Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция
Формула / Реферат
1. Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция, содержащая антиген вируса гриппа или его антигенный препарат по меньшей мере из двух штаммов вируса гриппа, где по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, где указанный адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде содержит метаболизируемое масло, стерин и/или альфа-токоферол и эмульгатор.
2. Композиция по п.1, где указанная эмульсия типа масло-в-воде содержит капельки масла, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеют диаметр меньше 1 мкм.
3. Композиция по п.1 или 2, где указанная эмульсия типа масло-в-воде содержит капельки масла, из которых по меньшей мере 70% по интенсивности имеют диаметр меньше 500 нм.
4. Композиция по любому из пп.1-3, где указанная эмульсия типа масло-в-воде содержит капельки масла, из которых по меньшей мере 80% по интенсивности имеют диаметр меньше 300 нм.
5. Композиция по любому из пп.1-4, где указанная эмульсия типа масло-в-воде содержит капельки масла, из которых по меньшей мере 90% по интенсивности имеют диаметр в диапазоне 120-200 нм.
6. Композиция по любому из пп.1-5, где указанное метаболизируемое масло представляет собой сквален.
7. Композиция по любому из пп.1-6, где указанное метаболизируемое масло присутствует в количестве от 0,5 до 20% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
8. Композиция по любому из пп.1-7, где указанное метаболизируемое масло присутствует в количестве от 1,0 до 10% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
9. Композиция по любому из пп.1-8, где указанное метаболизируемое масло присутствует в количестве от 2,0 до 6,0% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
10. Композиция по любому из пп.1-9, где указанный стерин представляет собой холестерин.
11. Композиция по любому из пп.1-10, где указанный альфа-токоферол присутствует в количестве от 1,0 до 20% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
12. Композиция по любому из пп.1-11, где указанный альфа-токоферол присутствует в количестве от 1,0 до 5,0% от общего объема указанной иммуногенной композиции.
13. Композиция по любому из пп.1-12, где соотношение сквален:альфа-токоферол равно или меньше 1.
14. Композиция по любому из пп.1-13, где указанный эмульгатор представляет собой Твин 80.
15. Композиция по любому из пп.1-14, где указанный эмульгатор присутствует в количестве от 0,01 до 5,0% (мас./мас.) от массы указанной иммуногенной композиции.
16. Композиция по любому из пп.1-15, где указанный эмульгатор присутствует в количестве 0,1-2,0% (мас./мас.) от массы указанной иммуногенной композиции.
17. Композиция по любому из пп.1-16, где иммуногенная композиция дополнительно содержит лиганд TLR-4 (Toll-подобный рецептор-4).
18. Композиция по любому из пп.1-17, где указанный лиганд TLR-4 выбран из перечня, состоящего из нетоксичного производного липида А, такого как 3D-MPL (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А); синтетического производного липида A; MDP (мурамилдипептид) и белка F из RSV (респираторно-синцитиальный вирус).
19. Композиция по любому из пп.1-18, где указанное производное липида А представляет собой 3D-MPL.
20. Композиция по любому из пп.1-19, где 3D-MPL присутствует в количестве 1-100 мкг (мас./об.) на дозу композиции.
21. Композиция по любому из пп.1-20, где 3D-MPL присутствует в количестве 10-50 мкг/мл.
22. Композиция по любому из пп.1-20, где 3D-MPL присутствует в количестве приблизительно
25 мкг/мл.
23. Композиция по любому из пп.1-22, где указанная поливалентная композиция представляет собой двухвалентную, трехвалентную или четырехвалентную композицию.
24. Композиция по любому из пп.1-23, где указанный пандемический штамм вируса гриппа выбран из перечня, состоящего из H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1.
25. Иммуногенная композиция по п.24, где по меньшей мере два штамма вируса гриппа выбраны из перечня, состоящего из H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1.
26. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-25, где указанные антиген или антигенная композиция содержат от 1 до 15 мкг НА (гемагглютинин) на штамм вируса гриппа.
27. Иммуногенная композиция по п.26, где указанные антиген или антигенная композиция содержат низкую дозу НА на штамм вируса гриппа.
28. Иммуногенная композиция по п.27, где указанные антиген или антигенная композиция содержат от 2,5 до 7,5 мкг НА на штамм.
29. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-28, где антиген или антигенная композиция существуют в форме очищенного цельного вируса гриппа, инактивированного вируса гриппа или субъединичного(ых) компонента(ов) вируса гриппа.
30. Иммуногенная композиция по п.29, где указанный инактивированный вирус гриппа представляет собой расщепленный вирус гриппа.
31. Способ приготовления противогриппозной иммуногенной композиции для пандемической ситуации, включающий смешивание антигена вируса гриппа или антигенного препарата по меньшей мере из двух штаммов вируса гриппа, по меньшей мере один из которых связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, с эмульсией типа масло-в-воде.
32. Способ по п.31, где адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде является таким, как определено в любом из пп.1-16.
33. Способ по п.32, где эмульсия типа масло-в-воде дополнительно содержит адъювант TLR-4.
34. Способ по п.33, где адъювант TLR-4 является таким, как определено в любом из пп.17-22.
35. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-30 для применения в медицине.
36. Применение (а) вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде в изготовлении иммуногенной композиции по любому из пп.1-30 для индукции по меньшей мере одного из следующего: 1) усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ, 2) усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ против указанного вируса или антигенной композиции у человека.
37. Применение вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде в изготовлении иммуногенной композиции по любому из пп.1-30 для вакцинации пожилых людей против гриппа.
38. Применение по п.37, где композиция индуцирует по меньшей мере одно из следующего: 1) усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ, 2) усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ против указанного вируса или антигенной композиции у указанного пожилого субъекта.
39. Применение по любому из пп.36-38, где введение указанной иммуногенной композиции индуцирует как усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ, так и усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ.
40. Применение по любому из пп.36 и 38, 39, где указанный CD4 T-клеточный иммунный ответ включает индукцию перекрестно-реактивного CD4 Т-хелперного ответа.
41. Применение по любому из пп.36-40, где возраст вакцинируемого населения составляет более
50 лет.
42. Применение по п.41, где возраст вакцинируемого пожилого населения составляет более 65 лет.
43. Применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, предварительно вакцинированных иммуногенной композицией, по любому из пп.1-30.
44. Применение по п.43, где композиция, которую использовали для ревакцинации, содержит дополнительный адъювант.
45. Применение по п.44, где указанный адъювант выбран из перечня, состоящего из адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде, алюминиевого адъюванта, лиганда TLR-4, сапонина.
46. Применение по п.45, где указанный адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде является таким, как определено в любом из пп.1-16, и лиганд TLR-4 является таким, как определено в любом из пп.17-22.
47. Применение по любому из пп.43-46, где указанная иммуногенная композиция для ревакцинации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие CD4 Т-клеточные эпитопы с расщепленным вирусом гриппа или антигенным препаратом расщепленного вируса, используемым для первой вакцинации.
48. Применение по любому из пп.43-47, где иммунологический ответ после ревакцинации представляет собой любое одно или два или все из следующего: усиленный CD4-ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или усиленный гуморальный ответ, или усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ.
49. Применение по любому из пп.43-48, где антиген вируса гриппа или его антигенный препарат происходит по меньшей мере из двух разных штаммов вируса гриппа.
50. Применение по п.49, где антиген вируса гриппа или его антигенный препарат происходит из трех разных штаммов вируса гриппа.
51. Применение по любому из пп.43-50, где указанная иммуногенная композиция для ревакцинации содержит по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии.
52. Применение по п.51, где указанный пандемический штамм выбран из перечня, состоящего из H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1.
53. Применение по любому из пп.43-52, где первую вакцинацию осуществляют противогриппозной композицией, содержащей штамм вируса гриппа, который потенциально мог бы вызвать вспышку пандемии, а ревакцинацию осуществляют противогриппозной композицией, содержащей циркулирующий пандемический штамм.
54. Применение по любому из пп.43-53, где указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу антигена НА.
55. Применение по любому из пп.43-54, где указанный антиген вируса гриппа или его антигенный препарат получен из куриных эмбрионов или тканевых культур.
56. Применение антигена или антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа в изготовлении иммуногенной композиции по любому из пп.1-30 для защиты против гриппозных инфекций, вызванных вариантным штаммом вируса гриппа.
57. Применение по п.56, где первый штамм вируса гриппа связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии.
58. Применение по п.56, где вариантный штамм вируса гриппа связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии.
59. Применение по п.57 или 58, где указанный пандемический штамм выбран из перечня, состоящего из H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1.
60. Применение по любому из пп.43-59, где указанный антиген вируса гриппа выбран из перечня, состоящего из расщепленного вируса гриппа, цельного вируса гриппа, субъединичного вируса гриппа, виросомы вируса гриппа и его антигенного препарата.
Текст
011419 Область техники Настоящее изобретение относится к противогриппозным вакцинным композициям и режимам вакцинации с целью иммунизации против заболевания гриппом, их применению в медицине, в частности их применению в усилении иммунных ответов на различные антигены, и к способам их изготовления. В частности, данное изобретение относится к поливалентным противогриппозным иммуногенным композициям, содержащим антиген вируса гриппа или его антигенный препарат из по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, где по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде. Предшествующий уровень техники Вирус гриппа является одним из самых наиболее распространенных в мире вирусов, поражающих как людей, так и домашний скот. Грипп приводит к экономическому бремени, заболеваемости и даже смертности, которые оказываются значительными. Вирус гриппа представляет собой заключенный в оболочку РНК-содержащий вирус с размером частицы приблизительно 125 нм в диаметре. По существу, он состоит из внутреннего нуклеокапсида или сердцевины из рибонуклеиновой кислоты (РНК), ассоциированной с нуклеопротеином, окруженной вирусной оболочкой с бислойной липидной структурой и внешними гликопротеинами. Внутренний слой вирусной оболочки состоит преимущественно из матриксных белков, а внешний слой, главным образом,из липидного материала хозяина. Вирус гриппа содержит два поверхностных антигена - гликопротеины нейраминидазу (NA) и гемагглютинин (НА), которые проявляются в виде шипов длиной 10-12 нм на поверхности частиц. Эти поверхностные белки, в частности гемагглютинин, определяют антигенную специфичность подтипов вируса гриппа. Эти поверхностные антигены постепенно, иногда быстро, подвергаются некоторым изменениям,приводящим к антигенному разнообразию вируса гриппа. Эти антигенные изменения, называемые"дрейф" и "шифт", являются непредсказуемыми и могут оказывать сильное воздействие с иммунологической точки зрения, поскольку они, в конечном счете, приводят к появлению новых штаммов вируса гриппа, что позволяет вирусу "ускользать" от иммунной системы и вызывать хорошо известные, почти ежегодные эпидемии. Штаммы вируса гриппа, которые каждый сезон подлежат включению в противогриппозную вакцину, определяются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в содружестве с национальными службами здравоохранения и производителями вакцин. НА представляет собой наиболее важный антиген в определении серологической специфичности разных штаммов вируса гриппа. Этот белок 75-80 кДа содержит многочисленные антигенные детерминанты, некоторые из которых находятся в участках, последовательности которых различаются у разных штаммов (штамм-специфические детерминанты), а другие - в участках, являющихся общими для многих молекул НА (общие детерминанты). Вирусы гриппа являются причиной эпидемий почти каждую зиму с уровнями заболеваемости для вируса типа А или В до 40% в течение шестинедельного периода. Гриппозная инфекция вызывает различные болезненные состояния: от бессимптомной инфекции через слабую инфекцию верхних дыхательных путей до тяжелой вирусной пневмонии. Обычные эпидемии гриппа вызывают увеличение случаев пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует увеличение частоты госпитализации или смертности. Тяжесть заболевания определяется, главным образом, возрастом реципиента, его иммунным статусом и местом инфекции. Пожилые люди 65 лет и старше особенно уязвимы, с ними связывают 80-90% всех случаев ассоциированной с гриппом смерти в развитых странах. Индивидуумы с хроническими заболеваниями также,скорее всего, будут испытывать такие осложнения. Маленькие дети также могут страдать тяжелым заболеванием. Поэтому эти группы особенно нуждаются в защите. Кроме этих групп "риска" службы здравоохранения также рекомендуют вакцинировать здоровых взрослых людей, которые находятся в контакте с пожилыми людьми. Вакцинация играет критическую роль в регулировании ежегодных эпидемий гриппа. Доступные в настоящее время противогриппозные вакцины представляют собой либо инактивированную, либо живую аттенуированную противогриппозную вакцину (flu-вакцину). В состав инактивированных flu-вакцин входят три возможные формы антигенного препарата: инактивированный цельный вирус, субвирионы,когда очищенные вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки (так называемая "сплит"-вакцина (расщепленная вакцина, или очищенные НА и NA (субъединичная вакцина). Эти инактивированные вакцины вводят внутримышечно (в/м) или интраназально (и/н). Противогриппозные вакцины всех видов обычно представляют собой трехвалентные вакцины. Как правило, они содержат антигены двух штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В. Стандартная 0,5 мл инъекционная доза в большинстве случаев содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма, как измерено простой радиальной иммунодиффузией (SRD) (J.M. Woodtechniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Доступные в настоящее время противогриппозные вакцины считаются безопасными для всех возрастных групп (De Donato et al., 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Однако имеется мало указаний на то, что существующие противогриппозные вакцины "работают" у маленьких детей в возрасте до 2 лет. Кроме того, приведенные в работах коэффициенты эффективности вакцин в предупреждении типичного подтвержденного гриппозного заболевания составляют 23-72% для пожилых людей, что значительно ниже коэффициентов эффективности 60-90%, приведенных для более молодых взрослых людей (Govaert, 1994,J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann. Intern. Med. 123, 523-527). Показано, что эффективность противогриппозной вакцины коррелирует с сывороточными титрами антител, ингибирующих гемагглютинацию (HI), к данному вирусному штамму, и в нескольких исследованиях обнаружено, что более пожилые люди демонстрируют более низкие HI-титры после иммунизации вирусом гриппа, чем более молодые взрослые (Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439). Следовательно, все еще существует потребность в новых вакцинах с повышенной иммуногенностью. Композиция вакцинного антигена с высокоэффективными адъювантами представляет собой возможный подход к усилению иммунных ответов на субвирионные антигены. Субъединичная противогриппозная вакцина с адъювантом MF59 в форме эмульсии типа масло-вводе имеется в продаже и продемонстрировала свою способность индуцировать более высокий титр антител, чем титр, полученный с использованием безадъювантной субъединичной вакцины (De Donato etal., 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Однако в более поздней публикации та же самая вакцина не продемонстрировала улучшенный профиль по сравнению с безадъювантной расщепленной вакциной (Puig-Barberaet al., 2004, Vaccine, 23, 283-289). В порядке пояснения, во время межпандемических периодов циркулируют вирусы гриппа, которые родственны вирусам предшествующей эпидемии. Эти вирусы распространяются среди людей с разными уровнями иммунитета к инфекциям, полученного в предшествующий период жизни. Такая циркуляция в течение периода обычно 2-3 лет стимулирует отбор новых штаммов, которые изменились в достаточной степени для того, чтобы вновь вызвать эпидемию у населения в целом; этот процесс обозначается термином "антигенный дрейф". "Дрейфующие варианты" могут оказывать разные воздействия в разных сообществах, регионах, странах или континентах в течение какого-либо одного года, однако, через несколько лет их суммарное воздействие часто будет аналогичным. Другими словами, пандемия гриппа имеет место тогда, когда появляется новый вирус гриппа, против которого у человеческой популяции нет иммунитета. Обычные эпидемии гриппа вызывают увеличение случаев пневмонии и заболевания нижних дыхательных путей, о чем свидетельствует увеличение коэффициентов госпитализации или смертности. Пожилые люди или люди с хроническими заболеваниями почти наверняка будут подвержены таким осложнениям, а маленькие дети также могут страдать тяжелым заболеванием. С непредсказуемыми интервалами возникают новые вирусы гриппа с подтипом ключевого поверхностного антигена, представляющего собой гемагглютинин, полностью отличающимся от подтипа в штаммах, циркулирующих в предыдущем сезоне. И здесь полученные антигены могут отличаться на 2050% от соответствующего белка штаммов, которые ранее циркулировали среди людей. Это может приводить к ускользанию вируса от "иммунитета населения" и установлению пандемий. Это явление названо "антигенным шифтом". Полагают, что, по меньшей мере, в прошлом пандемии происходили тогда,когда вирус гриппа из разных видов, как, например, птичий вирус гриппа или вирус гриппа свиньи, пересекал видовой барьер. Если такие вирусы обладают способностью