Поливалентная менингококковая полисахаридно-белковая конъюгированная вакцина

006947 Данная патентная заявка утверждает преимущество предварительной заявки США 60263435, поданной 23 января 2001 г. Предпосылки создания изобретения Область, к которой относится изобретение Данное изобретение в общем случае относится к медицине, а более точно к микробиологии, иммунологии, вакцинам и профилактике инфекции, вызванной бактериальным патогеном, при помощи иммунизации. Описание предшествующего уровня техники Во всем мире Neisseria meningitidis является основной причиной бактериальных менингитов и сепсисов. Доля эндемичных менингококковых заболеваний в течение последних тридцати лет находится в пределах от 1 до 5 на 100000 в развитых странах и от 10 до 25 на 100000 в развивающихся странах.(Reido, F.X. et. al. 1995). Во время эпидемий доля менингококковых заболеваний приближается к 1000 на 1000000. В Соединенных Штатах ежегодно происходит примерно 2600 случаев бактериальных менингитов и в среднем 330000 случаев в развивающихся странах. Уровень смертности находится в границах от 10 до 20%. Патогенные менингококки заключены в полисахаридную капсулу, прикрепленную к наружной поверхности мембраны организма. На основе иммунологической специфичности капсульных полисахаридов было идентифицировано тринадцать серогрупп менингококков. Пять из данных тринадцати серогрупп вызывают большинство менингококковых заболеваний; они включают в себя серогруппы А, В, С,W-135 и Y. Серогруппа А ответственна за большинство эпидемических заболеваний. Серогруппы В, С иY вызывают большинство эндемичных заболеваний и локальных вспышек. Носоглоточная слизистая оболочка человека является единственным известным естественным резервуаром Neisseria meningitidis. Образование колоний происходит как на внешней поверхности клеток слизистой оболочки, так и в субэпителиальной ткани носоглотки. Носительство менингококка может продолжаться в течение нескольких месяцев. Распространение менингококка происходит в результате прямого контакта или воздушно-капельным путем. Менингококки проникают в организм сквозь слизистый эпителий через фагоцитарные вакуоли в результате эндоцитоза. Защитная сила организма при инвазии менингококка зависит от комплементзависимого лизиса бактерий. Антитела сыворотки, которые ответственны за комплементзависимый лизис бактерий, в большинстве случаев направлены против внешних капсульных полисахаридов. Описаны вакцины, основанные на менингококковых полисахаридах, вызывающие иммунный ответ на капсульные полисахариды. Такие антитела имеют способность к комплементзависимому лизису менингококков определенных серологических групп. Показано, что полисахаридные менингококковые вакцины эффективны у детей и взрослых (Peltola H., et. al. 1977 and Artenstein M.S., et. al. 1970), но эффективность ограничена у новорожденных и детей раннего возраста (Reingold A.L., et. al. 1985). Последующие дозы полисахарида в группе детей раннего возраста вызывали слабый бустерный ответ или не вызывали его. (Goldschneider I., et. al. 1973 and Gold R., et. al. 1977). Продолжительность защиты, вызванной полисахаридными менингококковыми вакцинами, не является длительной и составляет примерно от 3 до 5 лет у взрослых и детей старше 4 лет (Brandt В., et. al. 1975, Kyhty H., et. al. 1980 and Ceesay S.J., et.al. 1993). У детей в возрасте от года до четырех лет длительность защиты составляет менее трех лет (Reingold A.L., et. al. 1985). Полисахариды не способны связываться с молекулами главного комплекса гистосовместимости,что является необходимым условием для презентации антигена лимфоцитам Т-хелперам и их стимуляции, т.е. они являются T-независимыми антигенами. Полисахариды способны стимулировать Влимфоциты к выработке антител без помощи лимфоцитов Т-хелперов. Как результат T-независимой стимуляции В-лимфоцитов, после иммунизации этими антигенами отсутствует индукция памяти. Полисахаридные антигены способны вызывать очень эффективные Т-независимые ответы у взрослых, но такие Т-независимые ответы слабы у незрелой иммунной системы младенцев и детей раннего возраста. Т-независимые полисахаридные антигены могут быть преобразованы в Т-зависимые антигены при помощи ковалентного присоединения полисахаридов к молекулам белка (носителям или белкамносителям). В-клетки, которые связывают полисахаридные компоненты конъюгированной вакцины,могут активироваться при помощи клеток Т-хелперов, специфичных для пептидов, являющихся частью конъюгированного белка-носителя. Ответ Т-хелперов на белок-носитель обеспечивает увеличение выработки антител на полисахариды. Показано, что полисахариды серогруппы В являются практически неиммуногенными в популяциях человека (Wyle F.A., et. al. 1972). Химическое присоединение полисахарида данной серогруппы к белками не изменяет значимо иммунный ответ у лабораторных животных (Jennings H.J., et. al. 1981). Считается, что причиной отсутствия иммунного ответа на полисахарид этой серогруппы является структурное сходство между полисахаридом серогруппы В и полисиалированными гликопротеинами хозяина, такими как молекулы адгезии нервных клеток. Описана менингококковая конъюгированная вакцина, основанная на полисахариде серогруппы С. Такая моновалентная вакцина вызывает сильный функциональный антительный ответ на капсульный-1 006947 полисахарид, присутствующий в штамме N.meningitidis, соответствующем серогруппе С. Эта вакцина способна только к защите от заболевания, вызванного бактериями серогруппы С. Существующие вакцины, основанные на менингококковых полисахаридах, имеют ограниченное применение среди детей раннего возраста и не обеспечивают долгосрочной защиты взрослых. Единственная менингококковая вакцина, которая, как было показано, способна вызывать длительную защиту при риске менингококковой инфекции у всех групп, включая детей, основана на полисахариде одной серогруппы N.meningitidis и не обеспечивает защитой от инфекции другими серогруппами. Таким образом, существует необходимость в менингококковой конъюгированной вакцине, способной предоставить широкую и длительную защиту детей и взрослых от менингококковых заболеваний при риске менингококковой инфекции. Поливалентные менингококковые полисахариды согласно изобретению решают эту проблему путем предоставления лекарственных форм вакцин, в которых иммуногенные полисахариды главных потагенных серогрупп N.meningitidis преобразованы в Т-зависимые антигены посредством конъюгации с белками-носителями. Сущность изобретения Настоящее изобретение предоставляет иммунологические препараты для терапии, основанные на конъюгатах белка с полисахаридом менингококка патогенной Neisseria meningitidis. Настоящее изобретение предоставляет иммунологические препараты, состоящие из двух или более конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов содержит капсульные полисахаридыNeisseria meningitidis, конъюгированные с белком-носителем. Настоящее изобретение предоставляет иммунологические препараты, состоящие из двух или более отдельных конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов содержит капсульные полисахариды различных серогрупп Neisseria meningitidis, конъюгированных с белком-носителем. Настоящее изобретение предоставляет менингококковые вакцины, основанные на конъюгатах белка с полисахаридом патогенной Neisseria meningitidis. Настоящее изобретение предоставляет поливалентные менингококковые вакцины, состоящие из иммунологически эффективного количества от двух до четырех отдельных конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов содержит различные капсульные полисахариды, конъюгированные с белком-носителем, и каждый капсульный полисахарид отобран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов серогрупп А, С, W-135 и Y. Настоящее изобретение также предоставляет способ производства поливалентного менингококкового полисахаридно-белкового препарата, состоящий из очистки двух или более капсульных полисахаридов патогенной Neisseria meningitidis; конъюгирования очищенного полисахарида с одним или более белками-носителями и комбинирования конъюгатов для приготовления поливалентного менингококкового полисахаридно-белкового препарата. