Анализ нуклеиновых кислот, полученных из единичных клеток

АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ЕДИНИЧНЫХ КЛЕТОК Изобретение относится к способам анализа геномной ДНК и/или РНК из небольших образцов или даже единичных клеток. Способы анализа геномной ДНК могут включать полногеномную амплификацию (WGA) с последующей преамплификацией и амплификацией выбранных нуклеиновых кислот-мишеней. Способы анализа РНК могут включать обратную транскрипцию желательной РНК с последующей преамплификацией и амплификацией выбранных нуклеиновых кислот-мишеней. Перекрестная ссылка на родственные заявки По заявке на данный патент испрашивается приоритет для предварительной заявки США 61/144416, поданной 13 января 2009 г.; предварительной заявки США 61/146583, поданной 22 января 2009 г.; и предварительной заявки США 61/284309, поданной 15 декабря 2009 г., все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме. Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способам, применяемым для анализа нуклеиновых кислот, например геномной ДНК или РНК (например, некодирующей РНК или мРНК), из небольших популяций клеток или единичных клеток. Уровень техники Для быстрого и достоверного анализа геномной ДНК или РНК (например, некодирующей РНК или мРНК) из небольших образцов или единичных клеток существовало препятствие, заключающееся в неудовлетворительной воспроизводимости принятой полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации всех интересующих нуклеиновых кислот-мишеней в достаточной для детекции степени. Сущность изобретения В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам анализа нуклеиновых кислот единичной клетки. В определенных вариантах осуществления единичная клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как, например, клетка преимплантированного эмбриона, стволовая клетка, предположительно раковая клетка, клетка патогенного организма и/или клетка, полученная с места преступления. В иллюстративных вариантах осуществления клетка представляет собой бластомер человека (например, эмбриона на стадии восьми клеток) или стволовую клетку человека. Например, иллюстративный способ генотипирования одной клетки включает в себя:(а) осуществление полногеномной амплификации генома единичной клетки для продукции амплифицированного генома;(b) преамплификацию амплифицированного генома для продукции преамплифицированной реакционной смеси, содержащей один или несколько ампликонов, специфичных для одной или нескольких нуклеиновых кислот-мишеней (локусов);(c) амплификацию и детекцию одного или нескольких ампликонов. В некоторых вариантах осуществления полногеномную амплификацию (WGA) осуществляют таким образом, чтобы реакция не выходила на плато. Как правило, WGA осуществляют в течение больше чем 2 циклов амплификации и в определенных вариантах осуществления меньше чем около 10 циклов(например, между около 4 и 8 циклами включительно). К подходящим техникам WGA относятся ПЦР с удлинением праймера (PEP), ПЦР с вырожденными олигонуклеотидами, ПЦР с лигированием (LMP), линейная амплификация ДНК на основе Т 7 (TLAD) и множественная амплификация со смещением (MDA). Иллюстративный способ анализа РНК единичной клетки включает в себя:(a) получение ДНК из РНК одной клетки;(b) преамплификацию ДНК для продукции преамплифицированной реакционной смеси, содержащей один или несколько ампликонов, специфичных для одной или нескольких нуклеиновых кислотмишеней (РНК-мишени(ей;(c) амплификацию и детекцию одного или нескольких ампликонов. В определенных вариантах осуществления кДНК получают обратной транскрипцией или амплификацией мРНК. В других вариантах осуществления ДНК получают обратной транскрипцией или амплификацией некодирующей РНК. Например, некодирующая РНК может представлять собой малую ядрышковую РНК (snoRNA), микроРНК (miRNA), малую интерферирующую РНК (siRNA) и/или Piwiвзаимодействующие РНК (piRNA). Нуклеиновые кислоты, полученные, например, из геномной ДНК или РНК единичной клетки, могут быть подвергнуты преамплификации. При получении ДНК из РНК, например посредством обратной транскрипции, затем в той же реакционной смеси может быть осуществлена преамплификация. В некоторых вариантах осуществления преамплификацию осуществляют, используя одну или несколько пар праймеров, специфичных для одной или нескольких интересующих нуклеиновых кислот-мишеней (например, локусов). Преамплификацию в конкретных вариантах осуществления можно осуществлять в продолжение 8-18 циклов. В определенных вариантах осуществления в смеси для преамплификации отсутствует зонд. Ампликоны, полученные путем преамплификации, могут быть детектированы в некоторых вариантах осуществления с помощью дополнительной амплификации. В определенных вариантах осуществления эту дополнительную амплификацию осуществляют, используя одну или несколько пар праймеров,специфичных для одной или нескольких интересующих нуклеиновых кислот-мишеней (локусов). Эти пары праймеров могут быть теми же или отличными от использованных для преамплификации. В иллюстративных вариантах осуществления перед амплификацией может быть осуществлена преамплификация, и полученная преамплифицированная смесь может быть разнесена в отдельные камеры микрофлуидального устройства. К подходящим микрофлуидальным устройствам относятся устройства,-1 020593 созданные, по меньшей мере частично, из эластомерного материала. В некоторых вариантах осуществления преамплификацию и/или амплификацию осуществляют посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). При осуществлении амплификации с помощью ПЦР наличие продукта амплификации может быть определено посредством количественной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (q-ПЦР). В таких вариантах осуществления для детекции продуктов амплификации в смесях для амплификации может использоваться универсальный зонд для qПЦР, такой как, например, краситель двухцепочечной ДНК (ds-ДНК). Альтернативно или дополнительно, для детекции продуктов амплификации может(гут) быть использован(ы) один или несколько зондов для q-ПЦР, специфичных для мишени. В иллюстративных вариантах осуществления наличие продукта амплификации определяют, используя анализ с флуорогенной нуклеазой. Например, наличие продукта амплификации может быть определено, используя олигонуклеотидный зонд с двойной флуорогенной меткой. Пары праймеров, использованные для преамплификации и/или амплификации, могут амплифицировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В определенных вариантах осуществления они могут коррелировать с наличием одного или нескольких генетических дефектов. Краткое описание чертежей Фиг. 1: изображение кластеров на основе генотипирования SNP с помощью программного обеспечения для генотипического анализа BioMark до 94 отдельных клеток. Фиг. 2: изображение кластеров всех SNP на основе программного обеспечения для генотипического анализа BioMark, полученных при анализах TaqMan 96 уникальных SNP от 94 единичных клеток. Фиг. 3: "стандартный график" линейности анализа miRNA 30 С, полученный исходя из матрицы,подвергнутой амплификации специфической мишени (STA), полученной при большом числе исходных уровней общей РНК, проанализированной, как описано в примере 2 В. Данные выражаются в пересчете на Ct против относительной концентрации. EFF указывает на эффективность ПЦР в серии разведений. Фиг. 4: стандартные графики линейности анализа U6, полученные из одного и того же разведенияSTA, но при различных исходных количествах общей РНК, проанализированной, как описано в примере 2 В. Анализы показывают явную линейность ответа со стадии обратной транскрипции (RT) через STA и окончательно в интегрированном жидком контуре (IFC). Данные выражаются в пересчете на величину Ct против нг введенной общей РНК. EFF указывает на эффективность ПЦР в серии разведений. Фиг. 5: тепловая карта 48.48, соответствующая величинам Ct, данных по экспрессии miRNA (пример 2 В). Данные получали, используя различные количества введенной общей РНК. STA в течение 15 или 18 циклов. Фиг. 6: тепловая карта 96.96, соответствующая величинам Ct, данных по экспрессии miRNA (пример 2 В). Данные получали, используя различные количества введенной общей РНК. STA в течение 15 или 18 циклов. Подробное описание Возможность анализа нуклеиновых кислот, например геномной ДНК, из небольших образцов важна, например, при оценке образцов в связи с оплодотворением in vitro (IVF), СТС и исследованиями однородности опухоли. Генотип единичных клеток интересен в большом числе контекстов, к которым относятся биология развития, детекция мутаций и бактериология. Аналогичным образом представляют интерес паттерны экспрессии кодирующей РНК (мРНК) и некодирующей РНК, например, в понимании молекулярной основы дифференциации, развития, заболевания и клеточных ответов на большое число стимулов. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам, основанным на применении полногеномной амплификации (WGA) с последующей преамплификацией и амплификацией выбранных нуклеиновых кислот-мишеней. Применение WGA создает большое число копий генома перед стадией преамплификации, повышая вероятность полной преамплификации всех интересующих нуклеиновых кислот-мишеней. В других вариантах осуществления получают ДНК-отображение РНК,например кДНК, полученную из мРНК, с последующей преамплификацией и амплификацией выбранных нуклеиновых кислот-мишеней. Определения. Если не указано другого, термины, использованные в формуле изобретения и описании, определяются, как приведено ниже. Термин "нуклеиновая кислота" относится к нуклеотидному полимеру и, если не огранивается другим, к нему относятся известные аналоги природных нуклеотидов, которые могут функционировать (например, гибридизоваться) аналогично природным нуклеотидам. К термину "нуклеиновая кислота" относится любая форма ДНК или РНК, включая, например, геномную ДНК; комплементарную ДНК (кДНК), которая представляет собой ДНК-отображение мРНК,обычно получаемую обратной транскрипцией матричной РНК (мРНК) или амплификацией; молекулы ДНК, полученные синтетическим путем или посредством амплификации; и мРНК. Термин "нуклеиновая кислота" охватывает двух- или трехцепочечную нуклеиновую кислоту, а также одноцепочечные молекулы. В двух- или трехцепочечных нуклеиновых кислотах цепи нуклеиновой кислоты необязательно должны быть одинаковой длины (т.е. двухцепочечная нуклеиновая кислота не обязательно должна быть двухцепочечной на всем протяжении обеих цепей). Термин "нуклеиновая кислота" также охватывает любую ее химическую модификацию, такую как метилирование и/или кэппинг. К модификациям нуклеиновых кислот могут относиться добавление химических групп, которые вводят дополнительный заряд, поляризуемость, связывание водорода, электростатическое взаимодействие и функциональность в отдельные основания нуклеиновых кислот, фосфодиэфирные связи или в нуклеиновую кислоту в целом. К таким модификациям могут относиться модификации оснований, такие как модификации сахара во 2'-позиции, модификации пиримидина в 5-позиции,модификации пурина в 8-позиции, модификации по экзоциклическим аминам цинозина, замены 5 бромурацила, модификации остова, необычные сочетания спаривания оснований, такие как изооснования изоцитидин и изогуанидин, и подобное. Конкретнее, в некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты могут включать полидезоксирибонуклеотиды (содержащие 2-дезокси-D-рибозу), полирибонуклеотиды (содержащие D-рибозу) и любой другой тип нуклеиновой кислоты, т.е. N- или С-гликозид пуринового или пиримидинового основания, а также другие полимеры, содержащие ненуклеотидные остовы, например полиамидные (например, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA и полиморфолино (коммерчески доступные у фирмыAnti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, как Neugene) полимеры и другие синтетические полимеры нуклеиновых кислот со специфической последовательностью при условии, что полимеры содержат нуклеотиды в конфигурации, которая обеспечивает спаривание оснований и стэкинг оснований, такие, которые обнаружены в ДНК и РНК. Термин "нуклеиновая кислота" также охватывает замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA), которые описаны в патентах США 6794499, 6670461, 6262490 и 6770748, которые приводятся в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме ввиду описания в них LNA. Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может(гут) быть получена(ы), исходя из способа полностью химического синтеза, такого как твердофазный химический синтез, из биологического источника, например,путем выделения из любого вида, который продуцирует нуклеиновую кислоту, или на основе способов,которые включают воздействие на нуклеиновые кислоты молекулярно-биологическими средствами, такими как репликация ДНК, ПЦР-амплификация, обратная транскрипция или исходя из сочетания этих способов. Термин "нуклеиновые кислоты-мишени" используется в настоящем документе в отношении конкретных нуклеиновых кислот, детектируемых в способах, описанных в настоящем документе. К нуклеиновым кислотам-мишеням относятся, например, интересующие локусы (например, однонуклеотидные полиморфизмы) в генотипических исследованиях, интересующие мРНК в исследованиях экспрессии, а также некодирующие РНК. Нуклеиновые кислоты-мишени, которые исходно (т.