, еще более предпочтительно примерно 10 С, даже еще более предпочтительно примерно 15 С, еще более предпочтительно примерно 20 С, еще более предпочтительно примерно 25 С и наиболее предпочтительно примерно 30 С при определении в одном и том же растворе. Таким образом, в одном аспекте изобретение предусматривает взаимодействие препарата рекомбинантного белка, который получен из гетерогенной смеси по меньшей мере двух конфигурационных изомеров рекомбинантного белка, со связующим окислительно-восстановительным реагентом в течение времени, достаточного для повышения относительного содержания желаемого конфигурационного изомера, и определение относительного содержания желаемого конфигурационного изомера в смеси. В другом аспекте изобретение предусматривает взаимодействие препарата рекомбинантного белка, продуцированного клетками млекопитающих, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 7 до примерно 11, и выделение фракции препарата рекомбинантного белка с желаемой конформацией. Некоторые рекомбинантные белки представляют собой гликозилированные рекомбинантные белки, например, такие как продуцированные эукариотическими клетками. В некоторых аспектах способы согласно изобретению применяются для уменьшения конформационной гетерогенности, которая индуцируется разрывом дисульфидных связей. В более конкретных аспектах данная конформационная гетерогенность имеется в антителах и конкретнее в IgG1-, IgG2-, IgG3- или IgG4 антителах. Следует отметить, что термин конфигурация используется здесь взаимозаменяемо с термином конформация и предназначен для обозначения белка, который имеет иную вторичную, третичную или четвертичную структуру по сравнению с другим белком с той же первичной структурой (с той же аминокислотной последовательностью). При использовании редокс-реагентов одних или в сочетании с дополнительным процессингом при использовании хаотропных агентов, таких как гуанидингидрохлорид, возможно получить более гомогенный и более терапевтически активный белок IgG по сравнению с образом того же белка, продуцированного таким же образом, но в присутствии редокс-реагентов и/или хаотропных агентов. Как правило, способы согласно изобретению являются пригодными для усовершенствования способов получения рекомбинантных молекул или белков IgG (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Рекомбинантные молекулы или рекомбинантные белки представляют собой белки, полученные генноинженерным способом. Термин генно-инженерный относится к любому способу рекомбинантной ДНК или РНК, используемому для создания клетки-хозяина, которая экспрессирует ген на высоких уровнях,низких уровнях и/или мутантную форму гена. Иными словами, клетку трансфектируют, трансформирут или трансдуцируют рекомбинантной полинуклестидной молекулой и тем самым изменяют таким образом, чтобы индуцировать в клетке изменение экспрессии желаемого белка. Способы и векторы для получения рекомбинантных клеток и/или клеточных линий для экспрессии представляющего интерес белка- 16012162 являются хорошо известными специалистам в данной области; например, различные методы приведены в Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (WileySons, New-York, 1988 и периодически обновляемые издания) и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring LaboratoryPress, 1989). Методы генной инженерии включают, но не ограничиваются этим, экспрессирующие векторы, целенаправленную гомологичную рекомбинацию и активацию генов (см., например, патент США 5272071, Chappel) и трансактивацию генно-инженерными факторами транскрипции (см., например, Segalet al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (6): 2758-63). В способах лечения заболевания, нарушения или состояния, в дополнении к профилактическим способам или способу профилактики таких заболеваний, нарушений или состояний, эффективное количество рекомбинантного полипептида представляет количество полипептида, которое будет обеспечивать желаемое биологическое или физиологическое действие, известное в данной области. Конкретно по отношению к способам лечения, а также способам ослабления симптома, связанного с заболеванием,нарушением или состоянием, эффективное количество используется как синоним выражения терапевтически эффективное количество. В таких способах субъект, нуждающийся представляет любое животное, например, человека, у которого имеется симптом или риск развития, или поставлен диагноз заболевания, нарушения или состояния. Изобретение находит особое применение в усовершенствовании продукции любых рекомбинантных белков, которые продуцируются клетками млекопитающих, и для которых требуется соответствующий рефолдинг. В некоторых вариантах осуществления изобретение, в частности, относится к усовершенствованной продукции и рефолдингу 146 В 7, молекулы IgG1 против IL-15. Гетерогенность таких белков за счет присутствия остатка непарного цистеина в положении 104 (Cys104) уменьшается в результате применения редокс-реагентов, описанных здесь. Данные положительные результаты можно оценить при определении такой гетерогенности с использованием методов ЖХ и ЖХ/МС, известных специалистам в данной области. В частности, белки, которые секретируются грибковыми клеточными системами (например, дрожжами, нитчатыми грибами) и клеточными системами млекопитающих, будут подвергаться гликозилированию. Предпочтительно белки секретируются продуцирующими их клетками млекопитающих, адаптированными для роста в клеточной культуре. Примерами таких клеток, обычно используемых в промышленности, являются клетки СНО, VERO, BHK, HeLa, CV1 (включая Cos), MDCK, 293,3 Т 3, миеломные клеточные линии (особенно мышиные), РС 12 и WI38. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки яичника китайского хомяка (СНО), которые широко применяют для получения нескольких сложных рекомбинантных белков, например, цитокинов, факторов свертывания крови и антител (Brasel et al., 1996, Blood 88: 2004-2012; Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 63526362; McKinnon et al., 1991, J. Mol. Endocrinol., 6: 231-239; Wood et al., 1990, J. Immunol., 145: 3011-3016). Мутантная клеточная линия с недостатком дигидрофолатредуктазы (DHFR) (Urlaub et al., 1980, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), DXB11 и DG-44 являются клеточными линиями-хозяевами СНО выбора, поскольку эффективная селектируемая по DHFR и амплифицируемая экспрессирующая ген система обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в данных клетках (Kaufman R.J. etal., 1990, Meth. Enzymol. 185: 527-566). Кроме того, с данными клетками легко манипулировать в виде прикрепляющейся к субстрату и суспензионной культур, и они проявляют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки СНО и рекомбинантные белки, экспрессированные в них, были хорошо охарактеризованы и разрешены для применения в производстве лекарственных препаратов официальными органами. Было установлено, что изобретение представляет собой мягкий и эффективный способ усовершенствования способа продукции молекул рекомбинантного IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), которые могут принимать множественные конформации и/или содержат более чем один домен. Домен представляет собой смежную область полипептидной цепи, которая принимает особую третичную структуру и/или обладает особой активностью, которая может быть локализована в данной области полипептидной цепи. Например, один домен белка может обладать аффинностью связывания для одного лиганда, и один домен белка может обладать аффинностью связывания для другого лиганда. В отношении термостабильности, домен можно отнести к кооперативной, развернутой единице белка. Такие белки, которые содержат более чем один домен, можно найти в природе в виде одного белка или полученного генно-инженерным путем в виде гибридного белка. Кроме того, домены полипептида могут иметь субдомены. Композиции и способы согласно изобретению также являются пригодными для получения других типов рекомбинантных IgG-белков, включая молекулы иммуноглобулинов или их фрагменты, и химерные антитела (например, антитела, содержащие человеческую константную область, соединенную с мышиной антигенсвязывающей областью) или их фрагменты. Известны многочисленные методы, с помощью которых можно манипулировать с ДНК, кодирующими молекулы иммуноглобулинов, с получением ДНК, способных кодировать рекомбинантные белки, такие как одноцепочечные антитела, антитела с повышенной аффинностью или другие полипептиды на основе антител (см., например, Larrick et al.,1989, Biotechnology 7: 934-938; Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Roberts et al., 1987, Nature 328: 731-734; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536; Claudhary et al., 1989, Nature 339: 394-397). Также- 17012162 в изобретении можно использовать препараты полностью человеческих антител (таких как полученные с использованием трансгенных животных и необязательно дополнительно модифицированные в условияхin vitro), а также гуманизированных антител. Термин гуманизированное антитело также включает одноцепочечные антитела. См., например, Cabilly et al., патент США 4816567; Cabilly et al., Европейский патент 0125023 В 1; Boss et al., патент США 4816397; Boss et al., Европейский патент 0120694B1;Neuberger M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger M. S. et al., Европейский патент 0194276B1; Winter, патент США 5225539; Winter, Европейский патент 0239400 В 1; Queen et al., Европейский патент 0451216B1; Padlan E. A. et al., EP 0519596A1. Способ согласно изобретению также можно использовать при получении конъюгатов, содержащих антитело и цитотоксическое или люминесцентное вещество. Такие вещества включают производные маитанзина (такие как DM1); энтеротоксины (такие как стафилококковый энтеротоксин); изотопы йода (такие как йод-125); изотопы технеция (такие как Тс-99m); флуорохромы на основе цианина (такие как Су 5.5.18) и инактивирующие рибосомы белки (такие как буганин, гелонин или сапорин-S6). С использованием способов согласно изобретению можно также получить препараты различных гибридных белков. Примеры таких гибридных белков включают белки, экспрессированные в виде гибридных белков с