Носитель с твердым фибриногеном и твердым тромбином

006700 Область изобретения Изобретение относится к готовой к применению абсорбируемой композиции для склеивания тканей, закрытия тканей и остановки кровотечения (гемостаза), состоящей, по существу, из носителя, покрытого твердыми фиксированными компонентами человеческого происхождения фибринового клея: фибриногена человека и тромбина человека. Эту фиксированную комбинацию можно наносить непосредственно, например, на поверхность раны. При контакте с кровью, общей водой организма или физиологическим раствором механизм этой системы симулирует окончательную стадию системы свертывания (коагуляционных процессов), на которой тромбин катализирует превращение фибриногена в фибрин и активацию фактора XIII в фактор XIIIа. Образовавшийся фактор ХIIIа стабилизирует фибриновый сгусток ковалентным сшиванием. Как и в случае любого двухкомпонентного клея, поверхность раны и носитель склеивают путем полимеризации. Во время этого процесса, который длится примерно 3-5 мин, предлагаемую композицию предпочтительно прижимают к поверхности раны. Компоненты предлагаемой композиции ферментативно разлагаются примерно в течение 4-6 месяцев после нанесения. Известные решения На рынке имеются фибриновые клеи, симулирующие окончательную стадию коагуляционных процессов, которые состоят из высококонцентрированного раствора фибриногена, перед нанесением на хирургическую рану смешиваемого с раствором тромбина. Эти смеси содержат ингибиторы фибринолиза,например апротинин или -аминокапроновую кислоту, для предотвращения преждевременного растворения фибринового сгустка фибролизином (плазмином). Эти двухкомпонентные клеи обладают рядом преимуществ в различных хирургических процедурах, однако, при сильном кровотечении могут вымываться до остановки кровотечения. Далее, для этих двухкомпонентных клеев требуются некоторые подготовительные операции, такие как оттаивание или растворение. Поэтому они весьма непрактичны, работать с ними обременительно, и для успешного применения этих фибриновых клеев необходим опыт. В последнем десятилетии хирурги получили возможность выбирать из большого числа заживляющих раны фибриновых клеев для ряда показаний. Однако в большинстве клинических испытаний с применением фибриновых клеев для улучшения кровоостанавливающих (гемостатических) и клеящих свойств дополнительно использовался коллаген, что свидетельствовало об их недостатках и ограниченных возможностях применения в хирургии. Коллаген используется в качестве кровоостанавливающего средства с конца шестидесятых годов. Коллаген является основным структурным белком у всех млекопитающих. Мономерный белок массой примерно 300 кДа (тропоколлаген) ковалентно сжат в специфических местах. Вследствие этого зрелый белок нерастворим и образует характерные фибриллы с высокой прочностью на растяжение. Известны многочисленные подклассы коллагена, наиболее распространенным из которых является коллаген типа I- основной тип коллагена, который присутствует в коже, костной ткани, сухожилиях и роговице. Коллаген - это белок белых (коллагеновых) волокон, состоящий из тройной спирали длиной примерно 290 нм. Пять таких тройных спиралей (молекул тропоколлагена) расположены в шахматном порядке и образуют микрофибриллу диаметром примерно 3,6 нм. Эти микрофибриллы имеют полярные и неполярные сегменты, которые легкодоступны для специфических меж- и внутрифибриллярных взаимодействий. Микрофибриллы упакованы в тетрагональную рештку и образуют субфибриллы диаметром примерно 30 нм. Эти субфибриллы затем собираются в коллагеновую фибриллу, основную единицу соединительной ткани, имеющую диаметр несколько сотен нанометров и поэтому видны через оптический микроскоп в виде тонкой линии. Коллаген может применяться в качестве материала для закрытия ран, возможно с покрытием, содержащим фибриновый клей. Фибриновые клеи, т.е. комбинация фибриногена, тромбина и апротинина,в течение многих лет находят успешное терапевтическое применение для склеивания тканей и нервных волокон и для закрытия поверхностей при слабом кровотечении. Одним из недостатков фибриновых клеев является то, что в случае сильного кровотечения клей обычно смывается до того, как произойдет достаточная полимеризация фибрина. Для устранения этого недостатка хирурги начали вручную наносить жидкие фибриновые клеи на абсорбируемые носители, например пучок коллагеновых волокон. Несмотря на впечатляющий успех такого совместного применения, этот метод до сих пор в широких масштабах не применяется, что обусловлено некоторыми его недостатками. Так, приготовление препарата относительно обременительно, метод требует опыта и квалификации персонала, и в экстренных случаях применить препарат немедленно нельзя - для его приготовления требуется 10-15 мин. Указанные факторы стимулировали разработку фиксированной комбинации коллагенового носителя с покрытием из твердого фибриногена, твердого тромбина и твердого апротинина, известной из ЕР 0059265. Функция коллагенового носителя, описанная в ЕР 0059265, заключается, главным образом, в абсорбировании коагулирующиго препарата, которым он покрыт, и в придании ему механической устойчивости. Продукт, сочетающий в себе кровоостанавливающие свойства фибринового клея с преимуществами коллагена как носителя, разработан и выпускается под товарным знаком TachoComb. TachoComb это готовая к пользованию и легкая в применении комбинация коллагеновой заплатки, покрытой сле-1 006700 дующими активными компонентами фибринового клея: фибриноген человека, бычий тромбин и бычий апротинин.TachoComb продается с начала 1990-х гг. компанией Nycomed Pharma и прошел клинические испытания в Европе на более чем 2500 больных. Кроме того, продукт прошел программу клинических испытаний в Японии на более чем 700 больных с самыми разными показаниями, например резекции печени и легкого, операция желчного тракта, хирургия селезенки, почек и панкреатическая хирургия, хирургия уха, горла, носа, оперативная гинекология и сердечно-сосудистая хирургия. TachoComb был признан эффективным и безопасным. В ходе проведенных клинических испытаний никаких клинических осложнений, связанных с применением TachoComb, не отмечено. Вместе с тем, при исследованиях в Японии были отмечены антитела против апротинина. За годы клинического применения заплаток TachoComb известны всего лишь 37 спонтанных побочных реакций на это лекарственное средство. Шестнадцать из этих реакций теоретически можно отнести к реакциям против компонентов TachoComb (лихорадочное состояние, гипертермия, эозинофильный лейкоцит, продолжительное протромбиновое время (время Квика), повышенная чувствительность,иммунные или аллергические реакции). Одна их побочных реакций на лекарственное средство (иммунная реакция) была явно связанной с лечением TachoComb. В WO 97/37694 (компания Immuno France S.A.) описан пример 4, когда при использовании коллагенового продукта TachoComb не удалось остановить кровотечение, что привело к смерти от потери крови, в отличие от остановки кровотечения в течение 5 мин, когда использовался коллагеновый продукт, не содержавший тромбина и приготовленный в соответствии с WO 97/37694. В WO 94/40033 подчеркиваются недостатки бычьего тромбина, используемого в TachoComb. Они заключаются в том, что использование тромбина коров и других видов скота может привести к занесению опасного вирусного загрязнения и возможному переносу болезней коров, например губчатой энцефалопатии коров. Подробное описание Изобретение относится к твердой композиции, состоящей из носителя, обладающего по крайней мере одним из следующих физических свойств: модуль упругости: 5-100 Н/см 2, например 10-50 Н/см 2; плотность: 1-10 мг/см 3, например 2-7 мг/см 3; диаметр камеры: более 0,75 мм и менее 4 мм и (или) диаметр камеры в среднем менее 3 мм,и равномерно распределенных и зафиксированных на указанном носителе б) твердого фибриногена и в) твердого тромбина. Композиция может обладать двумя, тремя или всеми из вышеупомянутых свойств. В предпочтительных вариантах осуществления материал носителя приготавливают, как описано в DK РА 2001 00135 и, далее, в заявке под названием "Способ приготовления коллагеновой губки, устройство для извлечения части коллагеновой пены и удлиненная коллагеновая губка", поданной компанией Nycomed Pharma 25 января 2002 г., притязающей на приоритет по этой заявке. В данном контексте термин "диаметр камеры" следует понимать как наибольшее расстояние по прямой между стенками камеры, т.