е. до экспериментального вмешательства) обнаруживаются в форме РНК, также называются в настоящем документе "РНКмишени". К некодирующим РНК относятся такие виды РНК, которые необязательно транслируются в белок. К ним относятся, но ими не ограничиваясь, транспортная РНК (тРНК) и рибосомальная РНК (рРНК), а также РНК, такие как малые ядрышковые РНК (snoPHK; например, ассоциированные с метилированием или псевдоуридилированием), микроРНК (miPHK; которые регулируют экспрессию генов), малые интерферирующие РНК (siPHK; которые вовлечены в путь РНК-интерференции (PHKi), где они влияют на экспрессию специфических генов, но также было показано, что они действуют как противовирусные агенты, и в формирование хроматиновой структуры генома) и Piwi-взаимодействующие РНК (piPHK; которые образуют комплексы РНК-белок за счет взаимодействий с белками Piwi; эти комплексы piPHK были связаны с сайленсингом транскрипционных генов ретротранспозонов и других генетических элементов в клетках зародышевой линии, в частности при сперматогенезе) и длинные некодирующие РНК(длинные псРНК; которые представляют собой некодирующие транскрипты, которые обычно длиннее,чем около 200 нуклеотидов). Под используемым в данном документе термином "нуклеотидная последовательность-мишень" понимают молекулу, которая имеет нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, например, продукт амплификации, полученный амплификацией нуклеиновой кислоты-мишени, или кДНК,полученная при обратной транскрипции мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. Под используемым в данном документе термином "комплементарность" понимают способность образовывать пары между двумя нуклеотидами. Т.е. если нуклеотид в данной позиции нуклеиновой кислоты способен к образованию водородной связи с нуклеотидом другой нуклеиновой кислоты, то полагают,что две нуклеиновые кислоты комплементарны друг другу в этой позиции. Комплементарность (Уотсона-Крика или неканоническое спаривание) между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот может быть "частичной", при этом связываются лишь некоторые нуклеотиды, или она может быть полной при наличии полной комплементарности между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновых кислот существенно влияет на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновых кислот и последующие стэкинг-взаимодействия. Под "специфической гибридизацией" понимают связывание нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью-мишенью в отсутствие существенного связывания с другими нуклеотидными по-3 020593 следовательностями, присутствующими в смеси для гибридизации при условиях определенной жесткости. Специалисты в данной области знают, что снижение жесткости условий гибридизации позволяет допускать неспаривания последовательностей. В конкретных вариантах осуществления гибридизации осуществляют при жестких условиях гибридизации. Под фразой "жесткие условия гибридизации", как правило, понимают температуру в диапазоне от около 5 до около 20 или 25 С ниже, чем температура плавления (Tm) конкретной последовательности при определенных величинах ионной силы и рН. Под используемой в настоящем документе Tm понимают температуру, при которой популяция двуцепочечных молекул нуклеиновых кислот становится наполовину диссоциированной на единичные цепи. Способы расчета Tm нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области (см., например, руководства Berger and Kimmel (1987), METHODS INPress, Inc. и Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ED., Vils. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, оба приводятся в данном документе в качестве ссылки). Как указано стандартными ссылками, простая оценка величины Tm может быть рассчитана по уравнению:Tm=81,5+0,41 (%G+C) при нахождении нуклеиновой кислоты в водном растворе с концентрацией NaCl 1 M (см., например, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (1985. На температуру плавления гибрида (и таким образом условия жесткой гибридизации) влияет большое число факторов, таких как длина и природа (ДНК, РНК, нуклеотидный состав) праймера или зонда и природа нуклеиновой кислоты-мишени (ДНК, РНК, нуклеотидный состав, нахождение в растворе или в иммобилизованном состоянии и подобное), а также концентрация солей и других компонентов (например, наличие или отсутствие формамида, сульфата декстрана, полиэтиленгликоля). Влияние этих факторов хорошо известно и обсуждается в стандартных ссылках в данной области. Иллюстративными условиями жесткости, подходящими для достижения специфической гибридизации большинства последовательностей, являются температура по меньшей мере около 60 С и концентрация соли около 0,2 М при величине рН 7. Под термином "олигонуклеотид" понимают нуклеиновую кислоту, которая относительно коротка,как правило, короче, чем 200 нуклеотидов, конкретнее, короче, чем 100 нуклеотидов, в частности короче,чем 50 нуклеотидов. Обычно олигонуклеотиды представляют собой одноцепочечные молекулы ДНК, но также могут быть получены двуцепочечные олигонуклеотиды. Под термином "праймер" понимают олигонуклеотид, который способен к гибридизации (также обозначаемой "отжигом") с нуклеиновой кислотой и служит в качестве сайта инициации полимеризации нуклеотидов (РНК или ДНК) при подходящих условиях (т.е. при наличии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и агента для полимеразации, такого ДНК- или РНК-полимераза или обратная транскриптаза) в подходящем буфере и при подходящей температуре. Подходящая длина праймера зависит от назначения праймера, но праймеры обычно имеют по меньшей мере 6 нуклеотидов в длину и чаще находятся в диапазоне от 10 до 30 нуклеотидов или даже чаще от 15 до 30 нуклеотидов в длину. Другие праймеры могут быть несколько длиннее, например от 30 до 50 нуклеотидов в длину. В этом контексте под "длиной праймера" понимают участок олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты, который гибридизуется с комплементарной последовательностью-"мишенью" и праймирует синтез нуклеотидов. Молекулы коротких праймеров, как правило, требуют более низких температур для образования в достаточной степени устойчивых комплексов гибридов с матрицей. Праймер не обязан воспроизводить точную последовательность матрицы, но должен быть в достаточной степени комплементарен для гибридизации с матрицей. Под термином "сайт праймера" или "сайт связывания праймера" понимают сегмент нуклеиновой кислоты-мишени, с которым праймер гибридизуется. Праймер может включать нуклеотидный хвост, например, присоединенный к его 5'-концу. Под термином "нуклеотидный хвост", используемым в настоящем документе, понимают заранее известную нуклеотидную последовательность, которая добавляется к нуклеотидной последовательности-мишени. Нуклеотидный хвост может кодировать часть информации о нуклеотидной последовательности-мишени,таким образом идентифицируя нуклеотидную последовательность-мишень, хромосому, из которой эта последовательность происходит, или идентифицируя образец, из которого происходила нуклеотидная последовательность-мишень. Последовательности нуклеотидного хвоста, как правило, не используются в качестве сайтов связывания праймеров в первом цикле амплификации. Говорят, что праймер отжигается на другой нуклеиновой кислоте, если праймер или его участок специфически гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, содержащейся в нуклеиновой кислоте. Утверждение, что праймер гибридизуется с определенной нуклеотидной последовательностью, не уточняет, гибридизуется ли праймер с этой нуклеотидной последовательностью полностью либо частично. Под термином "пара праймеров" понимают набор праймеров, включающий 5' "вышележащий праймер" или "прямой праймер", который гибридизуется с комплементом 5'-конца амплифицируемой последовательности ДНК, и 3' "нижележащий праймер" или "обратный праймер", который гибридизуется с 3'-концом амплифицируемой последовательности. Как должно быть известно специалистам в данной области, термины "вышележащий" и "нижележащий" или "прямой" и "обратный" не должны пониматься как ограничивающие, а скорее создают наглядную ориентацию в конкретных вариантах осуществления. Полагают, что пара праймеров "уникальна", если она может быть использована для специфической амплификации конкретной нуклеотидной последовательности-мишени в данной смеси для амплификации."Зонд" представляет собой нуклеиновую кислоту, способную связываться с нуклеиновой кислотоймишенью комплементарной последовательности за счет одного или нескольких типов химических связей, как правило, путем спаривания комплементарных оснований, обычно через образование водородных связей (но также за счет координационных комплексов металлов), таким образом, образуя структуру дуплекса. Зонд связывается или гибридизуется с "сайтом связывания зонда". Зонд может быть помечен детектируемой меткой для содействия детекции зонда, конкретно, после гибридизации зонда с комплементарной ему мишенью. Альтернативно, тем не менее, зонд может не быть помечен, но может быть детектируем посредством специфического связывания с меченым лигандом либо прямо, либо опосредованно. Зонды могут существенно варьировать по размеру. Как правило, зонды составляют по меньшей мере от 6 до 15 нуклеотидов в длину. Другие зонды составляют по меньшей мере 20, 30 или 40 нуклеотидов в длину. Еще одни зонды несколько длиннее, составляя по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90 нуклеотидов в длину. Другие же зонды еще длиннее и составляют по меньшей мере 100, 150, 200 или больше нуклеотидов в длину. Зонды также могут быть любой длины, которая находится в любом диапазоне, связанном с любой из вышеуказанных величин (например, 15-20 нуклеотидов в длину). В качестве зондов также могут действовать праймеры. Праймер или зонд может быть полностью комплементарен последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или может быть меньше чем полностью комплементарен. В некоторых вариантах осуществления праймер по меньшей мере на 65% гомологичен комплементу последовательности нуклеиновой кислоты-мишени свыше последовательности из по меньшей мере 7 нуклеотидов, чаще свыше последовательности в диапазоне 10-30 нуклеотидов и часто свыше последовательности из по меньшей мере 14-25 нуклеотидов, и чаще гомологичен по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99%. Должно быть понятно, что, как правило, желательно, чтобы некоторые основания (например, 3'-основание праймера) были полностью комплементарны соответствующим основаниям последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Праймер и зонды обычно наиболее специфично отжигаются с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени при жестких условиях гибридизации. Амплификация согласно настоящим воззрениям охватывает любые средства, с помощью которых копируется по меньшей мере часть по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени обычно зависимым от матрицы образом, к которым относится без ограничения широкий диапазон техник амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, либо линейно, либо экспоненциально. К иллюстративным способам осуществления стадии амплификации относятся лигазная цепная реакция (LCR), реакция лигазной детекции (LDR), лигирование с последующей амплификацией с помощью Q-репликазы, ПЦР,удлинение праймера, амплификация с вытеснением цепи (SDA), амплификация с вытеснением гиперразветвленной цепи, множественная амплификация со смещением (MDA), реакция транскрипционной амплификации (NASBA), двухстадийные мультиплексные амплификации, амплификация по типу катящегося кольца (RCA) и подобное, включая их мультиплексные версии и сочетания, например, но ими не ограничиваясь, OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (также известная как сочетанная цепная реакцияCCR) и подобное. Описания таких техник можно найти среди прочих источников в руководствах: Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., ColdRev Mol Diagn. 2002 Nov.; 2(6):542-8., Cook et al., J. Microbiol Methods. 2003 May; 53(2): 165-74, Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.; 12(1):21-7, патенты США 5830711, 6027889, 5686243, публикация РСТ WO 0056927 A3 и публикация РСТ WO 9803673 A1. В некоторых вариантах осуществления амплификация содержит по меньшей мере один цикл последовательных процедур: отжиг по меньшей мере одного праймера с комплементарными или по существу комплементарными последовательностями по меньшей мере в одной нуклеиновой кислоте-мишени; синтез по меньшей мере одной цепи нуклеотидов зависимым от матрицы образом, используя полимеразу; и денатурация вновь образованного дуплекса нуклеиновых кислот для разделения цепей. Цикл может или не может быть повторен. Амплификация может содержать термоциклирование или может быть осуществлена при одной температуре. Таким образом, к используемому в настоящем документе термину "амплификация" относятся способы изотермальной амплификации. В изотермальной амплификации используется постоянная температура вместо выполнения цикла через стадии денатурации и отжига/удлинения. Вместо температурной денатурации используются некоторые способы разделения цепей, например, ферментом. К примерам изотермальной амплификации относятся амплификация с вытеснением гиперразветвленной цепи (Groathouse, N., et al. (2006), "Isothermal Amplification and Molecular Typing of the Obligate Intracellular PathogenMycobacterium leprae Isolated from Tissues of Unknown Origins", J. Clin. Micro. 