участком молекулы рекомбинантного IgG (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), белки, экспрессированные в виде гибридных белков с застежкой-молнией, и новые полифункциональные белки,такие как гибридные белки цитокина и фактора роста (например, GM-CSF и IL-3, MGF и IL-3). В WO 93/08207 и WO 96/40918 описано получение различных растворимых олигомерных форм молекулы, относящейся к CD40L, включающих соответственно иммуноглобулиновый гибридный белок и гибридный белок с застежкой-молнией; способы, описанные здесь, применимы для других белков. Любую из вышеуказанных молекул можно экспрессировать в виде гибридного белка, включая, но не ограничиваясь внеклеточным доменом молекулы клеточного рецептора, ферментом, гормоном, цитокином, участком молекулы иммуноглобулина, застежкой-молнией-доменом и эпитопом. Получение рекомбинантного белка предпочтительно проводить при использовании редоксреагентов, описанных здесь, в среде культуры клеток. Рекомбинантные белки продуцируются клетками в культуре и затем их выделяют. Препарат рекомбинантного белка может представлять собой супернатант культуры клеток, клеточный экстракт, но предпочтительно он является частично очищенной фракцией указанного. Под выражением частично очищенная понимается, что проводили некоторую методику или методики фракционирования, но присутствуют еще полипептидные молекулы (по меньшей мере 10%) иные чем желаемый белок или белок с желаемой конформацией. Одно из преимуществ способов согласно изобретению заключается в том, что препарат рекомбинантного белка может иметь очень высокую концентрацию. Некоторые значения концентраций находятся в пределах от 0,1 до 20 мг/мл, более предпочтительно от 0,5 до 15 мг/мл и еще более предпочтительно от 1 до 10 мг/мл. Препарат рекомбинантного белка первоначально можно получить при культивировании рекомбинантных клеток-хозяев в условиях культивирования, подходящих для экспрессии полипептида, в присутствии редокс-реагентов, описанных здесь. Полипептид также можно экспрессировать в виде продукта трансгенных животных, например, в виде компонента молока трансгенных коров, коз, свиней или овец, для которых характерно, что соматические или половые клетки содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид. Затем полученный экспрессированный полипептид можно выделить или частично выделить из такой культуры или компонента (например, из культуральной среды или клеточных экстрактов, или жидкости организма) с использованием известных методов. Несмотря на то, что можно использовать фракционирование, включающее, но не ограничивающееся одной или более стадиями фильтрования, центрифугирования, осаждения, разделения фаз, аффинную очистку, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC; с использованием смол, таких как фениловый эфир, бутиловый эфир или пропиловый эфир), ВЭЖХ и сочетания вышеуказанного, в преимущественных способах согласно изобретению можно применять фракционирование и очистку высокомолекулярных терапевтических белков ЖХ, как описано в заявке на патент США 60/548302, Dillon et al., поданной 27 февраля 2004, и заявке 60/538982, Bondarenko et al., поданной 23 января 2004 (каждая из которых включена здесь в полном объеме для сведения). Также способы ЖХ и ЖХ/МС, описанные здесь ниже, можно объединить со способами очистки,например, такими как очистка полипептида с использованием колонки для аффинной хроматографии,содержащей агенты, которые будут связываться с полипептидом; с одной или более стадиями очистки на колонках с аффинными смолами, такими как А-агароза, гепарин-toyopearl или 3GA сефароза Цибахром синий; с одной или более стадиями, включающими элюирование; и/или иммуноаффинную хроматографию. Полипептид может экспрессироваться в форме, которая облегчает очистку. Например, он может экспрессироваться в виде гибридного полипептида, такого как связывающийся с мальтозой полипептид(МВР), глутатион-S-трансфераза (GST) или тиоредоксин (TRX). Имеются промышленно доступные наборы для экспрессии и очистки таких гибридных полипептидов производства соответственно New England BioLab (Beverly, Mass), Pharmacia (Piscataway, N.Y.) и InVitrogen. Полипептид может быть мечен эпитопом и затем подвергнут очистке с использованием специфического антитела против такого эпито- 18012162 па. Один такой эпитоп (FLAG) является промышленно доступным производства Kodak (New Haven,Conn.). Также возможно использовать колонку для аффинной хроматографии, содержащую полипептидсвязывающий полипептид, такой как моноклональное антитело к рекомбинантному белку, для аффинной очистки экспрессированных полипептидов. Другими типами стадий аффинной очистки может быть колонка протеин А- или протеин G-колонка, где аффинные реагенты связываются с белками, которые включают в себя Fc-домены. Полипептиды можно элюировать с колонки для аффинной хроматографии с использованием обычных методов, например, буфера для элюирования с высокой концентрацией соли и затем диализовать в буфер с низкой концентрацией соли для применения, или изменением рН или других компонентов в зависимости от используемого аффинного матрикса или можно удалить в конкурентных условиях с использованием нативных субстратов для аффинной группы. В одном варианте осуществления изобретения препарат рекомбинантного белка можно частично очистить на протеин А-колонке для аффинной хроматографии. Некоторые или все вышеописанные стадии очистки, в различных комбинациях, можно также использовать для получения соответствующего препарата рекомбинантного IgG (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 илиIgG4) для применения в способах согласно изобретению и/или дополнительно очистить такой рекомбинантный полипептид после взаимодействия препарата рекомбинантного белка со связующим окислительно-восстановительным реагентом. Полипептид, в основном не содержащий другие полипептиды млекопитающих, определяется как очищенный полипептид. Специфические ЖХ методы, которые можно объединить со способами на основе применения редокс-реагентов, описанными здесь, подробно представлены в заявке на патент США : 60/548302, Dillon et al., поданной 27 февраля 2004, и 60/538982, Bondarenko et al., поданной 23 января 2004 (каждая из которых включена здесь в полном объеме для сведения). Полипептид также можно получить известным обычным химическим синтезом. Специалистам в данной области известны методы конструирования полипептидов синтетическим путем. Полученные синтетически полипептидные последовательности можно гликозилировать в условиях in vitro. Желаемая степень чистоты зависит от предполагаемого использования полипептида. Желательна относительно высокая степень чистоты, когда полипептид предназначен, например, для введения в условиях in vivo. В таком случае полипептиды очищают таким образом, чтобы отсутствовали полосы полипептидов, соответствующие другим полипептидам, детектируемые при анализе электрофорезом в SDSполиакриламидном геле (SDS-PAGE). Очевидно, специалистам в данной области понятно, что можно обнаружить много полос, соответствующих полипептиду, при SDS-PAGE за счет различий в гликозилировании, различий в посттрансляционном процессинге и пр. Наиболее предпочтительно, когда полипептид согласно изобретению очищают до значительной гомогенности по данным анализа SDS-PAGE, когда обнаруживают одну полосу полипептида. Полосу полипептида можно визуализировать при окрашивании серебром, окрашивании кумасси синим и/или (если полипептид включает радиоизотопную метку) авторадиографией. Под термином взаимодействие понимается действие или воздействие в растворе. Белок или полипептид можно подвергнуть взаимодействию с редокс-реагентами, также связанными с твердой подложкой (например, колонкой для аффинной хроматографии или хроматографическим матриксом). Предпочтительно раствор забуферен. Для получения максимального выхода белка с желаемой конформацией рН раствора выбирают таким образом, чтобы обеспечить стабильность белка и оптимизировать для обмена дисульфидов. В практике изобретения является предпочтительным, чтобы значение рН раствора не было сильно кислым. Так, пределы рН должны быть выше рН 5, предпочтительно примерно от рН 6 до примерно рН 11, более предпочтительно примерно от рН 7 до примерно рН 10 и еще более предпочтительно от рН 7,6 до примерно рН 9,6. В одном не ограничивающем варианте осуществления изобретения было установлено, что оптимальное значение рН составляет примерно 8,6. Однако оптимальное значение рН для конкретного варианта осуществления изобретения может легко определить экспериментально специалист в данной области. Связующий окислительно-восстановительный реагент является источником восстановителей. Некоторые восстановители представляют собой свободные тиолы. Предпочтительно связующий окислительно-восстановительный реагент состоит из соединения из группы, включающей восстановленный и окисленный глутатион, дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, дитионитробензоат, цистеин и цистин/цистамин. Для простоты применения и экономии можно использовать восстановленный глутатион и/или восстановленный цистеин. Необходимо отметить, что при нейтральном значении рН цистеин образует дисульфиды с образованием цистина. Скорость такой реакции окисления возрастает в присутствии кислорода, который часто находится в растворах, включая растворы с редокс-реагентами, используемые для рефолдинга. Практически раствор с нейтральным рН, который первоначально содержит только цистеин (восстановитель), быстро образует цистин (окислитель). Следовательно, в раствор можно ввести реагент редокс-сопряжения при добавлении только цистеина. Редокс-реагент можно внести в ферментационную среду, на которой культивируют клетки, продуцирующие рекомбинантный белок. В дополнительных вариантах осуществления реагенты можно также добавить к подвижной фазе при ЖХ во время проведения стадии очистки ЖХ для выделения рекомби- 19012162 нантного белка. В некоторых вариантах осуществления белок иммобилизуют на стационарной фазе на колонке для ЖХ и редокс-реагент и хаотроп являются частью подвижной фазы. В конкретных вариантах осуществления необработанное IgG-антитело может элюировать в виде гетерогенной смеси, что