е. наибольшее диагональное расстояние камеры по прямой. Камеры могут быть многоугольной формы, например восьмиугольной. Таким образом, если носитель разрезать, камеры делятся и получаются разрезанными на полости. Твердый фибриноген и твердый тромбин зафиксированы на носителе и их основная часть находится в полостях, что обеспечивает практически равномерное распределение твердого тромбина и твердого фибриногена. Благодаря этому, а также фиксации, на носитель можно нанести значительные количества фибриногена и тромбина в отличие от ситуации, когда на материал наносят жидкие композиции тромбина и фибриногена, например, каплями или напылением. Приготовление покрытого носителя Приготовление покрытого носителя заключается, по существу, в следующем:- приготовление суспензии активных ингредиентов;- равномерное распределение суспензии на носитель;- высушивание покрытого носителя до твердой композиции/фиксации активных ингредиентов на носителе. Приготовление суспензии с фибриногеном и тромбином включает в себя: приготовление смеси фибриногена и спирта, например этилового спирта; приготовление смеси тромбина и спирта, например этилового спирта; смешивание смеси фибриногена и смеси тромбина для получения указанной суспензии. На стадии приготовления смесей смесь можно гомогенизировать или пропустить через сито с получением суспензии, содержащей частицы со средним диаметром по Folk Ward 25-100 мкм. При этом температуру поддерживают в пределах 0-12 С. Носителем может быть коллагеновый носитель, например коллагеновая губка. Коллагеновая губка может отвечать по крайней мере одному, но предпочтительно нескольким из следующих критериев:-2 006700 значение р: 5,0-6,0; содержание молочной кислоты не более 0,5%; содержание аммония: не более 0,5%; содержание растворимого белка, рассчитанного как содержание альбумина, не более 0,5%; содержание зол сульфатов не более 1,0%; содержание тяжелых металлов не более 20 млн.-1; микробиологическая чистота не более 103 КОЕ/г; содержание коллагена 75-100%; плотность 1-10 мг/см 3; модуль упругости 5-100 Н/см 2. В предпочтительном варианте осуществления коллагеновый носитель приготавливают, как описано в DK РА 2001 00135. Физические свойства трех образцов коллагеновых носителей приведены в таблице ниже: Равномерное распределение суспензий осуществляют либо с помощью капельного устройства, описанного в патентах США 5942278 и 6177126, или для нанесения суспензии на носитель можно использовать аппликатор, имеющий по крайней мере одну форсунку. Струйный аппликатор под давлением подает суспензию через форсунку при перемещении носителя и форсунки относительно друг друга. Аппликатор может содержать ленточный конвейер, устройство для перемешивания, соединенное с насосом или системой насосов или иным подающим оборудованием, или его можно располагать рядом с ними, и форсунку или систему форсунок, которые перемещаются в поперечном направлении, например, под прямым углом к ленточному конвейеру. В зависимости от конкретных характеристик среды форсунка или система форсунок могут иметь разные формы и размеры. Форсунку или систему форсунок можно трубками подключить к подающему оборудованию. Подающее оборудование может обеспечивать подачу среды покрытия из устройства для перемешивания в системы форсунок. В процессе нанесения покрытия систему форсунок можно перемещать поперек носителя. В положении ожидания ее можно держать в стороне от ленточного конвейера. Процесс нанесения покрытия можно запускать по сигналу светового датчика, который обнаруживает присутствие носителя на ленте конвейера, и точно так же можно останавливать по сигналу светового датчика. Такой аппликатор обеспечивает относительно малое мертвое пространство, легок в обращении, включая легкость чистки. Далее, он обеспечивает возможность в любой момент прервать процесс нанесения покрытия, им можно пользоваться в относительно широком диапазоне значений вязкости, и он обеспечивает однородное покрытие. С помощью обеих систем наносят 0,08-0,12 мл суспензии на 1 см 2 носителя. Одной из важных стадий является сушка суспензии фибриногена, тромбина и спирта, нанесенной как влажное покрытие на поверхность носителя. В одном из примеров способа к носителю с нанесенным покрытием прикладывают давление ниже 1000 мбар для сушки покрытия на поверхности носителя и закрепления высушенного покрытия на покрываемой поверхности. При использовании вакуума в процессе нанесения покрытия можно поддерживать низкую температуру (2-10 С) и высокую относительную влажность (80-95%), благодаря чему можно сохранить структуру и физические свойства носителя, в частности, носителя в виде коллагена, например коллагеновой губки, а также фибриногена и тромбина. Выражение "состоящая по существу из" означает, что все три компонента являются для данного изобретения существенными и необходимыми. Вместе с тем, в композиции могут присутствовать и несущественные добавки, например, ионы кальция и окрашивающий маркер, например рибофлавин. Кроме того, композиция может содержать другие полезные ингредиенты, например одну или более активных фармацевтических субстанций, которые можно, например, выбрать из группы, состоящей из антибиотиков, например антибактериальных или противогрибковых средств, и противоопухолевых средств. Хотя в предпочтительном варианте осуществления материалом носителя является коллагеновая губка, которая содержит коллаген типа I млекопитающих, из трансгенных или рекомбинантных источни-3 006700 ков, его можно приготовить с использованием других типов коллагена, например коллагена типа I, II, III,IV, VII и X. Вместе с тем, предполагается, что носителем можно быть и разлагаемый микроорганизмами полимер, например полигиалуроновая кислота, полиоксикислота, например молочная кислота, глюколовая кислота, оксибутановая кислота, целлюлоза или желатин. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит носитель с одной или более активными сторонами, в которых имеются фибриноген в количестве 2-10 мг/см 2, например 4,3-6,7 мг/см 2, предпочтительно примерно 5,5 мг/см 2, и тромбин в количестве 1,0-5,5 МЕ/см 2, предпочтительно примерно 2,0 МЕ/см 2. Фибриноген и(или) тромбин предпочтительно являются человеческими, например,взятые из естественного источника и очищенные известными способами, или трансгенным или фибриногеном и(или) тромбином человека, полученными известными способами. Все известные продукты, например TachoComb, Beriplast и TissueSeal, могут содержать апротинин или подобные антифибринолитические средства. Апротинин можно получить только у коров. Задачей настоящего изобретения было разработать композицию с улучшенным материалом носителя и только компонентами человеческого, трансгенного или рекомбинантного происхождения. Поэтому разработки проводились в направлении материала носителя, который исследовался на предмет возможности замены бычьего тромбина тромбином человека и исключения апротинина. Исследования в этом направлении проводились в два этапа. Прежде всего, был разработан TachoComb H как последующий продукт препарата TachoComb, у которого, например, бычий тромбин заменен тромбином человека. Клинический опыт примененияTachoComb H был накоплен в ходе ряда терапевтических контрольных (фаза IIIa) клинических испытаний для ряда показаний: остановка кровотечения, склеивание и закрытие тканей. Еще не опубликованные результаты, полученные в ходе этих исследований, подтвердили эффективность и безопасностьTachoComb H при борьбе с кровотечением и утечками воздуха. Он показал себя как эффективное терапевтическое средство в дополнение к зашиванию при гемостазе, склеивании и закрытии тканей. В частности, эффективность TachoComb H в достижении локального гемостаза, проявившаяся в значительном сокращении времени до остановки кровотечения по сравнению с контрольной группой, была убедительно продемонстрирована при операциях как на сосудах, так и на печени. Кроме того, установлено, что TachoComb H способен уменьшить размер дефектов (пороков) легких,обеспечивая тем самым более быстрое устранение утечек воздуха, и может быть полезен при закрытии сильных пульмональных утечек и в случае эмфизематозных легких. Вместе с тем, как TachoComb, так и TachoComb H в качестве составной части продукта содержат апротинин. Считается, что апротинин необходим для ингибирования возможного превращения небольших количеств плазминогена в плазмин в фибриногенном компоненте и предотвращения преждевременного лизиса фибринового сгустка, особенно в условиях гиперфибринолиза. Для проверки утверждения о том, что апротинин необходим, изобретатели разработали новые опыты. Результаты экспериментов in vitro показали антифибринолитическую защиту апротинина в сгустке и что TachoComb без апротинина (TachoComb S) не растворился за очень короткий промежуток времени. Поэтому были разработаны модели на животных с напряженными условиями, и проведено сравнениеTachoComb S с TachoComb H с целью доказательства их одинаковой эффективности. Во всех моделяхTachoComb H или S, соответственно, использовались только как средство остановки кровотечения. Для того, чтобы исследовать эффективность и гистопатологическую природу предпочтительного варианта осуществления изобретения TachoComb S в сравнении TachoComb H, проведены серии обширных экспериментов. TachoComb S или TachoComb H наносили на такие органы, как печень, селезнка,поджелудочная железа или головной мозг собак, свиней или кроликов. Эксперименты были разработаны с таким расчетом, чтобы отражать нормальные условия операции, очень напряженные условия и условия гиперфибринолиза. Результаты, полученные в ходе этих четырех исследований, не свидетельствуют о каком-либо различии между TachoComb S и TachoComb H. С точки зрения кровоостанавливающей и ранозакрывающей эффективности оба продукта вели себя одинаково, в том числе и при очень напряженных условиях, подобных повышенному внутриорганному давлению или гиперфибринолизу, вызванному локальным применением рекомбинантного тканевого активатора плазминогена (r-tPA). Из вышесказанного можно сделать вывод о том, что предклиническая программа, разработанная с целью оценки абсолютной необходимости апротинина в качестве компонента TachoComb H, показала одинаковую эффективность TachoComb S и TachoComb H. Оба продукта успешно применялись только как кровоостанавливающее средство при гемостазе, склеивании