распространяться от субъекта к субъекту, то они могут распространиться по всему миру в пределах от нескольких месяцев до года, что приводит к пандемии. Например, в 1957 г. (пандемия азиатского гриппа (Asia Flu вирусы подтипа H2N2 вытеснили вирусы H1N1, которые циркулировали в человеческой популяции по меньшей мере с 1918 г.,когда впервые был выделен данный вирус. Н 2 НА и N2 NA подвергались антигенному дрейфу в промежутке между 1957 и 1968 гг. до тех пор, пока НА не был вытеснен в 1968 г. (пандемия гонг-конгского гриппа (Hong-Kong Flu в результате появления подтипа вируса гриппа H3N2, после чего N2 NA продолжал дрейфовать вместе с Н 3 НА (Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395). Свойствами штамма вируса гриппа, которые делают его способным вызывать вспышку пандемии,являются следующие: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином штаммов,циркулирующих в настоящий момент, что может сопровождаться или не сопровождаться изменением в подтипе нейраминидазы; он обладает способностью передаваться горизонтально в человеческой популяции; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не проявлялся в человеческой популяции в течение продолжительного периода времени,возможно, в течение нескольких десятилетий, такой как Н 2. Или же он может представлять собой гемагглютинин, не циркулировавший в человеческой популяции раньше, например Н 5, Н 9, Н 7 или Н 6,которые обнаружены у птиц. В любом случае, большинство, или по меньшей мере большая часть популяции, или даже вся популяция раньше не сталкивалась с данным антигеном и является иммунологически "наивной" по отношению к нему. Все еще имеется необходимость в улучшенных противогриппозных вакцинах, особенно в случаях-2 011419 пандемии грипа и для пожилого населения. Сущность изобретения В первом аспекте настоящего изобретения предложена поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат из по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, где по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, где указанный адъювант в виде эмульсии типа масло-вводе содержит метаболизируемое масло, стерин и эмульгатор. Предпочтительно указанный стерин представляет собой альфа-токоферол. Подходящие пандемические штаммы представляют собой, но не ограничиваются этим, H5N1,H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1. В другом аспекте согласно изобретению предложен способ приготовления противогриппозной иммуногенной композиции для пандемической ситуации, включающий смешивание антигена вируса гриппа или антигенного препарата из по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, по меньшей мере один из которых связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, с эмульсией типа масло-в-воде, как определено в данном описании выше. В третьем аспекте предложена иммуногенная композиция, как она определена в данном описании,для применения в медицине. В другом аспекте предложено применение: (а) антигена вируса гриппа или его антигенного препарата и (б) адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде в изготовлении иммуногенной композиции для индуцирования по меньшей мере одного из следующего: 1) усиленного CD4 Т-клеточного иммунного ответа, 2) усиленного В-клеточного вторичного иммунного ответа против указанного вирусного антигена или антигенной композиции у человека, предпочтительно у индивидуума или популяции с ослабленным иммунитетом, такой как взрослые или пожилые люди из группы с высоким риском, что является предпочтительным. Предпочтительно, когда иммуногенная композиция является такой, как определено в данном описании. Кроме того, предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата и адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде в изготовлении иммуногенной композиции, как она определена в данном описании, для вакцинации пожилых людей против гриппа. В конкретном воплощении иммуногенная композиция способна индуцировать как усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ, так и усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ по сравнению с таковым, полученным при использовании безадъювантных антигена или антигенной композиции. В другом воплощении предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей, предварительно вакцинированных поливалентной противогриппозной иммуногенной композицией, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат из по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, где по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, как определено в данном описании. В конкретном воплощении композиция, которую использовали для ревакцинации, может быть безадъювантной или может содержать адъювант, в частности адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде. В другом конкретном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие CD4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или антигенным препаратом этого вируса, используемым для первой вакцинации. Предпочтительно ревакцинацию осуществляют у субъектов, которые проходили вакцинацию против гриппа в предыдущий сезон. Обычно ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой вакцинации, предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев. Предпочтительно указанная эмульсия типа масло-в-воде содержит метаболизируемое масло, альфатокоферол и эмульгатор. В другом конкретном воплощении указанный адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет капельки масла, диаметры которых, по меньшей мере для 70% по интенсивности,составляют менее 1 мкм. В следующем аспекте настоящего изобретения предложено применение антигена или антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа в изготовлении иммуногенной композиции, как она определена в данном описании, для защиты против инфекции вирусом гриппа, вызываемой вариантным штаммом вируса гриппа. В другом аспекте предложен способ вакцинации отдельного человека или человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, такой как взрослые или пожилые люди из группы с высоким риском, противогриппозной иммуногенной композицией, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат из по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, где по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, как определено в данном описании. Еще в одном другом воплощении согласно изобретению предложен способ ревакцинации людей,-3 011419 предварительно вакцинированных поливалентной противогриппозной иммуногенной композицией, содержащей антиген вируса гриппа или его антигенный препарат из по меньшей мере двух штаммов вируса гриппа, где по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии, в комбинации с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, включающий введение указанному человеку иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа, либо адъювантной,либо безадъювантной. В другом воплощении предложен способ вакцинации человеческой популяции или отдельного человека против одного штамма вируса гриппа с последующей ревакцинацией указанного человека или популяции против вариантного штамма вируса гриппа, включающий введение указанному человеку:(1) первой композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат из первого штамма вируса гриппа и адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, и (2) второй иммуногенной композиции,содержащей вариантный штамм вируса гриппа указанного первого штамма вируса гриппа. В конкретном воплощении указанный первый штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. В другом конкретном воплощении указанный вариантный штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны далее в следующем подробном описании его предпочтительных воплощений. Описание фигур Фиг. 1. Распределение капелек масла по размерам для эмульсии SB62 типа масло-в-воде, измеренное посредством PCS (фотонно-корреляционная спектроскопия). На фиг. 1 А показаны результаты измерения размера для SB62 партии 1023 с использованием Malvern Zetasizer 3000HS: А соответствует разведению 1/10000 (протоколы 22-24) (анализ по методу Contin и с использованием адаптированной оптической модели 1.5/0.01); В соответствует разведению 1/20000 (протоколы 28-30) (анализ по методу Contin и с использованием адаптированной оптической модели 1.5/0.01). На фиг. 1 В показана схематическая иллюстрация данных протокола 22 (верхняя часть) и протокола 23 (нижняя часть) по интенсивности. Фиг. 2. Схематическая иллюстрация приготовления нерасфасованной формы MPL. Фиг. 3. Схематическая иллюстрация приготовления адъюванта AS03+MPL. Фиг. 4. Клиническое испытание Explo-Flu-001. CD4 Т-клеточный ответ на антиген расщепленного вируса гриппа (Q1=первый квартиль, Q3=третий квартиль). Фиг. 5. Клиническое испытание Explo-Flu-001. CD8 Т-клеточный ответ на антиген расщепленного вируса гриппа (Q1=первый квартиль, Q3=третий квартиль). Фиг. 6. Клиническое испытание Explo-Flu-001. Перекрестно-реактивный CD4 Т-клеточный ответ на антиген расщепленного вируса гриппа после вакцинации Fluarix+AS03. Фиг. 7. Клиническое испытание Explo-Flu-001. В-Клеточный вторичный иммунный ответ после вакцинации. Фиг. 8. Клиническое испытание Explo-Flu-002. CD4 Т-клеточный ответ против антигена расщепленного вируса гриппа после ревакцинации. Фиг. 9. Клиническое испытание Explo-Flu-002. Анти-HI-титры после ревакцинации. Фиг. 10. Исследование I на хорьках. Температурный мониторинг (примирование и контрольное заражение). Фиг. 10 А соответствует примированию, фиг. 10 В соответствует контрольному заражению. Фиг. 11. Исследование I на хорьках. Вирусный шеддинг. Фиг. 12. Исследование II на хорьках. Температурный мониторинг (примирование и контрольное заражение). Фиг. 12 А соответствует примированию, фиг. 12 В соответствует контрольному заражению. Фиг. 13. Исследование II на хорьках. Вирусный шеддинг. Фиг. 14. Исследование II на хорьках. HI-титры к H3N2 A/Panama (вакцинный штамм) (фиг. 14A) и на H3N2 A/Wyoming (штамм для экспериментального заражения) (фиг. 14 В). Фиг. 15. Исследование на мышах. Частоты встречаемости CD4 Т-клеток у примированных C57BL/6 мышей в результате использования цельного инактивированного вируса в качестве повторного стимулирующего антигена (7-е сутки после иммунизации). Фиг. 16. Исследование на мышах. Частоты встречаемости CD8 Т-клеток у примированных C57BI/6 мышей в результате использования цельного инактивированного вируса в качестве повторного стимулирующего антигена (7-е сутки после иммунизации). Фиг. 17. Исследование на мышах. Частоты встречаемости CD4 (верхняя часть) и CD8 (нижняя часть) Т-клеток у C57BI/6 мышей, примированных гетерологичными штаммами, в результате использования цельного инактивированного вируса в качестве повторного стимулирующего антигена (7-е сутки после иммунизации). Фиг. 18. Клиническое испытание на людях. В-Клеточный вторичный иммунный ответ после вакцинации пожилых людей с помощью Fluarix, Fluarix+AS03, Fluarix+AS03+MPL (разница между состояниями до и после вакцинации (pre и post. Фиг. 19. Исследование III на хорьках. Температурный мониторинг до и после контрольного заражения. Фиг. 20. Исследование III на хорьках. Вирусный шеддинг до и после контрольного заражения. Фиг. 21. Исследование III на хорьках. HI-титры к H3N2 A/Wyoming (вакцинный штамм).-4 011419 Фиг. 22. Исследование III на хорьках. HI-титры к H3N2 A/Panama (штамм для экспериментального заражения). Фиг. 23. Клиническое испытание на людях. HI-титры (GMT; средние геометрические титры) на 21-е,90-е и 180-е сутки после вакцинации (персистенция). Фиг. 24. Клиническое испытание на людях. CD4-Ответ согласно тесту "все по два" на пул антигенов на 21-е, 90-е и 180-е сутки после вакцинации (персистенция). Фиг. 25. Клиническое испытание на людях. HI-Титры в клиническом испытании с ревакцинациейAS03+MPL по сравнению с Fluarix. Фиг. 26. Клиническое испытание на людях. CMI (клеточно-опосредованный иммунитет) по CD4 ответу согласно тесту "все по два" на пул антигенов на 0-е и 21-е сутки. Фиг. 27. Клиническое испытание на людях с использованием AS03+MPL в двух концентрациях. HIТитры на 0-е и 21-е сутки. Фиг. 28. Клиническое испытание на людях с использованием AS03+MPL в двух концентрациях. Реактогенность. Подробное описание Авторы настоящего изобретения обнаружили, что противогриппозная композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, содержащим метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, способна усиливать CD4 Т-клеточный иммунный ответ и/или В-клеточный вторичный иммунный ответ против указанного антигена или антигенной композиции у человека по сравнению с ответом, полученным с применением безадъювантного вируса или его антигенного препарата. Композиции, дополненные адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, как определено в данном описании, преимущественно будут использованы для индукции CD4 Т-клеточного ответа против вируса гриппа, способного определять эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами класса II MHC (главный комплекс гистосовместимости). В данной работе авторы настоящего изобретения обнаружили, что в качестве мишени эффективно воздействовать на клеточно-опосредованную иммунную систему для того, чтобы усилить иммунный ответ против гомологичных и дрейфующих штаммов вируса гриппа (после вакцинации и инфекции). Адъювантные противогриппозные композиции согласно изобретению имеют несколько преимуществ: 1) повышенную иммуногенность: они позволят восстановить слабый иммунный ответ у пожилых людей (в возрасте старше 50 лет, обычно в возрасте старше 65 лет) до уровней, наблюдаемых у молодых людей (антительные и/или Т-клеточные ответы); 2) улучшенный профиль перекрестного иммунитета: увеличенный перекрестный иммунитет против различных (дрейфующих) штаммов вируса гриппа; 3) они также позволят уменьшить дозировку антигена для получения аналогичного ответа, тем самым, гарантируя увеличенный потенциал в чрезвычайных обстоятельствах (пандемии, например). Композиции для применения в настоящем изобретении смогли обеспечить более хорошую серологическую защиту против вируса гриппа после ревакцинации, как оценено на группе людей, удовлетворяющих установленным коррелятам защиты против гриппа. Кроме того, композиция для применения в настоящем изобретении также способна индуцировать тенденцию к более высокому В-клеточному вторичному иммунному ответу после первой вакцинации человека-субъекта и к более высокому гуморальному ответу после ревакцинации по сравнению с безадъювантной композицией. Кроме того, авторы изобретения смогли показать, что заявленная адъювантная композиция оказалась способной не только индуцировать, но также поддерживать защитные уровни антител против всех трех штаммов, присутствующих в вакцине, у большего количества индивидуумов по сравнению с уровнями, полученными с использованием безадъювантной композиции (см. табл. 43, например). Таким образом, еще в одном воплощении заявленная композиция способна гарантировать персистирующий иммунный ответ против ассоциированного с гриппом заболевания. В частности, под персистенцией понимают HI-антительный иммунный ответ, который способен удовлетворять регуляторным критериям по меньшей мере через 3 месяца, предпочтительно по меньшей мере через 6 месяцев после вакцинации. В частности, заявленная композиция способна индуцировать защитные уровни антител у более 70% индивидуумов, предпочтительно у более 80% индивидуумов или предпочтительно у более 90% индивидуумов по меньшей мере для одного штамма вируса гриппа, предпочтительно для всех штаммов, присутствующих в вакцине, по меньшей мере через 3 месяца. В конкретном аспекте защитные уровни антител более 90% получают по меньшей мере через 6 месяцев после вакцинации против по меньшей мере одного, предпочтительно двух или всех штаммов, присутствующих в вакцинной композиции. Штаммы и антигены вируса гриппа Вирус гриппа или его антигенный препарат для применения согласно настоящему изобретению может представлять собой расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса. В альтернативном воплощении препарат вируса гриппа может содержать другой тип антигена инактивированного вируса гриппа, такого как инактивированный цельный вирус, или очищенные НА иNA (субъединичная вакцина), или виросома вируса гриппа. Еще в одном воплощении вирус гриппа может представлять собой препарат живого аттенуированного вируса гриппа.