Белок липокалин

011816 Настоящее изобретение относится к новому белку (обозначенному как INSP181) и его производным, идентифицированному в настоящей заявке как липокалин, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие указанный белок, для диагностики,профилактики и лечения заболеваний. Все цитируемые в настоящем описании публикации, патенты и патентные заявки включены в описание посредством ссылки в полном объеме. Область техники, к которой относится изобретение В настоящее время в области разработки лекарственных средств происходят фундаментальные изменения в связи с приходом эры функциональной геномики. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных о последовательностях этих белков. Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастают, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков по изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности. Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов,кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной. Липокалины представляют собой небольшие секретируемые белки, которые, как полагают, вовлекаются в транспортировку небольших гидрофобных молекул. Липокалины характеризуются мультидоменной структурой, включающей домен связывания лиганда, который в типичном случае вовлекается в процесс связывания малых гидрофобных молекул, и консервативный домен связывания с рецептором клеточной поверхности, который в типичном случае вовлекается в процесс связывания предположительного рецептора на клеточной поверхности, который может быть общим более чем для одного липокалина, и открытый конец складчатой структуры, которая формирует макромолекулярный комплекс, вовлекающий, возможно, рецептор клеточной поверхности. Несмотря на большое разнообразие на уровне последовательности, липокалины характеризуются структурной гомологией: один восьмицепочечный антипараллельный -цилиндр с присоединенной спиралью отчетливо формирует характерную "складчатую структуру липокалина". Один конец цилиндра открыт для поступления растворителя и содержит сайт связывания лиганда. Совокупность четырех петель соединяющихся цепей придает специфичность процессу связывания лиганда. Самые близкородственные представители семейства липокалинов отличаются наличием трех характерных мотивов в последовательности. Представители данной группы включают ретинолсвязывающий белок; пурпурин; белок, связывающий ретиноевую кислоту; альфа-2-микроглобин; крупный белок мочи; билинсвязывающий белок; альфа-крустацианин; белок 14, характерный для беременности, беталактоглобин; нейтрофильный липокалин и белок choroid plexus. Липокалины Outlier классифицируются как таковые, поскольку они содержат два или менее консервативных мотива последовательности, и указанные белки включают одорантсвязывающий белок, белок железы фон Эбнера, пробазин и афродизин. В связи с вышесказанным идентификация липокалинов чрезвычайно важна в свете возрастающего понимания путей, лежащих в основе развития некоторых болезненных состояний и ассоциированных с ними болезненных состояний, и для разработки более эффективных подходов в генной и/или лекарственной терапии для лечения указанных расстройств. Изобретение Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что белок человека, называемый в настоящем описании как INSP181, представляет собой липокалин. Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептиды по настоящему изобретению осуществляют положительную регуляцию Т-хелперных цитокинов 2 (Th2), более конкретно интерлейкина-10 (IL-10), интерлейкина-4 (IL-4) и интерлейкина-5 (IL-5). Полипептид INSP181 был исследован на его способность воздействовать на секрецию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови человека (МКПК), стимулированными митогеном - конкавалином А (ConA). Было показано, что данный полипептид стимулирует секрецию IL-10, IL-4 и IL-5 из ConA-стимулированных МКПК человека при тестировании в разведении 1/10 (46,2 мкг в тесте). Не был выявлен эффект на уровне IFN-, TNF- или IL-2. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полипептиды по настоящему изобретению демонстрируют неожиданно ограниченную экспрессию в образцах биопсии кожи, и в особенности в образцах биопсии кожи, взятых при псориазе. В общих чертах, процедура состояла в том, что праймеры, специ-1 011816 фичные для INSP181, исследовали с использованием набора примерно из 100 образцов нормальной ткани человека и пораженных заболеванием, представляющих первичные клетки и клеточные линии, а также 44 образцов биопсии ободочной кишки и повздошной кишки от индивидуумов с воспалительным заболеванием кишечника и 39 образцов биопсии, взятых из вариантов клинического испытания IL-18-связывающего белка (IL18BP). Полученные результаты показаны в табл. 3 и 4 и проиллюстрированы графически на фиг. 12 и 13. Неожиданно оказалось, что экспрессия INSP181 отмечается на низком уровне только в образцах кожи (0,16% от GAPDH) (табл. 5, фиг. 12) и в образцах биопсии кожи от пациентов с псориазом (положительный ответ в случае 19/39 образцов) (табл. 4, фиг. 13). Результаты, полученные с использованием второй пары праймеров, специфичных для экзона 4/6 (прямой праймер в экзоне 4 и обратный праймер в экзоне 6), подтвердили специфичность эффекта для кожи. В первом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, где указанный полипептид:(i) включает аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, которая представлена в виде SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID(ii) представляет собой фрагмент, который является липокалином или имеет общую антигенную детерминанту с одним или несколькими полипептидами по п.(i); или(iii) представляет собой функциональный эквивалент по п.(i) или (ii). Предпочтительно полипептид по первому аспекту изобретения состоит из аминокислотной последовательности или включает аминокислотную последовательность, которая представлена в виде SEQ IDNO: 18 или SEQ ID NO: 24, представляет собой ее фрагмент, который функционирует как липокалин,или имеет общую антигенную детерминанту с таким полипептидом; или является функциональным эквивалентом такого полипептида. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 2, называется далее в тексте как "полипептид экзона 1 INSP181". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 4, называется далее в тексте как "полипептид экзона 2 INSP181". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 6, называется далее в тексте как "полипептид экзона 3 INSP181". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 8, называется далее в тексте как "полипептид экзона 3 INSP181-SV1". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 10, называется далее в тексте как "полипептид экзона 4 INSP181SV1". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 12, называется далее в тексте как "полипептид экзона 4 INSP181". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 14, называется далее в тексте как "полипептид экзона 5 INSP181". Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 16, называется далее в тексте как "полипептид экзона 6 INSP181".SEQ ID NO: 18 получают путем объединения SEQ ID NONO: 2, 4, 6, 12, 14 и 16. Полипептид,имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 18, называется далее в тексте как "полипептид INSP181".SEQ ID NO: 24 получают путем объединения SEQ ID NONO: 2, 4, 8, 10, 14 и 16. Полипептид,имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 18, называется далее в тексте как "полипептид INSP181-SV1". Белок INSP181-SV1 содержит 25 аминокислотных вставок в стартовом кодоне 4. Второй клон INSP181-SV1 (INSP181-SV1-полиморф) был идентифицирован при исследовании пула, содержащего кДНК, полученные из слюнной железы, надпочечника, глаза и универсальной эталонной матрицы РНК Stratagene, которая содержит кДНК INSP181-SV1. Указанный клон содержит нуклеотидные замещения А 275 С и G340A, которые приводят к аминокислотным замещениям N92T и G114S. Указанные варианты рассматриваются как проявления полиморфизма в последовательности INSP181. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 36, называется далее в тексте как "полипептид-полиморф N92T экзона 3 INSP181" и включает аминокислотное замещениеN92T. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 38, называется далее в тексте как "полипептид-полиморф N92T экзона 3 INSP181-SV1" и включает аминокислотное замещение N92T. Полипептид, имеющий последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 40, называется далее в тексте как "полипептид-полиморф INSP181N92T". SEQ ID NO: 40 получают путем объединения SEQ IDSEQ ID NONO: 2, 4, 8, 56, 14 и 16. Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что полипептид INSP181, полипептид INSP181-SV1, полипептид-полиморф INSP181 N92T, полипептид-полиморф INSP181-SV1 N92T и полипептид-полиморф INSP181-SV1 G114S могут включать на N-конце сигнальный пептид из 20 аминокислот. Экзон 1 в полипептиде INSP181 и в полипептиде INSP181-SV1 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показан в виде SEQ ID NO: 20 и далее в тексте называется как "зрелый полипептид экзона 1 INSP181". Последовательность полипептида INSP181 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде SEQ ID NO: 22 и далее в тексте называется как "зрелый полипептидINSP181". Последовательность полипептида INSP181-SV1 без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде SEQ ID NO: 26 и далее в тексте называется как "зрелый полипептидINSP181-SV1". Последовательность полипептида-полиморфа INSP181 N92T без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде SEQ ID NO: 42 и далее в тексте называется как "зрелый полипептид-полиморф INSP181 N92T". Последовательность полипептида-полиморфа INSP181-SV1N92T без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде SEQ ID NO: 46 и далее в тексте называется как "зрелый полипептид INSP181-SV1-N92T". Последовательность полипептидаполиморфа INSP181-SV1-G114S без этой предполагаемой сигнальной последовательности показана в виде SEQ ID NO: 60 и далее в тексте называется как "зрелый полипептид INSP181-SV1-N92T". Последовательность полипептида, показанная в виде SEQ ID NO: 66, называется далее в тексте какINSP181-SV1" и включает сплайсинг-вариант домена липокалина. Полипептиды по первому аспекту настоящего изобретения могут дополнительно содержать гистидиновую метку. Такая гистидиновая метка предпочтительно присутствует у С-конца данного полипептида. Предпочтительно такая гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно указанная гистидиновая метка содержит 6 гистидиновых остатков. Соответственно, предпочтительными полипептидами являются такие полипептиды,которые включают последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ IDINSP181 с гистидиновой меткой" и включает домен липокалина с гистидиновой меткой. Полипептид,имеющий последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 72, называется далее в тексте как"полипептид домена липокалина INSP181-SV1 с гистидиновой меткой" и включает сплайсинг-вариант домена липокалина с гистидиновой меткой. Термин "полипептиды INSP181" в контексте настоящего описания обозначает полипептиды, включающие зрелый полипептид экзона 1 INSP181, полипептид INSP181, зрелый полипептид INSP181, полипептид INSP181-SV1, зрелый полипептид INSP181-SV1, полипептид INSP181 с гистидиновой меткой,зрелый полипептид INSP181 с гистидиновой меткой, полипептид INSP181-SV1 с гистидиновой меткой,зрелый полипептид INSP181-SV1 с гистидиновой меткой, полипептид-полиморф INSP181 N92T, зрелый полипептид-полиморф INSP181 N92T, полипептид-полиморф INSP181-SV1-N92T, зрелый полипептидполиморф INSP181-SV1-N92T, полипептид-полиморф INSP181 N92T с гистидиновой меткой, зрелый полипептид-полиморф INSP181 N92T с гистидиновой меткой, полипептид-полиморф INSP181-SV1 N92T с гистидиновой меткой, зрелый полипептид-полиморф INSP181-SV1 N92T с гистидиновой меткой, по-3 011816 липептид-полиморф INSP181-SV1 G114S с гистидиновой меткой, зрелый полипептид-полиморфINSP181-SV1 G114S с гистидиновой меткой, полипептид-полиморф INSP181-SV1 G114S, полипептид домена липокалина INSP181 и полипептид домена липокалина INSP181-SV1 и его вариант с гистидиновой меткой. Полипептиды, включая полипептиды домена липокалина, которые содержат и N92T, и G114S полиморфные варианты, также являются аспектами настоящего изобретения. Полипептиды INSP181 и INSP181-SV1 содержат, предположительно, одинаковый сайт гликозилирования по аминокислоте 92 (фиг. 10), который также является местом локализации предполагаемогоN92T полиморфизма. Замещение аспарагина в положении 92 будет препятствовать осуществлению Nгликозилирования. Наличие или отсутствие сахарных фрагментов может оказывать существенное влияние на функционирование полипептидов INSP181. Авторы изобретения отметили наличие дисульфидной связи между цистеиновыми аминокислотными остатками 90 и 181. Полипептиды по настоящему изобретению, в которых указанные цистеиновые остатки связаны дисульфидной связью, включаются в область настоящего изобретения. Термин "липокалин" относится к молекуле, содержащей по меньшей мере один домен липокалина. Предпочтительно термин "липокалин" относится к молекуле, содержащей домен липокалина, выявляемый с показателем е-значения менее чем 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,0002, 0,00001, 0,000001 или 0,0000001. Предпочтительно термин "липокалин" относится к молекуле, спариваемой с НММ, созданным на основе базы данных Pfam entry, что выявляется с показателем е-значения менее чем 0,1, 0,01, 0,001,0,0001, 0,0002, 0,00001, 0,000001 или 0,0000001. Предпочтительно полипептид по любому из указанных выше аспектов настоящего изобретения функционирует как липокалин. Предпочтительно домен липокалина кодируется участком, соответствующим остаткам 41-189 в аминокислотной последовательности INSP181. Последовательность домена липокалина показана в виде SEQ ID NO: 66. Другие полипептиды по настоящему изобретению включают фрагменты, которые важны для сохранения активности липокалина, и полипептиды, которые включают домен липокалина или состоят из домена липокалина, как показано на фиг. 14 (например, аминокислотные остатки 25-174, или аминокислотные остатки 26-180, или аминокислотные остатки 33-166) и на фиг. 11 (например, аминокислотные остатки 41-189), а также фрагмент, содержащий цистеиновые остатки, формирующие дисульфидную связь (например, аминокислотные остатки 96-187). Другой полипептид по настоящему изобретению представляет собой домен липокалина, расположенный между остатками 25 и 181 в INSP181. В полипептиде TNSP181-SV1 домен липокалина расположен между остатками 25 и 206 и включает последовательность, показанную в виде SEQ ID NO: 70. Термин "функция липокалина" используется в контексте настоящего описания для обозначения полипептидов, включающих аминокислотную последовательность или структурные особенности, которые могут быть идентифицированы как консервативные свойства в полипептидах семейства белков липокалинов, так что взаимодействие такого полипептида с его биологическим партнером, по существу, не будет оказывать вредного воздействия в сравнении с функционированием полноразмерного полипептида дикого типа. В частности, авторы относят к таким свойствам наличие цистеиновых остатков в определенных положениях полипептида, что создает возможность образования дисульфидных связей. Липокалины используются в качестве диагностических и прогностических маркеров при различных болезненных состояниях. Плазменный уровень AGP отслеживают в ходе беременности и при проведении диагностической и прогностической оценки состояний, включающих химиотерапию рака, дисфункцию почек, инфаркт миокарда, артрит и рассеянный склероз. Ретинолсвязывающий белок (RBP) используют в клинической практике в качестве маркера канальцевой реабсорбции в почке, и аро D является маркером кистозно-фиброзной мастопатии. Белок железы фон Эбнера также известен как слезный липокалин, слезный преальбумин или VEGP. Аналогично другим липокалинам VEGP является переносчиком ретинола или других малых гидрофобных соединений. VEGP связывает ретинол in vitro и, как считается, выполняет антимикробную функцию в глазе частично, поскольку он связывает длинноцепочечные жирные кислоты, которые ингибируют активацию лизоцима (Glasgow, 1995 Arch. Clin. Exp. Ophtalmol. 