идентифицируется по числу пиков. Применение связующего окислительно-восстановительного реагента и/или хаотропного агента приводит к образованию более простого и более однородного характера пиков. Предусматривается, что данный более однородный интересующий пик можно выделить в виде более гомогенного препарата IgG. Связующий окислительно-восстановительный реагент находится в концентрации, достаточной для повышения относительного содержания желаемой конформации. Оптимальная абсолютная концентрация и соотношение связующего окислительно-восстановительного реагента зависят от общей концентрации IgG и в некоторых обстоятельствах от конкретного подкласса IgG. Когда он применяется для получения молекул IgG1, то также это будет зависеть от количества и доступности непарных цистеинов в белке. Как правило, концентрация свободных тиолов связующего окислительно-восстановительного реагента может составлять примерно от 0,05 мМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно примерно от 0,1 мМ до примерно 25 мМ и еще более предпочтительно примерно от 0,2 мМ до примерно 20 мМ. Кроме того, связующий окислительно-восстановительный реагент может содержать окисленные тиолы в примерно более высокой, равной или более низкой концентрации по сравнению с восстановленным тиолом. Например, связующий окислительно-восстановительный реагент может представлять комбинацию восстановленного глутатиона и окисленного глутатиона. Было установлено, что могут одинаково хорошо функционировать соотношения восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону в пределах примерно от 1:1 до примерно 100:1 (восстановленные тиолы:окисленные тиолы). Альтернативно в другом варианте осуществления связующий окислительно-восстановительный реагент может представлять собой цистеин или комбинацию цистеина и цистина/цистамина. Таким образом, когда окисленные тиолы включены в исходный связующий окислительно-восстановительный реагент, то соотношение восстановленных тиолов к окисленным тиолам может в некоторых вариантах осуществления равняться примерно от 1:10 до примерно 1000:1, более предпочтительно примерно от 1:1 до примерно 500:1, еще более предпочтительно примерно от 5:1 до примерно 100:1, даже еще более предпочтительно составлять примерно 10:1. Взаимодействие препарата рекомбинантного белка со связующим окислительно-восстановительным реагентом проводят в течение времени, достаточном для повышения относительного количества желаемой конформации. Желательно любое относительное увеличение пропорции, включая, например,чтобы 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и даже 80% белка с нежелательной конформацией превращалось в белок с желаемой конформацией. Типичные выходы, которые можно достичь со способами согласно изобретению, находятся в пределах примерно от 40 до 80%. Взаимодействие можно проводить при добавлении редокс-реагента в ферментационную среду, в которой продуцируется белок. Альтернативно взаимодействие имеет место во время частичного выделения белка из клеточной культуры, в которой продуцируется белок. В еще одних вариантах осуществления взаимодействие проводят после элюирования белка с колонки для ВЭЖХ, но до проведения любого дополнительного процессинга. Важно, что взаимодействие можно осуществлять на любой стадии во время получения, очистки, хранения или формуляции антитела. Также можно проводить взаимодействие с IgG-антителами, присоединенными к стационарной фазе хроматографических колонок, в то время как редокс-реагенты и хаотропные агенты являются частью подвижной фазы. В данном случае взаимодействие можно проводить в виде части метода очистки хроматографией. Примеры показательных хроматографических методов с рефолдингом могут включать гель-хроматографию (SEC); обмен растворителя во время обратимой адсорбции на протеин А-колонке; хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом (IMAC); обращенно-фазовую хроматографию (RPC); применение иммобилизованного катализатора для укладки, такого как GroEl, GroES или других белков со свойствами способствовать укладке. Рефолдинг на колонке является привлекательным, поскольку его легко автоматизировать с использованием промышленно доступных препаративных хроматографических систем. Недавно был сделан обзор по рефолдингу рекомбинантных белков на колонке (Li et al., 2004). Если стадию взаимодействия проводят с частично или высоко очищенным препаратом рекомбинантного белка, то стадию взаимодействия можнопроводить в течение короткого периода времени примерно от 1 ч до примерно 4 ч, и более длительного - в течение примерно от 6 ч до примерно 4 суток. Было установлено, что хорошо функционирует стадия взаимодействия продолжительностью примерно от 4 ч до примерно 16 ч или примерно 18 ч. Также стадия взаимодействия может иметь место во время проведения другой стадии, такой как очистка на твердой фазе, или во время фильтрования или любой другой стадии при очистке. Способы согласно изобретению можно проводить в широком пределе значений температуры. Например, способы согласно изобретению с успехом проводили при температуре в пределах примерно от 4 до примерно 37 С, однако, наилучшие результаты получали при более низких значениях температуры.- 20012162 Типичная температура для взаимодействия частично или полностью очищенного препарата рекомбинантного белка равняется примерно от 4 до примерно 25 С (комнатной температуры), но также ее можно проводить при более низких значениях температуры и более высоких значениях температуры. Кроме того, предусматривается, что способ можно проводить при высоком давлении. Ранее было установлено, что высокое гидростатическое давление (1000-2000 бар), в сочетании с низкими, не приводящими к денатурации концентрациями гуанидингидрохлорида, т.е. ниже 1 М, использовали для дезагрегации (солюбилизации) и рефолдинга нескольких денатурированных белков, продуцированных Е. coli,в виде включений, в состав которых входил человеческий гормон роста и лизоцим, и b-лактамаза (St.John et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 13029-13033 (1999. В-лактамаза подвергалась рефолдингу с высоким выходом активного белка даже без добавления GdmHCl. В другом опыте (Seefeldt et al., ProteinSci., 13: 2639-2650 (2004 выход рефолдинга продуцированного клетками млекопитающих белка бикунина, полученного при модулированном высоким давлением рефолдингом при 2000 бар, составлял 70% по данным ОФ-ВЭЖХ, что было существенно выше по сравнению со значением 55% (по данным ОФВЭЖХ), полученным традиционным разведением-рефолдингом под действием гуанидингидрохлорида. Данные факты указывают, что высокое гидростатическое давление способствует разрыву меж- и внутримолекулярных связей, приводя к развертыванию и дезагрегации белка. Воздействие высокого давления на белок аналогично воздействию на белок хаотропных агентов. Таким образом, предусматривается,что в способах согласно изобретению вместо применения хаотропных агентов используется высокое давление для развертывания белка. Конечно, в некоторых случаях можно использовать сочетание высокого давления и хаотропных агентов. Препарат рекомбинантного белка можно подвергнуть взаимодействию со связующим окислительно-восстановительным реагентом в различных соответствующих объемах. Например, способы согласно изобретению можно успешно проводить в масштабах аналитической лаборатории (1-50 мл), препаративных масштабах (50 мл - 10 л) и промышленных масштабах (10 л и более). Таким образом, способы согласно изобретению можно воспроизводимо проводить в небольших и больших объемах. В некоторых вариантах осуществления белки, продуцированные с использованием среды, содержащей редокс-реагенты, дополнительно подвергаются процессингу на отдельной стадии процессинга, на которой применяются хаотропные денатурирующие агенты, например, такие как додецилсульфат натрия(SDS), мочевина или гуанидингидрохлорид (GuHCl). Для ощутимого развертывания требуются значительные количества хаотропных агентов. В некоторых вариантах осуществления на стадии процессинга используется от 0,1 M до 2 M хаотропа, который воспроизводит эффект, равноценный применению от 0,1 M до 2 M гуанидингидрохлорида. В конкретном варианте осуществления окислительный рефолдинг достигается в присутствии примерно 1,0 M гуанидингидрохлорида или количества другого хаотропного агента, который обеспечивает такой же или аналогичный рефолдинг, что и 1 M гуанидингидрохлорида. В некоторых вариантах осуществления в способах используется от 1,5 М до 0,5 М хаотропа. Используемое количество хаотропного агента зависит от структурной стабильности белка в присутствии указанного хаотропа. Необходимо иметь достаточное количество присутствующего хаотропа для нарушения локальной третичной структуры и/или четвертичной структуры взаимодействий домена белка, но меньшее чем требуется для полного развертывания вторичной структуры молекулы и/или отдельных доменов. Для определения точки, на которой белок начнет развертываться под действием равновесной денатурации, практикующий специалист в данной области должен оттитровать хаотроп в растворе,содержащем белок, и следить за структурой таким методом, как круговой дихроизм или флуоресценция(фиг. 36). Имеются другие параметры, которые можно использовать для развертывания или незначительного нарушения структуры белка, которые можно использовать вместо хаотропа. Температура и давление представляют собой два основных параметра, которые применялись ранее для изменения структуры белка и которые можно использовать вместо хаотропного агента при взаимодействии с редокс-реагентом. Заявители предусматривают, что специалистам в данной области можно использовать любой параметр,который, как было показано, приводит к денатурации или нарушению структуры белка вместо хаотропного агента. Обмен дисульфидов можно погасить любым методом, известным специалистам в данной области. Например, связующий окислительно-восстановительный реагент можно удалить или уменьшить его концентрацию на стадии очистки и/или можно инактивировать его химическим путем, например, при подкислении раствора. Как правило, когда реакцию гасят подкислением, то рН раствора, содержащего связующий окислительно-восстановительный реагент, следует довести до значения ниже рН 7. В некоторых вариантах осуществления рН следует довести до рН 6. Как правило, значения рН снижается в пределах примерно от рН 2 до примерно рН 6. Определение конформации белка и относительные соотношения конформационных форм белка в смеси можно провести с использованием любого из разнообразных аналитических или количественных методов. Если имеется различие в активности между конформационными формами белка, то определение относительного содержания конформации в смеси можно осуществить с помощью теста определения активности (например, связывания с лигандом, ферментативной активности, биологической актив- 21012162 ности и т.