Способы защиты млекопитающего от радиации

010291 Перекрестные ссылки По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 60/526460,поданной 2 декабря 2003 г., предварительной заявки на патент США 60/526461, поданной 2 декабря 2003 г., предварительной заявки на патент США 60/526496, поданной 2 декабря 2003 г., а также предварительной заявки на патент США 60/526666, поданной 2 декабря 2003 г., содержание которых приводится здесь путем ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к использованию флагеллина для защиты млекопитающих от апоптотических эффектов, а именно, к использованию флагеллина для защиты млекопитающих от воздействия стрессов, таких как радиация и терапия рака. Предпосылки создания изобретения Превращение нормальных клеток в опухолевые сопровождается утратой клеточных механизмов негативной регуляции роста, включающей устойчивость к стимулам, ингибирующим рост, а также потерю зависимости от факторов роста и гормонов. Традиционная терапия рака, использующая радиоактивное облучение или применение цитотоксических лекарств, основана на различиях в регуляции роста нормальных и раковых клеток. При традиционной терапии рака клетки подвергаются сильному генотоксическому стрессу. В этих условиях деление большинства нормальных клеток блокируется, и поэтому они выживают, в то время как опухолевые клетки продолжают делиться и погибают. Однако природа традиционной стратегии терапии рака такова, что при проведении такой терапии риску подвергаются и обычные ткани, в которых происходит быстрая пролиферация или апоптоз. Повреждение этих, в норме быстро делящихся клеток является причиной хорошо известных побочных эффектов терапии рака (чувствительными тканями являются кроветворные органы, тонкая кишка, волосяные фолликулы). К естественной чувствительности таких тканей добавляется то, что в раковых клетках зачастую появляются дефекты механизмов апоптоза, и те терапевтические процедуры, которые приводят к гибели клеток в нормальных чувствительных тканях, могут не быть столь же губительными для раковых клеток. Обычно предпринимаемые попытки свести к минимуму побочные эффекты при лечении рака основаны на (а) придании клеткам опухоли большей восприимчивости к воздействию, (б) придании методам лечения рака большей селективности по отношению к клеткам опухоли, или (с) стимулировании регенерации нормальных тканей после лечения (например, с использованием эритропоэтина, фактора, стимулирующего рост колоний гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF - granulocyte macrophage colonystimulation factor), и фактора роста кератиноцитов (KGF - keratinocyte growth factor. На настоящий момент существует острая необходимость создания терапевтических агентов, способных уменьшить побочные эффекты, вызываемые химиотерапией и лучевой терапией при лечении рака. Настоящее изобретение восполняет эту необходимость и предоставляет другие преимущества при решении близких проблем. Сущность изобретения Данное изобретение относится к способу защиты пациента при одном или нескольких видах терапии, вызывающей апоптоз, который включает введение пациенту композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность NF-В (nuclear factor B - ядерный транскрипционный фактор каппа В). Таким агентом может быть флагеллин или TGF (transforminggrowth factor- трансформирующий фактор роста ), который, в свою очередь, может быть латентнымTGF. Терапией может быть терапия рака, которая может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию. Изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от рака, сопровождающегося конститутивной активностью NF-B, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность NF-B. Таким агентом может быть флагеллин или TGF, который, в свою очередь, может быть латентнымTGF. Этот агент можно вводить до, во время или после терапии рака. Терапия может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию. Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения здоровых тканей, возникшего в результате терапии рака, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность NF-B. Агентом может являться флагеллин или TGF, который, в свою очередь, может быть латентным TGF. Агент можно вводить до, во время или после терапии рака. Терапией может являться химиотерапия или облучение. Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения здоровых тканей, связанного со стрессом, включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность NFB. Таким агентом может быть флагеллин или TGF, который, в свою очередь, может быть латентнымTGF. Агент можно вводить до, во время или после терапии заболевания, которым страдает млекопи-1 010291 тающее. Настоящее изобретение относится также к способу регуляции старения клеток у млекопитающих,включающему введение млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность NF-B. Таким агентом может быть флагеллин или TGF,который, в свою очередь, может быть латентным TGF. Агент можно вводить до, во время или после терапии заболевания, которым страдает млекопитающее. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей агент, индуцирующий активность NF-B, химиотерапевтическое лекарство, а также, возможно, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель или носитель. Агентом может быть флагеллин илиTGF, который, в свою очередь, может быть латентным TGF. Настоящее изобретение относится также к способу выявления индукторов NF-B, включающему добавление предполагаемого индуктора к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, и отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, при этом индуктор NFB определяется по способности увеличивать уровень экспрессии, отражающей активность NF-B. Настоящее изобретение также относится к способу защиты млекопитающего от воздействия радиоактивного облучения, включающему введение указанному млекопитающему композиции, содержащей фармацевтически приемлемое количество агента, индуцирующего активность NF-B. Таким агентом может быть флагеллин, который может быть выделен из какого-либо вида Salmonella. Композиция может вводиться в комбинации с радиопротектором. Радиопротектором может быть антиоксидант, которым может быть амифостин или витамин Е. Радиопротектором также может быть цитокин, который, в свою очередь, может являться фактором стволовых клеток. Настоящее изобретение относится к способу защиты пациента при одном или нескольких видах терапии или состояния, вызывающих апоптоз, который включает введение указанному пациенту композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество агента, индуцирующего NF-B. Таким агентом может быть флагеллин, выделенный из какого-либо вида Salmonella. Терапия может быть терапией рака, которая, в свою очередь, может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию. Состоянием может быть стресс, который, в свою очередь, может представлять собой радиоактивное облучение,рану, отравление, инфекцию и температурный шок. Настоящее изобретение также относится к способу выявления модуляторов апоптоза, включающему добавление предполагаемого модулятора к апоптотической клеточной системе, и отдельное добавление контроля к апоптотической клеточной системе, при этом модулятор апоптоза определяется по способности изменять апоптотический индекс, причем предполагаемый модулятор выделяют из паразита млекопитающего. Настоящее изобретение относится также к способу выявления модуляторов NF-B, включающему добавление предполагаемого модулятора к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, и отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, при этом модуляторNF-B определяют по способности изменять уровень экспрессии, отражающей активность NF-B, причем предполагаемый модулятор получают из паразитов млекопитающих. Паразит принадлежит к видам,включающим Salmonella, Mycoplasma и Chlamydia, но не ограничивающимся ими. Настоящее изобретение относится также к способу выявления модулятора TGF, включающему добавление предполагаемого модулятора к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, И отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, при этом модуляторTGF определяют по способности изменять уровень экспрессии, отражающей активность TGF, причем предполагаемый модулятор получают из паразитов млекопитающих. TGF может быть латентнымTGF. Паразит может принадлежать к видам, включающим Salmonella, Mycoplasma и Chlamydia, но не ограничивающимся ими. Настоящее изобретение относится также к способу выявления модулятора р 53, включающему добавление предполагаемого модулятора к системе экспрессии, отражающей активность р 53, и отдельное добавление контроля к системе экспрессии, отражающей активность р 53, при этом модулятор р 53 определяют по способности изменять уровень экспрессии, отражающей активность р 53, причем предполагаемый модулятор получают из паразитов млекопитающих. Паразит может принадлежать к видам, включающим Salmonella, Mycoplasma, и Chlamydia, но не ограничивающимся ими. Настоящее изобретение относится также к модулятору, выявленному с помощью описанных здесь способов. Также настоящее изобретение относится к композиции, включающей описанный здесь модулятор. Композиция может являться фармацевтической композицией, содержащей фармацевтически приемлемое количество описанного здесь модулятора. Настоящее изобретение относится также к способу лечения рака, включающему введение объекту,нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, содержащей модулятор, усиливающий апоптоз. Настоящее изобретение относится также к способу защиты пациента при одном или нескольких ви-2 010291 дах лечения, вызывающих апоптоз, который включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей модулятор, ингибирующий апоптоз. Один или несколько видов лечения могут представлять собой терапию рака. Терапия рака, в свою очередь, может представлять собой химиотерапию или лучевую терапию. Краткое описание фигур На фиг. 1 показано, что инфекция Salmonella приводит к локализации NF-B в ядрах даже неинфицированных клеток. Клетки НТ 29 выращивали на покровных стеклах, причем клетки либо ложно инфицировали, либо не подвергали обработке, либо инфицировали Salmonella typhimurium, либо обрабатывали фактором некроза опухоли(TNF - tumor necrosis factor ) (10 нг/мл). А: НТ 29 клетки искусственно инфицировали при множественности инфекции (МИ) 100 штаммомSalmonella typhirium SJW 1103G, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок (GF - green fluorescent protein) под промотором ssaH, который является единственным активным промотором в инфицированной клетке-хозяине. Клетки фотографировали с помощью микроскопии по методу светлого поля(МСП), и детектировали с помощью иммунофлуоресценции окрашивание GFP или 6-диамидино-2 фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI - 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochloride). Для выявления зараженных клеток изображения совмещали наложением. Б: Клетки НТ 29 оставляли необработанными, инфицировали штаммом 1103 Salmonella typhimurium или обрабатывали TNF. Как указанно, локализацию субъединицы р 65 NF-B (RelA) при различных условиях контролировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Визуализацию клеток осуществляли с помощью микроскопии по методу светлого поля (МСП), ядра клеток окрашивали с помощьюDAPI, а субъединицу р 65 (RelA) визуализировали с помощью флуоресцеин изотиоцианата (FITC - fluorescein isothiocyanate). Цвет окраски DAPI искусственно изменен на красный, чтобы сделать визуализацию этой окраски лучше опознаваемой при наложении. На фиг. 2 показано, что белковый фактор в культуральной жидкости Salmonella приводит к активации NF-B. А: 100-кратно концентрированную культуральную жидкость Salmonella dublin, обрабатывали, как указано выше, или проводили, как указано, стимуляцию клеток НТ 29 инфекционными бактериями. ДНКсвязывающую активность NF-B определяли методом анализа задержки в геле (EMSA - electrophoreticmobility shift assay) на экстрактах целых клеток, приготовленных через 45 мин после обработки. Аутентичность NF-B ДНК-белкового комплекса определяли, используя суперсдвиг р 65 (RelA)-специфичных и р 50-специфичных антител. Б: концентрированную культуральную жидкость Salmonella dublin (IN) изучали с помощью гельпроникающей хроматографии на колонке с гелем "Супероуз 12" (Superose 12). Элюированные белковые фракции анализировали фракционированием и методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (10% SDS-PAGE - 10% sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electrophoresis) и визуализировали с помощью окраски кумасси голубым (КГ). Отмечены маркеры молекулярного веса для гель-проникающей хроматографии. Аликвоты каждой фракции использовали, как указано, для стимулирования клеток НТ 29 и анализировали с помощью EMSA ДНК-связывающую активность NF-B в полученных в результате экстрактах целых клеток (ЭЦК). В: концентрированную культуральную жидкость Salmonella dublin (IN) анализировали ионообменной хроматографией на матрице POROS HQ. Белки элюировали в возрастающем градиенте NaCl, как указано, и анализировали с помощью 10% SDS-PAGE, а затем визуализировали окрашиванием Кумасси голубым (КГ). Расход и аликвоты каждой фракции использовали, как указано, для стимуляции клеток НТ 29, и получающиеся в результате ЭЦК анализировали с помощью EMSA на ДНК-связывающую активность NF-B. Элюированный материал, соответствующий белковым полосам В 1-В 6, и пустой участок геля, выделенный из дубликата 10% SDS-PAGE геля, вместе с образцами буфера из начала и конца буферного градиента NaCl использовали для стимулирования клеток НТ 29, затем полученные в результате ЭЦК анализировали с помощью EMSA на ДНК связывающую активность NF-B. На фиг. 3 показано, что фактор, активирующий NF-NF-B в культуральной жидкости Salmonella,представляет собой флагеллин, что обнаружено с помощью метода масс-спектрометрии. На фиг. 3 показаны результаты тандемной масс-спектрометрии в сочетании с микрокапиллярной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) В 2, переваренной трипсином. Пики, соответствующие белкам Salmonella, пронумерованы и идентифицированы в соответствии с номерами пептидных цепочек справа. На фиг. 4 показано, что мутантные формы флагеллина не вызывают активации NF-B.A: EMSA анализ на ДНК-связывающую активность NF-B в ЭЦК, полученных через 45 мин из неинфецированных клеток (UN) и после прямого инфицирования клеток НТ 29 диким типом E.coli DH5,диким типом Salmonella dublin или мутантом SopE-, мутантом SopB-, двойным мутантом SopE-/SopB-,диким типом Salmonella typhimurium, штамм 1103, мутантом fliC- (fliC- Tn10), двойным мутантом fliC/fljB-, как указано, при МИ 50. Б: EMSA анализ на ДНК связывающую активность NF-B на ЭЦК, полученных через 45 мин после контрольного заражения клеток НТ 29 из незараженных клеток (UN) или на стерильно фильтрованных-3 010291 концентрированных культуральных жидкостях бактерий дикого типа и мутантных бактерий. На фиг. 5 показано, что флагеллин необходим для активации многих сигнальных путей при инфекции Salmonella и приводит к локализации в ядре NF-B. А: Клетки НТ 29 не подвергались обработке или стимулировались TNF (10 нг/мл) или смесью анизомицина (20 мг/мл)/форболмиристат ацетата (РМА - phorbol myristate acetate) (12,5 нг/мл) в течение 15 мин, или инфицировались диким типом (ДТ) Salmonella typhimurium, штамм 1103, или Salmonella typhimurium, двойным мутантом fliC-/fljB-, штамм 134. ЭЦК изготавливали через указанное время или через 10 мин в случае клеток, обработанных TNF, либо через 15 мин в случае клеток, обработанных анизомицином/РМА; далее указанные ЭЦК использовали для анализа ДНК связывающей активности NF-B, или в иммунно-киназном анализе (ИКА), с использованием анти-IKK (IB kinase - киназа IB) или анти-JNK(c-Jun N-terminal kinase - c-Jun