-5 011419 Расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса для применения согласно настоящему изобретению представляет собой, соответственно, инактивированный вирусный препарат, в котором вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для солюбилизации липидной оболочки. Расщепленный вирус или антигенные препараты этого расщепленного вируса, соответственно, изготавливают путем фрагментации цельного вируса гриппа, либо инфекционного, либо инактивированного, используя органические растворители или детергенты в солюбилизирующих концентрациях и затем удаляя все или основное количество солюбилизирующего агента и некоторое количество или большую часть вирусного липидного материала. Под антигенным препаратом такого расщепленного вируса понимают расщепленный вирусный препарат, который может быть до некоторой степени подвергнут очистке по сравнению с расщепленным вирусом, в то же время сохраняя большинство антигенных свойств расщепленных вирусных компонентов. Например, в случае продуцирования на куриных эмбрионах расщепленный вирус может быть очищен от примесных белков куриных эмбрионов или, в случае продуцирования в клеточной культуре, расщепленный вирус может быть очищен от примесей клеток хозяина. Расщепленный вирусный антигенный препарат может содержать расщепленные вирусные антигенные компоненты более чем одного вирусного штамма. Вакцины, содержащие расщепленный вирус (названные как "противогриппозная сплит-вакцина") или расщепленные вирусные антигенные препараты, обычно содержат остаточные матриксные белки, и нуклеопротеины, и иногда липиды, а также мембранные оболочечные белки. Такие противовирусные сплит-вакцины обычно будут содержать большинство или все количество вирусных структурных белков, хотя нет необходимости в тех же пропорциях, в которых они присутствуют в цельном вирусе. Альтернативно, вирус гриппа может быть представлен в форме цельновирионной вакцины. Можно было бы доказать, что это является преимуществом относительно расщепленной вирусной вакцины в пандемической ситуации, поскольку позволяет избежать неопределенности в возможности успешного изготовления расщепленной вирусной вакцины против нового штамма вируса гриппа. Что касается некоторых штаммов, то традиционные детергенты, используемые для приготовления расщепленного вируса,могут повреждать вирус и делать его непригодным для применения. Несмотря на то, что всегда имеется возможность использовать другие детергенты и/или разработать другой способ приготовления сплитвакцины, для этого потребуется время, которого может оказаться недостаточно в пандемической ситуации. В дополнение к более высокой степени определенности при использовании цельновирионного подхода, производственная мощность изготовления вакцин также оказывается более высокой, чем в случае расщепленного вируса, поскольку значительные количества антигена теряются во время дополнительных стадий очистки, необходимых для изготовления подходящей сплит-вакцины. В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме очищенного субъединичного вируса гриппа. Субъединичные противогриппозные вакцины обычно содержат два основных оболочечных белка: НА и NA, и могут иметь дополнительное преимущество над цельновирионными вакцинами, поскольку они обычно менее реактогенны, в частности, для молодых вакцинированных субъектов. Субъединичные вакцины могут быть получены либо рекомбинантно, либо очищены из разрушенных вирусных частиц. В другом воплощении препарат вируса гриппа находится в форме виросомы. Виросомы представляют собой сферические однослойные везикулы, которые содержат функциональные вирусные оболочечные гликопротеины НА и NA в аутентичной конформации, интеркалированные в фосфолипидную бислойную мембрану виросом. Указанный вирус гриппа или его антигенный препарат может быть получен из куриных эмбрионов или тканевых культур. Например, антиген вируса гриппа или его антигенные препараты по изобретению могут быть получены традиционным способом с использованием яиц с развивающимся эмбрионом посредством выращивания вируса гриппа в яйцах и очистки собранной аллантоисной жидкости. Яйца могут быть собраны в больших количествах в короткий срок. Альтернативно, они (антигены) могут быть получены с помощью любого из новых способов производства с использованием тканевой культуры для выращивания вируса или экспрессии рекомбинантных поверхностных антигенов вируса гриппа. Подходящие клеточные субстраты для выращивания вируса включают в себя, например, клетки почки собаки, такие как MDCK или клетки из клона MDCK, MDCK-подобные клетки, клетки почки обезьяны, такие как клетки AGMK(клетки почки африканской зеленой мартышки), включая клетки Vero, подходящие линии клеток свиньи или любой другой тип клеток млекопитающих, подходящих для продуцирования вируса гриппа с целью изготовления вакцин. Подходящие клеточные субстраты также включают в себя человеческие клетки,например клетки MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничены клеточными линиями; например, также включены первичные клетки, такие как эмбриональные фибробласты кур и линии клеток птиц. Антиген вируса гриппа или его антигенный препарат может быть получен любым из множества коммерчески используемых способов, например с помощью сплит-flu-способа, описанного в патентахDD 300833 и DD 211444, включенных в данное описание посредством ссылки. Традиционно сплитflu получали, используя обработку растворителем/детергентом, таким как три-н-бутил-фосфат или диэтиловый эфир в комбинации с Tween (известную как "Твин-эфирное" расщепление), и этот способ все еще используют в некоторых производственных установках. Другие используемые в настоящее время-6 011419 расщепляющие агенты включают в себя детергенты, или протеолитические ферменты, или соли желчных кислот, например дезоксихолат натрия, как описано в патентеDD 155875, включенном в данное описание посредством ссылки. Детергенты, которые могут быть использованы в качестве расщепляющих агентов, включают в себя катионные детергенты, например цетилтриметиламмония бромид (СТАВ), другие ионные детергенты, например лаурилсульфат, тауродезоксихолат, или неионные детергенты, которые описаны выше, включая Тритон Х-100 (например, в способе, описанном в Una et al., 2000,Biologicals, 28, 95-103) и Тритон N-101, или комбинации любых двух или более детергентов. Способ приготовления сплит-вакцины может включать множество разных стадий фильтрации и/или других стадий разделения, таких как стадии ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, зонального центрифугирования и хроматографии (например, ионообменной), в разнообразных комбинациях и возможно стадию инактивации, например, с помощью нагревания, формальдегида или -пропиолактона или УФ, которая может быть проведена до или после расщепления. Способ расщепления может быть осуществлен в виде периодического, непрерывного или полунепрерывного способа. Предпочтительный способ расщепления и способ очистки иммуногенной сплит-композиции описан в WO 02/097072. Предпочтительные сплит-flu-вакцинные антигенные препараты по изобретению содержат остаточное количество Твина 80 и/или Тритона Х-100, остающееся после способа производства, хотя их можно добавить или довести их концентрацию после приготовления расщепленного антигена. Предпочтительно, когда присутствуют оба: Твин 80 и Тритон Х-100. Предпочтительные диапазоны конечных концентраций этих неионных поверхностно-активных веществ в вакцинной дозе составляют: Твин 80: 0,01-1%, более предпочтительно приблизительно 0,1% (об./об.); Тритон Х-100: 0,001-0,1 (% мас./об.), более предпочтительно 0,005-0,02% (мас./об.). В конкретном воплощении конечная концентрация Твина 80 варьирует от 0,045 до 0,09% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген предложен в виде 2-кратной концентрированной смеси, в которой концентрация Твина 80 варьирует от 0,045 до 0,2% (мас./об.) и которую необходимо в 2 раза разбавлять после приготовления конечной композиции с адъювантом (или с буфером в контрольной композиции). В другом конкретном воплощении конечная концентрация Тритона Х-100 варьирует от 0,005 до 0,017% (мас./об.). В другом конкретном воплощении антиген предложен в виде в 2 раза более концентрированной смеси, концентрация Тритона Х-100 в которой варьирует от 0,005 до 0,034% (мас./об.) и которую необходимо разбавить в 2 раза для приготовления конечной композиции с адъювантом (или с буфером в контрольной композиции). Предпочтительно препарат вируса гриппа приготавливают в присутствии низкого уровня тиомерсала или предпочтительно в отсутствие тиомерсала. Предпочтительно полученный препарат вируса гриппа стабилен в отсутствие ртутьорганических консервантов, в частности препарат не содержит никакого остаточного тиомерсала. Препарат вируса гриппа, в частности, содержит антиген гемагглютинин, стабилизированный в отсутствие тиомерсала или при низких уровнях тиомерсала (обычно 5 мкг/мл или меньше). Конкретно, стабилизацию штамма вируса гриппа В осуществляют, используя производное альфа-токоферола, такое как альфа-токоферола сукцинат (также известный как витамина E сукцинат, т.е. VES). Такие препараты и способы их приготовления раскрыты в WO 02/097072. Предпочтительная композиция содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена, приготовленных из рекомендованных ВОЗ штаммов вируса гриппа соответствующего сезона. Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде содержатся в одном и том же контейнере. Его обозначают как "подход в одном флаконе". Предпочтительно такой флакон представляет собой предварительно заполненный шприц. В альтернативном воплощении вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант в виде эмульсии типа маслов-воде содержатся в отдельных контейнерах или флаконах и быстро смешиваются до или во время введения субъекту. Его обозначают как "подход в двух флаконах". В виде примера, когда вакцина представляет собой 2-компонентную вакцину с общим объемом дозы 0,7 мл, концентрированные антигены (например, концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены) находятся в одном флаконе (335 мкл) (контейнер для антигенов), а предварительно заполненный шприц содержит адъювант (360 мкл) (контейнер для адъювантов). В момент инъекции содержимое флакона,содержащего концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены, извлекают из данного флакона с помощью шприца, содержащего адъювант, с последующим легким перемешиванием содержимого шприца. Перед инъекцией использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и объем доводят до 530 мкл. Одна доза восстановленной адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 530 мкл. Согласно настоящему изобретению по меньшей мере один штамм вируса гриппа в поливалентной иммуногенной композиции, как она определена в данном описании, связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Такой штамм также может быть обозначен ниже в тексте как"пандемические штаммы". В частности, когда вакцина является поливалентной, например двухвалентной, или трехвалентной, или четырехвалентной вакциной, тогда по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Подходящие штаммы представляют-7 011419 собой, но не ограничиваются этим, H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1. Удобно, когда указанный вирус гриппа или его антигенный препарат является поливалентным, например двухвалентным, или трехвалентным, или четырехвалентным. Предпочтительно вирус гриппа или его антигенный препарат является трехвалентным или четырехвалентным, имеющим антиген из трех разных штаммов вируса гриппа, при этом по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Свойствами штамма вируса гриппа, которые делают его способным вызывать вспышку пандемии,являются следующие: он содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютинином штаммов,циркулирующих в настоящий момент; он обладает способностью передаваться горизонтально в человеческой популяции; и он является патогенным для людей. Новый гемагглютинин может представлять собой гемагглютинин, который не проявлялся в человеческой популяции в течение продолжительного периода времени, возможно, в течение нескольких десятилетий, такой как Н 2. Или же он может представлять собой гемагглютинин, не циркулировавший в человеческой популяции раньше, например Н 5, Н 9,Н 7 или Н 6, которые обнаружены у птиц. В любом случае, большинство, или по меньшей мере большая часть популяции, или даже вся популяция раньше не сталкивалась с данным антигеном и является иммунологически "наивной" по отношению к нему. Обычно некоторые группы имеют повышенный риск заражения гриппом в пандемической ситуации. Особенно восприимчивы пожилые люди, хронически больные люди и маленькие дети, однако, многие молодые и явно здоровые люди также находятся в группе риска. Что касается вируса гриппа Н 2, то часть популяции, рожденная после 1968 г., имеет повышенный риск. Для этих групп важно получить эффективную защиту как можно более быстро и простым способом. Другой группой людей, которые находятся в группе повышенного риска, являются путешественники. Сейчас люди путешествуют больше, чем когда-либо раньше, а регионы, где появляется большинство новых вирусов, Китай и Юго-Восточная Азия, стали популярными местами для путешествий в последние годы. Такое изменение в характере путешествий дает возможность новым вирусам передаваться по всему земному шару за несколько недель, а не месяцев или лет. Таким образом, для этих групп людей существует особая необходимость в вакцинации с целью защиты против гриппа в пандемической ситуации или возможной пандемической ситуации. Подходящие штаммы представляют собой H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1, но не ограничиваются этим. Возможно, композиция может содержать более трех валентностей, например два непандемических штамма плюс пандемический штамм. Альтернативно, композиция может содержать три пандемических штамма. Предпочтительно композиция содержит три пандемических штамма. Адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде Адъювантная композиция по изобретению содержит адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде,предпочтительно указанная эмульсия содержит метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% общего объема и имеет капельки масла, диаметр которых, по меньшей мере для 70% по интенсивности,составляет менее 1 мкм. Для того, чтобы любая композиция типа масло-в-воде была подходящей для введения человеку,масляная фаза эмульсионной системы должна содержать метаболизируемое масло. Значение термина"метаболизируемое масло" хорошо известно в данной области техники. "Метаболизируемый" можно определить как "способный к превращению посредством метаболизма" (иллюстрированный Дорландом(Dorland) Медицинский словарь (Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974. Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животный жир или синтетическое масло, которые не токсичны для реципиента и способны к превращению посредством метаболизма. Орехи, зерна и крупа являются обычными источниками растительных масел. Синтетические масла также составляют часть этого изобретения, и они могут включать имеющиеся в продаже масла, такие какNEOBEE и другие. Особенно подходящим метаболизируемым маслом является сквален. Сквален(2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло,которое обнаружено в больших количествах в масле печени акулы и в меньших количествах в оливковом масле, масле из семян пшеницы, масле рисовых отрубей и дрожжах, и оно является особенно предпочтительным маслом для применения в этом изобретении. Сквален представляет собой метаболизируемое масло ввиду того, что является промежуточным соединением в биосинтезе холестерина (Merck Index, 10-e издание, входной 8619). Эмульсии типа масло-в-воде хорошо известны per se в данной области техники и, как полагают, полезны в качестве адъювантных композиций (EP 399843; WO 95/17210). Соответственно, метаболизируемое масло представлено в количестве от 0,5 до 20% (конечная концентрация) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительно в количестве от 1,0 до 10% от общего объема, предпочтительно в количестве от 2,0 до 6,0% от общего объема. В конкретном воплощении метаболизируемое масло представлено в конечном количестве приблизительно 0,5, 1, 3,5 или 5% от общего объема иммуногенной композиции. В другом конкретном воплощении метаболизируемое масло представлено в конечном количестве 0,5, 1, 3,57 или 5% от общего объема иммуногенной композиции.-8 011419 Предпочтительно эмульсионные системы типа масло-в-воде по настоящему изобретению имеют небольшой, в субмикронном диапазоне, размер капелек масла. Соответственно, размеры капелек будут находиться в диапазоне 120-750 нм, более предпочтительны размеры от 120 до 600 нм в диаметре. Наиболее предпочтительно, когда эмульсия типа масло-в-воде содержит капельки масла, диаметр которых,по меньшей мере у 70% по интенсивности, меньше 500 нм, более предпочтительно по меньшей мере у 80% по интенсивности диаметр меньше 300 нм, более предпочтительно по меньшей мере у 90% по интенсивности диаметр лежит в диапазоне 120-200 нм. Размер капелек масла, т.е. диаметр согласно настоящему изобретению, приведен по интенсивности. Существует несколько способов определения диаметра капелек масла по интенсивности. Интенсивность измеряют с помощью прибора для распределения по размерам, соответственно, с помощью динамического светорассеяния, такого как Malvern Zetasizer 4000 или предпочтительно Malvern Zetasizer 3000HS. Подробная методика приведена в примере II.2. Первая возможность заключается в определении среднего диаметра z (ZAD) с помощью динамического светорассеяния (PCS - фотонно-корреляционная спектроскопия); этот способ дополнительно дает индекс полидисперсности (PDI), и как ZAD, так и PDI рассчитывают с использованием алгоритма для кумулянтного анализа. Для этих величин не требуется знания показателя преломления частицы. Второй способ заключается в расчете диаметра капельки масла путем определения распределения по размерам всех частиц с помощью другого алгоритма, либо Contin, либоNNLS (неотрицательных наименьших квадратов), либо автоматизированного алгоритма "Malvern" (устанавливаемого по умолчанию алгоритма, задаваемого прибором для распределения по размерам). В большинстве случаев, когда показатель преломления частицы сложной композиции не известен, рассматривают только распределение интенсивности, а при необходимости среднее значение интенсивности, вытекающее из этого распределения. Эмульсия типа масло-в-воде согласно изобретению содержит стерин. Стерины хорошо известны в данной области техники, например хорошо известен холестерин, и он описан, например, в Merck Index,11 издание, с. 341, как стерин природного происхождения, обнаруженный в животном жире. Другие подходящие стерины включают -ситостерин, стигмастерин, эргостерин, альфа-токоферол и эргокальциферол. Предпочтительно указанный стерин присутствует в количестве от 0,01 до 20% (мас./об.) от общего объема иммуногенной композиции, предпочтительно в количестве от 0,1 до 5% (мас./об.). Предпочтительно, когда стерин представляет собой холестерин, тогда он представлен в количестве от 0,02 до 0,2%(мас./об.) от общего объема иммуногенной композиции, более предпочтительно в количестве 0,02%(мас./об.) в объеме вакцинной дозы 0,5 мл, или 0,07% (мас./об.) в объеме вакцинной дозы 0,5 мл, или 0,1% (мас./об.) в объеме вакцинной дозы 0,7 мл. Соответственно, стерин представляет собой альфа-токоферол или его производное, такое как альфатокоферола сукцинат. Предпочтительно альфа-токоферол присутствует в количестве от 0,2 до 5,0%(об./об.) от общего объема иммуногенной композиции, более предпочтительно в количестве от 2,5%(об./об.) в объеме вакцинной дозы 0,5 мл, или 0,5% (об./об.) в объеме вакцинной дозы 0,5 мл, или 1,71,9% (об./об.), предпочтительно 1,8% в объеме вакцинной дозы 0,7 мл. Для ясности, концентрации, приведенные в об./об., можно перевести в концентрацию в мас./об. путем использования следующего переводного коэффициента: концентрация альфа-токоферола 5% (об./об.) эквивалентна концентрации альфатокоферола 4,8% (мас./об.). Эмульсия типа масло-в-воде может дополнительно содержать эмульгатор. Эмульгатор может быть представлен в количестве 0,01-5,0% (мас./мас.) от массы иммуногенной композиции, предпочтительно представлен в количестве 0,1-2,0% (мас./мас.) по массе. Предпочтительная концентрация составляет 0,51,5% (мас./мас.) от массы суммарной композиции. Эмульгатор, соответственно, может представлять собой полиоксиэтиленсорбитан моноолеат (Твин 80). В конкретном воплощении объем вакцинной дозы 0,5 мл содержит 1% (мас./мас.) Твина 80, а объем вакцинной дозы 0,7 мл содержит 0,7% (мас./мас.) Твина 80. В другом конкретном воплощении концентрация Твина 80 составляет 0,2% (мас./мас). Адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде может быть использован вместе с другими адъювантами или иммуностимуляторами, и поэтому важным воплощением данного изобретения является композиция типа масло-в-воде, содержащая сквален или другое метаболизируемое масло, альфа-токоферол и Твин 80. Эмульсия типа масло-в-воде также может содержать span 85 и/или лецитин. Обычно эмульсия типа масло-в-воде будет содержать 2-10% сквалена от общего объема иммуногенной композиции, 2-10% альфа-токоферола и 0,3-3% Твина 80, и ее можно приготовить согласно методике, описанной в WO 95/17210. Предпочтительно, когда соотношение сквален:альфа-токоферол равно или меньше 1, так как это обеспечивает получение более стабильной эмульсии. Span 85 (полиоксиэтиленсорбитан триолеат) также может присутствовать, например, на уровне 1%. Иммуногенные свойства иммуногенной композиции, используемой для первой вакцинации по настоящему изобретению В настоящем изобретении поливалентная противогриппозная композиция способна индуцировать усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ против по меньшей мере одного из компонентов многокомпонентного антигена(ов) или антигенной композиции по сравнению с CD4 Т-клеточным иммунным-9 011419 ответом, полученным при использовании соответствующей композиции, которая является безадъювантной, т.