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ включения иммунного ответа на капсульный полисахарид N.meningitidis, заключающийся во введении иммунологически эффективного количества иммунологического препарата согласно изобретению человеку или животному. Настоящее изобретение предоставляет поливалентную менингококковую вакцину, состоящую из иммунологически эффективного количества от двух до четырех отдельных конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов содержит различные капсульные полисахариды, конъюгированные с белком-носителем, и каждый капсульный полисахарид отобран из группы, состоящей из капсульных полисахаридов серогрупп А, С, W-135 и Y. Настоящее изобретение предоставляет способ защиты человека или животного, восприимчивого к инфекции N.meningitidis, заключающийся во введении иммунологически эффективной дозы вакцины согласно изобретению человеку или животному. Все цитируемые патенты, патентные заявки и другие публикации включены здесь полностью в виде ссылки. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение включает в себя иммунологические препараты двух или более отдельных конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов состоит из капсульного полисахарида, конъюгированного с белком-носителем. Таким образом, настоящее изобретение включает в себя препараты, которые содержат два или более различных капсульных полисахаридов, конъюгированных с одним или более белком-носителем (носителями). Капсульные полисахариды могут быть приготовлены стандартными способами, известными специалистам в данной области техники (см. список литературы). В настоящем изобретении представлены капсульные полисахариды, приготовленные из N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y. В предпочтительном варианте осуществления изобретения такие конъюгаты менингококковых серогрупп изготавливаются в отдельных технологических процессах и оформляются в виде одной дозы вакцины. Например, капсульные полисахариды N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y очищаются отдельно. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения очищенные полисахариды деполимеризуются и активируются до конъюгации с белком-носителем. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения капсульные полисахариды N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 иY частично деполимеризуются в мягких условиях окисления. После деполимеризации или частичной деполимеризации полисахаридов может следовать этап активации. Под "активацией" подразумевается химическая обработка полисахарида для обеспечения химических групп, способных к реакции с белком-носителем. Предпочтительный способ активации включает в себя обработку дигидразидом адипиновой кислоты в физиологическом растворе с рН 5,00,1 в течение приблизительно 2 ч при температуре от 15 до 30C. Один из методов активации описан в патентной заявке США 5965714. После активации капсульные полисахариды могут затем быть конъюгированы с одним или более белками-носителями. В предпочтительном варианте осуществления согласно изобретению каждый капсульный полисахарид конъюгируется отдельно с одним типом белка-носителя. В предпочтительном варианте осуществления изобретения капсульные полисахариды N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y,каждый отдельно, конъюгируются с одним и тем же типом белка-носителя. Белки-носители могут включать в себя инактивированные бактериальные токсины, такие как дифтерийный анатоксин, CRM197, анатоксин столбняка, анатоксин коклюша, E.coli LT, E.coli ST и экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa. Также могут применяться белки внешней мембраны бактерий, такие как внешний мембранный комплекс С (OMPC), порины, трансферринсвязывающие белки, пневмолизин, поверхностный белок А пневмококка (PspA) или белок поверхностной адгезии пневмококка (PsaA). B качестве белков-носителей могут применяться другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или очищенное белковое производное туберкулина(PPD). Белки-носители предпочтительно являются белками, которые нетоксичны и нереактогенны и доступны в достаточном количестве и достаточной чистоты. Белки-носители должны поддаваться стандартным способам сшивки. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения в качестве белка-носителя применяется дифтерийный токсин, очищенный из культур Corynebacteria diphtheriae и химически детоксифицированный с применением формальдегида. После сшивки капсульного полисахарида с белком-носителем конъюгаты полисахарида с белком могут быть очищены (обогащены в отношении количества конъюгата полисахарида с белком) различными способами. Одной из целей этапа очистки является удаление несвязанного полисахарида из конъюгата полисахарида с белком. Один из методов очистки, включающий в себя ультрафильтрацию в присутствии сульфата аммония, описан в патентной заявке США 6146902. В качестве альтернативы, конъюгаты могут быть очищены от непрореагировавших белка и полисахарида любым из стандартных способов, включая, среди прочих, эксклюзионную хроматографию, центрифугирование в градиенте плотности, хроматографию гидрофобного взаимодействия или фракционирование в сульфате аммония. См.,например, P.W. Anderson, et. al. (1986). J. Immunol. 137:1181-1186. См. также H.J. Jennings and C.Lugowski (1981) J. Immunol. 127:1011-1018. После конъюгации полисахарида и белка-носителя иммунологические препараты согласно изобретению готовятся путем объединения различных конъюгатов полисахарида с белком. Иммунологические препараты согласно изобретению содержат два или более различных капсульных полисахаридов, конъюгированных с одним или более белком-носителем (носителями). Предпочтительный вариант осуществления согласно изобретению связан с бивалентным иммунологическим препаратом, состоящим из капсульных полисахаридов N.meningitidis серогруппы А или С, по отдельности конъюгированных с анатоксином дифтерии. Более предпочтительно, настоящее изобретение является тетравалентным иммунологическим препаратом, состоящим из капсульных полисахаридов N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y,по отдельности конъюгированных с анатоксином дифтерии. Способы приготовления и применения белков-носителей и различные возможные способы конъюгации хорошо известны специалистам в данной области техники. Конъюгаты согласно изобретению могут быть приготовлены специалистами в данной области техники с использованием указаний, содержащихся в настоящем изобретении, также как информации, легко доступной в литературе общего назначения. Указания также могут быть получены из любой или всех следующих патентных заявок США, описания которых включены в данное описание полностью в виде ссылки: США 4356170; США 4619828; США 5153312; США 5422427 и США 5445817. Иммунологические препараты согласно изобретению получают путем отдельного приготовления конъюгатов белка с полисахаридом для разных серогрупп менингококка и последующего объединения конъюгатов. Иммунологические препараты согласно изобретению могут применяться в качестве вакцин. Лекарственные формы вакцин согласно изобретению могут быть исполнены с применением стандартных способов данной области техники. Препараты вакцин согласно изобретению могут также содержать один или более адъювантов. Адъюванты включают в качестве примера, но не ограничения алюминиевые адъюванты, адъювант Фройнда, BAY, DC-chol, рсрр, монофосфорил липид A, CpG, QS-21, токсин холеры и формилметиониловый белок. См., например, Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995(M.F. Powell and M.J. Newman, edc., Plenum Press, NY). Адъюванты предпочтительно являются алюминиевыми адъювантами, такими как гидроксид алюминия или фосфат алюминия. Как показано ниже, вакцины и иммунологические препараты согласно настоящему изобретению вызывают Т-зависимый иммунный ответ на разных животных моделях, тогда как полисахаридная вакци-3 006947 на вызывает Т-независимый иммунный ответ. Таким образом, препараты согласно изобретению являются также инструментами исследования, пригодными для изучения биологических путей и процессов,вовлеченных в Т-независимые иммунные ответы на антигены N.meningitidis. Количество вакцины согласно изобретению для применения у человека или животного и режим применения могут быть определены в соответствии со стандартными способами, хорошо известными специалистам в фармацевтической и ветеринарной области, с учетом таких факторов как конкретный антиген, адъювант (если присутствует), возраст, пол, вес, вид и состояние конкретного животного или пациента и способ применения. В настоящем изобретении для обеспечения эффективных доз для вакцинации от N.meningitidis количество полисахарида и белка-носителя может быть заключено примерно в пределах от 0,02 до примерно 5 мкг на кг веса. В предпочтительных препарате и способе согласно изобретению дозы заключены примерно в пределах от 0,1 до 3 мкг на кг веса. Например, для эффективной дозировки потребуется тем меньше антител, чем короче постинфекционный период, т.