N-концевая киназа) антител для измерения IKK и JNK киназной активности на соответствующих субстратах IB 1-54 и cJun 1-79, меченных GST (glutation-S-transferase - глютатион-S-трансфераза) (как указано). Иммунноблот-анализ (ИБА) эквивалентных количеств (40 мкг) белка из каждого экстракта разделяли на фракции на SDS-PAGE геле и переносили на поливиниледенфторидные (PVDF-polyvinilidene fluoride) мембраны, затем осаждали с указанными антителами с обнаружением основной массы IKK, JNK, ERK (extracellular signal regulated kinase - киназа, регулируемая внеклеточным сигналом), а также субъединицы р 38, как указано. В иммунноблот-анализах использовали фосфоспецифичные антитела на ERK и субъединицу р 38 для обнаружения активированных ERK и р 38. Б: Данные иммунофлуоресценции, показывающие, что мутант Salmonella по флагеллину не инфицирует клетки НТ 29, и что стимуляция клеток НТ 29 очищенным флагеллином приводит к локализацииNF-B субъединицы р 65 (Re1A) в ядрах, что установлено с помощью непрямой иммуннофлуоресценции. Изображения отмеченных обработанных НТ 29 клеток, выращенных на покровном стекле, точно такие же, как на фиг. 1 А и В. Искусственное изменение цвета метки DAPI использовано для усиления визуализации как окрашенных ядер DAPI, так и ядерной локализации субъединицы р 65. На фиг. 6 показано, что очищенный флагеллин активирует сигнальные пути и экспрессию противовоспалительных генов в клетках эпителия кишечника, что имитирует эффект инфекции диким типомSalmonella. HT29 оставляли необработанными или обрабатывали TNF (10 нг/мл) или сывороткой анизомицина (20 мкг/мл)/РМА (12,5 нг/мл) в течение 10 мин, или флагеллином (1 мкг/мл) за такое же время. ЭЦК готовили и анализировали методом EMSA, определяя ДНК-связывающую активность NF-B, методами иммунно-киназного анализа (ИКА) и иммуноблот-анализа (ИБА) с использованием фосфоспецифических антител на ERK или р 38, обнаруживая таким образом их активацию, и с помощью киназа-специфических антител, как описано на фиг. 5 А, определяя общее количество киназ.A: EMSA анализ, определяющий ДНК-связывающую активность NF-B. Б: иммунноблот-анализ и анализ киназной активности, выявляющий киназную активность IKK,JNK, ERK и р 38, а также общее количество белка, как на фиг. 5. В: полуколичественная RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction -полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой), выявляющая экспрессию противовоспалительных генов у не обработанных, обработанных диким типом, двойным мутантом по флагеллину Salmonella typhimurium и стимулированных TNF (10 нг/мл) или флагеллином (1 мкг/мл) клеток. Клетки НТ 29 были собраны в указанное время после описанной выше обработки, и выделенная РНК использовалась как матрица для первой цепи комплементарной ДНК, которую затем использовали в RT-PCR с ген-специфическими праймерами для интерлейкина 1 (IL1), интерлейкина 1 (IL1), инерлейкина 8 (IL-8), фактора некроза опухоли(TNF), белка-хемоаттрактанта макрофагов 1 (МСР 1 - macrophage chemoattractant protein) и актина. -актин использовался в качестве контроля для нормализации паттернов экспрессии. Конечные продукты RT-PCR разделяли на фракции в 2% агарозном геле и выявляли окраской бромистым этидием. На фиг. 7 показано, что активация NF-B, опосредованная флагеллином, зависит от MyD88. Инфекционный дикий тип Salmonella dublin (МИ 100), IL-1 (20 нг/мл), очищенный флагеллин (1 мкг/мл)(как отмечено), стерильно-профильтрованный и сконцентрированный через фильтр 100 кДа ультраконцентрат надосадочной жидкости культуры дикого типа Salmonella dublin и SopE-/SopB- двойной мутантSalmonella dublin штамма SE1SB2 (как отмечено S2), использовались для стимулирования дикого типа(ДТ), MyD88-/- нокаутов и TLR2-/-/TLR4-/- двойных нокаутов эмбриональных мышиных фибробластов(MEF - mouse embryo fibroblast). ЭЦК готовили через 45 мин после обработки и анализировали методомEMSA на ДНК-связывающую активность NF-B. IL-1 (20 нг/мл) использовали в качестве положительного контроля при исследовании функции MyD88. На фиг. 8 показано, что TLR5 (toll-like receptor 5 - toll-подобный рецептор 5) ингибирует флагеллинопосредованную активность репортерного гена NF-B. Проводили трансфекцию клеток НТ 29 на 6 луночном планшете трижды, используя указанные доминантно-негативные экспрессионные векторыTLR млекопитающих (DN-TLR векторы), или антисмысловую РНК TLR5 (AS TLR5) (2 мкг/лунка), генрепортер 2NF-B Luc (100 нг/лунка), pRL-TK люциферазу Ренилла для нормализации (50 нг/лунка),доведенную до общего количества 4 мкг ДНК/лунка с помощью ДНК пустого вектора плазмидной кДНК 3.1. (pcDNA3.1).-4 010291 А: двукратное индуцирование NF-B Luc-репортерного гена в нестимулированных клетках (светлая штриховка) и обработанных TNF (10 нг/мл) клетках (темная штриховка). Лизат готовили через 12 ч после стимуляции. Приведены результаты показательных экспериментов. Б: проводили трансфекцию клеток НТ 29 как на фиг. 8 А, затем обрабатывали их флагеллином (1 мкг/мл) и получали и анализировали клеточный лизат. Приведены результаты показательных экспериментов. На фиг. 9 показано, что стимуляция флагеллином клеток эпителия кишечника приводит к активации подсистемы генов TLR. Клетки НТ 29 стимулировали флагеллином (1 мкг/мл) и спустя 3 ч выделяли РНК, используя тризол. Эту РНК затем использовали для получения первой нити комплементарной ДНК. В RT-PCR использовали ген-специфичные праймеры для каждого TLR. В качестве стандарта для нормализации образцов экспрессии использовали -актин. На фиг. 10 показано, что TLR5 экспрессируется во многих типах клеток и проявляет различный ответ на флагеллин. А: экстракт целых клеток получали из нестимулированных клеток Т 84, НТ 29, А 549, 293 Т и T98G и разделяли на фракции на 8% SDS-PAGE геле, белки переносили на поливинилдифторидную мембрану и брали пробы для иммунноблот-анализа (ИБА) с анти-TLR5 антителами. Общее количество белка выявляли антителами на актин. Б: клетки НТ 29, А 549, HeLa, 293T и T98G оставляли необработанными , обрабатывали флагеллином (F), или TNF (T), затем спустя 45 мин готовили ЭЦК и использовали их в EMSA для определения ДНК связывающей активности NF-B. Аутентичность сдвига полосы NF-B определяли, используя суперсдвиг р 65 (RelA)-специфичных антител. На фиг. 11 показано, что недостаток р 53 ускоряет развитие синдрома гамма-облучения у мышей. А: внутрибрюшинная инъекция PFT (pifitprin alpha - пифитрин альфа) (10 мг/кг) защищает мышей линии C57B1/6J (если не отмечено иначе, здесь и ниже использовали самцов мышей 6-8 недельного возраста) при однократном облучении дозой 9 Гр и серии облучений общей дозой 12,5 Гр (5 раз по 2,5 Гр).PFT не влиял на выживание мышей, которых подвергали однократному воздействию ионизирующего излучения дозой 12,5 и 25 Гр (приведены результаты показательных экспериментов, использовали источник Shepherd 4000 Кюри, Цезий 137, мощность дозы 4 Гр/мин). Б: мыши дикого типа и р 53-нулевые мутанты линии C57B1/6J отличаются по относительной чувствительности к низким (10 Гр) и высоким (15 Гр) дозам гамма-излучения: мыши дикого типа были более чувствительными к облучению дозой 10 Гр, но более устойчивы к облучению дозой 15 Гр по сравнению с р 53-нулевыми мутантами. В: мышам, все тело которых облучали гамма-излучением дозой 11 Гр, через 12 ч после облучения инъецировали 1,5107 клетки костного мозга (ККМ) мышей дикого типа или синнгенных р 53-нулевых мутантов линии C57B1/6J. (Данная доза вызывает стопроцентный летальный исход в контрольной группе мышей, не подвергавшихся инъекции). Два месяца спустя после полного восстановления гемопоэза,животных облучали по всему телу гамма-излучением дозой 15 Гр, и при этом обнаружили отсутствие разницы в показателе смертности между двумя группами, различающимися по статусу активности р 53 клетках костного мозга. Г: сравнение динамики поражения тонкой кишки мышей дикого типа и р 53-нулевых мутантов в указанные точки времени после воздействия гамма-излучением дозой 15 Гр показало увеличение повреждений у р 53-нулевых мутантов (парафиновый срез, окрашенный гематоксилином/эозином; 125-кратное увеличение). Приведены фотографии, сделанные спустя 24 ч, срезов крипт, окрашенных методомTUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling - мечение dUTP биотином концов однонитевых разрывов с помощью терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы), на которых очевидны значительные объемы апоптоза у дикого типа, но не в р 53-дефицитном эпителии. На фиг. 12 показана динамика пролиферации и продолжительности жизни клеток в тонкой кишке мышей дикого типа и р 53-нулевых мутантов. А: сравнение скорости пролиферации в кишечнике мышей дикого типа и р 53-нулевых мутантов после воздействия ионизирующего излучения (слева). Радиоаутограммы срезов всего тела (1,7-кратное увеличение) 4-недельных мышей дикого типа и р 53-нулевых мутантов, которым инъецировали внутрибрюшинно 14 С-тимидин (10 мкКи на животное) и воздействовали гамма-излучением дозой 15 Гр, или не подвергали воздействию (по Westphal и др. 1997). Стрелками обозначен кишечник. (Справа) сравнение включения BrdU (bromodeoxiuridine - бромдеоксиуридин) клетками тонкой кишки мышей дикого типа и р 53-нулевых мутантов в различные промежутки времени после облучения дозой в 15 Гр. BrdU (50 мг/кг) инъецировали за 2 ч до умерщвления животного и проводили иммунохимическое окрашивание согласно процедуре, описанной ранее (Watson и Pritchard 2000). Фотографии 96-часовых опытов приведены в большем увеличении (в 400 раз). Б: сравнение количества BrdU положительных клеток на крипту в тонком кишечнике мышей дикого типа и р 53-нулевых мутантов в разные моменты времени после воздействия гамма-излучением дозой 15 Гр. На каждый момент времени анализировали трех животных, с каждого животного делали пять по-5 010291 перечных срезов подвздошной кишки и изучали их под микроскопом с целью установить число крипт и ворсинок. Количество BrdU-положительных клеток в криптах подсчитывали в пяти областях размером 100-300 крипт, выбранных случайным образом при 200-кратном увеличении, и общее число BrdU положительных клеток наносили на диаграмму. В: Определение количества BrdU-меченых клеток в тонком кишечнике мышей дикого типа и р 53 нулевых мутантов в разные моменты времени после воздействия гамма-излучением дозой 15 Гр. BrdU инъецировали за 30 мин до облучения и умертвляли мышей в указанные моменты времени. Была обнаружена повышенная миграция из крипт в ворсинки, за которой последовала быстрая гибель меченых клеток. На фиг. 13 показано, что рекомбинантный флагеллин способен активировать NF-B. На фиг. 14 показаны результаты экспериментов, направленных на определение способности флагеллина защищать мышей от радиации. Мышам линии C56BL6 (самцы шестинедельного возраста, по 10 животных в группе) инъецировали внутрибрюшинно 2,0 мкг (0,1 мг/кг) или 5,0 мкг (0,25 мг/кг) флагеллина в PBS. Спустя 4 ч мышей подвергали облучению дозой 15 Гр и ежедневно отслеживали выживание мышей. На фиг. 15 показаны гистологические срезы (окрашивание гематоксилин/эозин) эпителия тонкой кишки мышей, облученных дозой 15 Гр, которым инъецировали внутрибрюшинно 0,25 мг/кг флагеллина, и не подвергавшихся инъекции. У контрольных мышей наблюдалось полное разрушение крипт и ворсинок в отличие от животных, обработанных флагеллином, у которых наблюдалась нормальная морфология: тканей. На фиг. 16 показано влияние флагеллина на чувствительность мышей к воздействию на все тело гамма-излучением дозой 10 Гр. На фиг. 17 показано влияние флагеллина, инъецированного внутрибрюшинно в указанные моменты времени до облучения, на чувствительность мышей к воздействию на все тело гамма-излучением дозой 13 Гр (слева) и 10 Гр (справа). На фиг. 18 показано влияние флагеллина на чувствительность мышей к воздействию на все тело гамма-излучением дозами 10, 13 и 15 Гр. На фиг. 19 показана доменная структура бактериального флагеллина. Показаны очертания Са остова, распределение гидрофобных ядер и структурная информация о F41. Четыре отдельных гидрофобных ядра представляют собой домены D1, D2, D2b и D3. Вместе с Са остовом показаны все гидрофобные атомы боковой цепи. Группы в боковой цепи маркированы цветом: Ala (аланин) - желтый; Leu (лейцин),Ile (изолейцин) или Val (валин) - оранжевый; Phe (фенилаланин) и Tyr (тирозин) - фиолетовый (атомы углерода) и красный (атомы кислорода), (с) обозначает позиции и регионы различных структурных черт последовательности аминокислот флагеллина. На чертеже приведены (сверху вниз): фрагмент F41 - голубой, три складки -листа - коричневый, распределение вторичной структуры -спиралей - желтый, структура - зеленый и -поворот - фиолетовый; метка на каждом 50 остатке - голубой; домены D0, D1,D2, и D3; регион контакта с осевой субъединицей в протоэлементе - бирюзовый; высоко консервативная аминокислотная последовательность - красный, и вариабельный регион - лиловый; точечные мутации вF41, продуцирующие элементы различных суперспиралей. Буквы указывают морфологию мутантных элементов: L (D107E, R124A, R124S, G426A), линия L-типа; R (A449V), линия R-типа; С (D313Y, A414V,A427V, N433D), виток 33. (Samatey et al., Nature 2001). Подробное описание изобретения Настоящее изобретение основано на защите нормальных клеток и тканей от апоптоза, вызванного стрессом, включающим химиотерапию, лучевую терапию и облучение, но не ограничивающимся ими. Есть два основных механизма контроля апоптоза в клетке: путь р 53 (проапоптический) и NF-B путь(антиапоптический). Регуляция обоих путей в опухолях часто нарушается: р 53 обычно утрачивается, в то время как NF-B становится конститутивно активным. Так, ингибирование р 53 и активация NF-B в нормальных клетках может обеспечить защиту клеток от смерти, вызванной стрессом, таким как терапия рака, но клетки опухоли не станут более устойчивыми к терапевтическим воздействиям, поскольку в них эти механизмы контроля нерегулируемы. Эти данные опровергают традиционный взгляд на р 53 и NF-B,которые рассматриваются в качестве мишеней для активации и репрессии соответственно. Настоящее изобретение относится к индуцированию активности NF-B с целью защиты нормальных клеток от апоптоза. Индуцируя NF-B активность у млекопитающих, можно защитить нормальные клетки от апоптоза, связанного с клеточным стрессом, который возникает при терапии рака, гипертермии, облучении опасными дозами излучения, риску которого в высокой степени подвержены, например,солдаты, рабочие на атомных станциях, оборонной промышленности или при радиационно-опасном производстве фармпрепаратов, а также предотвратить клеточное старение. Поскольку NF-B конститутивно активен в большинстве опухолевых клеток, путем индукции активности NF-B можно защитить нормальные клетки от апоптоза, не оказывая нежелательного положительного воздействия на клетки опухоли. Как только нормальные клетки восстановятся, можно восстановить нормальный уровень NF-B активности. Активность NF-B можно индуцировать для защиты тканей, восприимчивых к облучению и-6 010291 химиотерапии, к которым относятся, например, ткани кроветворной системы (включая иммунную систему), ткани эпителия кишечника и волосяные фолликулы. Индукторы активности NF-B могут применяться также по различным другим назначениям. Патологии и смерть, являющиеся следствием действия на млекопитающих различных факторов, включающих радиацию, ранения, отравления, инфекции, старение, а также температурный шок, но не ограничивающихся указанным, могут быть, следствием действия нормальных физиологических механизмов ответа на стресс, таких как индукция программируемой смерти клеток (апоптоз) или выделение биоактивных белков, цитокинов. Обычной функцией апоптоза является чистка тканей от поврежденных, в том числе генетически клеток, в то время как цитокины служат для мобилизации защитных механизмов