д.). Также можно использовать биологическую активность белка. Альтернативно можно применить тесты связывания, в которых активность выражена в виде единиц активности/мг белка. Если две конформационные формы разделяются во время проведения методов разделения, таких как хроматография, электрофорез, фильтрование и другая методика очистки, то тогда относительное количество конформационной формы в смеси можно определить с использованием таких методов очистки. Например, по меньшей мере две различные конформационные формы рекомбинантного IgG можно разделить хроматографией гидрофобного взаимодействия. Кроме того, поскольку круговой дихроизм в дальнем УФ-свете использовали для установления вторичной структуры белков (Perczel et al., 1991, Protein Engrg. 4: 669-679), то с помощью такого метода можно определить присутствие альтернативных конформации белка. Еще одним методом, используемым для определения конформации, является флуоресцентная спектроскопия, которую можно применять для установления некоторых дополнительных различий в третичной структуре за счет флуоресцирующих свойств триптофана и тирозина. Другими методиками, которые можно использовать для определения различий в конформации и, следовательно,относительного содержания конформационной формы, являются гель-хроматография для определения состояния агрегации, дифференциальная сканирующая калориметрия для определения перехода точки плавления (Тпл.) и энтальпии, и развертывания под действием хаотропа. В некоторых вариантах осуществления, подробно описанных ниже, в изобретении применяется детектирование ЖХ/МС для определения гетерогенности белка. Под термином выделение понимается физическое отделение по меньшей мере одного компонента в смеси от других компонентов в смеси. Выделение компонентов или конкретных конформационных форм белка можно достичь при использовании любого способа очистки, который приводит к разделению таких компонентов. Следовательно, можно осуществить много стадий хроматографии в дополнении к ОФ-ВЭЖХ, описанных ниже, включая, но не ограничиваясь этим, HIC, хроматографию на гидроксиапатите, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и катионообменную хроматографию. Другими методами очистки являются фильтрование (например, тангенциальное проточное фильтрование), электрофоретические методы (например, электрофорез, электроэлюция, изоэлектрическое фокусирование) к фазовое разделение (например, фазовое разделение на ПЭГ-декстране), и это только некоторые. Кроме того, фракцию препарата рекомбинантного белка, которая содержит белок в нежелаемой конформации, можно вновь обработать способами согласно изобретению для дополнительной оптимизации выхода белка с желаемой конформацией. Также изобретение необязательно включает дополнительную формуляцию белков. Под термином формуляция понимается, что для белков можно поменять буфер, стерилизовать, упаковать в объемных композициях и/или упаковать для конечного потребителя. Для целей изобретения термин стерильная объемная форма означает, что композиция не имеет или в основном не имеет загрязнения микроорганизмами (до той степени, которая допустима для продукта питания и/или лекарственного препарата), и она определяется составом и концентрацией. Термин стерильная разовая лекарственная форма означает форму, подходящую для продажи и/или введения или потребления пациентом. Такие композиции могут включать эффективное количество белка в комбинации с другими компонентами, такими как физиологически приемлемый разбавитель, носитель и/или наполнитель. Термин фармацевтически приемлемый означает нетоксичное вещество, которое не оказывает отрицательного влияния на биологическую активность активного ингредиента(ов). Композиции, подходящие для введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиокислители, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые способствуют обеспечению изотонических свойств раствора с кровью реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества или загустители. Кроме того, стерильные объемные формы и стерильные разовые лекарственные формы могут содержать небольшую концентрацию (примерно от 1 мкМ до примерно 10 мкМ) связующего окислительно-восстановительного реагента (например, глутатиона, цистеина и т.д.). Полипептиды можно формулировать согласно известным методам, используемым для получения фармацевтически пригодных композиций. Их можно объединить в смеси в виде одного активного вещества или с другими известными активными веществами, подходящими для данного показания, с фармацевтически приемлемыми разбавителями (например, физиологическим раствором, Трис-HCl буфером, ацетатом и забуференными фосфатом растворами), консервантами (например, тимеразолом, бензиловым спиртом, парабенами), эмульгаторами, солюбилизаторами, адъювантами и носителями. Подходящие лекарственные формы для фармацевтических композиций включают в себя описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. , 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA. Кроме того, такие композиции можно приготовить в виде комплексов с полиэтиленгликолем (ПЭГом), ионами металлов и/или включить в полимерные соединения, такие как полиуксусная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели,декстран и т.д., или включить в липосомы, микроэмульсии, мицеллы, униламеллярные и мультиламеллярные везикулы, тени эритроцитов и сферобласты. Подходящие липиды для липосомальной композиции включают, без ограничения, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и пр. Специалисты в данной области могут осуществить приготовление таких липосомальных композиций, как раскрыто, например, в патенте США 4235871; патенте- 22012162 США 4501728; патенте США 4837028; и патенте США 4 7 37323. Такие композиции будут оказывать влияние на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения в условиях in vivo и клиренс в условиях in vivo, и таким образом их выбирают согласно предполагаемому применению, так, что характеристики носителя будут зависеть от выбранного пути введения. Формы для замедленного высвобождения включают, но не ограничиваются этим, полипептиды, которые инкапсулируют в биосовместимый полимер с медленным растворением (такой как микрочастицы из альгината,описанные в патенте США 6036978), в смеси с полимером (включая наносимые местно гидрогели) или включают в биосовместимый полупроницаемый имплантат. Способы согласно изобретению являются пригодными для анализа рекомбинантных белков IgG(например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) и, в частности, пригодными для анализа таких высокомолекулярных белков. Также способы подходят для анализа мономеров белков с большой молекулярной массой и белковых гетеромультимеров, например, антител. Предусматривается, что данные белки будут включать пострансляционные модификации, такие как присоединение олигосахаридных групп и пр. В конкретных вариантах осуществления способы согласно изобретению применяют для анализа антител и доменов антител. В одном примере способы используют для анализа белков с молекулярной массой выше 90 кДа,включая интактные антитела, любой третичной структуры белков с молекулярной массой выше 90 кДа. Очевидно, понятно, что молекулярную массу рассчитывают на основе аминокислотной последовательности и включают известные пострансляционные модификации белка, например, модификацию углеводами. Способы применимы для характеристики олигосахаридной композиции, расщепления, образования димера или мультимера и окисления белков, структурных вариантов с различными дисульфидными структурами и/или специфических аминокислот в белке. В некоторых вариантах осуществления способы согласно изобретению применяют для анализа антител и фрагментов антител. Образец, предназначенный для анализа, может включать иктактное антитело, содержащее Fc-домен и два Fab-домена. Альтернативно способы согласно изобретению используют для анализа структуры участка антитела, например, такого как Fc-домен и один или оба Fab-домена. В частности, предусматривается, что способы согласно изобретению являются пригодными для анализа продуктов частичного расщепления интактного антитела. Такое расщепление можно осуществить до проведения разделения ОФ-ВЭЖХ. Типичный протеолиз проводят с использованием фермента, например, такого как папаин, lyc-С протеаза или пепсин, с воспроизведением расщепления антитела в шарнирной области. Альтернативно при расщеплении можно использовать восстановитель для восстановления дисульфидных связей, которые связывают две цепи антитела. Такое восстановление можно провести,например, с использованием дитиотреитола, меркаптоэтанола, трибутилфосфина и три(2-карбоксиэтил) фосфина гидрохлорида. Обзор аналитических и препаративных способов, используемых при получении антител и их фрагментов, представлен Josic and Lim: Methods for Purification of Antibodies, Food Technolog. Biotechnolog. 