Полипептид нейбластина, способы его получения и применения

009771 Область изобретения Изобретение, в общем, относится к полипептидам и более конкретно к модифицированным нейротрофическим полипептидам и способам применения указанных модифицированных полипептидов. Предпосылки изобретения Нейротрофические факторы являются белками природного происхождения, которые повышают жизнеспособность, поддерживают фенотипическую дифференцировку, предотвращают дегенерацию и повышают активность нервных клеток и тканей. Нейротрофические факторы выделяют из нервной ткани и из ненервной ткани, которая иннервирована нервной системой, и подразделяют на функционально и структурно родственные группы, также называемые семействами, суперсемействами или подсемействами. Среди суперсемейств нейротрофических факторов имеются суперсемейства фактора роста фибробластов, нейротрофина и трансформирующего фактора роста(TGF-). Отдельные виды нейротрофических факторов различаются по своей физической структуре, их взаимодействию с родственными им рецепторами и их воздействиям на различные типы нервных клеток. К суперсемейству TGF- относят лиганды, подобные нейротрофическому фактору, полученному из линии глиальных клеток, (GDNF), которые включают GDNF, персефин (PSP) и нейртурин (NTN). Лиганды подсемейства GDNF обладают общей способностью индуцировать передачу сигнала посредством тирозинкиназы рецептора RET. Три указанных лиганда подсемейства GDNF отличаются по их относительным аффиностям в отношении семейства нейротрофических рецепторов, рецепторов GFR. Недавно описанным нейротрофическим фактором является нейбластин или NBN. Нейбластин относят к подсемейству GDNF, поскольку он имеет общие области гомологии с другими GDNFлигандами и по его способности связываться и активировать RET. В отличие от других GDNF-лигандов нейбластин высоко избирателен в отношении комплекса GFR3-рецептор RET. Кроме того, NBN содержит уникальные подобласти в своей аминокислотной последовательности. К сожалению нейбластин подвергается быстрому клиренсу в организме. Указанный быстрый клиренс может препятствовать использованию нейбластина в терапевтических применениях. Таким образом, существует необходимость в идентификации вариантов нейбластина, которые имеют повышенную биодоступность. Сущность изобретения Данное изобретение частично основано на открытии новых форм нейбластина, которые проявляют повышенные фармакокинетические свойства и биодоступность in vivo. Указанные новые формы включают вариантные полипептиды нейбластина, конъюгированные с полимерными молекулами. В одном аспекте отличительным признаком изобретения является вариантный полипептид нейбластина или мутеин полипептида нейбластина, который содержит аминокислотную последовательность,имеющую одну или несколько аминокислотных замен в положениях зрелого димера нейбластина, экспонируемых в растворитель. Данные замены вводят в нативный полипептид нейбластина один или несколько сайтов, в которых с полипептидом могут быть связаны такие вещества, как имеющие природное происхождение или синтетические полимеры, для того, чтобы увеличить его растворимость и, следовательно, его биодоступность in vivo. Предпочтительно данные вариантные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. Вариантный полипептид нейбластина включает одну или несколько аминокислотных замен, при которых в положении 14 в аминокислотной последовательности вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аргинина, в положении 39 аминокислотной последовательности вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аргинина, в положении 68 вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аргинина или в положении 95 вариантного полипептида находится аминокислота, отличная от аспарагина, в том случае, когда положения аминокислот пронумерованы в соответствии с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1. В используемом в данном описании смысле нейбластин дикого типа или wt-NBN относится к имеющей природное происхождение или нативной последовательности полипептида нейбластина, такого как нейбластин крысы, мыши или человека (см., например, SEQ ID NO: 2, 3 или 4). Конкретные вариантные полипептиды нейбластина названы в данном описании NBN-X1N1X2 или X1N1X2-NBN, гдеX1 относится к аминокислоте полипептида нейбластина дикого типа, N1 относится к номеру положения аминокислоты X1 в последовательности, которое нумеруется в соответствии с SEQ ID NO: 1. Х 2 относится к аминокислоте, заменяющей аминокислоту дикого типа в указанном пронумерованном положении в последовательности. Таким образом, например, NBN-N95K означает вариантные полипептиды нейбластина, в которых аспарагин в положении 95 заменен лизином. Вариантный полипептид нейбластина может быть получен в виде мультимерного полипептида. Например, вариантный полипептид нейбластина может быть получен в виде димера, который содержит по меньшей мере один вариантный полипептид нейбластина. В некоторых случаях димер является гомодимером вариантного полипептида нейбластина. В других случаях димер является гетеродимером, который содержит один вариантный полипептид нейбластина и один полипептид нейбластина дикого типа. Другие димеры могут содержать две разные вариантные формы полипептида нейбластина.-1 009771 В некоторых вариантах вариантный полипептид нейбластина кроме аминокислот 8-113 содержит аминокислоты 1-7 SEQ ID NO: 1. В предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации связываетGFR3. В дополнительных предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации стимулирует фосфорилирование тирозина полипептида RET, либо сам по себе, либо в случае связывания с GFR3. В других предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации повышает жизнеспособность нейрона, например, повышает жизнеспособность чувствительного нейрона. В других предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации нормализует патологические изменения нейрона, такого как чувствительный нейрон. В следующих предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина при димеризации повышает жизнеспособность нейрона, например автономного нейрона или допаминэргического нейрона. В некоторых вариантах вариантный полипептид содержит две, три или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 14 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 39 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 68 вариантного полипептида и аминокислоты, отличной от аспарагина, в положении 95 вариантного полипептида. В предпочтительных вариантах аминокислотой в одном или нескольких положениях 14, 39, 68 и 95 является лизин. Предпочтительно аминокислоты 8-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотам 8-94 и 96-113 SEQ ID NO: 1. Более предпочтительно последовательности аминокислот идентичны по меньшей мере на 95%. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность вариантного полипептида нейбластина содержит аминокислотную последовательность полипептида нейбластина крысы, человека или мыши природного происхождения в положениях аминокислот 8-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина. Например, аминокислоты 8-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина могут содержать аминокислотную последовательность аминокислот 8-94 и 96-113 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Также изобретение относится к слитому белку или полипептиду, который включает в себя вариантный полипептид нейбластина или полипептид нейбластина дикого типа, или белку, который является димером двух слитых белков нейбластина. Слитые белки нейбластина также обладают усиленными фармакокинетическими свойствами и повышенной биодоступностью in vivo. В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид нейбластина. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариантный полипептид нейбластина,предпочтительно приготовлена в векторе, например в экспрессирующем векторе. Нуклеиновая кислота вариантного нейбластина или содержащий ее вектор могут быть предоставлены в клетке. Клетка может представлять собой, например, клетку млекопитающего, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку насекомого или бактериальную клетку. Предпочтительной клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка (клетка СНО). Изобретение также относится к способу получения вариантного полипептида нейбластина посредством культивирования клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариантный нейбластин, в условиях, обеспечивающих экспрессию вариантного полипептида нейбластина. При желании вариантный полипептид нейбластина затем можно извлечь. Изобретение, кроме того, включает вариантный полипептид нейбластина, продуцируемый клеткой. Сходные нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы получения полипептидов представлены в данном описании для слитых белков (таких как слитые белки нейбластин-сывороточный альбумин) согласно данному изобретению. Изобретение также относится к композиции, которая содержит полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полимером неприродного происхождения. Вариантный полипептид нейбластина в композиции предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, при условии, что вариантный полипептид нейбластина содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 14 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 39 аминокислотной последовательности вариантного полипептида, аминокислоты, отличной от аргинина, в положении 68 вариантного полипептида и аминокислоты, отличной от аспарагина, в положении 95 вариантного полипептида, при этом положения аминокислот пронумерованы в соответствии с полипептидной последовательностью SEQ ID NO: 1. В предпочтительных вариантах полимер содержит компонент, представленный полиалкиленгликолем, например полиэтиленгликолевый компонент (ПЭГ). В предпочтительных вариантах полиалкиленгликолевый компонент связан с аминогруппой полипептида нейбластина или лизином в вариантном полипептиде нейбластина.-2 009771 Связывание может осуществляться посредством активированного сложного эфира Nгидроксилсукцинимида (NHS). Активированный сложный эфир может представлять собой, например,сукцинимидилсукцинат (SS-ПЭГ), сукцинимидилбутират (SPB-ПЭГ) или сукцинимидилпропионат (SPAПЭГ) ПЭГ. Полиалкиленгликолевый компонент может, например, представлять собой карбоксиметил-NHS,норлейцин-NHS, SC-ПЭГ, трезилат, альдегид, эпоксид, карбонилимидазол или карбонат PNP. В некоторых вариантах полиалкиленгликолевый компонент связан с группой цистеина полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Например, связывание может осуществляться с помощью малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы и тиольной группы. В некоторых вариантах полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина в композиции гликозилирован. В том случае, когда полипептид нейбластина или вариантный полипептид гликозилирован, полимер может быть связан с углеводным компонентом гликозилированного полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Например, полимер может быть связан с гликозилированным полипептидом нейбластина или вариантным полипептидом нейбластина после окисления группы гидразола или аминогруппы гликозилированного полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, или окисления реакционноспособной группы полимера. В различных вариантах полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина содержит один, два, три или четыре ПЭГ-компонента. В предпочтительных вариантах полипептид нейбластина, вариантный полипептид нейбластина или конъюгат с полимером имеет более продолжительное время полужизни в сыворотке по сравнению со временем полужизни полипептида или вариантного полипептида в отсутствии полимера. В предпочтительных вариантах полипептид нейбластина, вариантный полипептид нейбластина или конъюгат с полимером в комплексе обладает физиологической активностью, выбранной из группы, состоящей из связывания GFR3, активации RET, нормализации патологических изменений нейрона или