е. не содержит какого-либо экзогенного адъюванта (обозначенной в данном описании также как"простая (plain) композиция"). В конкретном воплощении указанный усиленный CD4 T-кпеточный иммунный ответ представляет собой ответ против пандемического штамма вируса гриппа. Под усиленным CD4 Т-клеточным иммунным ответом подразумевают, что более высокий CD4 ответ получают у пациента-человека после введения адъювантной иммуногенной композиции по сравнению с иммунным ответом, полученным после введения такой же композиции без адъюванта. Например, более высокий CD4 Т-клеточный ответ получают у пациента-человека после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат вместе с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, содержащим метаболизируемое масло, альфа-токоферол и эмульгатор, по сравнению с ответом, индуцированным после введения иммуногенной композиции, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат. Такая композиция будет преимущественно использоваться для индуцирования CD4 T-клеточного ответа против вируса гриппа, способного определять эпитопы вируса гриппа, представленные молекулами класса II MHC. Предпочтительно, когда указанный иммунологический ответ, индуцированный адъювантной композицией расщепленного вируса гриппа для применения в настоящем изобретении, оказывается выше иммунологического ответа, индуцированного любой другой безадъювантной традиционной противогриппозной вакциной, такой как субъединичная противогриппозная вакцина или цельновирионная противогриппозная вакцина. В частности, но не исключительно, указанный "усиленный CD4 T-клеточный иммунный ответ" получают у иммунологически "непримированного" пациента, т.е. пациента, который является серонегативным в отношении указанного вируса гриппа или антигена. Эта серонегативность может быть следствием того, что указанный пациент никогда не сталкивался с таким вирусом или антигеном (так называемый"наивный" пациент) или, альтернативно, не давал реакции на указанный антиген после встречи с ним. Предпочтительно, чтобы указанный усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ был получен у субъекта с ослабленным иммунитетом, такого как пожилой человек, обычно в возрасте по меньшей мере 50 лет,обычно в возрасте 65 лет или старше, или взрослый человек моложе 65 лет с высоким риском медицинского состояния (взрослый человек "из группы с высоким риском"), или ребенок в возрасте менее 2 лет. Усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ можно оценить путем измерения количества клеток,продуцирующих любой из следующих цитокинов: клеток, продуцирующих по меньшей мере два разных цитокина (CD40L, IL-2 (интерлейкин-2), IFN(интерферон ), TNF (фактор некроза опухолей альфа; клеток, продуцирующих по меньшей мере CD40L и другой цитокин (IL-2, TNF, IFN); клеток, продуцирующих по меньшей мере IL-2 и другой цитокин (CD40L, TNF, IFN); клеток, продуцирующих по меньшей мере IFN и другой цитокин (IL-2, TNF, CD40L); клеток, продуцирующих по меньшей мере TNF и другой цитокин (IL-2, CD40L, IFN). Усиленным CD4 Т-клеточным иммунным ответом считается такой ответ, когда количество клеток,продуцирующих любой из вышеупомянутых цитокинов, будет более высоким после введения адъювантной композиции по сравнению с введением безадъювантной композиции. Обычно будут выполнены по меньшей мере одно, предпочтительно два из пяти условий, упомянутых в данном описании выше. В конкретном воплощении клетки, продуцирующие все четыре цитокина, будут представлены в большем количестве в адъювантной группе по сравнению с безадъювантной группой. Усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ, обусловленный адъювантной противогриппозной композицией по настоящему изобретению, в идеальном случае может быть получен после однократного введения. Подход с использованием однократной дозы будет чрезвычайно подходящим, например, в ситуации быстро развивающейся эпидемии. В некоторых случаях, особенно для пожилого населения, или в случае маленьких детей (в возрасте младше 9 лет), которых первый раз вакцинируют против гриппа, или в случае пандемий, полезным может быть введение 2 доз одинаковой композиции в течение сезона. Вторую дозу указанной одинаковой композиции (рассматриваемой еще как "композиция для первой вакцинации") можно вводить во время действия первичного иммунного ответа и через адекватный промежуток времени. Обычно вторую дозу такой композиции дают через несколько недель или приблизительно 1 месяц, например 2, 3, 4, 5 или 6 недель после первой дозы, чтобы помочь примировать иммунную систему "неотвечающих" или "слабо отвечающих" индивидуумов. В конкретном воплощении введение указанной иммуногенной композиции альтернативно или дополнительно индуцирует усиленный B-клеточный вторичный иммунный ответ у пациентов, которым введена адъювантная иммуногенная композиция, по сравнению с В-клеточным вторичным иммунным ответом, индуцированным у индивидуумов, иммунизированных безадъювантной композицией. Подразумевается, что усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ означает увеличенную частоту встречаемости В-лимфоцитов периферической крови, способных к дифференцировке в антитело-секретирующие плазматические клетки после встречи с антигеном, как измерено посредством стимуляции дифференцировки in vitro (см. разделы примеров, например Elispot-анализ (Enzyme-linked immunosorbentspot) В-клеток памяти (вторичного иммунного ответа. Еще в одном конкретном воплощении вакцинация композицией для первой вакцинации, адъювантной, не оказывает измеримого воздействия на CD8-ответ. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что композиция, содержащая вирус гриппа или его антигенный препарат, изготовленный с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, в частности с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, содержащим метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, эффективна в стимуляции T-клеточных ответов у человеческой популяции с ослабленным иммунитетом. Как показано авторами изобретения, введение однократной дозы иммуногенной композиции для первой вакцинации, как описано в данном изобретении, способно обеспечить улучшенную серопротекцию, как оценено посредством коррелятов защиты для противогриппозных вакцин после ревакцинации пожилого населения против гриппа по сравнению с вакцинацией безадъювантной противовирусной вакциной. Заявленная адъювантная композиция также способна индуцировать усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ против вируса гриппа по сравнению с ответом,полученным при использовании безадъювантной композиции. Это наблюдение может быть связано с повышенной реактивностью после вакцинации или инфекции по отношению к антигенной стимуляции вирусом гриппа. Кроме того, это также может быть связано с перекрестной реактивностью, т.е. более высокой способностью отвечать на вариантные штаммы вируса гриппа. Такой усиленный ответ может быть особенно полезен для человеческой популяции с ослабленным иммунитетом, такой как пожилое население (в возрасте 65 лет и старше), и в частности пожилое население из группы с высоким риском. Это может приводить к снижению коэффициента общей заболеваемости и смертности и предупреждению неотложной госпитализации в случае пневмонии и других гриппозоподобных заболеваний. Это также может быть полезно для детской популяции (в возрасте менее 5 лет, предпочтительно менее 2 лет). Кроме того, это позволяет индуцировать CD4 Т-клеточный ответ, который является более стабильным во времени, например все еще присутствует через 1 год после первой вакцинации, по сравнению с ответом,индуцированным безадъювантной композицией. Предпочтительно, когда CD4 Т-клеточный иммунный ответ, такой как усиленный CD4 Т-клеточный иммунный ответ, полученный у непримированного субъекта, включает индукцию перекрестно-реактивного CD4 Т-хелперного ответа. В частности, увеличивается количество перекрестно-реактивных CD4T-клеток. Под "перекрестно-реактивным" CD4-ответом понимают распознавание CD4 Т-клетками общих эпитопов среди штаммов вируса гриппа. Обычно доступные противогриппозные вакцины эффективны только против инфицирующих штаммов вируса гриппа, имеющих гемагглютинины с похожими антигенными характеристиками. Если инфицирующий (циркулирующий) вирус гриппа был подвергнут минорным изменениям (таким, как точечная мутация или накопление точечных мутаций, приводящее к аминокислотным изменениям, например, в поверхностных гликопротеинах, в частности гемагглютинине (антигенный дрейфующий вариант вирусного штамма, то вакцина все еще может обеспечивать некоторую защиту, хотя она может обеспечивать только ограниченную защиту, поскольку вновь созданные варианты могут ускользать от иммунитета, индуцированного предыдущей инфекцией вируса гриппа или вакцинацией. Антигенный дрейф ответственен за ежегодные эпидемии, которые происходят в течение периодов времени между пандемиями(WileySkehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394). Индукция перекрестно-реактивных CD4 Т-клеток дает дополнительное преимущество для композиции по изобретению в том, что она может также обеспечивать перекрестную защиту, другими словами, защиту против гетерологичных инфекций, т.е. инфекций, вызываемых циркулирующим штаммом вируса гриппа, который является вариантом (например,дрейфующим) штамма вируса гриппа, содержащегося в иммуногенной композиции. Это может иметь преимущество, когда циркулирующий штамм трудно культивировать на куриных эмбрионах или продуцировать в тканевой культуре, что делает использование дрейфующего штамма рабочей альтернативой. Это также может иметь преимущество в случаях, когда субъект получал первую и вторую вакцинацию с интервалом в несколько месяцев или год и когда штамм вируса гриппа в иммуногенной композиции,используемой для второй иммунизации, представляет собой дрейфующий вариантный штамм штамма,используемого в композиции, используемой для первой вакцинации. Следовательно, адъювантная противогриппозная иммуногенная композиция, как она определена в данном описании, обладает более высокой способность индуцировать серологическую защиту и перекрестно-реактивные CD4 Т-клетки у вакцинированных пожилых субъектов. Это свойство может быть связано с большей способностью давать ответ против вариантного штамма того штамма, который представлен в иммуногенной композиции. Это может служить доказательством важного преимущества в пандемической ситуации. Например, поливалентная противогриппозная композиция, содержащая любой штамм или несколько штаммов из Н 5, Н 2, Н 9, Н 7 или Н 6, может обеспечить большую способность давать ответ против пандемического варианта, т.е. дрейфующего штамма указанного пандемического штамма(ов), как после следующей за этим вакцинации указанным дрейфующим штаммом, так и после заражения им. Детекция перекрестно-реактивных CD4 Т-клеток после вакцинации противогриппозной вакциной После введения классической трехвалентной противогриппозной вакцины (3 недели) наблюдается- 11011419 существенное увеличение частоты встречаемости CD4 Т-клеток периферической крови, отвечающих на препарат антигенного штамма (цельновирионный или расщепленный антигенный), который гомологичен одному из присутствующих в вакцине (H3N2: A/Panama/2007/99, H1N1: A/New Caledonia/20/99, B: B/Shangdong/7/97)(см. пример III). Сравнимое увеличение частоты встречаемости можно наблюдать при повторной стимуляции CD4 Т-клеток периферической крови штаммами вируса гриппа, классифицированными как дрейфующие штаммы (H3N2: A/Sydney/5/97, H1N1: A/Beijing/262/95, B: B/Yamanashi/166/98). И, наоборот, если CD4 Т-клетки периферической крови повторно стимулируют штаммами вируса гриппа, классифицированными экспертом в данной области как шифт-штаммы (H2N2: A/Singapore/1/57,H9N2: A/Hongkong/1073/99), никакого заметного увеличения после вакцинации не наблюдается.CD4 Т-клетки, которые способны распознавать как гомологичные, так и дрейфующие штаммы вируса гриппа, названы в настоящем документе "перекрестно-реактивными". Адъювантные противогриппозные композиции, как они изложены в данном описании, способны продемонстрировать гетеросубтипическую перекрестную реактивность, поскольку имеется заметная перекрестная реактивность против дрейфующих штаммов вируса гриппа. Как указано выше, способность пандемической вакцинной композиции быть эффективной против дрейфующих пандемических штаммов может считаться важной характеристикой в случае пандемий. Согласно вышеприведенным наблюдениям у человека идентифицированы CD4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вируса гриппа (Gelder С. et al., 1998, Int. Immunol. 10 (2): 211-22; GelderC.M. et al., 1996, J. Virol., 70 (7): 4787-90; Gelder C.M. et al., 1995, J. Virol., 1995, 69 (12): 7497-506). В конкретном воплощении адъювантная композиция может приносить дополнительную пользу,обеспечивая лучшую защиту против циркулирующих штаммов, подвергнутых более значительному изменению (такому, как генетическая рекомбинация, например, между двумя разными видами) в гемагглютинине (антигенный шифт), против которых доступные в настоящее время вакцины не эффективны. Другие адъюванты Композиция может содержать дополнительный адъювант, в частности такой адъювант, как лигандTRL-4, предпочтительно нетоксичное производное липида А. Подходящим лигандом TRL-4 является 3 де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL). Другими подходящим лигандами TRL-4 являются липополисахарид (LPS) и производные, MDP (мурамилдипептид) и белок F из RSV (респираторносинцитиальный вирус). В одном из воплощений композиция может дополнительно включать в себя лиганд Toll-подобного рецептора (TLR-4) 4, такой как нетоксичное производное липида А, в частности монофосфориллипид А,или, более конкретно, 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL). 3D-MPL продается под торговым названием MPL (в данном описании MPL) фирмой Corixa corporation и стимулирует, главным образом, CD4+ T-клеточные ответы с фенотипом IFN- (TM). Он может быть получен согласно способам, раскрытым в GB 2220211 А. С химической точки зрения, это смесь 3 деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используют небольшие частицы 3D-MPL. Небольшие частицы 3D-MPL имеют такой размер частиц, что их можно стерильно фильтровать через фильтр 0,22 мкм. Такие способы получения описаны в WO 94/21292 и в примере II. 3D-MPL можно использовать, например, в количестве 1-100 мкг (мас./об.) на дозу композиции,предпочтительно в количестве 10-50 мкг (мас./об.) на дозу композиции. Подходящее количество 3D-MPL составляет, например, любое из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг(мас./об.) на дозу композиции. Более предпочтительно количество 3D-MPL варьирует от 25 до 75 мкг(мас./об.) на дозу композиции. Обычно доза композиции будет изменяться в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мл. Типичная вакцинная доза составляет 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мл. В предпочтительном воплощении конечная концентрация 50 мкг 3D-MPL содержится в 1 мл вакцинной композиции или 25 мкг в 0,5 мл вакцинной дозы. В других предпочтительных воплощениях конечная концентрация 35,7 или 71,4 мкг 3D-MPL содержится в 1 мл вакцинной композиции. Конкретно, объем вакцинной дозы 0,5 мл содержит 25 или 50 мкг 3D-MPL на дозу. Доза MPL, соответственно, способна усиливать иммунный ответ на антиген у человека. В частности,подходящим количеством MPL является такое, которое улучшает иммунологический потенциал такой композиции по сравнению с безадьювантной композицией или по сравнению с композицией, дополненной другим количеством адъюванта MPL, оставаясь при этом приемлемым с точки зрения профиля реактогенности. Синтетические производные липида А известны, некоторые из них описаны в качестве агонистовTLR-4 и включают, но не ограничиваются этим: ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(R)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоноD-глюкопиранозил]-2-[(R)-3-гидрокситетрадеканоиламино]D-глюкопиранозилдигидрофосфат) (WO 95/14026);OM197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(R)-3-гид- 12011419 рокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1-дигидрофосфат,10-(6-аминогексаноат) (WO 01/46127). Другими подходящими лигандами TRL-4 являются, например, липополисахарид и его производные, мурамилдипептид (MDP) или белок F респираторного синцитиального вируса. Другим подходящим иммуностимулятором для применения в настоящем изобретении является Quil A и его производные. Quil A представляет собой препарат сапонина, выделенный из южно-американского дерева Quillaja saponaria molina, и впервые был описан Dalsgaard и др. в 1974 г. ("Saponin adjuvants", Archiv.fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p. 243-254) как обладающий адъювантной активностью. Очищенные фрагменты Quil А были выделены посредством HPLC, что сохраняет адъювантную активность без токсичности, связанной с Quil A (EP 0362278), например QS7 и QS21 (также известные как QA7 и QA21). QS-21 является природным сапонином, выделенным из коры Quillaja saponaria molina,который индуцирует CD8+ цитотоксические Т-клетки (CTL), Th1-клетки и преобладающий IgG2aантительный ответ, и является предпочтительным сапонином в контексте настоящего изобретения. Описаны конкретные композиции QS21, являющиеся особенно предпочтительными, эти композиции дополнительно содержат стерин (WO 96/33739). Сапонины, образующие часть настоящего изобретения, могут быть в форме эмульсии типа масло-в-воде (WO 95/17210). Ревакцинация и композиция, которую использовали для ревакцинации(композиция для бустер-иммунизации) Согласно аспекту настоящего изобретения предложено применение антигена вируса гриппа в изготовлении противогриппозной иммуногенной композиции для ревакцинации людей, предварительно вакцинированных поливалентной противогриппозной композицией, заявленной в данном описании, или указанной поливалентной противогриппозной композицией, содержащей вариантный штамм вируса гриппа, изготовленной с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, как определено в данном описании. Обычно ревакцинацию осуществляют по меньшей мере через 6 месяцев после первой вакцинации(й),предпочтительно через 8-14 месяцев, более предпочтительно приблизительно через 10-12 месяцев. Иммуногенная композиция для ревакцинации (композиция для бустер-иммунизации) может содержать любой тип антигенного препарата, как инактивированный, так и живой аттенуированный. Она может содержать такой же тип антигенного препарата, т.е. расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса гриппа, цельный вирион, очищенные НА и NA (субъединичная вакцина) или виросому, что и иммуногенная композиция, которую использовали для первой вакцинации. Альтернативно, композиция для бустер-иммунизации может содержать иной тип антигена вируса гриппа, т.