организма против патогенных воздействий. Однако в условиях сильной травмы сами механизмы ответа на стресс могут вызывать смерть. Например, смерть от облучения может являться следствием обширного апоптоза, опосредованного р 53, который происходит в кроветворной, иммунной и пищеварительной системах. Целесообразная фармакологическая регуляция NF-B может повысить выживаемость в условиях сильного стресса. Управление этими факторами может также сделать возможным контроль как над противовоспалительной системой, так и над выбором между жизнью и смертью в клетках пораженного органа. Защитная роль NF-B опосредована активацией транскрипции множества генов, кодирующих: (а) антиапоптические белки, блокирующие оба главных пути апоптоза, (б) цитокины и факторы роста, индуцирующие пролиферацию и поддержание жизни гемопоэтических и других стволовых клеток, и (в) белки, являющиеся мощными антиоксидантами, утилизирующими активные формы кислорода, например MnSOD (manganese superoxide dismutase 2 - дисмутаза супероксида марганца 2). Таким образом,временно активируя NF-B для защиты от излучения, можно достичь не только подавления апоптоза у больных раком, но и уменьшить вероятность вторичного возникновения рака благодаря одновременному иммуностимулирующему эффекту, которого можно достичь, если активировать NF-B через активациюToll-рецепторов. Другой выгодной особенностью использования NF-B в качестве мишени является возможность его активации с помощью многих природных факторов, которые можно рассматривать в качестве возможных радиопротекторов. Среди них можно отметить различные связанные с патогенами молекулярные паттерны (ПМП). ПМП являются молекулами, отсутствующими в организме хозяина, они характерны для больших групп болезнетворных организмов и мало подвергаются мутациям. Они распознаютсяToll-подобными рецепторами (TLR), которые являются ключевыми чувствительными элементами врожденного иммунитета. TLR действуют как первый предупреждающий механизм иммунной системы, индуцируя миграцию и активацию иммунокомпетентных клеток непосредственно или через выделение цитокина. TLR представляют собой мембранные рецепторы I типа, о которых известно, что они действуют как гомо- и гетеродимеры. Связывая лиганды, TLR активируют белки MyD88, который является необходимым адаптером сигналинга для большинства TLR. Последующий путь активации сигнала приводит к эффекту, включающему: (1) активацию пути NF-B, и (2) активацию MAPK (mitogen activatedprotein kinases - киназы, активируемые митогенами), включая N-концевую киназу Jun (JNK). Активация пути NF-B лигандами TLR дает выгодную возможность использовать эти лиганды в качестве радиопротекторов. В отличие от цитокинов эффекты большинства ПМП, иные чем активация TLR, незначительны, то есть судя по всему, они почти не обладают побочным действием. Более того, многие ПМП присутствуют в организме человека. В соответствии со своей функцией активации иммуноцитов, все TLR экспрессируются в селезенке и лейкоцитах периферической крови, а более специфические паттерны экспрессии TLR наблюдаются в других лимфоидных органах и субпопуляциях лейкоцитов. Однако TLR также экспрессируются и в других тканях и органах тела, например, TLR 1 экспрессируется повсеместно, TLR5 обнаружен также в желудочно-кишечном эпителии и эндотелии, а также известно, что TLR 2, 6, 7 и 8 экспрессируются в легких. 1. Определения. Следует понимать, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных воплощений и не ограничивает объем изобретения. Следует отметить, что используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также подразумевают и формы множественного числа, если в контексте четко не оговаривается иное. Используемый здесь термин введение, используемый для описания дозы агента, индуцирующего активность NF-B, означает одиночную дозу или многократные дозы возбудителя. Используемый здесь термин аналог, применяемый при описании пептидов или полипептидов, означает пептид или полипептид, содержащий одну или более нестандартных аминокислот или других структурных вариаций обычного набора аминокислот. Используемый здесь термин антитело означает антитело, принадлежащее к какому-либо из классов иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или его фрагменты, или производные, включая Fab,F(at')2, Fd, а также одноцепочечные антитела, димерные антитела, биспецифические антитела, бифунк-7 010291 циональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой моноклональное антитело,поликлональное антитело, афинно-очищенное антитело или их смеси, которые проявляют достаточную специфичность связывания по отношению к желаемому эпитопу или полученной из него последовательности. Антитело также может представлять собой химерное антитело. Антитело может быть производным, полученным путем присоединения одного или нескольких химических веществ, пептидов или полипептидных компонентов, известных из уровня техники. Антитело можно конъюгировать с химическим компонентом. Используемый здесь термин апоптоз относится к форме клеточной смерти, которая включает прогрессирующее сжатие клетки с сохранением целостности цитоплазматических органелл; конденсацию хроматина (т.е. конденсацию ядра), выявляемую методами световой или электронной микроскопии; и/или расщепление ДНК на фрагменты размером с нуклеосому, что выявляется методами осаждения при центрифугировании. Смерть клеток происходит, когда нарушается целостность клеточной мембраны(т.е. блеббинг мембраны), а интактные клеточные фрагменты (апоптозные тела) поглощаются фагоцитами. Используемый здесь термин рак означает любое состояние, характеризующееся устойчивостью к апоптотическим стимулам. Используемый здесь термин терапия рака означает любой вид лечения рака, известный из уровня техники, включая химиотерапию и лучевую терапию, но не ограничиваясь ими. Используемый здесь термин в сочетании с, при описании введения агента, индуцирующего активность NF-B, и дополнительного лечения означает, что агент можно вводить до, совместно или после дополнительного лечения или в комбинируя эти способы. Используемый здесь при описании пептида или полипептида термин производное означает пептид или полипептид, отличающийся чем-либо, кроме первичной структуры (аминокислоты или аналоги аминокислот). В качестве иллюстрации производными могут быть гликолизированные белки (одна из форм пострансляционной модификации). Например, пептиды или полипептиды могут имеет паттерны гликолизования, обусловленные экспрессией в гетерологичных системах. Если при этом сохраняется хотя бы один вид биологической активности, такие пептиды или полипептиды согласно изобретению являются производными. Другие производные включают, но не ограничиваются ими, рекомбинантные пептиды или полипептиды, имеющие ковалентно модифицированные N- или С-концы, подиэтиленгликоль-коньюгированные пептиды или полипептиды, пептиды или полипептиды, ассоциированные с липидными компонентами, алкилированные пептиды или полипептиды, пептиды или полипептиды, соединенные через функциональные группы боковых аминокислот с другими пептидами, полипептидами или химикатами, и другие модификации, известные из уровня техники. Используемый здесь термин флагеллин означает флагеллин, полученный из любого источника,включая любые штаммы бактерий, но не ограничиваясь ими. Флагеллин может быть получен из штаммов Salmonella. Также конкретно рассматриваются фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные указанного флагеллина, а также их комбинации. Различные фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные описанные здесь могут быть идентичными флагеллину дикого типа на 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99%. Применяемый здесь при описании пептида или полипептида термин фрагмент означает пептиды,состоящие примерно из 8-50 аминокислот. Фрагментом может являться цепочка из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,45, 46, 47, 48, 49 или 50 аминокислот. Используемый здесь при описании пептида или полипептида термин гомолог означает пептид или полипептид, имеющий общий эволюционный предшественник с рассматриваемым пептидом или полипептидом. Используемый здесь термин латентный TGF означает предшественник TGF, пребывающий в неактивной форме. Латентным TGF может быть предшественник TGF, содержащий активный TGF и пептид, ассоциированный с латентностью (LAP - latency associated peptide). Латентный TGF может также включать LAP, присоединенный к белку, связывающему латентный TGF. Латентый TGF может также представлять собой большой латентный комплекс. Также латентный TGF может представлять собой латентный TGF, модифицированный так, что скорость его превращения в активную форму TGF или способность к такому превращению является пониженной. Модифицированным латентным TGF может быть, например, TGF, несущий мутацию, предотвращающую или замедляющую превращениеTGF в активную форму. Используемый здесь термин TGF означает любую изоформу активного или латентного TGF,включая TGF1, TGF2, TGF3, TGF4, или TGF5, а также их комбинации, но не ограничиваясь ими. Также конкретно рассматриваются фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные указанной изоформы TGF, а также их комбинации. Разнообразные фрагменты, варианты, аналоги, гомологи или производные, описанные здесь, могут быть идентичными изоформе TGF на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,90, 95, 97, 98 или 99%.-8 010291 Используемые здесь термины лечить, лечение или терапия, относящиеся к защите млекопитающего от состояний, означают предотвращение, подавление, остановку или устранение состояния. Предотвращение состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению до возникновения состояния. Подавление состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению после возникновения состояния, но до его клинического проявления. Остановка состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению после клинического проявления состояния с тем, чтобы ослабить состояние или не дать ему прогрессировать. Устранение состояния предполагает введение млекопитающему композиции по изобретению после клинического проявления состояния с тем, чтобы млекопитающее избавилось от этого состояния. Используемый здесь термин раковая клетка означает любую клетку, характеризующуюся устойчивостью к апоптотическим стимулам. Используемый здесь для описания пептида или полипептида термин вариант, означает пептид или полипептид, отличающийся последовательностью аминокислот, а именно наличием вставок, делеций или консервативным замещением аминокислот, но сохраняющий, по меньшей мере, один вид биологической активности. В контексте задач настоящего изобретения биологическая активность включает способность связываться со специфическими антителами, но не ограничивается ей. Консервативное замещение аминокислоты, т.е. замещение аминокислоты другой аминокислотой с подобными свойствами(например, гидрофильностью, степенью заряженности и распределением заряженных областей) понимается в данной области техники как обычная второстепенная замена. Такие второстепенные замены можно определить, в частности, с помощью индекса гидрофобности аминокислот, как это известно из уровня техники. (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982. Расчет индекса гидрофобности аминокислоты основан на определении ее гидрофобности и заряда. Из уровня техники известно, что аминокислоты с одинаковым индексом гидрофобности могут взаимно замещаться с сохранением функций белка. Известно,что аминокислоты, имеющие индекс гидрофобности 2, являются взаимозамещаемыми. Определение гидрофильности аминокислот также позволяет обнаружить замещения, которые можно производить с сохранением биологической функции белка. Анализ гидрофильности аминокислот при изучении пептидов позволяет рассчитать наибольшее локальное среднее значение гидрофильности этого пептида, которое, как было описано, является критерием, хорошо коррелирующим с антигенными и иммуногенными свойствами. (Патент США 4554101 включен здесь посредством ссылки). Замещение аминокислот,имеющих одинаковые значения гидрофильности, приводит в результате к сохранению биологической активности пептидов, например имунногености, как это понятно из уровня техники. Известно, что такое замещение можно производить с аминокислотами, индекс гидрофильности которых различается на 2 для каждой аминокислоты. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияют определенные боковые группы этих аминокислот. В соответствии с этими наблюдениями возможность замещения аминокислот, не приводящего к утрате желаемой биологической функции, зависит от относительного сходства аминокислот, а также конкретных боковых групп этих аминокислот, что определяется по гидрофобности, гидрофильности, заряду, размерам и другим свойствами этих групп и аминокислот. 2. Способы лечения. а. Опухоли с конститутивно активным NF-B. Настоящее изобретение относиться к способам лечения млекопитающего, страдающего от рака, ассоциированного с конститутивно активным NF-B, включающим введение млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество агента, индуцирующего активность NF-B. Агент, индуцирующий активность NF-B можно вводить в сочетании с другими видами терапии рака. Указанный агент можно вводить одновременно или поочередно с применением других видов противораковой терапии, например химиотерапии или лучевой терапии. Термин одновременный или одновременно, используемый здесь, означает, что промежуток времени между применением других видов противораковой терапии и введением соединения по изобретению составляет 48 ч, предпочтительно 24 ч, более предпочтительно 12 ч, еще более предпочтительно 6 ч и наиболее предпочтительно в 3 ч и менее. Термин поочередно, используемый здесь, означает введение соединений в иной момент времени,чем время проведения химиотерапии, с определенной частотой относительно повторного введения и/или режима химиотерапии. Указанный агент можно вводить в любое время до проведения терапии рака, например, но не ограничиваясь этим, приблизительно за 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10 часов, 8, 6, 4, 3, 2 или 1 ч. Агент можно вводить в любой момент после проведения терапии рака, например, но не ограничиваясь этим, спустя приблизительно 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ч после проведения терапии. Терапия рака может включать введение цитотоксических агентов или цитостатических агентов, или их комбинацию. Цитотоксические агенты препятствуют размножению раковых клеток посредством: (1) подавления способности клеток к репликации ДНК и (2) индукции клеточной гибели и/или апоптоза в раковых клетках. Цитостатические агенты действуют, модулируя, препятствуя или подавляя процессы-9 010291 передачи сигнала в клетках, регулирующие клеточную пролиферацию, в том числе поддерживающие е на непрерывном низком уровне. Классы соединений, которые можно использовать в качестве цитотоксических агентов включают следующие: алкилирующие агенты (включая, но не ограничиваясь указанным, азотистые иприты, производные этиленимина, алкилсульфонаты, нитромочевины и триазены): урамустин, хлорметин, циклофосфамид (Cytoxan), ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, пипоброман, триэтилен-меламин, триэтилентиофосфорамин, бусульфан, кармустин, ломустин, стрептозоцин, дакарбазин и темозоломид; антиметаболики (включая, но не ограничиваясь указанным, антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина,аналоги пурина и ингибиторы аденозин деаминазы): метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, флударабина фосфат, пентостатин и гемцитабин, натуральные продукты и их производные (например, алкалоиды барвинка, противоопухолевые антибиотики, ферменты,лимфокины и эпиподофиллотоксины): винбластин, винкристин, виндесин, блеомицин, дактиномицин,даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, цитозин-арабинозид, паклитаксел (паклитаксел имеется в продаже под торговым наименованием Таксол), митрамицин, дезоксикоформицин, митомицин-ц, 1-аспарагиназа, интерфероны (предпочтительно -интерферон), этопозид и тенипозид. Другими цитотоксическими агентами, воздействующими на пролиферацию, являются навелбен,СРТ-11 (иринотекан), анастразол, летразол, капецитабин, релоксафен, циклофосфамид, ифосамид и дролоксафен. Агенты, действующие на микротрубочки, которые хорошо известны из уровня техники, препятствуют митозу благодаря цитотоксической активности. Агенты, действующие на микротрубочки, которые применяются в изобретении, включают, не ограничиваясь указанным, аллоколхицин (NSC 406042), халихондрин В (NSC 609395), колхицин (NSC 757), производные колхицина (например, NSC 33410), доластатин 10 (NSC 376128), майтансин (NSC 153858), ризоксин (NSC 332598), паклитаксел (Таксол, NSC 125973), производные Таксола (например, NSC 608832), тиоколхицин (NSC 361792), тритил цистеин(NSC 83265), винбластин сульфат (NSC 49842), винкристин сульфат (NSC 67574), натуральные и синтетические эпотилоны, включая, но не ограничиваясь указанным, эпоптилон А, эпоптилон В, а также дискодермолид (см. Service, (1996) Science, 274:2009) эстрамустин, нокодазол, МАР 4 и т.