повышения жизнеспособности нейрона. Под нормализацией патологических изменений нейрона имеют в виду, что данный конъюгат индуцирует изменение одного или нескольких из следующих параметров клетки: уровня экспрессии структурного белка, рецептора нейротрофического фактора, ионного канала или нейромедиатора, или индуцирует изменение морфологии клетки, в каждом случае так, что в значительной степени восстанавливает такой параметр до его уровня в нейроне такого же или сходного фенотипа, который не затронут заболеванием, дегенерацией, инсультом или повреждением. Нормализацию патологических изменений нейрона можно контролировать иммуногистохимически или путем оценки изменений уровней секретируемых или выделяемых клеточных продуктов, или с помощью оценки изменений in vivo в проявлении, физиологически присущем функции пораженного нейрона(нов). Например, в случае патологических изменений, связанных с синдромом невропатической боли, контролируют такие проявления боли, как гиперальгезию, гипоальгезию или аллодинию. Под повышенной жизнеспособностью нейрона имеют в виду продленное выживание пораженного нейрона свыше периода жизнеспособности, наблюдаемого в соответствующем нейроне, пораженном тем же типом заболевания, расстройства, инсульта или повреждения, но не обработанном конъюгатом нейбластина или слитым белком согласно изобретению. В некоторых вариантах полимер связан с полипептидом в сайте нейбластина, который является Nконцом. В некоторых вариантах полимер связан с полипептидом в сайте в неконцевой аминокислоте полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. В предпочтительных вариантах полимер связан с аминокислотой полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, экспонируемой в растворитель. В предпочтительных вариантах полимер связан с полипептидом нейбластина или вариантным полипептидом нейбластина у остатка, выбранного из группы, состоящей из аминоконцевой аминокислоты вариантного полипептида, положения 14 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, положения 39 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, положения 68 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина и положения 95 в аминокислотной последовательности полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый наполнитель, содержащий или имеющий диспергированный в нем полипептид нейбластина,вариантный полипептид нейбластина или конъюгат согласно данному изобретению. В следующем аспекте изобретение включает стабильный водорастворимый конъюгированный комплекс полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, содержащий полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полиэтиленгликолевым компонентом, в котором полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина связан с полиэтиленгликолевым компонентом с помощью лабильной связи. В некоторых вариантах лабильная связь расщеп-3 009771 ляется при биохимическом гидролизе, протеолизе или сульфгидрильном расщеплении. В предпочтительных вариантах лабильная связь расщепляется в условиях in vivo. Изобретение также относится к способу получения модифицированного полипептида нейбластина,который обладает пролонгированной активностью in vitro или in vivo по сравнению с нейбластином дикого типа, путем приготовления полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина и связывания полипептида или модифицированного вариантного полипептида нейбластина с полимерным компонентом неприродного происхождения с образованием таким образом композиции полипептида нейбластина, связанного с полимером. В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения или профилактики нарушения нервной системы у субъекта (такого как человек) с помощью введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества вариантного полипептида нейбластина, композиции, содержащей полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полимером, или комплекса, который включает в себя стабильный водорастворимый конъюгированный комплекс полипептида нейбластина или вариантного полипептида, содержащий полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полиэтиленгликолевым компонентом. Предпочтительно расстройством нервной системы является расстройство периферической нервной системы, такое как периферическая невропатия или синдром невропатической боли. Предпочтительными субъектами для лечения являются люди. Введение может быть, например, системным или локальным. Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании,имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Хотя на практике или при тестировании данного изобретения можно использовать способы и вещества, подобные или эквивалентные приведенным в данном описании, подходящие способы и вещества описаны ниже. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие источники информации, упоминаемые в данном описании, включены в виде ссылки в полном объеме. В случае конфликтной ситуации данное описание, включая определения, будет проверено. Кроме того,материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не рассматриваются как ограничивающие. Другие отличительные признаки и преимущества изобретения станут понятными из следующего подробного описания и формулы изобретения. Подробное описание изобретения Изобретение относится к новым вариантным полипептидам нейбластина, которые могут быть модифицированы для того, чтобы усилить их фармакокинетические свойства и повысить биодоступность. Предпочтительные вариантные полипептиды нейбластина имеют измененные аминокислотные последовательности, которые облегчают связывание с полимерным агентом, таким как полимер полиалкиленгликоля. Вариантные полипептиды нейбластина Изобретение относится к полипептидам нейбластина, которые имеют вариантные аминокислотные последовательности по сравнению с последовательностью полипептида нейбластина дикого типа. Аминокислотные последовательности полипептидов нейбластина человека и мыши описаны в WO 00/01815. Примеры вариантных полипептидов нейбластина согласно изобретению представлены в табл. 1. Предпочтительно измененные остатки в вариантном полипептиде нейбластина выбраны для обеспечения связывания полимера, такого как полимер полиалкиленгликоля, в положении модифицированной аминокислоты. Предпочтительными сайтами модификации полипептида нейбластина являются сайты в доступных для растворителя областях полипептида нейбластина. Такие сайты можно выбрать на основе просмотра кристаллической структуры родственного нейротрофического фактора, GDNF, кристаллическая структура которого описана в Nat. Struct. Biol. 4: 435-38, 1997. Сайты также можно выбрать на основе структурно-функциональной информации, полученной для химерных белков персефин/нейбластин. Указанные химеры описаны в J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000. Примерный список доступных для растворителя или экспонированных на поверхности аминокислот нейбластина, идентифицированных с помощью указанной методики, указан в табл. 2. Изобретение включает вариантный полипептид нейбластина, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1,которая показана в табл. 1. В некоторых вариантах один или несколько аргининов в положении 14, положении 39, положении 68 или аспарагин в положении 95 аминокислотной последовательности полипептида заменяют аминокислотой, отличной от аргинина или аспарагина. Предпочтительно аминокислоту дикого типа заменяют лизином или цистеином. В табл. 2 представлен список остатков и их номера в нейбластине человека, которые предположительно являются экспонируемыми на поверхности. Экспонируемые на поверхности остатки определяли с помощью оценки структуры димера GDNF крысы, образованного цепями А и В (PDB код 1AGQ), и определения того, присутствует ли остаток на поверхности структуры. Затем данную структуру сравнивали с выравниванием последовательностей GDNF и нейбластина в Baloh et al., Neuron, vol. 21, p. 1291, 1998,чтобы определить подходящие остатки в нейбластине. Схема нумерации представляет собой схему, показанную в табл. 1. н/а указывает, что остатки не присутствуют в структуре GDNF. Это происходит либо-6 009771 вследствие дизайна конструкции, гибких областей, либо вставок в нейбластине по сравнению с GDNF- указывает, что остатки скрыты и не расположены на поверхности или являются остатками цистеина, вовлеченными в дисульфидные связи. Так как данный белок является цистеиновым узлом, огромное множество остатков расположено на поверхности.+ указывает, что данный остаток в структуре GDNF экспонирован на поверхности, и таким образом предположительно экспонирован на поверхности нейбластина, хотя петля, содержащая остатки 66-75,наблюдается только в одном из мономеров GDNF (предположительно гибком). Указанная петля также содержит вставку из 4 остатков в нейбластине по сравнению с GDNF. В используемом в данном описании смысле термины идентичность, или гомологичный, или гомология используются взаимозаменяемо и относятся к сходству последовательностей между двумя полипептидами, молекулами или между двумя нуклеиновыми кислотами. В том случае, когда положение в обеих сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или мономерной аминокислотной субъединицей (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы являются гомологичными по данному положению. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, имеющихся в двух последовательностях, разделенного на количество сравниваемых положений 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT обладают 50% гомологией (3 из общего количества 6 положений совпадают). Обычно сравнение выполняют в том случае, когда две последовательности выравнивают, чтобы получить максимальную гомологию. Такое выравнивание можно осуществить, используя, например, способ Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443-453(1970), для удобства выполняемый с помощью компьютерных программ, таких как программа Align(DNAstar, Inc.). Сходными последовательностями являются последовательности, которые при выравнивании имеют идентичные или сходные аминокислотные остатки, где сходные остатки являются консервативными заменами или допустимыми точечными мутациями соответствующих аминокислотных остатков в выровненной эталонной последовательности. В этом отношении консервативная замена остатка в эталонной последовательности является заменой остатком, который физически или функционально сходен с соответствующим эталонным остатком, например, который имеет сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или тому подобное. Таким образом, вариантной последовательностью с консервативными заменами является последовательность, которая отличается от эталонной последовательности или последовательности дикого типа тем, что в ней присутствует одна или несколько консервативных замен или допустимых точечных мутаций. В предпочтительных вариантах полипептид согласно изобретению на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичен аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах аминокислотная последовательность вариантного полипептида нейбластина содержит последовательность аминокислот полипептида нейбластина крысы, человека или мыши природного происхождения в положениях аминокислот 1-94 и 96-113 вариантного полипептида нейбластина, например, полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3 или 4 в указанных положениях. Вариантный полипептид нейбластина, отличающийся по последовательности от полипептидов,описанных в SEQ ID NO: 1-4, может содержать одну или несколько консервативных аминокислотных замен. Альтернативно или дополнительно вариантный полипептид нейбластина может отличаться одной или несколькими неконсервативными аминокислотными заменами, или делециями, или инсерциями. Предпочтительно замены, инсерции или делеции не нарушают биологическую активность выделенного белка. Консервативные замены обычно включают замену одной кислоты другой со сходными характеристиками, такие как замены в пределах следующих групп: валин, аланин и глицин; лейцин, валин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин, цистеин