е. расщепленный вирус гриппа или антигенный препарат этого расщепленного вируса гриппа, цельный вирион, очищенные НА и NA (субъединичная вакцина) или виросому, а не тот, который использован для первой вакцинации. Предпочтительно используют расщепленную вирусную или цельновирионную вакцину. Композиция для бустер-иммунизации может быть адъювантной или безадъювантной. Безадъювантная композиция для бустер-иммунизации может представлять собой Fluarix/-Rix/Influsplit, которую вводят внутримышечно. Данная композиция содержит три инактивированных расщепленных вирионных антигена, приготовленных из рекомендованных ВОЗ штаммов вируса гриппа соответствующего сезона. В соответствии с этим в предпочтительном воплощении изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигеного препарата в изготовлении иммуногенной композиции для ревакцинации людей,предварительно вакцинированных иммуногенной композицией, которая заявлена в данном описании. Композиция для бустер-иммунизации может быть адъювантной или безадъювантной. В предпочтительном воплощении композиция для бустер-иммунизации содержит адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, в частности адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, содержащий метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор. Предпочтительно, когда указанный адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде предпочтительно содержит по меньшей мере одно метаболизируемое масло в количестве от 0,5 до 20% от общего объема и имеет капельки масла, диаметры которых, по меньшей мере для 70% по интенсивности, составляют менее 1 мкм. В предпочтительном воплощении первую вакцинацию осуществляют противогриппозной композицией, предпочтительно композицией расщепленного вируса гриппа, содержащей по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который потенциально мог бы вызвать вспышку пандемии, а ревакцинацию осуществляют противогриппозной композицией, содержащей по меньшей мере один штамм, являющийся циркулирующим пандемическим штаммом. В конкретном воплощении иммуногенная композиция для ревакцинации (также называемая в данном описании ниже как "композиция для бустер-иммунизации") содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие CD4 Т-клеточные эпитопы с вирусом гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Считается, что "общий CD4 Т-клеточный эпитоп" означает пептиды/последовательности/эпитопы из разных антигенов, которые могут распознаваться одной и той же CD4-клеткой (см. примеры описанных эпитопов в Gelder C. et al., 1998, Int. Immunol. 10 (2): 21122; Gelder C.M. et al., 1996, J. Virol. 70 (7): 4787-90; Gelder C.M. et al., 1995, J. Virol. 69 (12): 7497-506). В воплощении согласно изобретению композиция для бустер-иммунизации представляет собой моновалентную противогриппозную композицию, содержащую штамм вируса гриппа, который связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. Подходящие штаммы представляют- 13011419 собой H5N1, H9N2, H7N7, H2N2 и H1N1, но не ограничиваются этим. Указанный штамм может быть тем же или одним из тех, которые присутствуют в композиции, используемой для первой вакцинации. В альтернативном воплощении указанный штамм может быть вариантным штаммом, т.е. дрейфующим штаммом, того штамма, который присутствует в композиции, используемой для первой вакцинации. В другом конкретном воплощении композиция для бустер-иммунизации является поливалентной противогриппозной вакциной. В частности, когда композиция для бустер-иммунизации является поливалентной противогриппозной вакциной, такой как двухвалентная, трехвалентная или четырехвалентная вакцина, по меньшей мере один штамм связан со вспышкой пандемии или может быть связан со вспышкой пандемии. В конкретном воплощении два или более штаммов в композиции для бустер-иммунизации являются пандемическими штаммами. В другом конкретном воплощении по меньшей мере один пандемический штамм в композиции для бустер-иммунизации является штаммом того же типа или одним из тех, которые присутствуют в композиции, используемой для первой вакцинации. В альтернативном воплощении по меньшей мере один штамм может быть вариантным штаммом, т.е. дрейфующим штаммом, по меньшей мере одного пандемического штамма, который присутствует в композиции, используемой для первой вакцинации. В соответствии с этим в другом аспекте настоящего изобретения предложено применение вируса гриппа или его антигенного препарата из первого пандемического штамма вируса гриппа в изготовлении иммуногенной композиции для защиты против гриппа, вызываемого штаммом вируса гриппа, являющимся вариантом указанного первого штамма вируса гриппа. В соответствии с этим в другом аспекте настоящего изобретения предложено применение:(а) вируса гриппа или его антигенного препарата из первого штамма вируса гриппа и(б) адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде, как определено в данном описании,в изготовлении иммуногенной композиции для защиты против гриппа, вызываемого штаммом вируса гриппа, являющимся вариантом указанного первого штамма вируса гриппа. Композиция для бустер-иммунизации может быть адъювантной или безадъювантной. Обычно композицию для бустер-иммунизации, если ее используют, применяют на следующий сезон гриппа, например приблизительно через 1 год после первой иммуногенной композиции. Композицию для бустер-иммунизации также можно использовать каждый последующий год (третья, четвертая,пятая вакцинация и т.д.). Композиция для бустер-иммунизации может быть такой же, как и композиция,которую использовали для первой вакцинации. Соответственно, композиция для бустер-иммунизации содержит вирус гриппа или его антигенный препарат, который является вариантом штамма вируса гриппа, используемого для первой вакцинации. В частности, штаммы вируса гриппа или их антигенный препарат выбраны в соответствии с эталонным веществом, распределяемым Всемирной организацией здравоохранения, так что они адаптированы к штамму вируса гриппа, циркулирующему в год ревакцинации. Антиген вируса гриппа или антигенная композиция, используемые при ревакцинации, предпочтительно содержат адъювант или эмульсию типа масло-в-воде, соответственно, как описано выше. Адъювант может представлять собой адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, как изложено в данном описании выше, который является предпочтительным, возможно содержащим дополнительный адъювант,такой как лиганд TLR-4, как, например, 3D-MPL или сапонин, или может представлять собой другой подходящий адъювант, такой как квасцы или такие альтернативы квасцам, как, например, полифосфазен. Предпочтительно, когда ревакцинация индуцирует любое одно, предпочтительно два или все, из следующего: (1) усиленный CD4-ответ против вируса гриппа или его антигенного препарата, или (2) усиленный В-клеточный вторичный иммунный ответ, или (3) усиленный гуморальный ответ по сравнению с эквивалентным ответом, индуцированным после первой вакцинации с применением безадъювантного вируса гриппа или его антигенного препарата. Предпочтительно, когда иммунологические ответы, индуцированные после ревакцинации с применением адъювантного вируса гриппа или его антигенного препарата,как определено в данном описании, оказываются выше соответствующего ответа, индуцированного после ревакцинации безадъювантной композицией. Предпочтительно, когда иммунологические ответы, индуцированные после ревакцинации с применением безадъювантного, предпочтительно расщепленного,вируса гриппа, выше у популяции, первый раз вакцинированной адъювантной композицией предпочтительно расщепленного вируса гриппа, по сравнению с соответствующим ответом у популяции, первый раз вакцинированной безадъювантной композицией предпочтительно расщепленного вируса гриппа. Как продемонстрировано авторами изобретения, ревакцинация субъектов композицией для бустериммунизации, содержащей вирус гриппа и адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, содержащий метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, как определено в данном описании выше, демонстрирует более высокие титры антител по сравнению с соответствующими величинами в группе людей, первый раз вакцинированных безадъювантной композицией и повторно стимулированных безадъювантной композицией. Влияние адъюванта на усиление антительного ответа на ревакцинацию особенно важно для пожилого населения, которое, как известно, имеет низкий ответ на вакцинацию или инфекцию вирусом гриппа. Успех, связанный с адъювантными композициями, также был отмечен в отношении усиления CD4 Т-клеточного ответа после ревакцинации. Адъювантная композиция по изобретению способна индуцировать лучшую перекрестную реактив- 14011419 ность против дрейфующего штамма (штамма вируса гриппа из следующего сезона гриппа) по сравнению с защитой, обеспечиваемой контрольной вакциной. Указанная перекрестная реактивность показала более продолжительную персистенцию по сравнению с реактивностью, полученной с использованием безадъювантной вакцины. Влияние адъюванта на усиление перекрестной реактивности против дрейфующего штамма важно для пандемической ситуации. Доклинические данные, приведенные, например, в примере 3, демонстрируют способность композиции по изобретению защищать против инфекции гетеротипическим вирусом гриппа и против заболевания гриппом, что оценивается по регистрации температуры тела. То же самое заключение справедливо для результатов клинических испытаний, полученных в исследованиях по ревакцинации. В другом воплощении данное изобретение относится к режиму вакцинации, согласно которому первую вакцинацию осуществляют композицией вируса гриппа, предпочтительно композицией расщепленного вируса гриппа, содержащей по меньшей мере один штамм вируса гриппа, который потенциально мог бы вызвать вспышку пандемии, а ревакцинацию осуществляют циркулирующим штаммом, или пандемическим штаммом, или классическим штаммом.CD4-эпитоп в НА Этот антигенный дрейф, главным образом, свойственен эпитопным участкам вирусных поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно, что любое различие в CD4- и В-клеточных эпитопах среди разных штаммов вируса гриппа, используемое вирусом для ускользания от адаптивного ответа иммунной системы хозяина, будет играть важную роль в вакцинации против гриппа, и это, действительно, имеет место. У человека идентифицированы CD4 Т-клеточные эпитопы, общие для разных штаммов вируса гриппа (см., например, Gelder C. et al., 1998, Int. Immunol. 10 (2): 211-22; Gelder C.M. et al., 1996, J. Virol. 70 (7): 4787-90; и Gelder C.M. et al., 1995, J. Virol., 69 (12): 7497-506). В конкретном воплощении ревакцинацию осуществляют путем использования композиции для бустер-иммунизации, содержащей вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общие CD4 Тклеточные эпитопы с антигеном вируса гриппа или его антигенным препаратом, используемым для первой вакцинации. Таким образом, данное изобретение относится к применению иммуногенной композиции, содержащей пандемический вирус гриппа или его антигенный препарат и адъювант в виде эмульсии типа масло-вводе, в частности адъювант в виде эмульсии типа масло-в-воде, содержащий метаболизируемое масло, стерин, такой как альфа-токоферол, и эмульгатор, в изготовлении компонента мультидозовой вакцины для первой вакцинации, причем мультидозовая вакцина дополнительно содержит, в виде повторной иммунизирующей дозы, вирус гриппа или его антигенный препарат, который имеет общиеCD4 Т-клеточные эпитопы с антигеном пандемического вируса гриппа или антигенным препаратом этого вируса, присутствующим в дозе, введенной при первой вакцинации. Средства для вакцинации Композицию по изобретению можно вводить любым подходящим способом доставки, таким как интрадермальный, через слизистые, например интраназальный, пероральный, внутримышечный или подкожный. Другие способы доставки хорошо известны в данной области. Для адъювантной противогриппозной композиции предпочтительным является внутримышечный способ доставки. Интрадермальная доставка представляет собой другой подходящий способ. Для интрадермальной доставки может быть использовано любое подходящее устройство, например устройства с короткой иглой, такие как устройства, описанные в US 4886499, US 5190521, US 5328483, US 5527288, US 4270537,US 5015235, US 5141496, US 5417662. Интрадермальные вакцины также можно вводить посредством устройств, ограничивающих эффективную длину проникновения иглы внутрь кожи, таких как устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, которые включены в данное описание посредством ссылки,и их функциональных эквивалентов. Кроме того, подходят устройства с безыгольным впрыскиванием, с помощью которых доставляют жидкие вакцины в дерму посредством безыгольного инжектора для жидкостей или посредством иглы, которой прокалывают роговичный слой и создают струю, достигающую дерму. Устройства с безыгольным впрыскиванием описаны, например, в US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Кроме того, подходят баллистические устройства для доставки порошков/частиц, в которых используется сжатый газ для ускорения прохождения вакцины в порошковой форме через внешние слои кожи в дерму. Кроме того, в классическом способе интрадермального введения манту могут быть использованы традиционные шприцы. Другим подходящим способом введения является подкожный способ. Любое подходящее устройство может быть использовано для подкожной доставки, например классическая игла. Предпочтительно используют действие безыгольного инжектора, такого как опубликовано в WO 01/05453, WO 01/05452,WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. Более предпочтительно, когда указанное устройство предварительно заполнено жидкой вакцинной композицией.- 15011419 Альтернативно, вакцину вводят интраназально. Обычно вакцину вводят местно в носоглоточную область, предпочтительно без осуществления распыления в легкие. Желательно использовать устройство для интраназальной доставки, которое доставляет вакцинную композицию в носоглоточную область, без или, по существу, без ее проникновения в легкие. Предпочтительными устройствами для интраназального введения вакцин по изобретению являются распылительные устройства. Подходящие имеющиеся в продаже назальные распылительные устройства включают Accuspray (Becton Dickinson). Небулайзеры продуцируют очень мелкий аэрозоль, который может легко вдыхаться в легкие, и, следовательно, он не достигнет эффективно слизистых оболочек носа. Следовательно, небулайзеры не являются предпочтительными. Предпочтительными распылительными устройствами для интраназального применения являются устройства, эффективность которых не зависит от давления, прилагаемого пользователем. Эти устройства известны как устройства с пороговым давлением. Жидкость высвобождается из сопла только тогда,когда приложено пороговое давление. Эти устройства позволяют легче достичь получения аэрозоля с регулярным размером капелек. Устройства с пороговым давлением, подходящие для применения в настоящем изобретении, известны в данной области техники и описаны, например, в WO 91/13281, и EP 311863 В, и EP 516636, которые включены в данное описание посредством ссылки. Такие устройства имеются в продаже от фирмы Pfeiffer GmbH и также описаны в Bommer, R. Pharmaceutical TechnologyEurope, Sept. 1999. Предпочтительные интраназальные устройства продуцируют капельки (измеренные с использованием воды в качестве жидкой фазы) в диапазоне 1-200 мкм, предпочтительно 10-120 мкм. Ниже 10 мкм существует риск вдохнуть их, следовательно, желательно иметь не более чем приблизительно 5% капелек менее 10 мкм. Капельки более 120 мкм не разбрызгиваются так же хорошо, как более мелкие капельки, поэтому желательно иметь не более чем приблизительно 5% капелек, превышающих 120 мкм. Доставка двойной дозы представляет собой дополнительный предпочтительный признак системы интраназальной доставки для применения с вакцинами по изобретению. Устройства для двойного дозирования содержат 2 субдозы разовой вакцинной дозы, по 1 субдозе для введения в каждую ноздрю. Обычно 2 субдозы находятся в одном отсеке, и конструкция устройства позволяет осуществлять эффективную доставку 1 субдозы в данный момент времени. Альтернативно, для введения вакцины по изобретению может быть использовано монодозирующее устройство. Альтернативно, в настоящее изобретение также включен способ эпидермальной или трансдермальной вакцинации. В конкретном аспекте настоящего изобретения адъювантная иммуногенная композиция для первого введения может быть введена внутримышечно, а композиция для бустер-иммунизации, либо адъювантная, либо нет, может быть введена другим способом, например интрадермальным, подкожным или интраназальным. В другом конкретном воплощении композиция для первого введения может содержать стандартное количество НА, составляющее 15 мкг на штамм вируса гриппа, а бустерная композиция может содержать низкую дозу НА, т.е. менее 15 мкг, и в зависимости от способа введения может быть введена в меньшем объеме. Популяции для вакцинирования Целевой популяцией для вакцинирования может быть человек с ослабленным иммунитетом. Люди с ослабленным иммунитетом обычно обладают меньшей способностью отвечать на антиген, в частности на антиген вируса гриппа, по сравнению со здоровыми взрослыми. Предпочтительно, когда целевой популяцией является популяция, не примированная против гриппа, либо являющаяся "наивной" (например, в отношении пандемического штамма), либо ранее не дававшая реакции на инфекцию или вакцинацию вирусом гриппа. Предпочтительно, когда целевой популяцией являются пожилые люди, соответственно, в возрасте по меньшей мере 50, обычно по меньшей мере 55, или по меньшей мере 60, или по меньшей мере 65 лет и старше, более молодые взрослые люди из группы высокого риска (т.