и закрытии тканей. Нежелательных реакций тканей в ходе экспериментов на животных отмечено не было. Исходя из этого, апротинин из предлагаемой композиции исключен. Ожидается, что клинически предлагаемая композиция будет обладать теми же кровоостанавливающими свойствами, свойствами склеивания и закрытия тканей, как и ее предшественники, и такой же или даже более высокой степенью безопасностью. Отсутствие апротинина, который в настоящее время получают только от коров, способствует защите от реакций, обусловленных повышенной чувствительностью. В этом отношении следует отметить, что в трех проведенных в Японии исследованиях образовы-4 006700 вались антитела против апротинина. При применении композиции без апротинина подобная иммунная реакция не ожидается. В предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к композиции для остановки кровотечения, склеивания и закрытия тканей, которая содержит эластичный носитель, обладающий по крайней мере одним из следующих физических свойств: модуль упругости 5-100 Н/см 2, например 10-50 Н/см 2; плотность 1-10 мг/см 3, например 2-7 мг/см 3; диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм и (или) диаметр камеры в среднем менее 3 мм,который также содержит твердый фибриноген и твердый тромбин и не содержит какого-либо антифибринолитического средства, например апротинина, -аминокапроновой кислоты или 2 антиплазмина, причем твердый фибриноген и твердый тромбин прочно связаны с носителем так, что при встряхивании в аппарате для встряхивания Vibrofix при частоте вращения примерно 1000 об/мин в течение 2 мин истирание составляет менее 1,0 мг/см 2, и если материал носителя с нанесенным покрытием помещают в устройство для эндоскопии и затем извлекают, материал остается практически неизменным и имеет потерю материала покрытия менее 20%, что свидетельствует об эластичности носителя и прочном сцеплении твердого фибриногена и твердого тромбина, и указанный материал является практически воздухо- и водонепроницаемым и имеет коэффициент упругости не менее 1,25, определенный путем испытания, которое включало в себя фиксацию носителя с нанесенным покрытием на листе латекса, растягивание латекса путем трехкратного прикладывания давления и после третьего раза измерение площади носителя с нанесенным покрытием в момент наибольшего растягивания латексного листа и сравнение растянутой площади носителя с нанесенным покрытием с исходной площадью с нанесенным покрытием. Предпочтительный вариант осуществления, отличающийся тем, что фибриноген и тромбин являются человеческими, т.е. получены из естественного источника и очищены, или трансгенными или рекомбинантными фибриногеном и тромбином человека, является единственным имеющимся не бычьим фибриновым средством закрытия с комбинацией активных компонентов, фиксированной на эластичном носителе, и обладает рядом преимуществ: легкость применения, отсутствие необходимости в отнимающем много времени оттаивании или подготовительной процедуры,легкость нанесения непосредственно на многие поверхности тканей и органов,возможность применения с помощью устройства для эндоскопии,отсутствие проблем с нагноением при гемостазе или промывкой целевой зоны,сочетание клеящего действия при образовании фибринового сгустка и механической опоры эластичного носителя,высокая эластичность и способность выдерживать сильное растяжение и сжатие,эффективные остановка кровотечения и закрытие тканей в течение 3-5 мин,хорошие показатели безопасности, т.е. отсутствие бычьих компонентов,разлагаемость микроорганизмами с остающимися лишь мелкими шрамами на тканях,может храниться при температуре от 2 до 8 С с ожидаемым сроком хранения 36 месяцев или при комнатной температуре в течение не менее 2 лет. Разработка композиции по предпочтительному варианту осуществления продиктована желанием избавиться от последнего бычьего компонента, чтобы исключить любой, даже чисто теоретический риск передачи болезней от коров людям, в том числе передающиеся губчатые энцефалопатии. Таким образом,активные компоненты фибриноген и тромбин являются человеческими, а бычий апротинин, ингибитор фибринолиза, исключен. Таким образом, преимущество предпочтительной композиции, не содержащей бычьих компонентов, заключается в том, что исключен риск передачи через бычий материал болезней, в том числе губчатой энцефалопатии коров. Как и в случае других двухкомпонентных клеев, предлагаемая композиция действует путем воспроизведения последней стадии системы свертывания. Смесь фибриногена и тромбина образует на поверхности эластичного носителя зафиксированный твердый слой. При контакте с жидкостями, например,с кровоточащей поверхностью, общей водой организма или физиологическим раствором компоненты слоя растворяются, диффундируют в полости раны и вступают в реакцию. Процесс полимеризации создает прочное сцепление между поверхностью раны и заплаткой носителя. В течение времени, необходимого для склеивания, т.е. 3-5 мин, композицию предпочтительно следует осторожно прижимать к поверхности раны. Заплатка носителя обеспечивает механическую опору,которая позволяет тампонировать рану. При сильном кровоточении раны заплатка удерживает компоненты свертывания и предотвращает возможное повторное кровотечение. Механизм действия состоит в превращении фибриногена тромбином в фибрин путем расщепления пептидов. Мономеры фибрина спонтанно полимеризуются в цепи фибрина и образуют вязкий и эластичный сгусток, который склеивает заплатку с поверхностью раны. После этого фибриновый матрикс служит каркасом для миграции фибринобластов (фиг. 8). Как и в случае любого двухкомпонентного клея, поверхность раны и носитель склеиваются за счет полимеризации. Механическая устойчивость заплатки носителя дополняет кровоостанавливающее дей-5 006700 ствие свертывания фибрина тампонадой. Далее, активные субстанции присутствуют только на поверхности носителя, обращенной к поверхности раны и в силу тампонады и легкого прижимающего давления не диффундируют через носитель. Следовательно, и в отличие от ситуации, когда используются большинство фибриновых клеев, при применении предлагаемой композиции не происходит склеивание поврежденной ткани, покрытой предлагаемой композицией, с другими органами или частями тела. В отличие от цианоакрилатных и желатино-резорцин-формальдегидных клеев, которые обладают высокой гистотоксичностью к паренхиматозной ткани, предлагаемая твердая композиция разлагается физиологически и в течение недель или месяцев после применения заменяется тканью, главным образом,двумя механизмами: 1. Фибриновый сгусток разлагается частично фирбинолизом и частично клеточным фагоцитозом. 2. Носитель разлагается слой за слоем абсорбирующей грануляционной тканью и превращается в псевдокапсулу, состоящую из эндогенной соединительной ткани. Предлагаемая композиция эффективна для остановки кровотечения, склеивания и закрытия тканей,в частности, при хирургическом вмешательстве в желудочно-кишечную систему, например пищевод,желудок, тонкая кишка, толстая кишка, прямая кишка, или паренхиматозные органы, например печень,селезенка, поджелудочная железа, почки, легкие, надпочечные железы, щитовидная железа или лимфатические узлы, при хирургии сердечно-сосудистой системы, хирургии грудной клетки, включая операцию на трахее, бронхах и легких, при хирургическом вмешательстве в область уха, горла, носа, включая стоматологическую операцию, при оперативной гинекологии и урологии, костной хирургии (например,резекция спонгиоза) и неотложной хирургии, оперативной неврологии, при лимфатических, желчных и ликворных свищах и утечках воздуха при хирургии грудной клетки и легких. Изобретение относится и к применению описанных композиций для указанных целей. Следует подчеркнуть, что предлагаемая композиция является практически воздухо- и влагонепроницаемой. Благодаря этому продукт особенно эффективен для лечения лимфатических, желчных и ликворных свищей и утечек воздуха при хирургии грудной клетки и легких. Далее, благодаря тому, что продукт является практически влагонепроницаемым, он очень эффективен при операциях на сильно кровоточащих органах, например печени и селезенке, и операциях, например, на желудочно-кишечном тракте. Предлагаемый продукт должен применяться, когда кровотечение или лимфатические, желчные и ликворные свищи или утечки воздуха невозможно устранить обычными методами или если эти методы дают неблагоприятные результаты. В предпочтительном варианте осуществления носителем является коллагеновая губка, коллагеновые волокна или заплатка - термины, которые в описании и формуле изобретения используются синонимично. Компоненты - коллаген, фибриноген и тромбин - предпочтительно имеют происхождение от млекопитающих. Предпочтительно, твердые компоненты являются человеческими. Коллаген, фибриноген и тромбин могут быть либо полученными из естественного источника и очищенными, либо трансгенными или рекомбинантными фибриногеном и (или) тромбином человека. В одном из предпочтительных вариантов осуществления источником коллагена является лошадь. Для того, чтобы предотвратить передачу через коллагеновую заплатку вирусов из-за контаминации вирусами лошади, которые патогенны для человека, как меры предосторожности важны тщательный выбор исходного материала и инактивация потенциально патогенных факторов в процессе приготовления.