и треонин; лизин и аргинин; и фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Любую замену одного представителя указанной выше групп полярных, основных или кислых аминокислот другим представителем той же группы можно считать консервативной заменой. Другие замены легко могут идентифицировать специалисты в данной области. Например, в случае аминокислоты аланина замена может быть выбрана из любой замены D-аланином, глицином, бетааланином, L-цистеином и D-цистеином. В случае лизина заменой может быть любая из аминокислот: Dлизин, аргинин, D-аргинин, гомо-аргинин, метионин, D-метионин, орнитин или D-орнитин. Как правило,заменами в функционально важных областях, которые предположительно могут индуцировать измене-7 009771 ния свойств изолированных полипептидов, являются замены, при которых: (i) полярный остаток, например, серин или треонин, заменяет гидрофобный остаток, например, лейцин, изолейцин, фенилаланин или аланин (или заменяется ими); (ii) остаток цистеина заменяет любой другой остаток (или заменяется им);(iii) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизин, аргинин или гистидин,заменяет остаток, имеющий электроотрицательную боковую цепь, например, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту (или заменяется ими); или (iv) остаток, имеющий большую боковую цепь, например, фенилаланин, заменяет остаток, не имеющий такой боковой цепи, например, глицин (или заменяется им). Вероятность того, что одна из вышеуказанных неконсервативных замен может изменить функциональные свойства белка, также коррелирует с положением замены по отношению к функционально важным областям белка, следовательно, некоторые неконсервативные замены могут оказывать небольшое или не оказывать влияния на биологические свойства. Изобретение также относится к мультимерным полипептидам, которые содержат вариантный полипептид нейбластина. Мультимерные полипептиды предпочтительно готовят в виде очищенных мультимерных полипептидов. Примеры мультимерных комплексов включают, например, димерные комплексы. Мультимерный комплекс можно получить в виде гетеромерного или гомомерного комплекса. Таким образом, мультимерный комплекс может быть гетеродимерным комплексом, включающим один вариантный полипептид нейбластина и один невариантный нейбластин, или гетеродимерным комплексом,включающим два или более вариантных полипептидов нейбластина. В некоторых вариантах вариантный полипептид нейбластина связывает GFR3. Предпочтительно связывание вариантного полипептида нейбластина стимулирует фосфорилирование полипептида RET. Чтобы определить, связывает ли полипептид GFR3, можно провести анализ, как описано вWO 00/01815. Например, присутствие нейбластина в среде в надосадках линии клеток СНО можно описать с использованием модифицированной формы анализа тройного комплекса, описанного Sanicola et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238). В данном анализе можно оценить GDNF-подобные молекулы в отношении их способности опосредовать связывание между внеклеточным доменом RET и различными корецепторами, GFR1, GFR2 и GFR3. Растворимые формы RET и корецепторы создают в виде слитых белков. Описан слитый белок между внеклеточным доменом RET крысы и плацентарной щелочной фосфатазой (RET-AP) и слитый белок между внеклеточным доменом GFR-1 крысы (описан в опубликованной заявке WO 9744356; 27 ноября 1997, включенной в данное описание в виде ссылки) и Fcдоменом IgG1 человека (rGFR (1-Ig) (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238. В некоторых вариантах вариантный полипептид нейбластина повышает жизнеспособность нейрона или нормализует патологические изменения нейрона или и то, и другое. Анализы для определения того,повышает ли полипептид жизнеспособность нейрона или нормализует патологические изменения нейрона, описаны, например, в WO 00/01815. Предпочтительно нейрон является чувствительным нейроном,автономным нейроном или допаминэргическим нейроном. Синтез и выделение вариантных полипептидов нейбластина Вариантные полипептиды нейбластина можно выделить, используя способы, известные в данной области. Полипептиды нейбластина природного происхождения можно выделить из клеток или тканевых источников согласно подходящей схеме очистки с использованием стандартных способов очистки белка. Альтернативно вариантные полипептиды нейбластина можно синтезировать химически, используя стандартные способы синтеза пептидов. Синтез коротких аминокислотных последовательностей хорошо разработан в области пептидов. См., например, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2d ed., 1984). В другом варианте вариантные полипептиды нейбластина получают способами на основе рекомбинантной ДНК. Например, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вариантный полипептид нейбластина, можно встроить в вектор, например, экспрессирующий вектор, и нуклеиновую кислоту можно ввести в клетку. Подходящие клетки включают, например, клетки млекопитающих (такие как клетки человека или клетки яичника китайского хомячка), клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки насекомых и бактериальные клетки. При экспрессии в рекомбинантной клетке клетку предпочтительно культивируют в условиях, обеспечивающих экспрессию вариантного полипептида нейбластина. Вариантный полипептид нейбластина при желании можно извлечь из клеточной суспензии. Термин извлечь означает,что вариантный полипептид удаляют из тех компонентов клетки или культуральной среды, в которых он присутствует до извлечения. Способ извлечения может включать одну или несколько стадий свертывания белка или очистки. Вариантные полипептиды нейбластина можно сконструировать, используя любой из нескольких способов, известных в данной области. Одним из таких способов является сайт-специфичный мутагенез,при котором изменяют конкретный нуклеотид (или при желании небольшое количество конкретных нуклеотидов) для того, чтобы изменить одну аминокислоту (или при желании небольшое количество предварительно определенных аминокислотных остатков) в кодируемом полипептиде нейбластина. Специалистам в данной области понятно, что сайт-специфичный мутагенез является обычным и широко используемым способом. В действительности многие наборы для сайт-специфичного мутагенеза коммер-8 009771 чески доступны. Одним из таких наборов является набор для трансформирующего сайт-специфичного мутагенеза, продаваемый Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.). При осуществлении данного изобретения на практике, если не оговорено особо, будут использованы обычные способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белков и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие способы описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning,Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; патент США 4683195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Haines and S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed).Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Вариантные слитые белки нейбластина При необходимости вариантный полипептид нейбластина можно приготовить в виде слитого белка. Слитые полипептидные производные белков согласно изобретению также содержат различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. В используемом в данном описании смысле слияние относится к колинеарной ковалентной связи двух или более белков или их фрагментов между их отдельными пептидными остовами, наиболее предпочтительно посредством генетической экспрессии молекулы полинуклеотида, кодирующей данные белки в одной и той же рамке считывания (т.е. в рамке). Предпочтительно, чтобы белки или их фрагменты были из разных источников. Таким образом, предпочтительные слитые белки включают вариантный белок нейбластина или фрагмент, ковалентно связанный со вторым компонентом, который не является вариантным нейбластином. Предпочтительно второй компонент получают из полипептида, который существует в виде мономера и достаточен для того, чтобы придать свойства повышенной растворимости и/или биодоступности полипептиду нейбластина. Например, слияние вариантный нейбластин/сывороточный альбумин человека является белком,содержащим вариантный полипептид нейбластина согласно изобретению или его фрагмент, N-конец или С-конец которого связан в рамке с полипептидом сывороточного альбумина человека (см. Syed et al.,Blood, 1997, 89: 3243 и Yeh et al., P.N.A.S. USA 1992, 89: 1904) и патенты США 5876969 и 5302697. Термин слитый белок, кроме того, включает в себя вариантный нейбластин, химически связанный посредством моно- или гетерофункциональной молекулы со вторым компонентом, который не является вариантным белком нейбластина и получен de novo из очищенного белка, как описано ниже. Слияния нейбластин-сывороточный альбумин можно сконструировать с использованием способов,известных в данной области. Любой из ряда перекрестно сшивающих агентов, который содержит соответствующую группу, реагирующую с аминогруппой, или группу, реагирующую с тиолом, можно использовать для связывания нейбластина с сывороточным альбумином. Примеры подходящих линкеров включают перекрестно сшивающие агенты, реакционноспособные по отношению к амину, которые встраивают малеимид, реагирующий с тиолом. Указанные линкеры включают, например, SMCC, AMAS,BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS или GMBS. Другие подходящие линкеры встраивают группу галогенацетата, реагирующую с тиолом. Указанные линкеры включают, например, SBAP, SIA, SIAB, а линкеры, которые предоставляют защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфгидрильными группами, чтобы получить восстанавливаемую связь, включают SPDP, SMPT, SATA или SATP, все из которых являются коммерчески доступными (например, Pierce Chemicals). Специалист в данной области может подобным образом представить альтернативные методики, которые позволят связать Nконец нейбластина с сывороточным альбумином. Также предполагается, что специалист в данной области может создать конъюгаты с сывороточным альбумином, для которых N-конец NBN или тиольный компонент сывороточного альбумина не являются мишенью. При желании слияния NBN-сывороточный альбумин можно создать с использованием способов генетической инженерии, при которых NBN сливают с геном сывороточного альбумина на его Nконце, С-конце или на обоих концах. Кроме того, предполагается, что с использованием сходной методики можно создать любой конъюгат NBN, результатом которого является продукт с пролонгированным временем полужизни у животных(включая человека). Другие производные вариантных нейбластинов включают ковалентно связанные или агрегированные конъюгаты вариантного нейбластина или его фрагментов с другими белками или полипептидами,например, путем синтеза в рекомбинантной культуре в виде дополнительных N-концов или С-концов. Например, конъюгированный пептид может представлять собой сигнальную (или лидерную) полипептидную последовательность в N-концевой области белка, которая котрансляционно или посттрансляци-9 009771 онно управляет переносом белка от места его синтеза к месту его функционирования с внутренней или наружной стороны клеточной мембраны или стенки (например, лидер альфа-фактора дрожжей). Рецепторные белки нейбластина могут содержать пептиды, добавляемые для облегчения очистки или идентификации нейбластина (например, слияния гистидин/нейбластин). Аминокислотная последовательность нейбластина также может быть связана с пептидом Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)(Норр et al., Biotechnology 6: 1204, 1988). Последняя последовательность является высоко антигенной и дает эпитоп, обратимо связываемый специфичным моноклональным антителом, обеспечивающий быстрый анализ и простую очистку экспрессированного рекомбинантного белка. Указанная последовательность также специфично отщепляется энтерокиназой слизистой оболочки быка у остатка, непосредственно следующего за парой Asp-Lys. Вариантные полипептиды нейбластина, конъюгированные с полимером При