е. в возрасте от 18 до 64 лет), как, например, люди, работающие в лечебно-профилактических учреждениях, или молодые взрослые люди с таким фактором риска, как сердечно-сосудистое и легочное заболевание или диабет. Другой целевой популяцией являются все дети в возрасте 6 месяцев и старше, особенно дети в возрасте 6-23 месяцев, которые демонстрируют относительно высокий коэффициент госпитализации, связанной с гриппом. Предпочтительно, когда целевой популяцией являются пожилые люди в возрасте старше 65 лет. Режимы, дозирование и дополнительные критерии эффективности вакцинации Предпочтительно иммуногенные композиции по настоящему изобретению представляют собой стандартную 0,5 мл инъекционную дозу, и в большинстве случаев она содержит 15 мкг антигенного компонента гемагглютинина из каждого штамма вируса гриппа, как измерено простой радиальной иммунодиффузией (SRD) (J.M. Wood et al., J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J.M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Предпочтительно объем вакцинной дозы будет составлять от 0,5 до 1 мл, в частности стандартный объем вакцинной дозы 0,5 или 0,7 мл. Небольшую корректировку объема дозы можно проводить стандартным образом в зависимости от концентрации НА в первоначальном нерасфасованном образце. Предпочтительно указанная иммуногенная композиция содержит низкую дозу антигена НА, например- 16011419 любую из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 мкг НА на штамм вируса гриппа. Подходящая низкая доза НА составляет от 1 до 7,5 мкг НА на штамм вируса гриппа, соответственно, от 3,5 до 5 мкг, например 3,75 мкг НА на штамм вируса гриппа, обычно приблизительно 5 мкг НА на штамм вируса гриппа. Предпочтительно, чтобы вакцинная доза по изобретению, в особенности низкая вакцинная доза,могла быть представлена в меньшем объеме, чем традиционные инъекционные сплит-flu-вакцины, который обычно составляет приблизительно 0,5, 0,7 или 1 мл на дозу. Дозы малого объема по изобретению составляют предпочтительно ниже 500 мкл, более предпочтительно ниже 300 мкл и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 200 мкл или меньше на дозу. Таким образом, предпочтительная вакцинная доза малого объема, соответствующая одному аспекту изобретения, представляет собой дозу, содержащую низкую дозу антигена в малом объеме, например приблизительно 15 мкг, или приблизительно 7,5 мкг НА, или приблизительно 3,0 мкг НА (на штамм) в объеме приблизительно 200 мкл. Лекарственное средство против гриппа по изобретению предпочтительно удовлетворяет конкретным международным критериям для вакцин. Для определения эффективности противогриппозных вакцин приняты международные стандарты. Официальные критерии Европейского Союза (ЕС) для эффективной вакцины против гриппа приведены ниже в табл. 1. Теоретически, чтобы удовлетворять требованиям Европейского Союза, противогриппозная вакцина должна удовлетворять только одному из критериев, приведенных в таблице, для всех штаммом вируса гриппа, включенных в вакцину. Композиции по настоящему изобретению, соответственно,удовлетворяют по меньшей мере одному из таких критериев. Однако на практике будет необходимо, чтобы все штаммы удовлетворяли по меньшей мере двум или всем трем критериям, в частности, что касается новой вакцины, такой как новая вакцина для доставки посредством другого способа. В некоторых случаях может быть достаточно двух критериев, например может быть приемлемо, чтобы двум из трех критериев удовлетворяли все штаммы, в то время как третьему критерию удовлетворяли несколько, но не все штаммы (например, два из трех штаммов). Требования для взрослого населения (18-60 лет) и пожилого населения (старше 60 лет) различны. Таблица 1 Для каждого вакцинного штамма уровень сероконверсии определяют как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере четырехкратное увеличение сывороточных титров ингибирования гемагглютинина (HI) после вакцинации.Для каждого вакцинного штамма фактор конверсии определяют как кратное увеличение сывороточных средних геометрических титров (GMT) HI после вакцинации.Уровень защиты определяют как процент вакцинированных с сывороточным HI-титром 1:40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принят в качестве показателя защиты. В следующем аспекте согласно изобретению предложен способ создания вакцины против заболеваний, о которых известно, что их можно лечить посредством CD4+ Т-клеточной активации, включающий: 1) выбор антигена, содержащего CD4+ эпитопы, и 2) объединение указанного антигена с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде, как определено в данном описании выше,где указанная вакцина после введения указанному млекопитающему способна индуцировать усиленный CD4 Т-клеточный ответ у указанного млекопитающего. Содержание всех ссылок в настоящей заявке, включая заявки на патент и выданные патенты, включено в данное описание во всей полноте посредством ссылки. Во избежание неясности, авторы изобретения подразумевают, что термины "содержащие", "содержат" и "содержит" в данном описании возможно заменять в каждом случае, соответственно, на термины"состоящий из", "состоят из" и "состоит из". Данное изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры. В примере I описаны методы иммунологического считывания, используемые в исследованиях на мышах, хорьках и людях. В примере II описано приготовление и определение характеристик эмульсии типа масло-в-воде и композиций адъювантов, используемых в приведенных в качестве примеров исследованиях. В примере III описано клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа и адъювант AS03, на пожилом населении в возрасте старше 65 лет. В примере IV описано второе клиническое испытание (ревакцинационное испытание) вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа и адъювант AS03, на пожилом населении- 17011419 в возрасте старше 65 лет. В примере V показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на хорьках (исследование I и исследование II). Осуществляли температурный мониторинг, измеряли вирусный шеддинг и CD4 Т-клеточный ответ. В примере VI показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на "наивных" и примированных C57BI/6 мышах. В примере VII показана доклиническая оценка адъювантных и безадъювантных противогриппозных расщепленных и субъединичных вакцин на C57BI/6 мышах, примированных гетерологичными штаммами. В примере VIII описано клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа, содержащий адъювант AS03, адъювант AS03+MPL или не содержащий никакого экзогенного адъюванта, на пожилом населении в возрасте старше 65 лет. В примере IX показана доклиническая оценка адъювантной и безадъювантной противогриппозных вакцин на хорьках (исследование III). Осуществляли температурный мониторинг, измеряли вирусный шеддинг и HI-титры. В примере X показано клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа, содержащий адъювант AS03 с MPL или без него, на пожилом населении в возрасте старше 65 лет: данные по персистенции иммуногенности на 90-е и 180-е сутки. В примере XI показано клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа, содержащий адъювант AS03 с MPL, на пожилом населении в возрасте старше 65 лет. В примере XII показано клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа, содержащий адъювант AS03 с MPL в двух концентрациях, на пожилом населении в возрасте старше 65 лет. Пример I. Методы иммунологического считывания.I.1.1. Тест на ингибирование гемагглютинации. Методика тестирования Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (HI). Принцип HI-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (RBC) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Инактивированные нагреванием образцы сыворотки предварительно обрабатывали каолином и RBC цыпленка для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 ед. гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:20, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 10. Статистический анализ Статистический анализ осуществляли для HI-титров после вакцинации, используя UNISTAT. Протокол, прилагаемый дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом: логарифмическое преобразование данных; критерий Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk) для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения групп; критерий Кокрена (Cochran) с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами); двусторонний дисперсионный анализ, выполненный на группах;HSD-критерий Тьюки (Tukey) для множественных сравнений (honestly significant differences; наибольшие значимые различия).I.1.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов. Эта методика позволяет осуществить количественное определение антиген-специфических Т-лимфоцитов на основе продукции ими цитокинов: эффекторные Т-клетки и/или эффекторные Т-клетки памяти продуцируют IFN- и/или центральные (центральных органов кроветворения) Т-клетки памяти продуцируют IL-2. На 7-е сутки после иммунизации собирают PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови). Лимфоидные клетки повторно стимулируют in vitro в присутствии ингибитора секреции (брефелдина). Эти клетки затем подвергают традиционной иммунофлуоресцентной процедуре с использованием флуоресцентных антител (к CD4, CD8, IFN- и IL-2). Результаты выражают как частоту встречаемости цитокин-позитивных клеток среди CD4/CD8 Т-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов Т-клеток осуществляли на PBMC через 7 суток после второй иммунизации. Осуществляли забор крови от мышей и объединяли в гепаринизированной среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute)+Add (добавки). Что касается крови, суспензии PBL (лимфоциты периферической крови), разведенные RPMI+Add, наслаивали на градиент Lympholyte-Mammal согласно рекомендованному протоколу (центрифугирование- 18011419 20 мин при 2500 об./мин и комнатной температуре). Мононуклеарные клетки с границы раздела фаз удаляли, промывали 2x в RPMI+Add и РВМС-суспензии доводили до 2106 клеток/мл, используя RPMI с 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Антигенную стимуляцию in vitro PBMC осуществляли в конечной концентрации 1107 клеток/мл(пробирка FACS с цельным FI (Whole FI) (1 мкг НА/штамм) и затем инкубировали 2 ч при 37 С с добавлением анти-CD28 и анти-CD49d (1 мкг/мл для обоих). После стадии повторной антигенной стимуляции PBMC инкубируют в течение ночи при 37 С в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37 С для ингибирования секреции цитокинов. Окрашивание на IFN-/IL-2/CD4/CD8 осуществляли следующим образом. Клеточные суспензии промывали, ресуспендировали в 50 мкл PBS с 1% FCS (забуференный фосфатом физиологический раствор), содержащего 2% Fc-блокирующего реагента (1/50; 2.4G2). После 10 мин инкубации при 4 С добавляли 50 мкл смеси анти-CD4-РЕ (2/50) и анти-CD8 perCp (3/50) и инкубировали 30 мин при 4 С. После промывки в PBS с 1% FCS клетки подвергали пермеабилизации путем ресуспендирования в 200 мкл Cytofix-Cytoperm (набор BD) и инкубировали 20 мин при 4 С. Клетки затем промывали, используя Perm Wash (набор BD), и ресуспендировали с использованием 50 мкл смеси анти-IFNAPC (1/50)+анти-IL-2 FITC (флуоресцеинизотиоцианат) (1/50), разведенных в Perm Wash. После инкубации, минимум, 2 ч, максимум, в течение ночи при 4 С, клетки промывали Perm Wash и ресуспендировали в PBS с 1% FCS+1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляли с использованием FACS(fluorescence-activated cell sorter, клеточный сортер с активацией флуоресценции). Живые клетки сортировали (FSC/SSC) и сбор данных осуществляли приблизительно на 20000 событий (лимфоцитов) или 35000 событий на CD4+ Т-клетках. Проценты IFN-+ или IL2+ рассчитывали на отсортированных популяциях CD4+ и CD8+.I.2.1. Тест на ингибирование гемагглютинации (HI). Методика тестирования Определяли титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа, используя тест на ингибирование гемагглютинации (HI). Принцип HI-теста основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (RBC) цыпленка гемагглютинином (НА) вируса гриппа. Образцы сыворотки первоначально обрабатывали 25% раствором нейраминидазы (RDE) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 ед. гемагглютинации каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляли эритроциты цыпленка и оценивали ингибирование агглютинации. Титры выражали в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, при котором наблюдали полное ингибирование гемагглютинации. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, недетектируемый уровень оценивали как титр, равный 5. Статистический анализ Статистический анализ осуществляли для HI-титров (41-е сутки до контрольного заражения), используя UNISTAT. Протокол, прилагаемый для дисперсионного анализа, можно кратко описать следующим образом: логарифмическое преобразование данных; критерий Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk) для каждой популяции (группы) с целью проверки нормальности распределения в группах; критерий Кокрена (Cochran) с целью проверки однородности дисперсии между разными популяциями (группами); критерий взаимодествия одностороннего ANOVA (дисперсионного анализа);HSD-критерий Тьюки для множественных сравнений.I.2.2. Мониторинг температуры организма. Индивидуальные температуры регистрировали в течение периода контрольного заражения с помощью датчиков и посредством телеметрической регистрации. Все имплантаты проверили и обновили и перед размещением во внутрибрюшинной полости провели новое калибрование с использованием DSI(Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Нидерланды). На время этих измерений всех животных индивидуально размещали в отдельных клетках. Температуры регистрировали каждые 15 мин в течение 4 суток до контрольного заражения и вплоть до 7 суток после контрольного заражения.I.2.3. Назальные смывы. Назальные смывы получали путем введения 5 мл PBS в обе ноздри бодрствующим животным. Инокулят собирали в чашку Петри и помещали в контейнеры для образцов на сухом льду. Титрование вирусов в назальных смывах Все назальные образцы сначала фильтровали в стерильных условиях через фильтры Spin X (Costar) для удаления любого бактериального загрязнения. По 50 мкл серийных десятикратных разведений назальных смывов переносили в микротитрационные планшеты, содержащие по 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл клеток MDCK (2,4105 клеток/мл) и инкубирова- 19011419 ли при 35 С в течение 5-7 суток. Через 5-7 суток инкубации культуральную среду осторожно удаляют, добавляют по 100 мкл 1/20WST-1-содержащей среды и инкубируют в течение еще 18 ч. Интенсивность желтого формазанового красителя, образующегося в результате восстановленияWST-1 (водорастворимой тетразолиевой соли, от англ. water soluble tetrasolium salt) жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству находящихся в лунке жизнеспособных клеток по окончании анализа титрования вирусов и определяется количественно путем измерения поглощения в каждой лунке на соответствующей длине волны (450 нм). Начало отсчета определяют как среднее значение OD (оптическая плотность) для неинфицированных контрольных клеток - 0,3 OD (0,3 OD соответствует +/-3 SD(стандартное отклонение) OD для неинфицированных контрольных клеток). Положительный балл определяют, когда OD находится ниже начала отсчета, и, наоборот, отрицательный балл определяют, когдаOD находится выше начала отсчета. Титры вирусного шеддинга определяли согласно "Reed and Muench" и выражали в виде log TCID50 (средняя цитопатогенная доза (инфицирующая 50% клеток/мл.I.3. Анализы оценки иммунного ответа у людей.I.3.1. Анализ ингибирования гемагглютинации. Иммунный ответ определяли путем измерения HI-антител, используя способ, описанный Центром ВОЗ по совместному изучению гриппа (WHO Collaborating Centre for influenza), Центрами по контролю заболеваемости, Атланта, США (1991). Измерение титра антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки с помощью стандартизированного и всесторонне достоверного микрометода с использованием 4 ед. ингибирования гемагглютинации (4 HIU) соответствующих антигенов и 0,5% суспензии куриных эритроцитов. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли тепловой обработкой и обработкой разрушающим рецепторы ферментом. Полученные образцы сыворотки оценивали по уровням HI-антител. Начиная с исходного разведения 1:10, приготавливали серии разведений (в 2 раза) до конечного разведения включительно, составляющего 1:20480. За конечную точку титрования принимали наибольшее разведение, при котором наблюдали полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы осуществляли в двух повторах.I.3.2. Анализ ингибирования нейраминидазы. Анализ осуществляли в покрытых фетуином микротитрационных планшетах. Приготавливали серии двукратных разведений антисыворотки и смешивали со стандартизированным количеством вируса гриппа A H3N2, H1N1 или вируса гриппа В. Тест основан на биологической активности нейраминидазы,которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления концевой нейраминовой кислоты -D-галактоза-N-ацетилгалактозамин становится доступным. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (HRP) агглютинин из арахиса Arachis hypogaea, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связанного агглютинина может быть определено и количественно измерено в реакции с субстратом пероксидазы тетра-метилбензидином (TMB). Наибольшее разведение антител, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, указывали как NI-титр.I.3.3. Анализ нейтрализующих антител. Измерения нейтрализующих антител осуществляли на размороженных образцах сыворотки. Нейтрализацию вируса содержащимися в сыворотке антителами определяли в анализе микронейтрализации. В данном анализе использовали сыворотки без дополнительной обработки. Каждую сыворотку тестировали в трех повторах. Стандартизированное количество вируса смешивали с последовательными разведениями сыворотки и инкубировали для обеспечения связывания антител с вирусом. Далее к смеси вируса и антисыворотки добавляли клеточную суспензию, содержащую определенное количество клетокMDCK, и инкубировали при 33 С. По окончании периода инкубации репликацию вируса визуализировали, используя гемагглютинацию эритроцитов цыпленка. Титр сыворотки, соответствующий 50% нейтрализации, рассчитывали по методу Reed и Muench.I.3.4. Клеточно-опосредованный иммунитет оценивали с использованием проточной цитометрии цитокинов (CFG). Антиген-специфические CD4 и CD8 Т-клетки периферической крови могут быть повторно стимулированы in vitro к продуцированию IL-2, CD40L, TNF-альфа и IFN, если их инкубировать с их соответствующим антигеном. В результате количество антиген-специфических CD4 и CD8 Т-клеток можно подсчитать с помощью проточной цитометрии с использованием традиционного иммунофлуоресцентного мечения клеточного фенотипа, а также внутриклеточной продукции цитокинов. В настоящем исследовании для повторной стимуляции специфических к вирусу гриппа Т-клеток использовали антиген вакцинного вируса гриппа, а также пептиды конкретного белка вируса гриппа. Результаты выражали в виде частоты встречаемости цитокин-позитивных CD4 или CD8 Т-клеток в CD4 или CD8 Т-клеточной субпопуляции.I.3.5.1. Первичные конечные точки. Процент, интенсивность и связь с вакцинацией вызывающих беспокойства местных и общих признаков и симптомов в течение 7-дневного периода контрольного наблюдения (т.е. в день вакцинации и в течение 6 последующих суток) после вакцинации и в целом.- 20011419 Процент, интенсивность и связь с вакцинацией не вызывающих беспокойства местных и общих признаков и симптомов в течение 21-дневного периода контрольного наблюдения (т.