к. у бактерий будет меньше времени для пролиферации. Таким же образом эффективная дозировка будет зависеть от бактериальной нагрузки в момент постановки диагноза. Могут быть рассмотрены для терапевтического применения множественные инъекции, применяемые с интервалом несколько дней. Поливалентные конъюгаты согласно изобретению могут применяться в виде одной дозы или в виде серий (т.е. с бустерной дозой или бустерными дозами). Например, дети могут получать одну дозу в раннем детстве, затем вводится бустерная доза в возрасте до десяти лет, как в настоящее время рекомендуется для других вакцин для предупреждения детских заболеваний. Бустерная доза генерирует антитела из примированных В-клеток, т.е. анамнестический ответ. То есть поливалентная конъюгированная вакцина вызывает сильный первичный (т.е. следующий за единичным применением вакцины) функциональный антительный ответ в группе детей раннего возраста по сравнению с лицензионной полисахаридной вакциной и способна вызывать анамнестический ответ (т.е. следующий после применения бустерной дозы), тем самым демонстрируя, что защитный иммунный ответ, вызываемый поливалентной конъюгированной вакциной согласно изобретению, является длительным. Препараты согласно изобретению могут включать в себя жидкие формы для применения через естественные анатомические отверстия, т.е. оральное, назальное, вагинальное, пероральное, интрагастральное, мукозное (т.е. через лингвальную, альвеолярную, десенную, обонятельную или респираторную слизистые оболочки) применения и т.д., лекарственные формы, такие как суспензии, сиропы или эликсиры; и формы для парентерального, подкожного, интрадермального, внутримышечного, внутрибрюшинного или внутривенного применения (т.е. применение путем инъекции), такие как стерильные суспензии и эмульсии. Предпочтительным является внутривенное и парентеральное применение Такие препараты могут быть смешаны с подходящим носителем, разжижителем или наполнителем, такими как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза или им подобное. Препараты также могут быть лиофилизированными. В зависимости от желаемого способа применения и приготовления, препараты могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН забуферивающие агенты, желатинирующие или увеличивающие вязкость добавки, консерванты, вкусовые агенты,красители и т.п. Для разработки подходящих способов изготовления без излишних экспериментов могут быть использованы стандартные руководства, например, REMINGSTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 17 изд., 1985, включенное здесь в виде ссылки. Препараты согласно изобретению для удобства представлены в виде жидких форм, например изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий или вязких смесей, которые могут быть забуферены до выбранного уровня рН. Если предпочтительна абсорбция в желудочном тракте, препараты согласно изобретению могут быть "твердыми": в виде пилюль, таблеток, капсул, каплет и т.п., включая "твердые" формы с задержанным высвобождением активного ингредиента или имеющие жидкий наполнитель, т.е. жидкость, покрытую желатином, желатин растворяется в желудке для доставки препарата в кишечник. Если желательно назальное применение или применение через дыхательные пути, препараты могут быть в форме спрей-дозатора и распределяться с его помощью, в виде помпового дозатора или аэрозольного дозатора. Аэрозоли обычно находятся под давлением, создаваемым углеводородом. Помповые дозаторы предпочтительно могут выдавать отмеренные дозы или дозы, имеющие определенный размер частиц. Жидкие формы обычно готовить легче, чем гели, другие вязкие препараты и твердые препараты. К тому же жидкие препараты отчасти являются более удобными для применения, особенно в виде инъекции или орально, для животных, детей, особенно маленьких детей, и других, кто может иметь сложности с глотанием пилюль, таблеток, капсул и т.п., или в случаях применения в виде мультидоз. С другой стороны, вязкие препараты могут быть в виде лекарственных форм с соответствующим уровнем вязкости для обеспечения более длительного контакта со слизистой оболочкой, такой как внутренняя оболочка желудка или слизистая оболочка носа. Очевидно, выбор подходящего носителя и других добавок будет зависеть исключительно от способа применения и природы конкретной формы дозировки, например, для жидкой формы дозировки (т.е. если лекарственная форма препарата должна быть раствором, суспензией, гелем или другой жидкой формой), или твердой формы дозировки (т.е. если лекарственная форма препарата должна быть пилюля-4 006947 ми, таблетками, капсулами, каплетами, формой с задержанным высвобождением активного ингредиента или формой с жидким наполнителем). Растворы, суспензии и гели обычно содержат большей частью воду (предпочтительно очищенную воду) в дополнение к активным ингредиентам. Может присутствовать незначительное количество других ингредиентов, таких как регуляторы рН (например, такое основание, как NaOH), эмульгаторы или диспергирующие агенты, агенты буферизации, консерванты, увлажняющие агенты, желатирующие агенты,(например, метилцеллюлоза), красители и/или вкусовые добавки. Препараты могут быть изотоническими, т.е. они могут иметь такое же осмотическое давление, как и кровь или слезная жидкость. Желательная изотоничность препаратов согласно изобретению может быть достигнута применением виннокислого натрия, пропиленгликоля или другого неорганического или органического раствора. Хлорид натрия является особенно предпочтительным для буферов, содержащих ионы натрия. Вязкость препаратов может поддерживатся на выбранном уровне применением фармацевтически допустимого сгущающего агента. Метилцеллюлоза является предпочтительной, т.к. она легко доступна,экономична и проста в работе. Другие подходящие сгущающие агенты включают в себя, например, ксантановую смолу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, карбомер и т.п. Предпочтительная концентрация загустителя будет зависеть от выбранного агента. Важным моментом является применение такого количества, при котором будет достигнута выбранная вязкость. Вязкие препараты обычно готовятся из растворов при помощи добавления таких сгущающих агентов. Для увеличения срока хранения препаратов может быть использован фармацевтически приемлемый консервант. Может быть подходящим бензиловый спирт, хотя также могут применяться различные консерванты, включая, например, парабены, тиомерсал, хлорбутанол, бензалкония хлорид. Подходящая концентрация консерванта заключена в пределах от 0,02 до 2%, в зависимости от общего веса, хотя могут быть и существенные отличия, в зависимости от выбранного агента. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что компоненты препаратов должны быть химически инертными по отношению к конъюгатам полисахарида N.meningitidis с белкомносителем. Данное изобретение дополнительно описывается следующими иллюстративными, не ограничивающими примерами, в которых изложено в деталях несколько предпочтительных вариантов осуществления концепции данного изобретения. Другие примеры данного изобретения должны быть очевидными для специалистов в данной области техники в рамках концепции данного изобретения. Примеры Пример 1. Изготовление порошков очищенных капсульных полисахаридов Neisseria meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y. Изготовление неочищенной пасты. Замороженные во влажном состоянии посевные культуры Neisseria meningitidis серогрупп А, С, W135 и Y по отдельности размораживали и переносили в жидкую питательную среду Watson Scherp и высевали в бутыли Blake, содержащие в качестве субстрата агар Mueller Hinton. Бутыли Blake инкубировали при 35-37 С в атмосфере СО 2 в течение 15-19 ч. После периода инкубации культуру извлекали из бутылей Blake и добавляли в 4-л флаконы, содержащие питательную среду Watson Scherp. Флаконы инкубировали при 35-37 С в течение 3-7 ч на платформенном шейкере. Содержимое 4-л флаконов переносили в ферментер, содержащий питательную среду Watson Scherp. Ферментер инкубировали при 35-37 С в течение 7-12 ч с дополнительным питанием и антипенными добавками, контролируя содержание растворенного кислорода и рН. После периода инкубации содержимое ферментера переносили в 500 л резервуар, добавляли цетавлон и материал перемешивали в течение 1 ч. Культуру, обработанную цетавлоном,центрифугировали приблизительно при 15000 до 17000 хg и скорости потока приблизительно от 30 до 70 л/ч. Производили вторичное осаждение неочищенного полисахарида из супернатанта