39 (3): 215-226 (2001). В примерных вариантах осуществления ограниченный протеолиз проводят с использованием эндопротеиназы Lys-C в течение от 10 до 60 мин при рН в пределах 7,0-8,0. Расщепление проводят без денатурации при 37 С с молярным соотношением фермент:белок, равным 1:150. Это приводит к образованию нескольких крупных фрагментов антитела без чрезмерного нарушения структуры белка. Затем продукты ограниченного протеолиза подвергают ОФ-ВЭЖХ/МС, описанным здесь. При использовании ограниченного протеолиза образуются Fc- и Fab-фрагменты в шарнирной области IgG. Данные способы позволяют детектировать увеличение массы фрагментов на +16 Да за счет окисления остатка метионина и детектировать повышение +2 Да за счет неполного образования дисульфидных связей. Способы согласно изобретению можно использовать для анализа нативных белков, гибридных белков, гуманизированных антител, химерных антител, человеческих антител, одноцепочечных антител и пр. В одном примере способы также можно использовать для анализа любого антитела или его фрагмента с такой небольшой молекулярной массой, как 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 кДа или выше. В некоторых вариантах осуществления антитело, нанесенное на колонку для ОФ-ВЭЖХ, представляет собой интактную Fab-область. В других вариантах осуществления антитело, подвергающееся анализу, представляет собой (Fab)2-область, полученную расщеплением Fc-области антитела. Аналогично способы согласно изобретению также можно использовать для анализа Fc-области антитела, полученного в результате такого расщепления. В конкретных вариантах осуществления анализируемое антитело содержит интактную Fc-область и только одну интактную Fab-область. Кроме того, способы согласно изобретению можно использовать для анализа белка, содержащего Fc-область антитела и соединенные с ним дополнительные пептиды, или белок, содержащий Fab-область антитела с соединенными с ним дополнительными пептидами. Способы согласно изобретению можно использовать для анализа рекомбинантных антител. Рекомбинантные антитела могут содержать Fc-домен или могут не содержать Fc-домен. В частности, мультивалентные антитела можно анализировать при использовании настоящего изобретения. В том смысле, в котором он здесь используется, термин мультивалентные антитела представляет собой рекомбинантные антителоподобные молекулы, которые содержат связывающие домены для более чем одного эпитопа. Например, такие белки, производные антител, включают молекулы, в которых Fab-цепь антитела- 23012162 гибридизована со связывающими доменами (например, битела Fab-scFv или тритела). Данные молекулы представляют собой пригодные промежуточные рекомбинантные биспецифические антитела, не содержащие Fc-область. Получение антител с отсутствием Fc-домена является преимущественным, поскольку наличие такого домена в связанной с антителом терапевтической молекуле приводит к повышению зремени нахождения молекулы в сыворотке крови посредством ее защиты от метаболизма в печени, и также она может связываться с другими клетками при взаимодействии с Fc-рецептором, тем самым, приводя к развитию токсических побочных эффектов за счет системного запуска иммунных эффекторных клеток. Таким образом, в некоторых терапевтических молекулах, представляющих антитела, отсутствует Fcдомен. Специалистам в данной области знакомы способы конструирования таких молекул на основе антител. Например, рекомбинантные антитела можно получить из комбинации строительных блоков для антител (таких как Fc, (Fab')2, Fab, scFv, дитело) с мотивом гетеродимеризации для эффективного создания мультиспецифических антител. Способы согласно изобретению являются особенно пригодными при определении целостности антитела и, в частности, терапевтического антитела. Антитело отделяют и анализируют с использованием методов ОФ-ВЭЖХ/МС, описанных здесь, для определения присутствия продуктов деградации антитела. Способы, описанные здесь, позволяют специалистам в данной области оценить наличие димеров, продуктов расщепления антитела, продуктов дезамидирования, наличие окисления или образования Nконцевой пироглутаминовой кислоты или беспорядочного взаимодействия дисульфидных связей в антителе. Все эти характеристики являются показателями деградации, которая имеет место в антителе, и снижают структурную целостность антитела. Способы, описанные здесь ниже в примерах, показывают улучшенное хроматографическое разделение и точное определение молекулярной массы фармацевтических антител и продуктов их деградации. В способе применяется масс-спектрометр высокого разрешения с высокой точностью, способный определять различие в массе между двумя вариантами антитела, которые различаются только на один аминокислотный остаток (например, глицин 57 Да) или на одну группу сахара (например, галактоза 162 Да). Разрешение спектрофотометра по массе должно составлять по меньшей мере 3000 для обычного IgGантитела с молекулярной массой 150 кДа. Разрешение по массе рассчитывается следующим образом: Разрешение = MM/MM = 150 кДа/57 кДа 3000. В некоторых вариантах осуществления способы согласно изобретению могут детектировать изменение массы антитела или белка более чем 100 кДа до и после окисления, т.е. различие в массе, составляющее 16 Да. Это обеспечивает разрешение по массе 10000 для обычного антитела. Способы согласно изобретению дополнительно иллюстрируются в примерах ниже. Примеры Последующие примеры включены для демонстрации некоторых вариантов осуществления. Специалисты в данной области, очевидно, понимают, что описанные в примерах методы, представляют методы, разработанные заявителями для хорошего функционирования в практике изобретения, и таким образом, их можно рассматривать в качестве предпочтительных способов его практики. Однако специалисты в данной области в свете настоящего изобретения, очевидно, понимают, что можно внести много изменений в конкретные варианты осуществления, которые раскрыты, и при этом получить такой же или аналогичный результат, не отступая от сущности и объема изобретения. В предварительной заявке на патент США 60/621295 (включена здесь для сведения) приводится раскрытие рефолдинга молекулы IgG2 в присутствии окислителя-восстановителя и необязательно хаотропных агентов. Биологическая активность такого подвергшегося рефолдингу IgG2 была в шесть раз выше по сравнению с подвергшимся рефолдингу IgG2 без хаотропного агента и в три-четыре раза выше по сравнению с обычным контрольным IgG2-антителом, которое было приготовлено без применения редокс-реагентов для воспроизведения рефолдинга белка. Согласно вышепредставленной заявке при использовании IgG2 после рефолдинга будет возможно доставить более высокую эффективную дозу IgG2 при меньшем количестве белка. Такое снижение общего количества белка, необходимого для получения биологически эффективной ответной реакции, будет преимущественным, поскольку снижение количества такого белка, которое необходимо ввести животному, будет приводить к меньшему развитию побочной реакции при введении, например, внутривенной или подкожной инъекцией. Последующие примеры обеспечивают примерные варианты осуществления для достижения преимущественного рефолдинга молекул рекомбинантного IgG. Пример 1. Обсуждение рефолдинга белков. Рефолдинг белков, продуцированных Е. coli. В недавнем обзоре Rudolph и коллег (Lilie et al., 1998;Rudolph and Lilie, 1996) были представлены преимущества рефолдинга белков, продуцированных Е. coli. Авторы подчеркивали, что укладка белков представляет собой один из наиболее сложных механизмов в процессе продукции белков и и для каждого белка должны быть оптимизированы конкретные условия в отношении состава буфера, концентрации белка, температуры и так далее. Неправильное образование дисульфидных связей являются одной из проблем. Это означает усилить корректировку неправильного образования дисульфидных связей в периплазме Е. Coli, означает привести к сверхэкспрессии эндогенного периплазматического белка DsbC, который представляет собой дисульфидизомеразу. Другой путь- 24012162 заключается в культивировании в присутствии тиоловых реагентов, что приводит к перегруппировке неправильных дисульфидных связей, что как было показано приводит к повышению выхода нативных белков, содержащих множественные дисульфидные связи (Glockshuber et al., Verbessereung der ausbeuteChem., 268: 24547-24550, 1993). Цитировано несколько других патентов, касающихся рефолдинга белков(Lilie et al., Curr. Opin. Biotech., 9: 497-501, 1998). Также было показано, что пропоследовательность облегчает укладку нескольких белков, включая человеческий фактор роста нервов (Rattenholl et al., Eur. J.Biohem., 268: 3296-3303, 2001) из телец включения Escherichia coli. Промежуточные продукты укладки мышиных моноклональных IgG-антител Исследовали пути укладки мышиного антитела, относящегося к подклассу k/IgG1 (Lilie et al., J.Mol. Biol., 248: 190-201, 1995b), включая укладку домена, ассоциацию посредством образования дисульфидных связей и пролил цис/транс-изомеризацию. В исследовании было установлено, что при ренатурации Fab укладка после ассоциации Fd и легкой цепи определяется пролилизомеризацией. Определяли по меньшей мере четыре промежуточных продукта укладки на стадии укладки легкой цепи и конфигурацию, по меньшей мере, пролил-пептидной связи. Остаток Pro 159 во Fd-фрагменте может быть ответственным за наблюдаемую медленную укладку, и может быть необходима четвертичная, но не третичная структура для облегчения изомеризации (Lilie et al., J. Mol. Biol., 248: 190-201, 1995b). Для того же Fabфрагмента антитела было установлено, что взаимодействия домен-домен являются лимитирующей скорость укладки стадией, таким образом приводя к накоплению промежуточных продуктов укладки на поздней стадии укладки (Lilie et al., Protein Sci., 4: 917-924, 1995a). Ранее Lilie et al. (Lilie et al., ProteinSci., 2: 1490-1496, 1993) показали, что несколько пролилизомераз (PPI) ускоряли процесс рефолдингаFab-фрагмента антитела и повышали выход правильно уложенных молекул в условиях in vitro. Они функционировали в качестве катализаторов укладки белков, ускоряя ограниченную во времени изомеризацию пептидной связи Xaa-Pro (Lilie et al., Protein Sci., 2: 1490-1496, 1993). Альтернативная укладка мышиных моноклональных IgG-антител Была описана альтернативная укладка, которая отличается от нативных состояний, для моноклональных IgG-антител с интактными дисульфидными связями (Buchner et al., Biochemistry, 30: 6922-6929,1991; Welfle et al., Biochim. Biophys. Acta, 1431: 120-131, 1999). Согласно сообщениям, это конформационное состояние образуется при инкубации нативной или подвергшейся денатурации молекуле IgG при кислых значениях рН (3). Данное А-состояние характеризуется высокой степенью вторичной структуры, повышенной гидрофобностью, повышенной стабильностью к