44(4): 1502-1508); хеликазно-зависимая амплификация (Vincent, M., et al. (2004), "Helicase-dependent isothermal DNA amplification",EMBO Rep. 5(8): 795-800); множественная амплификация со смещением (MDA; Luthra, R., and Medeiros,J. (2004), "Isothermal Multiple Displacement Amplification", J. Mol Diagn. 6(3): 236-242); петлевая изотермальная амплификация (Notomi, Т., et al. (2000), Nucleic Acids Research 28(1); PAN-AC (David, F. and Turlotte, E. (1998), "An Isothermal Amplification Method", C.R. Acad. Sci Paris, Life Science 321 (1): 909-14; амплификация с вытеснением цепи (SDA; Nycz, C., et al. (1998), Analytical Biochemistry 259 (2): 226-234); амплификация по типу катящегося кольца (RCA; Lizardi, P., et al. (1998), "Mutation detection and singlemolecule counting using isothermal rolling-circle amplification" Nature Genetics 19: 225-232); реакция транскрипционной амплификации (NASBA; Van Der Vliet, G., et al. (1993), "Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) for the identification of mycobacteria", Journal of General Microbiology 139 (10): 24232429) и рекомбиназная полимеразная амплификация (патенты США 7485428; 7399590; 7270981 и 7270951, каждый из которых приводится в качестве ссылки в полном объеме и конкретно в связи с его описанием рекомбиназной полимеразной амплификации). Термин "q-ПЦР", используемый в настоящем документе, относится к количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, которая также известна как "ПЦР в режиме реального времени" или "кинетическая полимеразная цепная реакция". Под "реагентом" понимают в широком смысле любой агент, использованный в реакции, отличный от аналита (например, анализируемой нуклеиновой кислоты). К иллюстративным реагентам для реакции амплификации нуклеиновой кислоты относятся, но ими не ограничиваясь, буфер, ионы металлов, полимераза, обратная транскриптаза, праймеры, нуклеотиды, метки, красители, нуклеазы и подобное. К реагентам для ферментативных реакций относятся, например, ферменты, субстраты, кофакторы, буфер, ионы металлов, ингибиторы и активаторы. Термин "универсальный зонд для детекции", используемый в настоящем документе, относится к любому зонду, который идентифицирует наличие продукта амплификации независимо от идентификации нуклеотидной последовательности-мишени, присутствующей в продукте. Термин "универсальный зонд для q-ПЦР", используемый в настоящем документе, относится к любому такому зонду, который идентифицирует наличие продукта амплификации в процессе q-ПЦР. В некоторых вариантах осуществления один или несколько праймеров для амплификации могут содержать нуклеотидную последовательность, с которой связывается зонд для детекции, такой как универсальный зонд для q-ПЦР. Таким образом, в процессе стадии амплификации способов, описанных в настоящем документе, к продукту амплификации может быть добавлен один, два или больше сайтов связывания зонда. Специалист в данной области знает, что возможность встраивания большого числа сайтов связывания зондов в процессе преамплификации (при ее осуществлении) и амплификации содействует мультиплексной детекции, при которой в данной смеси для амплификации или ее аликвоте могут быть детектированы два или больше различных продуктов амплификации. Также предполагается, что термин "универсальный зонд для детекции" охватывает праймеры, меченные с помощью детектируемой метки (например, флуоресцентной метки), а также зонды, не содержащие специфической последовательности, такие как ДНК-связывающие красители, к которым относятся красители двухцепочечной ДНК (ds-ДНК), такие как SYBR Green. Термин "мишень-специфический зонд для q-ПЦР", используемый в настоящем документе, относится к зонду для q-ПЦР, который идентифицирует наличие продукта амплификации в процессе q-ПЦР, исходя из гибридизации зонда для q-ПЦР с нуклеотидной последовательностью-мишенью, присутствующей в продукте."Гидролизируемые зонды" в целом описываются в патенте США 5210015, который приводится в данном документе в качестве ссылки в полном объеме ввиду описания в нем гидролизируемых зондов. Гидролизируемые зонды обладают преимуществом 5'-нуклеазной активности, присутствующей в термостабильном ферменте Taq-полимеразе, обычно используемой в реакции ПЦР (технология зондов TAQMAN, продукция фирмы Applied Biosystems, Foster City CA). Гидролизируемый зонд метят с помощью флуоресцентного красителя-детектора, такого как флуоресцеин, и красителя-акцептора или гасителя. В целом, флуоресцентный краситель ковалентно присоединен к 5'-концу зонда, а гаситель присоединен к 3'-концу зонда, и когда зонд интактен, флуоресценция красителя-детектора гасится за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Зонд отжигается ниже одного из праймеров, который определяет один конец нуклеиновой кислоты-мишени в реакции ПЦР. Используя полимеразную активность Taq фермента, амплификация нуклеиновой кислоты-мишени направляется одним из праймеров, который лежит выше зонда, и вторым праймером, который лежит ниже зонда, но отжигается с противоположной цепью нуклеиновой кислоты-мишени. При удлинении вышележащего праймера Taq-полимераза достигает региона, где отжигается меченый зонд, распознает гибрид зонд-матрица в качестве субстрата и гидролизует фосфодиэфирные связи зонда. Реакция гидролиза необратимо устраняет эффект гашения красителя-гасителя на репортерном красителе, таким образом, приводя к повышению флуоресценции детектора с каждым успешным циклом ПЦР. В частности, гидролизируемые зонды, подходящие для применения в способах, описанных в настоящем документе, могут детектировать 8- или 9-мерные повторы, которые часто встречаются в геноме человека и других геномах и/или транскриптомах, и могут иметь высокую Tm, составляющую около 70 С, обеспечиваемую применением аналогов замкнутых нуклеиновых кислот (LNA). Термин "метка", используемый в данном документе, относится к любому атому, фрагменту или молекуле, которые могут быть использованы для получения детектируемого и/или поддающегося количественному определению сигнала. В частности, метка может быть присоединена прямо или опосредованно к нуклеиновой кислоте или белку. К подходящим меткам, которые могут быть присоединены к зондам, относятся, но ими не ограничиваясь, радиоизотопы, флуорофоры, хромофоры, масс-метки, электроноплотные частицы, магнитные частицы, спиновые метки, молекулы, которые испускают хемилюминесценцию, электрохимически активные молекулы, ферменты, кофакторы и субстраты ферментов. Термин "краситель", используемый в настоящем документе, в целом относится к любой органической или неорганической молекуле, которая поглощает электромагнитное излучение при длине волны выше или равной 300 нм. Термин "флуоресцентный краситель", используемый в настоящем документе, в целом относится к любому красителю, который испускает электромагнитное излучение большей длины волны по механизму флуоресценции при облучении источником электромагнитного излучения, таким как лампа, фотодиод или лазер. Термин "эластомер" имеет общее значение, понимаемое в данной области. Таким образом, например, автор Allcock et al. (Contemporary Polymer Chemistry, 2nd Ed.) описывает эластомеры в целом в виде полимеров, существующих при температуре между температурой их перехода в стеклообразное состояние и температурой разжижения. У эластомерных материалов наблюдаются эластические свойства, поскольку полимерные цепи легко подвергаются торсионному движению, что обеспечивает раскручивание цепей остова в ответ на усилие со сворачиванием цепей остова для придания предшествовавшей формы в отсутствие усилия. В целом, эластомеры деформируются при приложении усилия, но затем при прекращении усилия возвращаются к своей исходной форме."Полиморфный маркер" или "полиморфный сайт" представляет собой локус, по которому наблюдается вариация нуклеотидной последовательности. Иллюстративные маркеры имеют по меньшей мере два аллеля, каждый из которых встречается с частотой выше чем 1% и чаще выше чем 10 или 20% от выбранной популяции. Полиморфный сайт может быть так мал, как одна пара нуклеотидов. К полиморфным маркерам относятся полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), вариабельное количество тандемных повторов (VNTR), гипервариабельные регионы, минисателлиты, динуклеотидные повторы, тринуклеотидные повторы, тетрануклеотидные повторы, простые повторы последовательности, делеции и элементы вставок, такие как Alu. Первую идентифицированную аллельную форму произвольно обозначают как эталонную форму и другие аллельные формы обозначают как альтернативные или вариантные аллели. Наиболее часто встречаемую аллельную форму в выбранной популяции иногда обозначают как форму дикого типа. Диплоидные организмы могут быть гомозиготами или гетерозиготами по аллельным формам. Диаллельный полиморфизм имеет две формы. Триаллельный полиморфизм имеет три формы."Однонуклеотидный полиморфизм" (SNP) наблюдается по полиморфному сайту, занятому одним нуклеотидом, который представляет собой сайт вариации между аллельными последовательностями. Сайту обычно предшествуют и следуют за ним высококонсервативные последовательности аллеля (например, последовательности, которые варьируют у меньше чем 1/100 или 1/1000 членов популяций).SNP обычно появляется в полиморфном сайте вследствие замены одного нуклеотида другим. Транзиция представляет собой замещение одного пурина другим пурином или одного пиримидина другим пиримидином. Трансверсия представляет собой замену пурина на пиримидин или наоборот. SNP также могут появляться из-за делеции нуклеотида или инсерции нуклеотида относительно эталонного аллеля."Замкнутая нуклеиновая кислота", часто обозначаемая как недоступная РНК, представляет собой модифицированный РНК-нуклеотид. Фрагмент рибозы нуклеотида замкнутой нуклеиновой кислоты модифицируется с помощью добавочного мостика, соединяющего углероды 2' и 4'. Мостик "блокирует" рибозу в структурной конформации 3'-эндо, которая часто обнаруживается в А-форме ДНК или РНК. Нуклеотиды замкнутой нуклеиновой кислоты могут быть смешаны с нуклеотидами ДНК или РНК в оли-7 020593 гонуклеотиде по желанию. Конформация замкнутой рибозы усиливает стэкинг оснований и предварительную организацию остова. Это существенно повышает температурную стабильность (температуру плавления) олигонуклеотидов. См., например, статью Kaur, H.; Arora, А.; Wengel, J.; Maiti, S. (2006),"Termodynamic, Counterion, and Hydration Effects for the Incorporation of Locked Nucleic Acid Nucleotidesinto DNA Duplexes", Biochemistry 45 (23): 7347-55. Способы анализа нуклеиновых кислот из небольших популяций или единичных клеток. Образцы/клетки, подходящие для анализа. Образцы, содержащие нуклеиновые кислоты или единичные клетки, могут быть получены из биологических источников и приготовлены, используя принятые способы, известные в данной области. В частности, ДНК или РНК, используемая в способах, описанных в настоящем документе, может быть экстрагирована и/или амплифицирована из любого источника, к которому относятся бактерии, простейшие,грибы, вирусы, органеллы, а также высшие организмы, такие как растения или животные, например,млекопитающие или конкретно люди. Подходящие нуклеиновые кислоты также могут быть получены из окружающей среды (например, прудовой воды), из созданных человеком продуктов (например, продуктов питания), из криминалистических образцов и подобное. Нуклеиновые кислоты могут быть экстрагированы или амплифицированы из клеток, жидкостей организма (например, крови, фракции крови, мочи и т.