Рекомбинантно модифицированный плазмин

010784 Предпосылки изобретения Плазминоген человека представляет собой одноцепочечный белок, содержащий 791 аминокислотный остаток. Активация плазминогена до плазмина происходит в результате одиночного расщепления пептидной связи Arg561-Val562 в зимогене. Полученная молекула плазмина представляет собой двухцепочечную дисульфидсвязанную сериновую протеазу с трипсиноподобной специфичностью (расщепляет после Lys и Arg). Аминоконцевая тяжелая цепь плазмина (остатки 1-561, приблизительно 60 кДа) состоит из пяти крингл-доменов, содержащих каждый приблизительно 80 аминокислотных остатков. Крингл-домены отвечают за регуляторные свойства плазминогена, такие как взаимодействие с ингибиторами активации,например ионами Cl-1; со стимуляторами активации, например -аминокапроновой кислотой; с клетками млекопитающих и бактерий и с другими белками, такими как физиологический субстрат плазмина фибрин и ингибитор плазмина 2-антиплазмин. Из всех пяти кринглов крингл 1 является одним из наиболее многофункциональных: показано, что его лизинсвязывающая активность отвечает за взаимодействие плазмина с 2-антиплазмином и фибрином. См. Wiman, В., et al., Biochim. Biophys. Acta 579: 142-154(1979); и Lucas, M.A., et al., J. Biol. Chem. 258: 4249-4256 (1983). С-Концевая легкая цепь плазмина (остатки 562-791, приблизительно 25 кДа) представляет собой типичную сериновую протеазу, гомологичную трипсину и содержащую классическую каталитическую триаду сериновых протеаз: His603, Asp646 и Ser741. Плазминоген содержит 24 дисульфидных мостика и 2 участка гликозилирования, на Asn289 и Thr346. Показано, что ограниченный протеолиз плазминогена эластазой приводит к трем фрагментам(Sottrup-Jensen, L., et al., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3: 191-209 (1978. Первый фрагмент, K1-3, содержит три первых крингла, и его можно выделить в двух вариантах, Tyr79-Val338 и Tyr79-Val354. Второй фрагмент, K4, соответствует четвертому кринглу и содержит остатки Val355-Ala440. Наконец, Сконцевой фрагмент (так называемый мини-плазминоген) содержит остатки Val443-Asn791 и состоит из пятого крингла и домена сериновой протеазы. Мини-плазминоген можно активировать тем же способом,что и плазминоген, с образованием мини-плазмина. Доказано, что из-за сложной структуры молекулы полноразмерного плазминогена бактериальные системы экспрессии не применимы для получения рекомбинантного плазминогена. Плазминоген продуцируется в форме нерастворимых телец включения и не подлежит повторной укладке из данного состояния. Кроме того, экспрессия плазминогена в клетках млекопитающих осложняется внутриклеточной активацией плазминогена до плазмина и появляющейся в результате цитотоксичностыо. Возможно получение полностью активного плазминогена с применением клеток насекомых, однако, данная система не применима для крупномасштабного производства из-за низкого выхода. Соответственно, является желательным модифицированный рекомбинантный белок, обладающий желаемыми характеристиками плазмина/плазминогена при отсутствии конкретных отрицательных характеристик, который бактериальные клетки могут продуцировать в достаточных количествах. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, обладающий одним N-концевым крингл-доменом, гомологичным крингл-домену природного плазминогена человека; и С-концевыми доменом участка активации и доменом сериновой протеазы, гомологичными соответствующим доменам в плазминогене человека; где полипептид связывается с иммобилизованным лизином. N-Концевой крингл-домен может являться гомологичным кринглу 1 или кринглу 4 природного плазминогена человека. В некоторых вариантах осуществления кодируемый полипептид по меньшей мере на 90, 95 или 98% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. Кроме того, кодируемый полипептид может представлять собой последовательность, показанную на SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида может представлять собой последовательность,показанную на SEQ ID NO: 1, или ее вырожденные варианты. Нуклеотидная последовательность может кодировать полипептид, содержащий N-концевой крингл-домен, гомологичный крингл-домену 1 или крингл-домену 4 природного плазминогена человека, и С-концевой домен участка активации и домен сериновой протеазы, гомологичные соответствующим доменам плазминогена человека. Нуклеотидная последовательность может кодировать также полипептид, содержащий один N-концевой крингл-домен,по меньшей мере на 90% идентичный крингл-домену 1 или крингл-домену 4 природного плазминогена человека, и С-концевой домен, по меньшей мере на 90% идентичный участку активации и домену сериновой протеазы плазминогена человека. Кодируемые полипептиды могут связывать иммобилизованный лизин. В другом аспекте изобретение относится к полипептидам, содержащим N-концевой крингл-домен,гомологичный крингл-домену природного плазминогена человека, и С-концевой домен участка активации и домен сериновой протеазы, гомологичные соответствующим доменам в плазминогене человека. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут содержать N-концевой крингл-домен,гомологичный крингл-домену 1 или крингл-домену 4 природного плазминогена человека.-1 010784 В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут проявлять фибринолитическую активность, которую 2-антиплазмин ингибирует со скоростью, по меньшей мере в 5 раз быстрее скорости ингибирования фибринолитической активности мини-плазмина 2-антиплазмином. Скорость ингибирования 2-антиплазмином может также быть по меньшей мере приблизительно в 10, 20, 30 или 40 раз быстрее, чем скорость ингибирования мини-плазмина. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут связывать иммобилизованный лизин. Иммобилизованный лизин может представлять собой лизин, связанный с материалом твердой подложки,выбранный из группы, включающей лизин-агарозу, лизин-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), лизинHYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, лизин-гидрогель), лизин-SEPHAROSE (SEPHAROSE представляет собой перекрестно-сшитую агарозу). Иммобилизованный лизин может представлять собой лизин-SEPHAROSE. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут проявлять более низкую аффинность связывания в отношении фибриногена, чем аффинность связывания мини-плазмина в отношении фибриногена. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут проявлять более высокую аффинность связывания в отношении частично расщепленного фибрина, чем аффинность связывания мини-плазмина в отношении частично расщепленного фибрина. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут обладать одним крингл-доменом, локализованным к N-концу от участка активации плазминогена, и доменом сериновой протеазы плазминогена, где крингл-домен обладает по меньшей мере на один остаток большей идентичностью аминокислотной последовательности с кринглом 1 или кринглом 4 природного плазминогена человека, чем с кринглом 5 природного плазминогена человека. Для данных вариантов осуществления понятно, что консервативные замены в крингл-областях полипептидов по изобретению относительно природных последовательностей кринглов 1 и 4 плазминогена человека нельзя считать отличающимися от природных последовательностей для целей сравнения идентичности с кринглом 5. В некоторых вариантах осуществления полипептиды могут обладать аминокислотной последовательностью, как показано на SEQ ID NO: 2, и ее консервативными заменами. Полипептиды могут иметь в соответствующем положении, аналогичном положению 76 аминокислотной последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2, остаток, представляющий собой аргинин. В другом аспекте изобретение относится к векторам, содержащим полинуклеотиды по изобретению, и к культивируемым клеткам-хозяевам, содержащим векторы. Краткое описание фигур Фиг. 1 представляет собой схематическое представление природного плазмина после активации протеолитическим расщеплением. K1-K5 представляют собой крингл-области 1-5; и SP представляет собой домен сериновой протеазы. 2-АР представляет собой участок связывания 2-антиплазмина крингла 1. Фиг. 2 представляет собой схематическое представление делеционного мутанта плазминогена по изобретению с применением таких же обозначений, как на фиг. 1, показывающее делецию K2-5. На фиг. 3 показана аминокислотная последовательность плазминогена человека, показывающая лидерную последовательность из 19 остатков, пронумерованных от -19 до -1, и последовательность плазминогена, показанную как остатки 1-791 (см. SEQ ID NO: 3 (последовательность кДНК для плазминогена человека); и SEQ ID NO: 4, кодируемая аминокислотная последовательность, как показано на фиг. 3). Показан ряд признаков, включая следующие: последовательность дельта-плазминогена (заштрихована); крингл-домены 1-5 (дважды подчеркнуты); участки гликозилирования Asn289 и Thr346 (жирным); участок активации плазминогена Arg-Val (жирным); и лизинсвязывающие участки в крингле 1 (подчеркнуты и с нумерацией конкретных положений). На фиг. 4 показаны сравнения последовательности полипептида между пятью крингл-доменами (15) природного плазмин(оген)а человека. Аминокислотные остатки, идентичные остаткам в таком же соответствующем положении в крингле 1, подчеркнуты. На фиг. 5 показан 8-25% градиентный SDS-PAGE невосстановленного (дорожка 1) и восстановленного (дорожка 2) препарата дельта-плазминогена. Активация дельта-плазминогена до дельта-плазмина стрептокиназой (дорожка 3), тканевым активатором плазминогена (tPA) (дорожка 4) и урокиназой (дорожка 5) приводит к формированию двухцепочечной