-7 006700 Примеры Примеры иллюстрируют различные способы приготовления коллагеновой губки с покрытием с разными исходными материалами фибриногена и тромбина. Исходные материалы фибриногена Пример I. В этом примере суспензия содержит фибриноген человека состава В и тромбин человека состава В. Окончательный объем суспензии 3500 мл получили с использованием следующих количеств и параметров: Смесь фибриногена:- 2800 мл этилового спирта (94% при 2-8 С);- 492,5 г фибриногена человека состава В;- 493,5 мг рибофлавина. Смесь фибриногена хранили в течение 8-16 ч при 2-8 С при помешивании. Смесь тромбина:- 100 мл этилового спирта (100% при -30 С);- 12,27 г тромбина человека состава В. Смесь тромбина хранили в течение 8-16 ч при -30 С. Суспензия:- К смеси фибриногена добавили 157 мл смеси тромбина;- Добавкой 94%-ного этилового спирта при 2-8 С объем суспензии довели до окончательного 3500 мл. Характеристики суспензии: 1. Концентрация этилового спирта 94,3%. 2. Осаждение: а) объем осаждения через 5 мин после начала: 98% испытательного объема; б) объем осаждения через 24 ч после начала: 64 % испытательного объема. 3. Размер частиц (средний диаметр по Folk Ward): 56,51,3 мкм. На носители в виде полосок коллагена суспензией нанесли покрытие. Вначале предварительно инкубировали 48 полосок коллагеновой губки в охладительной камере при следующих условиях: температура 5,2 С; абсолютная влажность 4,8 г воды на кг воздуха; время инкубации 18,5 ч. Полоски коллагеновой губки с нанесенным покрытием высушили следующим образом:-8 006700 Полоски с нанесенным покрытием инкубировали в течение 15 мин при температуре 5,2 С и абсолютной влажности 4,8 г воды на кг воздуха. Затем полоски с нанесенным покрытием высушили в вакуумной сушильной камере при следующих условиях сушки: воздух: температура 5,2 С, абсолютная влажность 4,8 г воды на кг воздуха; расход воздуха через дыхательный клапан 23 м 3/ч; вакуум 59 мбар; время сушки 4 ч. Истирание полученного покрытия на полосках коллагеновой губки при встряхивании в аппарате для встряхивания Vibrofix при частоте вращения примерно 800-1200 об/мин в течение 2 мин составило примерно 0,2 мг/см 2. Пример II. В этом примере суспензия содержит фибриноген человека состава С и тромбин человека состава С. Окончательный объем суспензии 3500 мл получили с использованием следующих количеств и параметров: Смесь фибриногена: 2252 мл этилового спирта (94% при 2-8 С); 370,7 г фибриногена человека состава С; 493,5 мг рибофлавина. Смесь фибриногена хранили в течение 8-16 ч при 2-8 С при помешивании. Смесь тромбина: 188 мл этилового спирта (100% при -30 С); 12 пузырьков тромбина человека состава С (10650 МЕ/пузырек)/12 мл воды для инъекций. Смесь тромбина хранили в течение 8-16 ч при -30 С. Суспензия: К смеси фибриногена добавили 164,5 мл смеси тромбина; Добавкой 94%-ного этилового спирта при 2-8 С объем суспензии довели до окончательного 3500 мл. Характеристики суспензии: 1. Концентрация этилового спирта 94,1%. 2. Осаждение: а) объем осаждения через 5 мин после начала: 94% испытательного объема; б) объем осаждения через 24 ч после начала: 71% испытательного объема. 3. Размер частиц (средний диаметр по Folk Ward): 49,20,93 мкм. На носители в виде полосок коллагена суспензией нанесли покрытие. Вначале предварительно инкубировали 48 полосок коллагеновой губки в охладительной камере при следующих условиях: температура 4,8 С; относительная влажность 90,3%; время инкубации 22,25 ч. Полоски коллагеновой губки с нанесенным покрытием высушили следующим образом: Полоски с нанесенным покрытием инкубировали в течение 13 мин при температуре 4,9 С и абсолютной влажности 4,8 г воды на кг воздуха. Затем полоски с нанесенным покрытием высушили в вакуумной сушильной камере при следующих условиях сушки: воздух: температура 5,2 С, абсолютная влажность 4,9 г воды на кг воздуха; расход воздуха через дыхательный клапан 25 м 3/ч; вакуум 60 мбар; время сушки 4 ч. Истирание полученного покрытия на полосках коллагеновой губки при встряхивании в аппарате для встряхивания Vibrofix при частоте вращения примерно 800-1200 об/мин в течение 2 мин составило примерно 0,3 мг/см 2. Пример III. В этом примере суспензия содержит фибриноген человека состава С и тромбин человека состава С. Окончательный объем суспензии 780 мл получили с использованием следующих количеств и параметров: Смесь фибриногена: 700 мл этилового спирта (94% при 2-8 С); 84,42 г фибриногена человека состава С; 110 мг рибофлавина. Смесь фибриногена хранили в течение 8-16 ч при 2-8 С при помешивании. Смесь тромбина: 35 мл этилового спирта (100% при -30 С);-9 006700 0,54 г тромбина человека состава С. Смесь тромбина хранили в течение 8-16 ч при -30 С. Суспензия: К смеси фибриногена добавили 23,0 мл смеси тромбина; Добавкой 100%-ного этилового спирта при 2-8 С объем суспензии довели до окончательного 780 мл. Характеристики суспензии: 1. Концентрация этилового спирта 94%. 2. Осаждение: а) объем осаждения через 5 мин после начала: 92% испытательного объема; б) объем осаждения через 24 ч после начала: 72% испытательного объема. 3. Размер частиц (средний диаметр по Folk Ward): 60,50,5 мкм. На носители в виде полосок коллагена суспензией нанесли покрытие. Вначале предварительно инкубировали 8 полосок коллагеновой губки в охладительной камере при следующих условиях: температура 6,0 С; относительная влажность 85%; время инкубации 18,5 ч. Полоски коллагеновой губки с нанесенным покрытием высушили следующим образом: Полоски с нанесенным покрытием инкубировали в течение 45 мин при температуре 5 С и относительной влажности 85%. Затем полоски с нанесенным покрытием высушили в вакуумной сушильной камере при следующих условиях сушки: воздух: температура 5 С, относительная влажность 85%; расход воздуха через дыхательный клапан 1,2 м 3/ч; вакуум 35 мбар; время сушки 4 ч. Истирание полученного покрытия на полосках коллагеновой губки при встряхивании в аппарате для встряхивания Vibrofix при частоте вращения примерно 800-1200 об/мин в течение 2 мин составило примерно 0,3 мг/см 2. Пример IV. В этом примере суспензия содержит фибриноген человека состава А и тромбин человека состава А. Окончательный объем суспензии 3120 мл получили с использованием следующих количеств и параметров: Смесь фибриногена: 2540 мл этилового спирта (100% при 2-8 С); 311,6 г фибриногена человека состава С; 440 мг рибофлавина. Смесь фибриногена хранили в течение 8-16 ч при 2-8 С при помешивании. Смесь тромбина: 210 мл этилового спирта (100% при -30 С); 229 г тромбина человека состава С. Суспензия: К смеси фибриногена добавили 87,3 мл воды для инъекций; К смеси фибриногена добавили смесь тромбина; Добавкой 100%-ного этилового спирта при 2-8 С объем суспензии довели до окончательного. Характеристики суспензии: 1. Концентрация этилового спирта 97%. 2. Осаждение: а) объем осаждения через 5 мин после начала: 95,6% испытательного объема; б) объем осаждения через 24 ч после начала: 63,5% испытательного объема. 3. Размер частиц (средний диаметр по Folk Ward): 51,80,8 мкм. На носители в виде полосок коллагена суспензией нанесли покрытие. Вначале предварительно инкубировали 48 полосок коллагеновой губки в охладительной камере при следующих условиях: температура 6,5 С; относительная влажность 90%; время инкубации 22,5 ч. Полоски коллагеновой губки с нанесенным покрытием высушили следующим образом: Полоски с нанесенным покрытием инкубировали в течение 10 мин при температуре 6,5 С и относительной влажности 90%. Затем полоски с нанесенным покрытием высушили в вакуумной сушильной камере при следующих условиях сушки:- 10006700 воздух: температура 6,5 С, относительная влажность 90%; расход воздуха через дыхательный клапан 21 м 3/ч; вакуум 58 мбар; время сушки 4 ч. Истирание полученного покрытия на полосках коллагеновой губки при встряхивании в аппарате для встряхивания Vibrofix при частоте вращения примерно 800-1200 об/мин в течение 2 мин составило примерно 0,1 мг/см 2. Пример 1. Апротинин как компонент TachoComb Исследование in vitro антифибринолитической активности при условиях смывания, подобных ситуации in vivo Цель данного исследования заключалась в том, чтобы показать эффективность апротинина как компонента TachoComb H в условиях гиперфибринолиза путем использования испытательных моделейTachoComb S - это белого цвета с желтоватым или сероватым оттенком с нанесенным покрытием губкоподобная заплатка. Эта заплатка из вспененного сухого коллагена используется в качестве носителя активных твердых компонентов. Активная сторона желтого цвета. 