необходимости можно использовать одну молекулу полимера для конъюгирования с полипептидом нейбластина, хотя также предполагается, что можно также связывать несколько молекул полимера. Композиции конъюгированного нейбластина согласно изобретению можно использовать для применений как in vivo, так и не in vivo. Кроме того, будет понятно, что в конъюгируемом полимере можно использовать любые другие группы, компоненты или другие конъюгированные виды, которые подходят для конечного применения. В качестве примера при некоторых применениях полезным может быть ковалентное связывание с полимером функционального компонента, придающего полимеру устойчивость к деградации УФ или антиоксидантные или другие свойства или характеристики. В качестве следующего примера при некоторых применениях может быть полезной функционализация полимера для того, чтобы сделать его реакционноспособным или в особенности способным к перекрестному сшиванию, чтобы усилить различные свойства или характеристики конъюгированного материала в целом. Таким образом,полимер может содержать любую функциональную группу, повторяющиеся группы, связи или другие составляющие структуры, которые не мешают эффективности композиции конъюгированного мутеина нейбластина при получении планируемого результата. Иллюстративные полимеры, которые можно успешно использовать для получения указанных требуемых характеристик, приведены в данном описании ниже в типичных схемах реакций. В случае применений ковалентно связанного пептида полимер может быть функционализирован и затем связан со свободной аминокислотой(ами) пептида(дов) с образованием лабильных связей. В некоторых вариантах полипептид нейбластина связывают с полимером посредством концевой реакционноспособной группы полипептида. Альтернативно или дополнительно полипептид нейбластина можно связать через аминогруппу боковой цепи внутреннего остатка лизина, например, остатка лизина,введенного в аминокислотную последовательность полипептида нейбластина природного происхождения. Таким образом, конъюгаты также могут быть разветвленными от неконцевых реакционноспособных групп. Полимер с реакционноспособной группой(ами) в данном описании называют активированным полимером. Реакционноспособная группа избирательно реагирует со свободной аминогруппой или другими реакционноспособными группами белка. Связывание активированного полимера может происходить у любой доступной аминогруппы нейбластина, такой как альфа-аминогруппы или эпсилон-аминогруппы остатка лизина или остатков, введенных в аминокислотную последовательность полипептида нейбластина или его варианта. Свободные карбоксильные группы, соответствующим образом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, имидазол, окисленные углеводные компоненты и меркаптогруппы нейбластина (если они имеются) также можно использовать в качестве мест связывания. Обычно используют примерно от 1,0 до 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество представляет собой баланс между максимизацией степени реакции при минимизации неспецифичных модификаций продукта и в то же время определением химических составов, которые будут поддерживать оптимальную активность, одновременно с оптимизацией, если это возможно, времени полужизни белка. Предпочтительно сохраняется по меньшей мере примерно 50% биологической активности белка и наиболее предпочтительно сохраняется около 100%. Реакции можно осуществлять любым подходящим способом, используемым для осуществления реакций биологически активных веществ с инертными полимерами, предпочтительно примерно при pH 58, например pH 5, 6, 7 или 8, в том случае, если реакционноспособные группы представляют собой альфа-аминогруппу на N-конце. В общем, способ заключается в получении активированного полимера и затем осуществлении реакции белка с активированным полимером, чтобы получить растворимый белок,подходящий для композиции. Указанную выше реакцию модификации можно осуществить несколькими способами, которые могут включать одну или несколько стадий. Полимер можно связать с вариантным полипептидом нейбластина с использованием способов, известных в данной области. Например, в одном варианте полиалкиленгликолевый компонент связывают с группой лизина полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Связывание с группой лизина можно осуществить с использованием активированного сложного эфира Nгидроксилсукцинимида (NHS), такого как сукцинимидилсукцинат (SS-PEG) и сукцинимидилпропионат(SPA-PEG) ПЭГ. Подходящие полиалкиленгликолевые компоненты включают, например,- 10009771 карбоксиметил-NHS, норлейцин-NHS, SC-ПЭГ, трезилат, альдегид, эпоксид, карбонилимидазол и карбонат PNP. Сукцинимидиловый компонент может быть заменен дополнительными реагирующими с амином линкерами ПЭГ. Указанные линкеры включают, например, изотиоцианаты, нитрофенилкарбонаты, эпоксиды и карбонаты бензотриазола. Предпочтительно выбирают условия, чтобы максимизировать избирательность и степень реакции. Можно использовать линейные и разветвленные формы ПЭГ, а также другие формы алкила. Длина ПЭГ может варьировать. Размер наиболее обычных форм варьирует от 2 до 100 кДа. Наряду с тем, что в данных примерах сообщается, что целенаправленное пегилирование на Nконце не влияет на фармакокинетические свойства, тот факт, что вещество сохраняло физиологическую функцию, свидетельствует о том, что модификация в сайте или сайтах, указанных в данном описании, не оказывает отрицательного воздействия. Поэтому при создании мутантных форм NBN, которые могут обеспечивать дополнительные сайты связывания, посредством инсерции остатков лизина, считается допустимым, что возможным результатом будет то, что указанные формы могут быть пегилированы как у лизина, так и на N-конце. При необходимости вариантные полипептиды нейбластина могут содержать метку, например метку, которую впоследствии можно высвободить с помощью протеолиза. Таким образом, представленный лизином компонент можно избирательно модифицировать сначала в результате реакции варианта, содержащего his-метку, с линкером с низкой молекулярной массой, таким как реагент Траута (Pierce), который будет реагировать как с лизином, так и с N-концом, и затем высвобождая his-метку. Затем полипептид будет содержать свободную SH-группу, которую можно избирательно модифицировать ПЭГ,содержащим реагирующую с тиолом головную группу, такую как группа малеимида, винилсульфоновая группа, галогенацетатная группа или свободная или защищенная группа SH. Реагент Траута можно заменить любым линкером, который будет обеспечивать специфичный сайт для связывания ПЭГ. В качестве примера реагент Траута можно заменить SPDP, SMPT, SATA или SATP(все доступны из Pierce). Подобным образом можно осуществлять реакцию белка с реакционноспособным по отношению к амину линкером, который встраивает малеимид (например, SMCC, AMAS, BMPS,MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS или GMBS), галогенацетатную группу (SBAP, SIA, SIAB) или винилсульфоновую группу, и осуществлять реакцию полученного в результате продукта с ПЭГ, который содержит свободную SH. Единственным ограничением размера линкера, который используют, состоит в том, чтобы он не мог блокировать последующее удаление N-концевой метки. Таким образом, в других вариантах полиалкиленгликолевый компонент связывают с группой цистеина полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина. Связывание можно осуществить, например, с использованием малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы и тиольной группы. С полимером может быть связан один или несколько сайтов вариантного полипептида нейбластина. Например, с полимером могут быть связаны один, два, три, четыре или пять ПЭГ-компонентов. В некоторых вариантах ПЭГ-компонент связывают с аминоконцом и/или аминокислотами 14, 39, 68 и 95 полипептида нейбластина, пронумерованными, как описано в табл. 1. В предпочтительных вариантах вариантный полипептид нейбластина в композиции имеет более продолжительное время полужизни в сыворотке по сравнению со временем полужизни вариантного полипептида в отсутствие полимера. Альтернативно или дополнительно вариантный полипептид нейбластина в композиции связывает GFR3, активирует RET, нормализует патологические изменения нейрона или повышает жизнеспособность нейрона или выполняет комбинацию указанных физиологических функций. В предпочтительных вариантах композицию готовят в виде стабильного водорастворимого конъюгированного комплекса полипептида нейбластина или вариантного полипептида нейбластина, содержащего полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина, связанный с полиэтиленгликолевым компонентом. При желании полипептид нейбластина или вариантный полипептид нейбластина можно связать с полиэтиленгликолевым компонентом с помощью лабильной связи. Лабильную связь можно расщепить, например, при биохимическом гидролизе, протеолизе или сульфгидрильном расщеплении. Например, связь можно расщепить в условиях in vivo (физиологических условиях). Фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты вариантный нейбластин-полимер Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат вариантный нейбластинполимер согласно данному изобретению. Фармацевтическую композицию в используемом в данном описании смысле определяют как композицию, содержащую белок или конъюгат нейбластина согласно изобретению, диспергированный в физиологически приемлемом наполнителе, необязательно содержащую один или несколько других физиологически совместимых ингредиентов. Таким образом, фармацевтическая композиция может содержать эксципиент, такой как вода, одно или несколько неорганических веществ, сахаров, детергентов и один или несколько носителей, таких как инертный белок (например,гепарин или альбумин). Конъюгаты полимер-нейбластин согласно изобретению можно вводить как таковые, а также в форме их фармацевтически приемлемых сложных эфиров, солей и других физиологически функциональных- 11009771 производных. В таких фармацевтических и лекарственных композициях конъюгат вариантного нейбластина предпочтительно используют вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно любыми другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(ли) должен быть фармацевтически приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не быть чрезмерно опасным для реципиента. Вариантный нейбластин вводят в количестве, эффективном для достижения требуемого фармакологического действия или полезного лекарственного эффекта, которые описаны в данном изобретении, и в количестве, подходящем для достижения требуемой биодоступной дозы или концентрации in vivo. Композиции включают композиции, подходящие для парентерального, а также для непарентерального введения, и конкретные способы введения включают пероральное, ректальное, трансбуккальное,местное, назальное, глазное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, трансдермальное, интратекальное, внутрисуставное, внутриартериальное, подарахноидальное, бронхиальное, лимфатическое, вагинальное и внутриматочное введение. Предпочтительны композиции, подходящие для аэрозольного и парентерального введения как локально, так и системно. В том случае, когда вариантный нейбластин используют в композиции, содержащей жидкий раствор, композицию преимущественно можно вводить перорально, бронхиально или парентерально. В случае использования нейбластина в жидкой суспензионной композиции или в виде порошка в биосовместимой композиции носителя, композицию преимущественно можно вводить перорально, ректально или бронхиально. Альтернативно ее можно вводить назально или бронхиально с помощью распыления порошка в газе-носителе, чтобы образовать газообразную дисперсию порошка, который вдыхается пациентом из дыхательного контура, содержащего подходящее устройство для распыления. Композиции, содержащие белки согласно данному изобретению, удобно могут быть представлены в дозированных лекарственных формах и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Такие способы, как правило, включают стадию введения