е. в день вакцинации и в течение 20 последующих суток) после вакцинации и в целом. Случаи серьезных неблагоприятных событий в течение всего исследования.I.3.5.2. Вторичные конечные точки. Что касается гуморального иммунного ответа: наблюдаемые переменные: на 0-е и 21-е сутки: титры сывороточных ингибирующих гемагглютинацию (HI) антител и NI-антител, тестируемые по отдельности против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (анти-H1N1-, анти-H3N2- и анти-В-антитела); на 0-е и 21-е сутки: титры нейтрализующих антител, тестируемых по отдельности против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине; вторичные переменные (с 95% доверительными интервалами): средние геометрические титры (GMT) сывороточных HI-антител с 95% доверительными интервалами (95% ДИ) до и после вакцинации; уровни сероконверсии с 95% ДИ на 21-е сутки; факторы конверсии с 95% ДИ на 21-е сутки; уровни серопротекции с 95% ДИ на 21-е сутки;GMT сывороточных NI-антител (с 95% доверительными интервалами) для всех временных точек. Уровень сероконверсии, определенный как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере четырехкратное увеличение сывороточных HI-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма. Фактор конверсии, определенный как кратное увеличение сывороточных GMT HI на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма. Уровень защиты, определенный как процент вакцинированных с сывороточным HI-титром, равным 40, после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принимают в качестве показателя защиты. Что касается клеточно-опосредованного иммунного (CMI) ответа: наблюдаемая переменная: на 0-е и 21-е сутки: частота встречаемости цитокин-позитивных CD4/CD8-клеток на 106 в разных тестах. В каждом тесте количественно определяли ответ CD4/CD8 Т-клеток на пептидный антиген вируса гриппа (pf) (точная природа и происхождение этих антигенов нуждается в представлении/объяснении); антиген расщепленного вируса гриппа (sf); антиген цельного вируса гриппа (wf); вторичные переменные: клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (CD40L, IL-2, IFN, TNF); клетки, продуцирующие по меньшей мере CD40L и другой цитокин (IL-2, TNF, IFN); клетки, продуцирующие по меньшей мере IL-2 и другой цитокин (CD40L, TNF, IFN); клетки, продуцирующие по меньшей мере IFN и другой цитокин (IL-2, TNF, CD40L); клетки, продуцирующие по меньшей мере TNF и другой цитокин (IL-2, CD40L, IFN).I.3.5.3. Анализ иммуногенности. Анализ иммуногенности осуществляли для всей когорты вакцинированных. Для каждой подвергаемой обработке группы подсчитывали следующие параметры (с 95% доверительными интервалами): средние геометрические титры (GMT) HI- и NI-антител на 0-е и 21-е сутки; средние геометрические титры (GMT) нейтрализующих антител на 0-е и 21-е сутки; факторы конверсии на 21-е сутки; уровни сероконверсии (SC) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере четырехкратное увеличение сывороточных HI-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками; уровни защиты на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных с сывороточным HIтитром, равным 1:40; частоту встречаемости CD4/CD8 Т-лимфоцитов, секретирующих в ответ, суммировали (описательная статистика) для каждой вакцинированной группы, для каждой временной точки (0-е сутки, 21-е сутки) и для каждого антигена (пептид вируса гриппа (pf), расщепленный вирус гриппа (sf) и цельный вирус гриппа (wf; описательную статистику индивидуального различия между ответами во временные точки "после" и "до"(Post-Pre) для каждой вакцинированной группы и каждого антигена (pf, sf и wf) в каждом из 5 разных тестов; для сравнения обнаруженных различий между 3 группами использовали непараметрический критерий (критерий Краскела-Уоллиса (Kruskall-Wallis и статистическое значение р рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 разных тестов. Все критерии значимости были двусторонними. Значения р,меньшие или равные 0,05, считали статистически значимыми.- 21011419 Пример II. Приготовление и определение характеристик эмульсии типа масло-в-воде и композиций адъювантов. Если не указано иное, то эмульсия типа масло-в-воде, используемая в последующих примерах, состоит из органической фазы, приготовленной из двух видов масел (альфа-токоферола и сквалена), и водной фазы из PBS, содержащего Твин 80 в качестве эмульгатора. Если не указано иное, то композиции адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде, используемые в последующих примерах, приготавливали как содержащие следующие компоненты эмульсии типа масло-в-воде (даны конечные концентрации): 2,5% сквалена (об./об.), 2,5% альфа-токоферола (об./об.), 0,9% полиоксиэтиленсорбитан моноолеатаII.1.1. Приготовление в лабораторных масштабах. Твин 80 растворяют в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) с получением 2% раствора в PBS. Для получения 100 мл двукратного концентрата эмульсии 5 г DL-альфа-токоферола и 5 мл сквалена интенсивно перемешивают для полного смешивания. Добавляют 90 мл раствора PBS/Твин и перемешивают для полного смешивания. Полученную эмульсию затем пропускают через шприц и осуществляют окончательную микрофлюидизацию, используя установку Microfluidics M110S. Полученные капельки масла имеют размер приблизительно 120-180 нм (выраженный как средний Z, измеренный посредствомPCS). Другие адъюванты/антигенные компоненты добавляют к эмульсии путем простого перемешивания.II.1.2. Приготовление в увеличенном масштабе. Приготовление эмульсии SB62 осуществляют путем смешивания в условиях сильного перемешивания масляной фазы, состоящей из гидрофобных компонентов (-токоферола и сквалена), и водной фазы,содержащей растворимые в воде компоненты (Твин 80 и PBS-мод (модифицированный); рН 6,8). При перемешивании масляную фазу (1/10 общего объема) переносят в водную фазу (9/10 общего объема) и смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученную смесь далее подвергают воздействию сил сдвига, ударных сил и сил кавитации в камере взаимодействия микрофлюидизатора(8 циклов по 15000 фунт/кв.дюйм (103,4 МПа для получения субмикронных капелек (распределение от 100 до 200 нм). Полученное значение рН составляет 6,80,1. Эмульсию SB62 затем стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм и стерильную нерасфасованную эмульсию хранят в холодильнике в контейнерах Cupac при 2-8C. Мертвый объем контейнера с конечной нерасфасованной эмульсиейSB62 продувают стерильным инертным газом (азотом или аргоном) в течение по меньшей мере 15 с. Конечный состав эмульсии SB62: Твин 80: 1,8% (об./об.) 19,4 мг/мл; сквален: 5% (об./об.) 42,8 мг/мл; -токоферол: 5% (об./об.) 47,5 мг/мл;II.2. Измерение размера капелек масла с использованием динамического светорассеяния.II.2.1. Введение. Размер диаметра капелек масла определяют согласно следующей методике и в следующих условиях эксперимента. Измерение размера капелек дано в виде меры интенсивности и выражено в виде среднегоII.2.2. Приготовление образцов. Измерения размеров осуществляли для адъюванта в виде эмульсии типа масло-в-воде: SB62, приготовленная согласно способу приготовления в увеличенном масштабе, AS03 и AS03+MPL (50 мкг/мл), два последних адъюванта приготавливали непосредственно перед использованием. Состав образцов приведен ниже (см. раздел II.2.4). Образцы разбавляли 4000 х-8000x в PBS 7,4. Для контроля стандарты частиц PL-Nanocal размером 100 нм ( по каталогу 6011-1015) разбавляли в 10 мМ NaCl.II.2.3. Результаты измерения размеров на Malvern Zetasizer 3000HS. Все измерения размеров осуществляли с использованием обоих Malvern Zetasizer 3000HS. Образцы измеряли в пластиковой кювете для Malvern-анализа в подходящем разведении (обычно при разведении от 4000 х до 20000x в зависимости от концентрации образцов) и с использованием двух оптических моделей: либо действительный индекс преломления (RI) частицы равен 0, а мнимый равен 0,либо действительный индекс преломления частицы равен 1,5, а мнимый равен 0,01 (адаптированная оптическая модель для эмульсии согласно значениям, найденным в литературе). Устанавливали следующие технические условия: длина волны лазера: 532 нм (Zeta3000HS),мощность лазера: 50 мВт (Zeta3000HS),рассеянный свет, детектируемый при 90 (Zeta3000HS),температура: 25 С,продолжительность: программированное автоматизированное определение,количество: 3 последовательных измерения,- 22011419 средний диаметр z: согласно кумулянтному анализу,распределение по размерам: согласно методу Contin или методу с использованием автоматизированного алгоритма. В автоматизированном алгоритме Malvern используется комбинация алгоритма для кумулянтного анализа, алгоритма Contin и алгоритма неотрицательных наименьших квадратов (NNLS). Распределение по интенсивности можно перевести в распределение по объему благодаря теории Mie. Приготовлено следующим образом: вода для инъекций, PBS 10x концентрированный, 250 мкл эмульсии SB62 и 25 мкг MPL смешивают вместе с достижением конечного объема 280 мкл. Размер среднего диаметра z (ZAD) оценивается по количеству света, рассеянного частицами каждого размера в образце. Эту величину связывают с мономодальным анализом образца и используют, главным образом, для целей воспроизводимости. Скорость счета (CR) представляет собой меру рассеянного света: она соответствует тысячам фотонов в секунду. Индекс полидисперсности (Poly) представляет собой ширину распределения. Он является безразмерным критерием уширения распределения. Анализ по Contin или с использованием автоматизированного алгоритма Два других препарата SB62 (двукратный концентрированный AS03) приготавливали и оценивали согласно методике, разъясненной выше, со следующими незначительными модификациями. Образцы измеряли в пластиковой кювете для Malvern-анализа в двух разведениях для получения оптимальных значений скорости счета: 10000 х и 20000x для Zetasizer 3000HS, в тех же оптических моделях, которые использовали в приведенном выше примере. Результаты показаны в табл. 3. Таблица 3"-" Когда полученные значения были некогерентными. Схематическое представление этих результатов показано на фиг. 1 для композиции 1023. Как можно видеть, значительное большинство частиц (например, по меньшей мере 80%) имеют диаметр менее 300 нм по интенсивности.II.2.5. Общий вывод. Композицию SB62 измеряли при разных разведениях с использованием Malvern Zetasizer 3000HS и двух оптических моделей. Размер частиц ZAD (т.е. среднее значение интенсивности согласно кумулянтному анализу) этих композиций, оцененных выше, составил приблизительно 150-155 нм. При использовании кумулянтного алгоритма авторы изобретения не наблюдали никакого влияния разведения на ZAD и полидисперсность.II.3.1. Приготовление жидкой суспензии MPL. Жидкий нерасфасованный MPL (как использовано во всем документе, это сокращенный вариант для 3D-MPL, т.е. 3-О-деацилированного монофосфориллипида А) приготавливают из лиофилизированного порошка MPL. Жидкий нерасфасованный MPL представляет собой стабильную концентрированную (приблизительно 1 мг/мл) водную дисперсию неочищенного вещества, которое готово к применению в вакцинной или адъювантной композиции. Схематическое представление способа приготовления приведено на фиг. 2. Для максимального размера партии 12 г приготовление жидкого нерасфасованного MPL осуществляют в стерильных стеклянных контейнерах. Процесс диспергирования MPL состоит из следующих стадий: суспендировать порошок MPL в воде для инъекций; провести дезагрегацию любых больших агрегатов путем нагревания (термической обработки); уменьшить размер частиц до диапазона от 100 до 200 нм посредством микрофлюидизации; провести предварительную фильтрацию препарата на модуле для предварительной фильтрацииSartoclean, 0,8/0,65 мкм; провести стерильную фильтрацию препарата при комнатной температуре (модуль Sartobran P; 0,22 мкм). Порошок MPL лиофилизуют посредством микрофлюидизации, получая стабильную коллоидную водную дисперсию (размер частиц MPL меньше 200 нм). Лиофилизированный порошок MPL диспергируют в воде для инъекций с целью получения грубой суспензии 10 мг/мл. Затем суспензию подвергают термической обработке при перемешивании. После охлаждения до комнатной температуры начинают процесс микрофлюидизации для уменьшения размера частиц. Микрофлюидизацию осуществляют, используя установку Microfluidics М 110 ЕН, посредством непрерывной циркуляции дисперсии через камеру для микрофлюидизационных взаимодействий при определенном давлении для минимального количества проходов (количество циклов: nmin). Продолжительность микрофлюидизации, представленную количеством циклов, рассчитывают на основе измеренной скорости потока и объема дисперсии. На данном оборудовании при указанном давлении полученная скорость потока может варьировать от одной камеры взаимодействия к другой и на протяжении срока службы конкретной камеры взаимодействия. В представленном примере используемая камера взаимодействия имеет тип F20Y Microfluidics. Поскольку эффективность микрофлюидизации связана с парой давление-скорость потока, продолжительность процесса может меняться от одной партии к другой. Время, необходимое для 1 цикла, рассчитывают на основе скорости потока. Нужно иметь в виду, что скорость потока представляет собой скорость потока, измеренную с использованием воды для инъекций непосредственно перед введением MPL в установку. Один цикл определяют как время (в минутах), необходимое для одного прохождения суммарного объема MPL через установку. Время, необходимое для получения n циклов, рассчитывают следующим образом:nколичество MPL для обработки (мл)/скорость потока (мл/мин) Таким образом, в соответствии с этим подбирают количество циклов. Минимальное количество циклов выполнения (nmin) описано для предпочтительных использованных оборудования и камер взаимодействия. Общее количество циклов работы определяют по результату измерения размеров частиц,выполненного после nmin циклов. На основе литературных данных определяют предельный размер частиц (dlim). Измерение осуществляют посредством методики фотонно-корреляционной спектроскопии(PCS) и dlim выражают в виде одномодального результата (Zaverage). Если получено значение ниже этого предела, то микрофлюидизация может быть остановлена после nmin циклов. Выше этого предела микрофлюидизацию продолжают до тех пор, пока не будет получено удовлетворительное уменьшение размера, в течение, максимум, 50 следующих циклов. Если фильтрацию не осуществляют непосредственно после микрофлюидизации, то диспергированный MPL хранят при температуре от +2 до +8C, ожидая передачи на участок для фильтрации. После микрофлюидизации дисперсию разбавляют водой для инъекций и стерильно фильтруют через фильтр 0,22 мкм в ламинарном потоке. Конечная концентрация MPL равна 1 мг/мл (0,80-1,20 мг/мл).II.3.2. Приготовление AS03+MPL-адъювантной вакцины: подход "в 1 флаконе". К композиции адъюванта AS03 добавляют MPL в конечной концентрации 10-50 мкг на вакцинную дозу. Десятикратный концентрированный PBS (рН 7,4 в расчете на однократную концентрацию), а также смесь SB62, содержащую Твин, Тритон Х-100 и VES (витамина E сукцинат), добавляют в воду для инъекций. Количества детергентов берутся с учетом детергентов, присутствующих в штаммах вируса гриппа, с тем, чтобы достичь целевой конечной концентрации 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона Х-100 и 100 мкг/мл VES. После 5 мин перемешивания добавляют по 15 мкг каждого представляющего интерес штамма вируса гриппа (например, штамма H1N1, H3N2 и В в классической трехвалентной вакцине). После 15 мин перемешивания добавляют 250 мкл эмульсии SB62 и затем 25 мкг или 50 мкг MPL. Схематическое представление способа приготовления приведено на фиг. 3. Конечная композицияAS03, содержащая MPL, на дозу для человека приведена в табл. 4.II.3.3. Приготовление AS03+MPL-адъювантной вакцины: подход "в 2 флаконах". Такую же композицию можно приготовить с использованием подхода "в 2 флаконах" путем смешивания двукратного концентрированного антигена или антигенного препарата с адъювантом AS03 (250 мкл SB62) илиAS03+MPL (250 мкл SB62 + 25 мкг или 50 мкг MPL). В этом случае приготовление осуществляют следующим образом. Приготовление AS25-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий: 1) приготовление трехвалентной конечной нерасфасованной композиции (двукратной концентрированной) без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов; 2) приготовление адъюванта AS03+MPL; 3) разведение непосредственно перед применением AS03+MPL-адъювантной расщепленной вирусной вакцины. 1) Приготовление трехвалентной конечной нерасфасованной композиции без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов. Объемы трех одновалентных нерасфасованных форм берут на основании содержания НА, измеренного в каждой одновалентной нерасфасованной форме перед приготовлением композиции, и целевого объема, равного 1100 мл. Концентрированный, забуференый фосфатом физиологический раствор и предварительно приготовленную смесь Твина 80, Тритона Х-100 и -токоферилгидросукцината разбавляют в воде для инъекций. Затем три концентрированные нерасфасованные моноформы (A/New Caledonia,A/New York, B/Jiangsu) последовательно разбавляют в полученном растворе, представляющем собой забуференый фосфатом физиологический раствор/Твин 80 - Тритон Х-100 - -токоферилгидросукцинат(рН 7,4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, 990 мкг/мл Твина 80, 150 мкг/мл Тритона Х-100 и 130 мкг/мл -токоферилгидросукцината), для получения конечной концентрации 39,47 мкг НА из штаммов A (H1N1, H3N2) в 1 мл трехвалентной конечной нерасфасованной формы (15 мкг НА/штамм А/380 мкл трехвалентной конечной нерасфасованной формы) и 46 мкг НА из штамма В (17,5 мкг НА/штамм В/380 мкл трехвалентной конечной нерасфасованной формы). Между добавлением каждой одновалентной нерасфасованной формы смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре. После добавления последней одновалентной нерасфасованной формы и 15-30 мин перемешивания рН контролируют и доводят до 7,20,2 с помощью HCl или NaOH. Трехвалентную конечную нерасфасованную форму антигенов помещают в асептических условиях в 3 мл стерильные стеклянные флаконы типа I (Европейская фармакопея). Каждый флакон имеет объем 470 мкл (380 мкл+90 мкл с учетом переполнения). 2) Приготовление нерасфасованной формы адъюванта AS03/MPL и помещение в контейнер для адъювантов. Адъювант AS03/MPL приготавливают путем смешивания двух компонентов: эмульсии SB62 (способ в разделе II.1.2) и MPL (способ в разделе II.3.1). Однократный концентрированный PBS-мод (приготовленный путем разведения десятикратного концентрированного PBS-мод в воде для инъекций) смешивают с нерасфасованной формой SB62 и жидкой нерасфасованной формой MPL в концентрации 1 мг/мл. Концентрация MPL будет определена таким образом, чтобы достичь конечного содержания в диапазоне 10-50 мкг, соответственно, приблизительно 25 мкг на конечную вакцинную дозу для человека. Смесь перемешивают в течение 5-30 мин при комнатной температуре и рН доводят до 6,80,1 с помощьюNaOH (0,05 или 0,5M)/HCl (0,03M или 0,3M). После следующего перемешивания в течение 5-30 мин при комнатной температуре смесь стерилизуют фильтрацией через мембрану 0,22 мкм. В течение, минимум,1 мин осуществляют продувку стерильным инертным газом (азотом) для создания свободного инертного пространства в заполненных контейнерах. Стерильный адъювант AS03+MPL хранят при +2-8C до момента асептического заполнения в 1,25 мл стерильные стеклянные шприцы типа I (Европейская фармакопея). Каждый шприц имеет избыточный объем 80 мкл (320 мкл+80 мкл с учетом переполнения).