1 см 2 заплатки TachoComb S (толщиной 0,5 см) состоит из следующего: Коллаген лошадиного происхождения 2,1 мг с покрытием из следующего: Фибриноген человека 5,5 мг Тромбин человека 2,0 ME Рибофлавин (желтого цвета как маркр поверхности с покрытием) 16,5 мкг Экспериментальные испытания in vivo с целью определения дозы подтвердили, что указанные выше концентрации тромбина и фибриногена обеспечивают максимальную прочность сцепления (см. пример 3).TachoComb S, содержащим в качестве активных компонентов только тромбин человека и фибриноген человека. Для количественного определения эффективности при разных условиях гиперфибринолиза, которые можно было считать соответствующими реальным операционным условиям и которые позволили провести ряд испытаний, необходимых для демонстрации существенного эффекта, были разработаны две испытательные модели. В испытательной модели 1 испытуемый образец нанесли на синтетическую ткань как поверхность сцепления. В ткани прорезали определенное отверстие, имитирующее, например, перфорацию кровеносного сосуда. На образец через отверстие воздействовали двумя разными фибринолитическими растворами (инкубационными растворами). Один из этих растворов дополнительно содержал антифибринолитический компонент 2-антиплазмин. Состав инкубационных растворов: Все субстанции разбавлены в буфере 1: 50 мМ трометанола, 100 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2, 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (не содержащего протеазы), 0,5 мг/мл азида натрия/мл. Инкубационный раствор I (1 мкМ плазминоген, 1 нМ тканевый активатор плазминогена (tPA), 1 мкМ 2-антиплазмин); 49 мкл буфера 1, рН 7,4; 50 мкл раствора плазминогена (концентрированный 4,9 мкМ Coachrom, активность плазминогена человека); 50 мкл раствора тканевого активатора плазминогена (50 нМ) 100 мкл раствора 2-антиплазмина(2,5 мкМ). Инкубационный раствор II (1 мкМ плазминоген, 1 нМ тканевый активатор плазмогена) 149 мкл буфера 1, рН 7,4; 51 мкл раствора плазминогена (концентрированный 4,9 мкМ Coachrom, активность плазминогена человека); 50 мкл раствора тканевого активатора плазминогена (50 нМ). Для имитации смывания инкубационный раствор меняли каждые два часа. При этом контролировали сцепление. К образцу прикладывали давление 50 мбар. Регистрировали время, когда образец отставал при давлении 50 мбар. Испытательная модель 2 предназначалась для демонстрации фибринолитического действия поврежденной ткани кишки. Испытуемый образец нанесли на кишку свиньи (ex vivo) как поверхность сцепления. В кишке прорезали определенное отверстие, чтобы позволить инкубационному раствору вступать в контакт с фибриновым сгустком и имитировать смывание. Инкубационный раствор в регистрируемые- 11006700 моменты времени меняли, и при этом к образцу прикладывали давление 50 мбар. Регистрировали время,когда образец отставал при давлении 50 мбар. Полученные результаты выявили значительные различия между TachoComb H, содержащим апротинин, и TachoComb S без апротинина. В испытательной модели 1, в которой использовался инкубационный раствор, содержавший тканевый активатор плазминогена и плазминоген, время фибринолиза для TachoComb H составило 31,65,3 ч по сравнению с 8,31,8 ч для TachoComb S. В испытательной модели 2 время отделения для TachoComb H составило 78,416,3 ч по сравнению с 6,51,8 ч для TachoComb S. На испытуемом образце можно было по-прежнему наблюдать большое количество фибрина. Но под давлением с поверхности кишки образец отделился, поскольку прочность сцепления между фибриновым сгустком и поверхностью кишки ослабла. В обеих моделях антифибринолитическое действие апротинина как активного компонента можно было продемонстрировать очень наглядно. В испытательной модели 1 продление времени фибринолиза из-за присутствия апротинина в качестве активного компонента TachoComb H составило 320% для инкубационного раствора I, содержавшего 2-антиплазмин, и 380% для инкубационного раствора II без 2-антиплазмина. Испытательная модель 1 продемонстрировала также дополнительное антифибринолитическое действие 2-антиплазмина, выразившееся в продлении времени фибринолиза для TachoComb H с 31,6 до 41,2 ч (130%) и для TachoComb S с 8,3 до 12,8 ч (154%). Пример 2. Сравнение губки Nycomed с нанесенным покрытием (TachoComb S) с другими продуктами носителя с покрытием аналогичным TachoComb S. Сцепление слоя Метод 1. Нанесение покрытия на разные носители На поверхность размером 2 х 4,5 см каждого носителя наносили в качестве покрытия суспензиюTachoComb S. Количество суспензии соответствовало техническим условиям TachoComb (5,5 мг фибриногена/см 2). Образцы высушили. 2. Приготовили образец размером 1 х 4 см каждого носителя с нанесенным покрытием. 3. Сцепление слоя испытывали следующим образом: Описание метода Оборудование Аналитические весы (точность измерения 0,5 мг) Устройство для встряхивания Vibrofix в сочетании с устройством фиксации Линейка, градуированная в миллиметрах Секундомер, скальпель, пробирки внутренним диаметром 2 см с пробкой Метод Из носителя с нанесенным покрытием скальпелем вырезали кусок с нанесенным покрытием размером 1 х 4 см. Образец поместили во взвешенную пробирку с пробкой. Затем его встряхивали в аппарате для встряхивания Vibrofix (частота вращения: примерно 1000 об/мин) в течение 2 мин. Лист сняли, и остаточное количество материала покрытия (истирание: мг/см 2) повторно взвесили. Расчет: Комментарий Все носители, за исключением коллагеновой губки Nycomed, после нанесения покрытия не эластичны. Образец необходимо вырезать очень осторожно. При вырезании ножницами много материала покрытия расслаивается, поскольку сам слой жесткий. Заплатка Ethisorb Patch вообще не соединилась с материалом покрытия. При легком встряхивании все покрытие облезло как "ковер". Разница между коллагеновой губкой Nycomed и остальными материалами носителя проявилась очень наглядно. Эластичность увлажненного носителя с нанесенным покрытием Метод 1. Покрытие разных носителей На поверхность размером 2 х 4,5 см каждого носителя наносили в качестве покрытия суспензиюTachoComb S. Количество суспензии соответствовало техническим условиям TachoComb (5,5 мг фибриногена/см 2). Образцы высушили. 2. Приготовили образец размером примерно 5-7 см 2 каждого носителя с нанесенным покрытием. Измерили точную начальную площадь сухого образца. 3. Образец увлажнили и поместили на эластичный лист из латекса, закрепленный в специальном устройстве (более подробно см. под заголовком "Метод"). После двух растягиваний и отпусков лист расширили в третий раз. Измерили площадь носителя при самом большем растяжении. Описание метода Устройство/химикаты Перистальтический насос (IKA PA-SF) Буферная бутыль под давлением (3 выпускных отверстия) Манометр VDO (пределы измерения 0-250 бар) Стеклянная воронка (диаметр отверстия 1: 30 мм; отверстия 2: 15 мм) Силиконовые трубки и зажимы, латексные рукавицы (Semper Med), скальпель,линейка, градуированная в миллиметрах, ножницы Физиологический раствор Метод К трем выпускным отверстиям буферной бутыли под давлением силиконовыми трубками присоединили следующее оборудование: а) перистальтический насос б) манометр в) стеклянная воронка (к отверстию 2) Из латексной рукавицы вырезали двойной лист размером примерно 8x8 см. Этот лист герметично закрепили на стеклянной воронке (отверстие 1). Из носителя с нанесенным покрытием скальпелем вырезали кусок размером примерно 5-7 см 2. Измерили площадь образца (начальную площадь). Покрытие образца увлажнили физиологическим раствором и поместили на латексный лист. Затем вручную прижали его к латексному листу примерно на 1 мин. Перистальтическим насосом латексный лист растянули путем прикладывания давления примерно 70 мбар. Эту операцию повторили дважды с отпусканием латексного листа после каждого растягивания. После третьего растяжения измерили площадь (длину и ширину) носителя при самом большем растяжении латексного листа. Расчет: Коэффициент "эластичности" = площадь носителя при третьем растяжении начальная площадь образца Результаты Комментарий Эластичность увлажненной коллагеновой губки Nycomed (TachoComb S) является одной из важных характеристик продукта. Эластичность играет важную роль при полостных операциях и хирургии грудной клетки. После склеивания носитель должен обладать способностью, например, расширяться и сжиматься вместе с легкими или кишками. Ethisorb вообще не продемонстрировала эластичности. Она сразу же отстала от покрытия. В ходе испытания Willospon Spezial и Opraskin с нанесенным покрытием имели структурные дефекты. Использование носителя с нанесенным покрытием в эндоскопической хирургии Метод 1. Нанесение покрытия на разные носители На поверхность размером 2 х 4 см каждого носителя наносили в качестве покрытия суспензиюTachoComb S. Количество суспензии соответствовало техническим условиям TachoComb (5,5 мг фибриногена/см 2). Образцы высушили. 2. Манипуляции с образцами носителя с нанесенным покрытием для применения в эндоскопической хирургии и потеря покрытия в результате этих манипуляций документально зарегистрированы цифровым фотооборудованием. Описание метода ОборудованиеEndodock: инструмент для эндоскопии, предназначенный для применения TachoComb в эндоскопической хирургии (см. фиг. 7). Цифровое фотооборудование. Перечень исследованных покрытий Метод Серия сделанных снимков каждого носителя: 1. Снимок: документальное оформление образцов носителя с нанесенным покрытием и без покрытия. 2. Снимок: образцы с нанесенным покрытием вставлены в оборудование для эндоскопии(Endodock). Образец необходимо вручную разгладить, чтобы намотать его на направляющий "палец". Затем образец осторожно вставляют в стальную трубку диаметром 10 мм. Документальное оформление образца, частично вставленного в трубку Endodock. 