233: 513-522). Данный белок может также инактивировать оболочечные вирусы, способствовать распределению по поверхности липидной пленки в глазе и/или защищать эпителий. Другой член семейства липокалинов включает белок связывания ретиноевой кислоты в яичках(ERBP), который гомологичен по пространственной структуре ретинолсвязывающему белку в сыворотке крови (Newcomer et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 12876-12879). Считается, что ERBP играет важную роль в созревании спермы и проходит через яички. Было показано, что ERBP связывает большой перечень ретиноидов, включающих ретинол (витамин А), ретиналь, ретинил ацетат, бета-ионон, цис-ретиноиды, бета-каротин, холестерин, терпеноиды, бета-лонилиденацетат, длинноцепочечные сложные эфиры ретинола и ретиноевой кислоты (Flower, 1996 Biochem. J. 318: 1-14) in vivo и/или in vitro. Как было показано,ретиноиды выполняют важную роль в процессах клеточной дифференцировки и пролиферации, а также(Goodman, D., 1984 N. Engl. J. Med. 310: 1023-1031). Синтаза простагландина D2, будучи членом семейства липокалинов, вовлекается в синтез простагландина D2 в мозге за счет катализа превращения простагландина Н 2 в простагландин D2. Как и другие липокалины, синтаза PD2 является переносчиком гидрофобных соединений. Синтаза PD2 связывает ретинол in vitro и, как предполагается, выполняет функцию транспортной молекулы для секретируемых ретиноидов, которые циркулируют в различных жидкостях организма, доставляя их к соответствующим внутриклеточным переносчикам. Попадая внутрь клеток, ретиноиды связываются с димеризованным рецептором, выполняя в итоге свою биологическую роль по регуляции разнообразных процессов, таких как морфогенез, дифференцировка и митогенез (Tanaka et al., 1997, ibid). Другие виды активности, ассоциированные с членами семейства липокалинов, включают антимикробную активность, транспортировку феромонов, активность в качестве модуляторов воспаления, участие в функции обоняния и регуляцию иммунного ответа, а также регуляцию развития нервной системы и антибактериальную активность. Один из липокалинов, ассоциированных с модуляцией иммунной функции, представляет собой липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL). NGAL локализован в специфических гранулах в нейтрофилах, будучи как в виде мономеров, так и димеров (Bartsch et al., 1995 FEBS Letters 357: 255-259). NGAL является типичным липокалином по своей способности связывать малые гидрофобные молекулы для транспортировки их через гидрофильные жидкости. Хотя физиологический лиганд для NGAL еще не идентифицирован, было показано, что он связывает бактериальный фактор хемотаксиса FMLP, и это указывает на то, что, предположительно, данная молекула связывает липофильные воспалительные медиаторы (Bungaard et al., 1994 Biochem. Biophys. Res. Comm. 202: 1468-1475). Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что описываемые в изобретении полипептиды осуществляют положительную регуляцию Th2, более конкретно интерлейкина-10 (IL-10), интерлейкина-4 (IL-4) и интерлейкина-5 (IL-5). Кроме того, неожиданно было обнаружено, что полипептиды по настоящему изобретению демонстрируют неожиданно ограниченную экспрессию в образцах биопсии кожи, и в особенности в образцах биопсии кожи, взятых при псориазе. Иммунные заболевания могут быть разделены на такие, при которых отмечается доминирование Т хелперных клеток 1 (Th1) или Т хелперных клеток 2 (Th2). Лекарственные средства могут влиять наTh1/Th2 баланс, что можно использовать для модификации рассматриваемого аутоиммунного заболевания. В контексте настоящего описания Th1 заболевание определяется как заболевание, выбранное из болезни Крона, диабета типа I, болезни Хашимото, болезни Грейвса (тироидит), кожного заболевания Th1 типа, такого как псориаз или гиперкератозный дерматоз, ревматоидного артрита, пролиферативного гломерулонефрита и гломерулонефрита с клубочками полулунной формы, рассеянного склероза, увеита заднего отдела глазного яблока, заживления раны и/или саркоидоза. Предпочтительно Th1 заболевание представляет собой псориаз. Предпочтительно гиперкератозный дерматоз выбирают из псориаза, красного питириаза и/или порокератоза. В контексте настоящего описания Th2 заболевание определяется как заболевание, выбранное из аллергических состояний, таких как аллергический ринит, астма, кожного заболевания Th2 типа, такого как плоский красный лишай, хронического синусита, синдрома Сезари, рака, лучевого кератоза, гепатита С,язвенного колита, мембранозного гломерулонефрита и/или вирусной инфекции. Предпочтительно Th2 заболевание выбирают из атопического дерматита, контактного дерматита,контактной аллергии, например, к никелю или золоту, кожной Т-клеточной лимфомы, атопической экземы, острой экземы и/или хронической экземы. Предпочтительно атопический дерматит представляет собой острый атопический дерматит. Предпочтительно Th2 заболевание представляет собой атопический дерматит. Предпочтительно рак выбирают из кожной Т-клеточной лимфомы, плоскоклеточной карциномы и/или базально-клеточной карциномы. Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что полипептид по настоящему изобретению, один или как часть белка слияния и/или как фрагмента, может переключать сдвиг Тклеточных цитокинов с Th1 на Th2. В качестве такового полипептид по настоящему изобретению, один или как часть белка слияния и/или его фрагмента, может использоваться для лечения Th1 заболевания. Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, может переключать сдвиг Т-клеточных цитокинов с Th2 на Th1. В качестве такового антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, может использоваться для лечения Th2 заболевания. Например, усиленный Th2 иммунный ответ и образование цитокинов, таких как IL-4, IL-5 и IL-13, будут действовать в направлении индукции аллергии и астмы (Ngoc et al. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2005 Apr.; 5 (2): 161-6). В качестве такового-5 011816 антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, может использоваться для лечения астмы и/или аллергии. Кроме стратегии направленного воздействия на клеточные механизмы при лечении псориаза используют методы терапии, связанные с гуморальной иммуномодуляцией, осуществляемой за счет воздействия на имеющееся в дисбалансе цитокинов доминирование цитокинов типа 1 с повышенным уровнем IL-2, -6, -8, TNF- или TNF-. Указанная модуляция может быть достигнута путем введения экзогенных дефицитных цитокинов типа 2 с противоположным регулирующим воздействием, таких как IL-4,-10 и -11, для отклонения процесса дифференцировки от продукции Т-клеточных цитокинов типа I к продукции Т-клеточных цитокинов типа II, которое стимулирует эндогенную дифференцировку лимфоцитов типа I до достижения нормального ответа. Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что полипептиды по настоящему изобретению могут функционировать таким образом. Лекарственные препараты, модулирующие продукцию цитокинов, таких как IL-4 или IL-10, известны в данной области, а введение рекомбинатных цитокинов, таких как IL-4, IL-10 и IL-11, рассматривается как способ лечения псориаза (Schleyer et al., J. Eur. Acad. Dermatol. Venerol., 2005 Jan.; 19 (1): 1-20). Например, на начальной фазе испытаний 1b с использованием разных доз рекомбинатного IL-4 были получены впечатляющие результаты, указывающие на антипсориатический эффект препарата(Schleyer et al.). 20 человек из 22 пациентов, которым в течение 6 недель проводились еженедельно инъекции IL-4 в 5 разных дозах, завершили испытания, и у 1 пациента отмечались побочные реакции II степени. У 18 пациентов показатель PASI снизился на 60-80% в течение 6 недель и в течение 6-недельного периода наблюдений не отличался. Отмечалась зависимость улучшения от дозы у больных с псориазом,ассоциированная со снижением инфильтрации кожи и с нормализацией структуры эпидермиса. Такого рода первые результаты испытаний позволяют полагать, что описанный подход путем сдвига иммунного дисбаланса может быть очень удачной стратегией в лечении псориаза, поскольку затрагивает исключительно недавно активированные Т клетки. В зоне псориатических поражений отмечается относительная недостаточность экспрессии кожногоIL-10. Указанный Th2 цитокин является мощным ингибитором функций АРС, таких как пролиферация Т клеток. Он также подавляет продукцию цитокина типа I, включая IFN- или TNF-, и, в этой связи, выполняет необходимую роль в контроле воспалительных ответов кожи. Можно полагать, что системное введение IL-10, как и в случае других видов традиционной терапии,такой как лечение с использованием производных сложных эфиров фумаровой кислоты, местного введения аналогов витамина D3 и УФ-облучение, которые действуют, в числе других, по механизму положительной регуляции эндогенного IL-10, будет эффективным при лечении псориаза за счет относительного восстановления баланса цитокинов. Проведенные исследования показали, что липокалины могут быть полезны для лечения следующих заболеваний: расстройство зрения (например, ночная слепота), расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные состояния, воспалительное заболевание кишечника(например, рак молочной железы, кожная Т-клеточная лимфома, плоскоклеточная карцинома и/или базально-клеточная карцинома), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибные инфекции), кожные болезни (например, кожное заболевание, ассоциированное с Th1, такое как псориаз или гиперкератозный дерматоз; кожное заболевание, ассоциированное с Th2, такое как атопический дерматит, контактный дерматит, контактная аллергия, например, к никелю или золоту, кожная Т-клеточная лимфома, атопическая экзема, острая экзема и/или хроническая экзема), репродуктивные расстройства(например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункция почки, инфаркт миокарда, артрит,рассеянный склероз, кистозно-фиброзная мастопатия, регуляция развития нервной системы, диабет типаI, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса (тироидит), ревматоидный артрит, пролиферативный и гломерулонефрит с клубочками полулунной формы, увеит заднего отдела глазного яблока, заживление раны и/или саркоидоз, красный питириаз и/или порокератоз, аллергические расстройства, такие как аллергический ринит, астма, красный плоский лишай, хронический синусит, синдром Сезари, лучевой кератоз,гепатит С, язвенный колит, мембранозный гломерулонефрит и/или вирусные инфекции. Считается, что INSP181 может принадлежать к подсемейству иммунокалинов и что ему присущи все функциональные свойства иммунокалинов, более конкретно свойства гликоделина (см., например,обзор Logdberg and Wester. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1482 (1-2): 284-97). Члены этого семейства кодируются генным кластером на участке q32-34 хромосомы 9 генома (INSP181) человека на участке q34. Гликоделин вовлекается в процессы оплодотворения, иммуномодуляции и дифференцировки. Могут быть выявлены три основные изоформы гликоделина (GdA, GdS и GdF), придающие специфические функциональные свойства и определяющие важность гликозилирования для проявления биологической активности членов подсемейства иммунокалинов. В документе WO 02/053701 описываются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие липокалин,и полипептиды липокалина (более конкретно - ген ЕР 17 человека), которые могут использоваться для создания на мышах модели мужского бесплодия, для скрининга разрабатываемых лекарственных средств-6 011816 и лечения состояний, связанных с бесплодием. В документе DE19807389 описываются моноклональные антитела против гликоделина А, используемые при лечении рака. Предпочтительно активность полипептида по настоящему изобретению, одного или в качестве части белка слияния, или его фрагмента, и/или его антагониста, может быть подтверждена с использованием по меньшей мере одного из следующих тестов:a) на моделях рака кожи, описанных в обзоре Одаширо с соавт. (Odashiro et al., Drug Discovery Today:b) на моделях контактного дерматита или атопической экземы, описанных в обзоре Гутермута с соавт. (Gutermuth et al., Drug Discovery Today: Disease Models 2005; в печати), илиc) на моделях атопического дерматита, описанных в обзоре Женга и Жу (Zheng and Zhu, Curr. Allergyd) на модели мышей D6, описанной в работе Джемисона с соавт. (Jamieson et al., Nat. Immunol. 