активного ингредиента(тов) в ассоциацию с носителем, в состав которого входит один или несколько дополнительных ингредиентов. Обычно композиции готовят путем получения однородной и тесной ассоциации активного ингредиента(тов) и жидкого носителя, тонко диспергированного твердого носителя или обоих носителей и затем при необходимости формованием продукта в виде дозированных форм требуемой композиции. Композиции согласно данному изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, таблетки или лепешки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента в виде порошка или гранул; или в виде суспензии в водном растворе или неводном растворе, такой как сироп, эликсир,эмульсия или дозируемое жидкое лекарство. Композиции, подходящие для парентерального введения, для удобства содержат стерильный водный препарат активного конъюгата, который предпочтительно является изотоничным крови реципиента(например, физиологический раствор соли). Такие композиции могут содержать суспендирующие агенты и загустители или другие системы микрочастиц, которые разработаны для целенаправленной доставки соединения к компонентам крови или одному или нескольким органам. Композиции могут быть представлены в форме однократной дозы или форме многократных доз. Композиции назального спрея содержат очищенные водные растворы активного конъюгата с консервантами и агентами для изотоничности. Такие композиции предпочтительно доводят до pH и изотоничного состояния, совместимого с мембранами слизистой оболочки носа. Композиции для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящим носителем, таким как масло какао, гидрогенизированные жиры или гидрогенизированная жирная карбоновая кислота. Глазные композиции, такие как глазные капли, готовят способом, подобным способу получения назального спрея, за исключением того, что pH и факторы для изоточности предпочтительно доводят так, чтобы они подходили для глаза. Местные композиции содержат конъюгаты согласно изобретению, растворенные или суспендированные в одной или нескольких средах, таких как минеральное масло, керосин, многоатомные спирты или другие основы, используемые для местных фармацевтических композиций. Кроме указанных выше ингредиентов композиции согласно данному изобретению могут дополнительно содержать один или несколько вспомогательных ингредиентов, выбранных из разбавителей, буферов, корригентов, дезинтегрирующих агентов, поверхностно-активных веществ, загустителей, скользящих веществ, консервантов (включая антиоксиданты) и тому подобного. Указанные выше рассуждения также применимы к слитым белкам нейбластина согласно изобретению (например, слияние нейбластинHSA). Таким образом, данное изобретение охватывает получение подходящих слитых белков для стабилизации конъюгата вариантного нейбластина в растворе in vitro в качестве предпочтительного иллюстративного применения изобретения. Слитые белки можно использовать, например, для того, чтобы повысить устойчивость вариантного полипептида нейбластина к деградации ферментами и предоставить способы повышения срока хранения, стабильности при комнатной температуре и тому подобного. Понятно,- 12009771 что указанные выше рассуждения также применимы к слитым белкам нейбластин-сывороточный альбумин (включая слитые белки нейбластин человека-сывороточный альбумин человека) согласно изобретению. Способы лечения Вариантные полипептиды нейбластина, а также их слитые белки или конъюгаты можно использовать для лечения или ослабления расстройства или заболевания в организме существующих животных,предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно примата, включая человека, когда указанное расстройство или заболевание поддается влиянию активности нейротрофических агентов. Композиции согласно изобретению можно использовать непосредственно, например, посредством инъецируемых, имплантируемых или проглатываемых фармацевтических композиций для лечения патологического процесса, отвечающего на полипептиды нейбластина. Композиции можно использовать для ослабления расстройства или заболевания в организме существующих животных, включая человека, когда расстройство или заболевание поддается воздействию активности нейротрофических агентов. Расстройством или заболеванием, в частности, может быть повреждение нервной системы, вызванное травмой, хирургической операцией, ишемией, инфекцией, метаболическими заболеваниями, недостаточностью питания, злокачественным новообразованием или токсичными агентами, и генетическими или идиопатическими процессами. Повреждение, в частности, может произойти в чувствительных нейронах или клетках ретинального ганглия, включая нейроны в ганглиях дорзальных корешков спинного мозга, или в любой из следующих тканей: ганглий коленца, внечерепной ганглий и узловатый ганглий; преддверно-улитковый комплекс восьмого черепно-мозгового нерва; вентролатеральный полюс верхнечелюстной-нижнечелюстной доли тройничного ганглия; и мезэнцефалическое ядро тройничного нерва. В предпочтительном варианте способа согласно изобретению заболеванием или расстройством является нейродегенеративное заболевание, в которое вовлечены поврежденные и травмированные нейроны, а именно травматические повреждения периферических нервов, продолговатого мозга и/или спинного мозга, повреждение нейронов при церебральной ишемии, невропатия и в особенности периферическая невропатия, травма или повреждение периферического нерва, ишемический инсульт, острое повреждение головного мозга, острое повреждение спинного мозга, опухоли нервной системы, множественный склероз, воздействие нейротоксинов, метаболические заболевания, такие как диабет или дисфункция почек, и повреждение, вызванное инфекционными агентами, нейродегенеративные расстройства, включающие болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, синдромы с проявлениями болезни Паркинсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдром Стила-РичардсонаОльшевского), оливо-понто-церебеллярную дегенерацию (ОПЦД), синдром Шая-Дрейджера (множественная системная атрофия), комплекс деменция-паркинсонизм (Гуам-тип), боковой амиотрофический склероз, или любое другое врожденное или нейродегенеративное заболевание, и ухудшение памяти, связанное с деменцией. В предпочтительном варианте можно лечить чувствительные нейроны и/или нейроны автономных систем. В частности, можно лечить ноцицептивные и механорецептивные нейроны, более конкретно нейроны с дельта-волокнами и С-волокнами. Кроме того, можно лечить симпатические и парасимпатические нейроны автономной системы. В другом предпочтительном варианте можно лечить заболевания мотонейронов, такие как боковой амиотрофический склероз (БАС) и спинальная амиотрофия. В еще одном предпочтительном варианте молекулы нейбластина согласно данному изобретению можно использовать для ускорения восстановления нервов после травматического поражения. Альтернативно или дополнительно в приведенных в данном описании способах можно использовать канал управления нервом с помощью матрикса, содержащего вариантные полипептиды нейбластина или слияние или конъюгаты вариантных полипептидов нейбластина. Такие каналы управления нервами заявлены, например, в патенте США 5834029, включенном в данное описание в виде ссылки. В предпочтительном варианте указанные в данном описании композиции (и фармацевтические композиции, которые их содержат) используют для лечения периферических невропатий. Среди периферических невропатий, которые предполагается лечить молекулами согласно данному изобретению, находятся индуцированные травмами невропатий, например, такие, которые вызваны физическим повреждением или патологическим состоянием, физическое повреждение головного мозга, физическое повреждение спинного мозга, инсульт, связанный с повреждением головного мозга, и неврологические нарушения, связанные с нейродегенерацией. Также включены в данное изобретение невропатии, являющиеся вторичными после инфекции, воздействия токсина и воздействия лекарственного средства. Кроме того, в данное изобретение включены невропатии, являющиеся вторичными после системного или метаболического заболевания. Заявленные в данном описании композиции также можно использовать для лечения невропатий, индуцированных химиотерапией (таких как невропатии, вызванные поступлением хемотерапевтических средств, например, таксола или цисплатина); невропатий, индуцированных токсинами,невропатий, индуцированных лекарственными средствами, невропатий, индуцированных недостатком- 13009771 витаминов; идиопатических невропатий и диабетических невропатий. См., например, патенты США 5496804 и 5916555, каждый из которых включен здесь в виде ссылки. Дополнительными состояниями, которые можно лечить с использованием приведенных в данном описании композиций, являются мононевропатии, множественные мононевропатии и полиневропатии,включая аксональную и димиелинизирующую невропатии, с использованием указанных в данном описании композиций. В другом предпочтительном варианте композиции согласно изобретению (и фармацевтические композиции, которые их содержат) используют для лечения различных заболеваний глаза, включая разрушение фоторецепторов сетчатки у пациентов, страдающих дегенерацией желтого пятна, пигментным ретинитом, глаукомой и сходными заболеваниями. Изобретение будет далее иллюстрировано следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Биодоступность пегилированного на N-конце нейбластина. Обнаружили, что полученный в клетках СНО рекомбинантный нейбластин человека подвергается быстрому клиренсу из циркуляции в случае внутривенного введения крысам. После подкожного введения не выявляли белка в сыворотке. Чтобы повысить биодоступность нейбластина конструировали пегилированные формы. Поскольку в последовательности NBN не встречаются лизины, то результатом специфичных в отношении амина химических реакций пегилирования будет пегилирование полипептида NBN по его аминоконцу. Следовательно, для каждого димера нейбластина необходимо связать два ПЭГ-компонента. Таким образом, сначала непосредственной мишенью ПЭГ-форм был N-конец за счет специфичных по отношению к амину химических реакций. Неожиданно даже пегилирование двумя связанными ПЭГ с М.м. 20 кДа было мало полезным в отношении времени полужизни, что свидетельствует о том, что механизм, лежащий в основе пути клиренса, доминировал над увеличением времени полужизни, которое ожидали при пегилировании. Пример 2. Конструирование пегилированного мутеина нейбластина N95K. Затем определяли биодоступность мутантных форм NBN, пегилированных по внутренним аминокислотным остаткам. Конструировали серию из четырех мутантов с заменами остатков природного происхождения в положениях 14, 39, 68 и 95, чтобы встроить лизин в выбранные места в последовательности. Указанные лизины могли бы обеспечивать альтернативные сайты для связывания ПЭГ. Указанные сайты выбирали с использованием кристаллической структуры GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 435-8, 1997) в качестве основы для идентификации поверхностных остатков и мутагенного исследования химеры персефин/нейбластин (J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000), чтобы идентифицировать функционально важные области структуры, которые не следует затрагивать. Две мутации (R39 и R68) были целенаправленно введены в область, которая на основании распределения положительных зарядов на поверхности может представлять собой сайт связывания гепарина,свойство белка, которое вероятно вносит вклад в его быстрый клиренс. Третий сайт был целенаправленно введен в N95, сайт естественного гликозилирования NBN дикого типа. Данный сайт модифицируется в естественных условиях сложной углеводной структурой. Таким образом, ожидалось, что ПЭГмодификация в указанном сайте не нарушит функцию. Четвертый сайт (R14) выбрали в области, которая не содержит каких-либо других модификаций. Для указанных в данном описании исследований выбрали мутант, в котором остаток аспарагина в положении 95 заменяли лизином (мутант N95K). Конструировали четыре различных мутеина нейбластина крысы, содержащих одно или несколько изменений в последовательности полипептида нейбластина крысы дикого типа. Мутеины включают мутеин N95K с одним изменением и мутеины, содержащие единичные замены в других сайтах аминокислотной последовательности нейбластина крысы: R14K; R68K и R39K. В номенклатуре X1N1X2 X1 относится к аминокислоте полипептида нейбластина дикого типа, N1 относится к номеру положения аминокислоты X1 в последовательности, которая пронумерована согласно SEQ ID NO: 1. X2 относится к аминокислоте, замещающей аминокислоту дикого типа в указанном пронумерованном положении последовательности. Чтобы сконструировать мутацию нейбластина N95K, осуществляли сайт-специфичный мутагенез в рСМВ 020, плазмиде, кодирующей нейбластин крысы дикого типа. Нуклеотидная последовательность нейбластина дикого типа и аминокислотная последовательность кодируемого ею полипептида представлены далее. Мутагенез рСМ 020 с использованием олигонуклеотидов KD2-310 и KD3-211 приводил к образованию плазмиды рСМВ 027 В рСМВ 027 кодон, кодирующий аспарагин в положении 95, заменили кодоном, кодирующим лизин. Мутеин нейбластина R14K образовывали заменой кодона, кодирующего аргинин, в положении 14 последовательности рСМВ 020, кодирующей нейбластин, кодоном, кодирующим лизин. Сайтспецифичный мутагенез осуществляли в рСМВ 020 с использованием олигонуклеотидов KD3-254 и KD3255 Полученная в результате конструкция названа рСМВ 029. Мутеин нейбластина R68K образовывали заменой кодона, кодирующего аргинин, в положении 68 последовательности рСМВ 020, кодирующей нейбластин, кодоном, кодирующим лизин. Сайтспецифичный мутагенез осуществляли в рСМВ 020 с использованием олигонуклеотидов KD3-258 и KD3259 Полученная в результате конструкция названа рСМВ 030.