3. Снимок: образец осторожно вытянут. После этого его необходимо развернуть. Покрытие, отделившееся от носителя при этой операции, собирают сбоку носителя. Развернутый образец после вставки в оборудование для эндоскопии и потеря покрытия в результате этой манипуляции документально регистрируют. КомментарийTachoComb S (губка из лошадиного коллагена с нанесенным покрытием / Nycomed) в эндоскопической хирургии - это наиболее требовательное применение продукта. TachoComb S вставляют в оборудование для эндоскопии. Трубка этого оборудования обычно имеет диаметр 10-13 мм. Для того чтобы вставить в трубку, TachoComb S разглаживают и затем наматывают на направляющий "палец", после чего осторожно вставляют в трубку. Таким образом, соединение покрытия с носителем и внутри него должно быть прочным, но продукт в сухом состоянии должен оставаться достаточно эластичным, чтобы его можно было сгибать и разворачивать. Доставленный к месту операции TachoComb S осторожно вытягивают из трубки. Затем его необходимо развернуть и поместить на поверхность раны. Для этого часто- 14006700 требуются некоторые манипуляции. Поэтому сцепление слоя с носителем должно быть достаточно прочным, чтобы выдержать эти манипуляции. Результаты Результаты приведены на прилагаемых фиг. 1-6. Оценка потери материала покрытия приводится ниже:Collagen Sponge Nycomed5% Поскольку Ethisorb - это очень жесткий носитель, сцепление покрытия очень слабое. Из-за этого в ходе эксперимента Ethisorb утратил почти все покрытие. По сравнению с коллагеновой губкой Nycomed с нанесенным покрытием, все остальные исследованные носители имеют плоскую поверхность для нанесения покрытия. Поэтому покрытие лежит на носителе подобно "плоскому ковру". Это приводит к довольно неэластичной структуре сухих носителей с нанесенным покрытием. При изгибании или разворачивании часто разрушается само покрытие. После вставки носителей с нанесенным покрытием в трубку оборудования для эндоскопии и последующего развертывания образца все носители, за исключением коллагеновой губки Nycomed, теряют весьма значительное количество покрытия, в результате чего без материала покрытия остаются большие площади. Высокая эластичность TachoComb S в сухом или увлаженном состоянии обусловлена структурой и текстурой коллагеновой губки Nycomed. Коллагеновая губка Nycomed вспенена и имеет внутри многоугольные камеры. На поверхности эти камеры разрезаны на полости. Указанные полости увеличивают поверхность покрытия. При нанесении покрытия суспензию равномерно распределяют на структурированной поверхности. При сушке раствор, содержащий фибриноген и тромбин, фиксируется в указанных полостях как твердое вещество. Благодаря этому TachoComb S можно нарезать кусками нужного размера и вставлять в оборудования для эндоскопии с лишь небольшой потерей материала покрытия или вовсе без потерь. Высокая эластичность TachoComb S в сухом состоянии является большим преимуществом по сравнению со всеми другими исследованными носителями с нанесенным покрытием. Пример 3. Испытания активных компонентов с целью определения дозы Необходимая доза активных компонентов определена с помощью двух разных экспериментальных моделей, на которых измерили прочность сцепления: прочность при растяжении на печени крысы и прочность сцепления при повышенном внутритканевом давлении на почке крысы. А. Прочность при растяжении на печени крысы На левой доле печени крыс под наркозом сделали рану размером 1 х 1 см глубиной примерно 1 мм,чтобы получить просачивание крови. Рану закрыли кусочком TachoComb S размером 1 х 1 см, который соединили с пружинными весами. Измерили натяжение, при котором происходил отрыв TachoComb S. Б. Прочность сцепления при повышенном внутритканевом давлении на почке крысы На левой почке крыс под наркозом сделали одного уровня сильно кровоточащую рану примерно на четверть ее массы. Рану закрыли испытуемыми листиками TachoComb S. Давление в тканях повысили перекрыванием венозного оттока и закачиванием в почку изотопного раствора цитрата (рН 7,2). Измерили натяжение, при котором начинался отрыв TachoComb S. Таблица 1 Прочность сцепления TachoComb S при содержании разных количеств фибриногена- 15006700 Прочность сцепления TachoComb S при содержании разных количеств тромбина Полученные результаты выявили значительные различия между несколькими вариантами. Оптимальным для тромбина человека был диапазон 0,9-10 МЕ/см 2 при постоянном содержании фибриногена человека примерно 5 мг/см 2. Оптимальным для фибриногена человека был диапазон 2,9-7,2 мг/см 2 при постоянном содержании тромбина человека примерно 2,1 МЕ/см 2. Эти испытания in vivo подтвердили правильность концентрации фибриногена (4,3-6,7 мг/см 2) и концентрации тромбина (1,5-2,5 МЕ/см 2), которые используются в других составах TachoComb (TachoComb и TachoComb H), а также обеспечивают максимальную прочность сцепления для TachoComb S. Пример 4. Эффективность TachoComb S в закрытии ран селезенки и печени у собак Цель этого исследования заключалась в сравнении кровоостанавливающей эффективности TachoComb H (содержащей апротинин) с TachoComb S (без апротинина) на модели ран селезенки и печени у собак. Для симулирования просачивания крови были выбраны надрез и прокол (глубиной 0,5 см) селезенки. Для симулирования раны с сильно кровоточащей поверхностью выполнили резекцию кончика краниальной доли печени (2-3 см 2). На раны наложили заплатку TachoComb H или TachoComb S только как кровоостанавливающее средство (ту же самая заплатку использовали для ран селезенки и печени той же собаки). Аутопсию провели через 48 ч после операции, поскольку такое время - это период наибольшего риска повторного кровотечения в клинической практике. Полная остановка кровотечения была достигнута для обоих продуктов. При аутопсии через 48 ч вторичное кровотечение не обнаружили ни при общем осмотре, ни при гистологическом обследовании. Кроме того, гистологическое обследование не выявило различий в гемостазе и заживлении ран между собаками, которым прикладывали заплатку TachoComb Н или TachoComb S, при анализе ран селезенки и печени, закрытыми соответствующими заплатками. Вторичное кровотечение после операции не наблюдалось ни в одном из случаев. Данные подсчета форменных элементов крови дали аналогичные результаты для обеих групп с небольшим увеличением числа лейкоцитов через 48 ч после операции. Не отмечено никаких различий любого из других оценивавшихся параметров между группами или во времени. Кроме того, пробы на свертывание не выявили никаких различий, связанных с присутствием или отсутствием апротинина. Повышение содержания фибриногенов в крови через 48 ч после операции было очевидным у обеих групп. Увеличение числа лейкоцитов и повышение содержания фибриногенов в крови можно отнести к воспалительной реакции на хирургическую травму и не рассматриваются как токсичный побочный эффектTachoComb H или S. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что TachoComb S (без апротинина) обладает такой же эффективностью при лечении слабого и сильного кровотечения паренхиматозных ран у собак, как и TachoComb H (содержащая апротинин). При выбранных условиях присутствие или отсутствие апротинина на устойчивости сгустка не отражалось. Пример 5. Сравнительное кровоостанавливающее и ранозакрывающее действие и стойкость абсорбируемых TachoComb S и TachoComb H: экспериментальное исследование на свинье Цель исследования Цель испытания заключалась в том, чтобы оценить немедленную эффективность и кратковременную стойкость кровоостанавливающих волокон на ране селезенки у свиньи. Материал и методы Исследование проводилось на 24 самках свиней. Испытывались две произвольно выбранные группы кровоостанавливающих волокон: TachoComb H с апротинином и TachoComb S без апротинина. В день операции животному непосредственно в стандартную рану, выполненную хирургическим путем на вентральной части селезенки, вставили волокна.- 16006700 Немедленный и кровоостанавливающий эффект волокон оценили путем подсчета числа пузырей и измерения времени, необходимого для остановки кровотечения. Было отмечено прилипание TachoCombH и S. Спустя 72 ч исследовали краткосрочные поведение и стойкость обеих материалов, и с этой целью повысили внутриселезеночное давление (зажимом венозных сосудов). Когда давление достигло почти установившегося состояния, ввели шарик адреналина IV (0,02 или 0,04 мг) для повышения артериального давления, связанного или не связанного с вливанием хлоргидрата добутамина. После применения этих фармакологических субстанций был отмечен прорыв кровотечения на ране,залеченной TachoComb H и S у каждого животного. Результаты При операции на ране селезенки никаких различий между методами лечения с точки зрения кровоостанавливающего действия не выявлено. С другой стороны, спустя 72 ч макроскопический внешний вид обоих волокон был идентичным. Результаты измерений резкого давления и стойкости к прорыву не выявили значительных различий между двумя экспериментальными группами. Прорыва материала не произошло. Кровотечение раны наблюдалось у 4 животных с TachoComb S и 2 животных с TachoComb H (с одним дополнительным пузырем в группе 4). Результаты гистологического обследования свидетельствовали о том, что апротинин может оказывать на структуру коллагеновых волокон защитное действие; апротинин, похоже, модифицирует микроскопическую картину, снижая разложение коллагеновых волокон. Никакой специфической клеточной картины не наблюдалось. Заключение Исследовалась немедленная кровоостанавливающая активность 2 составов TachoComb (S и Н) на стандартной модели раны селезенки у 24 свиней. С точки зрения эффективности, приклеивания к ране и соответствия паренхиме оба материала ведут себя одинаково. Их эффективность была поражающей. Их стойкость к разложению микроорганизмами и протеолизу исследовали через 72 ч после операции путем повышения внутриселезеночного давления (механическим путем и фармакологическими средствами) и проверкой локальной стойкости коллагеновых волокон TachoComb H