д.) или образцов ткани с помощью любой из большого числа стандартных техник. Клетки могут либо быть культивированы, либо получены из первичных изолятов, таких как клинические образцы. К иллюстративным образцам относятся образцы плазмы, сыворотки, спинномозговой жидкости, лимфы, перитонеальной жидкости, плевральной жидкости, жидкости ротовой полости и поверхностных срезов кожи; образцы дыхательного, кишечного тракта, половых и мочевых путей; образцы слезы, слюны, клеток крови, стволовых клеток или опухолей. Например, образцы фетальной ДНК могут быть получены из эмбриона (например, из одной или нескольких эмбриональных или фетальных клеток) или из крови матери. Образцы могут быть получены из живых или мертвых организмов или из in vitro культур. К иллюстративным образцам могут относиться единичные клетки, залитые в парафин образцы ткани и игольные биопсии. Нуклеиновые кислоты, используемые в способах, описанных в настоящем документе, также могут быть получены из одной или нескольких библиотек нуклеиновых кислот, включая библиотеки кДНК, космид, YAC, ВАС, Р 1, РАС и подобное. Образцы могут отражать определенные состояния, например, пролиферацию клеток, дифференциацию клеток, клеточную смерть, заболевание, воздействие стимулов и/или стадии, например стадии развития. В конкретных вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, могут осуществляться на одной клетке из преимплантированного эмбриона, стволовой клетке, предположительно раковой клетке, клетке патогенного организма и/или клетке, полученной с места преступления. Например, бластомер человека (например, восьмиклеточного эмбриона или более позднего) может быть проанализирован для определения, включает ли геном один или несколько генетических дефектов. Интересующие нуклеиновые кислоты могут быть выделены, используя способы, хорошо известные в данной области, выбрав конкретный способ в зависимости от источника, природы нуклеиновой кислоты и подобных факторов. Нуклеиновые кислоты образца не обязательно должны быть в чистом виде, но обычно в достаточной степени очищенными для осуществления стадий амплификации осуществляемых способов, описанных в настоящем документе. Если нуклеиновые кислоты-мишени представляют собой мРНК, то РНК может быть обратно транскрибирована в кДНК с помощью стандартных способов, известных в данной области и описанных в руководстве Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989), например. кДНК затем может быть проанализирована согласно способам, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления единичная клетка может быть добавлена непосредственно в подходящую реакционную смесь для проведения WGA, и WGA осуществлена. В других вариантах осуществления РНК единичной клетки может быть преобразована в ДНК (например, кДНК) или амплифицирована непосредственно РНК. Нуклеиновые кислоты-мишени. Любая нуклеиновая кислота-мишень, которая может быть амплифицирована, может быть детектирована, используя способы, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления для нуклеиновых кислот-мишеней должна быть известна по меньшей мере некоторая нуклеотидная последовательность. Например, при использовании ПЦР для преамплификации/амплификации нуклеиновых кислот-мишеней достаточная информация о последовательности обычно доступна для каждого конца заданной нуклеиновой кислоты-мишени, чтобы иметь возможность создания подходящих праймеров для амплификации, хотя специалисты в данной области понимают, что могут быть амплифицированы и нуклеиновые кислоты-мишени неизвестной последовательности (например, используя пул вырожденных праймеров или пул комбинаторных праймеров, таких как случайные гексамеры) так же как может быть амплифицирована и мРНК (например, используя олиго-dT). К мишеням могут относиться, например, нуклеиновые кислоты, ассоциированные с патогенами, такими как вирусы, бактерии, простейшие или грибы; РНК, например, такие, для которых сверх- или по-8 020593 ниженная экспрессия является показателем заболевания, такие, которые экспрессируются тканеспецифичным образом или в зависимости от стадии развития; или такие, которые индуцируются определенными стимулами; геномная ДНК, которая может быть проанализирована в отношении специфических полиморфизмов (таких как SNP), аллелей или гаплотипов, например, при генотипировании. Особый интерес представляют геномные ДНК, которые изменяются (например, амплифицируются, делетируются и/или мутируют) при генетических заболеваниях или других патологиях; последовательности, которые ассоциированы с желаемыми или нежелательными признаками; и/или последовательности, которые однозначно идентифицируют индивидуум (например, при судебно-медицинской экспертизе или установлении отцовства). В конкретных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты-мишени включают полиморфизмы,такие как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В этом случае праймеры для амплификации могут представлять собой SNP-специфичные праймеры, это означает, что по меньшей мере один из праймеров гибридизуется с SNP, так что ампликон продуцируется лишь при наличии SNP в нуклеиновых кислотах образца. В некоторых вариантах осуществления с целью характеристики определенных состояний, например клеточной пролиферации, клеточной дифференциации, клеточной смерти, заболевания, воздействия стимулов и/или стадий, например стадий развития, может быть желательно амплифицировать коллекцию нуклеиновых кислот-мишеней, например, коллекцию SNP, мРНК, некодирующих РНК (например, miPHK). Например, коллекция нуклеиновых кислот-мишеней, таких как miPHK, может быть амплифицирована и проанализирована в отношении корреляции с определенными паттернами экспрессии генов. Создание праймеров. Праймеры, подходящие для амплификации нуклеиновых кислот, являются достаточно длинными,чтобы праймировать синтез продуктов удлинения при наличии агента полимеризации. Точная длина и состав праймера будут зависеть от многих факторов, к которым относятся, например, температура реакции отжига, источник и состав праймера и при использовании зонда близость сайта отжига зонда к сайту отжига праймера и соотношение концентрации праймер:зонд. Например, в зависимости от сложности последовательности нуклеиновой кислоты-мишени олигонуклеотидный праймер обычно содержит в диапазоне от около 15 до около 30 нуклеотидов, хотя он может содержать и больше или меньше нуклеотидов. Праймеры должны быть в достаточной степени комплементарны, чтобы избирательно отжигаться на соответствующих им цепях и образовывать устойчивые дуплексы. Праймеры также могут нести нуклеотидные хвосты (которые необязательно предназначены для связывания с нуклеиновыми кислотамимишенями) например, при первичной амплификации (такой как преамплификация). Специалист в данной области знает, как выбрать подходящие пары праймеров для амплификации интересующей нуклеиновой кислоты-мишени. Например, ПЦР-праймеры могут быть созданы, используя любое коммерчески доступное программное обеспечение или программное обеспечение с открытым исходным кодом, такое как Primer3www.broad.mit.edu/node/1060 и подобное) или обратившись к вебсайту Roche UPL. Последовательности ампликонов вводятся в программу Primer3 с последовательностями зондов UPL в скобках, чтобы программа Primer3 создала праймеры на одной или другой стороне последовательности зонда в скобках. Праймеры могут быть получены любым подходящим способом, к которому относятся, например,клонирование и рестрикция подходящих последовательностей или прямой химический синтез способами, такими как фосфотриэфирный способ Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; фосфодиэфирный способ Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; диэтилфосфорамидитный способ Beaucage et al.(1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; способ на твердой подложке, описанный в патенте США 4458066 и подобное, или могут быть получены из коммерческого источника. Альтернативно, РНК-праймеры могут быть получены путем расщепления двухцепочечной РНК с помощью РНКазы III. Праймеры могут быть очищены, используя колонку с сефадексом (продукция фирмы Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) или другие способы, известные специалистам в данной области. Очистка праймера может улучшить чувствительность способов, описанных в настоящем документе. Анализ геномной ДНК - полногеномная амплификация. Для анализа геномной ДНК нуклеиновые кислоты образца могут быть амплифицированы, используя процедуру полногеномной амплификации (WGA). К подходящим способам WGA относятся ПЦР с удлинением праймера (PEP) и улучшенная PEP (I-PEP) - в PEP обычно используется Taq полимераза и случайные праймеры размером 15 нуклеотидов, которые отжигаются при температуре низкой жесткости. Применение Taq-полимеразы предполагает, что максимальная длина продукта составляет около 3 тыс.п.н. (т.п.н.). ПЦР с вырожденными олигонуклеотидами (DOP-ПЦР) - DOP-ПЦР представляет собой хорошо известный, широко распространенный и технически легко осуществимый способ. В DOP-ПЦР используется Taq-полимераза и частично вырожденные олигонуклеотиды (CGACTCGAGNNNNNNATGTGG; SEQID NO:1), которые связываются при низкой температуре отжига с приблизительно одним миллионом сайтов в геноме человека. После первых циклов выполняется большое число циклов с повышенной тем-9 020593 пературой отжига, что позволяет амплифицировать лишь фрагменты, которые метились на первой стадии. С помощью DOP-ПЦР подобно PEP создаются фрагменты, которые составляют в среднем 400-500 п.н. с максимальным размером 3 т.п.н., хотя был описан способ DOP-ПЦР, который позволял продуцировать фрагменты до 10 т.п.н. ПЦР с лидированием (LMP) - в LMP используется эндонуклеаза или химическое расщепление до фрагмента образца геномной ДНК и линкеры и праймеры для его амплификации. Впервые она была описана Ludecke и соавторами и позднее адаптирована для WGA небольших количеств гДНК и единичных клеток. Фирма Rubicon Genomics продает различные наборы (Omniplex), которые дают возможность амплифицировать РНК, ДНК и метилированные последовательности ДНК. К преимуществам относится то,что способ дает возможность амплифицировать разрушенную ДНК и что все стадии осуществляются в одной и той же пробирке. Ограничение заключается в том, что этот способ создает фрагменты лишь до 2 т.п.н. Линейная амплификация ДНК на основе Т 7 (TLAD) - TLAD представляет собой вариант протокола,исходно созданный для амплификации мРНК, который был адаптирован для WGA. В нем используется расщепление эндонуклеазой-рестриктазой Alu I и терминальная трансфераза для добавления к 3'-концу полиТ-хвоста. Затем используется праймер, содержащий промотор Т 7 на 5'-конце и полиА-тракт на 3'конце, и для синтеза второй цепи используется Taq-полимераза. Затем образец подвергают in vitro реакции транскрипции и последующей обратной транскрипции. Основное преимущество заключается в том,что при TLAD не вводятся систематические ошибки в зависимости от последовательности и длины. Множественная амплификация со смещением (MDA) - MDA представляет собой изотермальный способ, основанный не на ПЦР, а на отжиге случайных гексамеров на денатурированной ДНК с последующим синтезом с вытеснением цепи при постоянной температуре. Он был применен на образцах с небольшим количеством геномной ДНК, приводя к синтезу высокомолекулярной ДНК с ограниченной систематической ошибкой представления последовательности. Поскольку ДНК синтезируется путем вытеснения цепи, наблюдается постепенно возрастающее количество реакций праймирования, образуя решетку из гиперразветвленных структур ДНК. Реакция может быть катализирована с помощью ДНКполимеразы Phi29 или с помощью большого фрагмента ДНК-полимеразы Bst. ДНК-полимераза Phi29 обладает активностью вытеснения цепей и активностью исправления ошибок, что приводит к в 100 раз меньшему количеству ошибок, чем при использовании Taq-полимеразы. Наборы для WGA коммерчески доступны, например, у фирм Qiagen, Inc. (Valencia, CA USA),Sigma-Aldrich (Rubicon Genomics; например, набор для полногеномной амплификации единичных клетокSigma GenomePlex, PN WGA4-50RXN). Стадия WGA способов, описанных в настоящем документе,может быть осуществлена, используя любой из доступных наборов согласно инструкциям производителя. В конкретных вариантах осуществления стадия WGA ограничивается WGA, т.е. WGA останавливается перед выходом реакции на плато. Обычно WGA осуществляют в течение более чем двух циклов амплификации. В некоторых вариантах осуществления WGA осуществляют в течение меньше чем около 10 циклов амплификации, например, между четырьмя и восемью циклами включительно. Тем не менее,WGA может быть осуществлена в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 циклов или в течение большого числа циклов, попадающего в диапазон, определенный любой из этих величин. Анализ РНК. В некоторых вариантах осуществления может быть проанализирована РНК из единичной клетки или небольшой популяции клеток в отношении одной или нескольких РНК-мишеней. К подходящим РНК-мишеням относятся мРНК, а также некодирующая РНК, такая как малая ядрышковая РНК(snoPHK), микроРНК (miPHK), малая интерферирующая РНК (siPHK) и взаимодействующие с Piwi РНК(piPHK). В определенных вариантах осуществления интересующую РНК преобразуют в ДНК, например,путем обратной транскрипции или амплификации. Например, для анализа мРНК единичной клетки или небольшой популяции клеток мРНК, как правило, преобразуют в ДНК-изображение популяции мРНК. В некоторых вариантах осуществления использованный(е) способ(ы) предпочтительно приводит(ят) к получению популяции кДНК, в которой относительные количества каждой кДНК приблизительно такие же как относительные количества соответствующих мРНК в популяции образца. В определенных вариантах осуществления для продукции кДНК с мРНК-матрицы может быть использована обратная транскрипция, применяя обратную транскриптазу согласно стандартным техникам. Этот фермент, который присутствует во всех ретровирусах (например, вирусе миелобластомы птиц),добавляет дезоксирибонуклеотиды к 3' концу праймера (Varmus, Science 240: 1427-1435 (1988. Обратная транскрипция популяции мРНК клетки может быть праймирована, например, с помощью применения специфических праймеров, олиго-dT или случайных праймеров. Для синтеза репрезентативной библиотеки кДНК клеточной мРНК первая цепь кДНК, комплементарная клеточной РНК образца, может быть синтезирована, используя обратную транскриптазу. Это может быть осуществлено, используя коммерчески доступный набор Superscript II BRL (продукция фирмы BRL, Gaithersburg, Md. ) или любой другой коммерчески доступный набор. Обратная транскриптаза преимущественно использует в качестве матрицы РНК, но также может использовать матрицы одноцепочечных ДНК. Соответственно, синтез второй цепи кДНК может быть осуществлен, используя обратную транскриптазу и подходящие праймеры (например, поли-А, случайные праймеры и т.