- 15009771 Мутеин нейбластина R39K образовывали заменой аргинина лизином в положении аминокислоты 39 последовательности рСМВ 020, кодирующей нейбластин. Сайт-специфичный мутагенез рСМВ 020 осуществляли с использованием олигонуклеотидов KD3-256 и KD3-257coli в виде меченого His слитого белка с сайтом расщепления энтерокиназой, непосредственно прилежащим к началу последовательности зрелого 113-аминокислотного NBN. Е. coli выращивали в ферментере объемом 500 л и готовили замороженную клеточную массу. Клетки Е. coli лизировали в пресс-фильтреManton Gaulin, и NBN NK крыс извлекали из нерастворимой промытой фракции осадка.NBN экстрагировали из осадка гуанидинхлоридом, подвергали свертыванию и his-метку удаляли энтерокиназой. Затем продукт подвергали хроматографии на Ni NTA-агарозе (Qiagen) и на катионообменной смоле WP CBX Bakerbond. Обработка энтерокиназой his-меченого продукта приводила к аберрантному расщеплению белка у аргинина в положении 7 зрелой последовательности. Полученный в результате продукт des-1-7-NBN был полностью активным в ELISA KIRA и структурно неотличим от зрелой формы по своей чувствительности к индуцированной гуанидином денатурации и поэтому был использован для последующей работы.NBN N95K крысы пегилировали в среднем 3,3 ПЭГ-компонентов/молекулу, используя в качестве реагента метоксиполи(этиленгликоль)сукцинимидилпропионат (SPA-ПЭГ) с молекулярной массой 10000 Да. Полученный в результате пегилированный продукт всесторонне характеризовали, включая анализ с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, эксклюзионную хроматографию по размеру (SEC), обращенно-фазовую ВЭЖХ, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией/ионизацией из матрицыSEC, составляла более 95%. Продукт NBN N95K в невосстанавливающих условиях мигрировал в виде димера, что соответствовало его рассчитанной структуре. После пегилирования полученный продукт состоял из серии модифицированных аддуктов, содержащих 2 ПЭГ/молекулу - 5% продукта, 3 ПЭГ/молекулу - 60% продукта, 4 ПЭГ/молекулу - 30% продукта и несколько минорных форм более высокой массы. В пегилированном образце не было признаков агрегатов. Остаточные уровни немодифицированного NBN в продукте были ниже пределов количественного измерения. Содержание эндотоксина в материале обычно составляет менее 1 EU/мг. Удельная активность пегилированного NBN в ELISA KIRA составляет 10 нМ. Пегилированный продукт готовили при концентрации 1,1 мг/мл в PBS, pH 6,5. Материал, который по эффективности подобен NBN дикого типа, можно поставлять в виде замороженного раствора, который хранят при -70 С. Мутеины R14K, R39K и R68K экспрессировали в Е. coli и их можно подвергать таким же способам очистки, пегилирования и оценки функции, которые описаны выше для N95K-NBN. Приготовление пегилированного NBN 230 мл подвергнутого свертыванию NBN N95K крысы (2,6 мг/мл), который получали в Е. coli и хранили при 4 С в 5 мМ фосфате натрия, pH 6,5, 100 мМ NaCl, разбавляли 77 мл воды,14,4 мл 1 М HEPES, pH 7,5 и 2,8 г (конечная концентрация 10 мг/мл) ПЭГ SPA, 10000 Да (ShearwaterPolymers, Inc.). Образец инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч в темноте, затем обрабатывали 5 мМ имидазола (конечная концентрация), фильтровали и хранили в течение ночи при 4 С. Продукт готовили в двух партиях, одна из которых содержала 130 мл NBN N95K по объему, а другая содержала объем 100 мл. Пегилированный NBN очищали от реакционной смеси на колонке FractogelEMD SO3- (М) (ЕМ Industries). Разгонку на колонке проводили при комнатной температуре. Все буферы готовили апирогенно. К реакционной смеси добавляли хлорид натрия до конечной концентрации 87 мМ и образец наносили на колонку Fractogel объемом 45 мл (внутренний диаметр 5 см). Колонку промывали одним объемом колонки 5 мМ фосфата натрия, pH 6,5, 80 мМ NaCl, затем тремя аликвотами объемом, равным объему колонки, 5 мМ фосфата натрия, содержащего 50 мМ NaCl. Смолу переносили на колонку диаметром 2,5 см и пегилированный NBN элюировали с колонки шестью аликвотами объемом по 10 мл, содержащими 5 мМ фосфат натрия, pH 6,5, 400 мМ NaCl, тремя аликвотами,содержащими 500 мМ NaCl, и шестью аликвотами, содержащими 600 мМ NaCl. Элюированные фракции анализировали в отношении содержания белка по оптической плотности при 280 нм и затем в отношении степени модификации с помощью электрофореза в SDS-ПААГ. Выбранные фракции объединяли, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и разбавляли водой до 1,1 мг пегилированного NBN крыс/мл. После оценки уровней эндотоксина в отдельных партиях их объединяли и повторно фильтровали через 0,2 мкм-мембрану. Конечное вещество делили на аликвоты и хранили при -70 С. УФ-спектр очищенного пегилированного NBN NK УФ-спектр (240-340 нм) пегилированного NBN NK измеряли на чистом образце. Образец анализировали в трех повторах. Пегилированный образец проявлял максимум поглощения при 275-277 нм и ми- 16009771 нимум поглощения при 247-249. Полученный результат согласуется с результатом, наблюдаемым в случае немодифицированного промежуточного соединения основной массы NBN. Концентрацию белка пегилированного продукта оценивали на основе спектра, используя коэффициент экстинкции 2800,1%=0,50. Концентрация белка основной массы пегилированного NBN составляла 1,1 мг/мл. В образце не было мутности, что очевидно, исходя из отсутствия поглощения при 320 нм. Характеристика пегилированного NBN NK с помощью электрофореза в SDS-ПААГ Аликвоты пегилированного NBN, содержащие 3; 1,5; 0,75 и 0,3 мкг продукта, подвергали анализу вSDS-ПААГ в 4-20% градиентном геле (Owl). Гель красили Кумасси ярко-синим R-250. Параллельно разгоняли маркеры молекулярной массы (GIBCO-BRL). Анализ в SDS-ПААГ пегилированного NBN NK в невосстанавливающих условиях выявил серию полос, соответствующих модификациям 2, 3, 4 и более 4 ПЭГ/молекулу. Основная полоса с видимой массой 98 кДа содержит 3 ПЭГ/молекулу. В очищенном пегилированном продукте немодифицированный NBN не выявляли. Наличие смеси продуктов с 2, 3 и 4 связанными ПЭГ подтверждали с помощьюMALDI-масс-спектрометрического анализа. Соотношение продуктов, содержащих 2, 3 и 4 ПЭГ, определяли с помощью денситометрии и установили равным 7, 62 и 30% от суммарного количества, соответственно. Характеристика пегилированного NBN с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру Пегилированный NBN подвергали эксклюзионной хроматографии по размеру на аналитической колонке Superose 6 HR10/30 FPLC с использованием в качестве подвижной фазы 5 мМ MES, pH 6,5, 300 мМ NaCl. Разгонку на колонке проводили со скоростью 20 мл/ч. Элюированные фракции контролировали в отношении оптической плотности при 280 нм. Пегилированный NBN элюировали в виде отдельного пика с видимой молекулярной массой примерно 200 кДа в соответствии с большим гидродинамическим объемом ПЭГ. Не наблюдали признаков агрегатов. Свободный NBN, который элюируется с видимой молекулярной массой примерно 30 кДа, в препарате не выявляли. Анализ пегилированного NBN обращенно-фазовой ВЭЖХ Пегилированный NBN NK подвергали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С 4 (5 мкм,1250 мм). Колонку обрабатывали, используя 60 мм градиент от 40 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФУ, буфер В: 75% ацетонитрил/0,085% ТФУ). Вытекающий из колонки поток контролировали в отношении оптической плотности при 214 нм и собирали фракции для последующего анализа. ПегилированныйNBN NK фракционировали на его различные ди- (60,5 мм), три- (63,3 мм) и тетра- (67,8 мм) пегилированные компоненты обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С 4. Относительные интенсивности пиков свидетельствуют, что соотношения компонентов составляют 5,4; 60,5 и 30,1% соответственно. Интенсивности пиков подтверждали с помощью MALDI-MC. Не было признаков непегилированного NBN NK(элюируется при 5-15 мм) в продукте. Анализ пегилированного NBN масс-спектрометрией Пегилированный NBN NK обессоливали на С 4 Zip Tip и анализировали масс-спектрометрией во времяпролетном масс-спектрометре с лазерной десорбцией/ионизацией из матрицы (MALDI-TOF) Voyager-DE STR (PerSeptive Biosystems) с использованием в качестве матрицы синапиновой кислоты. 0,5 мкл очищенного белка смешивали с 0,5 мкл матрицы на пластине для мишеней. Масс-спектрометрия пегилированного NBN выявила формы трех аддуктов с одним и двумя зарядами. Наблюдаемые массы 43803 Да, 54046 Да и 64438 Да соответствуют модификациям 2, 3 и 4 ПЭГ/молекулу. Анализ пегилированного NBN с помощью картирования пептида Специфичность реакции пегилирования оценивали с помощью картирования пептидов. Пегилированный NBN разделяли на ди-, три- и тетрапегилированные компоненты, которые затем восстанавливали, алкилировали и далее разделяли на их одноцепочечные компоненты с помощью ВЭЖХ на колонке С 4. Полученные компоненты и восстановленный и алкилированный немодифицированный NBN NK в качестве контроля расщепляли Asp-N-протеиназой и полученные в результате продукты расщепления фракционировали обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac C18 (5 мкм, 1250 мм), используя 60 ммградиент от 0 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФУ, Buffer В: 75% ацетонитрил/0,085% ТФУ). Вытекающий из колонки поток контролировали в отношении оптической плотности при 214 нм. Последовательность NBN крыс содержит четыре внутренних аспарагиновых кислоты и поэтому предполагается, что она дает простой профиль расщепления в случае расщепления эндопротеиназой AspN. Все пики из продукта расщепления NBN NK крысы эндопротеиназой Asp-N идентифицировали массспектрометрией и/или N-концевым секвенированием по Эдману и таким образом пептидную карту можно использовать в качестве простого средства для исследования сайтов модификации по наличию или отсутствию пика. Идентификация различных пиков суммарно показана в табл. 3 ниже.: в результате окисления пептида, содержащего метионин, при MALDI. Так как NBN существует в виде гомодимера, продукт NBN NK крысы содержит четыре возможных сайта для пегилирования, два N-концевых амина из каждой цепи и два сайта N95K, которые были созданы в конструкции. В пептидной карте дипегилированной цепи только пик, который содержит пептид с мутацией NK, был изменен