цетавлоном. К супернатанту добавляли цетавлон и материал перемешивали в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Материал хранился при температуре 1-5 С в течение 8-12 ч. Осажденный полисахарид собирали путем центрифугирования при приблизительно 45000-50000 xg и скорости потока от 300 до 400 мл/мин. Собранная масса хранилась при -60C или ниже до дальнейшей обработки. Приготовление порошка очищенного полисахарида. Инактивированную массу размораживали и переносили в смеситель. Массу перемешивали с 0,9 M хлоридом кальция до получения гомогенной суспензии. Суспензию центрифугировали приблизительно при 10000 xg в течение 15 мин. Супернатант декантировали через безворсовую салфетку в сосуд в качестве первичного экстракта. В пасту добавляли второй объем 0,9 M хлорида кальция и перемешивали до получения гомогенной суспензии. Суспензию центрифугировали, как описано выше, супернатант объединяли с супернатантом первой фракции. Всего было выполнено четыре экстракции, а супернатанты объединены. Объединенные экстракты концентрировали при помощи ультрафильтрации с применением 10-30 кДа MWCO Spiral Would модулей ультрафильтрации. В концентрат добавляли хлорид магния, а рН доводили до 7,2-7,5, используя гидроксид натрия. В концентрат добавляли ДНКазу и РНКазу и инкубировали при 25-28 С при перемешивании в течение 4 ч. Добавляли этанол до концентрации 30-50%. Осажденные нуклеиновые кислоты и белки удаляли путем-5 006947 центрифугирования при 10000 xg в течение 2 ч. Супернатант отделяли и осаждали полисахарид, добавляя этанол до 80% и отстаивая в течение ночи при температуре 1-5 С. Спирт откачивали сифоном и осажденный полисахарид центрифугировали в течение 5 мин при 10000 xg. Осажденный полисахарид промывали спиртом. Полисахарид промывали ацетоном и центрифугировали в течение 15-20 мин при 10000xg. Полисахарид сушили под вакуумом. Исходный порошок полисахарида разводили в растворе ацетата натрия. Добавляли хлорид магния и рН доводили до 7,2-7,5 раствором гидроксида натрия. В раствор добавляли ДНКазу и РНКазу и инкубировали при температуре 25-28 С при перемешивании в течение 4 ч для удаления остаточных нуклеиновых кислот. После инкубации с этими ферментами добавляли равный объем раствора ацетат натрия-фенол в смесь полисахарид-фермент и помещали на платформенный шейкер при температуре 1-5 С приблизительно на 30 мин. Смесь центрифугировали при 10000 хg в течение 15-20 мин. Извлекали верхний водный слой, сохраняя его. Равный объем раствора ацетат натрия-фенол добавляли в жидкий слой и экстрагировали, как описано выше. Всего было выполнено четыре экстракции для удаления белка и эндотоксина из раствора полисахарида. Объединенные водные экстракты десятикратно разбавляли водой для инъекций и проводили диализ против 10 объемов воды для инъекций. Добавляли хлорид кальция к диализованному полисахариду. Добавлением этанола до 80% полисахарид осаждали в течение ночи при температуре 1-5 С. Супернатант спирта удаляли и полисахарид собирали путем центрифугирования при 10000 хg в течение 15 мин. Очищенный полисахарид дважды промывали этанолом и один раз ацетоном. Промытый порошок сушили под вакуумом в сушильном шкафу. Высушенный порошок хранили при 30C или ниже до проведения конъюгации. Пример 2. Деполимеризация порошка очищенного капсульного полисахарида Neisseria meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y. Материалы, применяемые в приготовлении, включают в себя порошки очищенного полисахаридаNeisseria meningitidis серогрупп А, С, W-135 и У (приготовленных согласно примеру 1), стерильный 50 мМ буфер ацетата натрия, рН 6,0, стерильную 1 н. соляную кислоту, стерильный 1 н. гидроксид натрия,30% перекись водорода и стерильный физиологический раствор (0,85% хлорида натрия). Полисахарид каждой серогруппы деполимеризовали в отдельной реакции. Резервуар из нержавеющей стали наполняли 60 г порошка очищенного полисахарида. К полисахариду добавляли 50 мМ стерильный буфер ацетата натрия, рН 6,0, до получения концентрации 2,5 г полисахарида на литр. Раствор полисахарида перемешивали при температуре 1-5 С в течение 12-24 ч для улучшения растворения. Реакционный резервуар соединяли с теплообменником. Дополнительно добавляли 50 мМ буфер ацетата натрия, рН 6,0, для разбавления полисахарида до реакционной концентрации 1,25 г на литр. Раствор полисахарида нагревали до 55 С 0,1. В реакционную смесь добавляли аликвоту 30% перекиси водорода для получения реакционной концентрации перекиси водорода 1%. Течение реакции контролировали по изменению размера молекулы полисахарида с течением времени. Каждые 15-20 мин аликвоты извлекали из реакционной смеси и вводили в колонку HPSEC для измерения размера молекулы полисахарида. Когда размер молекулы полисахарида достигал требуемого молекулярного размера, нагреватель выключали и раствор полисахарида быстро остужали до температуры 5 С при помощи циркуляции через баню с ледяной водой. Раствор деполимеризованного полисахарида концентрировали до 15 г на литр, подсоединяя реакционный резервуар к устройству ультрафильтрации, оснащенному картриджами с регенерированной целлюлозой. Раствор концентрированного деполимеризованного полисахарида диализовали против 10 объемов стерильного физиологического раствора(0,85% хлорида натрия). Деполимеризованный полисахарид хранили при температуре 1-5 С до следующего этапа технологического процесса. Размер молекулы деполимеризованного полисахарида определяли при помощи пропускания через хроматографическую колонку гель-фильтрации, продаваемую под торговой маркой Ultahydrogel250,которая калибровалась с использованием декстрановых стандартов молекулярного размера и статического рассеяния лазерного света под несколькими углами. Количество полисахарида определяли по содержанию фосфора для серогруппы А, используя способ Bartlet, G.R.J. (1959) Journal of Biological Chemistry,234, pp. 466-468, и по содержанию сиаловой кислоты для серогрупп С, W-135 и Y, используя способSvennerholm, L. (1955) Biochimica Biophysica Acta 24, pp.604-611. Содержание о-ацетила определяли способом Hesterin, S. (1949) Journal of Biological Chemistry 180, p.249. Остаточную активность определяли способом Park, J.T. and Johnson, M.J. (1949 Journal of Biological Chemistry 181, pp. 149-151). Структурную целостность деполимеризованного полисахарида определяли при помощи 1H- и 13 С-ЯМР белка. Чистоту деполимеризованного полисахарида определяли, измеряя содержание LAL (эндотоксина) и содержание остаточной перекиси водорода. Пример 3. Получение дериватизированного деполимеризованного полисахарида Neisseria meningitidis серогрупп A, C, W-135 и Y. Материалы, использованные при приготовлении, включают в себя капсульный полисахарид серогрупп А, С, W-135 и Y Neisseria meningitidis, деполимеризованный перекисью водорода (приготовленный согласно примеру 2), дигидразид адипиновой кислоты, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид(EDAC) только для серогруппы А, цианборгидрид натрия, стерильную 1 н. соляную кислоту, стерильный-6 006947 1 н. гидроксид натрия, стерильный 1 M хлорид натрия и стерильный физиологический раствор (0,85% хлорид натрия). Дериватизированный полисахарид каждой серогруппы получали в отдельной реакции. Резервуар из нержавеющей стали заполняли очищенным деполимеризованным полисахаридом и разбавляли стерильным 85% физиологическим раствором до достижения реакционной концентрации 1 г на литр. Только для серогруппы А добавляли EDAC как концентрированную аликвоту, растворенную в стерильном 0,85% физиологическом растворе, до достижения реакционной концентрации 1 г на литр. Доводили рН до 5,00,1 и поддерживали рН на этом уровне в течение 2 ч, используя стерильную 1 н. соляную кислоту и стерильный 1 н. гидроксид натрия, при комнатной температуре (от 15 до 30C). Через 2 ч в реакционную смесь добавляли концентрированную аликвоту цианборгидрида натрия, растворенную в 0,85% физиологическом растворе, до достижения реакционной концентрации 2 г на литр. Реакция проходила при перемешивании при комнатной температуре (от 15 до 30C) в течение 444 ч, рН поддерживался на уровне 5,50,5. По прошествии указанного реакционного периода рН доводили до 6,00,1 и дериватизированный полисахарид концентрировали до 12 г полисахарида на литр, подсоединив реакционный резервуар к устройству ультрафильтрации, оснащенному 3000 MWCO картриджами с регенерированной целлюлозой. Концентрированный дериватизированный полисахарид диализовали против 30 объемов 1 M хлорида натрия, затем 10 объемов 0,15 M хлорида натрия. Резервуар отсоединяли от устройства ультрафильтрации и хранили при температуре 1-5 С в течение 7 дней. Резервуар снова присоединяли к устройству ультрафильтрации, оснащенному 3000 MWCO картриджами с регенерированной целлюлозой, и диализовали против 30 объемов 1 M хлорида натрия, затем 10 объемов 0,15 M хлорида натрия. Размер молекулы полученного дериватизированого полисахарида, количество полисахарида и содержание о-ацетила измеряли теми же способами, которые применялись при деполимеризации полисахарида. Содержание гидразида измеряли при помощи метода с использованием 2,4,6 тринитробензенсульфоновой кислоты по Snyder, S.L. and Sobocinski, P.Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, pp. 282-288. Структурную целостность полученного дериватизированого полисахарида определяли при помощи 1H- и 13C-ЯMP белка. Чистоту полученного дериватизированого полисахарида определяли путем измерения уровня несвязанного гидразида, содержания LAL (эндотоксина) и содержания остаточного цианборгидрида. Пример 4. Приготовление белка-носителя. Приготовление неочищенного белка анатоксина дифтерии. Лиофилизированные посевные культуры восстанавливали и инкубировали в течение 16-18 ч. Аликвоту культуры помещали в 0,5-литровый флакон, содержащий питательную среду для роста и флакон с культурой инкубировали при температуре 34,5-36,5C на ротационном шейкере в течение 7-9 ч. Аликвоту из флакона с культурой переносили в 4-литровый флакон, содержащий питательную среду для роста,и флакон с культурой инкубировали при температуре 34,5-36,5C на ротационном шейкере в течение 1422 ч. Культуры из 4-литрового флакона использовали для инокуляции ферментера, содержащего среду для роста. Ферментер инкубировали при температуре 34,5-36,5 С в течение 70-144 ч. Содержимое ферментера отфильтровывали через объемный фильтр в сосуд-коллектор. В урожай добавляли аликвоту раствора формальдегида, 37%, до достижения концентрации 0,2%. Доводили рН до 7,4-7,6. Урожай отфильтровывали через картридж 0,2-микронного фильтра в стерильные 20-литровые бутыли. Бутыли инкубировали при температуре 34,5-36,5 С в течение 7 дней. В каждую 20-литровую бутыль добавляли аликвоту раствора формальдегида, 37%, до достижения концентрации 0,4%. Доводили рН смесей до уровня 7,4-7,6. Бутыли инкубировали на шейкере при температуре 34,5-36,5 С в течение 7 дней. В каждую 20-литровую бутыль добавляли аликвоту раствора формальдегида, 37%, до достижения концентрации 0,5%. Доводили рН смеси до 7,4-7,6. Бутыли инкубировали при температуре 34,5-36,5 С в течение 8 недель. Неочищенный анатоксин тестировали на уровень детоксикации. Бутыли хранили при температуре 1-5 С в период тестирования. Очистка неочищенного белка анатоксина дифтерии. Неочищенный анатоксин нагревали до комнатной температуры и содержимое 20-литровых бутылей объединяли в резервуаре для очистки. Доводили рН анатоксина до 7,2-7,4 и добавляли уголь в неочищенный анатоксин и перемешивали в течение 2 ч. Смесь угля и анатоксина отстаивали в течение часа и затем отфильтровывали через картридж с объемным фильтром во второй резервуар очистки. В фильтрат добавляли твердый сульфат аммония до достижения 70% насыщения. Доводили рН до 6,8-7,2 и раствор отстаивали в течение 16 ч. Осажденные белки собирали путем фильтрации и промывали раствором сульфата аммония 70% насыщения, рН 7,0. Осадок растворяли в стерильной дистиллированной воде и раствор белка отфильтровали в сосуд-коллектор из нержавеющей стали. Доводили рН до 6,8-7,2 и добавляли сульфат аммония до 40% насыщения. Доводили рН раствора до 7,0-7,2 и раствор отстаивали в течение 16 ч. Осадок отделяли путем фильтрации и удаляли. В фильтрат добавляли сульфат аммония до 60% насыщения и рН доводили до 7,0-7,2. Смесь отстаивали в течение 16 ч и осажденные белки собирали путем фильтрации. Осадок растворяли в стерильной дистиллированной воде, отфильтровывали для удаления нерастворенных белков и-7 006947 диализовали против 0,85% физиологического раствора. Концентрирование и стерильное фильтрование очищенного белка анатоксина дифтерии. Раствор белка концентрировали до 15 г на литр и диализовали против 10 объемов 0,85% физиологического раствора, используя 10000 MWCO картридж с фильтром из регенерированной целлюлозы. Концентрированный раствор белка стерилизовали путем фильтрации через 0,2-микронную мембрану. Раствор белка хранили при температуре 1-5 С до проведения конъюгации. Концентрацию белка определяли методом Lowry, O.H. et. al. (1951) Journal of Biological Chemistry 193, p. 265-275. Чистоту белка определяли на стерильность, содержание LAL (эндотоксин) и содержание остаточного формальдегида. Пример 5. Приготовление моновалентных конъюгатов полисахарида с белком анатоксина дифтерииNeisseria meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y. Материалы, использованные при приготовлении, включают в себя дериватизированный адипиновой кислотой полисахарид Neisseria meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y адипиновой кислоты (приготовленную согласно примеру 3), стерильный белок анатоксина дифтерии (приготовленный согласно примеру 4), EDAC, сульфат аммония, стерильную 1 н. соляную кислоту и стерильный физиологический раствор (0,85%). Конъюгат полисахарида каждой серогруппы получали в отдельной реакции. Все четыре конъюгата готовили следующим способом. Резервуар из нержавеющей стали заполняли очищенным дериватизированным адипиновой кислотой полисахаридом при реакционной концентрации от 700 до 1000 мкмолей рективного гидразида на литр и очищенным белком анатоксина дифтерии с реакционной концентрацией от 3,8 до 4,0 г белка на литр. Использовали физиологический раствор 0,85% для разбавления исходных материалов до нужной реакционной концентрации, и рН доводили до 5,00,1. К смеси белка с полисахаридом добавляли аликвоту EDAC до достижения реакционной концентрации от 2,28 до 2,4 г на литр. рН реакции поддерживали на уровне 5,00,1 в течение 2 ч при температуре 15-30C. Спустя 2 ч рН доводили до 7,00,1, используя стерильный 1 н. гидроксид натрия, и поддерживали реакционную смесь при температуре 1-5 С в течение 16-20 ч. Реакционную смесь нагревали до температуры 15-30C и реакционный резервуар присоединяли к устройству ультрафильтрации, оснащенному картриджами с регенерированной целлюлозой. Добавляли твердый сульфат аммония до 60% насыщения (для серогрупп A, W-135 и Y) и до 50% насыщения (для серогруппы С). Реакционную смесь конъюгата диализовали против 20 объемов раствора сульфата аммония 60% насыщения (для серогрупп A, W-135 и Y) и раствора сульфата аммония 60% насыщения (для серогруппы С), затем 20 объемов физиологического раствора, 0,85%. Диализованный конъюгат был отфильтрован первый раз через фильтрационную капсулу, содержащую 1,2-микронный и 0,45-микронный фильтры, затем через вторую фильтрационную капсулу, содержащую 0,22-микронный фильтр. Количество полисахарида и содержание о-ацетила измеряли теми же способами, которые применяли при деполимеризации и получении производных полисахарида. Количество белка определяли способом Lowry. Размер молекулы конъюгата определяли, пропуская через хроматографическую колонку гель-фильтрации, продаваемую под торговой маркой TSK6000PW, в которой использовались ДНК в качестве маркера мертвого объема, АТФ в качестве маркера полного объема и бычий тиреоглобулин в качестве референсного маркера. Дополнительно, размер молекулы конъюгата, элюированного из колонки TSK6000PW, измеряли при помощи статического рассеяния лазерного света под несколькими углами. Антигенные свойства конъюгата измеряли по связыванию с антителами к полисахаридам данной серогруппы, используя метод ELISA двойной сэндвич. Чистоту конъюгатов определяли, измеряя количество несвязанного (неконъюгированного) полисахарида путем элюирования через хроматографическую колонку с гидрофобным носителем, измеряя количество неконъюгированных белков при помощи капиллярного электрофореза, проверкой на стерильность, измеряя содержание LAL (эндотоксин), содержание остаточного EDAC и содержание остаточных ионов аммония. Пример 6. Формирование поливалентной менингококковой вакцины из конъюгата дифтерийного анатоксина с полисахаридом менингококка А, С, W-135 и Y. Материалы, использованные в приготовлении, включают в себя конъюгаты анатоксина дифтерии с полисахаридом серогрупп А, С, W-135 и Y (приготовленные согласно примеру 5), физиологический раствор (0,85% хлорид натрия, забуференный стерильным 100 мМ фосфатом натрия). В физиологический раствор (0,85%), находящийся в резервуаре-коллекторе из нержавеющей стали,добавляли аликвоту стерильного физиологического