д.). Синтез второй цепи также может быть осуществлен,используя ДНК-полимеразу I E.coli. РНК может быть удалена одновременно с синтезом второй цепи кДНК или позже. Это осуществляют, например, обрабатывая смесь РНКазой, такой как РНКаза Н Е.coli,которая разрушает РНК. Как отмечено выше, фирма Rubicon Genomics продает наборы (Qmniplex), которые дают возможность амплифицировать РНК. В других вариантах осуществления для продукции кДНК с матрицы мРНК используется способ амплификации. В таких вариантах осуществления обычно используется способ амплификации, в котором продуцируется популяция кДНК, репрезентативная для популяции мРНК. Анализ некодирующей РНК из единичной клетки или небольшой популяции клеток также обычно начинается с преобразования интересующей РНК в ДНК. Это преобразование может быть осуществлено путем обратной транскрипции или амплификации. В некоторых вариантах осуществления использованный(е) способ(ы) предпочтительно приводит(ят) к получению популяции ДНК, в которой относительные количества каждой ДНК приблизительно такие же как относительные количества соответствующих мРНК в популяции образца. РНК-мишени могут быть избирательно обратно транскрибированы или амплифицированы, используя праймеры, которые отжигаются преимущественно на интересующих РНК. Подходящие праймеры коммерчески доступны или могут быть созданы специалистами в данной области. Например, фирма Applied Biosystems продает пулы праймеров для микроРНК (miPHK)-мишенейMegaPlex. Эти праймеры могут быть использованы как для обратной транскрипции (RT), так и амплификации специфической мишени (STA). См., например, пример 2 В. Преамплификация. В определенных вариантах осуществления амплифицированный геном, полученный с помощьюWGA, или ДНК, полученную из РНК (например, кДНК), преамплифицируют для продукции преамплифицированной реакционной смеси, которая включает один или несколько ампликонов, специфичных для одной или нескольких интересующих нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах осуществления преамплификацию осуществляют, используя одну или несколько пар праймеров, специфичных для одной или нескольких интересующих нуклеиновых кислот-мишеней. Преамплификацию обычно осуществляют, используя праймеры для преамплификации, подходящую буферную систему, нуклеотиды и фермент ДНК-полимеразу (например, фермент полимеразу, модифицированную для условий "горячего старта"). Ампликоны, полученные данным способом, затем могут быть дополнительно подвергнуты анализу ПЦР либо в анализе по конечной точке, либо анализом в режиме реального времени. Типичная реакционная смесь для преамплификации содержит подходящий буфер, источник ионов магния (Mg2+) в диапазоне от около 1 до около 10 мМ, предпочтительно в диапазоне от около 2 до около 8 мМ, нуклеотиды и необязательно детергенты и стабилизаторы. Примером одного из подходящих буферов является Трис-буфер в концентрации от около 5 до около 85 мМ с предпочтительной концентрацией от 10 до 30 мМ. В одном из вариантов осуществления концентрация Трис-буфера составляет 20 мМ в 2 кратном виде реакционной смеси. Реакционная смесь может иметь величину рН в диапазоне от около 7,5 до около 9, причем обычный диапазон значений рН от около 8,0 до около 8,5. Концентрация нуклеотидов может находиться в диапазоне от около 25 до около 1000 мМ, обычно в диапазоне от около 100 до около 800 мМ. Примерами концентраций dNTP являются концентрации 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 и 800 мМ. В реакционную смесь также могут быть включены детергенты, такие как Твин 20, Тритон X 100 и Нонидет Р 40. Также могут быть включены стабилизирующие агенты, такие как дитиотреитол (DTT, реагент Клеланда) или меркаптоэтанол. В определенных вариантах осуществления праймеры для преамплификации представляют собой такую же последовательность, как и используемая в анализах амплификации, для чего получают образец,хотя, как правило, в пониженной концентрации. Концентрация праймеров может быть, например, в от около 10 до около 250 раз меньше, чем концентрации праймеров, использованных в анализе амплификации. Варианты осуществления включают применение праймеров, которые в около 10, 20, 35, 50, 65, 75,100, 125, 150, 175 и 200 раз меньше, чем концентрация праймеров в анализе амплификации. К праймерам, использованным в преамплификации, могут относиться случайные праймеры, поли-А-хвосты и/или специфические праймеры, созданные для амплификации интересующих нуклеиновых кислот-мишеней. Реакционная смесь может необязательно содержать эталонный краситель для нормализации результатов последующего количественного ПЦР-анализа в режиме реального времени. Примером широко известного коммерчески доступного эталонного красителя является ROX. Коммерчески доступной реакционной смесью, содержащей краситель ROX, является реакционная смесь CellsDirect 2X, кат.11754-100 и 11754-500, продукция корпорации Invitrogen. К реакционной смеси также добавляют фермент Taq-полимеразу. Taq ДНК полимераза Platinum представляет собой рекомбинантную Taq ДНК полимеразу, образующую комплекс с антителом, которое ингибирует активность полимеразы при температурах окружающей среды. Полная полимеразная активность восстанавливается после стадии денатурации в ПЦР, давая возможность "горячего старта". В конкретных вариантах осуществления преамплификацию осуществляют в течение по меньшей мере двух циклов. В некоторых вариантах осуществления преамплификацию осуществляют в течение меньше чем около 20 циклов, например между 8 и 18 циклами включительно. Тем не менее, преамплификация может быть осуществлена в течение 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 или 24 циклов или в течение большого числа циклов, попадающего в диапазон, определенный любой из этих величин. В типичном варианте осуществления преамплификацию осуществляют в течение около 14 циклов для увеличения детектируемых ампликонов в около 16000 раз. Амплификация. Ампликоны, полученные при преамплификации, обычно анализируют способом амплификации, таким как ПЦР. В определенных вариантах осуществления преамплифицированный образец из единичной клетки или небольшой популяции клеток может быть использован для большого числа отдельных реакций ПЦР, осуществляемых в приборе для проведения реакции ПЦР малого объема. В некоторых вариантах осуществления преамплификацию осуществляют, используя одну или несколько пар праймеров,специфичных для одной или нескольких интересующих нуклеиновых кислот-мишеней. Таким образом,прибор для проведения реакции ПЦР малого объема может включать отдельные реакционные ячейки для амплификации с каждой парой праймеров, так что продукция ампликона в определенной реакционной ячейке указывает на наличие в образце соответствующей нуклеиновой кислоты-мишени. Реакционные ячейки для проведения ПЦР низкого объема могут иметь объем от около 2 до около 500 нл. Чем меньше размер реакционной ячейки, тем больше количество отдельных анализов, которые могут быть проведены (либо используя различные наборы зондов и праймеров, либо в виде повторов одних и тех же наборов зондов и праймеров, либо используя любое сочетание числа повторов и числа различных анализов). В одном из вариантов осуществления реакционная ячейка составляет от около 2 до около 50 нл, предпочтительно от 2 до около 25 нл, более предпочтительно от около 4 до около 15 нл. В некоторых вариантах осуществления объем реакционной ячейки составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 нл. Реакционные ячейки могут быть созданы из нереакционноспособного материала, такого как стекло,пластик, силикон, эластомерные полимеры, такие как полидиметилсилоксан, полиуретан или другие полимеры. В определенных вариантах осуществления продукты преамплификации анализируют, используя систему BioMark (продукция фирмы Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA). В системе BioMark используется полидиметилсилоксановое микрофлуидальное устройство, которое обеспечивает проведение большого числа анализов на большом числе образцов. Например, матричный чип 3232 обладает способностью проведения 32 отдельных анализов на 32 отдельных образцах. Матричный чип 4848 обладает способностью проведения 48 отдельных анализов на 48 отдельных образцах. Матричный чип 9696 обладает способностью проведения 96 отдельных анализов на 96 отдельных образцах. Матричный чип 9696 более подробно описывается в одновременно рассматриваемой предварительной заявке США 61/044417, которая приводится в данном документе в качестве ссылки ввиду описания в ней создания,производства и применения чипа 9696. В типичных вариантах осуществления для детекции интересующих ампликонов осуществляют от 5 до 96 отдельных ПЦР-анализов, в частности от около 5 до 4 8 анализов, конкретнее от около 8 до около 48 анализов и еще более конкретно от около 10 до около 48 анализов. В других вариантах осуществления осуществляют больше чем 10, больше чем 12, больше чем 15, больше чем 17, больше чем 20, больше чем 23, больше чем 25, больше чем 28, больше чем 30, больше чем 33, больше чем 35, больше чем 37, больше чем 40, больше чем 45, больше чем 48, больше чем 50, больше чем 53, больше чем 55, больше чем 58,больше чем 60, больше чем 63, больше чем 65, больше чем 68, больше чем 70, больше чем 73, больше чем 75, больше чем 78, больше чем 80, больше чем 83, больше чем 85, больше чем 88, больше чем 90,больше чем 93 или больше чем 96 ПЦР-анализов из образца, полученного из одной клетки. В некоторых вариантах осуществления, особенно в количественных ПЦР-экспериментах, для обеспечения равноценной амплификации всех интересующих нуклеиновых кислот-мишеней праймеры в смеси для преамплификации должны быть ограничены и количество циклов амплификации должно быть ограничено. Для проведения ПЦР-реакций в режиме реального времени реакционные смеси, как правило, содержат подходящий буфер, источник ионов магния (Mg2+) в диапазоне от около 1 до около 10 мМ, например, в диапазоне от около 2 до около 8 мМ, нуклеотиды и необязательно детергенты и стабилизаторы. Примером одного из подходящих буферов является Трис-буфер в концентрации от около 5 мМ до около 85 мМ с предпочтительной концентрацией от 10 мМ до 30 мМ. В одном из вариантов осуществления концентрация Трис-буфера составляет 20 мМ в виде 2-кратной реакционной смеси (2 Х). Реакционная смесь может иметь величину рН в диапазоне от около 7,5 до около 9,0, причем обычный диапазон величин рН от около 8,0 до около 8,5. Концентрация нуклеотидов может находиться в диапазоне от около 25 до около 1000 мМ, обычно в диапазоне от около 100 до около 800 мМ. Примерами концентрацийdNTP являются концентрации 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 и 800 мМ. В реакционную смесь также могут быть включены детергенты, такие как Твин 20, Тритон X 100 и Нонидет Р 40. Также могут быть включены стабилизирующие агенты, такие как дитиотреитол (DTT, реагент Клеланда) или меркаптоэтанол. Кроме того, реакционные смеси могут необязательно содержать dUTP, а также урацил-ДНК- 12020593 гликозилазу (урацил-N-гликозилазу, UNG). UNG представляет собой продукт гена ung из Escherichia coli,и он был клонирован, секвенирован и экспрессирован в Е.coli. Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) удаляет из ДНК (одно- и двухцепочечной) урацильные остатки, не инициируя разрушение сахарофосфодиэфирного остова ДНК, таким образом, предотвращая ее использование в качестве мишени гибридизации или в качестве матрицы для ДНК-полимераз. Фосфодиэфирные связи, фланкирующие полученные сайты с удаленными азотистыми основаниями, становятся чувствительными к гидролитическому расщеплению при повышенных температурах. Таким образом, удаление урациловых оснований обычно сопровождается фрагментацией ДНК. Duncan, В.K., and Chambers, J.A. (1984), GENE 28, 211, Varshney,U., Huycheon, Т., and van de Sande, J.H. (1988), J. Biol. Chem. 263, 7776. Реакционная смесь коммерчески доступна у фирмы Applied Biosystems, Foster City, CA (универсальная реакционная смесь TaqMan, кат.4304437, 4318157 и 4326708). Реакционные смеси для проведения ПЦР также могут содержать аналоги оснований, дестабилизирующие структуру, такие как 7-дезагуанин, для предотвращения образования связи Хугстина. Следствием этого является возможность осуществлять амплификацию независимо от структуры. См., например,USPN 5091310, опубликованный 25 февраля 2002 г. авторами Innis et al. В конкретном аспекте может быть получена предварительная смесь, которая может включать универсальную реакционную смесь TaqMan, AmpliTaq-Gold (около 5 ед./мкл), 20-кратный буфер GT и Н 2 О. Предварительная смесь может быть объединена с интересующей нуклеиновой кислотой и подходящими праймерами. В одном из аспектов изобретения 1-кратный буфер GT может содержать бетаин в диапазоне от около 0,1 до около 0,8 М, BSA в диапазоне от около 1 до около 4 мг/мл, глицерин в диапазоне от около 1 до около 5%, PEG 20000 в диапазоне от около 1 до около 5%, PEG MME550 в диапазоне от около 0,5 до около 5%, ММЕ 5000 в диапазоне от около 1 до около 5%, Superblock в PBS в диапазоне от около 1 до около 15%, SuperblockT20 в диапазоне от около 1 до около 10% и Твин 20 в диапазоне от около 0,1 до около 3%. В конкретном аспекте 1-кратный буфер GT может содержать бетаин в концентрации около 0,4 М, BSA в концентрации 2 мг/мл, глицерин в концентрации около 2,5%, PEG 20000 в концентрации около 2%, PEG MME550 в концентрации около 1%, ММЕ 5000 в концентрации около 2,5%, Superblock в PBS в концентрации около 10%, Superblock T2 0 в концентрации около 5% и Твин 2 0 в концентрации около 0,5%. В более конкретном варианте осуществления 1-кратный буфер GT может содержать бетаин в концентрации около 0,4 М, BSA в концентрации 4 мг/мл, глицерин в концентрации около 5%, PEG 20000 в концентрации около 2%, PEG MME550 в концентрации около 1%, ММЕ 5000 в концентрации около 2,5%, Superblock в PBS в концентрации около 10%, Superblock T20 в концентрации около 10% и Твин 20 в концентрации около 1%. В другом аспекте изобретения может быть получен 20-кратный буфер GT и может быть разведен в реакционных смесях до конечной концентрации 1-кратного буфера. Например, 20-кратный буфер GT может включать бетаин в диапазоне от около 1 до около 10 М, BSA в диапазоне от около 5 до около 15 мг/мл и SuperblockT20 (в TBS) в диапазоне от около 20 до около 65%. В определенном аспекте буферGT может включать бетаин в концентрации около 5 М, BSA в концентрации около 10 мг/мл и SuperblockT20 в TBS в концентрации около 57%. Как понятно специалисту в данной области, 20-кратный буфер GT должен быть разведен до 1-кратного в конечной реакционной смеси. В определенных вариантах осуществления анализ обычно имеет динамический диапазон по меньшей мере 3 порядков величины, чаще по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 порядков величины. Детекция. Детекция ампликонов может быть осуществлена любым способом, известным в данной области. Анализы с флуорогенной нуклеазой представляют собой один из конкретных примеров количественного способа в режиме реального времени, который может быть успешно использован в способах, описанных в настоящем документе. Этот способ мониторинга за образованием продукта амплификации включает непрерывное измерение накопления ПЦР-продукта, используя флуорогенный олигонуклеотидный зонд с двумя метками - подход, часто обозначаемый в литературе как "способ TaqMan". См. патент США 5723591; статью Heid et al., 1996, Real-time quantitative PCR Genome Res. 6:986-94, каждый из которых приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме, и конкретно ввиду описания в них применения флуорогенных олигонуклеотидных зондов с двумя метками. Должно быть понятно, что несмотря на то, что для количественной ПЦР наиболее широко используются "зонды TaqMan", изобретение не ограничивается применением этих зондов; может быть использован любой подходящий зонд. В определенных вариантах осуществления может быть использован любой способ детекции, в котором зонд представляет собой флуорогенный олигонуклеотидный зонд с двумя метками. В конкретных вариантах осуществления к флуорофорам, которые могут быть использованы в качестве детектируемых меток для зондов, относятся, но ими не ограничиваясь, родамин, цианин 3 (Су 3),цианин 5 (Су 5), флуоресцеин, Vic, Liz, Tamra, 5-Fam, 6-Fam и Texas Red (продукция фирмыCity CA). В некоторых вариантах осуществления количество меченого зонда, которое дает флуоресцентный сигнал в ответ на излучение возбуждения, обычно соответствует количеству нуклеиновой кислоты, продуцируемой в реакции амплификации. Таким образом, в таких вариантах осуществления количество флуоресцентного сигнала соответствует количеству продукта, полученного в реакции амплификации. В таких вариантах осуществления можно поэтому оценить количество продукта амплификации, измерив интенсивность флуоресцентного сигнала от флуоресцентного индикатора. Согласно некоторым вариантам осуществления для количественной оценки продукта амплификации, указанной флуоресцентным сигналом, можно использовать внутренний стандарт. См., например, патент США 5736333. Были разработаны устройства, которые могут осуществлять температурную циклическую реакцию с составами, содержащими флуоресцентный индикатор, излучать луч света определенной длины волны,считывать интенсивность флуоресцентного красителя и отображать интенсивность флуоресценции после каждого цикла. Устройства, содержащие термоциклер, излучатель пучка света и детектор флуоресцентного сигнала, были описаны, например, в патентах США 5928907; 6015674 и 6174670. В некоторых вариантах осуществления каждая из этих функций может быть осуществлена с помощью отдельных устройств. Например, при использовании для амплификации реакции с репликазой Qбета реакцию можно не проводить в термоциклере, а можно включить луч света, испускаемый при определенной длине волны, детекцию флуоресцентного сигнала и расчет и отображение количества продукта амплификации. В определенных вариантах осуществления для точной количественной оценки нуклеиновых кислот-мишеней могут быть использованы устройства, сочетающие термоциклирование и флуоресцентную детекцию. В некоторых вариантах осуществления при проведении реакций в режиме "реального времени" флуоресцентные сигналы могут быть детектированы и отображены во время и/или после одного или нескольких температурных циклов, таким образом, давая возможность следить за продуктами амплификации. В некоторых вариантах осуществления для расчета количества последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, находившегося в образце до амплификации, можно использовать количество продукта амплификации и число циклов амплификации. Согласно некоторым вариантам осуществления можно просто отслеживать количество продукта амплификации после заранее определенного числа циклов, достаточного для определения наличия в образце последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Специалист в данной области может без труда определить для любого данного типа образца, последовательности праймеров и условий проведения реакции, скольких циклов достаточно для определения наличия данной нуклеиновой кислоты-мишени. При обнаружении флуоресценции при различных температурах можно отслеживать степень гибридизации. Более того, зависимость гибридизации ПЦР-продукта от температуры может быть использована для идентификации и/или количественной оценки продуктов ПЦР. Соответственно, способы, описанные в настоящем документе, охватывают применение анализа графика плавления при детекции и/или количественной оценке ампликонов. Анализ кривой плавления хорошо известен и описан, например, в патентах США 6174670; 6472156 и 6569627, каждый из которых приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме и конкретно ввиду описания в них применения анализа кривой плавления для детекции и/или количественной оценки продуктов амплификации. В иллюстративных вариантах осуществления анализ кривой плавления осуществляют, используя краситель двуцепочечной ДНК, такой какSYBR Green, Eva Green, Pico Green (продукция фирмы Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), этидия бромид, и подобное (см. статью Zhu et al., 1994, Anal. Chem. 66:1941-48). Стратегии внесения метки. В способах, описанных в настоящем документе, может быть использована любая подходящая стратегия внесения метки. При делении амплификационной смеси на аликвоты и анализе каждой аликвоты на наличие одного продукта амплификации в амплификационной смеси может быть использован универсальный зонд для детекции. В определенных вариантах осуществления при проведении ПЦР в режиме реального времени детекция может быть осуществлена, используя универсальный зонд для количественной ПЦР. К подходящим универсальным зондам для количественной ПЦР относятся красители двухцепочечной ДНК, такие как SYBR Green, Eva Green или Pico Green, или зонды со специфической последовательностью, которые связываются с нуклеотидной последовательностью, присутствующей во всех продуктах амплификации. Сайты связывания для зондов со специфической последовательностью могут быть встроены в нуклеиновые кислоты-мишени принятым способом в процессе преамплификации и/или в процессе амплификации. Альтернативно, для детекции продуктов амплификации в амплификационных смесях используются один или несколько мишень-специфичных зондов для количественной ПЦР (т.е. специфичных для детектируемой нуклеотидной последовательности-мишени). Мишень-специфичные зонды могут быть использованы, например, если в большом количестве образцов необходимо детектировать лишь несколько нуклеиновых кислот-мишеней. Например, если необходимо детектировать лишь три мишени, то может быть использован мишень-специфичный зонд с отличной флуоресцентной меткой для каждой мишени. При правильном выборе меток могут быть проведены анализы, в которых различные метки возбуждают- 14020593 ся и/или детектируются при различных длинах волн в одной реакции. См., например, руководства Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., Eds.), Marcel Dekker, New York (1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York (1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra ofHaugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992). Удаление нежелательных компонентов реакции. Должно быть понятно, что используются реакции, включающие сложные смеси нуклеиновых кислот, с большим числом реакционных стадий, что может приводить к большому числу невстроенных компонентов реакций, и что удаление таких невстроенных компонентов реакций или снижение их концентрации любой из большого числа процедур очистки может улучшить эффективность и специфичность последовательно проходящих реакций. Например, может быть желательно в некоторых вариантах осуществления удалить или снизить концентрацию праймеров для преамплификации до осуществления стадий амплификации, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления концентрация нежелательных компонентов может быть уменьшена путем простого разведения. Например, для улучшения специфичности последующей стадии амплификации преамплифицированные образцы могут быть разведены до амплификации в около 5, 10,20, 50, 100 раз (или до любой степени в диапазоне, определенном любым из этих значений). В некоторых вариантах осуществления нежелательные компоненты могут быть удалены большим числом ферментативных способов. К примерам подходящих ферментативных способов относятся ферменты, которые расщепляют одноцепочечные нуклеиновые кислоты, такие как экзонуклеаза I E.coli. Избыток dNTP, оставшийся после реакции амплификации, может быть "удален" обработкой щелочной фосфатазой креветок (SAP), которая удаляет из dNTP фосфатные группы. Для предотвращения нежелательного переноса праймеров из первичной реакции амплификации, в которой праймеры содержалиdUTP вместо dTTP, может быть использована урацил-N-гликозилаза (UNG) (AmpErase фирмы AppliedBiosystems, Foster City CA). UNG разрушает U-содержащие праймеры. Альтернативно, непрореагировавшие праймеры и dNTP могут быть удалены колоночной хроматографией. Например, для этой цели может быть использована гель-фильтрация через сефадекс. В определенных вариантах осуществления очистка включает селективную иммобилизацию нуклеиновых кислот. Например, желательные нуклеиновые кислоты могут быть преимущественно иммобилизованы на твердой подложке. В типичном варианте осуществления к желательной нуклеиновой кислоте присоединяют фотобиотин и полученные меченные биотином нуклеиновые кислоты иммобилизуют на твердой подложке, содержащей связыватель аффинных фрагментов, такой как стрептавидин. Альтернативно, нежелательные нуклеиновые кислоты могут быть иммобилизованы на твердой подложке и желаемые нуклеиновые кислоты собраны путем отмывки. Применения. Способы, описанные в настоящем документе, приемлемы для любой техники, предназначенной для детекции наличия или количества одной или нескольких нуклеиновых кислот-мишеней в образце, содержащем нуклеиновые кислоты. Таким образом, например, эти способы приемлемы для идентификации наличия конкретных полиморфизмов (таких как SNP), аллелей или гаплотипов или хромосомных аномалий, таких как увеличение числа копий, делеции или анеуплоидия. Способы могут быть использованы в генотипировании, которое может быть осуществлено в большом числе контекстов, к которым относятся диагностика генетических заболеваний или расстройств, фармакогеномика (персонализированная медицина), контроль качества в сельском хозяйстве (например, для семенного материала или домашнего скота), исследование и организация популяций растений или животных (например, в организации сельского хозяйства или рыбной промышленности или в определении многообразия популяции) или установлении отцовства или судебно-медицинской экспертизе. Способы, описанные в настоящем документе, могут быть применены для идентификации последовательностей, указывающих на определенные состояния или организмы в биологических образцах или образцах из окружающей среды. Например, способы могут быть использованы для идентификации патогенов, таких как вирусы, бактерии и грибы). Способы также могут быть использованы для характеристики окружающей среды или микроокружения, например, для характеристики видов микроорганизмов в кишечнике человека. Эти способы также могут быть использованы для определения числа копий ДНК или РНК (например, мРНК, miPHK). Определения нарушенного числа копий ДНК в геномной ДНК можно использовать,например, в диагностике и/или прогнозировании генетических дефектов и заболеваний, таких как рак. Определение "числа копий" РНК, т.