ПЭГ-модификацией. ПЭГ-модификация не влияла ни на какие другие пики. Таким образом, данные картирования свидетельствуют о том, что ПЭГ-компонент специфично связан с данным пептидом и не связан ни с какими другими пептидами, которые подвергали скринингу. Второй возможный сайт связывания, N-конец, находится на пептиде, который имеет длину только из трех аминокислот и не выявляется в пептидной карте. Предполагается, что дополнительное связывание ПЭГ происходит в данном сайте. Согласно этой точки зрения небольшой процент NBN NK крысы не укорочен и содержит зрелую последовательность Ala-1. Данный пептид элюируется при 30 мкм и виден на пептидной карте непегилированного продукта расщепления, но отсутствует в продуктах расщепления пегилированного NBN NK. Пример 3. Оценка эффективности внутренне пегилированного нейбластина в ELISA активации киназного рецептора (KIRA). Эффективность пегилированного NBN крысы измеряли с использованием NBN-зависимой активации/фосфорилирования c-RET в качестве репортера активности NBN в ELISA, который был специфичен в отношении присутствия фосфорилированного RET. Клетки NB41A3-mRL3 линии адгезивных клеток нейробластомы мышей, которая экспрессирует RET и GFR3, высевали при концентрации 2105 клеток на лунку в 24-луночные планшеты в среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и культивировали в течение 18 ч при 37 С и 5% CO2. Клетки промывали PBS и обрабатывали серийными разведениями NBN в 0,25 мл DMEM в течение 10 мин при 37 С и 5% CO2. Каждый образец анализировали в двух повторах. Клетки промывали 1 млPBS и лизировали в течение 1 ч при 4 С с помощью 0,30 мл 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,5% Nonidet P40,0,2% дезоксихолата натрия, 50 мМ NaF, 0,1 мМ Na3VO4, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида при осторожном покачивании планшетов. Затем лизаты дополнительно перемешивали многократным пипетированием и 0,25 мл образца переносили в 96-луночные планшеты для ELISA, которые были покрыты 5 мкг/мл анти-RET-мАт (AA.GE7.3) в 50 мМ карбонатном буфере, pH 9,6, при 4 С в течение 18 ч, и блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч блокирующим буфером (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20 (TBST), содержащий 1% нормальной сыворотки мыши и 3% бычьего сывороточного альбумина). После 2 ч инкубации при комнатной температуре лунки 6 раз промывали TBST. Фосфорилированный RET регистрировали, инкубируя лунки при комнатной температуре в течение 2 ч с 2 мкг/мл конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) антитела против фосфотирозина 4G10 в блокирующем буфере,6 раз промывая TBST и измеряя активность HRP при 450 нм с помощью реагента для колориметрической регистрации. Измеряли значения оптической плотности для лунок, обработанных лизатом или лизирующим буфером, и скорректированный относительно фона сигнал наносили на график в виде функции концентрации NBN, присутствующего в активационной смеси. Эффективность пегилированного NBN вELISA KIRA составляла 10 нМ, что не отличается от эффективности исходного вещества NBN NK. Два цикла замораживания-оттаивания не влияли на эффективность, и после указанной обработки не было существенного увеличения мутности образца, что свидетельствует о том, что образцы можно безопасно размораживать для исследования. В независимых исследованиях по оценке активности продукта с тремя и четырьмя 10 кДа-ПЭГ/молекулу отдельно определили, что аддукт с тремя ПЭГ был полностью активным, тогда как продукт с четырьмя ПЭГ имел пониженную активность. Пример 4. Фармакокинетические исследования внутренне пегилированного нейбластина крысы у крыс и мышей. Исследовали фармакокинетические свойства различных пегилированных и непегилированных продуктов NBN в моделях на крысах и мышах.- 18009771 Результаты показали, что пегилирование NBN NK крысы 3,3 ПЭГ, 10000 Да приводило к существенному воздействию на время полужизни и биодоступность нейбластина. После в/в введения 1 мг/кг крысам Sprague Dawley, пиковые уровни пегилированного NBN, составляющие 3000 нг/мл, регистрировали через 7 мин, и уровни 700 нг/мл регистрировали через 24 ч, 200 нг/мл - через 48 ч и 100 нг/мл - через 72 ч. В отличие от этого, для непегилированного NBN после в/в введения 1 мг/кг уровни 1500 нг/мл регистрировали через 7 мин, но затем уровни быстро падали до 70 нг/мл через 3 ч и не регистрировались через 7 ч. Влияние пегилирования было даже более выраженным у животных, обработанных пегилированным NBN при подкожном введении. После п/к введения 1 мг/кг циркулирующие уровни пегилированного NBN достигали максимума 200 нг/мл через 24 ч и сохранялись на указанном уровне в течение трех дней исследования. В отличие от этого, не наблюдали регистрируемого NBN ни в какой временной точке после введения немодифицированного NBN. Анализы образцов пегилированного NBN осложняются присутствием аддуктов, содержащих 2, 3 и 4 ПЭГ на молекулу, каждый из которых будет демонстрировать различный ФК-профиль. В ранних ФКисследованиях использовали мышей, чтобы обеспечить скрининг множества выбранных для исследования веществ и способов введения. Исследования на мышах выявили поразительные различия в биодоступности выбранных веществ. Однако в том случае, когда оценивали аддукт 3,3 ПЭГ 10 кДа у крыс, обнаружили, что он менее биодоступен у крыс, чем у мышей. Указанное различие в биодоступности было особенно выражено после в/б введения. Уровни у мышей достигали 1600 нг/мл через 7 ч и сохранялись на уровне 400 нг/мл через 24 ч. Напротив, уровни у крыс были постоянными при 100 нг/мл в течение 448 ч. Как нейбластин крыс дикого типа (wt-NBN), так и нейбластин с заменой Asn на Lys в положении 95(NK-NBN) подвергали свертыванию и очищали до 95% для тестов на эффективность в модели невропатии у диабетических крыс STZ. NBN дикого типа готовили в композиции для непосредственного исследования на животном, тогда как NK-NBN готовили для пегилирования ПЭГ-SPA 10 кДа. Для осуществления свертывания и в целях очистки разработали способ свертывания с использованием эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC), который позволяет проводить ренатурацию NBN из телец включения Е. coli в больших количествах и при высоких концентрациях. Для повышения чистоты конечного белка дополнительно к SEC применяли стадии хроматографии как на колонке с Ni-NTA, так и на колонке с диоксидом кремния СМ. Белки подвергали всесторонней характеризации, включая анализ с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, эксклюзионную хроматографию по размеру, ESMS, оценку активности в ELISA KIRA и определение содержания эндотоксина. SDS-ПААГ и SEC конечных белковых продуктов показал чистоту более 95%. Уровень эндотоксина в каждом продукте составлял 0,2 EU/мг. Удельная активность обоих белков в ELISA KIRA составляет примерно 10 нМ. NBN дикого типа готовили в концентрации 1,0 мг/мл, а NK-NBN готовили в концентрации 2,6 мг/мл в фосфатно-солевом буфере(PBS), pH 6,5. NBN дикого типа делили на аликвоты в пробирки объемом 15 мл и хранили замороженными при -70 С, тогда как NK-NBN перед разделением на аликвоты и замораживанием подвергали пегилированию. Пример 5. Свертывание нейбластина дикого типа и мутеина нейбластина N95K. Обе формы NBN экспрессировали в Е. coli в виде His-меченых слитых белков с сайтом расщепления энтерокиназой, непосредственно прилежащим к началу зрелой последовательности из 113 аминокислот. Бактерии, экспрессирующие либо NBN дикого типа (1,8 кг осадка), либо NK-NBN (2,5 кг осадка), подвергали лизису в 2 л PBS, используя пресс Gaulin. После центрифугирования (10000 об/мин) для осаждения телец включения из каждого препарата удаляли надосадки. Осадки телец включения два раза промывали буфером (0,02 М Трис-HCl, pH 8,5, 0,5 мМ EDTA), затем два раза промывали таким же буфером, содержащим Тритон Х-100 (2%, об./об.), с последующими двумя дополнительными промывками буфером без детергента. Оба осадка солюбилизировали с использованием 6 М гуанидингидрохлорида,0,1 М Триса, pH 8,5, 0,1 М ДТТ и 1 мМ EDTA. Чтобы способствовать процессу солюбилизации каждый осадок подвергали гомогенизации с использованием гомогенизатора Polytron с последующим перемешиванием в течение ночи при комнатной температуре. Растворимые белки осветляли центрифугированием перед денатурирующей хроматографией через Superdex 200 (колонка объемом 5,5 л, уравновешенная 0,05 М глицином/Н 3 РО 4, pH 3,0 с 2 М гуанидин-HCl) при скорости 20 мл/мин. Денатурированный NBN идентифицировали в SDS-ПААГ. Фракции, содержащие либо NBN дикого типа, либо NK-NBN, объединяли и концентрировали примерно до 250 мл, используя концентратор клеток с мешалкой Amicon объемом 2,5 л. После фильтрования для того, чтобы удалить какой-либо осадок,концентрированный белок подвергали ренатурирующей хроматографии по размеру через Superdex 200,уравновешенный 0,1 М Трис-HCl, pH 7,8, 0,5 М гуанидин-HCl, 8,8 мМ восстановленным глутатионом и 0,22 мМ окисленным глутатионом. Колонку обрабатывали, используя 0,5 М гуанидин-HCl при скорости 20 мл/мин. Фракции, содержащие ренатурированный NBN дикого типа или NK-NBN, идентифицировали в SDS-ПААГ, объединяли и хранили при 4 С вплоть до того, как требовалось удалить His-метку.- 19009771 Концентрирование NBN при Ni-NTA-хроматографии (TR5919-138) Ренатурированный NBN хранили при 4 С по меньшей мере в течение 24 ч до осуществления очистки, чтобы стимулировать дисульфидное образование между мономерами NBN. За это время образовывался осадок, и его удаляли фильтрованием через фильтровальную установку 0,2 мк PES. Чтобы уменьшить неспецифичное связывание, концентрацию имидазола в растворе белка доводили до 20 мМ перед загрузкой на колонку Ni-NTA (Qiagen) объемом 100 мл, уравновешенную буфером для колонки (0,5 М гуанидин и 20 мМ имидазол) со скоростью 50 мл/мин. После нанесения белка колонку промывали до установления базовой линии тем же самым буфером. NBN элюировали из смолы, используя примерно 300 мл элюируирующего буфера, содержащего 0,5 М гуанидин-HCl и 0,4 М имидазол. После элюирования NBN диализовали в течение ночи (используя диализные трубки на 10 кДа) при комнатной температуре против десяти объемов 5 мМ HCl. Диализ стимулировал гидролиз загрязняющих веществ и снижал концентрации гуанидин-HCl и имидазола до 0,05 М и 0,04 М, соответственно. Отщепление His-метки лизилэндопептидазой или энтерокиназой На следующий день любой осадок, который образовывался во время диализа, удаляли фильтрованием. Концентрацию NaCl в образце белка делали равной 0,1 М добавлением 5 М маточного раствора до конечной концентрации соли, при этом он содержал примерно 150 мМ остаточного гуанидин-HCl. Указанную концентрацию подтверждали с использованием измерителя проводимости. Кроме того, добавляли 1 М HEPES, pH 8, до конечной концентрации 25 мМ. Чтобы отщепить метку, к NBN дикого типа добавляли лизилэндопептидазу и к NK-NBN добавляли энтерокиназу, оба фермента примерно при соотношении протеазы к NBN 1:300. В случае NK-NBN использовали энтерокиназу вместо лизилэндопептидазы из-за дополнительного сайта расщепления в мутантном белке у Lys95. Образцы перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и расщепление контролировали с помощью электрофореза в SDSПААГ. Удаление His-метки Ni-NTA-хроматографией Обработанный протеазой NBN наносили на колонку Ni-NTA объемом 100 мл, уравновешенную 0,5 М гуанидин-HCl и 20 мМ имидазолом, со скоростью 50 мл/мин. Колонку промывали до установления базовой линии таким же буфером. Любой белок, вымываемый из колонки, объединяли с протекающим белком, содержащим NBN без His-метки. Хроматография на диоксиде кремния СМ После Ni-NTA-хроматографии белок сразу же подвергали дальнейшей очистке пропусканием через смолу на основе диоксида кремния СМ. На колонку с диоксидом кремния объемом 20 мл, уравновешенную буфером для нанесения (5 мМ фосфат, pH 6,5, 150 мМ NaCl), загружали NBN со скоростью 20 мл/мин. Колонку промывали двадцатью объемами колонки буфера для промывки (5 мМ фосфат, pH 6,5,400 мМ NaCl) и белок элюировали