п. Примеры таких агентов также описаны в Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110:3055 3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez(1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; а также Panda (1996) J. Biol. Chem 271:29807-29812. Также подходят цитотоксические агенты, такие как эпидофиллотоксин, противоопухолевый фермент; ингибитор топоизомеразы, прокарбазин, митоксантрон, координационные комплексы с платиной,например, цисплатин и карбоплатин, модификаторы биологического ответа, ингибиторы роста, антигормональные терапевтические агенты, лейковорин, тегафур, а также гемопоэтические факторы роста. Цитостатические агенты, которые можно использовать, включают гормоны и стероиды (включая синтетические аналоги): 17-альфа-этинилэстрадиол, диэтилстилбестрол, тестостерон, преднизон, флуоксиместерон, дромостанолон пропионат, тестолактон, мегестролацетат, метилпреднизолон, метилтестостерон, преднизолон, триамицинолон, хлортрианизен, гидроксипрогестерон, аминоглютетимид, эстрамустин, медроксипрогестеронацетат, леупролид, флутамид, торемифен, золадекс, но не ограничиваются ими. Также в объем настоящего изобретения включены другие цитостатические агенты, препятствующие росту сосудов, такие как ингибиторы металлопротеаз матрикса, а также другие ингибиторы VEGF(vascular endothelium growth factor - фактор роста эндотелия сосудов), такие как антитела к VEGF и микромолекулы, например ZD6474 и SU 6668 (ингибиторы киназной активности рецептора VEGF типа 2). Также можно использовать антитела на Her-2 (human epidermal growth factor receptor 2 - рецептор человеческого эпидермального фактора роста типа 2) от Джинтек. Подходящими ингибиторами EGFR (epidermal growth factor receptor - рецептор эпидермального фактора роста) является ЕКВ-569 (необратимый ингибитор). Также включены антитела С 225, специфичные к EGFR, и ингибиторы Src-киназ. Также подходит для использования в качестве цитостатического агента Касодекс (бикалутамид,Астра Зенека), который запрещает пролиферацию андрогензависимых карцином. Еще одним примером цитостатического агента является антиэстроген Тамоксифен, ингибирующий пролиферацию и рост эстрогензависимых опухолей молочной железы. Ингибиторы передачи пролиферативных сигналов в клетке являются цитостатическими агентами. Иллюстративные примеры включают ингибиторы эпидермальных факторов роста, ингибиторы Her-2, ингибиторы MEK-1 киназ, ингибиторы MAPK киназ, ингибиторы PI3 (phosphatidyl inositol 3-phosphate - фосфатидил-инозитол 3-фосфат), ингибиторы Src-киназ, а также ингибиторы PDGF (platelet derived growth factor - фактор роста тромбоцитов). Согласно данному изобретению можно лечить многие виды рака, включая следующие: карцинома,включая карциному мочевого пузыря (в том числе ускоренный и метастатический рак мочевого пузыря),груди, толстой кишки (в том числе рак прямой кишки), почек, печени, легких (в том числе мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого и аденокарциному легкого), яичников, простаты, семенников, мочеполового тракта, лимфатической системы, прямой кишки, гортани, поджелудочной железы (включая- 10010291 ациноцитарную карциному), пищевода, желчного пузыря, шеи, щитовидной железы и кожи (включая плоскоклеточную карциному); гематопоэтические опухоли лимфоидного типа, включая лейкемию, острый лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, гистиоцитарную лимфому, лимфому Буркета; гематопоэтические опухоли миелоидного типа, включая острые и хронические миелоидные лейкемии, миелодиспластический синдром, миелоидную лейкемию, а также промиелоцитарую лейкемию; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому, невриному; опухоли мезенхимального происхождения включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому, а также другие виды опухолей, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакнтому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы, тератокарциному, но не ограничиваясь ими. В предпочтительном воплощении, данное изобретение используется для лечения рака желудочно-кишечного тракта. б. Лечение побочных эффектов, возникающих при терапии рака. Настоящее изобретение также относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения нормальных тканей, возникающего вследствие лечения рака, ассоциированного с конститутивной активностью NF-B. Агент, индуцирующий активность NF-B, можно применять совместно с другими видами терапии рака, описанными выше. в. Модулирование клеточного старения. Данное изобретение также относится к способу модулирования клеточного старения у млекопитающих, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества агента,индуцирующего активность NF-B. Агент, индуцирующий активность NF-B можно применять совместно с другими видами лечения. Агент можно вводить в любой промежуток времени до проведения другого вида лечения, включая промежутки времени около 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4,3, 2 или 1 ч до проведения другого вида лечения, но не ограничиваясь этим временем. Указанный агент также можно вводить в любой промежуток времени после проведения другого вида лечения, включая промежутки времени около 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 в, 38, 40, 42,44, 46, 48 ч после проведения другого вида лечения, но не ограничиваясь этим временем. г. Лечение стресса. Настоящее изобретение относится также к способу лечения млекопитающего, страдающего от повреждения нормальных тканей, обусловленного стрессом, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества агента, индуцирующего активность NF-B. Агент, индуцирующий активность NF-B, можно вводить совместно с применением иных видов лечения. Стресс может вызываться облучением, ранением, отравлением, инфекцией или температурным шоком, а также другими видами воздействий. Композицию, содержащую индуктор активности NF-B, можно вводить за любое количество времени до воздействия факторов стресса, включая промежутки времени около 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34,32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2 или за 1 ч до воздействия стресса, но не ограничиваясь этим временем. Композицию, содержащую индуктор NF-B, можно вводить в любой промежуток времени после воздействия стрессовых нагрузок, включая промежутки времени около 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ч после воздействия, но не ограничиваясь этим временем. д. Облучение. Настоящее изобретение также относится к защите клеток от эффектов, вызванных радиоактивным облучением. Поражение и смерть клеток в результате действия ионизирующего излучения является совокупностью поражений, вызванных непосредственно облучением незащищенных клеток и активностью генетически обусловленных механизмов ответа клетки на стресс, вызываемый действием радиации, которая приводит в результате к "самоубийству клетки" или к апоптозу. Апоптоз играет ключевую роль в массовой гибели клеток, происходящей в некоторых чувствительных к излучению органах (например,кроветворная и иммунная системы, эпителий пищеварительного тракта и т.д.), и неустойчивость этих органов к излучению определяет общую чувствительность организма к воздействию излучения. Воздействие ионизирующего излучения (ИИ) может быть коротким или длинным, его можно производить однократно или несколько раз, подвергать ему все тело или только отдельные участки. Так,ядерные аварии или военные действия могут приводить к облучению всего тела одиночной дозой высокой мощности (иногда за этим следует длительное отравление радиоактивными изотопами). То же самое происходит (но под строгим контролем мощности дозы излучения) при предварительной терапии, проводящейся перед трансплантацией костного мозга, в случаях, когда это необходимо для подготовки кроветворных органов реципиента для пересадки донорского костного мозга путем очищения их от клеток-предшественников крови реципиента. Лечение рака может вовлекать использование нескольких доз местного облучения, причем общая сумма этих доз, если бы облучению подвергалось все тело, намного превосходила бы летальную дозу. Отравление или лечение радиоактивными изотопами приводит к длительному облучению органов-мишеней (например, щитовидной железы, при ингаляции 125I). Наконец,- 11010291 существует много физических форм ионизирующего излучения, существенно различающихся по силе биологического действия. На молекулярном и клеточном уровне радиоактивные частицы способны вызвать разрыв и образование поперечных связей в ДНК, белках, клеточных мембранах и других макромолекулярных структурах. Ионизирующее излучение также вызывает вторичные повреждения клеточных компонентов, создавая свободные радикалы и активные формы кислорода. Многие системы репарации борются с такими повреждениями, так, несколько путей репарации ДНК восстанавливают целостность ДНК и правильную последовательность нуклеотидов, антиоксиданты химической и ферментативной природы утилизируют свободные радикалы и уменьшают количество окисленных белков и липидов. Системы точек контроля клеточного цикла выявляют дефекты ДНК и приостанавливают клеточный цикл до тех пор, пока повреждения не будут устранены, или блокируют рост клеток, либо направляют клетку на путь апоптоза. Излучение может причинять вред организму млекопитающего, начиная от умеренного мутагенного и канцерогенного влияния при небольших дозах, и заканчивая смертельным исходом при высоких дозах. Общая радиочувствительность организма определяется патологическими нарушениями, которые возникают в нескольких чувствительных тканях, в числе которых гемопоэтическая система, половая система и различные эпителиальные ткани с высокой скоростью клеточного цикла. Степень выраженности патологических последствий, вызываемых гамма-излучением и приводящих к смерти, зависит от дозы и определяется поражением конкретных органов, определяющих порог чувствительности организма к каждой определенной дозе. Так, летальный исход при низкой дозе возникает от аплазии костного мозга, в то время как смерть при умеренных дозах наступает быстрее вследствие гастроинтестинального синдрома. Очень высокие дозы излучения практически во всех случаях приводят к немедленной смерти, вызванной дегенерацией нейронов. Организм, переживший период острой токсичности, вызванной радиацией, может в течение длительного времени страдать от поздних последствий, среди которых вызываемые радиацией канцерогенез и фиброз, развивающиеся в облученных органах (например, почки, печень или легкие) в течение нескольких месяцев или лет после облучения. Клеточная ДНК является главной мишенью для ионизирующего излучения, которое вызывает различные виды повреждений ДНК (генотоксический шок), действуя напрямую или опосредованно (например, с помощью свободных радикалов). Во всех организмах функционируют системы репарации ДНК,которые способны эффективно восстанавливать поврежденную радиоактивным излучением ДНК; нарушения процесса репарации ДНК могут приводить к мутациям. Опухоли обычно являются наиболее чувствительными к гамма-излучению, и их можно лечить несколькими местными дозами, которые вызывают относительно небольшие повреждения нормальных тканей. Однако в некоторых случаях возможность повреждения нормальных тканей ограничивает применение гамма-излучения при лечении рака. Использование при раковой терапии обычного трехмерного конформного гамма-облучения или даже более сфокусированного облучения с помощью системы BeamCath также имеет дозовые ограничения, связанные с токсичностью, обусловленной кумулятивным эффектом излучения и индуцированием повреждений стволовых клеток в норме быстро восстанавливающихся тканей, таких как ткани костного мозга и желудочно-кишечного тракта. Высокие дозы облучения вызывают летальный исход, связанный с так называемыми гемопоэтическим и гастроинтестинальным синдромами. Гемопоэтический синдром характеризуется утратой кроветворных клеток и их предшественников, что делает невозможным обновление крови и лимфатической системы. Смерть, как правило, наступает вследствие инфекции (результат иммуносупрессии), кровопотери и/или анемии. Гастроинтестинальный синдром возникает вследствие массовой смерти клеток эпителия кишечника, в основном тонкого кишечника, за которым следует разрушение стенок кишечника и смерть в результате бактериемии и сепсиса. Гематопоэтический синдром чаще возникает при меньших дозах излучения и приводит к более медленной смерти, нежели чем при гастроинтестинальном синдроме. Ранее в качестве радиопротекторов как правило использовались антиоксиданты как синтетические,так и натуральные. Совсем недавно в список радиопротекторов были добавлены цитокины и факторы роста; считается, что механизм их радиопротективного действия является результатом влияния на чувствительные ткани, облегчающего их восстановление. Однако нет четкого функционального разграничения между обеими группами радиопротекторов, поскольку некоторые цитокины индуцируют экспрессию клеточных антиоксидантов, таких как дисмутаза супероксида марганца (MnSOD - manganese superoxide dismutase) и металлотионеин. Степень протективного действия каждого конкретного агента выражается в факторе модификации дозы или факторе уменьшения дозы (ФМД или ФУД). ФМД определяется воздействием на объекты, получающие радиопротектор, и контрольные объекты, не получающие радиопротектор, несколькими дозами облучения и последующим сравнением количества выживших или других критериев. ФМД обычно рассчитывается при наблюдении за выживанием объектов в течение 30 дней (вычисляется отношение количества выживших в группе, получившей ЛД (летальную дозу) 50/30 и принимавших лекарство, к- 12010291 количеству выживших в группе, получившей ЛД 50/30 и принимавших "пустой" наполнитель) и количественно определяет защитное действие исследуемого вещества на гемопоэтическую систему. Оценивая защитное действие на гастроинтестинальную систему, рассчитывают ЛД 50 и ФМД при наблюдении за выживанием в течение 6 или 7 дней. Величины ФМД приведенные здесь, рассчитаны при 30-дневном наблюдении, если не указано иначе. Агенты, индуцирующие активность NF-B, оказывают действие, в значительной мере способствующее выживанию клеток и всего организма. В ответ на сверхлетальную дозу излучения индукторыNF-B ингибируют гастроинтестинальный и гематопоэтический синдром, которые являются главными причинами возникновения смерти при сильном излучении. Благодаря этим свойствам, агенты, индуцирующие NF-B, можно использовать для лечения последствий