и S. Никаких значительных различий в стойкости 2 материалов не выявлено. Результаты гистопатологических исследований показали, однако, что протеолитическое разложениеTachoComb S было чуть более выраженным, чем у TachoComb H.TachoComb S или TachoComb H использовали только как кровоостанавливающее средство для закрытия сильно кровоточащих ран селезенки у свиней (поверхностные раны 2 х 3 см глубиной 3-5 см, n = 12 на группу). Спустя 72 ч внутриселезеночное давление повысили перевязкой селезеночной (-ых) вены(вен). После этого внутриселезеночное давление дополнительно повысили введением адреналина. Свиньи наблюдались на предмет признаков повторного кровотечения или возникновение кровяных пузырей под заплаткой. После аутопсии провели гистопатологию образцов (участок раны, закрытый заплаткойTachoComb S и TachoComb H продемонстрировали одинаковые эффективность, приклеивание к ране и соответствие паренхиме. Пример 6. Сравнительное кровоостанавливающее ранозакрывающее действие и стойкость абсорбируемых TachoComb S и TachoComb H: экспериментальное исследование на свинье на модели острого панкреатита Цель исследования Цель испытания заключалась в том, чтобы оценить немедленную эффективность и кратковременную стойкость кровоостанавливающих волокон на ране селезенки у свиньи на модели острого панкреатита. Материал и методы Исследование проводилось на 20 самках свиней. Испытывались две произвольно выбранные группы кровоостанавливающих волокон: TachoComb H с апротинином и TachoComb S без апротинина. В день операции животным непосредственно в стандартную рану, выполненную хирургическим путем на вентральной части селезенки, вставили волокна. Немедленный кровоостанавливающий эффект волокон оценили путем подсчета числа пузырей и измерения времени, необходимого для остановки кровотечения. Было отмечено прилипание TachoCombH и S. Затем стерильным шприцем прокололи желчный пузырь, желчь собрали и, чтобы вызвать панкреатит, через вирзунгов проток ввели 10 мл желчи. До операции и ежедневно после нее контролировали уровни ферментов в крови (уровни липаз и амилаз). Небольшие кусочки TachoComb H и S положили на паренхиму поджелудочной железы на ее соединении с кишкой.- 17006700 Спустя 72 ч исследовали краткосрочные поведение и стойкость TachoComb Н и S к ферментативному разложению, и с этой целью повысили внутриселезеночное давление (зажимом венозных сосудов и фармакологическими средствами). Когда давление достигло почти установившегося состояния, ввели шарик адреналина IV (0,02 или 0,04 мг) с последующим введением норадреналина 0,02 или 0,04 мг/мин для повышения артериального давления, связанного или не связанного с перфузией хлоргидрата добутамина 0,3-0,6 мг/мин. После применения этих фармакологических субстанций был отмечен прорыв кровотечения на ране,залеченной TachoComb H и S у каждого животного. Результаты На селезенке оба материала с точки зрения немедленной кровоостанавливающей эффективности,приклеивания к ране и соответствия паренхиме ведут себя одинаково. Их эффективность была поразительной. Макроскопический осмотр на 3-й день не выявил изменений у обоих коллагеновых волокон, хотя ферментативные условия были суровыми, особенно на второй день в крови и еще на 4-й день в перитонеальной жидкости. Через 72 ч никаких значительных различий в стойкости обоих материалов после повышение внутриселезеночного давления не выявлено. Один прорыв материала произошел в группе TachoComb S. Кровотечение раны наблюдалось у 1 животного с TachoComb S и 2 животных с TachoComb H (с одним пузырем в группе TachoComb H). Результаты гистологического обследования не свидетельствовали о значительном различии в разложении TachoComb S по сравнению с TachoComb H. Никакой специфической клеточной картины на селезенке не наблюдалось. Даже на образцах поджелудочной железы кусочки TachoComb S и Н в тесном контакте с высокими концентрациями ферментов поджелудочной железы не претерпели какого-либо значительного изменения. Заключение В заключение, никакого очевидно различия между TachoComb S или TachoComb H с точки зрения их стойкости к прорыву в условиях окружения с повышенной концентрацией ферментов поджелудочной железы не выявлено. Какого-либо конкретного макроскопического или микроскопического свидетельства изменения коллагеновых волокон TachoComb H и S обнаружить не удалось. Кровоостанавливающую эффективность TachoComb S и TachoComb H исследовали на стандартной модели раны селезенки (поверхностная рана 2x3 см глубиной 3-5 см, n = 10 на группу) у свиней с острым панкреатитом, вызванным дегенерирующей инъекцией желчи через вирзунгов проток и последующей перевязкой канала поджелудочной железы. Через 72 ч после операции внутриселезеночное давление повысили перевязкой вены селезенки и внутривенной инъекцией адреналина. На селезенке TachoComb S и TachoComb H ведут себя одинаково с точки зрения немедленной кровоостанавливающей эффективности, приклеивания к ране и стойкости к повышенному внутриселезеночному давлению, несмотря на заметное повышение уровней ферментов в поджелудочной железе (20-100 кратное повышение амилазы и липазы в крови и 10-100-кратное повышение уровня панкреатических ферментов в перитонеальной жидкости по сравнению с базальными уровнями). Результаты гистологического обследования не свидетельствовали о значительном различии в разложении TachoComb S и TachoComb H. Никакой специфической клеточной картины на селезенке не наблюдалось. Даже на образцах поджелудочной железы после тесного контакта TachoComb S и Н с высокими концентрациями ферментов поджелудочной железы приклеивание TachoComb S и Н и гистопатология не претерпели какого-либо значительного изменения. Таким образом, в этой очень напряженной модели острого панкреатита у свиней какого-либо специфического макроскопического или микроскопического различия между TachoComb S и Н не выявлено. Пример 7. Сравнительная реакция тканей головного мозга и эффективность рассасывающихсяTachoComb S и TachoComb H: экспериментальное исследование на модели кролика при нормальном свертывании или при локальном гиперфибринолизе Цель этого исследования заключалась в сравнении эффективности TachoComb S и TachoComb H после нейрохирургического применения. Раны головного мозга у кроликов были сделаны при нормальных условиях свертывания (реакция ткани головного мозга, n = 12 кроликов, n подходящих = 10) и условиях гиперфибринолиза, вызванного локальным применением r-tPA. На каждой полусфере сделали кортикальные раны (всего 6 ран на каждое животное; высверленные раны головного мозга глубиной 3 мм и диаметром 4 мм). Исследование при нормальных условиях свертывания Две из трех ран на каждой полусфере обработали TachoComb H или TachoComb S соответственно, а одну рану на каждой полусфере оставили открытой в качестве контрольной. После закрытия ран заплатками TachoComb S и Н под высоком увеличением измерили время кровотечения при непрерывном слаботочном орошении физиологическим раствором. После остановки кровотечения из всех ран внутривенной инъекцией адреналина (0,01 мг адреналина/кг) вызвали артериальную гипертензию, повысив среднее- 18006700 артериальное давление не менее чем до 120 мм рт.ст. При этом продолжали наблюдать за повторным кровотечением. После снижения среднего артериального давления до нормальных значений рана снова закрылась. Время до аутопсии было 3 и 7 дней (по 5 кроликов в каждом случае). У трех животных на третий день до аутопсии сделали магнитно-резонансные снимки. При аутопсии провели общее обследование участков ран и взяли образцы для гистопатологии. Исследования при локальном гиперфибринолизе На раны, сделанные как описано в предыдущем параграфе, каплями нанесли r-tPA (0,3 мг r-tPA в 0,5 мл физиологического раствора на рану), после чего все раны закрыли попеременно TachoComb S илиTachoComb H. Время кровотечения измерили под высоком увеличением при непрерывном слаботочном орошении физиологическим раствором. Аутопсию с общим осмотром произвели в первый день (n = 7) и на третий день (n = 3). Гистопатологию в целях сравнения выполнили на образцах, взятых на третий день. В ходе всего исследования каких-либо различий между TachoComb S и TachoComb H не выявили ни в отношении закрывающей эффективности, переносимости повышенного среднего артериального давления и продолжительности кровотечения, ни в отношении гистопатологии. Сильное кровотечение наблюдалось у всех животных этой группы не только на участке раны, но и под кожей всей мордочки. Несмотря на эти тяжелые условия, TachoComb S и в этом случае продемонстрировал одинаковую сTachoComb H эффективность. Пример 8. Нейрохирургическое применение TachoComb H и TachoComb S: реакция тканей головного мозга и кровоостанавливающая эффективность Жидкие фибриновые средства для закрытия ран широко применяются в нейрохирургии для остановки кровотечения. Всеобъемлющих опубликованных данных о реакции тканей головного мозга наTachoComb пока нет, и применение антифибринолитических средств (т.