молекулы, состоящей из крингла 1 (K1) и домена сериновой протеазы (SP), соединенных двумя дисульфидными мостиками. Фиг. 6 представляет собой графическое представление активации дельта-плазминогена урокиназой. Урокиназу (5,6 нМ) добавляли к раствору 5 мкМ дельта-плазминогена в PBS, содержащем 1,0 мМ S-2251 при 37 С. Увеличение оптической плотности контролировали при 405 нм. Фиг. 7 представляет собой хроматограмму, показывающую связывание дельта-плазминогена с лизин-SEPHAROSE 4 В: 0,5 мг очищенного дельта-плазминогена наносили на колонку с лизинSEPHAROSE 4 В (13 см), уравновешенную трис-солевым буфером, рН 7,4. Связанный белок элюировали с колонки 0-20 мМ градиентом -аминокапроновой кислоты (-АСА) как отдельный пик. На графике-2 010784 представлена оптическая плотность при 280 нм и концентрация -АСА как функция объема потока. На фиг. 8 показано связывание дельта-плазминогена с фибрином. Дельта-плазминоген в различных концентрациях инкубировали с фибриновыми сгустками в титрационном микропланшете в течение 1 ч при 37 С. После инкубации сгустки тщательно промывали PBS и в каждую лунку добавляли раствор tPA 0,1 мг/мл. После 2-часовой инкубации при 37 С жидкость удаляли и оставшиеся твердые сгустки восстанавливали 100 мкл 1 М NaOH. Количество оставшегося фибрина оценивали измерением оптической плотности данных восстановленных сгустков при 280 нм. Степень фибринолиза, являющегося результатом связывания дельта-плазминогена с фибрином, наносили на график как функцию концентрации дельта-плазминогена (сплошная линия). Пунктирной линией показано наилучшее соответствие экспериментальных данных уравнению связывания. На фиг. 9 показан 8-25% градиентный SDS-PAGE исходного дельта-плазминогена в невосстанавливающих (дорожка 1) и в восстанавливающих (дорожка 2) условиях и конечного препарата дельта-плазмина также в невосстанавливающих (дорожка 3) и в восстанавливающих (дорожка 4) условиях. На фиг. 10 показаны схематические чертежи плазмина, мини-плазмина, микроплазмина и дельтаплазмина вместе с соответствующими характеристиками ферментативной активности (kкат и Km по отношению к субстрату S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-нитроанилид, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH. Фиг. 11 представляет собой графическое представление индуцированного дельта-плазмином лизиса сжатых сгустков цельной крови. В каждый сгусток (0,87 см) инъецировали плазмин (1,0 мг/мл) или дельта-плазмин (0,44 мг/мл) в 1 мл объема носителя (подкисленный солевой раствор, рН 3,6) и позволяли растворению сгустка продолжаться 1 ч при 37 С. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к делеционному мутанту плазминогена для предоставления простой, негликозилированной молекулы, обладающей свойствами связывания фибрина и антиплазмина,присущими полноразмерному плазмину. В данном мутанте, называемом здесь дельта-плазминогеном, по меньшей мере часть природной аминокислотной последовательности между доменом, гомологичным кринглу 1, и участком активации делетирована. В одном из аспектов домен, гомологичный природному крингл-домену 1 плазминогена человека, может быть непосредственно присоединен к части сериновой протеазы плазминогена или его гомологичного, функционального аналога с остающейся между доменами, по существу, только промежуточной природной последовательностью, содержащей участок активации плазминогена. Дельта-плазмин(оген) по настоящему изобретению можно охарактеризовать тем, что низкая молекулярная масса (37198 Да) дельта-плазмина может приводить к увеличенной специфической активности(на мг белка); отсутствие по меньшей мере двух участков гликозилирования, обнаруженных в природном белке (см. фиг. 3), в совокупности с относительно низкой молекулярной массой может облегчать рекомбинантное получение данного белка с применением относительно недорогих бактериальных и дрожжевых экспрессионных систем; дельта-плазминоген можно активировать посредством активаторов плазминогена tPA, урокиназы и стрептокиназы; присутствие домена, гомологичного природному кринглу 1,сохраняет фибринсвязывающие свойства плазмина, которые могут являться важными для тромболитической активности; присутствие участков связывания 2-антиплазмина в домене, гомологичном кринглу 1,может позволять легко ингибировать дельта-плазмин данным физиологическим ингибитором плазмина(свойство, которое может предупреждать кровотечение); меньший размер дельта-плазмина может облегчать его ингибирование 2-макроглобулином, далее уменьшая осложнения кровотечения, связанные с природным плазмином. В конкретных вариантах осуществления отсутствие крингла 5, сохраняющего первичный участок связывания для интактного, нерасщепленного фибрин(оген)а, может позволять применение дельта-плазмина с уменьшением истощения циркулирующего фибриногена. Главным образом, изобретение относится к рекомбинантным молекулам плазмин(оген)а, содержащим одиночную крингл-область к N-концу от участка активации и домена сериновой протеазы, обладающим конкретными преимуществами относительно мини-плазмин(оген)а. Хотя полипептиды дельтаплазминогена по изобретению обладают только одной крингл-областью, по существу, N-концевой от участка активации, в некоторых вариантах осуществления включают дополнительные последовательности к N-концу от участка активации. Дополнительные N-концевые последовательности можно выводить из последовательностей природных крингл-областей плазминогена.N-Концевые крингл-домены по настоящему изобретению включают в себя крингл-последовательности кринглов 1 и 4 природного плазмин(оген)а и их функциональных эквивалентов. В частности, см. обсуждение ниже, предоставляющее руководство относительно сохранения функции в вариантах полипептидов, включая сохранение остатков, участвующих в связывании лизина, или влияющих на него. Определения Термины домен и область полипептида обычно являются синонимами, как применяют здесь,если иначе не указано противоположное. Совместно с хорошо известными структурными или функциональными определениями, такими как крингл или сериновая протеаза и т.д., такие термины будут вводить признак полипептида, относящийся, по меньшей мере, к некоторой(ым) характеристике(кам),-3 010784 общеизвестным и, как понятно, ассоциированным со структурами полипептида, соответствующими данным определениям. Культивируемая клетка-хозяин, как применяют здесь, относится к прокариотической или эукариотической клетке, содержащей гетерологичную ДНК, которую вводят в клетки любыми способами,например электропорацией, преципитацией фосфатом кальция, микроинъекцией, трансформацией, вирусной инфекцией и подобными. Гетерологичный, как применяют здесь, означает из другого природного источника или представляет неприродное состояние. Например, если культивируемую клетку-хозяин трансформируют ДНК или геном, происходящим из другого организма, особенно из других видов, данный ген является гетерологичным по отношению к данной культивируемой клетке-хозяину и также по отношению к потомству данной культивируемой клетки-хозяина, несущему данный ген. Подобным образом, гетерологичный относится к нуклеотидной последовательности, выведенной из природного, исходного типа клеток и вставленной в такой же, но присутствующей в неприродном состоянии, например в другом числе копий или под контролем других регуляторных элементов. Молекула вектора представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в которую можно вставить гетерологичную нуклеиновую кислоту, которую затем можно ввести в подходящую культивируемую клетку-хозяин. Векторы предпочтительно обладают одной или несколькими точками начала репликации и одним или несколькими участками, в которые можно вставить рекомбинантную ДНК. Для векторов часто существуют удобные способы, которыми клетки с векторами можно отбирать от клеток без векторов, например они кодируют гены устойчивости к антибиотикам. Общепринятые векторы включают в себя плазмиды, геномы вирусов и (в основном, в дрожжах и бактериях) искусственные хромосомы. Как применяют здесь, термин контрольная последовательность транскрипции относится к последовательностям нуклеиновых кислот, таким как последовательности инициатора, последовательности энхансера и промотора, которые индуцируют, репрессируют или другим способом контролируют транскрипцию белка, кодируемого последовательностями нуклеиновой кислоты, с которыми они функционально связаны. Термин полипептид применяют попеременно с терминами пептид и белок. Термины полинуклеотид и нуклеиновая кислота применяют здесь попеременно, и они могут относиться к любой нуклеиновой кислоте, содержащей информацию, необходимую для целей, указанных в контексте. То есть нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, или РНК, или одноцепочечную, или двухцепочечную, или другую нуклеиновую кислоту, пока полимер способен предоставлять соответствующую информацию, например, по отношению к кодируемому пептиду, и может содержать комплементарные последовательности, например смысловые цепи и антисмысловые цепи полимеров нуклеиновых кислот. Термин вариант полипептида относится к аминокислотной последовательности, измененной по одной или нескольким аминокислотам. Вариант может содержать консервативные замены, где замещенные аминокислоты обладают сходными структурными или химическими свойствами, например замену лейцина на изолейцин. Альтернативно, вариант может содержать неконсервативные замены, например замену глицина на триптофан. Аналогичное минорное изменение может включать также делецию или вставку аминокислоты или обе. Конкретной формой варианта полипептида является функционально эквивалентный полипептид, т.