облучения, произошедшего в результате естественных причин или ядерных аварий. Более того, поскольку индукторы NF-B действуют по механизмам, иным, чем все известные в настоящее время радиопротекторы, их можно использовать в комбинации с другими радиопротекторами, таким образом, значительно повышая степень защиты от ионизирующего излучения. В отличие от традиционных агентов-радиопротектров (например, ловушки свободных радикалов),антиапоптические агенты могут не уменьшать первичные повреждения, вызванные излучением, но они действуют против вторичных явлений, включающих активную реакцию клеток на первичное повреждение, таким образом, дополняя существующие способы защиты. Пифитрин-альфа, фармакологический ингибитор р 53 (ключевой медиатор ответа клеток млекопитающих на облучение), является примером нового класса радиопротекторов. Однако активность ингибиторов р 53 ограничена защитой гемопоэтической системы и не оказывает защитного действия на кишечный тракт (не защищает от гастроинтестинального синдрома), что понижает лечебно-профилактическое значение этих соединений. Антиапоптические фармпрепараты с более широким спектром активности являются в высшей степени необходимыми. Индукторы NF-B можно использовать в качестве агентов, защищающих от излучения, в результате чего можно расширить диапазон приемлемых доз облучения, усиливая устойчивость человеческого организма к облучению до уровня большего, чем достигаемый с помощью доступных на сегодняшний день средств (экранирование или применение существующих биопротекторов), и значительно увеличить шансы на спасение персонала в случае ядерных аварий на предприятиях, или при широкомасштабном действии солнечных частиц высокой энергии. При том, что средний ФМД (30 дней) флагеллина больше 1,5, этот индуктор NF-B более эффективен, чем любые другие известные ныне природные соединения. Индукторы NF-B также пригодны для лечения утраты невозобновляемых клеток, вызванной излучением небольшой мощности, например, в центральной нервной системе и репродуктивных органах. Индукторы NF-B можно также применять во время химиотерапии рака для лечения побочных эффектов, связанных с химиотерапией, включая облысение. В одном из воплощений, млекопитающее подвергают терапии против действия излучения, включающей введение млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество индуктора NF-B. Композицию, содержащую индуктор NF-B, можно вводить в комбинации с одним или более радиопротектором. Одним или более радиопротектором может являться любой агент, применяемый при лечении от последствий действия излучения, включая антиоксиданты, ловушки свободных радикалов и цитокины, но не ограничиваясь указанным. Индукторы NF-B могут ингибировать апоптоз, вызванный действием излучения, повреждающего ДНК и другие клеточные структуры, однако, они не могут исправлять клеточные повреждения и предотвращать мутации. Свободные радикалы и активные формы кислорода являются главной причиной мутаций и других внутриклеточных повреждений. Антиоксиданты и ловушки свободных радикалов эффективно предотвращают повреждения, вызываемые свободными радикалами. Комбинация индуктора NFB и антиоксидантов или ловушки свободных радикалов может приводить к уменьшению силы поражения, большей выживаемости и улучшению здоровья облученных млекопитающих. Антиоксиданты и ловушки свободных радикалов, которые можно применять при практическом использовании изобретения,включают тиолы, такие как цистеин, цистеамин, глутатион и билирубин; амифостин (WR-2721); витамин А, витамин С, витамин Е; флавоноиды, такие как индийский базилик священный (Ocimum sanctum), ориентин и виценин, но не ограничиваются ими. Индукторы NF-B можно также применять в комбинации с некоторыми цитокинами и факторами роста, которые обеспечивают защиту от излучения посредством обновления и/или защиты популяций стволовых клеток, чувствительных к излучению. Защита от излучения с минимальными побочными эффектами может быть достигнута при использовании фактора стволовых клеток (SCF - stem cell ligand, ckit лиганд), Flt-3 лиганд, а также фрагмент интерлейкина-1 IL-1b-rd. Также защитный эффект наблюдается при индуцировании пролиферации стволовых клеток (все отмеченные цитокины) и предотвращении их апоптоза (SCF). Указанные виды терапии делают возможным накопление лейкоцитов и их предшественников до облучения, благодаря чему после облучения происходит более быстрое восстановление иммунной системы. SCF эффективно спасает мышей, облученных летальной дозой, причем значение ФМД- 13010291 находится в интервале 1,3-1,35. Также он эффективен при терапии гастроинтестинального синдрома. Flt3 лиганд также проявляет выраженный защитный эффект при воздействии на мышей (70-80% 30-дневное выживание при ЛД 100/30, эквивалентной ФМД 1,2) и кроликов (15, 16). Несколько факторов не цитокиновой природы стимулируют пролиферацию иммуноцитов и могут использоваться в комбинации с индукторами NF-B. 5-AED (5-androstenediol - 5-андростендиол) представляет собой стероид, стимулирующий экспрессию цитокинов и повышающий устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям. Подкожная инъекция 5-AED мышам за 24 ч до облучения повышает выживаемость с ФМД 1,26. Синтетические соединения, такие как трихлор(диоксоэтилен-O,O'-)теллурат аммония (AS-101), также позволяют индуцировать секрецию некоторых цитокинов, и их также можно использовать в комбинации с возбудителями NF-B. Факторы роста и цитокины также можно использовать для обеспечения защиты от гастроинтестинального синдрома. Фактор роста кератиноцитов (KGF - keratinocyte growth factor) способствует пролиферации и дифференциации клеток слизистой оболочки кишки, а также увеличивает выживаемость стволовых клеток в криптах кишечника после облучения. Гемопоэтические цитокины и радиопротекторы, такие как фактор стволовых клеток, также могут повышать выживаемость стволовых клеток кишечника и связанное с ней кратковременное выживание организма. Индукторы NF-B могут также предохранять как от гастроинтестинального, так и от гемопоэтического синдрома. Так как мыши, которых облучали по всему телу летальной дозой 15 Грэй, умирали в основном от гастроинтестинального синдрома, композиция, содержащая индукторы NF-B в сочетании с одним или несколькими ингибиторами гастроинтестинального синдрома может быть более эффективной. Ингибиторы гастроинтестинального синдрома, которые можно использовать при практическом осуществлении изобретения, включают цитокины, такие как фактор стволовых клеток (SCF) и фактор роста кератиноцитов (KGF), но не ограничиваются ими. Композицию, содержащую индукторы NF-B, можно вводить в любой промежуток времени до облучения, включая промежутки времени около 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16,14, 12, 10, 8, 6, 4, 3, 2 или 1 ч до облучения, но не ограничиваясь этим временем. Композицию, содержащую возбудители NF-B, можно также вводить в любой промежуток времени после облучения, включая промежутки времени около 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44,46, 48 ч после облучения, но не ограничиваясь этим временем. 3. Агенты. Настоящее изобретение также относится к агентам, индуцирующим активность NF-B. Агент может быть искусственно синтезированным или встречающимся в природе соединением. Агентами также могут быть соединения с малым молекулярным весом, полипептиды или пептиды или их фрагменты,аналоги, гомологи, варианты или производные. Агентами также могут быть цитокины, индуцирующие активность NF-B, включая IL2 (интерлейкин 2), IL6 (интерлейкин 6), TNF (фактор некроза опухоли) и TGF (трансформирующий фактор роста), но не ограничиваясь ими. Возбудителем может быть также простагландин. Агентами также могут быть факторы роста, включая KGF (фактор роста кератиноцитов) и PDGF (фактор роста тромбоцитов),но не ограничиваясь ими. Агентом может также быть антитело, индуцирующее активность NF-B. а. Флагеллин. В одном из воплощений агентом является флагеллин, который может быть получен из бактерий,включая виды рода Salmonella, такие как S. typhimurium, но не ограничиваясь ими. Как показано в примерах ниже, флагеллин обладает сильной активностью, стимулирующей выживание как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Фрагмент, вариант, аналог, гомолог или производное индуктора NF-B, такого как флагеллин, с желаемыми свойствами можно получить, основываясь на доменной структуре флагеллина. Доменная структура флагеллина Salmonella описана в литературе (фиг. 19). Флагеллин имеет консервативные домены (D1 и D2) на N-конце и С-конце и промежуточный гипервариабельный домен (D3) (Samatey, et al.,2001, Eaves-Pyles T, et al., 2001a). Результаты исследований рекомбинантого белка, содержащего Nконцевые D1 и D2, и С-концевые D1 и D2, разделенные участком белка Escherichia coli (ND12/ECH/CD2) показывают, что D1 и D2 являются биологически активными при слиянии с ЕСН элементом. Данный химерный белок, но не элемент ДНК E.coli отдельно, индуцирует деградацию IkB, активациюNF-B, а также образование NO и IL-8 (интерлейкина 8) в линиях клеток кишечного эпителия. Неконсервативный D3 домен находится на поверхности жгутиковой нити и содержит основные антигенные эпитопы. Сильная противовоспалительная активность флагеллина, скорее всего, связана с чрезвычайно консервативными N- и С-концевыми D1 и D2 доменами. б. Индукторы NF-B из паразитов. Свойства флагеллина позволяют предполагать, что у паразитических организмов можно обнаружить дополнительные модуляторы NF-B. Существуют паразиты, жизнедеятельность которых требует подавления апоптоза, поскольку они не могут выжить без клеток хозяина. Эти организмы должны быть адаптированы к эффективному выживанию в организме хозяина и выделять антиапоптотические факто- 14010291 ры. Подобно опухолям на поздних стадиях развития, эти организмы выделяют факторы, способные увеличивать их выживаемость и решать конфликт с защитными механизмами ответа хозяина на стресс. Антиапоптические факторы паразитирующих или симбиотических организмов прошли миллионы лет адаптации для сведения к минимуму ущерба организму хозяина, влияющего на его жизнеспособность. В результате, эти факторы если и требуют дополнительных модификаций, то небольших, и их можно использовать непосредственно в их природной форме или с небольшими модификациями. Такие факторы могут быть пригодными для лечения апоптоза, вызванного стрессом, например побочными эффектами, связанными с химиотерапией и лучевой терапией. Настоящее изобретение также относится к способам скрининга паразитов для выявления модуляторов NF-B. Предполагаемые модуляторы могут быть получены из паразитов человека или иных приматов. Предпочтительны внеклеточные паразиты организма-хозяина. Паразитами могут также быть симбионты. Паразиты, из которых можно выделить модуляторы по изобретению, включают Mycoplasma,Chlamydia и Salmonella, но не ограничиваются ими. Эти модуляторы можно выявить, используя методы скрининга, описанные здесь, а также способы биохимической и генетической селекции, тестирование invitro, агенты, защищающие от смерти клеток, и in vivo. 4. Композиция. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество индуктора NF-B. Композиция может быть фармацевтической композицией, которую можно получить, используя способы, хорошо известные из области техники. Как описано выше, композицию,содержащую индуктор NF-B, можно вводить млекопитающему для лечения состояний, связанных с апоптозом, включающих облучение, побочные эффекты, вызванные терапией рака, стресс и старение клеток, но не ограничивающихся ими. Композиция может также содержать дополнительные агенты,включающие радиопротекторы или лекарства для химиотерапии, но не ограничивающиеся ими. а. Применение. Композиции по изобретению можно применять любым способом, включая оральное, парентеральное, сублингвальное, подкожное, ректальное введение, введение через слизистую, локальное введение,ингаляцию, введение через рот или их комбинацию, но не ограничиваясь этим. Парентеральное введение включает внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутримышечное, интратекальное и внутрисуставное введение, но не ограничивается ими. При ветеринарном использовании композицию можно вводить в подходящей лекарственной форме, в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринары могут легко определить режим дозирования и способ введения, наиболее подходящий для данного животного. б. Состав. Композиции по изобретению могут быть представлены в форме таблеток или пастилок, составленных обычным образом. Например, таблетки и капсулы для орального применения могут содержать подходящие наполнители, включая связующие агенты, наполнители, скользящие вещества, дезинтегрирующие и увлажняющие агенты, но не ограничиваясь ими. Связующие агенты включают сироп, камедь, желатин, сорбитол, трагакант, крахмальный клейстер и поливиниллпирролидон, но не ограничиваются ими. Наполнители включают лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, фосфат кальция и сорбитол, но не ограничиваются ими. Скользящие вещества включают стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и окись кремния, но не ограничиваются ими. Дезинтегрирующие агенты включают картофельный крахмал и натриевый гликолат крахмала, но не ограничиваются ими. Увлажнители включают лаурилсульфат натрия, но не ограничиваются им. Таблетки могут быть покрыты оболочкой, как это известно из уровня техники. Композиции по изобретению могут также представлять собой жидкие лекарственные формы, включая водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры, но не ограничиваясь ими. Композиция может быть представлена в виде сухого продукта для разбавления водой или другими подходящими разбавителями перед использованием. Подобные жидкие препараты могут содержать добавки,включая суспендирующие агенты, эмульгаторы, неводные разбавители и консерванты, но не ограничиваясь ими. Суспендирующие агенты включают сироп сорбитола, метилцеллюлозу, сироп глюкозы/сахара, желатин, гидроксицеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, а также гидрогенизированные пищевые жиры, но не ограничиваются ими. Эмульгирующие агенты включают лецитин, сорбитола моноолеат и камедь, но не ограничиваются ими. Неводные разбавители включают пищевые масла, миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, масляные эфиры, пропиленгликоль и этиловый спирт, но не оканчиваются ими. Консерванты включают метил или пропил nгидроксибензоат и сорбиновую кислоту, но не ограничиваются ими. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в форме суппозиториев,которые могут содержать основу для суппозитория, включая масло кокоса или глицериды, но не ограничиваясь ими. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены в формах, пригодных для ингаляции, включающих, но не ограничивающихся указанным, суспензии, или эмульсии, которые можно- 15010291 применять в виде сухого порошка или в виде аэрозоля, и распыляющие вещества, такие как дихлордифторметан или трихлорфторметан. Композиции по изобретению могут также быть в форме составов для кожи, содержащих водные или неводные разбавители, включая кремы, мази, лосьоны, пасты, лекарственные пластыри, накладки или мембраны, но не ограничиваясь ими. Композиции по изобретению могут быть также составлены для парентерального введения, включая инъекции или продолжительную инфузию. Препараты для инъекции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных разбавителях, а также могут содержать дополнительные агенты, включая суспендирующие, стабилизирующие, диспергирующие агенты, но не ограничиваясь ими. Композиции могут быть также представлены в виде порошка для разведения с подходящим разбавителем, включая стерильную воду, не содержащую пирогенных веществ, но не ограничиваясь ей. Композиции по изобретению также могут быть в представлены форме препарата с замедленным высвобождением, который можно вводить путем имплантации или внутримышечной инъекции. Композиции могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (такими как, например, эмульсии в подходящем масле), ионообменными смолами, или в виде постепенно растворяемых производных (таких как, например, постепенно растворяемая соль). в. Дозировка. Терапевтически эффективное количество агента, необходимое для использования в разных видах терапии, изменяется в зависимости от природы состояния, которое будут лечить, продолжительности времени, в течение которого требуется индукция активности NF-B, возраста и состояния пациента, и в конечном счете определяется лечащим врачом. В основном, однако, дозы, применяемые для лечения взрослого человека, обычно находятся в диапазоне от 0,001 до, примерно 200 мг/кг в день. Доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 10 мкг/кг в день. Требуемую дозу можно вводить однократно, или за несколько раз через соответствующие интервалы времени, например, два, три, четыре или более раз в день. Множественное введение чаще более желательно или даже требуется, поскольку активность NF-B в нормальных клетках может понижаться в течение некоторого времени с момента введения индуктора. Дозировка индуктора NF-B может быть любой, включая примерно 1, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175,200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725,750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975 мкг/кг или 1 мг/кг. 5. Способы выявления. Настоящее изобретение также относится к способам выявления агентов, индуцирующих активностьNF-B. Агенты, индуцирующие активность NF-B, можно определять способом, включающим добавление предполагаемого активатора NF-B к системе экспрессии, отражающей активность NF-B, и сравнение уровня экспрессии, отражающей активность NF-B, с контролем, где активатор NF-B определяется по способности повышать уровень экспрессии в системе, отражающей активность NF-B. Предполагаемые агенты могут присутствовать в библиотеке (т.е. коллекции соединений). Такие агенты могут, например, кодироваться ДНК экспрессионных библиотек. Предполагаемые соединения могут присутствовать в кондиционированной среде или клеточном экстракте. Другие подобные агенты включают соединения, известные из уровня техники как малые молекулы, имеющие молекулярную массу менее 105 Да, предпочтительно менее 104 Да, более предпочтительно менее 103 Да. Такие предполагаемые возбудители могут быть элементами комбинированной библиотеки, которая включает синтетические агенты (например, белки), полученные в результате определенных многоступенчатых химических реакций. Любой специалист в данной области поймет, что при выполнении установленных методов можно получить различный набор таких библиотек, и элементы библиотеки подозреваемых возбудителей можно подвергать скринингу одновременно или последовательно в соответствии с описанным здесь способом. Скрининг можно проводить различными способами, включая in vitro, клеточный и in vivo анализ. Для клеточного анализа можно использовать любые клетки. Согласно данному изобретению предпочтительно использовать клетки млекопитающего, более предпочтительно - клетки человека и иных приматов. Скрининг с использованием клеточного анализа можно проводить, используя генетически модифицированные клетки опухоли, экспрессирующие суррогатные маркеры активации NF-B. Такие маркеры включают бактериальную бета-галактозидазу, бактериальную люциферазу и улучшенный зеленый флуоресцирующий белок (enhanced green fluorescent protein - EGFP), но не ограничиваются ими. Уровень экспрессии суррогатных маркеров можно измерять, используя методы, стандартные для данной области техники, включая колориметрию, люминеметрию и флуориметрию, но не ограничиваясь ими. Условия, при которых предполагаемые модуляторы добавляют в клетку, например, путем смешивания, представляют собой условия, при которых клетка может претерпеть апоптоз или сигналинг, если другие регуляторные вещества, препятствующие апоптозу или сигналингу, по существу, отсутствуют. Эффективные условия включают подходящую среду, температуру, уровень рН и присутствие кислорода,позволяющие клеткам расти, но не ограничиваются ими. Подходящей средой обычно является твердая или жидкая среда, содержащая факторы роста и источники ассимилируемого углерода, азота и фосфора,а также подходящие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины, на- 16010291 пример, это может быть эффективная среда, в которой клетку можно культивировать таким образом, что она будет способна к апоптозу или сигналингу. Например, в случае клеток млекопитающего, среда может включать среду Дульбекко-Игла, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки можно культивировать в различных контейнерах, включая флаконы для культур тканей,тестовые пробирки, микротитровальную посуду и чашки Петри, но не ограничиваясь ими. Клетки культивируют при подходящих температуре, уровне рН и содержании диоксида углерода. Такие условия культивирования также известны специалистам в данной области. Способы введения предполагаемых модуляторов в клетку включают электропорацию, микроинъекции, клеточную экспрессию (т.е. использование систем экспрессии, таких как молекулы депротеинизированных нуклеиновых кислот, рекомбинантные вирусы, ретровирусные векторы экспрессии и аденовирусная экспрессия), использование агентов для образования пары ионов, а также использование детергентов для улучшения проницаемости мембраны. Настоящее изобретение имеет множество аспектов, которые иллюстрируются приведенными ниже примерами, не ограничивают объем настоящего изобретения. Пример 1. Ускоренное развитие гастроинтестинального синдрома у мышей, обусловленное недостаточностью р 53. Основная причина смерти млекопитающих от действия ионизирующего излучения (ИИ) может быть разной в зависимости от дозы облучения. При дозах выше 9-10 Гр мыши умирают спустя 12-20 дней, в основном, от смертельного гемопоэтического синдрома/синдрома истощения костного мозга. Облученных такими дозами мышей можно спасти от смерти путем пересадки костного мозга. Животные,получившие дозу выше 15 Гр, умирали в течение 7-12 дней после облучения (т.е. до того, как они могли бы умереть от гемопоэтического синдрома - ГПС) от осложнений гастроинтестинального синдромаet al., 1994), и это наблюдение позволило нам ранее предположить, что р 53 может быть фактором, определяющим наступление смерти при облучении. В частности, мыши с недостаточной экспрессией р 53 устойчивы к дозам облучения, вызывающим смерть от ГПС (Westphal et al., 1997, Komarov et al., 1999); также можно уменьшить смертность животных дикого типа, получивших дозу гамма-излучения мощностью 6-11 Гр, посредством временного фармакологического ингибирования р 53 с помощью низкомолекулярного ингибитора р 53 пифитрина-альфа (ПФА) (Комаров и др., 1999). То, что р 53 является фактором, определяющим чувствительность тканей к генотоксическому стрессу, было далее подтверждено демонстрацией зависимости потери волос (облысения), возникающей в результате экспериментальной химиотерапии или облучения, от р 53 (Бочкарев и др., 2000). Следовательно, основываясь на полученных ранее результатах, можно предположить, что р 53 продолжает играть важную роль в развитии летального ГИС после облучения высокими дозами ИИ. Неожиданно оказалось, что дефицит р 53 делает мышей чувствительными к высоким дозам ИИ, вызывающим летальный ГИС (фиг. 11). Продолжительная пролиферация клеток в криптах эпителия с дефицитом р 53 после воздействия ИИ коррелирует с ускорением гибели поврежденных клеток крипты и быстрым разрушением ворсинок. р 53 продлевает жизнь, индуцируя блокаду роста в криптах тонкого кишечника и защищая таким образом целостность пищеварительного канала (фиг. 12). Таким образом, проапоптическая функция р 53 активизирует гемопоэтический синдром,в то время как его функция блокировки роста задерживает развитие гастроинтестинального синдрома. Кинетику клеточной популяции в тонкой кишке очень тщательно анализировали. Пролиферация клеток в эпителии пищеварительного канала ограничена криптами, где расположены стволовые клетки и ранние пролиферирующие клетки-предшественники. После нескольких делений уже дифференцированные потомки стволовых клеток поднимаются по ворсинкам и слущиваются с их кончиков. В тонком кишечнике мышей полное перемещение клеток (от пролиферативного компартмента до кончика ворсинки) обычно занимает от 3 до 5 дней (Potten 1992, Potten et al., 1997, Booth et al., 2002, Somosy et al., 2002). Хотя реакция тонкого кишечника на гамма-излучение хорошо изучена на патоморфологическом уровне,до сих пор остается неясным, что именно является причиной летального эффекта ГИС, в том числе и первопричина смерти. Смерть может наступить как прямое следствие повреждения клеток крипт эпителия и последующего оголения ворсинок, приводящего к жидкостному и электролитическому дисбалансу,бактериемии и эндотоксикозу. Помимо воспалительного и стромального откликов, дисфункция эндотелия, вероятно, является важным фактором возникновения летального исхода (Potten et al., 1997, Somosyet al., 2002). Подводя итог вышесказанному, фармакологическое торможение р 53, которое, как было показано, является весьма эффективным методом защиты от гемопоэтического синдрома, вызванного ИИ,оказывается неприменимым (если не вредным) для защиты от ГИС. Поэтому необходимо разработать альтернативные подходы для защиты эпителия тонкой кишки от действия излучения, основанные на другом механизме, например на активации NF-B и последующем ингибировании смерти клеток. Пример 2. Инфекция Salmonella активирует NF-B. Инфекция Salmonella приводит к сильной активации IKK и NF-B, а также к активации противовоспалительной генетической программы (Elewaut et al., 1999). Предыдущие исследования позволяют- 17010291 предположить, что при типичной инфекции Salmonella в культивированных клетках эпителия кишечника примерно 30-40% клеток кишечного эпителия оказываются зараженными (Valdivia et al., 1996). Здесь мы хотели бы рассмотреть вопрос о том, каким образом бактериальная инфекция приблизительно 30% клеток хозяина может увеличивать ДНК связывающую активность NF-B, до величины, эквивалентной той,которая наблюдается при активации NF-B практически во всех стволовых клетках, как это происходит при терапии TNF. Для того чтобы детально изучить этот феномен, клетки НТ 29 или инфицировали, или подвергли ложной инфекции при МИ (множественности инфекции) 50 в течение одного часа диким типом S. typhimurium, трансформированным плазмидой pFM10.1, которая кодирует зеленый флуоресцирующий белок(GFP) под промотором гена ssaH Salmonella и функционирует, только когда бактерия поразила клетку хозяина (Valdivia et al., 1997). Клетки, пораженные Salmonella, обнаруживали по экспрессии GFP, которую непосредственно выявляли флуоресцентной микроскопией. Локализацию субъединицы p65 (RelA) определяли с помощью непрямой иммунофлуоресценции кроличьих антител к р 65, выявляемых с помощью FITC-конъюгированных антител теленка. Для окрашивания ядер использовали DAPI. Как можно увидеть на фиг. 1 А, экспрессия GFP наблюдается примерно в 40% клеток. Далее мы изучили локализацию р 65 субъединицы NF-B в необработанных (ложно инфицированных) клетках и клетках, инфицированных Salmonella или стимулированных TNF (10 нг/мл). Субъединица р 65 (RelA) была локализирована в цитоплазме необработанных клеток, в то время как в клетках, инфицированныхSalmonella или TNF, субъединица р 65 (RelA) была локализована в ядрах (фиг. 1 Б). Эти результаты показывают, что инфекция Salmonella активирует экспрессию NF-B практически во всех клетках, хотя инфицированной является только небольшая часть клеток. Пример 3. Флагеллин активирует NF-B. Поскольку при инфицировании Salmonella клеток эпителия кишечника наблюдается инфицирование лишь приблизительно 30% клеток, а активация NF-B, напротив, происходит практически во всех клетках, мы предположили, что активация NF-B происходит в ответ на распознавание клетками хозяина структурных компонентов бактерий или продуктов, производимых бактериями, и не связана с процессом инвазии. Было показано, что инвазия сама по себе не требуется для активации генетической программы защиты от воспаления, как это полагали ранее (16). Для того чтобы проверить это предположение, стерильно фильтрованную культуральную жидкость S. dublin либо не подвергали обработке, либо кипятили в течение 20 мин и использовали для контрольного заражения клеток эпителия кишечника НТ 29, а затем изучали ДНК-связывающую активность NF-B к с помощью анализа задержки в геле (EMSA) целого клеточного экстракта (ЦКЭ), приготовленного по прошествии 45 мин после облучения (3, 40). В обоих случаях была обнаружена сильная активация NF-B в ответ на внесение культуральной жидкости, что показывает устойчивость активирующего фактора к нагреванию. Нативную стерильно фильтрованную концентрированную культуральную жидкость затем обрабатывали ДНКазой, рибонуклеазой, протеиназой K, или выполняли грубое фракционирование через 100 кДа фильтры Центрикон. Культуральные среды, подвергавшиеся различной обработке, затем использовали для контрольного заражения НТ 29 клеток эпителия кишечника, по прошествии 45 мин готовили ЭЦК, и затем анализировали ДНК-связывающую активность NF-B с помощью EMSA (фиг. 2 А). Прямое инфицирование НТ 29 S. typhimurium 1103 или воздействие культуральной среды, как отмечалось, индуцировало NF-B связывающую активность, причем было обнаружено, что фактор, инициирующий активность, чувствителен к расщеплению протеазами и удерживается фильтром 100 кДа (фиг. 2 А). Далее,чтобы точно установить природу активности, индуцирующей NF-B, стерильно фильтрованную концентрированную культуральную среду разделяли с помощью гель-проникающей хроматографии в геле "Супероуз 12" (Superose 12) (фиг. 2 Б) и анионообменной хроматографии (фиг. 2 В). Отбирали аликвоты хроматографических фракций и анализировали их способность активировать NF-B в клетках НТ 29, а затем анализировали с помощью анализа задержки в геле (EMSA). Как показывает окрашивание геля красителем Кумасси голубым (фиг. 2 Б, верх), возрастание ДНК-связывающей активности NF-B (фиг. 2 Б, низ,кривые 4-6) соответствует увеличению общей массы белка примерно до 55 кДа. Анионообменная хроматография на матрице POROS HQ и элюирование связанных белков с помощью возрастающего солевого градиента, как указано (фиг. 2 В), показывает, что ДНК-связывающая и индуцирующая активность NF-B соответствует хроматографическим фракциям, содержащим увеличенную до 55 кДа общую массу белка(фиг. 2 В, верх, а также не приводящиеся здесь результаты). Элюированные фракции, показанные на фиг. 2 В, концентрировали и фракционировали на препаративном 12% SDS-PAGE геле, полосы, соответствующие В 1-В 6, вырезали из геля, затем белки элюировали, осаждали, ренатурировали и использовали для стимулирования клеток НТ 29. ЭЦК из этих клеток анализировали на ДНК-связывающую и индуцирующую активность NF-B с помощью анализа задержки в геле (EMSA), и установили, что только полоса 2 (В 2), соответствующая белку с массой 55 кДа (фиг. 2 В, низ), способна активировать ДНКсвязывающую активность NF-B, в то время как буфер из конца и начала солевого градиента не обнаружил способности активировать ДНК-связывающую активность NF-B.