развертыванию под действием денатурирующих реагентов и нагревания и наличием третичной структуры (Buchner et al., Biochemistry, 30: 6922-6929, 1991). Было установлено (Buchner et al., J. Biol. Chem., 318: 829-836, 2002), что восстановленный Fab-фрагмент мышиного моноклонального антитела и его восстановленная легкая цепь образовывали специфическую, стабильную, но не нативную структуру при низком значении рН. Интересно, что явная стабильность альтернативной укладки восстановленной легкой цепи выше по сравнению с окисленной легкой цепью, на основании чего можно предположить, что дисульфидные связи внутри домена,которые являются решающими для обеспечения стабильности нативного состояния, приводят к дестабилизации альтернативной укладки (Buchner et al., J. Biol. Chem., 318: 829-836, 2002). Было установлено,что взаимодействия легкой и тяжелой цепей, стабилизированные внутрицепочечными дисульфидными связями в Fab-фрагменте, являются важными для образования альтернативной укладки (Lilie et al., FEBSLett., 362: 43-46, 1995). Welfle et al. установили, что снижение рН до 3,4-2,0 вызывало конформационные изменения и образование новой структуры, и на основании чего можно предположить, что десорбцию с колонок для аффинной хроматографии следует проводить при значении рН 3,5 или выше (Welfle et al.,Biochim. Biophys. Acta, 1431: 120-131, 1999). Рефолдинг уложенных иммуноглобулиновых белков с использованием GudHCl и L-аргинина Обсуждалось влияние добавок, таких как GuHCl, глутатион, L-аргинин, на рефолдинг уложенных иммуноглобулиновых белков (Umetsu et al., J. Biol. Chem., 278: 8979-8987, 2003). Спонтанная укладка в присутствии 1 М GudHCl приводила к образованию структуры, в которой достигалось правильное образование дисульфидных связей; однако, внесение L-аргинина приводило к образованию частично уложенного промежуточного продукта без дисульфидных связей (Umetsu et al., J. Biol. Chem., 278: 89798987, 2003). Пример 2. Установление структурной гетерогенности человеческих моноклональных IgG2-антител. В нескольких работах опубликованы спектры рентгеновской кристаллографии человеческих IgG1 антител (Saphire et al., Science, 293: 1155-1159, 2001; Saphire et al., J. Mol. Biol., 319: 9-18, 2002). Например, Saphire et al. (2001) представили спектр рентгеновской кристаллографии человеческого IgG1-b-12 антитела. Однако к настоящему времени отсутствуют данные по рентгеновской кристаллографии IgG2 антитела. В настоящем изобретении показано, что человеческие IgG2-антитела обладают структурной гетерогенностью, и такая гетерогенность может быть причиной затруднений для получения данных по рентгеновской кристаллографии для IgG2. Данные обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и катионообменной (СЕХ) ВЭЖХ показывали, что для всех исследованных IgG2-антител характерно наличие многих пиков на ОФ- и СЕХ-хроматограммах, в- 25012162 то время как IgG1-антитела выходят одним пиком. На фиг. 1 представлены ОФ-хроматограммы рекомбинантных человеческих антител с одинаковыми CDR в виде молекул IgG1 и XgG2. Аминокислотные последовательности имели 95% гомологию для данных двух молекул, но ОФ-хроматограммы различались и содержали много пиков для IgG2 и один пик для IgG1. На СЕХ-хроматограммах виден одинаковый характер пиков по сравнению с ОФ-хроматограммами (фиг. 2). После того, как собранные СЕХфракции повторно наносили на ОФ-колонку, то они элюировались вместе с ОФ-пиками целого образцаIgG2 (фиг. 2). Использовали масс-спектрометр с высокой разрешающей способностью Micromass/Waters Q-TOF для получения масс-спектров пиков, разделенных ОФ-ВЭЖХ. На фиг. 3 представлены ОФхроматограммы IgG2-антитела при детектировании по поглощению в УФ-свете и общему ионному току на масс-спектрометре. Из данных фигуры следует, что пик 1 давал более слабый ток по сравнению с другими пиками. Данные фиг. 3 показывают, что ионы IgG2, элюирующие в виде пика 1, содержат максимальное число 53 протонов на поверхности иона, придавая иону 53 положительный заряд. Молекулярные ионы IgG2 пика 1 имели примерно на 6 протонов меньше по сравнению с другими молекулами IgG2,элюирущими в виде пиков 2, 3 и 4, что указывает на то, что пик 1 содержит молекулы IgG2, которые уложены более компактно по сравнению с другими элюирущими молекулами данного образца. Меньший заряд на поверхности ионов пика 1 также дает меньший сигнал TIC (фиг. 3 А). С другой стороны, развернутые масс-спектры с использованием электрораспылительной ионизации показывают, что все изоформы IgG2, разделенные ОФ-ВЭЖХ, имели одинаковые значения молекулярной массы (ММ) в пределах точности определения массы 2 Да. Данный факт устраняет возможность большей части сообщений о структурных модификациях IgG2-антител. После восстановления и алкилирования ОФ-хроматографияIgG1- и IgG2-антител дает узкие пики для легкой и тяжелой цепей без наличия гетерогенности. Тот факт,что восстановление устраняет гетерогенность, указывает, что она связана с наличием дисульфидных связей. Подклассы IgG1- и IgG2-антител различаются по структуре шарнирной области, которая включает две дисульфидные связи между цепями в IgG1 и четыре в IgG2 (фиг. 4 и 43). На основании результатов вышепредставленных опытов можно высказать обоснованное предположение, что множественные изоформы IgG2 состоят из молекул с различным расположением дисульфидных связей в шарнирной области. При анализе представленных выше результатов заявители пришли к выводу о том, что молекулыIgG2 имеют несколько структурных вариантов, которые различаются по дисульфидным связям в шарнирной области. На фиг. 4, взятой из Kuby, Chapter 4 Iiranunoglobulins: Structure and Function, 2002, представлены все четыре подкласса IgG-антител в их обычной конфигурации. В действительности в результате исследований, проведенных Aalberse и Schuurman (Aalberse et al., Immunology, 105: 9-19, 2002), было установлено, что в предпочтительной конфигурации IgG4 CH1-области взаимодействуют с СН 2 доменами данного антитела (фиг. 5). На фиг. 4 показано, что структуры IgG4 очень схожи, включая четыре дисульфидных связи в шарнирной области. Имеются различия в аминокислотной последовательности шарнирной области, так что в результате не предполагается, что конфигурации IgG2 и IgG4 являются одинаковыми, но могут иметь аналогии и, возможно, укладываются, как IgG4-антитело на фиг. 5. В другом исследовании, проведенном Phillips et al. (Phillips et al., Mol. Immun., 31: 1201-1210, 1994) с использованием электронной микроскопии и анализа осаждения, было получено распределение формIgG2 по сравнению с другими тремя подклассами антител. Авторы данного исследования наблюдали распределение комплексов, которые существенно отличались от других подклассов. Наблюдали наличие циклических димеров, некоторого количества линейных димеров и большого количества мономеров. Эти факты интерпретировали в отношении энергетического барьера для смыкания кольца в результате ориентации Fab-плеч в IgG2, что, возможно, приводит к образованию линейных димеров в виде преобладающего комплекса, обнаруженного при аналитическом ультрацентрифугировании. Данные по осаждению (фиг. 6) показывают наличие частично разделенных многих пиков, дополнительно указывая на то,что молекулы IgG2 в структурном отношении являются гетерогенными (Phillips et al., Mol. Iranian., 31: 1201-1210, 1994). В другой работе Gregory et al. (Gregory et al., Mol. Immun., 24: 821-829, 1987) описано применение осаждения и анализа рассеивания рентгеновских лучей с небольшим углом подклассов IgG. Согласно данным авторов предполагается, что IgG1 имеет длину шарнирного участка 0-15 А и некопланарные Fab-плечи; IgG2 эффективно стабилизируется уложенными назад Fab-плечами. На основании двух цитированных выше работ (Gregory et al., Mol. Immun., 24: 821-829, 1987; Phillips et al., Mol.Immun., 31: 1201-1210, 1994) можно предположить, что IgG2 может иметь несколько конформационных состояний, включая конфигурацию с уложенными назад Fab-плечами. На фиг. 7 приведено несколько структур IgG2-антитела, предложенных авторами настоящей работы. Также на фиг. 7 представлена единственная опубликованная структура IgG1-антитела, полученная на основе данных рентгеновской кристаллографии. Пример 3. Рефолдинг IgG2-антител в присутствии редокс-реагентов приводит к снижению структурной гетерогенности IgG2 и повышает его активность. Результаты исследований, описанных выше, привели к возникновению идеи о рефолдинге IgG2- 26012162 антитела для проверки его активности. Рефолдинг проводили при инкубации антитела в буфере, содержащем смесь цистеин/цистин, при рН 8, 4 С в течение 72 ч. Предпочтительной редокс-сопряженной системой, используемой здесь, является смесь цистеин/цистин в качестве связующих окислительно-восстановительных реагентов. Исходное вещество представляло собой очищенный препарат IgG2-антитела. Буферами были 0,1 М цитрат или 0,2 Трис при рН 8,5. Концентрация белка IgG2 в реакционной смеси варьировала в пределах от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл. В предпочтительных примерах концентрация составляла от 2,5 мг/мл до 3 мг/мл. Применяли редокс-сопряжающую систему L-цистеина (в концентрации от 0 до 50 мМ) и способ оценивали в присутствии или отсутствии равных количеств L-цистеина и в присутствии или отсутствии 1 мМ ЭДТА. Температура при инкубации равнялась 4 С, 15 С и 22 С в течение 6, 18 и 48 ч. Обработанные препараты рекомбинантного белка охарактеризовывали ОФ-ВЭЖХ, как описано в примерах выше, и в описании к фиг. 1-15 у Dillon et al., предварительная заявка на патент США 60/621295 иPCT/US05/001840. Было установлено, что рефолдинг быстро происходит, когда редокс-система содержит примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистеина и примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистина. Смесь цистеин/цистин может находиться, но это не требуется, в соотношении концентраций 1:1. Кроме того, протокол включал 0,9 М GndHCl в буфере для незначительного развертывания (релаксации) структуры во время рефолдинга/окисления. На фиг. 8 приведены результаты двух опытов по рефолдингу. Результаты указывают, что два подвергшихся рефолдингу образца IgG2-антитела имеют гомогенную структуру и