раствора, забуференного 100-500 мМ фосфатом натрия, до получения конечной концентрации фосфата натрия в вакцине 10 мМ. В резервуар-коллектор,содержащий 10 мМ стерильный физиологический раствор фосфата натрия, добавляли аликвоту каждого из двух-четырех стерильных моновалентных конъюгатов анатоксина дифтерии с полисахаридом менингококка до получения конечной концентрации 8 мкг полисахарида каждой серогруппы на миллилитр буфера. Сформированный тетравалентный конъюгат перемешивали и отфильтровывали через 0,2 микронный фильтр во второй резервуар-коллектор. Количество содержания полисахарида каждой серогруппы в поливалентной композиции определя-8 006947 ли при помощи анализа компонентного состава сахаридов, используя ионообменную хроматографию с высоким значением рН с импульсным амперометрическим детектором. Количество белка измеряли способом Lowry. pH вакцины измеряли, используя комбинацию электродов, соединенных с рН-метром. Антигенные характеристики поливалентной конъюгированной вакцины измеряли по связыванию с антителами к полисахаридам данной серогруппы, используя способ ELISA двойной сэндвич. Иммуногенность поливалентной конъюгированной вакцины измеряли по способности каждого конъюгата, находящегося в вакцине, вызывать как основной, так и бустерный анти-полисахаридный IgG-иммунный ответ на животных моделях. Чистоту поливалентной конъюгированной вакцины определяли, измеряя количество несвязанного (неконъюгированного) полисахарида, используя ионообменную хроматографию с высоким значением рН с импульсным амперометрическим детектором, содержание LAL (эндотоксин), содержание пирогенов; проверкой на стерильность, проверкой на общую безопасность. Пример 7. Приготовление поливалентного конъюгата белка анатоксина дифтерии с полисахаридом менингококка, адъювированного гидроксидом алюминия. Приготовление конъюгата абсорбированного гидроксидом алюминия. Материалы, использованные в приготовлении, включают в себя конъюгаты анатоксина дифтерии с полисахаридом серогрупп А, С, W135 и Y, приготовление описано в примере 5, стерильный физиологический раствор (0,85% хлорид натрия) и стерильный гидроксид алюминия в физиологическом растворе (0,85% хлорид натрия). В резервуар-коллектор, содержащий биологический раствор, добавляили аликвоту каждого из моновалентных конъюгатов анатоксина дифтерии со стерильным полисахаридом менингококка до получения конечной концентрации 8 мкг полисахарида каждой серогруппы на миллилитр буфера. В поливалентную конъюгированную вакцину добавляли аликвоту стерильного гидроксида алюминия в физиологическом растворе (0,85% хлорида натрия) до достижения конечной концентрации 0,44 мг ионов алюминия на миллилитр вакцины. Пример 8. Приготовление конъюгата, адъювированного фосфатом алюминия. Материалы, использованные при приготовлении, включают в себя конъюгаты анатоксина дифтерии с полисахаридом серогрупп А, С, W-135 и Y, приготовленные, как описано в примере 5, стерильный физиологический раствор (0,85% хлорид натрия) и стерильный фосфат алюминия в физиологическом растворе (0,85% хлорид натрия). В резервуар-коллектор, содержащий биологический раствор, добавляли аликвоту каждого из конъюгатов анатоксина дифтерии со стерильным моновалентным полисахаридом менингококка до достижения конечной концентрации 8 мкг полисахарида каждой серогруппы на миллилитр буфера. В вакцину поливалентного конъюгата добавляли аликвоту стерильного фосфата алюминия в физиологическом растворе (0,85% хлорида натрия) до достижения конечной концентрации 0,44 мг ионов алюминия на миллилитр вакцины. Пример 9. Иммуногенность тетравалентной конъюгированной вакцины. Тетравалентную конъюгированную вакцину исследовали на ее способность вызывать иммунный ответ у маленьких лабораторных животных перед клиническим использованием. Для изучения иммуногенности конъюгированной вакцины относительно полисахаридной вакцины использовались мыши,крысы и кролики. Эти животные модели полезны, т.к. они дают возможность отличить конъюгированную вакцину от соответствующей полисахаридной по характеру иммунного ответа. Конъюгированная вакцина вызывает T-зависимый иммунный ответ в этих моделях, тогда как полисахаридная вакцина вызывает Т-независимый иммунный ответ. При изучении иммуногенности на мышах конъюгат разбавляли физиологическим раствором (0,85% хлорида натрия) для применения от одной четвертой до одной шестнадцатой дозы для человека. Мышам вводили одну или две дозы вакцины, либо конъюгированной, либо полисахаридной, и через две недели после вакцинации брали образцы крови. Одна группа мышей служила в качестве неиммунизированной контрольной группы. Антитела к каждой серогруппе полисахаридов измеряли в тесте ELISA. Образцы сыворотки инкубировали с избытком каждого капсульного полисахарида, связанного с лункой микротитровального планшета ELISA. Для связывания полисахарида каждой серогруппы с лункой микротитровального планшета использовался метилированный альбумин сыворотки человека. После инкубации лунки микротитровального планшета промывали буфером и к комплексу антитело-полисахарид добавляли конъюгат вторичное антитело-фермент, который связывался с антителом к полисахариду менингококка. Микротитровальный планшет промывали и добавляли химический субстрат к конъюгату антитело-полисахарид менингококка-вторичное антитело-фермент. Фермент гидролизует часть химического субстрата, который в результате окрашивается. Количество окрашенной субстанции пропорционально количеству конъюгата антитело-полисахарид менингококка-вторичное антитело-фермент, связанного с лункой микротитровального планшета. Силу вакцины определяли путем сравнения с референсной антисывороткой для каждой серогруппы, которую измеряли на таком же микротитровальном планшете, методом расчета параллельных с использованием четырехпараметрической оценки. Референсная антисывортка мыши производилась на той же линии мышей, которые отдельно иммунизировались тремя дозами конъюгированной вакцины для каждой серогруппы. Референсной антисыворотке мыши присвоили титры, как обратное значение разведения, дающего оптическую плотность 1,0.-9 006947 Данные, представленные в табл. 1, являются сводкой анти-полисахаридных IgG-титров для каждой серогруппы, полученных на мышах Swiss-Webster, вакцинированных двумя дозами либо тетравалентной конъюгированной вакциной, в виде лекарственных форм как жидкой, так и с хлоридом аммония, либо соответствующей тетравалентной полисахаридной вакциной. IgG-титры измеряли в смешанной сыворотке у группы мышей численностью десять штук. Две группы по десять мышей использовали для измерения иммунного ответа на каждую лекарственную форму вакцины. Обе группы вакцинировали в первый день. На 15 день (через две недели после вакцинации) взяли образцы крови у одной группы из 10 мышей,а вторую группу из 10 мышей вакцинировали второй дозой вакцины на 15 день. Две недели спустя, на 29 день, взяли образцы крови у второй группы из 10 мышей и у неиммунизированной контрольной группы. Все антитела оттитровали в одно и то же время, у двух групп, 15-дневной и 29-дневной, образцы крови анализировали в одно и то же время вместе с неиммунизированным контролем и мышиной референсной сывороткой. Таблица 1 Титры антиполисахаридных IqG объединенной сыворотки мышей Swiss-Webster, вакцинированных либо тетравалентным конъюгатом, либо полисахаридом Тетравалентная конъюгированная вакцина, как без адъюванта, так и адъювированная гидроксидом алюминия, способна вызывать сильный антиполисахаридный IgG-иммунный ответ в данной мышиной модели. Адъювант, гидроксид алюминия, служит для улучшения как первичного, так и бустерного ответов на каждый из четырех конъюгатов серогрупп полисахарида. Тетравалентная полисахаридная вакцина вызывает незначительный иммунный ответ на серогруппы А, С, W-135 в данной мышиной модели в сравнении с неиммунизированной контрольной группой, тогда как серогруппа Y действительно вызывает значительный иммунный ответ, но не вызывает бустерного ответа. В этой модели тетравалентная полисахаридная вакцина не вызывает бустерный ответ на все четыре серогруппы полисахаридов. Данная модель дает возможность легко отличать полисахаридную вакцину от конъюгированной вакцины как по силе иммунного ответа, так и по характеру бустерного ответа для конъюгированной вакцины каждой серогруппы. Неадъювированную форму тетравалентной конъюгированной вакцины изучали в клинических условиях на безопасность и иммуногенность на молодых здоровых взрослых и здоровых детях младшего возраста. При изучении взрослых пациентов вакцинировали одной дозой вакцины