е. полипептид, проявляющий, в основном, такую же активность in vivo или in vitro, как примеры полипептида по изобретению, как более подробно описано ниже. Руководство для определения, какие аминокислотные остатки можно замещать, вставлять или делетировать без потери биологической или иммунологической активности, можно получить с применением компьютерных программ, хорошо известных в данной области, например программного обеспеченияDNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Кроме того, ниже предоставлено конкретное руководство,включая предоставленное в цитированных ссылках, содержание которых приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме. Термины N-концевой и С-концевой применяют здесь для обозначения относительного положения какой-либо аминокислотной последовательности, или полипептидного домена, или структуры, к которой их применяют. Относительное расположение будет очевидно из контекста. То есть N-концевой признак будет локализован, по меньшей мере, ближе к N-концу молекулы полипептида, чем другой признак, обсуждаемый в том же контексте (другой признак, возможно, называют С-концевым от первого признака). Подобным образом, термины 5'- и 3'- могут применять здесь для обозначения относительных положений признаков полинуклеотидов. Полипептиды дельта-плазминогена/плазмина, обозначенные здесь как обладающие N-концевым доменом, гомологичным крингл-домену природного плазминогена человека, имеют структурные и функциональные характеристики, как у природных крингл-доменов плазминогена. Кроме того, полипептиды дельта-плазминогена/плазмина, обозначенные здесь как обладающие N-концевым доменом, гомологичным кринглу 1, имеют характеристики, как у природного крингла 1, по меньшей мере, в пределах того, что полипептиды могут обладать более высокой аффинностью для -аминокарбоновых кислот (и функциональных гомологов, таких как транс-4-аминометилциклогексан-1-карбоновая кислота, цикличе-4 010784 ская кислота), чем крингл 5. См., например, в Chang, Y., et al., Biochemistry 37: 3258-3271 (1998), содержание которой приведено здесь в качестве ссылки, условия и протоколы для сравнения связывания выделенных полипептидов с крингл-доменами с 5-аминопентановой кислотой, (5-APnA); 6-аминогексановой кислотой (6-АНхА), известной также как -аминокапроновая кислота (АСА); 7-аминогептановой кислотой (7-АНрА) и транс-4-аминометилциклогексан-1-карбоновой кислотой (t-AMCHA). Ссылки на крингл-домены, гомологичные кринглу 4, определяют сходным образом, как указано выше относительно фразы гомологичные кринглу 1. То есть они проявляют функциональные характеристики, как у крингла 1 природного плазминогена человека, как обсуждают выше. Данные полипептиды также связывают иммобилизованный лизин, как описано выше. Полипептиды по изобретению связывают иммобилизованный лизин. Как применяют здесь, фраза связывающие иммобилизованный лизин означает, что охарактеризованные таким образом полипептиды замедляются в своем продвижении по сравнению с мини-плазминогеном, когда их подвергают хроматографии на колонке с применением лизин-SEPHAROSE в качестве хроматографической среды. Обычно полипептиды по изобретению можно элюировать с такой хроматографической среды (смол с лизиновой аффинностью) с применением растворов, содержащих специфический лиганд, например АСА, в качестве элюентов. Кроме того, в дополнение к Chang et al., выше, специалисты в данной области могут принимать во внимание другие ссылки для определения, какие остатки можно изменять консервативным или неконсервативным замещением, делецией или добавлением, для получения делеционного мутанта в рамках настоящего изобретения. Например, в следующих ссылках предоставлена информация относительно конкретных остатков природных крингл-доменов, которые могут являться важными для связывания аминокарбоновых кислот: в патенте США 6538103 на Ji, et al.; в патенте США 6218517 на Suzuki;(1978), содержание всех приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме. Поскольку авторы настоящего изобретения обнаружили, что можно получить применимую, упрощенную молекулу плазмин(оген)а, обладающую N-концевым крингл-доменом, обладающим благоприятными функциональными характеристиками (которые можно частично оценить тестированием связывания иммобилизованного лизина, как описано здесь), настоящее изобретение может относиться к другим фибринсвязывающим доменам или областям к N-концу от участка активирования. Например, изобретение может относиться к полипептидам, в которых домен сериновой протеазы плазмина присоединен к фибринсвязывающему кринглу, выбранному из группы, включающей в себя в качестве неограничивающих примеров крингл 4 плазминогена человека, крингл 2 tPA или крингл аполипопротеина (а). Кроме того, изобретение может относиться к полипептидам, в которых домен сериновой протеазы плазмина присоединен к любым другим известным фибринсвязывающим модулям, таким как домен-палецtPA или фибронектина или FAB-фрагмент фибринспецифичного IgG. В конкретных вариантах осуществления остатки в конкретных положениях N-концевого крингл-домена дельта-плазминогена являются консервативными по отношению к кринглу 1 природного плазминогена человека. Это могут быть остатки в положениях, ассоциированных со связыванием лизина, включающих в себя Pro136-Pro140, Pro143-Tyr146 и Arg153-Tyr156 (положения пронумерованы, как показано на фиг. 3). В некоторых вариантах осуществления дельта-плазминоген по изобретению может содержатьArg в положении 153. В других вариантах осуществления конкретные положения указанных остатков могут являться до некоторой степени измененными, все еще присутствуя в полипептиде в структурно и функционально аналогичных положениях (т.е. относительно крингл-структуры N-концевого домена; см.Chang, Y., et al., как обсуждают выше). В некоторых вариантах осуществления N-концевая крингл-область полипептида дельта-плазмин(оген)а обладает по меньшей мере на один остаток большей идентичностью аминокислотной последовательности с кринглом 1 или кринглом 4 природного плазминогена человека, чем с кринглом 5 природного плазминогена человека. Кроме того, конкретные варианты осуществления изобретения можно охарактеризовать функционально по сравнению с мини-плазмин(оген)ом, обладающим похожей композицией доменов, т.е. кринглсериновой протеазой (K-SP) (см. Sottrup-Jensen, L., et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis,Vol. 3, (Eds: J. F. Davidson, et al.) Raven Press, New York (1978. В предпочтительных вариантах осуществления дельта-плазмин по изобретению проявляет увеличенную скорость ингибирования 2-антиплазмином, например, настолько, как приблизительно на один или два порядка величины больше, чем скорость-5 010784 ингибирования мини-плазмина. Кроме того, в конкретных вариантах осуществления дельта-плазмин связывает иммобилизованный лизин (например, лизин-SEPHAROSE). Характеризация крингл-домена дельта-плазминогена как N-концевого означает только, что домен присутствует с N-конца от участка активации, и не означает, что не присутствует дополнительных аминокислотных остатков с N-конца от самого домена. Кроме того, число и идентичность остатков, помещенных между доменом, гомологичным кринглу 1, и участком активации плазминогена, может изменяться без отклонения от объема изобретения. Специалист в данной области будет способен определить такие изменения, которыми достигают преимуществ по изобретению (крингл 1-подобного связывания аминокарбоновых кислот без значительного увеличения размера делеционного мутанта или введения потенциально проблематичных участков гликозилирования) без ненужных экспериментов, на основе описания здесь и ссылок, цитированных здесь для руководства относительно структуры и функции крингла 1. Соответственно, изобретение относится к полинуклеотидам, полипептидам, рекомбинантным способам для получения полипептидов, векторам, содержащим полинуклеотиды, экспрессионным системам для получения полипептидов и культивируемым клеткам-хозяевам, содержащим данные экспрессионные системы. Как указано, в одном из аспектов изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему описанный здесь полипептид или полипептид, обладающий консервативными заменами его аминокислот. Руководство относительно выбора консервативных аминокислотных замен более подробно предоставлено ниже. В одном из вариантов осуществления полинуклеотид представляет собой ДНК. В другом аспекте изобретение относится к способу получения вектора, содержащего вставленный в вектор полинуклеотид по изобретению. В другом аспекте изобретение относится к вектору, полученному по способу изобретения. В другом аспекте изобретение относится к способу получения культивируемой клетки-хозяина,предусматривающему введение вектора по изобретению в культивируемую клетку-хозяин. В другом аспекте изобретение относится к культивируемой клетке-хозяину, полученной способом по изобретению. В другом аспекте изобретение относится к выделенному полипептиду по изобретению, полученному способом, предусматривающим: (а) введение вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид, в культивируемую клетку-хозяин; (b) культивирование клетки-хозяина и (с) выделение полипептида. В другом аспекте изобретение относится к способу получения полипептида, предусматривающему: (а) культивирование клетки-хозяина по изобретению в условиях, при которых вектор экспрессируется; и (b) выделение полипептида. В другом аспекте изобретение относится к клеткам, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид по изобретению. В одном из вариантов осуществления полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность,как показано на SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO: 2. Полинуклеотиды Полинуклеотиды по изобретению включают варианты с заменами, делециями и/или добавлениями,которые могут вовлекать один или несколько нуклеотидов. Варианты могут являться измененными в кодирующих областях, некодирующих областях или и в тех, и в других. Изменения в кодирующих областях могут давать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или добавления. Особенно предпочтительными среди них являются молчащие замены, добавления и делеции,которые не изменяют свойства и активности белка дельта-плазмин(оген)а или его частей. Также особенно предпочтительными в этом отношении являются консервативные замены (см. ниже). Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной и более предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной: (а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид дельта-плазминогена, обладающий полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2; (b) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид дельта-плазминогена, обладающий аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2; и(с) нуклеотидной последовательности, комплементарной любой нуклеотидной последовательности по (а) или (b) выше. Под полинуклеотидом с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, например, на 95% идентичной контрольной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид дельта-плазминогена, понимают, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида является идентичной контрольной нуклеотидной последовательности, за исключением того, что последовательность полинуклеотида может содержать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной последовательности, кодирующей полипептид дельта-плазминогена. Другими словами, для получения полинуклеотида с нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 95% идентичной контрольной нуклеотидной последовательности, вплоть до 5% нуклеотидов в контрольной последовательности можно делетировать или заменить другими нуклеотидами или число нуклеотидов вплоть до 5% от общего числа-6 010784 нуклеотидов в контрольной последовательности можно вставить в контрольную последовательность. Такие мутации в контрольной последовательности могут присутствовать в 5'- или 3'-концевых положениях контрольной нуклеотидной последовательности или где угодно между данными концевыми положениями, распределяясь или по отдельности среди нуклеотидов в контрольной последовательности, или в одной или нескольких непрерывных группах в контрольной последовательности. Как указано выше, две или более последовательностей полинуклеотидов можно сравнить определением их процентной идентичности. Подобным образом, две или более аминокислотные последовательности можно сравнить определением их процентной идентичности. Процентную идентичность двух последовательностей, последовательностей или нуклеиновой кислоты, или пептида, обычно описывают как число точных совпадений между двумя выравниваемыми последовательностями, деленное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. Приближенное выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот предоставлено алгоритмом локальной гомологии Smith and Waterman, Advances inApplied Mathematics 2: 482-489 (1981). Данный алгоритм можно расширить для применения с пептидными последовательностями с применением матрицы баллов, разработанной Dayhoff, Atlas of Protein Sequencesand Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington,D.C., USA, и нормализованной Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745-6763 (1986). Реализация данного алгоритма для последовательностей нуклеиновых кислот и пептидов предоставлена Genetics ComputerGroup (Madison, Wis.) в осуществлении их обслуживающей программы BESTFIT. Парамеры по умолчанию для данного способа описаны в Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8(1995) (доступно в Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Конечно, из-за вырожденности генетического кода обычному специалисту в данной области сразу понятно, что большое число молекул нуклеиновой кислоты с последовательностью, по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты из последовательности нуклеиновой кислоты, показанной на SEQ ID NO: 1, будет кодировать полипептид дельта-плазминогена. Фактически, поскольку вырожденные варианты данных нуклеотидных последовательностей все кодируют один и тот же полипептид, это будет понятно специалисту в данной области без проведения какихлибо функциональных анализов или измерений, описанных здесь. Далее, в данной области будет понятно, что из тех молекул нуклеиновой кислоты, которые не являются вырожденными вариантами, разумное число будет также кодировать полипептид, обладающий активностью полипептида дельта-плазминогена. Это происходит потому, что специалист в данной области полностью осведомлен об аминокислотных заменах, которые или маловероятно, или вряд ли значительным образом изменяют функцию белка (например, замена одной алифатической аминокислоты на вторую алифатическую аминокислоту). В последнее время успехи в синтетическом получении более длинных последовательностей полинуклеотидов сделали возможным синтетическое получение нуклеиновых кислот, кодирующих значительно более длинные полипептиды без применения традиционных способов клонирования. Коммерческие поставщики данных услуг включают Blue Heron, Inc., Bothell, WA (http://www.blueheronbio.com). Технология, применяемая в Blue Heron, Inc., описана в патентах США 6664112; 6623928; 6613508; 6444422; 6312893; 4652639; опубликованных патентных заявках США 20020119456A1; 20020077471 А 1; и опубликованных международных патентных заявкахWO03054232A3; WO0194366A1; WO9727331A2 и WO9905322A1, все приведены здесь в качестве ссылки. Конечно, традиционные способы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной нуклеиновой кислоты можно также применять для получения полинуклеотидов по изобретению. Данные способы хорошо известны и объяснены, например, в Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausebel,ed., Vols. I, II and III (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Springand Grossman and Wu, eds., Vols. 154 and 155, соответственно, все приведены здесь в качестве ссылки. Векторы и культивируемые клетки-хозяева Настоящее изобретение относится также к векторам, содержащим выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, культивируемым клеткам-хозяевам, генетически модифицированным рекомбинантными векторами, и к получению полипептидов дельта-плазмин(оген)а рекомбинантными способами. Рекомбинантные конструкции можно вводить в культивируемые клетки-хозяева с применением хорошо известных способов, таких как инфекция, трансдукция, трансфекция, трансвекция, электропорация и трансформация. Вектор может представлять собой, например, фаг, плазмиду, вирусный или ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы могут являться компетентными по репликации или дефектными по репликации. В последнем случае размножение вируса, как правило, будет происходить только в комплементирующих культивируемых клетках-хозяевах.-7 010784 Полинуклеотиды можно присоединять к вектору, содержащему селективный маркер для размножения в культивируемом хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводят в преципитате, таком как преципитат фосфата кальция, или в комплексе с заряженным липидом. Если вектор представляет собой вирус, его можно упаковывать in vitro с применением подходящей линии упаковывающих клеток и затем трансдуцировать в культивируемые клетки-хозяева. Предпочтительными являются векторы, содержащие цис-действующие контрольные области для интересующего полинуклеотида. Подходящие транс-действующие факторы могут являться предоставленными культивируемым хозяином, предоставленными комплементирующим вектором или предоставленными самим вектором при введении в культивируемый хозяин. В конкретных вариантах осуществления в данном отношении предоставляют векторы для специфической экспрессии, которые могут являться индуцируемыми и/или специфическими для типа клеток. Особенно предпочтительными среди таких векторов являются индуцируемые факторами внешней среды,которыми легко управлять, такими как температура и питательные добавки. Экспрессирующие векторы, применимые по настоящему изобретению, включают векторы-производные хромосом, эписом и вирусов, например векторы, производные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы,паповавирусы, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы птиц, вирусы псевдобульбарного паралича и ретровирусы, и векторы, производные из их сочетаний, такие как космиды и фагмиды. Вставки ДНК должны являться функционально связанными с подходящим промотором, таким как промотор фага лямбда PL, промоторы Е. coli lac, trp и tac, ранние и поздние промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR, если называть немногие. Другие подходящие промоторы известны специалистам в данной области. Экспрессирующие конструкции будут дополнительно содержать участки для инициации транскрипции, терминации, и, в транскрибируемой области, участок связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструкциями, будет предпочтительно содержать инициирующий трансляцию в начале и терминирующий кодон (UAA, UGA илиUAG), соответственно расположенный в конце полипептида, подлежащего трансляции. Как указано, экспрессирующие векторы предпочтительно будут содержать по меньшей мере один селективный маркер. Данные маркеры включают устойчивость к дигидрофолатредуктазе или неомицину для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования Е. coli и других бактерий. Характерные культивируемые хозяева включают в качестве неограничивающих примеров бактериальные клетки, такие как клетки Е. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, такие как клетки дрожжей; клетки насекомых, таких как клетки Drosophila S2 и SpodopteraSf9; клетки животных, такие как СНО, COS и клетки меланомы Bowes; и клетки растений. Подходящие среды и условия для описанных выше культивируемых клеток-хозяев известны в данной области. Векторы, предпочтительные для применения в бактериях, включают в себя pQE70, pQE60 и pQE-9,доступные из Qiagen Inc., Valencia, CA; векторы pBS, векторы PHAGESCRIPT, векторы BLUESCRIPT,pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные из Stratagene, LaJolla, CA; и ptrc99a, pKK223-3, pKK2333, pDR540, pRIT5 доступные из Pharmacia (теперь Pfizer, Inc., New York, NY). Предпочтительные эукариотические векторы включают pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные из Stratagene; иpSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные из Pharmacia. Другие предпочтительные векторы ясно очевидны специалисту в данной области. Бактериальные промоторы, подходящие для применения по настоящему изобретению, включают промоторы Е. coli lacI и lacZ, промоторы Т 3 и Т 7, промотор gpt, промоторы лямбда PR и PL и промоторtrp. Подходящие эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40, промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), и промоторы металлотионеина, такие как промотор металлотионеина-I мыши. Введение векторной конструкции в культивируемую клетку-хозяин можно осуществлять посредством кальций-фосфатной трансфекции, опосредованной DEAE-декстраном трансфекции, опосредованной катионными липидами трансфекции, электропорации, трансдукции, инфекции или других способов. Такие способы описаны во многих обычных лабораторных руководствах, таких как Davis et al., Basic MethodsIn Molecular Biology, 2nd Edition (1995). Транскрипцию ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению, в высших эукариотах можно увеличить вставкой энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно приблизительно от 10 до 300 п.н., которые действуют, увеличивая транскрипционную активность промотора в данном типе культивируемых клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, расположенный в поздней стороне от точки начала репликации в п.н. от 100 до 270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне от точки начала репликации и энхансеры аденовируса. Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство в экспрессирующийся полипептид можно вводить подходящие сигналы секреции. Сигналы могут являться эндогенными для полипептида или могут-8 010784 представлять собой гетерологичные сигналы. Полипептид может являться экспрессированным в модифицированной форме, такой как слитый белок, и может содержать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, область дополнительных аминокислот, особенно заряженных аминокислот, можно добавить к N-концу полипептида для улучшения стабильности и персистенции в культивируемой клетке-хозяине в процессе очистки или в процессе последующих обработки и хранения. Также для облегчения очистки к полипептиду можно добавить пептидные фрагменты. Такие области можно удалить перед окончательным выделением полипептида. Добавление к полипептидам пептидных фрагментов, чтобы вызвать секрецию или экскрецию, для улучшения стабильности или облегчения очистки,среди прочих, являются известными и общепринятыми способами в данной области. Предпочтительный слитый белок содержит гетерологичную область от иммуноглобулина, которая применима для солюбилизации белков. Например, в ЕР 0464533 А 1 (канадская копия 2045869) описаны слитые белки, содержащие различные части константной области молекул иммуноглобулина вместе с другим белком человека или его частью. Во многих случаях Fc-часть в слитом белке является вполне выгодной для применения в терапии и диагностике и, таким образом, приводит, например, к улучшенным фармакокинетическим свойствам. С другой стороны, для некоторых нужд может являться желательным делетировать Fcчасть после экспрессии, детекции и очистки белка описанным выгодным способом. Это происходит в случае, когда показано, что Fc-часть является помехой для применения в терапии и диагностике, например когда слитый белок подлежит применению в качестве антигена для иммунизации. Например, для обнаружения лекарственных средств белки человека присоединяли к Fc-частям для целей высокопроизводительных анализов скрининга (такие, как рецептор hIL5, для идентификации антагонистов hIL-5). См.Bennett, D., et al., J. Molecular Recognition, 8: 52-58 (1995) и Johanson, K. et al., J. Biol. Chem., 270 (16): 9459-9471 (1995). Белок дельта-плазминоген можно выделять и очищать из культур рекомбинантных клеток хорошо известными способами, включая конкретно описанные в примерах здесь. Полипептиды по настоящему изобретению включают природные очищенные продукты, продукты способов химического синтеза и продукты, полученные посредством рекомбинантных способов из прокариотического или эукариотического культивируемого хозяина, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. Кроме того, полипептиды по изобретению могут содержать также инициирующий модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях как результат опосредованных хозяином процессов. Полипептиды Полинуклеотиды по изобретению включают кодирующие варианты и конкретные примеры полипептидов по изобретению. Например, руководство относительно того, как получить фенотипически молчащие аминокислотные замены, предоставлено в Bowie, J.U. et al., Deciphering the Message in ProteinSequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions Science 247: 1306-1310 (1990), где авторы указывают,что белки являются неожиданно устойчивыми к аминокислотным заменам. Хотя любое число замен в рамках объема изобретения можно получить с применением таких общих принципов, для конкретного руководства относительно замен, цитированных здесь ссылок относительно структуры и функции крингл 1-доменов можно проконсультироваться у специалиста в данной области. В дальнейшем будет принято во внимание, что, в зависимости от применяемых критериев, точное положение крингла 1, участка активации и доменов сериновой протеазы в полипептиде дельта-плазминогена может немного отличаться в конкретных вариантах в рамках объема настоящего изобретения. Например, точное положение крингл-домена 1 относительно участка активации может немного варьировать и/или последовательность с N-конца от крингл-домена 1 может варьировать по длине. Таким образом, изобретение относится к таким вариантам полипептида дельта-плазминогена, которые проявляют активность полипептида дельта-плазминогена, как описано здесь. Такие варианты включают делеции,вставки, инверсии, повторы и замены. Как указано выше, руководство относительно аминокислотных изменений, вероятно, являющихся фенотипически молчащими, можно найти в Bowie, J.U., et al., Decipheringthe Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, Science 247: 1306-1310 (1990). Таким образом, фрагменты, производные или аналоги полипептида из SEQ ID NO: 2 могут представлять собой: (i) те, в которых один или несколько аминокислотных остатков (например, 3, 5, 8, 10, 15 или 20) заменяют консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком); такие замещенные аминокислотные остатки могут являться или не являться кодируемыми генетическим кодом, или (ii) те, в которых один или несколько аминокислотных остатков содержит замещенную группу (например, 3, 5, 8, 10, 15 или 20), или (iii) те, в которых зрелый полипептид присоединен к другому соединению, такому как соединение для увеличения времени полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль), или (iv) те, в которых дополнительные аминокислоты присоединены к зрелому полипептиду, так, как в пептиде, слитом с Fc-областью IgG, лидерной или секреторной последовательностью, которая служит для очистки зрелого полипептида или последовательности пробелка. Такие фрагменты, производные и аналоги считают находящимися в компетенции специалистов в данной области по объяснениям здесь.