элюирующим буфером, содержащим 5 мМ фосфат, pH 6,5, но 1 МNaCl. Элюированный белок диализовали в течение ночи против одного фосфата, чтобы понизить концентрацию соли до 100 мМ в случае NK-NBN и 150 мМ в случае NBN дикого типа. Оба образца фильтровали через фильтровальную установку 0,2 мк PES, анализировали в SDS-ПААГ и хранили при 4 С вплоть до того, как требовалась дальнейшая характеристика и/или пегилирование.NBN дикого типа и NK-NBN подвергали анализу в отношении УФ-спектров, чтобы оценить их поглощение при 280. Используя кварцевую микрокювету и обнуление по сравнению с одним буфером,100 мкл либо NBN дикого типа, либо NK-NBN непрерывно сканировали от 230 до 330 нм, используя спектрофотометр Beckman. На основе данного анализа определили, что концентрация NBN дикого типа составляла 1,1 мг/мл, а концентрация NK-NBN - 2,6 мг/мл (для каждого белка использовали А 280 нм-Е 0,1%=0,5). Менее 1% осажденного вещества идентифицировали на основе поглощения при 330 нм. Чтобы оценить чистоту обоих препаратов белка, каждый образец (0,5 мг) подвергали эксклюзионной хроматографии по размеру через колонку 16/30 Superdex 75. Колонку уравновешивали 5 мМ фосфатом, pH 6,5, содержащим 400 мМ NaCl, и обрабатывали при скорости потока 1,5 мл/мин. На основании поглощения при 280 нм и NBN дикого типа и NK-NBN мигрировали в виде отдельного пика с ожидаемой молекулярной массой (23-24 кДа) и они не содержали какого-либо существенного загрязнения белка. И NBN дикого типа, и NK-NBN восстанавливали в 2,5 М гуанидин-HCl, 60 мМ Трис, pH 8,0 и 16 мМ ДТТ. Восстановленные образцы обессоливали на короткой колонке С 4 и анализировали в оперативном режиме с помощью ESMS, используя тройной квадрупольный прибор. Исходные данные ESMS подвергали развертке с помощью программы MaxEnt, чтобы создать масс-спектр. Данный способ позволяет свести множественные заряженные сигналы в один пик, который прямо соответствует молекулярной массе в килодальтонах (кДа). Развернутый масс-спектр для NBN дикого типа показал, что преобладающий вид имеет М.м. 12046 кДа, которая соответствует рассчитанной молекулярной массе 12046,7 кДа для формы белка из 113 аминокислот. Также наблюдали минорный компонент (12063 кДа),свидетельствующий о присутствии продукта окисления. В образце NK-NBN идентифицировали три пика. Основной компонент показал видимую молекулярную массу 11345 кДа в соответствии с рассчитан- 20009771 ной массой для формы белка из 106 аминокислот. Два других пика имели массы 11362 и 12061 кДа, что свидетельствовало об окислении NK-NBN и присутствии формы из 113 аминокислот, соответственно. Присутствие в препарате NK-NBN форм из 106 и 113 аминокислот можно отнести к расщеплению энтерокиназой. Указанная протеаза от Biozyme является препаратом природного фермента, очищенного из слизистой оболочки кишечника теленка, и по сообщениям содержит небольшую примесь трипсина(0,25 нг трипсина на мкг энтерокиназы). Таким образом, трипсин может действовать на NK-NBN с карбоксиконцевой стороны Arg7, продуцируя преобладающую форму из 106 аминокислот. С другой стороны, лизилэндопептидаза, используемая для расщепления NBN дикого типа, обладает единственной протеазной активностью, действуя с карбоксиконцевой стороны остатка лизина, находящегося в областиHis-метки, давая форму зрелого NBN из 113 аминокислот. Обе формы NBN из 106 и 113 аминокислот одинаково активны во всех исследованных анализах и проявляют сходство в тестах на стабильность в гуанидин-HCl. Активность NBN определяли по его способности стимулировать фосфорилирование c-RET в клетках NB41A3-mRL3 с использованием ELISA KIRA, описанного в примере 3. Фосфорилирование RET определяли при инкубации (2 ч) иммобилизованного рецептора с конъюгированным с HRP антителом против фосфотирозина (4G10; 0,2 мкг на лунку). После инкубации лунки шесть раз промывали TBST и затем активность HRP регистрировали при 450 нм с помощью колориметрического анализа. Измеряли значения оптической плотности для лунок, обработанных лизатом или одним лизирующим буфером,корректировали относительно фона и данные наносили на график в виде функции концентрации нейбластина, присутствующего в активационной смеси. Данные показывают, что очищенный NBN приводил к появлению фосфорилированного RET, что свидетельствует о том, что очищенный NBN был активным в данном анализе. Пример 6. Получение конъюгата сывороточный альбумин-нейбластин. Нейбластин крысы дикого типа в концентрации 1 мг/мл в PBS обрабатывали 1 мМ сульфо-SMCC(Pierce) и обессоливали, чтобы удалить избыток перекрестно сшивающего агента. Так как белок NBN дикого типа содержит только единственный амин на своем N-конце и не имеет свободных сульфгидрильных групп, предполагали, что результатом реакции с SMCC будет сайт-специфичная модификацияNBN посредством SMCC, связанным с N-концом. 60 мкг конъюгата NBN-SMCC инкубировали с 120 мкг бычьего сывороточного альбумина и анализировали в отношении степени перекрестного сшивания в SDS-ПААГ. БСА содержит одну свободнуюSH-группу и, следовательно, ожидается, что реакция с конъюгатом NBN-SMCC приведет к модификации в указанном сайте посредством малеимида на SMCC. При указанных условиях наблюдали две дополнительные полосы с более высокой молекулярной массой, которые соответствуют по массе модификацииNBN одним БСА-компонентом и двумя молекулами БСА, так как каждая молекула NBN содержит два Nконца, которые могут подвергаться реакции и, следовательно, полосы согласуются с данной точкой зрения. Образованию указанных полос сопутствовало уменьшение интенсивности полос NBN-SMCC и БСА. На основании интенсивности остающейся полосы NBN, реакция, по-видимому, протекала до завершения на 70-80%. Однозамещенный продукт очищали от реакционной смеси, подвергая материал катионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии по размеру на колонке Superdex 200 (Pharmacia), по существу, как описано для обсуждаемых выше исследований пегилирования. Фракции с колонки при гель-фильтрации анализировали в SDS-ПААГ, и фракции, содержащие однозамещенный продукт, анализировали в отношении содержания белка по оптической плотности при 280 нм. Так как масса БСА примерно в два раза выше массы нейбластина, кажущуюся концентрацию делили на 3, чтобы получить эквивалент NBN. Указанную фракцию подвергали анализу в отношении функции в ELISA KIRA. ЗначенияIC50 и для NBN дикого типа, и для БСА-конъюгированного NBN составляли 3-6 нМ, свидетельствуя о том, что конъюгация с БСА не мешает функционированию. Хотя указанные предварительные исследования проводили с БСА, соответствующие белки сывороточного альбумина крыс и человека также содержат свободную группу SH. Следовательно, сходный способ можно применять для создания конъюгата сывороточный альбумин крысы-NBN крысы для проведения исследований ФК и эффективности у крыс и конъюгата сывороточный альбумин человека-NBN человека для проведения клинических испытаний. Подобным образом SMCC можно заменить любым из ряда перекрестно сшивающих агентов, которые содержат группу, реагирующую с аминогруппой, с одной стороны, и группу, реагирующую с тиолом, с другой стороны. Примерами перекрестно сшивающих агентов, реагирующих с амином, которые встраивают реагирующий с тиолом малеимид, являютсяAMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS или GMBS, примерами агентов, которые встраивают реагирующую с тиолом галогенацетатную группу, являются SBAP, SIA, SIAB, и примерами агентов, которые предоставляют защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфгидрильными группами с получением восстанавливаемой связи, являются SPDP, SMPT, SATA или SATP, которые все доступны из Pierce. Такие перекрестно сшивающие агенты являются только примерными, и допустимы многие альтернативные способы связывания N-конца NBN с сывороточным альбумином. Специалист в данной области также может создать конъюгаты с сывороточным альбумином, мишенью в которых не являетсяN-конец NBN или тиольный компонент сывороточного альбумина. Также предполагается, что функциональными будут слияния NBN-сывороточный альбумин, созданные с использованием генетической инженерии, когда NBN сливают с геном сывороточного альбумина на N-конце, С-конце или на обоих концах. Данный способ можно распространить посредством обычного адаптирования на любой конъюгатNBN-сывороточный альбумин, результатом которого может быть продукт с пролонгированным временем полужизни у животных и, следовательно, у человека. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Полипептид нейбластина, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из:SEQ ID NO: 1, представляет собой лизин. 4. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, содержащий аминокислоты 8-113 SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, в котором аспарагин в положении 95 заменен на другую аминокислоту. 5. Полипептид нейбластина, содержащий аминокислоты 1-113 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 илиSEQ ID NO: 4, в котором аспарагин в положении 95 заменен на лизин. 6. Полипептид по любому из пп.1-3, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 1. 7. Полипептид по любому из пп.1-3, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 8-113 SEQ ID NO: 2. 8. Гибридный белок, содержащий полипептид по любому из предшествующих пунктов, слитый со вторым компонентом. 9. Гибридный белок по п.8, где вторым компонентом является сывороточный альбумин человека. 10. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп.1-7. 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок по п.8 или 9. 12. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.10. 13. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.11. 14. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.12. 15. Клетка-хозяин по п.14, где клеткой-хозяином является клетка яичника китайского хомячка. 16. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13. 17. Клетка-хозяин по п.15, где клеткой-хозяином является клетка яичника китайского хомячка. 18. Способ получения полипептида по любому из пп.1-7, включающий:(a) культивирование клетки-хозяина по п.14 или 16 в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида по любому из пп.1-7, и(b) выделение указанного полипептида. 19. Способ получения гибридного белка по п.8 или 9, включающий:(a) культивирование клетки-хозяина по п.15 или 17 в условиях, обеспечивающих экспрессию гибридного белка по п.8 или 9, и(b) выделение указанного гибридного белка. 20. Димер, содержащий два полипептида по любому из пп.1-7. 21. Димер, содержащий два слитых белка по любому из пп.8 или 9. 22. Конъюгат, содержащий полипептид по любому из пп.1-7 и неприродный полимер. 23. Конъюгат, содержащий гибридный белок по любому из пп.8 или 9 и неприродный полимер. 24. Конъюгат по п.22 или 23, где полимер представляет собой полиалкиленгликоль. 25. Конъюгат по п.24, где полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль. 26. Конъюгат по п.25, где полиалкиленгликоль связан с остатком лизина, введенным в качестве замены в положение 14, 39, 68 или 95 в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4 полипептида нейбластина, или с его N-концом. 27. Конъюгат по любому из пп.22-26, в котором соответствующий полипептид гликозилирован. 28. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-7 и физиологически приемлемый носитель. 29. Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по п.8 или 9 и физиологически приемлемый носитель. 30. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.22-27 и физиологически приемлемый носитель. 31. Применение полипептида по любому из пп.1-7 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы. 32. Применение гибридного белка по п.8 или 9 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы. 33. Применение конъюгата по любому из пп.22-27 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики заболевания или расстройства нервной системы. 34. Применение по любому из пп.31-33, где заболеванием или расстройством является периферическая нейропатия или синдром нейропатической боли.