е., апротинина) по-прежнему вызывает споры. Цели Исследование преследовало две основные цели: оценка краткосрочной локальной реакции тканей головного мозга после нанесения TachoComb H (ТСН) и TachoComb S (TCS) на кортикальные раны в сравнении с открытыми контрольными ранами с использованием методов гистологии и современных методов получения изображений. Вторая цель заключалась в изучении кровоостанавливающей эффективности продуктов TachoCombH и S при нормальном свертывании (группа для исследований при нормальном свертывании) и после вызванного локально сильного гиперфибринолиза (группа для исследований при гиперфибринолизе) и оценке, оказывает ли апротинин какое-либо влияние на кровоостанавливающие качества и прочность приклеивания препарата. Материал и метод Группе из 22 молодых кроликов были сделаны по три кортикальных раны в каждой полусфере. Двадцать животных включили в группу для исследований при нормальном свертывании и 10 - в группу для исследований при гиперфибринолизе. У животных первой группы две раны обработали TachoComb H или TachoComb S соответственно, а одну оставили открытой в качестве контрольной. Измерили время кровотечения, и контролировали возникновение повторного кровотечения, вызванного артериальной гипертензией. На третий и седьмой дни после операции животных убили и провели гистологическое обследование. У трех животных из группы для исследований при нормальном свертывании на третий день непосредственно перед эйтаназией сделали магнитно-резонансные снимки для оценки отека мозга. У животных из группы для исследований при гиперфибринолизе, у которых вначале рекомбинантным тканевым активатором плазминогена (rt-PA) вызвали сильное локальное гиперфибринолитическое состояние, все три раны одной полусферы обработали TachoComb H, а другой - TachoComb S. Измерили время кровотечения, и на третий провели гистологическое обследование трех животных. Результаты При нормальном свертывании (животные из группы для исследований при нормальном свертывании) остановка кровотечения заплатками ТСН и TCS происходила значительно быстрее (р 0,001), чем без кровоостанавливающего средства. Было показано, что время кровотечения при применении обоих продуктов не отличается (р = 0,294), но что это время значительно короче, чем у контрольных (незакрытых) ран (р 0,001). При вызванной артериальной гипертензии повторное кровотечение наблюдалось из 1 из 24 ран, обработанных ТСН, 3 из 24 ран, обработанных TCS и 19 из 24 контрольных ран. Присутствие кровоостанавливающего средства устойчиво предотвращало повторное кровотечение при сильно повышенном артериальном давлении (Chi квадратичное = 16,3, р 0,001). В свою очередь, отсутствие ТСН или TCS при повышении артериального давления вызывало 80%-ный риск повторного кровотечения.- 19006700 Результаты статистического анализа времени кровотечения у животных из группы для исследования при гиперфибринолизе показали отсутствие какого-либо различия во времени кровотечения для обоих продуктов (критерий знаков: р = 0,927 и критерий Стьюдента: р = 0,4102). Наконец, в доверительном интервале 99,73 % (D3sdD = ns) значительное различие в кровоостанавливающей эффективности одного и того же продукта в обеих ситуациях свертывания было исключено. ЗаключениеTachoComb H и TachoComb S не вызвали каких-либо специфических гистологических изменений в тканях головного мозга. Оба продукта показали хорошую биологическую совместимость с паренхимой головного мозга, поскольку не вызывали большей реакции тканей, чем рана сама по себе. Морфологических свидетельств каких-либо неблагоприятных воздействий, связанных с продуктами комбинации, не отмечено. Гистологическое обследование не выявило различий между продуктами ни при нормальном,ни при серьезно нарушенном свертывании. TachoComb H и S обладают одинаковой кровоостанавливающей эффективностью и прочностью сцепления как при нормальном свертывании, так и при гиперфибринолизе. Получено убедительное доказательство того, что апротинин не влияет на кровоостанавливающие свойства и прочность сцепления даже при серьезно нарушенном свертывании. По сравнению с данными, приведенными в литературе, TachoComb H и S обеспечивают остановку кровотечения намного быстрее, чем окисленная целлюлоза и коллагеновые волокна. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Твердая композиция, состоящая, по существу, из а) коллагенового носителя, обладающего по крайней мере двумя из следующих физических свойств: модуль упругости 5 -100 Н/см 2; плотность 1-10 мг/см 3; диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм; средний диаметр камеры менее 3 мм; и равномерно распределенной и фиксированной на указанном носителе смеси из: б) твердого фибриногена и в) твердого тромбина. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что коллагеновым носителем является коллагеновая губка, которая содержит коллаген типа I млекопитающих или коллаген типа I из трансгенных или рекомбинантных источников. 3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что коллагеновый носитель имеет одну или более активных сторон, в которых имеется фибриноген в количестве 2-10 мг/см 2 и тромбин в количестве 1,55,5 МЕ/см 2. 4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что коллагеновый носитель имеет одну или более активных сторон, в которых имеется фибриноген в количестве 4,3-6,7 мг/см 2 и тромбин в количестве 1,5-5,5 МЕ/см 2. 5. Композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что фибриноген является человеческим. 6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что фибриноген получен очисткой из естественного источника. 7. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что фибриноген является трансгенным или рекомбинантным. 8. Композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что тромбин является человеческим. 9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что тромбин получен очисткой из естественного источника. 10. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что тромбин является трансгенным или рекомбинантным. 11. Композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что адаптирована для хирургического вмешательства в желудочно-кишечную систему, например пищевод, желудок, тонкую кишку, толстую кишку, прямую кишку, или паренхиматозные органы, например печень, селезенку, поджелудочную железу, почки, легкие, надпочечные железы, щитовидную железу или лимфатические узлы, при хирургии сердечно-сосудистой системы, хирургии грудной клетки, включая операцию на трахее, бронхах и легких,при хирургическом вмешательстве в область уха, горла, носа, включая стоматологическую операцию,для хирургического вмешательства при оперативной гинекологии и урологии, сосудистой хирургии, костной хирургии (например, резекция спонгиоза) и неотложной хирургии, оперативной неврологии, при лимфатических, желчных и ликворных свищах и утечках воздуха при хирургии грудной клетки и легких. 12. Материал для остановки кровотечения, склеивания и закрытия тканей, который содержит эластичный носитель, обладающий по крайней мере двумя из следующих физических свойств: модуль упругости 5-100 Н/см 2; плотность 1-10 мг/см 3;- 20006700 диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм; средний диаметр камеры менее 3 мм; и который также содержит смесь твердого фибриногена и твердого тромбина и не содержит какоголибо антифибринолитического средства, например апротинина, -аминокапроновой кислоты или 2 антиплазмина, причем твердый фибриноген и твердый тромбин прочно связаны с носителем так, что при встряхивании в аппарате для встряхивания Vibrofix при частоте вращения примерно 1000 об./мин в течение 2 мин истирание составляет менее 1,0 мг/см 2, и при помещении материала носителя с нанесенным покрытием в устройство для эндоскопии и последующем извлечении материал остается практически неизменным и имеет потерю материала покрытия менее 20%, что свидетельствует об эластичности носителя и прочном сцеплении твердого фибриногена и твердого тромбина, и указанный материал является практически воздухо- и водонепроницаемым и имеет коэффициент упругости не менее 1,25, определенный путем испытания, которое включает в себя фиксацию носителя с нанесенным покрытием на листе латекса, расширение латекса путем трехразового прикладывания давления и после третьего раза измерение площади носителя с нанесенным покрытием в момент наибольшего растягивания латексного листа и сравнение расширенной площади носителя с нанесенным покрытием с исходной площадью с нанесенным покрытием. 13. Способ закрытия ткани, который включает нанесение на поврежденную поверхность композиции, которая содержит носитель, обладающий по крайней мере одним из следующих физических свойств: модуль упругости 5-100 Н/см 2; плотность 1-10 мг/см 3; диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм; средний диаметр камеры менее 3 мм; и достаточное количество фибриногена и достаточное количество тромбина, равномерно покрывающих носитель. 14. Способ остановки кровотечения, который включает нанесение на кровоточащую поверхность композиции, которая содержит носитель, обладающий по крайней мере одним из следующих физических свойств: модуль упругости 5-100 Н/см 2; плотность 1-10 мг/см 3; диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм; средний диаметр камеры менее 3 мм; и достаточное количество фибриногена и достаточное количество тромбина, равномерно покрывающих носитель. 15. Способ склеивания ткани, который включает нанесение на поврежденную поверхность композиции, которая содержит носитель, обладающий по крайней мере одним из следующих физических свойств: модуль упругости 5-100 Н/см 2; плотность 1-10 мг/см 3; диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм; средний диаметр камеры менее 3 мм; и достаточное количество фибриногена и достаточное количество тромбина, равномерно покрывающих носитель.