- 18010291 Белки, соответствующие полосам В 1-В 6, и пустые области геля далее использовали для секвенирования пептидов. Обработка трипсином белковой фракции полосы В 2 и анализ с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии по методу электрораспыления с ионной ловушкой позволили идентифицировать аминокислотные последовательности двадцати одного пептида. Флагеллин (75% охват двадцатью одним пептидом) был однозначно определен как белок, индуцирующий ДНК-связывающую активность NF-В (фиг. 3). Пример 4. Флагеллин требуется для активации NF-В в клетках эпителия кишечника. Чтобы определить, действительно ли флагеллин является фактором, отвечающим за инициациюNF-В в клетках эпителия кишечника, подвергающихся непосредственной бактериальной инфекции или действию фильтрованной культуральной жидкости патогенной Salmonella, мы приготовили инфекционные бактерии, прокипятили и отфильтровали культуральную жидкость из не имеющего жгутиков штамма Е. coli DH5, патогенного штамма S. dublin 2229, изогенного мутанта S. dublin 2229 SopE-, изогенного мутанта S. dublin 2229 SopB-, двойного изогенного мутанта S. dublin 2229 SopE-/SopB-(штамм SE1SB2),штамма S. typhimurium 1103, изогенного инсерционного мутанта S. typhimurium(штамм 86) и изогенного двойного мутанта S. typhimurium 1103 fliC-/fljB-. SopE является белком, кодируемым патогенным по отношению к Salmonella бактериофагом, который вводится в клетку хозяина, действует как фактор обмена для малых Rho ГТФаз Rac1 и CdC42 и инициирует перестройку цитоскелета и окончательную активацию путей MAPK (mitogen activated protein kinase - киназа, активируемая митогенами),SAPK (stress activated protein kinase - киназа, активируемая стрессом) и NF-кВ (7, 15), в то время какSopB является белком Salmonella, который действует как инозитолфосфат фосфатаза и участвует в перестройке цитоскелета, а также стимулирует секрецию хлоридов клетками хозяина (44). Бактерии и культуральную жидкость использовали для контрольного заражения клеток НТ 29 эпителия кишечника, спустя 45 мин изготовили ЦКЭ и провели анализ ДНК-связывающей активности NF-В к с помощью EMSA. Штаммы Salmonella были способны активировать NF-В, тогда как штаммы Salmonella (мутанты fliC иfliC-/fljB-, как указано) оказались не способны продуцировать флагеллин и активировать NF-В (фиг. 4 А и Б). Штамм Е. coli DH5 не имеет жгутиков и не продуцирует флагеллин, вследствие чего он не способен активировать NF-В. В ходе многочисленных экспериментов мы также отметили, что прямое инфицирование S. dublin всегда активирует NF-В в большей степени, чем S. typhimurium, как отмечено на фиг. 4 А, тогда как культуральные жидкости обоих видов активируют NF-В практически в одинаковой степени (фиг. 4 Б). Мы полагаем, что эта разница может быть вызвана тем, что S. dublin выделяет больше флагеллина в культуральную среду по сравнению S. typhimurium при прямой инфекции, поскольку внесение флагеллина, выделенного из культуры S. dublin и S. typhimurium и эквивалентных количеств хроматографически очищенного флагеллина дает схожий профиль активации NF-В. Примечательно, что общая неспособность двойных мутантов по гену флагеллина активировать NF-В в сравнении с очень небольшой способностью к его активации, наблюдаемой у одиночного инсерционного мутанта по флагеллину фазы I(предпоследняя кривая на фиг. 4 А и Б), вероятно, является следствием очень сильно ограниченной экспрессии флагеллина фазы II (у fljB), хотя штаммы Salmonella, используемые здесь, либо генетически неспособны к смене фаз экспрессии флагеллина, либо проявляют такую способность крайне редко. Поскольку оказалось, что флагеллин необходим для активации пути NF-В при прямом инфицировании клеток эпителия кишечника, оказывается возможным, что флагеллин является также основной детерминантой других главных митогенных и активируемых стрессом путей сигналинга,активируемых при инфекции патогенным штаммом Salmonella клеток эпителия кишечника. Прямое инфицирование Salmonella клеток эпителия кишечника приводит к активации JNK (8) и также активацииNF-В посредством IKK киназного пути (3). Пример 5. Флагеллин запускает активацию активируемой митогеннами протеинкиназы (MAPK),активируемой стрессом протеинкиназы (SAPK) и путей IВ киназного (IKK) сигналинга. Клетки эпителия кишечника выступают как индикаторы инвазии поверхности просвета кишечника и осуществляют привлечение иммуноцитов-эффекторов к очагу инфекции, продуцируя хемокины, такие как интерлейкин-8 (IL-8) и белок хемоаттрактант макрофагов 1 (MCP 1), и противовоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли(TNF), интерлейкин-1 (IL-1) и интерлейкин-6 (IL-6) (1,4-6). Экспрессия этих генов исходно зависит от активности транскрипционных факторов, которые активируются в ответ на передачу сигналов через MAPK, SAPK и IKK сигнальные пути. Поскольку NF-В считается главным регулятором/активатором противовоспалительных генетических программ, мы решили исследовать эффект, который мутантный штамм Salmonella, не продуцирующий флагеллин, оказывает на активацию MAPK, SAPK и IKK путей сигналинга, и сравнить его с эффектом, наблюдаемым при инфицировании клеток эпителия кишечника диким типом Salmonella, или при воздействии на клетки эпителия кишечника очищенного флагеллина. Инфицирование клеток НТ 29 диким типом S. typhimurium приводит к активации MAPK, ERK (киназы, регулируемые внеклеточными сигналами) 12, SAPK, субъединицу р 38 и JNK (Jun N-концевая киназа), а также IKK (фиг. 5), что было показано с использованием фосфоспецифичных антител, выявляющих активацию, методом иммунноблот-анализа (ИБ), и методом антите- 19010291 ло-специфичного иммунно-киназного анализа (KA) для JNK и IKK с использованием соответствующих им субстратов cJun 1-79 и GST-IB 1-54, меченых глутатион-S-трансферазой (GST). Интересно, что стимуляция MARK имеет временную природу, причем спад активности начинается спустя 45 мин, тогда как активность р 38, JNK и IKK в течение последующего часа увеличивается. Как можно увидеть на фиг. 4, двойной мутант Salmonella fliC-/fljB- также неспособен индуцировать активность IKK и NF-B (как показано на фиг. 5). Неожиданно оказалось, что двойной мутант Salmonella fliC-/fTjB-неспособен индуцировать SAPKs p38 и JNK и активирует MARK лишь на короткое время (15 мин). Этот результат сложно интерпретировать, поскольку другие белки Salmonella, такие как SopE и SopE2, могут активировать малые ГТФазы Rac и CdC42, и эти ГТФазы Rho семейства, будучи связанными с активацией JNK и р 38(7, 8, 14, 15), как выяснилось, не работают у штамма, негативного по флагеллину. Двойной мутант Salmonella fliC-/fljB- неспособен заражать НТ 29 клетки в отличие от штамма дикого типа Salmonella, как было установлено с помощью анализа методом гентамициновой защиты/инвазии. Двойной мутант по флагеллину fliC-/fljB-продемонстрировал способность заражать НТ 29 клетки, отличающуюся на 4 порядка. Для того чтобы проверить это наблюдение, мы инфицировали клетки НТ 29 диким типом Salmonella и двойным мутантом Salmonella fliC-/fljB- (штамм 134), причем оба штамма трансформировали плазмидой pFM10.1, которая кодирует GFP под контролем промотора ssaH Salmonella и функционирует, только когда бактерия поразила клетку хозяина (10, 36). Способность дикого типа Salmonella инфицировать клетки НТ 29 была очевидной (GFP, фиг. 5 Б), тогда как мутант по флагеллину этой бактерии, как оказалось, не способен поражать клетки НТ 29, что было с очевидностью показано по отсутствию экспрессии GFP (фиг. 5 Б). Чтобы определить, достаточно ли присутствия флагеллина для того,чтобы призошла инвазия, или для этого требуются также какие-либо другие белки, продуцируемые бактериями, мы вносили очищенный флагеллин, или стерильно фильтрованную культуральную жидкость,или их комбинацию в клетки НТ 29, которые контрольно инфицировали двойным мутантом SalmonellafliC-/fljB-, а затем исследовали степень их инвазии бактериями. Ни одна из тестируемых комбинаций - ни очищенный флагеллин, ни культуральная жидкость - не способствовала инфицированию бактерий штаммом с двойной мутацией fliC-/fljB-. Предполагается, что прямая связь между генами флагеллина и эффективностью доставки системой секреции типа III белков, продуцируемых бактериями, таких какSopE и SipA, а также других Sip-белков (7, 14, 15, 45, 46), которые играют важную роль в инициировании бактериальной интернализации, отсутствует. Более того, для оценки эффективности стимулирования флагеллином локализации субъединицы р 65 (RelA) в ядрах клеток эпителия кишечника, мы провели контрольное заражение клеток НТ 29 очищенным флагеллином и исследовали локализацию субъединицы р 65 (RelA), используя непрямую иммуннофлуоресценцию, и обнаружили локализацию р 65 (RelA) в ядрах почти всех клеток (как показано на фиг. 5). Очищенный флагеллин (0,5 мкг/мл) в значительной степени активирует NF-B в клетках НТ 29, подобно тому, как это наблюдается у обработанных фактором некроза опухоли (TNF) (10 нг/мл) НТ 29 клеток, причем активация зависит от времени. Это показано в серии экспериментов (фиг. 6 А), где спустя разное время после воздействия, как указано, готовили ЭЦК и анализировали ДНК-связывающую активность NF-B с помощью EMSA. Результаты анализа MARK, SAPK и IKK путей (фиг. 6 Б) в тех же ЭЦК с использованием активационно-специфичных фосфоантител для мониторинга активации MARK и р 38 киназ и анализа JNK и IKK активности методом антитело-специфичной иммуннокиназной преципитации показывают, что активность JNK и IKK увеличивается спустя один час, в то время как активность р 38 иMARK (ERK1 и 2) достигает пика спустя 30 мин и затем начинает снижаться, достигая значительно более низкого уровня через час (как показывает фиг. 6 Б). Кривые активации MARK, SAPK и IKK сигнальных молекул ERK12, р 38, JNK и IKK в клетках эпителия кишечника в ответ на. воздействие очищенного флагеллина в значительной степени похожи на кривые активации в клетках кишечного эпителия, инфицированных диким типом Salmonella (фиг. 5 А). Из полученных данных мы заключили, что временная активация сигнальных путей (MARK, SAPK и IKK), изученная здесь, которая отражает ранние события,происходящие при инфицировании Salmonella, определяется почти исключительно распознаванием флагеллина и ответом на него со стороны клеток эпителия кишечника. Далее нам требовалось изучить влияние очищенного флагеллина и флагеллина, присутствующего в клетках Salmonella на временной характер экспрессии противовоспалительных цитокинов в клетках эпителия кишечника, для того чтобы отделить влияние флагеллина в чистом виде от других воздействий,происходящих при инфекции жгутиковыми или безжгутиковыми штаммами Salmonella. Клетки НТ 29 оставляли необработанными, стимулировали TNF (10 нг/мл), или стимулировали флагеллином (0,5 ультраграмм/мл), либо инфицировали диким типом Salmonella tuphimurium или двойным мутантом Salmonella fliC/fljB при множественности инфекции (МИ) 50. Спустя отмеченное время после обработки или инфекции, клетки НТ 29 собирали в охлажденный до 0 С фосфатный буфер и лизировали дебрис в тризоле, затем РНК очищали и использовали для получения первой нити комплементарной ДНК (см. описание эксперимента). Аликвоты кДНК использовали в полуколичественной RT-PCR с использованием специфичных праймеров для генов IL1, IL-1, IL-8, TNF, MCP1 и -актина (сведения о последовательности предоставляются по требованию), затем продукты фракционировали в агарозном геле, содер- 20010291 жащем 1,2% бромистого этидия. Экспрессия известных генов-мишеней NF-B, таких как IL-1, IL-8,TNF и МСР 1, увеличивалась в ответ на TNF или воздействие очищенным флагеллином (фиг. 6 В). Инфицирование диким типом Salmonella также приводило к активации этих генов, однако, по сравнению с результатами упомянутых выше эекспериментов, экспрессия TNF и МСР 1 была временной и возникала сразу после инфицирования. Двойной мутант Salmonella fliC-/fljB-, как оказалось, не способен индуцировать экспрессию IL-1, IL-8, TNF, однако, индуцирует экспрессию МСР 1, хотя уровни этой экспрессии ниже по сравнению с экспрессией, индуцируемой диким типом Salmonella. К тому же индуцируемая двойным мутантом экспрессия MCP 1 не была временной, а продолжалась на протяжении всего времени наблюдения (9 ч) (фиг. 6 В). В качестве внутреннего стандарта для сравнения использовался уровень экспрессии -актина. Интересно, что в ответ на все виды контрольного заражения НТ 29 клеток наблюдалась стимуляция IL-1, который не является геном-мишенью NF-B. Очевидно, двойной мутант SalmonellafliC-/fljB- может активировать другие неизвестные сигнальные пути, приводящие к экспрессии IL-1. Пример 6. Флагеллин активирует связывание NF-B с ДНК через MyD88-зависимый путь. Поскольку флагеллин, как оказалось, способен активировать требуемые для активации противовоспалительных генов сигнальные пути, и эта активность схожа с действием цитокинов, подобных TNF,которые активируют все клетки, имеющие на поверхности соответствующие функциональные рецепторы(см. фиг. 1 и 5 В, где видна локализация р 65 [RelA] в ядрах), мы решили изучить способность Tollподобных рецепторов, известных рецепторов, распознающих связанный с патогеном паттерн, активировать NF-B путь в ответ на действие флагеллина. Для того чтобы проверить это предположение, мы исследовали действие аденовируса, экспрессирующего доминантно-негативный MyD88 (аа 152-296) (47) на опосредованную флагеллином активацию NF-B в клетках НТ 29. MyD88 является адаптерным белком,утилизируемым рецептором IL-1 и всеми известными TLR, которые имеют цитоплазменные сигнальные домены, гомологичные таковым IL-1, и необходимы для немедленной активации NF-B путей. Чтобы проверить это предположение, мы сначала использовали эмбриональные мышиные фибробласты (ЭМФ) дикого типа и мутанты MyD88-/- и TLR2-/-/TLR47-/- (подарок С. Акира, Университет Осака, Япония) для уточнения роли MyD88 и для изучения потенциальной роли двух TLR при ответе на действие флагеллина или на прямое инфицирование диким типом Salmonella, и при активации NF-B (фиг. 7). Инфекция диким типом Salmonella приводила к значительной активации NF-B как у дикого типа, так и у мутантов,дефектных по TLR (полосы 2 и 15), но в ЭМФ, дефектных по MyD88, эта активация являлась несколько неполноценной (полоса 10). Контрольное инфицирование всех трех типов клеток концентрированной стерильно фильтрованной жидкостью из культуры дикого типа S. dublin или двойного изогенного мутанта SopE-/SopB- штамма SE1SB2 S. dublin приводила к активации NF-B в ЭМФ дикого типа и клетках двойных мутантов по TLR2/4, но не активировала NF-B в клетках, лишенных MyD88 (сравнение полос 11 и 12 с полосами 3, 4, 6, 7, 16 и 17). В ЭМФ дикого типа под действием очищенного флагеллина (0,5 мкг/мл) наблюдалась значительная активация NF-B, и поэтому возможность того, что в активиации NFB в этих экспериментах играют роль липополисахариды, была исключена. Исключение липополисахаридов из основных причин активации NF-B также подтверждается значительным уровнем его активации в ЭМФ, несущих двойную мутацию по TLR2/4 (полосы 16 и 17), так как TLR 2 и 4 отвечают на бактериальные липопептиды, пептидогликаны, некоторые липополисахариды, в том числе липополисахариды грамотрицательных бактерий (50-52). Стимуляция IL-1 подтвердила функциональную необходимость наличия MyD88 для передачи сигналов, опосредованных IL-1 и флагеллином. С целью далее исследовать роль TLR рецепторов в распознавании флагеллина мы проанализировали способность NF-B быть активированным при гиперэкспрессии TLR в клетках, которые обычно слабо реагируют на действие флагеллина. Выбирая клетки, которые слабо реагировали на очищенный флагеллин, подтвердили то, что сигнальные компоненты и адаптеры, которые используются в ответе на флагеллин, присутствуют в этих клетках и являются функциональными, а также то, что лимитирующим фактором, вероятно, является только рецептор, отвечающий на флагеллин. Обнаружив, что клетки HeLa и НЕК 293 Т стимулируют ДНК-связывающую активность NF-B в ответ на стимуляцию IL-1, но плохо реагируют на действие флагеллина, мы выбрали клетки НЕК 293 Т для дальнейшего использования благодаря тому, что их можно более эффективно трансфецировать. В клетках НЕК 293 Т в результате временной трансфекции достигали гиперэкспрессии