е. уровня экспрессии можно использовать для мониторинга экспрессии интересующих генов, например, у различных индивидуумов, в различных тканях или клетках при различных условиях (например, различных внешних стимулах или болезненных состояниях) и/или на различных стадиях развития. Наборы. Наборы по изобретению могут включать один или несколько реагентов, используемых для осуществления одного или нескольких способов анализа, описанных в настоящем документе. Набор, как правило, включает упаковку с одним или несколькими контейнерами, содержащими реагент(ы) (например,праймеры и/или зонд(ы в виде одного или нескольких отдельных составов или необязательно в виде смеси, если позволит совместимость реагентов. Набор также может включать другой(ие) материал(ы),который(е) может(гут) быть желателен(ьны) с точки зрения пользователя, такой(ие) как буфер(ы), разбавитель(и), стандарт(ы) и/или любой другой материал, используемый при обработке, отмывке образца или проведении любой другой стадии анализа. Наборы, как правило, включают инструкции для осуществления одного или нескольких способов,описанных в настоящем документе. Инструкции, включенные в наборы, могут быть прикреплены к упакованному материалу или могут быть включены в виде листка-вкладыша. Несмотря на то что в инструкциях обычно описываются или печатаются материалы, они не ограничиваются таковыми. Настоящим изобретением охватывается любой носитель, способный хранить такие инструкции и сообщать их конечному пользователю. К таким носителям относятся, но ими не ограничиваются, электронные носители(например, магнитные диски, ленты, картриджи, чипы), оптические носители (например, CD ROM), радиочастотные чипы и подобное. К используемому в настоящем документе термину "инструкции" может относиться обращение к интернет-сайту, который предоставляет инструкции. Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в настоящем документе, предназначены лишь для целей иллюстрации и что большое число модификаций или изменений в свете этого будет предложено специалистам в данной области и должно быть включено в сущность и сферу действия настоящего изобретения и объем прилагаемой формулы. Кроме того, все другие публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем документе, таким образом, приводятся в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры Пример 1. Протокол преамплификации и амплификации образцов, полученных путем полногеномной амплификации единичной клетки. ДНК из единичных клеток амплифицировали с помощью полногеномной амплификации с последующей преамплификацией и затем загрузкой на матричный чип Fluidigm и анализировали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (q-ПЦР), используя системуBioMark. Преамплификацию и амплификацию на чипе осуществляли следующим образом. Предварительную амплификацию осуществляли для получения преамплифицированного образца из единичной клетки. Предварительную амплификацию осуществляли, объединяя 2,5 мкл образца одной клетки с буфером (после полногеномной амплификации), 2,5 мкл пулированных проб, содержащих 192 пробы в концентрации каждого прямого праймера и обратного праймера 18 0 нМ и зонда 50 нМ и 5 мкл 2-кратной реакционной смеси PreAmp TaqMan (Applied Biosystems, Foster City CA). Эту реакцию осуществляли при 95 С в течение 10 мин с последующими 14 циклами: 15 с при 95 С и 4 мин при 60 С. Амплификации осуществляли на чипе Dynamic Array Fluidigm. Растворы, добавленные в лунки для проб чипа 96.96 (продукция фирмы Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA), состояли из праймера в концентрации 9 мкМ и зонда в концентрации 2,5 мкМ, 1 мкл 50-кратного ROX (продукция фирмы Invitrogen) и 0,25% Твина 20. Раствор, добавленный в лунки для образца, получали смешиванием 2,5 преамплифицированного образца, 3 мкл 2-кратной универсальной реакционной смеси TaqMan (продукция фирмы Applied Biosystems, Foster City CA), 0,1 мкл полимеразы AmpliTaq Gold (продукция фирмы Applied Biosystems, Foster City CA), 0,3 мкл 20-кратного буфера для загрузки образца GT (продукция фирмыFluidigm Corporation, South San Francisco, CA) и 0,1 мкл воды, не содержащей ДНК. После загрузки, используя автоматический регулятор NanoFlex IFC ( продукция фирмы Fluidigm Corporation, South SanFrancisco), ПЦР и детекцию флуоресценции осуществляли в системе BioMark (продукция фирмы Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA) для генетического анализа. Протокол термоциклирования состоял из 50 С в течение 2 мин, 70 С в течение 30 мин, 25 С в течение 10 мин, 50 С в течение 2 мин,95 С в течение 10 мин с последующими 40 циклами: 15 с при 95 С и 1 мин при 60 С. Конечные концентрации в реакционных камерах чипа составляли по 900 нМ каждого прямого и обратного праймера и 250 нМ зонда. Пример 2. Способы и протоколы детекции матричной РНК, микроРНК или видов малых РНК, используя микрофлуидальные устройства Fluidigm и количества нуклеиновых кислот, содержащиеся в единичных клетках. В данном примере описывается методология, необходимая для получения кинетической детекции в режиме "реального времени" ампликона матричной РНК (мРНК), микроРНК (miPHK) и/или других видов малых РНК и использования интегрированных жидких контуров (IFC) Dynamic Array 48.48 или 96.96, используя образцы с малым количеством нуклеиновой кислоты. Этот пример сфокусирован на оценке этих нуклеиновых кислот, полученных из небольших количеств клеток или единичных клеток. Используя IFC Dynamic Array 48.48, представляется возможным проанализировать до 48 мишеней для 48 отдельных образцов. Используя IFC Dynamic Array 96.96, представляется возможным проанализировать до 96 мишеней для 96 отдельных образцов. Объединенные протоколы могут быть адаптированы для анализа даже большего количества образцов и/или мишеней на чипе 48 или 96, как описано в одновременно рассматриваемом USSN 12/548132, поданном 26 августа 2006 г., который приводится в настоящем документе в качестве ссылки для всех целей и в частности ввиду описания в нем способов введения в образцы меток и/или анализов мишеней для мультиплексного анализа. А) Детекция мРНК. Типичный протокол включает анализ экспрессии генов единичной клетки, используя Dynamic Array 48.48 BioMark и ПЦР в режиме реального времени. Этот протокол описывается ниже в качестве нового и эффективного способа получения данных по экспрессии генов для вплоть до 48 генов из одной клетки,используя BioMark и IFC 48.48. Этот протокол позволяет оценить содержимое клетки с минимальным временем подготовки образца и минимальной стоимостью. Этот протокол охватывает лабораторную процедуру и требования к реагентам для осуществления исследований по экспрессии генов одной клетки, используя набор для одностадийной qOT-ПЦР CellsDirect (продукция фирмы Invitrogen, каталожные номера 11753-100 и 11753-500) и процедуру амплификации специфической мишени (STA). Этот подход объединяет обратную транскрипцию и амплификацию специфической мишени проб из единичных клеток. Этот подход может быть адаптирован для анализа любой нуклеиновой кислоты-мишени и использован для анализа образцов плохого качества, а также образцов единичных клеток. Реагенты для анализа видов мРНК в единичных клетках: набор для одностадийной qOT-ПЦР CellsDirect (продукция фирмы Invitrogen, каталожные номера 11753-100 и 11753-500); необязательно: SUPERase-In (Ambion, PN АМ 2694); универсальная реакционная смесь для проведения ПЦР TaqMan (продукция фирмы Applied Biosystems, PN 4304437); ТЕ-буфер (продукция фирмы Technova). Одностадийная OT-STA (преамплификация) для экспериментов с единичными клетками. 1. Пользователи могут начать с применения 20-кратных исходных проб (включающих праймеры),как описано в быстрой эталонной карте STA Fluidigm (PN 68000133RevB). 2. Объединить все пробы для проведения анализа в режиме реального времени и развести ТЕбуфером, чтобы каждая проба имела конечную концентрацию 0,2. Это 0,2-кратная смесь проб. 3. Получить реакционную смесь для OT-STA образца, объединив следующие компоненты: Замечание: при хранении клеток перед OT-STA или при предполагаемой активности РНКазы добавить к реакционной смеси для OT-STA 0,1 мкл SUPERaseIn Ambion. 4. В каждую пробирку или лунку для проведения реакции мультилуночного планшета добавить аликвоту 9 мкл реакционной смеси для OT-STA. Сортировать клетки с помощью сортинга клеток, активированных флуоресценцией, (FACS) в каждую отдельную пробирку или лунку для проведения реакции.(Эти стадии могут быть изменены в зависимости от потребностей исследователя). 5. Для перемешивания закрыть пробирку или планшет. 6. Использовать незамедлительно или хранить при -20 С. Комментарий 1: объем может быть уменьшен до 5 мкл при возможности осуществления сортировки клеток с этим реакционным объемом. Комментарий 2: применение зонда в процессе STA необязательно, если это не неизбежно, поскольку зонд также находится в полученной смеси проб. Зонд может быть исключен при осуществлении больших количеств STA с низким исходным количеством молекул. Не включение зонда на этой стадии может привести к более полному вычитанию фона. Комментарий 3: реакционная смесь, содержащая единичные клетки, может быть перенесена в термоциклер для немедленного термоциклирования OT/STA. 7. Обратно транскрибировать РНК в кДНК при 50 С в течение 15 мин. 8. Инактивировать фермент RT и активировать Taq, перенеся образец на 95 С в течение 2 мин. 9. Амплифицировать специфическую мишень (STA) кДНК в процессе 18 циклов: 95 С в течение 15 с; 60 С в течение 4 мин. 10. Развести полученный преамплифицированный продукт кДНК ТЕ-буфером 1:5. Детекция с помощью ПЦР в режиме реального времени (амплификация). 1. Приготовить реакционные смеси для ПЦР в режиме реального времени согласно таблице ниже: 2. Встряхнуть на вортексе и затем раскапать реакционную смесь для ПЦР в режиме реального времени в лунки для образцов чипа Dynamic Array Fluidigm (DA). 3. Пипетировать 10-кратные пробы в лунки для проб на DA. 4. Для полного выполнения инструкций экспериментов в режиме реального времени следовать быстрой эталонной карте с программным обеспечением для анализа ПЦР в режиме реального времениBioMark (PN 68000089). В) Детекция микроРНК и/или малой РНК. Отдельный типичный протокол охватывает анализ микро РНК в единичных клетках, используя Dynamic Array 48.48 BioMark и ПЦР в режиме реального времени (PN 100-1616 А 1). Этот протокол позволяет оценить miPHK при низких концентрациях суммарной нуклеиновой кислоты. Могут быть оценены как miPHK, так и виды малой РНК (U6). В этом протоколе описываются лабораторные процедуры и требования к реагентам для анализа miPHK и/или малых РНК из таких малых количеств как 100 пикограммов общей РНК (10 клеток) после 15-18 циклов амплификации специфической мишени (STA). В этом примере в протоколе используются пулы MegaPlex как для обратной транскрипции (RT), так и для амплификации специфической мишени (STA) фирмы Applied Biosystems. Каждый из пулов А и В MegaPlex включает вплоть до 381 пары уникальных праймеров, давая возможность использовать один и тот же образец для анализа большого числа различных miPHK с минимальным введением образца. Реагенты для анализа видов miPHK: набор для одностадийной qOT-ПЦР CellsDirect(продукция фирмы Invitrogen, каталожные номера 11753-100 и 11753-500); необязательно: SUPERase-In (Ambion, PN АМ 2694); универсальная реакционная смесь для проведения ПЦР TaqMan (Applied Biosystems, PN 4304437); ТЕ-буфер (продукция фирмы Technova). Получение реакционной смеси (ОТ) MegaPlex и обратная транскрипция РНК. 1. Приготовить реакционную смесь для ОТ в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл согласно следующей таблице: 2. Осторожно несколько раз встряхнуть пробирку на вортексе до полного перемешивания; центрифугировать недолго для сбора компонентов. 3. В каждую реакционную лунку мультилуночного планшета добавить аликвоту 4,5 мкл реакционной смеси для ОТ. 4. В каждую лунку, содержащую реакционную смесь, добавить 3,5 мкл (от 100 пг до 350 нг) суммарной РНК. 5. Встряхнуть на вортексе и центрифугировать. 