-9 010784 Как указано, изменения предпочтительно являются минорными, такими как консервативные замены аминокислот, которые значительно не влияют на укладку или активность белка. Конечно, число аминокислотных замен, которые будет выполнять специалист в данной области, зависит от многих факторов, включая описанные выше. Вообще говоря, число замен для любого данного полипептида дельтаплазминогена не должно превышать 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 или 3. Аминокислоты в полипептиде дельта-плазминогена по настоящему изобретению, которые являются необходимыми для функционирования, можно идентифицировать способами, известными в данной области, такими как сайт-специфический мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham andWells, Science 244: 1081-1085 (1989. Последним способом вводят отдельные аланиновые мутации в каждом остатке молекулы. Затем полученные мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, например, как показано в приведенных здесь примерах. Участки, критические для связывания лиганда, также можно определить структурным анализом, таким как кристаллизация, ядерно-магнитный резонанс или фотоаффинное мечение (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224: 399-904 (1992) and de Vos, et al. Science 255: 306-312 (1992. Даже если делеция одной или нескольких аминокислот с N-конца белка приводит к модификации или потере одной или нескольких биологических функций белка, другие биологические активности могут еще сохраняться. Предполагают также, что полипептиды, применимые в получении выделенных полипептидов по настоящему изобретению, можно получать способами твердофазного синтеза. См. Houghten, R.A., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985); и патент США 4631211 Houghten et al. (1986). Полипептиды по настоящему изобретению можно получать в выделенной форме. Под выделенным полипептидом понимают полипептид, удаленный из его природного окружения. Таким образом,полипептид, получаемый и/или содержащийся в рекомбинантной культивируемой клетке-хозяине, считают выделенным для целей настоящего изобретения. Также выделенными полипептидами считают полипептиды, очищенные, частично или в основном, из рекомбинантного культивируемого хозяина. Полипептиды, обладающие аминокислотной последовательностью с указанной процентной идентичностью контрольной аминокислотной последовательности полипептида дельта-плазминогена, можно определить с применением способов, включая компьютеризованные способы, указанные выше относительно полинуклеотидов. Аминокислотные последовательности полипептидов исследуют и сравнивают так же, как нуклеотидные последовательности в предшествующем обсуждении. Специалисты в данной области будут признавать, что такие концепции, как молекулярные конечные точки, обсуждаемые для полинуклеотидов, будут обладать прямыми аналогами, когда рассматривают соответствующее применение данных способов и программ для анализа полипептидов. Например, ручная коррекция, обсуждаемая относительно полинуклеотидов, относится к 5'- и 3'-конечным точкам нуклеиновых кислот, но такое же обсуждение будет признано применимым к N-концам и С-концам полипептидов. Изобретение относится к полипептидам дельта-плазминогена, по-разному модифицированным в течение или после трансляции, например гликозилированием, ацетилированием, фосфорилированием,амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением, присоединением к молекуле антитела или другому клеточному лиганду и т.д. Любые из множества химических модификаций можно осуществлять посредством известных способов, включающих в качестве неограничивающих примеров специфическое химическое расщепление бромцианом,трипсином, химотрипсином, папаином, протеазой S. aureus V8, NaBH4; ацетилирование, формилирозание, окисление, восстановление; метаболический синтез в присутствии туникамицина и т.д. Дополнительные посттранслянционные модификации, относящиеся к изобретению, включают, например, N-связанные или О-связанные углеводородные цепи, процессинг N-конца или С-конца, присоединение химических групп к аминокислотному остову, химические модификации N-связанных или Освязанных углеводородных цепей и добавление N-концевого остатка метионина из-за векторов и конструкций, принятых для экспрессии полипептидов дельта-плазминогена в культивируемых прокариотических клетках-хозяевах. Полипептиды можно модифицировать также детектируемой меткой, такой как ферментативная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, чтобы позволять детекцию и выделение белка. Фармацевтические композиции и способы лечения Дельта-плазмин(оген) можно составлять для терапевтического применения согласно способам и композициям, описанным в US 2003/0012778 А 1; и Novokhatny, V., et al., J. Thromb. Haemost. 1 (5): 103441 (2003), оба приведены здесь в качестве ссылки. Например, для составления дельта-плазмина можно применять буфер с низким рН (от приблизительно 2,5 до приблизительно 4), низкой буферной емкостью. Кроме того, другие способы и составы, известные специалистам в данной области как применяемые для плазмина, мини-плазмина и/или микроплазмина, можно применять для составления дельта-плазмина по изобретению для терапевтического введения. Дельта-плазмин(оген) можно применять для лечения множества тромботических заболеваний или состояний, например, согласно способам, описанным в патенте США 6355243 и опубликованных патентных заявках СШАUS 2003/0026798 A1; US 2003/0175264 A1, все приведены здесь в качестве ссылки. Снова, как для возможных фармацевтических составов, применимых для дельта-плазмина, дельта- 10010784 плазмин можно также вводить терапевтически известными в данной области способами, например такими, которые в настоящее время можно осуществлять для плазмина, мини-плазмина и/или микроплазмина. Примеры Конструирование экспрессирующего вектора Аминокислотная последовательность для дельта-плазминогена показана на SEQ ID NO: 2. Предполагаемую последовательность, кодирующую дельта-плазминоген, оптимизировали по кодонам для экспрессии в Е. coli и стабильности мРНК для получения последовательности ДНК, как показано на SEQ IDNO: 1. Данную ДНК синтезировали химически (Blue Heron, Inc,) и вставляли в участки NdeI и BamH1 экспрессирующего вектора для Е. coli pET22b(+) (Novagen; Madison, WI), чтобы получить цитозольный белок. С данной конструкцией получают дельта-плазминоген с дополнительным, неприродным N-концевым метионином (рЕТ-22b(+)=экспрессирующая система рЕТ 22b (Cat. No. 70765), EMD Biosciences, Inc.,Novagen Brand, Madison, WI; подробности относительно вектора см. на http://www.emdbiosciences.com, в разделе информации о продукте относительно рЕТ-22b). Экспрессия и очистка дельта-плазминогена ДНК, кодирующей последовательность дельта-плазминогена, трансформировали ряд клеток и сверхэкспрессию белка после индукции 1 мМ IPTG (изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид) анализировали в SDS-PAGE. Для получения дельта-плазминогена применяли клетки типа BL21(DE3) RIL(Stratagene, La Jolla, CA), сконструированные для экспрессии редких тРНК Е. coli для кодонов Arg, Ile иLeu. Продукцию дельта-плазминогена подтверждали крупномасштабной экспрессией, в которой клетки лизировали и как растворимый белок, так и очищенные тельца включения проверяли SDS-PAGE. КлеткиBL21(DE3) RIL продуцировали значительное количество белка дельта-плазминогена в форме телец включения. Оценки экспрессии составляли 50-80 мг/л культуры клеток. Следующий типичный протокол применяли для экспрессии дельта-плазминогена. Отдельную колонию клеток BL21(DE3) RIL, содержащих вектор с дельта-плазминогеном, применяли для инокуляции в 5 мл LB/ампициллин (100 мкг/мл)/хлорамфеникол (50 мкг/мл) и инкубировали 8 ч при 37 С во встряхивателе. После этого 50 мкл аликвоту отбирали из культивируемой бактериальной суспензии для дальнейшего роста в свежей среде. Процедуру повторяла через 16 ч с 6 мл культуры бактерий и 250 мл среды. Культуры растили при 37 С с покачиванием до OD 600 нм приблизительно 1,0 и добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Культуры растили дополнительные 5 ч. Клетки собирали центрифугированием при 5000g, осадки клеток растворяли в 20 мМ Трис рН 8,0, содержащем 20 мМEDTA, и замораживали при -80 С. Для очистки дельта-плазминогена осадки клеток оттаивали и добавляли буфер, пока объем раствора не достигал приблизительно 1/20 объема исходной культуры клеток. После этого добавляли лизоцим до конечной концентрации 0,5 мг/мл и клетки быстро перемешивали при 4 С в течение 10-15 мин. Затем добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и перемешивали следующие 10 мин. Добавляли ДНКазу I (0,05 мг/мл) и MgCl2 (2,5 мМ) и продолжали перемешивание при 4 С 30 мин или пока раствор не потеряет вязкость. Конечный раствор центрифугировали при 4 С 30 мин при 15000g и удаляли супернатант. Осадок клеток промывали 3 раза раствором для промывки (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, содержащий 10 мМEDTA, 1% Тритон-Х-100 и 0,5 М мочевину), окончательный осадок растворяли в 40 мл буфера для экстракции (PBS, рН 7,4, содержащий 10 мМ EDTA, 20 мМ DTT и 6 М гуанидин-HCl) и сохраняли при 4 С в течение ночи. После 16 ч раствор центрифугировали 30 мин при 15000g для удаления твердых частиц и супернатант медленно добавляли к раствору для повторной укладки (50 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 3,5 М гуанидин-HCl, 0,5 М аргинин-HCl, 10 мМ EDTA, 3 мМ GSH, 0,3 мМ GSSG) при перемешивании при 4 С. Процедуру повторной укладки проводили при концентрации белка 0,03 мг/мл или менее. Раствор для повторной укладки сохраняли нетронутым в течение 2 суток при 4 С и затем диализовали против 8-кратного объема 0,1 М Трис-HCl рН 8,0, содержащего 10 мМ EDTA, 0,15 М NaCl, 0,15 М аргинин-HCl, в течение периода 8-10 ч с частыми заменами буферного раствора. Затем раствор белка снимали с диализа и концентрировали с применением фильтров AMICON с мембраной, отсекающей 10 кДа, до приблизительно 10-20 мл и диализовали в течение ночи против 100 кратного объема 0,1 М Трис рН 8,0, содержащего 10 мМ EDTA, 0,15 М NaCl. Данный материал центрифугировали для удаления частиц, затем пропускали через лизиновую аффинную смолу (лизин-SEPHAROSE 4 В; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Дельта-плазминоген элюировали со смолы с применением Трис-буферного солевого раствора, рН 8,0, содержащего 0,2 М эпсилон-аминокапроновую кислоту(АСА). Обычно из 1 л культуры клеток можно выделить 80 мг телец включения и 40 мг можно элюировать на стадии хроматографии на лизин-SEPHAROSE. Свойства дельта-плазминогена Очищенный дельта-плазминоген выглядел отдельной полосой в области 35-40 кДа при анализе вSDS-PAGE восстановленного (обработанного дитиотреитолом) и невосстановленного белка (см. фиг. 5). Его точная молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией MALDI, составляла 37089 Да, очень близко к ожидаемому значению 37198 Да. Для тестирования, можно ли активировать