генов TLR 1-9, меченных эпитопом FLAG по N-концу,(подарок Р. Меджитова, Йельский Университет и Р. Улевича, Научно-Исследовательский Институт Скриппса) (42, 43) а также репортерного гена люциферазы, управляемого 2 х-NF-B-зависимым промотором, и при этом выявили экспрессию люциферазы в ответ на воздействие флагеллина (0,5 мкг/мл) илиTNF (10 нг/мл). TLR5 был единственным представителем рецепторов группы TLR, экспрессия которого вызвала значительный ответ клеток на иммунизацию флагеллином (табл. 1). Для дальнейшего проверки того, действительно ли активация NF-B флагеллином проходит именно при участии TLR5, мы внесли в ген TLR доминантно-негативные сигнальные мутации, которые представляли собой делеции карбоксильного конца каждого из TLR до консервативного триптофана в TIR домене. Подобная мутация в рецепторе IL-1 делает его неспособным активировать NF-B (54, 55). Все- 21010291 доминантно негативные TLR вместе с клонированным с кДНК TLR5 (antisense(AS)-TLR5 - антисмысловой TLR5) клонировали в экспрессионном векторе млекопитающих pCDNA3.1 (Invitrogen). Все мутантные белки хорошо экспрессировались. Каждый вектор экспрессии доминантно-негативного TLR и пустой вектор экспрессии вместе с 2-х NF-B Luc использовали, как описано выше (3), для трансформации клеток НТ 29, которые очень хорошо реагировали на флагеллин. Трансфецированные клетки оставили необработанными, либо стимулировали TNF (10 нг/мл) или очищенным флагеллином (0,5 мкг/мл). Было обнаружено, что экспрессия доминантно-негативных TLR не влияет на экспрессию репортерных генов в ответ на стимуляцию трансфецированных TNF клеток (фиг. 8 А); однако, только экспрессия как доминантно-негативного TLR5, так и антисмысловой конструкции TLR5 приводит, соответственно,примерно к 50%-ному и 25%-ному ингибированию опосредованной флагеллином активации репортерного гена (фиг. 8 В), в то время как доминнано-негативный TLR2 также показал умеренное ингибирование экспрессии генов репортеров, вызываемой флагеллином. Эти результаты означают, что TLR5 принимает участие в распознавании флагеллина клеточной поверхностью и инициирует пути сигналинга, приводящие к активации NF-B. Влияние доминантно-негативного TLR2 на зависимую от NF-B активацию репортерного гена, возможно, является неспецифическим, поскольку его экспрессия также ингибирует опосредованную TNF активацию репортера как и экспрессия других доминантно-негативных TLR. Доминантно негативный TLR2 может также конкурировать с TLR5 за некий неизвестный белок адаптор. В любом случае, результаты, представленные на фиг. 7 показывают, что TLR2 и TLR4 не требуются для активации NF-B, опосредованной флагеллином. Пример 7. Опосредованная флагеллином активация NF-B, приводит к увеличению экспрессии генов подсемейства TLR. Стимуляция клеток эпителия кишечника S. typhimirium или очищенным флагеллином приводит к активации программы противовоспалительных генов (фиг. 6 С). Нам требовалось проверить, может ли экспрессия генов TLR также изменяться в клетках, стимулированных флагеллином. НТ 29 клетки обрабатывали очищенным флагеллином (0,5 мгк/мл) и из необработанных и обработанных клеток, через 3 ч после стимуляции выделяли тотальную фракцию РНК и использовали ее для получения первой нити комплементарной ДНК. Полуколичественную RT-PCR с использованием ген-специфичных праймеров для каждого TLR и первой нити кДНК, полученной из нестимулированных или стимулированных флагеллином клеток, использовали для генерации ДНК, которую разделяли в 1,2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Экспрессия TLR 2, 3 и 7 увеличивалась после стимуляции флагеллином (фиг. 9). Паттерн экспрессии других TLR оставался неизменным. В качестве внутреннего количественного контроля использовался -актин.TLR5 экспрессируется в клетках, не показывающих значительного ответа на флагеллин. В ходе данного исследования, а также ряда других (22, 33), было показано, что флагеллин активирует NF-B именно через TLR5. В предыдущих сообщениях не указывалось точно наличие и количественное содержание TLR в клетках, которые использовались для определения функции флагеллина (22, 33). Нам требовалось установить, уменьшается ли количество TLR5 и присутствует ли он вообще в клетках, которые показывают очень слабый ответ, или полное его отсутствие, на контрольное инфицирование флигеллином. Количество TLR5 в нескольких клеточных линиях исследовали иммунноблот-анализом (ИБА) с использованием TLR5-специфических антител и сравнивали со способностью очищенного флагеллина индуцировать ДНК-связывающую активность NF-B в ЭЦК, полученных из этих клеток. Использовали клеточные линии эпителия кишечника Т 84 и НТ 29, а также клеточную линию аденокарциномы легкого А 549, клеточную линию HeLa шейной аденокарциномы человека, клеточную линию почки человеческого эмбриона, экспрессирующую большой Т-антиген НЕК 293 Т, а также клеточную линию глиобластомыT98G. Белок TLR5 обнаружили во всех клеточных линиях, изученных с помощью иммуноблот анализа с антителами, специфичными к TLR5 (фиг. 10 А). В клетках Т 84 наблюдалось самое большое количествоTLR 5, тогда как в других клеточных линиях уровни экспрессии различались не более чем в 2 раза (фиг. 10 А). ДНК-связывающая активность NF-B в не стимулированных, стимулированных TNF и стимулированных флагелином клетках анализировали на ЭЦК, полученных из каждого типа клеток, методомEMSA (фиг. 10 В). НТ 29 и А 549 клетки сильно реагировали на стимуляцию флагеллином и TNF, тогда как HeLa, 293 Т и T98G клетки слабо (HeLa, 293T) или вовсе (T98G) не реагировали на стимуляцию флагеллином. Аутентичность комплекса NF-B и ДНК определяли, используя р 65-специфичные антитела для суперсдвига NF-B и ДНК-белкового комплекса. Интересно то, что некоторые клетки, экспрессирующие TLR5, проявляли или очень слабый ответ, или вообще никакого. Такой результат может быть следствием либо недостаточного присутствия рецепторов на плазматической мембране и внутри клетки,инактивационной или субвитальной мутации в гене TLR5 в этих клеточных линиях, либо отсутствия или небольшого количества требуемых ко-рецепторов или адапторных белков (как это имеет место в некоторых клетках для TLR4 и его корецепторов/адапторов MD2 (30, 56, 57). Интерлейкин-1 может стимулировать ДНК-связывающую активность NF-B во всех изученных клеточных линиях, из чего следует, что механизмы, передающие сигнал от MyD88 к NF-B остаются неповрежденными. Пример 8. Изолирование рекомбинантного флагеллина.- 22010291 Для того чтобы подтвердить способность рекомбинантного флагеллина индуцировать NF-B, провели тест на активность флагеллина, используя репортерные клетки, несущие NF-B-чувствительную люциферазу (Luc). Описанная конструкция содержала три NF-B-связывающих сайта из промотора Еселектина, скомбинированного с минимальным промотором Hsp70, который обычно используют для детекции NF-B. Люциферазную активность измеряли в клеточном лизате спустя 6 ч после добавления флагеллина в среду. В качестве положительного контроля использовали TNF. Результаты репрезентативного эксперимента представлены на фиг. 13 и показывают, что рекомбинантный флагеллин способен активировать NF-B. Пример 9. Флагеллин замедляет смерть мышей от ГИС, вызванного ионизирующим излучением. Как отмечено выше, флагеллин является мощным активатором NF-B и вероятно может действовать как ингибитор клеточной гибели по механизму апоптоза. Поскольку цитокины, способные индуцировать NF-B, действуют как радиопротекторы, мы проверили, может ли флагеллин также выступать в качестве радиопротектора. Мыши, все тело которых подвергают гамма-излучению дозой 15 Гр, гибнут в течение 8 дней от гастроинтестинального синдрома. Такие эксперименты представляют собой стандартную модель для изучения повреждений желудочно-кишечного (ЖК) тракта, вызванных ИИ (см. выше). Для изучения способности флагеллина защищать эпителий ЖК тракта от ИИ, мы протестировали влияние внутривенной инъекции флагеллина на динамику смертности мышей после облучения дозой 15 Гр. Мы использовали различные дозы флагеллина, каждая из которых была значительно ниже, чем наиболее высокая толерантная доза, известная из литературных источников (300 мкг/мышь, Eaves-Pyles T, et al., 2001b). Облучение производили через 4 ч после обработки. Результаты репрезентативных экспериментов приведены на фиг. 14. Как мы и ожидали, облученные контрольные мыши (которые получили раствор хлорида натрия, забуференного фосфатом) умерли спустя 5-8 дней после облучения, тогда как животные, получившие флагеллин, жили значительно дольше; причем срок, на который продлевалась их жизнь, коррелировал с дозой флагеллина. Патоморфологический анализ, проведенный на 7 день после облучения, выявил значительную разницу между тонким кишечником мышей, обработанных флагеллином, и мышей из контрольной группы (фиг. 15). Внутривенные, интраперитонеальные и подкожные инъекции 0,2 мг/кг флагеллина, за которыми следовало облучение дозой 13 Гр, подобным образом увеличивали время жизни примерно 85-90% мышей на 30 дней (данные не приводятся). Эксперименты проводили, в целом, также,как и эксперименты с оптимальной дозой, описанные выше, но использовали дозу облучения 13 Гр и изменяли способы введения. Пример 10. Флагеллин предотвращает смерть мышей от гемопоэтического синдрома, вызванного ионизирующим излучением. Далее мы изучали влияние флагеллина на смерть мышей от гемопоэтического синдрома, вызванного ИИ, который экспериментально индуцировали с помощью низких доз излучения (обычно до 11 Гр),которые не способны вызвать смертельный ГИС. Эксперименты проводили так же, как и описанные выше (фиг. 14 и 15), однако, вместо дозы 15 Гр мыши получили дозу 10 Гр, вызвавшую 100% летальный исход в контрольной группе к 13 дню (фиг. 16). Группа, которой вводили флагеллин (5 мкг/мышь), оказалась полностью защищенной от такой дозы ИИ, что доказывает, что флагеллин защищает от действия излучения, предохраняя не только от гастроинтестинального, но и гемопоэтического синдромов, вызываемых ИИ. Пример 11. Зависимость защитного действия флагеллина от времени. Для того чтобы установить, как радиопротективная активность флагеллина зависит от времени воздействия, мышам инъецировали флагеллин за разные промежутки времени до воздействия гаммаизлучением дозой 13 Гр. Результаты одного из таких экспериментов приведены на фиг 17. Эти результаты показывают, что флагеллин оказывает эффективное радиопротективное действие, предохраняя от излучения дозой 13 Гр, если его вводить за 1-4 ч до облучения, но не является эффективным, если его вводить за 24 ч до облучения. Для того чтобы установить зависимость радиопротективной активности флагеллина от времени,мышей подвергали инъекции в различные промежутки времени относительно момента гамма-облучения. Эксперименты проводили согласно описанному выше, проводя внутрибрюшинную инъекцию CBLB-501 в количестве 5 мкг/мышь (0,2 мг/кг), а мышам контрольной группы инъецировали бактериальную РНК полимеразы в количестве 5 мкг/мышь (0,2 мг/кг). Эксперименты проводили с линией мышей NIh-Swiss. Результаты этих экспериментов демонстрируют, что флагеллин-501 обеспечивает выживание 90% животных после облучения дозой 13 Гр, если вводить флагеллин за 1 или 2 ч до облучения (фиг. 17). Для ясности приведен только график, соответствующий 1 ч до облучения, однако, мыши, которым проводили инъекцию за 2 ч до облучения, демонстрировали такую же степень и динамику выживания. При введении флагеллина за 4 ч до облучения защитный эффект проявляется в несколько меньшей степени. Флагеллин, введенный за 24 ч до облучения, не оказывает защитного эффекта при облучении дозой 13 Гр,вызывающей смерть. Интересно, что введение флагеллина за 24 ч до воздействия гамма-излучением дозой 10 Гр обеспе- 23010291 чивает 100% защиту. В то время как облучение мышей дозой 13 Гр вызывает смерть от ГИС, смерть, вызываемая облучением дозой 10 Гр, обусловлена гемопоэтическим синдромом. Соответственно, такая длительная защита от облучения дозой 10 Гр может быть обусловлена усиленной пролиферацией или выживанием кроветворных стволовых клеток, индуцированными флагеллином и/или долгоживущими вторичными цитокинами. Пример 12. Определение летальной дозы 50/30, детальной дозы 50/7 и фактора модулирования дозы для флагеллина. Мы произвели оценку способности флагеллина защищать от облучения в зависимости от дозы. Как показано выше (фиг. 17), обработка флагеллином была достаточной, чтобы обеспечить 100% защиту от действия гамма-излучением дозой 10 Гр (такая доза вызывает смерть от гемопоэтического синдрома) и выживание в течение 30 дней в 90% случаев при получении дозы 13 Гр (гемопоэтические и гастроинтестинальный синдром). Эксперименты выполняли, как описано выше, используя дозу флагеллина 5 мкг/мышь (0,2 мг/кг), вводящуюся внутрибрюшинно за 1 ч до облучения. Тем не менее, при облучении дозой 15 Гр за 7-дневным выживанием последовала смерть, и к 13 дню 100% животных были мертвы (30-дневное выживание в 0% случаев), тогда как в контрольной группе в течение 7 дней все мыши погибли от гастроинтестинального синдрома (фиг. 18). Кинетика смертности группы, обработанной CBLB-501 после облучения дозой 15 Гр, напоминает кинетику смертности контрольной группы, получившей дозу 10 Гр, из чего можно сделать вывод, что причиной смерти был гемопоэтический синдром. Исходя из представленных результатов, можно заключить, что смертельная доза 50/30 для флагеллина составляет около 13,5-14 Гр и фактор модулирования дозы 30 составляет около 1,75-1,8. Такой уровень радиопротекции существенно выше, чем известные для любых других природных соединений уровни. ТаблицаTLR5 демонстрирует ответ на флагеллин и активирует NF-B Клетки 293 Т трансфецировали пустым вектором (pCDNA3.1) или индивидуально перечисленными аллелями дикого типа TLR трижды на 6-луночном планшете (1 мкг/мл). Репортерная активность NF-B была отрегулирована нормализацией экспрессии до контрольного уровня активности люциферазы Ренилла, и кратность индуцирования рассчитывалась как отношение активности гена-репортера в обработанных клетках к активности гена-репортера в нестимулированных клетках (но - не определено). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ защиты млекопитающего от радиации, который включает введение млекопитающему,нуждающемуся в такой защите, композиции, которая содержит флагеллин. 2. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят радиопротектор. 3. Способ по п.2, где указанный радиопротектор представляет собой антиоксидант. 4. Способ по п.3, где указанный антиоксидант выбран из группы, состоящей из амифостина и витамина Е. 5. Способ по п.2, где указанный радиопротектор представляет собой цитокин. 6. Способ по п.5, где указанный цитокин представляет собой фактор стволовых клеток. 7. Способ по п.1, где указанную композицию вводят до, после или одновременно с воздействием радиации. 8. Способ по п.1, где радиация представляет собой ионизирующее излучение. 9. Способ по п.8, где радиация индуцирует гастроинтестинальный синдром или гематопоэтический синдром. 10. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят фактор роста. 11. Способ по п.10, где фактор роста представляет собой фактор роста кератиноцитов. 12. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят стероид.- 24010291 13. Способ по п.12, где стероид представляет собой 5-андростендиол. 14. Способ по п.1, где млекопитающему дополнительно вводят аммония трихлор(диоксоэтиленO,O')теллурат. 15. Способ по любому из пп.1-14, где млекопитающее представляет собой человека. 16. Способ по п.1, где указанный флагеллин содержит последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична областям D1 и D2 флагеллина. 17. Способ по п.16, где млекопитающему дополнительно вводят радиопротектор. 18. Способ по п.16, где флагеллин получен из бактерий Salmonella.