элюируют вместе в виде пиков 1 и 3 на ОФ-хроматограммах элюирования. Еще одной редокс-сопряжающей системой, которую можно использовать, является таковая, в которой восстановленный глутатион и окисленный глутатин (GSH/GSSG в соотношении 10:1) вносят в различных концентрациях от 0,1 до 5 мМ GSH. Можно оценить влияние рН и температуры при инкубации в присутствии данного реагента редокс-сопряжения. Значение рН может находиться в пределах от 5 до 9. Температура при инкубации может составлять 4, 22 или 31 С. В других вариантах осуществления варьировала температура, при которой IgG2 инкубировали в редокс-сопряжающей системе GSH/GSSG. Рефолдинг был более эффективным при 4 С по сравнению с комнатной температурой (фиг. 52). Биологическая активность подвергшегося рефолдингу IgG2 в присутствии 0,89 М гуанидингидрохлорида была в шесть раз выше по сравнению с подвергшимся рефолдингу IgG2 без гуанидингидрохлорида и в три-четыре раза выше по сравнению с контрольным; IgG2-антителом, которое получали без использования редокс-реагентов в целях воспроизведения рефолдинга белка (фиг. 47). Способы рефолдинга можно осуществлять с г и кг продуцированного клетками СНО контрольногоIgG2 с существенным повышением концентрации активной формы IgG2 на г вещества и снижением концентраций белка в растворе композиции. Таким образом, процессинг белка гуанидингидрохлоридом дополнительно будет повышать выход биологически активного белка. Результаты ОФ-ВЭЖХ/МС, описанные здесь, показывают, что все IgG2-антитела содержат множественные формы и их можно модифицировать по предложенному способу рефолдинга. С использованием подвергшегося рефолдингу IgG2 будет возможным вводить более высокую эффективную дозу IgG2 при меньшем количестве белка. Такое снижение общего количества белка, которое необходимо для воспроизведения биологически эффективной ответной реакции, будет преимущественным, поскольку уменьшение количества такого белка, которое необходимо ввести животному, вероятно,будет в меньшей степени приводить к развитию побочной реакции при введении, например, внутривенной или подкожной инъекцией. Способы согласно изобретению преимущественно позволят получать гомогенные препараты IgG2, которые во многих случаях представляют преимущественный тип фармацевтических средств на основе антител по сравнению с IgG1, поскольку имеется больший риск, связанный с высокой комплемент-связывающей активностью IgG1 по сравнению с IgG2. Несмотря на то, что в примерных протоколах с использованием редокс-реагентов, описанных выше,обработке подвергается очищенный препарат продуцированного рекомбинантным путем IgG2, предусматривается, что IgG2 может быть получен в присутствии такой редокс-сопряжающей системы, где реагенты добавляют в среду клеточных культур, в которой продуцируется белок. Альтернативно редоксреагенты можно вносить после очистки белка. Кроме того, несмотря на то, что примеры, приведенные здесь, относятся к исследованию гетерогенности IgG2, предусматривается, что способы можно легко адаптировать и использовать для любого рекомбинантного белка, который подвергается посттрансляционному рефолдингу и проявляет гетерогенность за счет присутствия дисульфидных связей, доступных для восстановления. Способы, описанные здесь, могут быть особенно пригодными для получения другихIgG, например, таких как IgG3- и IgG4-антитела, которые могут проявлять гетерогенность. Пример 4. Дополнительные исследования по получению и характеристике конформационных изоформ человеческих моноклональных IgG2-антител. Человеческие терапевтические белки, продуцированные клетками микроорганизмов, часто бывают неправильно уложены и накапливаются в виде нерастворимых телец включения. Белок затем требуется подвергнуть рефолдингу с использованием хаотропных агентов в условиях восстановления/окисления для получения биологической активности. До недавнего времени полагали, что продукция человеческих- 27012162 терапевтических белков клетками млекопитающих обеспечивает получение продукта, имеющего правильную укладку и посттрансляционные модификации. В настоящем примере установлено четыре структурных варианта IgG2-антитела против IL-1R и несколько других IgG2-антител. Данные вновь охарактеризованные структурные варианты являются уникальными для подкласса IgG2 (для рекомбинантных и нативных IgG2), которые не встречаются для IgG1 и IgG4. На основе этих фактов можно предположить, что подкласс IgG2 человеческих иммуноглобулинов можно дополнительно подразделить на подклассы с учетом представлений о конформационных вариантах. Материалы и методы Последующие материалы и методы являются примерными методами, использованными в настоящем примере. В других примерах использовали аналогичные такие методы, как конкретно указано в этих примерах. Очевидно, понятно, что данные примерные методы можно легко модифицировать для применения при анализе других IgG в контексте настоящего изобретения.IgG2-антитела против IL-1R и другие человеческие моноклональные IgG-антитела, использованные в данном опыте, экспрессировали рекомбинантным путем и очищали с использованием стандартной методики получения. IgG2-каппа из человеческих миеломных клеток из плазмы получали от Sigma, 15404. Проведение рефолдинга: в другом конкретном примере способа рефолдинга, использованного в настоящем изобретении, человеческое моноклональное IgG2-антитело против IL-1R инкубировали в концентрации 3 мг/мл или 10 мг/мл в двух буферах 1) 200 мМ Трис буфер при рН 8,0 (нативный рефолдинг); 2) 200 мМ Трис буфер при рН 8,0 с 0,9 М GuHCl (рефолдинг под действием GuHCl). Комбинацию цистеин:цистин добавляли в молярном соотношении соответственно 6 мМ : 1 мМ (3 мг/мл) и 10 мМ :1 мМ (10 мг/мл). Точную концентрацию цистина не определяли ввиду слабой растворимости цистина, однако, цистин обеспечивался по массе в соотношении, указанном выше. Образцы выдерживали при 2-8 С в течение 48 ч. Другие испытанные условия рефолдинга включали применение аргинина и мочевины в качестве хаотропного агента, другие соотношения цистеин:цистин и применение цистамина вместо цистина, пределы концентраций GuHCl 0-2 M и многие значения температуры во время проведения редокс-процесса. Анализ интактного антитела катионообменной хроматографией: белки наносили на слабую катионообменную колонку Dionex WCX10 в условиях функционирования со скоростью потока 0,80 мл/мин и 25 С. Использовали градиентное элюирование при повышении концентрации растворителя В и соответственно снижении растворителя в подвижной фазе. Растворитель А представлял 20 мМ ацетата натрия при рН 5,0, растворитель В включал 20 мМ ацетата натрия, 0,5 MNaCl при рН 5,0. Анализ интактного антитела и фрагментов антитела обращенно-фазовой ЖХ/МС: белки наносили на колонку С 8 Zorbax 300SB, работающую при 75 С. В оптимизированном методе использовали подвижную фазу, состоящую из смеси изопропилового спирта и ацетонитрила с 0,1% ТФУ. Система для капиллярной ВЭЖХ Agilent 1100 была соединена с масс-спектрометром Waters QTofMicro, снабженном источником электрораспылительной ионизации (ESI). Масс-спектрометр ESI-QTOF был установлен в режиме положительных ионов с капиллярным напряжением, равным 3400 V, напряжением на воронке для образца 70-100 V, пределах m/z 1000-5000 и разрешении массы 5000. Прибор был настроен и откалиброван с использованием множественно заряженных ионов бычьего трипсиногена,23981,0, Sigma T1143. Развертку ESI-масс-спектров проводили с использованием алгоритма MaxEnt1 программного обеспечения MassLynx производства Waters. Ограниченный протеолиз с использованием пепсина: расщепление человеческого IgG2 проводили методом, аналогичным описанному (Turner and Bennich, 1968, Biochem. J., v.107, 171-178), но при более низком значении рН и в течение более короткого периода времени. IgG2-антитело против IL-1R и несколько других IgG2-антител подвергали ограниченному протеолизу с использованием пепсина в течение 1 ч при рН 2,5 в 100 мМ аммонийно-ацетатном буфере, рН 2,5 при комнатной температуре с одним добавлением пепсина. Расщепление проводили без денатурации при соотношении фермента к белку (мас./мас.), равном 1:50. Восстановление, окисление и расщепление трипсином: восстановление и алкилирование проводили с использованием IgG в денатурирующих условиях с получением свободной тяжелой и легкой цепей для проведения дальнейшей аналитической характеристики. Антитело разводили до концентрации 2 мг/мл 7,5 M гуанидингидрохлоридом (Mallinckrodt,7716), 0,1 М Трис-HCl (Fluka), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА, Sigma 6281-92-6),рН 7,5 до объема 0,5 мл. Вносили 5 мкл 0,5 M маточного раствора дитиотреитола (DTT, производстваSigma D5545) с получением концентрации 5 мМ DTT и реакционную смесь помещали при 37 С на 30 мин. Затем раствор белка охлаждали до комнатной температуры и добавляли 13 мкл 0,5 М маточного раствора йодацетата (IAM, Sigma I1149) для получения концентрации IAM, равной 13 мМ. Алкилирование проводили при комнатной температуре в течение 40 мин в темноте. 0,5 мл от объема восстановленного и алкилированного вещества заменяли на 1 мл 10 мМ раствора ацетата натрия (JT BAKER, Phillipsburg, NJ,9526-03) рН 5,0 до конечной концентрации 1 мг/мл белка. Обмен буфера проводили с использованием колонки для гель-фильтрования NAP-5, упакованной Sephadex G-26 (Pharmacia Biotech).- 28012162 Расщепление трипсином градации для секвенирования проводили с использованием восстановленного и алкилированного IgG из предыдущего раздела. Лиофилизованный трипсин (Worthington 3744) суспендировали в воде до конечной концентрации 0,50 мг/мл. Восстанавливающий буфер заменяли на буфер для расщепления, включающий 0,1 М Трис, 1 М мочевины, 20 мМ гидроксиламина (Sigma Н 9876), рН 7,5. 