- 25011419 В момент инъекции содержимое предварительно заполненного шприца, содержащего адъювант,впрыскивают во флакон, который содержит концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены. После смешивания содержимое возвращают назад в шприц, а иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции. 1 доза восстановленной AS25-адъювантной противогриппозной вакцины-кандидата соответствует 0,7 мл.II.4. Приготовление иммуногенных композиций, содержащих антиген вируса гриппа и возможноMPL в эмульсионной композиции типа масло-в-воде. К эмульсии SB62 из II.1 добавляли равный объем двукратного концентрированного антигена расщепленного вируса гриппа (Fluarix) (15 мкг НА на штамм) и перемешивали. Это объединяли, когда было целесообразно, с 50 мкг/мл MPL, получая конечную композицию. Пример III. Клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа и адъювант AS03, на пожилом населении в возрасте старше 65 лет (Explo-Flu-001). Фазу I открытого рандомизированного исследования осуществляли на пожилом населении в возрасте старше 65 лет в 2003 г. с целью оценки реактогенности и иммуногенности противогриппозной вакцины-кандидата от GlaxoSmithKline (GSK) Biologicals, содержащей адъювант AS03. Гуморальный иммунный ответ (т.е. титры антигемагглютининовых, нейтрализующих и антинейраминидазных антител) и клеточно-опосредованный иммунный ответ (CD4 и/или CD8 Т-клеточные ответы) измеряли через 21 сутки после внутримышечного введения 1 дозы AS03-адъювантной вакцины или вакцины WVV. Fluarix использовали для сравнения.III.1. План исследования. Три группы субъектов, параллельно получавшие внутримышечно следующую вакцину: одна группа из 50 субъектов, получающих 1 дозу восстановленной и адъювантной противогриппозной вакцины SV (FluAS03); одна группа из 50 субъектов, получающих 1 дозу противогриппозной цельновирионной вакцины (FluWVV); одна группа из 50 субъектов, получающих 1 дозу Fluarix (Fluarix), представляющая собой контрольную группу. Режим вакцинации: 1 инъекция противогриппозной вакцины на 0-е сутки, отбор образцов крови,анализ данных на 21-е сутки (определение HI-антител, определение NI-антител, определение нейтрализующих антител и анализ CMI) и заключение по результатам исследования. Стандартная трехвалентная расщепленная вакцина против гриппа Fluarix, которую использовали в этом исследовании, представляет собой имеющуюся в продаже с 2003 г. вакцину, разработанную и производимую фирмой GlaxoSmithKline Biologicals.AS03-Адъювантная противогриппозная вакцина-кандидат представляет собой 2-компонентную вакцину, состоящую из концентрированных трехвалентных инактивированных расщепленных вирионных антигенов, представленных в стеклянном флаконе типа I (335 мкл) (контейнер для антигенов), и предварительно заполненного стеклянного шприца типа I, содержащего эмульсию SB62 (335 мкл) (контейнер для адъювантов). В момент инъекции содержимое контейнера для антигенов извлекают из флакона с помощью шприца, предварительно заполненного эмульсией SB62, с последующим легким перемешиванием содержимого шприца. Смешивание эмульсии SB62 с вакцинными антигенами дает адъювант AS03. Перед инъекцией использованную иглу заменяют на иглу для внутримышечной инъекции и доводят объем до 500 мкл. 1 доза восстановленной AS03-адъювантной противогриппозной вакцины соответствует 0,5 мл, содержит 15 мкг НА каждого штамма вируса гриппа, как в зарегистрированной вакцине Fluarix/-Rix, и содержит 10,68 мг сквалена, 11,86 мг DL-альфа-токоферола и 4,85 мг полисорбата 80 (Твин 80). Приготовление Приготовление AS03-адъювантной противогриппозной вакцины состоит из трех основных стадий. 1) Приготовление трехвалентной конечной нерасфасованной композиции без адъюванта и помещение в контейнер для антигенов. Объемы трех одновалентных нерасфасованных форм берут на основании содержания НА, измеренного в каждой одновалентной нерасфасованной форме перед приготовлением композиции, и целевого объема, равного 800 мл. Концентрированный, забуференый фосфатом физиологический раствор и предварительно приготовленную смесь Твина 80, Тритона Х-100 и -токоферилгидросукцината разбавляют в воде для инъекций. Затем три концентрированные нерасфасованные моноформы (штамм A/New Caledonia, штамм A/Panama и штамм B/Shangdong) последовательно разбавляют в полученном растворе, представляющем собой забуференный фосфатом физиологический раствор/Твин 80 - Тритон Х-100 - -токоферилгидросукцинат (рН 7,4, 137 мМNaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, 1500 мкг/мл Твина 80, 220 мкг/мл Тритона Х-100 и 200 мкг/мл -токоферилгидросукцината), для получения конечной концентрации 60 мкг НА из штаммов А в 1 мл трехвалентной конечной нерасфасованной формы (15 мкг НА/штамм А/250 мкл трехвалентной конечной нерасфасованной формы) и 70 мкг НА из штамма В (17,5 мкг НА/штамм В/250 мкл трехвалентной конечной нерасфасованной формы). Между добавлением каждой одновалентной нерасфасованной формы смесь переме- 26011419 шивают в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления последней одновалентной нерасфасованной формы и 15 мин перемешивания рН контролируют и доводят до 7,20,2 с помощью HCl или NaOH. Конечную трехвалентную нерасфасованную форму антигенов помещают в асептических условиях в 3 мл стерильные стеклянные флаконы типа I. Каждый флакон имеет избыток объема 34% (общий объем 335 мкл). 2) Приготовление стерильной нерасфасованной эмульсии SB62 и помещение в контейнер для адъювантов. Водная фаза: при перемешивании 902 мл Твина 80 смешивают с 44105 мл буфера PBS-мод (рН равен 6,8 после подведения с помощью HCl). Масляная фаза: при перемешивании к 2550 мл -токоферола добавляют 2550 мл сквалена. Смешивание водной и масляной фаз: при перемешивании 5000 мл масляной фазы (1/10 общего объема) переносят в 45007 мл водной фазы (9/10 общего объема). Смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Эмульгирование: полученную смесь подвергают воздействию сил сдвига, ударных сил и сил кавитации в камере взаимодействия микрофлюидизатора (8 циклов по 15000 фунт/кв.дюйм (103,4 МПа для получения субмикронных капелек (распределение от 100 до 200 нм). Полученное значение рН находится в диапазоне 6,80,1. Стерильная фильтрация: эмульсию SB62 стерилизуют путем фильтрации через мембрану 0,22 мкм и стерильную нерасфасованную эмульсию хранят в холодильнике в контейнерах Cupac при 2-8 С. Мертвый объем контейнера с конечной нерасфасованной эмульсией SB62 продувают стерильным инертным газом (азотом или аргоном) в течение по меньшей мере 15 с. Все количества ингредиентов приведены для приготовления 50 л эмульсии и даны в объемах. На практике эти количества взвешивают, учитывая плотности ингредиентов. Плотность PBS считается равной 1. Конечный состав эмульсии SB62 следующий. Таблица 5 Стерильную нерасфасованную эмульсию SB62 затем помещают в асептических условиях в 1,25 мл стерильные стеклянные шприцы типа I. Каждый шприц имеет избыток объема 34% (общий объем 335 мкл). 3) Разведение непосредственно перед применением AS03-адъювантной расщепленной вирусной вакцины. В момент инъекции содержимое флакона, содержащего концентрированные трехвалентные инактивированные расщепленные вирионные антигены, извлекают из флакона с помощью шприца, содержащего эмульсию SB62, с последующим легким перемешиванием содержимого шприца. Смешивание эмульсии SB62 с вакцинными антигенами дает адъювант AS03.- 27011419 Вакцины вводили внутримышечно в участок дельтовидной мышцы недоминирующей руки. За вакцинированными тщательно наблюдали в течение по меньшей мере 30 мин с оказанием соответствующего медицинского лечения, легко доступного в случае нечастой анафилактической реакции после введения вакцины.III.3. Результаты исследований на населении. В этом исследовании всего было зарегистрировано 148 субъектов: 49 субъектов в группе FluAS03,49 субъектов в группе Fluarix и 50 субъектов в группе FluWVV. Средний возраст всей когорты вакцинированных на момент вакцинации составлял 71,8 лет со стандартным отклонением 6,0 лет. Средний возраст субъектов и распределение их по половому признаку среди трех вакцинных групп были аналогичными.III.4. Выводы по безопасности. Введение противогриппозной вакцины с адъювантом AS03 было безопасным и клинически хорошо переносилось обследованным населением, т.е. пожилыми людьми в возрасте старше 65 лет.III.5. Результаты по иммуногенности. Анализ иммуногенности осуществляли для всей когорты вакцинированных.III.5.1. Гуморальный иммунный ответ. С целью оценки гуморального иммунного ответа, индуцированного AS03-адъювантной вакциной,для каждой подвергаемой обработке группы рассчитывали следующие параметры (с 95% доверительными интервалами): средние геометрические титры (GMT) HI- и NI-антител на 0-е и 21-е сутки; средние геометрические титры (GMT) нейтрализующих антител на 0-е и 21-е сутки; уровни сероконверсии (SC) на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере четырехкратное увеличение сывороточных HI-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками; факторы конверсии на 21-е сутки, определенные как кратное увеличение сывороточных GMT HI на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма; уровни защиты на 21-е сутки, определенные как процент вакцинированных с сывороточным HI-титром, равным 1:40.III.5.1.1. Антигемагглютининовый антительный ответ. а) Средние геометрические титры (GMT) HI.GMT для HI-антител с 95% ДИ показаны в табл. 7 (GMT для анти-HI-антитела). Перед вакцинацией GMT антител для всех вакцинных штаммов находились в одном и том же диапазоне для трех групп. После вакцинации уровни антигемагглютининовых антител значительно увеличились. После вакцинации имелась тенденция к более высоким значениям GMT HI-антитела для всех трех вакцинных штаммов в группах FluAS03 и Fluarix, хотя имелось некоторое перекрывание 95% ДИ между группами Fluarix и группами FluWVV. Таблица 7PRE = перед вакцинацией на 0-е сутки.PI(D21) = после вакцинации на 21-е сутки. б) Факторы конверсии титров анти-HI-антител, уровни серопротекции и уровни сероконверсии- 28011419 Факторы конверсии представляют собой кратное увеличение сывороточных GMT HI для каждого вакцинного штамма на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками. Фактор конверсии варьирует от 6,1 до 13,6 в зависимости от вирусного штамма и вакцины. Такой фактор конверсии значительно превосходит двукратное увеличение GMT, требуемое Европейскими ведомствами. Уровни серопротекции представляют собой долю субъектов с сывороточным HI-титром, превышающим или равным 40 на 21-е сутки. В начале исследования половина субъектов (диапазон 34,0-69,4%) во всех группах имела защитные уровни антител для всех штаммов. На 21-е сутки уровни серопротекции в трех группах находились в диапазоне от 88,0 до 100% для разных вирусных штаммов. В контексте иммунитета это означает, что более чем 88% субъектов имели сывороточный HI-титр после вакцинации,превышающий или равный 40, и считается, что они защищены против этих трех штаммов. Такой уровень значительно превосходит уровень серопротекции 60%, требуемый европейскими ведомствами для пожилого населения в возрасте 60 лет или старше. Уровни сероконверсии представляют собой долю субъектов по меньшей мере с четырехкратным увеличением сывороточных HI-титров на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками. Уровни общего ответа для трех штаммов, по существу, оказались равны в трех группах. Чтобы считаться эффективной и соответствующей требованиям Европейского Союза (ЕС), вакцина должна индуцировать уровень сероконверсии более чем 30% у пожилого населения в возрасте 60 лет. В этом исследовании уровень сероконверсии превышал 50% для трех групп. Таблица 8N = общее количество субъектов. В заключение: после вакцинации наблюдалась тенденция к более высоким значениям GMT HI-антитела для всех трех вакцинных штаммов в группах FluAS03 и Fluarix, хотя имелось некоторое перекрывание 95% ДИ между группами Fluarix и группами FluWVV; фактор конверсии варьирует от 6,1 до 13,6 в зависимости от вирусного штамма и вакцины. Такой фактор конверсии значительно превосходит двукратное увеличение GMT, требуемое европейскими ведомствами; на 21-е сутки уровни серопротекции в трех группах находились в диапазоне от 88,0 до 100% для разных вирусных штаммов. Такой уровень значительно превосходит уровень серопротекции 60%, требуемый европейскими ведомствами для пожилого населения в возрасте 60 лет или старше; в этом исследовании уровень сероконверсии превышал 50% для трех групп. Уровни общего ответа для трех штаммов, по существу, оказались равными в трех группах.III.5.1.2. Титры нейтрализующих антител. Для того, чтобы лучше охарактеризовать иммунный ответ на противогриппозную вакцинацию пожилых людей, оценивали сывороточные антительные ответы на нейтрализующие антигены. Результаты показаны в табл. 9 (уровни серопротекции и средние геометрические титры (GMT) для титров антинейтрализующих антител) и табл. 10 (уровни сероконверсии для антинейтрализации на 21-е сутки после вакцинации (кратное увеличение равно 4. Титры нейтрализующего антитела против трех штаммов вируса гриппа измеряли в сыворотках до и после иммунизации. Определяли следующие параметры: средние геометрические титры (GMT) сывороточных нейтрализующих антител с 95% доверительными интервалами (95% ДИ) до и после вакцинации;- 29011419 уровни сероконверсии с 95% ДИ на 21-е сутки, определяемые как процент вакцинированных,имеющих по меньшей мере четырехкратное увеличение в HI-титрах на 21-е сутки по сравнению с 0-ми сутками, для каждого вакцинного штамма. Таблица 9PRE = перед вакцинацией на 0-е сутки.PI(D21) = после вакцинации на 21-е сутки. Таблица 10N = количество субъектов с доступными результатами как до, так и после вакцинации.% = доля респондеров (n/N100). 95% ДИ = строго 95% доверительный интервал; LL = нижний предел, UL = верхний предел. Основные результаты Для трех вакцин на 21-е сутки получен уровень серопротекции 100% против обоих штаммов А. Что касается штамма В, то уровни серопротекции в трех группах находились в диапазоне от 92 до 100%. После вакцинации наблюдалось значительное возрастание GMT для всех штаммов в трех группах. Однако наблюдалась тенденция к более высоким значениям GMT нейтрализующего антитела для всех трех вакцинных штаммов в группах FluAS03 и Fluarix по сравнению с группой FluWVV, хотя имелось некоторое перекрывание 95% ДИ между группами Fluarix и группой FluWVV. Что касается уровней сероконверсии, то уровни общего ответа для трех штаммов, по существу, оказались равными в трех группах. Во всех группах результаты согласовывались с результатами, полученными из анализа, выполненного для антигемагглютининовых антител.
МПК / Метки
МПК: A61K 39/39, A61K 39/145
Метки: композиция, противогриппозная, поливалентная, иммуногенная
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-11419-polivalentnaya-protivogrippoznaya-immunogennaya-kompoziciya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Поливалентная противогриппозная иммуногенная композиция</a>
Поливалентная менингококковая полисахаридно-белковая конъюгированная вакцина
Номер патента: 6947
Опубликовано: 30.06.2006
Автор: Райэлл Роберт П.
МПК: A61K 47/48
Метки: вакцина, поливалентная, конъюгированная, полисахаридно-белковая, менингококковая
Формула / Реферат:
1. Иммунологическая композиция, содержащая комбинацию двух, трех или четырех отдельных и раздельно приготовленных конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов содержит очищенный капсульный полисахарид, полученный из N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 или Y, конъюгированных с белком-носителем, где по меньшей мере одна серогруппа представляет собой W-135 или Y. 2. Иммунологическая композиция по п.1, в которой по меньшей мере...
Композиция, обладающая антивирусной активностью, способ её получения и фармацевтическая композиция на её основе
Номер патента: 112
Опубликовано: 27.08.1998
Автор: Аликс Ролан Коммэн
МПК: A61K 35/78
Метки: композиция, обладающая, основе, активностью, антивирусной, получения, способ, фармацевтическая
Формула / Реферат:
1. Композиция на основе продуктов природного происхождения, обладающая антивирусной активностью, отличающаяся тем, что она содержит настой порошка кокосового ореха в уксусной кислоте, водный раствор минеральных солей и фармацевтически приемлемые экстракты кактусовых, лилейных, анакардиевых и молочайных культур. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она содержит настой порошка кокосового ореха в уксусной кислоте, водный раствор минеральных...
Стабилизированная полимерная композиция, способ стабилизации термопластичной смолы и композиция стабилизаторов
Номер патента: 42
Опубликовано: 26.02.1998
Авторы: Прабху Ваикунт С., Авакиан Роджер В.
МПК: C08L 23/02, C08K 5/32
Метки: стабилизированная, способ, стабилизации, композиция, стабилизаторов, термопластичной, полимерная, смолы
Формула / Реферат:
1. Стабилизированная полимерная композиция, содержащая термопластичную смолу и стабилизатор в количестве от 0,001 до 5% по отношению к общей массе композиции, отличающаяся тем, что в качестве стабилизатора она содержит N-окись амина общей формулы: в которой R1, R2 и R3 независимо выбираются из алкила, арила, аралкила, алкарила, циклоалкила, алкилциклоалкила и циклоалкилалкила, и каждый содержит от 1 до 36 углеродных атомов, при условии,...
Композиция для лечения гриппа, способ ее стабилизации
Номер патента: 9896
Опубликовано: 28.04.2008
Авторы: Киселев Олег Иванович, Огольцев Вячеслав Александрович, Купсин Евгений Вениаминович, Катков Владимир Федорович
МПК: A61K 31/135, A61K 31/353, A61K 31/375...
Метки: гриппа, композиция, способ, стабилизации, лечения
Формула / Реферат:
1. Антигриппозный комплексный препарат для перорального назначения, включающий аскорбиновую кислоту, рутин, димедрол, препараты кальция, анальгин и наполнитель, характеризующийся тем, что активные компоненты при этом сгруппированы по химической совместимости в две капсулы или таблетки, составляющие вместе одноразовую дозу, при следующем соотношении компонентов, на каждую капсулу или таблетку A, мас.%: ацетилсалициловая кислота 43,0 ...
Вакцинная композиция против малярии
Номер патента: 2167
Опубликовано: 28.02.2002
Автор: Коэн Джозеф
МПК: A61P 33/06, A61K 39/015
Метки: композиция, против, малярии, вакцинная
Формула / Реферат:
1. Вакцинная композиция, содержащая, по меньшей мере, два антигена в комбинации с адъювантом, который является предпочтительным стимулятором ТН1 клеточного ответа, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, два антигена выбраны из группы, включающей в себя: (а) гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок CS белка, четыре или более чем четыре тандемных повтора иммунодоминантного района CS белка и поверхностный антиген вируса...
Предыдущий патент: Производные 2-(1h-индолилсульфанил)ариламина для применения при лечении аффективных расстройств, боли, нгдв и стрессового недержания мочи
Следующий патент: Профилактика вич-инфекции
Случайный патент: Способ диагностики шизофрении, комплект из двух праймеров для осуществления способа и набор, включающий комплект праймеров