дельта-плазминоген (Pg) до дельта-плазмина, дельтаплазминоген ингибировали с урокиназой (молярное соотношение 1:1000) и увеличение активности сериновой протеазы контролировали измерением увеличения скорости гидролиза S-2251 (S-2251=D-Val-LeuLys-p-нитроанилид, DiaPharma Group, Inc., West Chester, ОН). Как видно на фиг. 6, наблюдали параболическое увеличение активности, типичное для двойной реакции активации (зимоген переходит в активный фермент (1); и фермент расщепляет хромогенный субстрат (2. В данных условиях активация дельтаплазминогена до дельта-плазмина завершалась за 3 мин. Очень похожие результаты получили с tPA и стрептокиназой. Кинетику для урокиназной активации дельта-плазминогена сравнивали с кинетикой для полноразмерного плазминогена с применением способа Wohl et al. (Wohl, R.C., Summaria, L., Arzadon, L., andRobbins, K.C.; J. Biol. Chem. 253: 1402-1407 (1978), который приведен в качестве ссылки в полном объеме). Для данной цели 5,8 нМ урокиназу добавляли к растворам, содержащим различные концентрации видов плазмина в присутствии 1 мМ субстрата S-2251 при 37 С, рН 7,5. Контролировали увеличение оптической плотности при 405 нм и увеличенную скорость образования продукта S-2251 рассчитывали с применением параболического уравнения, где скорость=kt2. Данные подставляли в кинетическую модель Михаэлиса-Ментена с применением анализа Lineweaver-Burk, получая значения ниже. Таблица 1 Кинетика для урокиназной активации дельта-плазминогена Полноразмерный плазминоген являлся активированным урокиназой со значениями Km такими же,как обнаруженные в литературе (1,7 мкМ; Wohl, R.C., Summaria, L., and Robbins, K.C.; J. Biol. Chem. 255(5): 2005-2013 (1980, и эквивалентными значениями kкат. Значения Km для урокиназной активации дельта-плазминогена были приблизительно в 30 раз выше,чем для плазминогена, возможно, указывая на более низкую аффринность урокиназы для данного мутанта плазминогена. В то же самое время, значение kкат для активации дельта-плазминогена являлось намного более высоким, чем для плазминогена. Несмотря на упомянутые выше различия в kкат и Km, их отношение, или каталитическая эффективность, является приблизительно одинаковой для активации природного и рекомбинантно-модифицированного видов плазминогена урокиназой. Таким образом, эти данные показывают, что присутствие чужеродного крингла 1 незначительно влияет на свойства активации домена сериновой протеазы в дельта-плазминогене. Еще в одном эксперименте по активации дельта-плазминоген инкубировали со стрептокиназой, tPA и урокиназой и анализировали в восстанавливающем SDS-PAGE для наблюдения перехода одноцепочечной молекулы дельта-плазминогена в двухцепочечный дельта-плазмин (см. фиг. 5, дорожки 3-5). Во всех трех случаях можно было видеть две цепи (приблизительно 12 кДа крингл 1 и приблизительно 25 кДа цепь сериновой протеазы) дельта-плазмина, что позволяет предполагать, что дельта-плазминоген, действительно, можно активировать всеми тремя активаторами плазминогена. Как ожидали, дельта-плазминоген связывался с лизин-SEPHAROSE через крингл 1, и его можно было элюировать с колонки градиентом АСА как отдельный пик (см. фиг. 7). Способность дельта-плазминогена после повторной укладки связываться с лизин-SEPHAROSE показывает, что крингл-домен молекулы уложен надлежащим образом и лизинсвязывающий участок является полностью активным. Для дальнейшего подтверждения функциональности крингла 1 связывание АСА с дельта-плазминогеном измеряли контролированием ассоциированных изменений флуоресценции белка, как описано уDouglas et al. (Douglas, J.T., von Haller, P.D., Gehrmann, M., Llinas, M., and Schaller. J., Biochemistry 41: 3302-3310 (2002), все приведены здесь в качестве ссылки). Связывание АСА с кринглом 1 дельта-плазминогена приводит к уменьшению флуоресценции, подобному вызванному заглушением триптофановых остатков, являющихся частью лизинсвязывающего участка. Чтобы контролировать данный процесс, аликвоты от 4 до 16 мкл концентрированного раствораACA добавляли к 2 мл 5 мкМ дельта-плазминогена в 50 мМ Трис-буфере, содержащем 20 мМ NaCl, рН 8,0, 25 С. Флуоресценцию контролировали при длине волны возбуждения 298 нм и длине волны испус- 12010784 кания 340 нм в флуоресцентном спектрофотометре FLUOROMAX (Jobin Yvon, Inc., Edison, NJ); после каждого добавления АСА раствору позволяли уравновешиваться, пока не прекращали наблюдать дальнейшие изменения флуоресценции. Полученные значения флуоресценции корректировали по разведению и наносили на график против концентрации АСА в диапазоне 0-50 мкМ АСА. Данные приближали к нелинейной регрессии с получением Kd 11,1+/-2,3 мМ в хорошем соответствии с литературными значениями для аффинности крингла 1 к АСА 3,2 мкМ (Matsuka, et al.) и 13 мкМ (Douglas, et al.). Одним из свойств плазмина является его способность связывать фибрин. Чтобы определить, сохраняет ли дельта-плазминоген способность взаимодействовать с фибрином, его фибринсвязывающие способности тестировали анализом в титрационном микропланшете, в котором связывание дельта-плазминогена с фибрином оценивали по его последующей активации посредством tPA и лизису сгустка в результате. Для данной цели 100 мкл 5 мг/мл фибриногена полимеризовали с тромбином в каждой лунке титрационного микропланшета. Поверх фибриновых сгустков наносили дельта-плазминоген в различных концентрациях и инкубировали 1 ч при 37 С. Планшет тщательно промывали PBS, в то время как фибриновые сгустки все еще оставались интактными и прикрепленными к лункам. После промывки в каждую лунку добавляли 0,1 мг/мл раствор tPA и инкубировали планшет 2 ч при 37 С. В результате некоторые из сгустков являлись полностью растворенными, а некоторые частично растворенными, в то время как лунки с очень малыми количествами дельта-плазминогена и контрольные лунки оставались практически интактными. Степень фибринолиза контролировали измерением оптической плотности при 280 нм остатков исходных сгустков, восстановленных в 1 М NaOH. Значения оптической плотности наносили на график как функцию концентрации дельта-плазминогена. Как видно на фиг. 8, связывание дельта-плазминогена с фибрином следует классической сигмоидальной кривой связывания. С применением данного анализа обнаружили, что дельта-плазминоген связывает фибрин с аффинностью, сравнимой с аффинностью полноразмерного плазминогена, и что C50 данного взаимодействия(приблизительно 0,2 мкМ) сравнима с Kd связывания фибрина с полноразмерным плазминогеном (Lucas,M.A., Fretto, L.J., and McKee, P.A.; J. Biol. Chem. 258 (7): 4249-4256 (1983. Данные эксперименты показывают, что дельта-плазминоген может связывать фибрин. Таким образом, взаимодействие дельта-плазминогена с лизин-SEPHAROSE, его способность связывать АСА с ожидаемой Kd, его способность связывать фибрин, его способность к активации посредством всех основных активаторов плазминогена и активность дельта-плазмина по отношению к хромогенному субстрату плазмина S-2251, все показывают, что данную молекулу получили в системе Е. coli в полностью функциональной форме. Очистка и составление композиции дельта-плазмина Дельта-плазминоген, диализованный против 0,1 М буфера Трис, рН 8,0, содержащего 10 мМ EDTA и 0,15 М NaCl, активировали до дельта-плазмина с применением урокиназы, иммобилизованной наSEPHAROSE 4B, по существу, как описано ранее для плазмина (Marder, V.J., et al., Thromb Haemost., 86(3): 739-45 (2001), приведено в качестве ссылки). Активацию осуществляли при комнатной температуре и контролировали в реальном времени по увеличению активности по отношению к S-2251. В зависимости от количества дельта-плазминогена, которое изменялось от партии к партии (обычно 1-2 мг/мл), время инкубации составляло 30-60 мин. После завершения активации, когда активность с S-2251 достигала плато, урокиназу-SEPHAROSE отфильтровывали и активный дельта-плазмин удерживали на бензамидин-SEPHAROSE (Pharmacia). Дельта-плазмин элюировали со смолы с применением буфера с низким рН(0,2 М глицин, рН 3,0, 0,3 М NaCl, 0,2M ACA). В элюированных фракциях измеряли концентрации белка и активность по отношению к S-2251. Фракции с высокой специфической активностью объединяли и диализовали против многократных смен 0,15 М NaCl, pH 3,6 при 4 С. Анализ SDS-PAGE невосстановленных образцов дельта-плазмина (см. фиг. 9,дорожка 3) показал, что чистота данного вещества обычно составляла более чем 95%. В восстанавливающих условиях (фиг. 9, дорожка 4) кроме цепей сериновой протеазы и крингла присутствовали две слабые полосы сверху и снизу полосы крингла. Данные полосы представляют собой продукты самодеградации домена сериновой протеазы, происходящей из-за внутренних расщеплений в его полипептидной цепи; обычно они удерживаются вместе дисульфидными связями, но становятся видимыми приPAGE в восстанавливающих условиях. Количество продуктов самодеградации, обычно не превышающее 10%, сильно уменьшается проведением стадии очистки на бензамидин-SEPHAROSE в режиме порционной загрузки вместо формата колонки. Так как показано, что дельта-плазмин, подобно полноразмерному плазмину, подвержен самодеградации при физиологическом рН, для конечного состава выбрали рН 3,6 (подкисленный уксусной кислотой солевой раствор). Как показано ранее для плазмина (Novokhatny, V. et al., J. Thromb. Haemost., 1 (5): 1034-41 (2003), приведено в качестве ссылки) и подтверждено в экспериментах с дельта-плазмином, данный состав с низкой буферной емкостью и низким рН не только позволяет безопасное хранение активных плазминов в течение длительных периодов времени, но также совместим с парентеральным введе- 13010784 нием данных прямых тромболитиков. При смешивании с плазмой или с буферами с нейтральным рН дельта-плазмин быстро активируется вновь. Ферментативные свойства дельта-плазмина Амидолитическую активность дельта-плазмина проверяли с применением субстрата плазмина DVal-Leu-Lys-р-нитроанилида (S-2251) (DiaPharma, West Chester, ОН). При рН 7,4, 25 С в буфере PBS,обнаружили, что константа Михаэлиса-Ментена (Km) для S-2251 составляет 138 мкМ (табл. 2). Обнаружили, что kкат для препарата составляет 510 мин-1. С применением титрования гидрохлоридом 4-нитрофенил 4-гуанидинбензоата (pNPGB) (Chase, Т. and E. Shaw, Methods Enzymol. 