1 М мочевины и 20 мМ гидроксиламина добавляли соответственно для повышения растворимости легкой и тяжелой цепей и для защиты белка от карбамилирования (Cohen, 1968, Ann. ReviewBiochem.,v.37, pp.695-726). Расщепление трипсином проводили в течение ночи (15 ч) при 37 С с использованием соотношения фермент:белок, равного 1:50. Расщепление гасили добавлением небольшого количества 20% муравьиной кислоты до конечной концентрации муравьиной кислоты 0,2%. Перевар помещали в автосамплер при 4 С для анализа ОФ-ЖХ/МС или замораживали для последующего анализа. Меньшие количества антитела восстанавливали, алкилировали и расщепляли с использованием аналогичного метода в меньших объемах с теми же молярными соотношениями компонентов. ВЭЖХ подвергшихся расщеплению трипсином пептидов: подвергшиеся расщеплению трипсином пептиды разделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе для ВЭЖХ Agilent 1100, снабженном УФ-детектором, автосамплером, микропроточной ячейкой и колонкой с контролируемой температурой. Для разделения пептидов использовали колонку Polaris Ether,2502 мм, с размером частиц 3 мкм, С 18 смола с размером пор 300(Varian, Torrance, CA, USA). Растворителями были: А=0,1% трифторуксусной кислоты в воде и В=90:9,015:0,085 ACN:вода:ТФУ. Методику проводили следующим образом. Подвергшиеся обработке трипсином пептиды вводили в колонку для ОФ-ВЭЖХ, которую затем уравновешивали 100% А. В течение 205 мин шел линейный градиент 050% В. Колонку элюировали со скоростью подвижной фазы 200 мкл/мин и температуру поддерживали при 50 С. В целом на колонку было нанесено 20 мкг общего перевара белка для анализа массспектрометрией. Элюат с колонки анализировали с использованием УФ-детектора и затем направляли на ионозахватывающий масс-спектрометр. Ионозахватывающая масс-спектрометрия: использовали ионозахватывающий масс-спектрометр Thermo Finnigan LCQ DECA в комбинации с системой для ВЭЖХ для идентификации продуктов расщепления. Массы пептидов и их фрагментов получали с использованием метода тройной игры, включающего полный скан, затем зум-скан и МС/МС. Использовали стандартный осевой источник электрораспылительной ионизации в виде поверхности раздела атмосфера-вакуум. Аппарат настраивали с использованием дважды заряженных ионов синтетического пептида (m/z 842). Для идентификации пептидов использовали алгоритм программного обеспечения Termo Finnigan BioWorks 3.1 и программное обеспечение Mass Analyzer. Тест связывания: покрытые биотином флуоресцентные микросферы (шарики Beadlyte (Upstate Biotechnology Inc. покрывали гибридным белком авидин-IL-1R. Шарики промывали для удаления несвязанного белка и аликвотные порции вносили в 96-луночный планшет с дном-фильтром (Millipore Corp.). Затем к микросферам добавляли оттитрованные количества тестируемых антител (в разведении от 1 нМ до 61 фкМ). Связывание антител с захваченным микросферами гибридным белком авидин-IL-1R детектировали с использованием козьего античеловеческого, конъюгированного с рФикоэритрином (Fab')2 (Southern Biotechnology). Реакции связывания анализировали с использованием прибора Luminex 100 (Luminex Corp.). Количество антитела, связавшегося со связанным с микросферами белком, было пропорционально среднему значению интенсивности флуоресценции (MFI) по данным прибора. Кривые связывания и соответствующие значения ЕС 50 (концентрация антитела, генерирующая половинный от максимального ответ) рассчитывали с помощью программного обеспечения PRISM. Биологическая активность (тест на хондроцитах): готовили серийные разведения IgG2-антитела против IL-1R, рефолдинг 1-формы 1 и рефолдинг 2 формы 3 в пределах от 40 нМ до 0,0256 пкМ средой для теста. 50 мкл разведенных тестируемых антител вносили в лунки 96-луночного планшета с высеянными человеческими хондроцитами при титре 10000 клеток/лунку в объеме 100 мкл. Конечная концентрация антител составляла от 10 нМ до 0,0064 пкМ. После 30 мин инкубации вносили 50 мкл рекомбинантного человеческого IL-1R до конечной концентрации 10 пкМ. После инкубации в течение ночи определяли активность антител с использованием ELISA сIL-6 и MMP-13. Инкубирование продукции IL-6 и ММР-13 рассчитывали в виде процента от максимальной активности IL-1-бета. Строили кривые зависимости ингибирования ответа для каждого тестируемого антитела и определяли соответствующие значения IC50 (концентрацию антитела, которая приводит к уменьшению сигнала на 50%) с использованием программного обеспечения Graph Pad PRISMAa. Биологическая активность (антителоопосредованный лизис): для теста антителоопосредованного лизиса клеток антитело добавляли к цельной крови (1 мг/мл),инкубировали в течение 48 ч (37 С, 5% СО 2), проводили клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (FACS) (метка Т/В-клеток и лизис эритроцитов) и затем анализировали. Истощение В/Т-клеток определяли проточной цитометрией.- 29012162 Результаты Результаты катионообменной (СЕХ) и обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии IgG2-антитела против IL-1R указывали на наличие структурной гетерогенности IgG2 (фиг. 1 и 2 А), хотя структура антитела оценивалась двумя методиками в очень разных условиях. Антитело находилось в нативном конформационном состоянии (характеризующемся противоположными по направлению бета-складками) в подвижной фазе при СЕХ, которая по своему составу близка к физиологическим условиям по значению рН, температуре и концентрации соли. С другой стороны,антитело находилось в расплавленном глобулярном состоянии (Buchner et al., 1991, Biochemistry, v.30,pp.6922-6929; Ptitsyn et al., 1990, FEBS Lett., v.262, pp.20-24; Kuwajima, 1989, Proteins, v.6, pp.87-103), когда элюировалось с обращенно-фазовой колонки с высоким процентом изопропанола в 0,1% водном растворе ТФУ (рН 2) при 75 С. Данные кругового дихроизма в дальнем УФ-свете указывают, что бетаскладки нативного глобулина превращались в спиральные и произвольно закрученные расплавленные структуры в данных условиях ОФ-хроматографии. На основании того факта, что нативная и расплавленная структуры, элюированные с СЕХ- и ОФ-колонок, имеют одинаковые хроматограммы, можно предположить, что конформационные изоформы имеют различные ковалентные структуры, которые сохраняют различие в нативном и расплавленном состоянии. Для исследования корреляции пиков, разделенных при использовании двух различных методов, собирали четыре фракции, полученные при СЕХ, и наносили на ОФ-колонку (фракции при СЕХ 1, 2, 3 и 4). Повторное введение СЕХ-фракций 1, 2, 3 и 4 привело к совместному элюированию пиков 1, 2, 3 и 4 при ОФ-ВЭЖХ, указывая, что имеется корреляция между относительным количеством и порядком элюирования пиков (фиг. 2 В). В результате данного опыта также было получено дополнительное доказательство того, что ОФ-хроматография сама по себе не является источником расщепления пиков, а в большей степени представляет иной пригодный аналитический инструмент для детектирования ковалентных вариантов. Человеческое моноклональное IgG2-антитело против IL-1R клонировали и экспрессировали в виде IgG1. Подтип IgG1 имеет более чем 96% гомологию последовательности с IgG2. Анализировали СЕХ и ОФ-ВЭЖХ человеческое IgG1-mAb против IL-1R с использованием аналогичных методов, как описано ранее. Анализ IgG1 с помощью СЕХ и ОФ-ВЭЖХ давал хроматограммы, на которых имелся один гомогенный пик. IgG1-антитело элюирует примерно в то же время, что и форма 3 (при ОФ-ВЭЖХ пик 3) IgG2-антитела (фиг. 1). С использованием ESI-ортогонального-TOF масс-спектрометра, описанного в экспериментальном разделе, соединенного с системой ОФ-ВЭЖХ, было установлено, что четыре изоформы IgG2 имеют одинаковые значения молекулярной массы в пределах ошибки определения на приборе, равной 2 Да (фиг. 45). Это элиминировало различия гликозилирования, варианты лизина и другие химические модификации, характерные для деградации, связанные со значительным изменением массы как причины гетерогенности. Несмотря на то, что развернутые ESI масс-спектры изоформ показали одинаковые значения молекулярной массы, изоформы несли различное количество положительных зарядов (протонов) на их поверхности. Проводили ОФ-хроматографию интактного антитела при детектировании в УФ-свете при 215 нм и определение общего ионного тока (TIC) (фиг. 3 А). Также получали ESI масс-спектры, содержащие множественные заряженные ионы интактных антител, для четырех разделенных изоформ. Эти данные показывали, что элюирующие позднее формы несли большее количество положительных зарядов(фиг. 3 В). Это обстоятельство указывает на то, что данные варианты обладают большей площадью поверхности и, возможно, лучшей доступностью остатков основных аминокислот для протонов (Chowdhurry and Chait, 1991, Anal. Chem., v.63, pp.1660-1664; Dobo and Kaltashov, 2001, Anal. Chem., v.73,pp.4763-4773; Fenn, 1993, J. Am. Soc. Mass Spectrom. , v.4, pp. 524-535). Когда данные формы элюировали с ОФ-колонки, то форма 3 имела большую площадь поверхности с большим числом зарядов, в то время как форма 1 имела меньшую площадь поверхности и более уложенную структуру. Тот факт, что форма 3 имела большее число зарядов по сравнению с формой 1, также был подтвержден в опытах, которые показывали, что форма 3 также обеспечивает более высокий общий ионный ток (TIC), но меньшее поглощение в УФ-свете по сравнению с формой 1. Это означает, что форма 3 несет большее количество зарядов по сравнению с формой 1. Увеличение концентрации растворителя В во время получения пика при элюировании пика составляет менее 0,5%. Следовательно, изменение органического растворителя для электрораспыления является незначительным и не должно привести к сдвигу пиков m/z. Проводили контрольный опыт с использованием (структурно гомогенного) IgG1-антитела для получения дополнительных доказательств того, что различие в заряде не индуцировано минорным изменением процента органического растворителя в элюирующей подвижной системе. После восстановления и алкилирования гетерогенность исчезла и на ОФ-хроматограммах IgG2 антитела с восстановленными дисульфидными связями имел место только один узкий пик легкой цепи и один узкий пик тяжелой цепи (фиг. 46). Данные факты вновь указывают на то, что открытые вариантыIgG2-антитела имеют различную связь через дисульфиды или открытые дисульфидные связи. Открытый дисульфид представлял возможность, поскольку одна открытая дисульфидная связь будет увеличивать массу на 2 Да, что находится в пределах ошибки определения массы для интактного антитела с молекулярной массой 150 кДа. Структурные варианты, возникающие за счет дисульфидных связей, имеют другие ковалентные структуры, которые можно разделить как при СЕХ в нативных условиях, так и при ОФ- 30