2005e) по процедуре количественного теста, позволяющего определить уровень цитокиновой секреции клетками МКПК, стимулированными Con А, описанной в примере 5. Более конкретно, активность полипептида по настоящему изобретению, одного или в качестве части белка слияния, или его фрагмента,и/или его антагониста, может быть подтверждена, если выявляется модуляция по меньшей мере одного из следующих цитокинов: IL-4, IL-5 и/или IL-10. Предпочтительно модуляции подвергаются два (например, IL-4 и IL-5; IL-4 и IL-10; или IL-5 и IL-10) или все три цитокина. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению, один или в качестве части белка слияния или его фрагмента, осуществляет положительную регуляцию одного или нескольких указанных выше цитокинов. Предпочтительно антагонист, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, осуществляет отрицательную регуляцию одного или нескольких указанных выше цитокинов. Активность полипептидов по настоящему изобретению, например INSP181, может быть определена по любому из методов, приведенных в настоящем описании или известных в данной области. Полипептиды по первому аспекту настоящего изобретения могут дополнительно содержать гистидиновую метку. Такая гистидиновая метка предпочтительно присутствует у С-конца данного полипептида. Предпочтительно такая гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно указанная гистидиновая метка содержит 6 гистидиновых остатков."Антигенная детерминанта" по изобретению может представлять собой часть полипептида по изобретению, которая связывается с антигенсвязывающим сайтом антитела или с Т-клеточным рецептором(TCR). Альтернативно, "антигенная детерминанта" может представлять собой сайт на поверхности полипептида по изобретению, с которым связывается одна молекула антитела. Вообще говоря, антиген имеет несколько или множество различных антигенных детерминант и реагирует с антителами, обладающими множеством различных специфичностей. Такое антитело предпочтительно является иммуноспецифичным к полипептиду по изобретению. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к полипептиду по изобретению, который не составляет часть гибридного белка. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к INSP181, INSP181-SV или к его фрагменту. Антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и могут иметь специфические трехмерные структуры, а также определенный заряд. Предпочтительно термин "антигенная детерминанта" означает конкретную химическую группу на полипептиде по изобретению, которая является антигенной, то есть вырабатывает специфический иммунный ответ. Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по первому аспекту изобретения. Термин "очищенная молекула нуклеиновой кислоты" предпочтительно означает молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, которая: (1) отделена по меньшей мере примерно от 50% белков, липидов,углеводов или других соединений, с которыми ассоциируется природная полноразмерная нуклеиновая кислота при ее выделении из клеток-источников; (2) не связана со всеми полинуклеотидами или с их частью,с которыми указанная "очищенная молекула нуклеиновой кислоты" ассоциируется в природе, (3) функционально присоединена к полинуклеотиду, с которым она не ассоциируется в природе; или (4) не встречается в природе как часть более крупной полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению, по существу, не содержит любой(ых) другой(их) примесной(ых) молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты или других примесей, которые присутствуют в ее природном окружении и могут препятствовать использованию этой нуклеиновой кислоты для продуцирования полипептидов, или ее терапевтическому, диагностическому или профилактическому применению, или применению в целях исследования. Предпочтительный вариант изобретения, в частности, относится к геномных ДНК, которые не входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно геномная ДНК, в частности, имеющая размер более чем 10 т.п.н.(тысяч пар нуклеотидов), 50, 100, 150, 200, 250 или 300 т.п.н., не входит в объем изобретения. При этом предпочтительно, если такая "очищенная молекула нуклеиновой кислоты" состоит-7 011816 только из кДНК. Предпочтительно очищенная молекула нуклеиновой кислоты состоит из или включает последовательность(ти) нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1 (кодирующей полипептид экзона 1INSP181), SEQ ID NO: 13 (кодирующей полипептид экзона 5 INSP181), SEQ ID NO: 15 (кодирующей полипептид экзона 6 INSP181), SEQ ID NO: 17 (кодирующей полипептид INSP181), SEQ ID NO: 19 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 INSP181), SEQ ID NO: 21 (кодирующей зрелый полипептидINSP181-SV1 G114S), SEQ ID NO: 61 (кодирующей полипептид-полиморф INSP181-SV1 G114S с гистидиновой меткой), SEQ ID NO: 63 (кодирующей зрелый полипептид-полиморф INSP181-SV1 G114S с гистидиновой меткой), SEQ ID NO: 65 (альтернативный нуклеотид экзона 2), SEQ ID NO: 67 (кодирующей полипептид домена липокалина INSP181), SEQ ID NO: 69 (кодирующей полипептид домена липокалинаINSP181 с гистидиновой меткой), SEQ ID NO: 71 (кодирующей полипептид домена липокалина INSP181SV1) и/или SEQ ID NO: 73 (кодирующей полипептид домена липокалина INSP181-SV1 с гистидиновой меткой). В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42 С в растворе, содержащем 50% формамид, 5XSSC (150 мМ NaCl,15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5 раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1 Х SSC приблизительно при 65 С. В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения. В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором четвертого аспекта настоящего изобретения. В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом по первому аспекту изобретения и который предпочтительно ингибирует способность полипептида по первому аспекту изобретения переносить малые гидрофобные молекулы. Лиганды для полипептидов по изобретению могут иметь различные формы, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы размером до 2000 Да, а предпочтительно 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела и их структурные или функциональные миметики. Такие соединения могут быть идентифицированы с использованием описанных выше методов анализа и скрининга. В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида по первому аспекту изобретения. Соединение по седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида. Важно отметить, что идентификация функции полипептидов INSP181 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения по шестому и седьмому аспектам изобретения могут-8 011816 быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения. Соединения, идентифицированные как агонисты полипептидов по настоящему изобретению, могут использоваться для транспортировки малых гидрофобных молекул, in vitro или in vivo. Например, соединения-агонисты могут использоваться в качестве компонентов некоторых известных сред для культивирования клеток, для доставки малых гидрофобных молекул в клетки и для защиты их от разрушения ферментами, присутствующими в сыворотке крови. Антагонисты (например, антитела) INSP181, INSP181-SV1, полиморфа INSP181 N92T, полиморфаINSP181-SV1 N92T и/или полиморфа INSP181-G114S могут использоваться при лечении рака, более конкретно рака, поражающего головной мозг, яичники, яичко, селезенку, поджелудочную железу, матку,кровь и/или легкое. Предпочтительно антагонисты (например, антитела) INSP181-SV1, полиморфа INSP181-SV1 N92T или полиморфа INSP181-SV1 G114S (полученные с использованием кДНК слюнной железы, надпочечника и глаза) могут использоваться при лечении рака, в частности рака, поражающего слюнные железы,надпочечник и/или глаз. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению гена или полипептидаINSP181 в качестве мишени для скрининга кандидатов на лекарственные средства-модуляторы, а в частности лекарственных средств-кандидатов, обладающих активностью, направленной против расстройств,ассоциированных с липокалином. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с липокалином, где указанные способы включают выявление способности указанного соединения связываться с геном, или полипептидом INSP181, или с их фрагментами. Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с липокалином, где указанные способы включают анализ на модуляцию активности гена, или полипептида INSP181, или их фрагментов. В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду по первому аспекту настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту настоящего изобретения, или к вектору по четвертому аспекту настоящего изобретения, или к клетке-хозяину по пятому аспекту настоящего изобретения, или к лиганду по шестому аспекту настоящего изобретения,или к соединению по седьмому аспекту настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики. Фрагменты соединений по настоящему изобретению могут найти применение в производстве лекарственного средства для лечения некоторых заболеваний, включающих, без ограничения, расстройство зрения (например, ночную слепоту), расстройства иммунной системы (например, аутоиммунные расстройства), воспалительные состояния, воспалительное заболевание кишечника (IBD), язвенный колит(UC), болезнь Крона (CD), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак молочной железы, кожную Т-клеточную лимфому, плоскоклеточную карциному и/или базально-клеточную карциному), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибковые инфекции), эмфизему, кожные болезни (например, кожное заболевание, ассоциированное с Th1, такое как псориаз или гиперкератозный дерматоз; кожное заболевание, ассоциированное с Th2, такое как атопический дерматит, контактный дерматит, контактную аллергию, например, к никелю или золоту, кожную Т-клеточную лимфому, атопическую экзему, острую экзему и/или хроническую экзему), репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункцию почки, инфаркт миокарда, артрит, кистозно-фиброзную мастопатию, регуляцию развития нервной системы, диабет типа I, болезнь Хашимото, болезнь Грейвса (тироидит), ревматоидный артрит, пролиферативный гломерулонефрит и гломерулонефрит с клубочками полулунной формы, увеит заднего отдела глазного яблока, заживление раны и/или саркоидоз, красный питириаз и/или порокератоз, аллергические расстройства, такие как аллергический ринит, астма, плоский красный лишай, хронический синусит, синдром Сезари, актинический кератоз, гепатит С, язвенный колит, мембранозный гломерулонефрит и/или вирусные инфекции. Приведенные далее в примерах анализы могут использоваться для идентификации терапевтически активных фрагментов. В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или оценку активности полипептида по первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем,где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания. Более высокая экспрессия липокалинов может быть обнаружена у пациентов с кожными заболева-9 011816 ниями, такими как псориаз, в сравнении с пациентами, не имеющими такого заболевания, или у пациентов, которые подвергались воздействию аллергенов. Например, у пациентов, которые подвергались воздействию никеля или золота (контактная аллергия), определяют значительное повышение уровня желатиназы нейтрофилов, ассоциированной с липокалином (NGAL) (Moller et al. Contact Dermatitis. 1999 Apr.; 40 (4): 200-4). Положительная регуляция пептидов/полипептидов, таких как NGAL, также выявляется при заживлении раны и может служить объяснением экспрессии этих пептидов/полипептидов при псориазе и заживлении раны (Sorensen et al. J. Immunol. 2003 Jun. 1; 170 (11): 5583-9). Кроме того, выраженная индукция NGAL в эпидермисе наблюдается в случае многих кожных расстройств, характеризующихся разбалансировкой процесса дифференциации эпителия, таких как псориаз, красный питириаз и плоскоклеточная карцинома (Mallbris et al. Exp. Dermatol. 2002 Dec.; 11 (6): 584-91). Так, Маллбрис с соавт. (Mallbris et al.) делают вывод о том, что NGAL является маркером разбалансировки процесса дифференциации кератиноцитов в коже человека. Таким образом, суперэкспрессия некоторых полипептидов по настоящему изобретению может коррелировать с прогрессированием заболевания и/или может служить прогностическим показателем его течения. Считается, что некоторые ткани млекопитающих при заболевании Th1 типа или при заболеванииTh2 типа содержат более высокое число копий гена для белка INSP181 и экспрессируют существенно повышенные уровни белка INSP181 и мРНК, кодирующей белок INSP181, в сравнении с соответствующим, "стандартным" млекопитающим, то есть с млекопитающим того же вида, но не имеющим заболевания Th1 типа или заболевания Th2 типа. Повышенные уровни белка INSP181 определяются в некоторых жидкостях организма (например, в сыворотке крови, плазме, моче, синовиальной жидкости и спинальной жидкости) и/или в коже млекопитающих, имеющих заболевание Th1 типа или заболевание Th2 типа, в сравнении с его уровнем в сыворотке/коже млекопитающих того же вида, но не имеющих заболевания Th1 типа или заболевания Th2 типа. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу,используемому при диагностике заболевания Th1 типа или заболевания Th2 типа, который включает анализ уровня экспрессии гена, кодирующего белок INSP181, или числа копий гена в клетках млекопитающего, в частности в коже или в жидкости организма, и сравнение уровня экспрессии данного гена или числа копий гена со стандартными значениями уровня экспрессии гена или числа копий гена, где повышение уровня экспрессии гена или числа копий гена в сравнении со стандартными значениями является показателем некоторых заболеваний Th1 типа или заболеваний Th2 типа. В том случае, когда заболевание Th1 типа или заболевание Th2 типа уже диагностировано традиционными методами, то настоящее изобретение может использоваться для целей прогноза. Фраза "анализ уровня экспрессии гена, кодирующего белок INSP181" относится к качественному или количественному измерению или оценке уровня белка INSP181 или уровня мРНК, кодирующейINSP181, в первом биологическом образце либо непосредственно (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка или уровня мРНК), либо опосредованно (например, путем сравнения с уровнем белка или уровнем мРНК во втором биологическом образце). Фраза "анализ числа копий гена,кодирующего белок INSP181" относится к качественному или количественному измерению или оценке числа копий гена, кодирующего INSP181, в первом биологическом образце либо непосредственно (например, путем определения или оценки абсолютного числа копий гена), либо опосредованно (например,путем сравнения с числом копий гена, кодирующего белок INSP181, во втором биологическом образце). Предпочтительно уровень белка INSP181, уровень мРНК или число копий гена в первом биологическом образце измеряют или оценивают и сравнивают со стандартным значением уровня белкаINSP181, уровня мРНК или числа копий гена, где стандарт отбирают из второго биологического образца,полученного от индивидуума, не имеющего заболевания Th1 типа или заболевания Th2 типа. Альтернативно, в том случае, когда данный способ используют как прогностический показатель, и первый, и второй биологические образцы могут быть отобраны от индивидуумов, имеющих заболевание Th1 типа или заболевание Th2 типа, и могут быть измерены соответствующие значения уровней экспрессии или числа копий для определения прогноза заболевания. Как известно в данной области, когда известно стандартное значение уровня белка INSP181, уровня мРНК или числа копий гена, указанное значение может использоваться повторно, в качестве стандарта, для сравнения. Термин "биологический образец" означает любой биологический образец, полученный от индивидуума, из клеточной линии, культуры ткани или другого источника, который содержит белок INSP181 или соответствующую мРНК, предпочтительно из кожи. Способы получения образцов биопсии из ткани и жидкостей тела млекопитающих известны в данной области. В том случае, когда биологический образец должен включать мРНК, образец биопсии ткани является предпочтительным источником. Настоящее изобретение используется для выявления заболевания Th1 типа или заболевания Th2 типа у млекопитающих. В частности, настоящее изобретение используется при диагностике или для прогностической оценки у млекопитающих указанных выше типов Th1 заболевания или Th2 заболевания. Предпочтительные млекопитающие включают обезьян, пчел, кошек, собак, коров, свиней, лошадей, кроликов и людей. Особенно предпочтительными являются люди. Один возможный способ детекции полипептидов по первому аспекту изобретения включает стадии:(а) контактирования лиганда по шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса. Что касается девятого аспекта изобретения, то в этой связи следует отметить, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, известные читателю-специалисту, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Подобные методы могут быть использованы в короткий или продолжительный период времени,что позволяет проводить мониторинг терапевтического лечения заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к наборам, которые могут быть использованы в указанных методах диагностики заболевания. В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида по первому аспекту изобретения в качестве липокалина. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться для связывания небольших молекул жирных кислот, например, в крови или тканях для модуляции их биологической функции. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться для транспортировки ретиноидов или стероидов к рецепторам, в частности, в качестве составной части терапии при раке молочной железы, эмфиземе и заболеваниях кожи и играют важную роль в репродуктивном процессе. Другие варианты использования включают модуляцию противовоспалительных ответов, активность в качестве микробного агента либо как усилителя ферментативной функции, либо в качестве самой ферментоподобной молекулы. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться благодаря своим противомикробным свойствам. Противомикробная активность может быть измерена in vitro с использованием культуры клеток или in vivo путем введения молекул по настоящему изобретению в организм животного соответствующей модели. Анализы на выявление противомикробной активности являются специфичными для конкретных микробов и, в основном, известны специалистам в данной области. Например, анализ in vivo на противомикробную активность проводится путем внутрибрюшинной инокуляции мышам патогенных микроорганизмов в соответствующей бульонной среде. Сразу после инокуляции вводят композицию,содержащую данный полипептид, и регистрируют уровень смертности в течение 7 последующих дней. В основном, введение проводят внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным способом или через рот. См., например, работу Musiek et al., Antimicrobial Agents Chemother. 3: 40, 1973, в которой содержится обсуждение методов анализа противомикробных агентов in vivo и in vitro. Активность полипептидов по настоящему изобретению может быть измерена с использованием большого числа методов анализа, которые позволяют определить их способность связывать малые гидрофобные молекулы. Такие методы анализа включают, без ограничения, методы анализа, основанные на определении изменений в интенсивности флуоресценции (Cogan et al., Eur. J. Biochem. 65: 71-78, 1976), и равновесный диализ водорастворимых соединений (Hase et al., J. Biochem. 79: 373-380, 1976). Другие варианты использования молекул по настоящему изобретению включают использование их в качестве системы доставки для транспортировки и/или стабилизации малых липофильных молекул. Например, молекулы по настоящему изобретению могут использоваться для микроинкапсулирования малой липофильной молекулы, которая образует активный фармакологический агент, и таким образом защищают данный агент от влияний экстремальных значений рН в кишке от воздействия мощных пищеварительных ферментов и последствий непроницаемости мембран желудочно-кишечного тракта для активного ингредиента. Другие преимущества инкапсулирования фармакологического агента включают предупреждение преждевременной активации агента или защиту его от агрессивной среды желудка. В последнее время стали использовать складчатую структуру липокалина для создания белков, обладающих специфичностью для неприродных лигандов. Такие сконструированные липокалины могут рассматриваться как миметики антител и получили, в этой связи, название "антикалины" (см. обзор в работе Skerra, Biochim Biophys Acta. 2000 Oct. 18; 1482 (1-2): 337-50). Соответственно, полипептиды по настоящему изобретению могут найти применение в синтезе "антикалинов". В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции,содержащей полипептид по первому аспекту изобретения, или молекулу нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту изобретения, или вектор по четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяин по пятому аспекту изобретения, или лиганд по шестому аспекту изобретения, или соединение по седьмому аспекту настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду по первому аспекту изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору по четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину по пятому аспекту изобретения, или к лиганду по шестому аспекту изобретения, или к соединению по седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях приготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний, включая расстройства зрения (например, ночную слепоту), иммунные системные расстройства (например, аутоиммунные расстройства), воспалительную болезнь кишечника (IBD), язвенный колит (UC), болезнь Крона (CD), проктит, клеточно-пролиферативные расстройства, рак (например, рак- 11011816 молочной железы), микробные инфекции (например, вирусные, бактериальные и грибковые инфекции),эмфизему, заболевания кожи, репродуктивные расстройства (например, бесплодие, в частности мужское бесплодие), дисфункцию почки, инфаркт миокарда, артрит, рассеянный склероз, кистозно-фиброзную мастопатию и регуляцию нервной системы. В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида по первому аспекту изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты по второму или третьему аспекту изобретения, или вектора по четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина по пятому аспекту изобретения, или лиганда по шестому аспекту изобретения, или соединения по седьмому аспекту изобретения. Полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться сами по себе как компоненты гибридных белков, таких как гибридный белок Fc, и/или в сочетании с одним или несколькими агентами,действующими как отрицательные регуляторы Th1. Антагонисты, например антитело против полипептида по настоящему изобретению, могут использоваться сами по себе или в сочетании с одним или несколькими агентами, действующими как отрицательные регуляторы Th2. Агенты, действующие как отрицательные регуляторы Th1 или Th2, известны в данной области и не ограничиваются указанными ниже агентами. Предпочтительно агент, действующий как отрицательный регулятор Th1, выбирают из клеточных иммуномодуляторов, гуморальных иммуномодуляторов, полипептида Т, Mycobacterium vaccae, тазаротена, бексаротена, троглитазона, лиарозола, рамбазола, аргинина, оксида азота, циклоспорина, метотрексата, аналогов витамина D3, ретиноидов, кортикостероидов, антралина, дегтя, псоралена плюс UVA(PUVA), куркумина, полиподиума, лейкотомаса, глюкокортикоида, такого как предизон, и/или средств,оказывающих влияние на баланс Th1/Th2 (адаптогены), таких как изофлавоны сои, растительные стеролы, стеролины, пробиотики и/или прегненолон. Предпочтительно клеточный иммуномодулятор выбирают из DAB389IL-2, микофенолята мофетила, VX-497, лефлуномида, эфализумаба, OKTedr4a, CTLA4-Ig, MEDI 507, LFA3TIP, даклизумаба, базиликсимаба, такролимуса, пимекролимуса и/или сиролимуса. Предпочтительно гуморальный иммуномодулятор выбирают из IL-4, IL-10, IL-11, инфликсимаба,этанерцепта, онерцепта и/или адалимумаба. Предпочтительно агент, действующий как отрицательный регулятор Th2, выбирают из антагонистов (например, антител) хемокинового рецептора CCR3 или CCR4, антагонистов CXCR4, анти-TARC,ингибиторов молекулы адгезии VLA-4, агонистов PPAR-, циклопентеноновых простагландинов, тиазолодиндионов, SB203580, SB239063, RWJ67657, аналогов витамина D3, глюкокортикоидов, микобактерий, анти-IL-5/IL-13/IL-9, растворимого IL-4R, ингибиторов CD80/86, лиганда ICOS, агониста Toll-подобного рецептора (TLR)-9, такого как CpG ДНК, CTLA4-Ig, антисмысловых олигонуклеотидов GATA3,Mycobacterium bacillus Calmette-Guerin (BCG), Mycobacterium vaccae, анти-IgE, агонистов бета рецептора, кортикостероидов, семян периллы, кверцетина, лютеолина, изофлавонов, глюкокортикоида, такого как предизон, и/или средств, гармонизирующих баланс Th1/Th2 (адаптогенов), таких как изофлавоны сои, растительные стеролы, стеролины, пробиотики и/или прегненолон. В случае заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида по первому аспекту изобретения ниже, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И, наоборот, в случае заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида по первому аспекту изобретения выше, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела. Полипептиды INSP181 представляют собой липокалины, а поэтому они играют определенную роль в развитии многих патологических состояний. Антагонисты полипептидов INSP181 представляют особый интерес, поскольку они позволяют благоприятно воздействовать на динамику патологических состояний. В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, которые являются дефицитными по полипептиду первого аспекта настоящего изобретения и не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни указанного полипептида или вообще не экспрессируют такого полипептида. Указанные трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики данного заболевания. Используемый здесь термин "функциональный эквивалент" означает молекулу белка или нуклеиновой кислоты, обладающую функциональными или структурными свойствами, в основном, аналогичными свойствам молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты по изобретению. Функциональный- 12011816 эквивалент белка может содержать модификации, если такие модификации необходимы для осуществления конкретной функции. Термин "функциональный эквивалент" включает фрагменты, мутанты, гибриды, варианты, аналоги или химические производные молекулы. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая любой одной или несколькими функциональными активностями полипептидов по изобретению. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая, по существу, аналогична активности INSP181 или его фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты,обладающая активностью, которая идентична активности или превышает активность INSP181 или его фрагментов, измеренную в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты,обладающая активностью, которая составляет 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 100% или более от активностиINSP181 или его фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть белок или полипептид, обладающий in vivo или in vitro активностью, которая, по существу, аналогична активности полипептидов по изобретению. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть белок или полипептид,способный взаимодействовать с другими клеточными или внеклеточными молекулами по механизму,который, по существу, аналогичен механизму взаимодействия соответствующей части полипептидов по изобретению. Так, например, в иммуноанализе "функциональный эквивалент" может способствовать снижению способности к связыванию антитела с соответствующим пептидом (то есть пептидом, имеющим модифицированную аминокислотную последовательность, а поэтому являющимся "функциональным эквивалентом") полипептида по изобретению или с самим полипептидом по изобретению, где указанное антитело вырабатывается против соответствующего пептида полипептида по изобретению. Эквимолярная концентрация указанного функционального эквивалента будет снижать уровень вышеупомянутого связывания соответствующего пептида по меньшей мере примерно на 5%, предпочтительно примерно на 5-10%, более предпочтительно примерно на 10-25%, еще более предпочтительно примерно на 25-30% и наиболее предпочтительно примерно на 40-50%. Так, например, функциональные эквиваленты могут быть полностью функциональными либо у них может отсутствовать одна или несколько активностей. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением модификации могут влиять на функцию, например на активности полипептида, которые подтверждают их идентификацию как домена лиопкалина. Различные стандартные методы и процедуры, которые могут применяться для осуществления изобретения, систематизированы ниже. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных вариантов изобретения и эта терминология не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения. В настоящем описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот. Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения используются стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Более полное описание указанных методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы в качестве консультации, приводятся в следующих работах: Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), DNA Cloning,Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acidand C.C. Blackwell eds. 1986). Используемый здесь термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированных пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам). Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может- 13011816 присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности. Полипептид по первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, такому как соединение, увеличивающее время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю). В частности, гибридный белок полипептида может содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей и фрагментов полипептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно указанный фрагмент является доменом липокалина, например, представленным в виде SEQID NO: 66, SEQ ID NO: 70 или в виде участка аминокислот 25-174, аминокислот 26-180, аминокислот 33166 или аминокислот 41-189 в SEQ ID NO: 18 или участка аминокислот 25-206 в SEQ ID NO: 24. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению, содержащий последовательность, которая гомологична по меньшей мере на 85% полипептиду INSP181, является гибридным белком. Такие гибридные белки могут быть получены путем клонирования полинуклеотида, кодирующего полипептид,содержащий последовательность, которая гомологична по меньшей мере на 85% полипептиду INSP181, в рамке считывания с последовательностями, кодирующими гетерологичную белковую последовательность. Используемый здесь термин "гетерологичный" означает любой полипептид, отличающийся от полипептида INSP181 человека. Примеры гетерологичных последовательностей, которые могут содержаться в гибридных белках, на амино- или карбоксиконце, включают внеклеточные домены связанного с мембраной белка, константные области иммуноглобулина (Fc области), домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, экспортные последовательности и последовательности, позволяющие проводить очистку по методу аффинной хроматографии. Многие из приведенных гетерологичных последовательностей коммерчески доступны в виде плазмид экспрессии, поскольку указанные последовательности обычно включаются в гибридные белки с тем,чтобы получить дополнительные свойства, не нарушив существенно специфической биологической активности слитого с ними белка (Terpe K., 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 523-33). Примеры таких дополнительных свойств включают увеличение полужизни в физиологических жидкостях, внеклеточную локализацию или облегчение процедуры очистки за счет наличия тяжа из гистидинов, образующих так называемую "гистидиновую метку" (Gentz et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 821-4), или "НА" метки, эпитопа, полученного из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al. 1994, Cell, 37: 76778). При необходимости гетерологичная последовательность может быть удалена при протеолитическом расщеплении, например, путем встраивания сайта протеолитического расщепления между белком и гетерологичной последовательностью, с последующей обработкой очищенного гибридного белка соответствующей протеазой. Указанные свойства особенно важны в случае гибридных белков, поскольку облегчают их получение и использование при изготовлении фармацевтических композиций. Так, например,использованный в примерах белок (зрелый полипептид INSP181; SEQ ID NO: 22) был очищен по процедуре, включающей присоединение гексагистидинового пептида к карбоксиконцу INSP181. В том случае,когда гибридный белок включает область иммуноглобулина, указанный гибрид может быть получен путем прямого присоединения компонентов или путем их присоединения посредством короткого линкерного пептида, длина которого может составлять по меньшей мере 1-3 аминокислотных остатка или более, например 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть, например, трипептид с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met) или линкерная последовательность, состоящая из 13 аминокислот и содержащая последовательность Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, встроенную между последовательностью веществ по настоящему изобретению и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время его присутствия в физиологических жидкостях (например, увеличенное время полужизни), повышенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии или способность указанного гибридного белка легко подвергаться очистке. В предпочтительном варианте изобретения белок присоединяют к константной области молекулыIg. Предпочтительно такой белок присоединяют к областям тяжелой цепи, таким как домены СН 2 и СН 3,например, IgG1 человека. Для получения гибридных белков по изобретению могут быть также использованы и другие изоформы Ig, такие как изоформы IgG2 или IgG4, и изоформы других классов Ig, таких как, например, IgM или IgA. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, а также гетеро- или гомомультимерными.- 14011816 В другом предпочтительном варианте изобретения функциональное производное включает по меньшей мере один фрагмент, присоединенный к одной или нескольким функциональным группам, которые представлены в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно указанным фрагментом является полиэтиленовый фрагмент (ПЭГ). ПЭГилирование может быть проведено с использованием известных методов, таких как методы, описанные, например, вWO99/55377. Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации,хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование иADP-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование,ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы тема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование GPI-якоря, иодирование,метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование, и убихитинизация. Модификации могут присутствовать в любой области полипептида, включая пептидный остов,аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде либо того и другого посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения. Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом,природа и степень модификации, по большей части, будут определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа. Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов. Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептиду INSP181. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин"сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко вычислена (Computational Molecular Biology, Lesk A.M. ed., Oxford UniversityAnalysis Primer, Gribskov M.Devereux J. eds, M. Stockton Press, New York, 1991). Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например,аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых эти полипептиды происходят) и мутанты (такие, как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов INSP181. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; между основными остатками Lys и Arg или между ароматическими остатками Phe и Tyr. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, то есть от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот, или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно- 15011816 предпочтительными являются "молчащие" замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков имеют группу-заместитель. В соответствии с настоящим изобретением любая замена должна быть предпочтительно "консервативной" или "допустимой" заменой, которую обычно определяют как замену, вводящую аминокислоты,имеющие аналогичные химические свойства (например, основная положительно заряженная аминокислота должна быть заменена другой основной, положительно заряженной аминокислотой), которые являются достаточными для сохранения структуры и биологической функции данной молекулы. В литературе описано множество моделей, с помощью которых может быть осуществлен отбор консервативных аминокислотных замен, исходя из статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры белков (Rogov S.I. и Nekrasov A.N., 2001). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование специфических подпоследовательностей аминокислот позволяет продуцировать белки с соответствующей укладкой и активные белки и классифицировать аминокислотные "синонимичные" замены, которые могут легко адаптироваться к белковой структуре и которые могут быть использованы для детекции функциональных и структурных гомологов и паралогов(Murphy L.R. et al., 2000). Группы синонимичных аминокислот и группы более предпочтительных синонимичных аминокислот представлены в табл. I. В полипептиды по изобретению также могут быть введены в различных целях специфические неконсервативные мутации. Мутации, снижающие аффинность CD24-подобного белка, допускают возможность повторного использования этих полипептидов, а также их применения в других целях, что потенциально повышает их терапевтическую эффективность. (Robinson C.R., 2002). Иммуногенные эпитопы, фактически присутствующие в полипептидах по изобретению, могут быть использованы для разработки вакцин (Stevanovic S., 2002), либо они могут быть удалены путем модификации их последовательности известными методами отбора мутаций, повышающих стабильность белка,и их коррекции (van den Burg В.Eijsink V, 2002; WO 02/05146, WO 00/34317 и WO 98/52976). Предпочтительной альтернативой синонимичным группам для аминокислотных производных,включенных в пептидомиметики, являются группы, определенные в табл. II. Неисчерпывающий список аминокислотных производных также включает аминоизомасляную кислоту (Aib), гидроксипролин (Hyp),1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-COOH, индолин-2-карбоновую кислоту, 4-дифторпролин, L-тиазолидин 4-карбоновую кислоту, L-гомопролин, 3,4-дегидропролин, 3,4-дигидроксифенилаланин, циклогексилглицин и фенилглицин. Термин "аминокислотное производное" означает аминокислоту, не входящую в 20 кодируемых генетическим кодом природных аминокислот, или химическую молекулу, подобную такой аминокислоте. В частности, такое аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные молекулы, молекулы с прямой цепью, молекулы с разветвленной цепью или циклоалкильные молекулы, а также может включать 1 или несколько гетероатомов. Указанные аминокислотные производные могут быть получены de novo, либо они могут быть взяты из коммерчески доступных источников (CalbiochemNovabiochem A.G., Switzerland; Bachem, USA). Различные методы включения неприродных аминокислотных производных в белки с использованием in vitro и in vivo систем трансляции для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков описаны в литературе (Dougherty D.A., 2000). Методы синтеза и получения пептидомиметиков, а также непептидомиметиков также хорошо известны специалистам (Golebiowski A. et al., 2001; Hruby V.J.Balse P.M., 2000; Sawyer T.K. "Structure Based Drug Design", edited by Veerapandian P., Marcel Dekker Inc.,pg. 557-663, 1997). Обычно считается, что два полипептида, имеющих более чем 30%-ную идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов по первому аспекту изобретения были более чем на 70 или на 80% идентичны последовательностям полипептидов INSP181 или их активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98, 98,5, 99 или 99,5%, соответственно. Функционально эквивалентными полипептидами по первому аспекту изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов структурного сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например,технология информационной обработки потока геномных данных (Inpharmatica Genome Threader), которая составляет один из аспектов способа поиска, используемых для генерирования базы данных поискаBiopendium, может быть применена (см. WO 01/67507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидами экзона INSP181 или полипептидом INSP181 (SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 18), высказывается предположение, что они представляют собой липокалины, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с полипептидами экзона INSP181, полипептидом INSP181,полипептидом INSP-SV1, зрелым полипептидом INSP181, зрелым полипептидом INSP-SV1, полипепти- 16011816 дом-полиморфом INSP181 N92T, зрелым полипептидом-полиморфом INSP181, полипептидом-полиморфом INSP181-SV1 N92T, зрелым полипептидом-полиморфом INSP181 N92T, полипептидом-полиморфомThreader позволяет предсказать структурную гомологию двух белков с достоверностью по крайней мере 10%, предпочтительно по крайней мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% и выше. Вероятностное значение по технологии Inpharmatica Genome Threader вычисляют следующим образом. Вначале проводят серию сравнений в рамках технологии Inpharmatica Genome Threader с использованием только последовательностей с известной структурой. Некоторые из сравнений проводят между белками, в отношении которых известно, что они являются близкородственными белками (на основании их структуры). Для этого был использован информационный поток по невральной сети, который обработали соответствующим образом с тем, чтобы наилучшим способом провести грань между близкородственными и неродственными вариантами, используя для этого структурную классификацию САТН(www.biochem.ucl.