в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг каждого из четырех конъюгатов, в пересчете на полисахарид. Образцы крови брали непосредственно перед вакцинацией и 28 дней спустя после вакцинации. Антитела на каждый из конъюгатов определенной серогруппы определяли в тесте ELISA, что дало количество антиполисахаридного IgG. Метод ELISA очень сходен с методом измерения, применяемым при измерении количестваIgG-антител, содержащихся в мышиной сыворотке. Вкратце, образцы сыворотки инкубировали в лунках микротитровального планшета ELISA, покрытых избытком менингококкового полисахарида, связанного с планшетом посредством метилированного альбумина сыворотки человека. Количество связанных антител определяли реакцией с моноклональными антителами мыши против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена. Последующая реак- 10006947 ция с пероксидазным субстратом давала хромогенные продукты, измеренные спектрофотометрическим способом. Получанная оптическая плотность хромофора коррелировала с количеством IgG-антител в сыворотке, связанных с менингококковым полисахаридом на микротитровальном планшете. Количество антител определяли путем сравнения с контрольной сывороткой человека (CDC1922) с известным содержанием антител, используя метод 4-параметрической логистической кривой. Дополнительно определяли способность антител вызывать лизис бактерий определенных серогрупп. Образцы сыворотки были сначала инактивированы путем нагревания до разрушения комплемента. Образцы сыворотки разводили двукратно на стерильном микротитровальном планшете с 96 лунками. Бактерии определенных серогрупп вместе с комплементом детеныша кролика добавляли в растворы сыворотки и инкубировали. После периода инкубации добавляли агаровое покрытие в смесь сыворотка/комплемент/бактерии. Агаровому покрытию давали возможность отвердеть, и затем инкубировали в течение ночи при 37 С при содержании углекислого газа 5%. На следующий день подсчитывали присутствующие в лунках колонии бактерий. Конечную точку титрования определяли как величину, обратную максимальному разведению сыворотки,дающему киллинг более 50% в сравнении со значением в контрольных лунках с комплементом. Данные в табл. 2 являются сводкой средних концентраций антиполисахаридных IgG для каждой серогруппы и средних значений титра бактерицидных антител сыворотки (БАС) в сыворотке взрослых до и после вакцинации тетравалентной конъюгированной вакциной в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг полисахарида на дозу. Иммунный ответ на все конъюгаты четырех серогрупп был удовлетворителен, что сравнимо с иммунным ответом, полученным при помощи лицензионной полисахаридной вакцины как в показателе IgG-антител, так и в показателе функционального бактерицидного антительного ответа. Вакцины были определены как безопасные для данной возрастной группы, и профиль безопасности был определен как сопоставимый с профилем лицензионной полисахаридной вакцины. Таблица 2 УКГ (усредненная по группе концентрация) анти-полисахаридного IgG и УТГ (усредненный по группе титр) бактерицидных антител сыворотки для здоровых молодых взрослых, вакцинированных тетравалентной менингококковой конъюгированной вакциной в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг на дозу полисахарида В группах раннего возраста - дети младше 2-летнего возраста - иммунный ответ на полисахаридную вакцину являлся слабым с ожидаемым временем исчезновения иммунитета один год. Детям от 12- до 15 месячного возраста вводили единичную дозу тетравалентной конъюгированной вакцины в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг каждой серогруппы полисахарида на дозу, и два месяца спустя после первой дозы им вводилась вторая доза тетравалентной конъюгированной вакцины. Образцы крови брали до первой и второй вакцинаций и месяц спустя после второй вакцинации. Антительные ответы на конъюгаты четырех серогрупп сведены в табл. 3. Для каждой серогруппы наблюдались бустерные IgGантительный и функциональный бактерицидный антительный ответы после второй дозы тетравалентного конъюгата. Уровень IgG-антител, вызванный конъюгированной вакциной сравним с таковой, вызванной лицензионным полисахаридом для данной возрастной группы; после 6 недель IgG-антительный ответ на серогруппу С полисахарида 3,6 мкг/мл (2,96-4,49). Однако уровень бактерицидных антител, вызванный конъюгированной вакциной, гораздо выше, чем обычно вызываемый лицензионной полисахаридной вакциной для этой возрастной группы - после 6 недель титры БАС 7,2 (5,0-10,4). Предполагается,что причиной такого несоответствия между IgG-антителами и бактерицидными антителами в группе раннего возраста является то, что полисахарид вызывает высокую долю антител с низкой авидностью в группе раннего возраста. Наоборот, оказывается, что конъюгат вызывает гораздо большую долю антител с высокой авидностью. Предполагается, что антитела с высокой авидностью ответственны за бактерицидную активность.- 11006947 Таблица 3 УКГ (усредненная по группе концентрация) анти-полисахаридных IgG и УТГ (усредненные по группе титры) бактерицидных антител сыворотки у здоровых детей раннего возраста (возраст 1-2 года), вакцинированных двумя дозами тетравалентной менингококковой конъюгированной вакцины, в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг на дозу полисахарида В дополнение к способности тетравалентной конъюгированной вакцины вызывать высокий функциональный антительный ответ у групп раннего возраста в сравнении с лицензионной полисахаридной вакциной, тетравалентная конъюгированная вакцина способна вызывать анамнестический ответ, показывающий, что защита, вызываемая тетравалентной конъюгированной вакциной согласно изобретению является длительной. При создании тетравалентной конъюгированной вакцины первые исследования проводили на лекарственной форме в виде бивалентного АС-конъюгата. Вакцина показала более широкую область действия, чем действующий лицензионный моновалентный C-конъюгат, но не защищает от заболевания, вызываемого серогруппами W-135 и Y. Клиническое исследование провели на новорожденных пациентах, у которых сравнивали иммунный ответ на бивалентную АС-полисахаридную вакцину с ответом на бивалентную ACконъюгированную вакцину. В этом исследовании третью группу новорожденных рассматривали в качестве контрольной группы, и они получали конъюгат Haemophilus influenzae типа b. Все три вакцинируемые группы получали одни и те же детские вакцины. Группа бивалентного АС-конъюгата получила три дозы вакцины конъюгата (4 мкг полисахарида на дозу) в возрасте 6, 10 и 14 недель. Группа бивалентного АС-полисахарида получила две дозы вакцины бивалентного АС-полисахарида (50 мкг полисахарида на дозу) в возрасте 10 и 14 недель. Группа конъюгата Haemophilus influenzae типа b получила три дозы вакцины конъюгата в возрасте 6, 10 и 14 недель. Образцы крови брали на 6-й неделе, до вакцинации, и 18-й неделе, 4 недели спустя после вакцинации. Когда младенцы достигли 11-12 месячного возраста, взяли образцы крови, а дети, которые получили либо бивалентную AC-конъюгированную вакцину, либо бивалентную АС-полисахаридную вакцину, получили бустерную дозу АС-полисахарида. Бустерная доза полисахарида вводилась для того, чтобы установить, будет ли у пациентов вызван анамнестический ответ. Результаты этого исследования как первичный иммунный ответ, так и бустерный иммунный ответ,вызванный полисахаридом, представлены в табл. 4 для IgG-антительного ответа и табл. 5 для БАСантительного ответа. IgG-антительный ответ после первичных серий был примерно одинаковым как для полисахаридной, так и для конъюгированной вакцин. Однако бактерицидный антительный ответ у пациентов, вакцинированных конъюгатом, был существенно выше, чем ответ у пациентов, вакцинированных полисахаридом. Как наблюдалось у годовалых пациентов, вакцинация новорожденных полисахаридом вызывает очень небольшое количество бактерицидных функциональных антител. Антитела, вызываемые у новорожденных полисахаридной вакциной, предположительно являются антителами с низкой авидностью, тогда как оказывается, что конъюгированная вакцина вызывает антитела с высокой авидностью,тем самым давая гораздо более высокие титры бактерицидных антител. Высокий уровень функциональных антител, вызываемый бустерной дозой полисахаридной вакцины у пациентов, которые получили конъюгированную вакцину в сериях первичной вакцинации, показал, что такие пациенты были примированы на иммунологическую память или Т-зависимый антительный ответ. У пациентов, которые получили полисахаридную вакцину в сериях первичной вакцинации, вызывался умеренный ответ на бустерную дозу полисахарида, что является признаком T-независимого ответа.