197: 20-27 (1970 обнаружили, что процент функционально активных участков составляет 67%. Определили kкат с поправкой на процент активных участков, kкат 755+/-45 мин-1. Данное значение являлось очень близким к значению,определенному в таком же анализе для полноразмерного плазмина, 760+/-23 мин-1, и для микроплазмина(с отсутствием всех пяти кринглов), 795+/-24 мин-1 (см. фиг. 9). Эти данные показывают, что присутствие или отсутствие кринглов не влияет на каталитическую активность домена сериновой протеазы. Скорость ингибирования дельта-плазмина 2-макроглобулином измеряли с применением способаAnonick et al. (Anonick, P., et al., Thrombosis Res. 59: 449-462 (1990. Обнаружили, что скорость ингибирования составляет 7,6+/-0,6105 М-1 с-1 при 22 С в буфере PBS. Скорость ингибирования дельта-плазмина 2-антиплазмином определили составляющей 1,1107 М-1 с-1 с применением способа Wiman and Collen (Wiman, В. and D. Collen, Eur. J. Biochem. 84: 573-578 (1978, в котором плазмин и 2-антиплазмин смешивали, затем анализировали по активности для S-2251 в конкретных временных точках (табл. 3). Данное значение сравнимо с опубликованными значениями для плазмина 2,5107 М-1 с-1 (из Anonick, et al., Thrombosis Res. 59: 449 (1990. В таких же экспериментах, проведенных с микроплазмином, получили скорости ингибирования 2 антиплазмином 1,8105 М-1 с-1 и 3,1105 М-1 с-1 в двух отдельных экспериментах. Скорость ингибирования 2-антиплазмином мини-плазмина (состав доменов мини-плазмина K5-SP) определили составляющей 2,4105 М-1 с-1. Эти данные согласуются с литературными значениями для микро- и мини-плазмина и показывают, что ингибирование дельта-плазмина 2-антиплазмином происходит в 40 раз быстрее, чем ингибирование либо микроплазмином, либо мини-плазмином. Таким образом, данные результаты показывают, что дельта-плазмин подлежит быстрому ингибированию 2-антиплазмином из-за присутствия в его структуре крингла 1. В общем, данные, представленные в этом разделе, показывают, что ферментативные свойства и свойства ингибирования дельта-плазмина аналогичны свойствам полноразмерного плазмина. Таблица 2 Кинетические параметры для различных видов плазмина в устойчивом состоянии с субстратом S 2251 в буфере PBS, рН 7,4, 25 С Таблица 3 Скорости ингибирования для различных видов плазмина иингибиторов,определенные при 22 С в буфере PBS, рН 7,4 Литературные значения взяты из Anonick, et al., Thrombosis Res. 59: 449 (1990). Все скорости измеряли способами, опубликованными в Anonick, et al.- 14010784 Тромболитическая эффективность in vitro Тромболитическую эффективность дельта-плазмина тестировали на модели тромболизиса in vitro с помощью катетера (Novokhatny, V. et al., J. Thromb. Haemost., 1 (5): 1034-41 (2003), приведено в качестве ссылки) с применением следующего протокола эксперимента. Свежую цельную кровь человека собирали в стеклянные пробирки 200,95 см и позволяли самопроизвольно сворачиваться, без добавок. Пробирки инкубировали 20 ч при 37 С, чтобы позволить полное сжатие. Сжатые сгустки отделяли от сыворотки с применением тестирующих сит USA Standard D16 с ячейкой 14 и определяли их массы. Сгустки крови переносили в стеклянные пробирки меньшего диаметра, в которые сжатые сгустки входили плотно (0,87 см). Средняя масса сгустков составляла приблизительно 3,6 г. Однократные 1 мл дозы подкисленного солевого раствора, плазмина или дельта-плазмина инъецировали в сгусток с применением шприца. Сгустки инкубировали в течение 1 ч при 37 С в лабораторном термостате THELCO (Jouan, Inc., Winchester, VA). После инкубации сгустки опять помещали на сито для удаления разжиженного материала и измеряли массу переваренных сгустков. Степень лизиса сгустка определяли по разнице между исходной массой сгустка и массой оставшегося сгустка и выражали в процентах уменьшения массы сгустка. На фиг. 10 показаны результаты экспериментов по лизису с дельта-плазмином в данной модели. Однократное вливание дозы дельта-плазмина 0,44 мг (на основе молярности эквивалентно 1 мг/мл плазмина) приводило к уменьшению массы сгустка на 36% за 60 мин. В то же время масса сгустков, в которые вливали солевой раствор, уменьшилась только на 4%. Плазмин (1,0 мг) за тот же период приводил к 50% уменьшению веса сгустков. Таким образом, эти данные показывают, что дельта-плазмин проявляет тромболитическую эффективность и его можно применять в качестве прямого тромболитического средства. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид,имеющий один N-концевой крингл-домен, который по меньшей мере на 90% идентичен крингл-домену 1 или крингл-домену 4 природного плазминогена человека; и С-концевой домен, который по меньшей мере на 90% идентичен участку активации и домену сериновой протеазы плазминогена человека. 2. Полинуклеотид по п.1, где полипептид связывается с иммобилизованным лизином. 3. Полинуклеотид по п.1 или 2, где кодируемый полипептид представляет собой SEQ ID NO: 2,имеющую не более 50 аминокислотных замен. 4. Полинуклеотид по любому из пп.1-3, где кодируемый полипептид по меньшей мере на 90% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 5. Полинуклеотид по любому из пп.1-4, где кодируемый полипептид по меньшей мере на 95% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 6. Полинуклеотид по любому из пп.1-5, где кодируемый полипептид по меньшей мере на 98% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 7. Полинуклеотид по любому из пп.1-6, где кодируемый полипептид представляет собой последовательность, показанную на SEQ ID NO: 2. 8. Полинуклеотид по любому из пп.1-7, где нуклеотидная последовательность полинуклеотида представляет собой последовательность, показанную на SEQ ID NO: 1, или ее вырожденный вариант. 9. Полипептид, содержащий один N-концевой крингл-домен, который по меньшей мере на 90% идентичен крингл-домену 1 или крингл-домену 4 природного плазминогена человека; и С-концевой домен, который по меньшей мере на 90% идентичен участку активации и домену сериновой протеазы плазминогена человека. 10. Полипептид по п.9, где полипептид связывается с иммобилизованным лизином. 11. Полипептид по п.9 или 10, где полипептид представляет собой SEQ ID NO: 2, имеющую не более 50 аминокислотных замен. 12. Полипептид по любому из пп.9-11, где полипептид по меньшей мере на 90% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 13. Полипептид по любому из пп.9-12, где полипептид по меньшей мере на 95% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 14. Полипептид по любому из пп.9-13, где полипептид по меньшей мере на 98% идентичен последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 15. Полипептид по любому из пп.9-14, где полипептид представляет собой последовательность, показанную на SEQ ID NO: 2. 16. Полипептид по любому из пп.9-15, где полипептид демонстрирует фибринолитическую активность, ингибируемую 2-антиплазмином со скоростью ингибирования, по меньшей мере в 5 раз быстрее скорости ингибирования фибринолитической активности мини-плазмина 2-антиплазмином. 17. Полипептид по любому из пп.9-16, где скорость ингибирования по меньшей мере приблизительно в 10, 20, 30 или 40 раз быстрее, чем скорость ингибирования мини-плазмина.- 15010784 18. Полипептид по любому из пп.9-17, где иммобилизованный лизин представляет собой лизин,связанный с материалом твердой подложки, выбранный из группы, состоящей из лизин-агарозы, лизингидрогеля, лизин-перекрестно-сшитой агарозы. 19. Полипептид по любому из пп.9-18, где иммобилизованный лизин представляет собой лизинперекрестно-сшитую агарозу. 20. Полипептид по любому из пп.9-19, где полипептид демонстрирует более низкую аффинность связывания для фибриногена, чем аффинность связывания для фибриногена мини-плазмина. 21. Полипептид по любому из пп.9-20, где полипептид демонстрирует более высокую аффинность связывания для частично расщепленного фибрина, чем аффинность связывания для частично расщепленного фибрина мини-плазмина. 22. Полипептид, содержащий один крингл-домен, локализованный к N-концу от участка активации плазминогена и домена сериновой протеазы плазминогена, где крингл-домен обладает по меньшей мере на один остаток большей идентичностью аминокислотной последовательности с кринглом 1 или кринглом 4 природного плазминогена человека, чем с кринглом 5 природного плазминогена человека, и где консервативные замены в одной крингл-области относительно природных последовательностей кринглов 1 и 4 плазминогена человека не считают отличающимися от природных последовательностей для целей сравнения идентичности с кринглом 5. 23. Полипептид по п.22, где полипептид обладает аминокислотной последовательностью, как показано на SEQ ID NO: 2, и его консервативные замены. 24. Полипептид по п.22 или 23, где полипептид обладает остатком аргинина в относительном положении, аналогичном положению 76 аминокислотной последовательности, показанной на SEQ ID NO: 2. 25. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.1-8. 26. Культивируемая клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.25.