ас.uk/bsm/cath). В результате, данные по невральной сети были ранжированы по баллам от 0 до 1. При этом, поскольку количество близкородственных белков и количество неродственных белков было известно, было возможно распределить результаты анализа невральной сети по пакетам и эмпирически вычислить процент корректных результатов. Аналогично, в случае поисковой базы данныхBiopendium, для любого точного предсказания берется балл, взятый из результатов анализа невральной сети, и процент доверительности указывает, насколько успешным было использование Inpharmatica GenomeThreader для обработки/анализа исследуемой серии. Полипептиды по первому аспекту изобретения также включает фрагменты полипептидов INSP181 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов INSP181, при условии, что эти фрагменты являются липокалинами или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидом INSP181, зрелым полипептидом INSP181, полипептидом INSP181-SV1, зрелым полипептидом INSP181-SV1, полипептидом-полиморфом INSP181 N92T, зрелым полипептидом-полиморфом INSP181, полипептидом-полиморфом INSP181-SV1 N92T, зрелым полипептидом-полиморфом INSP181 N92T, полипептидом-полиморфомINSP181 или доменом липокалина INSP181-SV1. Примеры фрагментов, которые демонстрируют активность липокалинов, включают такие фрагменты, которые содержат или состоят из домена липокалина, который представлен в виде SEQ ID NO: 66,или последовательности (последовательностей), как показано на фиг. 12 (то есть аминокислоты на участке 25-174, аминокислоты на участке 26-180 и/или аминокислоты на участке 33-166 полноразмерных последовательностей INSP181), а также фрагмента (фрагментов), которые содержат цистеиновые остатки,образующие дисульфидные связи (то есть аминокислоты на участке 96-187 любой из полноразмерных последовательностей INSP181). Предпочтительно дисульфидная связь образуется между цистеиновыми остатками в положениях аминокислот 90 и 181. Используемый здесь термин "фрагмент" означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов INSP181 либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать, по крайней мере, n смежных аминокислот данной последовательности, и, в зависимости от конкретной последовательности, указанное число n предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту. Длина фрагментов по настоящему изобретению составляет 1-100 аминокислот, предпочтительно 550, более предпочтительно 7-20 аминокислот. Длина молекул нуклеиновой кислоты по изобретению составляет предпочтительно 10-1000 нуклеотидов, предпочтительно 50-800 нуклеотидов, предпочтительно 100-600 нуклеотидов, предпочтительно 200-550 нуклеотидов, предпочтительно 300-500 нуклеотидов. Длина полипептидов по изобретению составляет предпочтительно 5-500 аминокислот, предпочтительно 50-400 аминокислот, предпочтительно 100-300 аминокислот, предпочтительно 150-250 аминокислот. Фрагменты полноразмерных полипептидов INSP181 могут состоять из комбинаций 2 или 3, 4, 5 последовательностей смежных экзонов в последовательностях полипептидов INSP181, соответственно. Указанные экзоны могут быть объединены с другими зрелыми фрагментами по настоящему изобретению. Такие комбинации включают, например, экзоны 1 и 2 и т.д. Указанные фрагменты включаются в объем настоящего изобретения. Фрагменты могут также состоять из комбинаций различных доменов белка INSP181. Например, фрагмент может состоять из комбинаций разных доменов липокалинаINSP181, как было отмечено выше. Указанные фрагменты могут присутствовать в "свободной форме", то есть они могут не быть частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фраг- 17011816 менту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов. Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого читателя-специалиста, такие антитела,помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств. Термин "иммуноспецифический" означает, что данные антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин "антитело" означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения. Под понятием "значительно более высокая аффинность" авторы подразумевают заметно более высокую аффинность к полипептиду по изобретению по сравнению с аффинностью других известных родственных полипептидов, таких как липокалины. При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду по изобретению по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106 раз или более превышала аффинность по сравнению с другими родственными полипептидами, известными из уровня техники. При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду по изобретению значительно превышала аффинность по отношению к известным липокалинам. При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду по изобретению значительно превышала аффинность по отношению к природным липокалинам. Если предпочтительными являются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизировано полипептидом по первому аспекту изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Такой связанный полипептид может быть затем использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного,собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией. Моноклональные антитела против полипептидов по первому аспекту изобретения могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна специалистам (см., например, Kohler G.Milstein, С. Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985. Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов по первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела,могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах. Могут быть также использованы и химерные антитела, в которых вариабельные области нечеловека соединены или лигированы с константными областями человека (см., например, Liu et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987. Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их "гуманизации" (см., Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al.,Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 88, 34181 (1991) and Hodgson et al.,Bio/Technology, 9, 421 (1991. Используемый здесь термин "гуманизованное антитело" означает молекулы антитела, в которых аминокислоты CDR и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей донорного антитела нечеловека были заменены эквивалентными аминокислотами антитела человека. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с антителом человека, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом. В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть "биспецифическое" антитело, то есть антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам. Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами- 18011816 по изобретению, либо из набора ПЦР-амплифицированных V-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки "необученных" лимфоцитов может быть использована техника фагового дисплея (McCafferty J. et al. (1990), Nature 348, 552554; Marks J. et al. (1992) Biotechnology 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также повышена путем перестановки цепей (Clackson Т. et al. (1991) Nature 352, 624-628). Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, то есть они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты по второму и третьему аспектам изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в SEQNO: 66 или SEQ ID NO: 68 и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и в целях, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению предпочтительно содержат, по крайней мере, n смежных нуклеотидов в описанных здесь последовательностях, где n, в зависимости от конкретной последовательности, предпочтительно равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более). Молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению также являются последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов). Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из соответствующего организма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем in vitro- или in vivo-транскрипции ДНК-последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги,содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA). Используемый здесь термин "PNA" означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. PNA могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и прекращают элонгацию транскрипта (Nielsen P.E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8: 53-63). Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по изобретению, может быть идентична кодирующей последовательности одной или нескольких описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты. Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид, представленный в любой из последовательностей SEQNO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68, и функционально эквивалентные полипептиды. Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, последовательность, кодирующая только зрелый полипептид; последовательность, кодирующая зрелый полипептид, и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препрополипептидную последовательность; последовательность, кодирующая зрелый полипептид с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями или без них либо вместе с другими дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК.- 19011816 Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами. Молекулы нуклеиновой кислоты по второму и третьему аспектам изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов по первому аспекту изобретения. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо такая молекула может представлять собой вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты,к клеткам или к целым организмам. Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном, известными специалистам, включая, в зависимости от целей применения, модификацию клонирования, процессинг и/или экспрессию генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по первому аспекту изобретения,могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным осуществление экспрессии гибридного белка, который может распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между последовательностью полипептида по изобретению и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка. Молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть также антисмысловые молекулы,которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды по изобретению, а поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, известными среднему специалисту в данной области,такие антисмысловые молекулы, например олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по изобретению, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и, тем самым, предотвращали ее транскрипцию (см., например, Cohen J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J.(1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991. Используемый здесь термин "гибридизация" означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или BLOTTO); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (Sambrook et al., см. выше). Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (Sambrook etal., см.выше). В высокой степени гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у Wahl G.M. и S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) иKimmel A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511). Термин "жесткость" означает условия реакции гибридизации, которые благоприятствуют ассоциации молекул с большим сходством, но не способствуют ассоциации отличающихся молекул. Условия- 20011816 гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42 С в растворе, содержащем 50% формамид, 5XSSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5 раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1X SSC приблизительно при 65 С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35 С(Sambrook et al., см.выше). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости. В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид INSP181 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68), и молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по меньшей мере на 80% идентична молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 или SEQ ID NO: 69, либо чтобы молекула нуклеиновой кислоты была комплементарна указанной молекуле. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по меньшей мере на 90%,предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98, 98,5, 99 или более 99% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном,такой же биологической функцией или активностью, как и полипептид INSP181, зрелый полипептидN92T, зрелый полипептид-полиморф INSP181, полипептид-полиморф INSP181-SV1 N92T, зрелый полипептид-полиморф INSP181 N92T, полипептид-полиморф INSP181-SV1G114S, зрелый полипептид-полиморф INSP181-SV1G114S или полипептид домена липокалина INSP181. Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, включающему стадии: (а) контактирования нуклеинового зонда по изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (b) детекции любого из таких образованных дуплексов. Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды INSP181, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими эти полипептиды. В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы методы, описанные и обсуждаемые ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны, и, в основном, доступны специалистам, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов по изобретению, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназа (US BiochemicalCorp., Cleveland, ОН), полимераза Taq (Perkin Elmer), термостабильная полимераза Т 7 (Amersham, Chicago,IL) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в ELONGASE Amplification System и поставляемые Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Способ секвенирования может быть предпочтительно автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), термоячейка Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJElmer). Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией,эквивалентной функции полипептидов INSP181, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам (см., например, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al.- 21011816 являются зонды, содержащие по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 30, а более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ IDNO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61,SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 и/или SEQ ID NO: 69). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов средний специалист в данной области может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа. Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, то есть в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет сильно обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных методов детекции вышерасположенных последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (RACE; см., например,Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии,проиллюстрированные Marathon T.M. (Clontech Laboratories Inc.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется "сайт-рестрикционной" ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров(Sarkar G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Triglia Т. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). Другим методом,который может быть использован в данном случае, является ПЦР "с захватом", которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (Lagerstrom M. et al., (1991) PCR Methods Applic. 1, 111-119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Parker J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060. Кроме того, можно использовать ПЦР, "гнездовые" праймеры и библиотеки PromoterFinder для "прогулки" по геномной ДНК (Clontech,Palo Alto, CA). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон. При скрининге на полноразмерные ДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека oligo-d(T) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'-нетранскрибируемых регуляторных областей. В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важной стадией в подтверждение корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (имеющейся в настоящее время в библиотеке Уэлльского медицинского университета Джона Хопкинса) (John Hopkins University Welch Medical Library). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После- 22011816 предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах,которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов, страдающих заболеванием. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации insitu и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволяют получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в данном заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу. Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид по изобретению, могут быть также использованы методы "отключения" гена. Одним из методов, который может быть использован для "отключения" последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (RNAi) (Elbashir S.M. et al., Nature 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНК-олигонуклеотиды синтезируют in vitro и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, что приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии белка-мишени. Эффективность методов "отключения" гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), а на РНК-уровне она может быть оценена с помощью методики, основанной на TaqMan. Векторы по изобретению содержат молекулы нуклеиновой кислоты и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева по изобретению, которые могут быть трансформированы, трансфицированы или трансдуцированы векторами по изобретению, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева. Полипептиды по изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие их них подробно описаны у Sambrook et al. (см. выше) и FernandezHoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Using naturefor the art of expression", Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto). Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у Sambrook etal. (см. выше). В общих чертах кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях) и, необязательно,оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине. Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусная системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы или их комбинации, а также векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные хромосомы человека (НАС). Предпочтительными примерами векторов, которые могут быть использованы в соответствии с аспектами настоящего изобретения, относящимися к INSP181, являются векторы pCR4-TOPO-INSP181, pCR4-TOPO-INSP181-SV1,pDONR221INSP181-6HIS, pDONR221INSP181SV1-HIS, pEAKINSP181-6HIS, pEAKINSP181SV1-6HIS,pDEST12.2INSP181-6HIS и pDEST12.2INSP181SV1-6HIS. Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНК-экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаики табака, TMV) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Ti или pBR322); или клеточные системы жи- 23011816 вотных. Для продуцирования полипептидов по изобретению могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции. Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по изобретению, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах,таких как руководство Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и Sambrook et al. (см. выше). Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном; трасвекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см., Sambrook et al.,1989 (см. выше), Ausubel et al., 1991 (см. выше), Spector,GoldmanLeinwald, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными(хромосомная интеграция). Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге. Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмиды BlueScript (Stratagene,LaJolla, CA) или плазмиды pSportl (Gibco BRL) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, RUBISCO и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе SV40 или EBV с соответствующим селективным маркером. Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под "контролем" регуляторных последовательностей, то есть так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать указанную последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, то есть с сохранением рамки считывания. Указанные регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт. Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки,- 24011816 успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа. Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии,имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (ATCC), включая, но не ограничиваясь ими,клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детенышей хомячка (BHK), клетки почек обезьяны (COS), клетки С 127, клетки 3T3, клетки BHK, клетки HEK 293, клетки меланомы Боуэса,клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и ряд других клеточных линий. В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, inter alia, от Invitrogen, SanDiego CA (набор "МахВас"). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны уSummersSmith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клеткиDrosophila S2 и клетки Spodoptera Sf9. Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991). В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим продуцированием из них целых регенерированных растений, которые содержат перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых, а также овощных растений. Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, E.coli, Streptomyces и Bacillus subtilis. Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae) и клетки Aspergillus. Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны специалистам. Примерами являются гены тимидинкиназы (Wigler M. et al.(1977) Cell 11: 223-32) и аденинфосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Lowy I. et al. (1980)Cell 22: 817-23), которые могут быть использованы в tk- или aprt-клетках, соответственно. Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), который сообщает резистентность к метотрексату (Wigler M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70); ген npt,который сообщает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к G-418 (Colbere-Garapin F. et al.(1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14), и гены als или pat, которые сообщают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе, соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам. Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако, его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид по изобретению, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена. Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по изобретению, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (FACS) или иммуноанализы (такие, как твердофазный иммуноферментный анализ [ELISA] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. Hampton R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APSPress, St. Paul, MN) и Maddox D.E. et al., (1983) J. Exp. Med. 158, 1211-1216). Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченных зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды по изобретению, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченого полинуклеотида. Альтернативно, последова- 25011816 тельности, кодирующие полипептид по изобретению, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы, известные специалистам, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т 7, Т 3 или SP6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры могут быть проведены с использованием различных коммерчески доступных наборов (PharmaciaUpjoin (Kalamazoo, MI); Promega(Madison WI) и U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, OH. Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, а в частности грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект по изобретению. Это генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов по изобретению. Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае, если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения и/или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков. Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды по изобретению, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков,являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе удлинения/очистки FLAGS (Immunex Corp., Seattle, WA). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом по изобретению могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (Invitrogen,San Diego, CA). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка,содержащего полипептид по изобретению, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью IMAC (аффинной хроматографии на иммобилизованном ионе металла, описанной Porath J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов,содержащих гибридные белки, можно найти у Kroll D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453). Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида эти клетки должны быть сначала подвергнуты лизису. Как указывалось выше, настоящее изобретение также относится к новым мишеням и к способам скрининга на лекарственные средства-кандидаты или другие нужные вещества. Такие методы скрининга включают анализы на связывание и/или функциональные анализы и могут быть осуществлены in vitro, в клеточных системах и in vivo в организме животного. В этой связи конкретной целью настоящего изобретения является применение полипептидаINSP181 в качестве мишени для скрининга на лекарственные средства-кандидаты, которые могут быть использованы для лечения или профилактики расстройств, ассоциированных с липокалином. Другой целью настоящего изобретения является разработка способов отбора биологически активных соединений, где указанные способы включают контактирование соединения-кандидата с геном или полипептидом INSP181 и отбор соединений, которые связываются с указанным геном или полипептидом. Другой целью настоящего изобретения является разработка способов отбора биологически активных соединений, где указанные способы включают контактирование соединения-кандидата с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей полипептид INSP181, и отбор соединений, которые связываются с указанным полипептидом INSP181 на поверхности указанных клеток и/или которые модулируют активность полипептида INSP181.- 26011816 Термин "биологически активное соединение" означает любое соединение, обладающее биологической активностью у индивидуума, предпочтительно терапевтической активностью; более предпочтительно соединение, обладающее активностью липокалина, а еще более предпочтительно соединение,которое может быть использовано для лечения INSP181-ассоциированных расстройств или в качестве средства для разработки лекарственных препаратов, предназначенных для лечения расстройств, ассоциированных с липокалином. "Биологически активным соединением" предпочтительно является соединение, модулирующее активность INSP181. Вышеописанные способы могут быть осуществлены in vitro с применением различных устройств и различных условий, включая использование иммобилизованных реагентов, и эти способы могут также включать дополнительную стадию анализа активности выбранных соединений в модели, такой как животное-модель с расстройством, ассоциированным с липокалином. Предпочтительными выбранными соединениями являются агонисты INSP181, то есть соединения,которые могут связываться с INSP181 и имитировать активность его эндогенного лиганда. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа отбора биологически активных соединений, где указанный способ включает контактирование in vitro тестируемого соединения с полипептидом INSP181 по изобретению и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать активность указанного полипептида INSP181. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа отбора биологически активных соединений, где указанный способ включает контактирование in vitro тестируемого соединения с геномINSP181 по изобретению и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать экспрессию указанного гена INSP181, а предпочтительно стимулировать его экспрессию. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга, отбора или идентификации активных соединений, и в частности соединений, обладающих активностью, направленной на подавление рассеянного склероза или ассоциированных с ним расстройств, где указанный способ включает контактирование тестируемого соединения с рекомбинантной клеткой-хозяином, содержащей репортерную конструкцию, где указанная конструкция содержит репортерный ген, находящийся под контролем промотора гена INSP181, и отбор тестируемых соединений, модулирующих (например, стимулирующих или снижающих, а предпочтительно стимулирующих) экспрессию указанного репортерного гена. Полипептид по изобретению может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для поиска лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) экспрессию гена или активность полипептида по изобретению, а поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид по первому аспекту изобретения, или регулировать активность полипептида по первому аспекту изобретения. Соединения-агонисты или соединения-антагонисты могут быть выделены, например, из клеток,бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991). Связывание с геном или с полипептидом-мишенью служит показателем способности указанного соединения модулировать активность указанной мишени и, тем самым, оказывать влияние на путь, приводящий к развитию у индивидуума расстройства, ассоциированного с липокалином. Детекция связывания может быть осуществлена различными методами, такими как мечение соединения-кандидата, анализ на конкурентное связывание с известным меченым лигандом и т.п. Для проведения анализов на связывание in vitro указанные полипептиды могут быть использованы, в основном, в чистой форме, в виде суспензии, в форме, иммобилизованной на носителе, или в форме, экспрессируемой в мембране (в форме интактной клетки, мембранного препарата, липосомы и т.п.). Модуляция активности включает, но не ограничивается ими, стимуляцию поверхностной экспрессии рецептора INSP181, модуляцию мультимеризации указанного рецептора (например, образование мультимерных комплексов с другими субъединицами) и т.п. Клетками, используемыми в таких анализах,могут быть любые рекомбинантные клетки (то есть любые клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид INSP181) или любые клетки, экспрессирующие эндогенный полипептид INSP181. Примерами таких клеток являются, но не ограничиваются ими, прокариотические клетки (такие, как бактерии) и эукариотические клетки (такие, как клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений и т.п.). Конкретными примерами является клетки E. coli,Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Shizosaccharomyces pombe, дрожжевые клетки Kluyveromyces илиSaccharomyces, клеточные линии млекопитающих (например, клетки Vero, клетки СНО, клетки 3 Т 3,клетки COS и т.п.), а также первичные и стабилизированные клеточные культуры млекопитающих (например, культуры фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.п.). Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие анта- 27011816 гонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом по изобретению, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом по изобретению и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может быть подвергнуто ингибированию, что будет приводить к подавлению нормальной биологической активности такого полипептида. Полипептид по изобретению, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе или может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. Вообще говоря, в таких процедурах скрининга могут быть использованы соответствующие клетки или клеточные мембраны, экспрессирующие полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Затем функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с ответом контрольных клеток,которые не контактировали с тестируемым соединением. Такой анализ, проводимый с помощью подходящей системы детекции, позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения. Предпочтительный способ идентификации соединения, являющегося агонистом или антагонистом полипептида по изобретению, включает:(a) контактирование клетки, экспрессирующей (необязательно на своей поверхности) полипептид по первому аспекту изобретения, где указанный полипептид ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и(b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом. Методы генерирования детектируемых сигналов в анализах описанного здесь типа хорошо известны специалистам. Конкретным примером является совместное введение конструкции, экспрессирующей полипептид по изобретению или его фрагмент, такой как LBD, присутствующий в виде гибрида с ДНКсвязывающим доменом GAL4, в клетку вместе с репортерной плазмидой, такой как, например, pFR-Luc(Stratagene Europe, Amsterdam, The Netherlands). Эта конкретная плазмида содержит синтетический промотор с пятью тандемными повторами GAL4-связывающих сайтов, регулирующих экспрессию гена люциферазы. При введении потенциального лиганда в клетки он будет связываться с гибридом "GAL4-полипептид" и индуцировать транскрипцию гена люциферазы. Мониторинг уровня экспрессии гена люциферазы может быть проведен путем детекции его активности на устройстве для считывания интенсивности люминесценции (см., например, Lehman et al., JBC 270, 12953, 1995; Pawar et al., JBC, 277, 39243, 2002). Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида по изобретению включает:(a) контактирование меченого или немеченого соединения с полипептидом, иммобилизованным на любом твердом носителе (например, на сферах, пластинах, матричном носителе, чипе), и детекцию указанного соединения путем определения присутствия метки или самого соединения;(b) контактирование клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид, путем его искусственного заякоривания на клеточной мембране или путем конструирования химерного рецептора, ассоциированного со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и(c) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствие данного соединения. Так, например, может быть применен такой способ, как FRET-детекции лиганда, связанного с полипептидом в присутствии пептидных коактиваторов (Norris et al., Science 285, 744, 1999). Другой предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида по изобретению включает:(a) контактирование клетки, экспрессирующей (необязательно на своей поверхности) полипептид,ассоциированный со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и(b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодей- 28011816 ствия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствие данного соединения. В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут, кроме того, включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченого или немеченого лиганда для полипептида. В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида по изобретению включает определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые экспрессируют полипептид по изобретению (и которые, но необязательно, содержат на своей поверхности полипептид по изобретению), или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с указанным полипептидом. Считается, что соединение,способствующее снижению уровня связывания с лигандом, является агонистом или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченым. Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, включает стадии:(а) инкубирования меченого лиганда с целой клеткой, экспрессирующей на своей поверхности полипептид по изобретению, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид по изобретению;(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;(d) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и(e) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (b) и (d), где соединение,вызывающее снижение уровня связывания в стадии (d), считается агонистом или антагонистом. Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к способу скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, который включает стадии:(a) инкубирования меченого лиганда с полипептидом по изобретению, иммобилизованным на любом твердом носителе или на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид по изобретению;(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с полипептидом по изобретению, иммобилизованным на любом твердом носителе, или с целой клеткой или с клеточной мембраной;(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и полипептида, иммобилизованного на твердом носителе, целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведения этой смеси до состояния равновесия;(d) измерения количества меченого лиганда, связанного с иммобилизованным полипептидом, с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и(e) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (b) и (d), где соединение,вызывающее снижение уровня связывания в стадии (d), считается агонистом или антагонистом. Было обнаружено, что полипептиды INSP181 могут также модулировать большое число физиологических и патологических процессов зависимым от дозы образом в вышеописанных анализах. Таким образом, термин "функциональные эквиваленты" полипептидов по настоящему изобретению включает полипептиды, которые обладают любой из указанных дозозависимых модулирующих активностей в вышеописанных анализах. Хотя степень дозозависимой активности необязательно должна быть идентична активности полипептидов по настоящему изобретению, однако, предпочтительно, чтобы указанные"функциональные эквиваленты" обладали, по существу, аналогичной дозозависимой активностью, измеренной в данном анализе, по сравнению с активностью полипептидов по настоящему изобретению. В некоторых описанных выше вариантах настоящего изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или анализы на конкуренцию с меченым соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом. Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид, в клетках. Так, например, может быть разработан такой анализ ELISA, который позволяет измерять секретированные или клеточно-ассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными специалистам, и такой анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образо- 29011816 вания связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением. Могут быть также разработаны другие методы для детекции эффекта добавляемых исследуемых соединений на продукцию мРНК, кодирующей данный полипептид в клетке. Например, с помощью известных стандартных процедур можно таким образом адаптировать методику проведения иммуноферментного анализа ELISA, которая позволит определять уровни секретируемого или ассоциированного с клеткой полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител, что, в свою очередь, можно будет использовать для поиска соединений, способных ингибировать или усиливать продукцию полипептида на основе соответствующим образом обработанных клеток или тканей. Далее может быть проведена оценка образования связанных комплексов между полипептидом и исследуемым соединением. Методы анализа, охватываемые терминами, которые используются в настоящем изобретении,включают также такие методы, которые вовлекают использование генов и полипептидов по настоящему изобретению в тестах на суперпродукцию или аблацию. Такие тесты вовлекают манипуляцию уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку воздействия такой манипуляции на физиологию задействованных при этом клеток. Например, такого рода эксперименты позволяют выявить детали сигнальных и метаболических путей, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, получить информацию, касающуюся природы полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и выявить возможные способы влияния на регуляцию родственных генов и белков. Другой метод, который может быть использован для скрининга лекарственных средств, позволяет осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с представляющим интерес полипептидом (см. международную патентную заявку WO 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом по изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование ненейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными специалистам. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в вышеупомянутых способах скрининга на лекарственные средства. Полипептиды по изобретению могут быть использованы для идентификации мембраносвязанных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной специалистам, такой как анализы на связывание и перекрестное связывание с лигандом, в которых данный полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазменный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны специалистам. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению полипептида INSP181 или его фрагмента, где указанным фрагментом предпочтительно является фрагмент, специфичный к генуINSP181, в целях выделения или генерирования агониста или стимулятора полипептида INSP181 для лечения иммуноассоциированного расстройства, где указанный агонист или стимулятор выбран из группы, состоящей из: 1. специфического антитела или его фрагмента, включая: а) химерное,b) гуманизованное илиc) полностью антитело человека, а также 2. биспецифического или мультиспецифического антитела,3. одноцепочечного антитела (например, scFv), или 4. однодоменного антитела, или 5. пептидо- или непептидомиметика, происходящего от указанных антител, или 6. антитело-миметика, такого как (а) антикалин или (b) связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин). Получение пептидо- или непептидомиметиков из антител известно специалистам (Saragovi et al.,1991Saragovi et al., 1992). Антикалины также известны специалистам (Vogt et al., 2004). Связывающие молекулы на основе фибронектина описаны в патенте США 6818418 и в WO 2004029224. Кроме того, тестируемыми соединениями могут быть соединения различного происхождения, природы и состава, такие как любые небольшие молекулы, нуклеиновые кислоты, липиды, пептиды, полипептиды, включая антитела, такие как химерное, гуманизованное или полностью антитело человека или его фрагмент, происходящие от них пептидо- или непептидомиметики, а также биспецифические или