6. Инкубировать планшет на льду в течение 5 мин. 7. Термоциклировать реакцию, как описано в таблице ниже: Комментарий: к ДНК может храниться при от -15 до -25 С в течение по меньшей мере одной недели. Амплификация специфической мишени (также известная как преамплификация). 1. Приготовить реакционную смесь для STA в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл согласно следующей таблице: 2. Встряхнуть на вортексе и центрифугировать реакционную смесь для STA. 3. В каждую реакционную лунку мультилуночного планшета добавить аликвоту 3 мкл реакционной смеси для STA. 4. В каждую реакцию добавить 2 мкл обратно транскрибированной РНК из указанного выше. 5. Встряхнуть реакционный планшет на вортексе и остановить. 6. Инкубировать планшет на льду в течение 5 мин. 7. Выполнить протокол STA согласно таблице ниже: 8. Разбавить матрицу 1:10, добавив в каждую реакцию 45 мкл ТЕ-буфера с низким содержанием ЭДТА до конечного объема 50 мкл. Комментарий: количество циклов STA - лишь рекомендация. Оптимальное количество осуществляемых циклов STA необходимо определить эмпирически, и оно зависит от избытка miPHK в каждом образце. Детекция с помощью ПЦР в режиме реального времени (амплификация). Обратиться к быстрой эталонной карте для технологии проведения ПЦР в режиме реального времени Fluidigm 4 8.48 (PN 68000089) или быстрой эталонной карте для технологии проведения ПЦР в режиме реального времени Fluidigm 96.96 (PN 68000130) для полных инструкций по получению проб и образцов для анализа. При выполнении IFC Dynamic Array 48.48: при использовании праймеров для ОТ и праймеров дляSTA пула А для выполнения на DA может быть выбрано до 48 отдельных проб микроРНК TaqMan из пула А. При использовании праймеров для ОТ и праймеров для STA пула В для выполнения на DA может быть выбрано до 4 8 отдельных проб микроРНК TaqMan из пула В. При выполнении IFC Dynamic Array 96.96: при использовании праймеров для ОТ и праймеров дляSTA пула А для выполнения на DA может быть выбрано до 96 отдельных проб микроРНК TaqMan из пула А. При использовании праймеров для ОТ и праймеров для STA пула В для выполнения на DA мо- 19020593 жет быть выбрано до 96 отдельных проб микроРНК TaqMan из пула В. Результаты. Характерные данные по экспрессии miPHK (miPHK 30C, фиг. 3 или контрольной малой РНК U6,фиг. 4) получали, используя DA Fluidigm. Концентрацию miPHK или малой РНК измеряли, используя большое число введений общей РНК, после STA в течение различных количеств циклов. EFF указывает на эффективность ПЦР в серии разведений. На фиг. 5 и 6 ниже показаны тепловые карты, соответствующие величинам Ct, данных, полученных, используя DA m48 и m96. На фиг. 3 показаны стандартные графики, полученные на основе амплифицированной способомSTA матрицы из большого числа исходных уровней общей РНК. Разведения стандартов осуществляли после реакции STA для демонстрации линейности, наблюдаемой при проведении ПЦР с dynamic array. Эта линейность сохраняется при большом числе уровней исходного материала. На фиг. 4 показаны стандартные графики, полученные, исходя из такого же разведения STA, но при отличных исходных количествах общей РНК, демонстрируя заметную линейность анализа со стадии RT через STA и окончательно в ПЦР с динамическим чипом. С) Варианты протокола/методологии. 1. Варианты в количестве образца и объемах реагентов. 2. Увеличение числа температурных циклов STA вплоть до 24 циклов. 3. Удаление зонда из реакций STA для повышения накопления исходной флуоресценции. 4. Альтернативные способы кинетической детекции ампликонов, используя красители, связывающиеся с ДНК, такие как SYBR Green или Eva Green. 5. Применение материала, не участвующего в реакции STA (т.е. непреамплифицируемого). К иллюстративному подходу не-STA может относиться, например, полиаденилирование всех РНК, отличных от рРНК, перед прерванной транскрипцией по типу Эбервайна. Конкретнее, некоторая часть транскриптов в суммарной РНК необязательно содержит поли-А хвосты; поэтому они должны быть исключены с помощью поли-А РНК-позитивной техники отбора, если поли-А хвосты не добавляются. Подход снижения рРНК может сделать протокол более полноценным при обращении с меньшими количествами образцов суммарной РНК. В иллюстративном протоколе для специфического связывания с многочисленными видами 18S и 28S рРНК создают четыре биотинилированных содержащих LNA зонда RiboMinus (по 2 зонда для 18S и 28S рРНК). После гибридизации биотинилированных зондов с молекулами рРНК в образце суммарной РНК рРНК эффективно удаляют из образца добавлением магнитных шариков RiboMinus, которые покрывают стрептавидином. Этот процесс широко используется фирмой Affymetrix Corp. См. сайтwww. Affymetrix. com/support/help/faqs/wt/faq1.jsp. Наборы для осуществления этого процесса доступны у фирмы Invitrogen (технология RiboMinus). 6. Применение праймеров, несущих замкнутые нуклеиновые кислоты, или других праймеров, несущих модифицированные нуклеотиды или фосфодиэфирные связи (т.е. подход типа Exiqon). В этом случае преамплификация может не потребоваться. 7. Применение альтернативных способов лизиса единичных клеток, включая применение наборов для лизиса CelluLyser и синтеза кДНК (доступных у фирмы ТАТАА Biocenter AB, Odinsgatan 2841103Gteborg, Sweden) для содействия денатурации РНК и усиления обратной транскрипции. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ анализа ДНК единичной клетки, причем указанный способ включает:(a) осуществление полногеномной амплификации генома единичной клетки для получения амплифицированного генома, причем способ предусматривает осуществление полногеномной амплификации в течение менее чем около 10 циклов амплификации;(b) преамплификацию амплифицированного генома для получения преамплифицированной реакционной смеси, содержащей множество ампликонов, специфичных для одной или более нуклеиновых кислот-мишеней;(c) амплификацию и детекцию множества ампликонов. 2. Способ анализа мРНК из единичной клетки, причем указанный способ включает:(a) получение ДНК из мРНК единичной клетки;(b) преамплификацию ДНК для получения преамплифицированной реакционной смеси, содержащей множество ампликонов, специфичных для одной или более нуклеиновых кислот-мишеней, причем указанную преамплификацию осуществляют в течение 18 циклов или менее;(c) амплификацию и детекцию множества ампликонов, причем ампликон(ы) детектируют способом,выбранным из количественного способа в режиме реального времени, контроля количества продукта амплификации после заранее определенного числа циклов и анализа кривой плавления. 3. Способ анализа некодирующей РНК из единичной клетки, причем указанный способ включает:(a) получение ДНК из некодирующей РНК единичной клетки;(b) преамплификацию ДНК для получения преамплифицированной реакционной смеси, содержащей множество ампликонов, специфичных для одной или более нуклеиновых кислот-мишеней;(c) амплификацию и детекцию множества ампликонов способом, выбранным из количественного способа в режиме реального времени, контроля количества продукта амплификации после заранее определенного числа циклов и анализа кривой плавления. 4. Способ анализа ДНК единичной клетки, причем указанный способ включает:(a) осуществление полногеномной амплификации генома единичной клетки для получения амплифицированного генома;(b) преамплификацию амплифицированного генома для получения преамплифицированной реакционной смеси, содержащей множество ампликонов, специфичных для одной или более нуклеиновых кислот-мишеней;(c) амплификацию и детекцию множества ампликонов, где пары праймеров, используемые в преамплификации и/или амплификации, могут амплифицировать и детектировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) способом, выбранным из количественного способа в режиме реального времени, контроля количества продукта амплификации после заранее определенного числа циклов и анализа кривой плавления. 5. Способ анализа РНК единичной клетки, причем указанный способ включает:(a) получение ДНК из РНК единичной клетки;(b) преамплификацию ДНК для получения преамплифицированной реакционной смеси, содержащей множество ампликонов, специфичных для одной или более нуклеиновых кислот-мишеней;(c) амплификацию и детекцию множества ампликонов, где пары праймеров, используемые в преамплификации и/или амплификации, могут амплифицировать и детектировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) способом, выбранным из количественного способа в режиме реального времени, контроля количества продукта амплификации после заранее определенного числа циклов и анализа кривой плавления. 6. Способ по любому из пп.1-5, где указанная единичная клетка содержит клетку млекопитающего. 7. Способ по п.6, в котором указанную единичную клетку выбирают из клетки преимплантированного эмбриона, стволовой клетки, предполагаемой раковой клетки, клетки из патогенного организма и клетки, полученной с места преступления. 8. Способ по п.7, в котором клетка содержит бластомер человека. 9. Способ по п.8, в котором бластомер человека получают из эмбриона на стадии восьми клеток. 10. Способ по п.7, в котором клетка содержит стволовую клетку человека. 11. Способ по п.4, в котором указанную полногеномную амплификацию осуществляют так, чтобы реакция не достигала плато. 12. Способ по п.1 или 4, в котором указанную полногеномную амплификацию осуществляют в течение больше чем двух циклов амплификации. 13. Способ по п.4, в котором указанную полногеномную амплификацию осуществляют в течение меньше чем около 10 циклов амплификации. 14. Способ по п.12, в котором указанную полногеномную амплификацию осуществляют в течение 4-8 циклов включительно. 15. Способ по п.1 или 4, в котором указанную полногеномную амплификацию осуществляют, используя методику, выбранную из группы, состоящей из ПЦР с удлинением праймера (PEP), ПЦР с вырожденными олигонуклеотидами, ПЦР, опосредованную лигированием (LMP), линейной амплификации ДНК на основе Т 7 (TLAD) и множественной амплификации со смещением (MDA). 16. Способ по п.2, в котором ДНК представляет собой кДНК, полученную с помощью обратной транскрипции мРНК. 17. Способ по п.5, в котором РНК содержит некодирующую РНК. 18. Способ по п.3 или 17, в котором некодирующую РНК выбирают из группы, состоящей из малой ядрышковой РНК (snoPHK), микроРНК (miPHK), малой интерферирующей РНК (siPHK) и Piwiвзаимодействующих РНК (piPHK). 19. Способ по п.3 или 17, в котором ДНК получают из некодирующей РНК посредством обратной транскрипции или амплификации. 20. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанную преамплификацию осуществляют, используя одну или более пар праймеров, специфичных для указанной одной или более нуклеиновых кислот-мишеней. 21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанную преамплификацию осуществляют в течение 8-18 циклов. 22. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанную амплификацию осуществляют, используя одну или более пар праймеров, специфичных для указанных одной или более нуклеиновых кислот-мишеней. 23. Способ по п.16 или 19, где ДНК получают посредством обратной транскрипции с последующей преамплификацией в той же реакционной смеси. 24. Способ по любому из пп.16, 19 или 23, где в преамплифицированной смеси отсутствует зонд. 25. Способ по п.20, где указанные одна или более пар праймеров, используемые для преамплифи- 21020593 кации, амплифицируют один или более однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). 26. Способ по п.25, в котором наличие указанных одного или более SNP коррелирует с наличием одного или более генетических дефектов. 27. Способ по любому из пп.1-5, в котором преамплифицированную смесь распределяют в отдельные камеры микрофлуидального устройства перед амплификацией. 28. Способ по п.27, в котором микрофлуидальное устройство производят, по меньшей мере, частично из эластомерного материала. 29. Способ по любому из пп.1-5, где преамплификацию и/или амплификацию осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). 30. Способ по любому из пп.1-5, где наличие продукта амплификации определяют количественной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (q-ПЦР). 31. Способ по п.30, где для детекции продуктов амплификации в амплифицированных смесях используют универсальный зонд для q-ПЦР. 32. Способ по п.31, в котором универсальный зонд для q-ПЦР содержит краситель двуцепочечной ДНК (ds-ДНК). 33. Способ по п.30, где для детекции продуктов амплификации в амплифицированных смесях используют один или более зондов для q-ПЦР, специфичных к мишеням. 34. Способ по п.30, где наличие продукта амплификации определяют, используя анализ с флуорогенной нуклеазой. 35. Способ анализа по п.34, в котором наличие продукта амплификации определяют, используя олигонуклеотидный зонд с двумя флуорогенными метками. 36. Способ по любому из пп.1-5, где множество ампликонов содержит по меньшей мере 10 ампликонов. 37. Способ по любому из пп.1-5, где множество ампликонов содержит от 10 до 96 ампликонов. 38. Способ по п.27, где различные ампликоны амплифицируются и детектируются в различных ячейках.