- 12006947 Таблица 4 УКГ (усредненная по группе концентрация) анти-полисахаридых IqG у новорожденных на серогруппы А и С до и после как первичных серий иммунизации (в возрасте 6, 10 и 14 недель), так и бустерной вакцинации бивалентным АС-полисахаридом, введенным в возрасте 11-12 месяцев Таблица 5 УТГ (по группе усредненный титр) БАС антител у новорожденных на серогруппы А и С до и после как первичных серий иммунизации (в возрасте 6, 10 и 14 недель), так и бустерной вакцинации бивалентным АС-полисахаридом, введенном в возрасте 11-12 месяцев В дополнение к преимуществам, которые настоящее изобретение предлагает для улучшения защиты против менингококковых заболеваний в группе раннего возраста и более широкой защиты против серогрупп А, С, W-135 и Y, тетравалентные конъюгаты могут обеспечить защиту от других патогенов путем включения антительного ответа на белок-носитель. Когда тетравалентная конъюгированная вакцина, с применением конъюгата анатоксина дифтерии, была введена новорожденным, эти пациенты также получили обычную детскую иммунизацию, которая включала анатоксин дифтерии. В следствии этого, у пациентов не было видимого улучшения антительного ответа на анатоксин дифтерии. Однако наблюдался сильный бустерный ответ на анатоксин дифтерии, когда конъюгаты анатоксина дифтерии вводили пациентам, которые параллельно не получили вакцин, содержащих анатоксины дифтерии. Эти пациенты получили серию дифтерийного и столбнячного токсоидов и коклюшной вакцины (DTP) по трехразовой схеме в 2-, 3- и 4-месячном возрастах. В этом исследовании пациенты получили или единичную дозу бивалентной АС-конъюгированной вакцины, или единичную дозу бивалентной АС-полисахаридной вакцины в возрасте 2-3 лет. Образцы крови брали во время вакцинации и 30 дней спустя после вакцинации. В бивалентных AC-конъюгатах использовался анатоксин дифтерии в качестве белка-носителя. Иммунный ответ на анатоксин дифтерии для двух групп вакцин представлен в табл. 6. Как ожидалось, у этих пациентов полисахарид не стимулировал антидифтерийный иммунный ответ, однако, наблюдался сильный антидифтерийный иммунный ответ у пациентов, получивших АС-конъюгат. Следовательно, менингококковая конъюгированная вакцина может обеспечить дополнительное преимущество,стимулируя иммунный ответ на белок-носитель, таким образом обеспечивая защиту от заболеваний, вызываемых Corynebacteria diphtheriae, в случае использования анатоксина дифтерии в качестве белканосителя.- 13006947 Таблица 6 УТГ (усредненные титры по группе) антидифтерийных антител по тесту ELISA в IU/мл у здоровых детей раннего возраста, вакцинированных либо бивалентной АС-вакциной, конъюгированной с анатоксином дифтерии, в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг полисахарида на дозу, либо бивалентной АСполисахаридной вакциной в виде лекарственной формы, содержащей 50 мкг полисахарида на дозуJennings H.J. and Lugowski C. (1981) The Journal of Immunology 127, pp. 1011-1018. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммунологическая композиция, содержащая комбинацию двух, трех или четырех отдельных и раздельно приготовленных конъюгатов полисахарида с белком, причем каждый из конъюгатов содержит очищенный капсульный полисахарид, полученный из N.meningitidis серогрупп А, С, W-135 или Y,конъюгированных с белком-носителем, где по меньшей мере одна серогруппа представляет собой W-135 или Y. 2. Иммунологическая композиция по п.1, в которой по меньшей мере один из капсульных полисахаридов получен из N.meningitidis серогруппы А или С. 3. Иммунологическая композиция по п.2, в которой по меньшей мере один из капсульных полисахаридов получен из N.meningitidis серогруппы А. 4. Иммунологическая композиция по п.2, в которой по меньшей мере один из капсульных полисахаридов получен из N.meningitidis серогруппы С. 5. Иммунологическая композиция по п.1, содержащая комбинацию двух отдельных и раздельно приготовленных конъюгатов полисахарида с белком, причем первый конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы W-135, а второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из очищенных капсульных полисахаридовN.meningitidis серогрупп Y, А или С. 6. Иммунологическая композиция по п.5, в которой второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы Y. 7. Иммунологическая композиция по п.5, в которой второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы А. 8. Иммунологическая композиция по п.5, в которой второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы С. 9. Иммунологическая композиция по п.1, содержащая комбинацию двух отдельных и раздельно приготовленных конъюгатов полисахарида с белком, причем первый конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы Y, а второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогрупп А или С.- 14006947 10. Иммунологическая композиция по п.9, в которой второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы А. 11. Иммунологическая композиция по п.9, в которой второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы С. 12. Иммунологическая композиция по п.1, содержащая комбинацию трех отдельных и раздельно приготовленных конъюгатов полисахарида с белком, причем первый конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы W-135, второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitides, выбранный из группы, состоящей из Y, А и С, а третий конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis, выбранный из группы, состоящей из серогрупп Y, А или С, причем второй конъюгат отличается от третьего конъюгата. 13. Иммунологическая композиция по п.12, в которой по меньшей мере один из второго конъюгата и третьего конъюгата содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы Y. 14. Иммунологическая композиция по п.12, в которой по меньшей мере один из второго конъюгата и третьего конъюгата содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы А. 15. Иммунологическая композиция по п.12, в которой по меньшей мере один из второго конъюгата и третьего конъюгата содержит очищенный капсульный полисахарид из N.meningitidis серогруппы С. 16. Иммунологическая композиция по п.1, содержащая комбинацию четырех отдельных и раздельно приготовленных конъюгатов полисахарида с белком, причем первый конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы W-135, второй конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы Y, третий конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы А, а четвертый конъюгат содержит очищенный капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы С. 17. Иммунологическая композиция по п.1, дополнительно содержащая адъювант. 18. Иммунологическая композиция по п.17, где указанный адъювант выбран из группы, включающей алюминиевый адъювант, адъювант Фройнда, N-(2-дезокси-L-лейциламиноD-глюкопиранозил)-Nоктадецилдодеканоиламида гидроацетат, 3[N-(N',N-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин, поли[бис(карбоксилатфенокси)фосфазен] и/или поли[ди(карбоксилатфенокси)фосфазен], монофосфорил липид А, олигодезоксинуклеотидные мотивы, сапониновые адъюванты, токсин холеры и формилметиониловый белок. 19. Иммунологическая композиция по п.18, в которой адъювантом является гидроксид алюминия. 20. Иммунологическая композиция по п.17, в которой указанный белок-носитель представляет собой белок одного вида. 21. Иммунологическая композиция по п.20, в которой указанный белок одного вида включает инактивированный бактериальный токсин, полученный из бактерии, которая выбрана из группы, состоящей из Corynebacteria diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa и Echerichiacoli. 22. Иммунологическая композиция по п.21, в которой инактивированный бактериальный токсин получен из Corynebacteria diphtheriae. 23. Иммунологическая композиция по п.22, в которой инактивированный бактериальный токсин получен из Corynebacteria diphtheriae CRM197. 24. Иммунологическая композиция по п.16, полученная в виде стерильной жидкости. 25. Иммунологическая композиция по п.24, где данная стерильная жидкость помещена в шприц одноразового использования. 26. Иммунологическая композиция по п.24, где данная стерильная жидкость помещена во флакон. 27. Иммунологическая композиция по п.16, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый консервант. 28. Иммунологическая композиция по п.27, в которой указанный фармацевтически приемлемый консервант выбран из перечня, включающего бензиловый спирт, парабены, тиомерсал, хлорбутанол и бензалкония хлорид.