Способы получения и применения рекомбинантного альфа-фетопротеина

011606 Область техники Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной инженерии, биотехнологии. Рекомбинантный альфа-фетопротеин (АФП) по настоящему изобретению, сохраняя активность АФП человека, получаемого из сыворотки, предназначен для применения в онкологии, иммунотерапии, косметологии. Уровень техники Альфа-фетопротеин (АФП) - основной компонент эмбриональной сыворотки крови млекопитающих, который синтезируется висцеральной эндодермой желточного мешка и клетками эмбриональной печени. Сразу после рождения уровень АФП в сыворотке резко снижается, и его экспрессия практически не определяется у взрослых здоровых особей (Deutsch H.F. (1991) Adv. Canc. Res. 56, 253-312). Синтез АФП возобновляется при возникновении опухолей печени и герминогенных тератобластом и в меньшей степени - при химических и механических повреждениях печени, сопровождающихся регенерацией, например, при остром вирусном гепатите или циррозе (Mizejewsky G.J. (2002) Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). АФП человека - гликопротеин, состоящий из 590 аминокислот и содержащий около 4% углеводного компонента (Morinaga Т., et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 4604-4608; Pucci P. et al., (1991)Biochemistry 30, 5061-5066). Одно из основных свойств АФП - нековалентная сорбция различных низкомолекулярных химических веществ, таких как полиненасыщенные жирные кислоты, стероидные гормоны, металлы, ретиноиды, гидрофобные антибиотики и другие (Aussel, С.Masseyeff, R. (1994) Biochem.Biophys. Res. Commun. 119: 1122-1127; Deutsch H.F. (1994) J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14. ). На ранних стадиях эмбрионального развития АФП заменяет альбумин в качестве транспортного средства для жирных кислот и других низкомолекулярных веществ (Deutsch H.F. (1991) Adv. Canc. Res. 56, 253-312). Молекула АФП состоит из трех глобулярных структурных доменов, скрепленных 15 межцепьевыми дисульфидными связями, что существенно осложняет процесс сборки третичной структуры белка(Morinaga Т., et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 4604-4608; Pucci, P. et al., (1991) Biochemistry 30,5061-5066). Кроме того, важным структурным элементом молекулы АФП является карбогидратный компонент, который обеспечивает правильную рецепцию и функционирование молекулы (Deutsch H.F.(1991) Adv. Canc. Res. 56, 253-312). Кроме полипептидной цепи, состоящей из 590 аминокислотных остатков, в структуру молекулы сывороточного эмбрионального АФП или секретируемого клетками гепатокарциномы, входит одна олигосахаридная группа, связанная с аспарагином по N-типу гликозилирования (Yamashita K. et al. (1993)Cancer Res. 53: 2970-2975). Структура олигосахаридной цепи АФП гетерогенна и зависит от различных факторов: стадии развития гепатокарциномы или стадии развития эмбриона. Олигосахариды влияют на структурные свойства молекулы АФП, входят в состав антигенных детерминант и рецепторсвязывающих центров (Deutsch H.F. (1991) Adv. Canc. Res. 56, 253-312). В отличие от сывороточного АФП, рекомбинантный АФП, экспрессированный в бактериальных клетках, негликозилирован, что является характерным отличием продукта, охарактеризованного в работах Murgita (US Patents 6331611; 6627440; 6416734), и, следовательно, обладает структурными и функциональными свойствами, отличающими его от сывороточного аналога и также от рекомбинантного АФП, экспрессированного в дрожжевых системах. Известно, что при экспрессии геторологичных белков в дрожжах осуществляется их гликозилирование по тем же аминокислотным остаткам, как и у сывороточного аналога, но структура самих олигосахаридов сильно различается по составу, длине и разветвленности цепи, что также предопределяет определенные различия в структурных и функциональных свойствах соответствующих белков(Hard K. et al (1989) FEBS Lett. 248:111). АФП может избирательно поглощаться клетками, экспрессирующими специфические АФПрецепторы (АФПР), такими как эмбриональные клетки, стволовые клетки, активированные иммунные клетки, раковые клетки или клетки, трансформированные определенными типами ретровирусов (Uriel J.et al., (1989) in Mizejewsky G.I., Jakobson H.I. (eds): Biological Properties of Alpha-Fetoprotein. Boca Raton,CRC Press, vol. 2:103-117). Нормальные зрелые клетки теряют способность поглощать АФП и не экспрессируют специфические АФПР. На основе этого свойства АФП предложены методы терапевтического использования АФП для целевой доставки в опухоль цитостатиков и других веществ, подавляющих рост раковых клеток (Deutsch H.F. (1994) J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14.; Tsukada Y. et al. (1994) J. Tumor Marker Oncol. 9: 99-103). АФП обладает рядом функциональных свойств, которые в настоящее время интенсивно исследуются. Классические представления об АФП, как об аналоге эмбрионального сывороточного альбумина, в настоящее время дополняются данными о способности АФП осуществлять регуляцию роста, развития и запрограммированной гибели клеток (Mizejewsky G.J. (2002) Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). В частности, было показано, что рекомбинантный АФП, аналогично сывороточному и культуральному аналогу, способен подавлять рост эстроген-зависимых опухолевых и нормальных тканей (Bennett J. A. etal., (1997) Breast Cancer Res. Treat. 45, 169-179; Bennet J. A. et al., (1998) Clinical Cancer Research, 4, 28772884). Недавно было установлено, что онкосуппрессивная активность АФП осуществляется по механизму активации апоптоза, характеризующегося типичными морфологическими изменениями, арестом рос-1 011606 та, цитотоксичностью и ДНК-фрагментацией (Semenkova L.N. (1997) Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I.,et al.(1998) Tumor Biol. 19, 30-40; Dudich E.I. et al. (1999) Eur. J. Biochem. 266: 1-13; Semenkova L., et al.(2003) Eur. J. Biochem. 70: 4388-4399). Более ранние исследования показали способность АФП регулировать дифференцировку и активацию иммунных клеток. В частности, АФП способен оказывать подавляющее действие на активированные алло- или аутоантигенами иммунные клетки и ингибировать экспрессию генов ряда цитокинов (Yamashita K. et al. (1993) Cancer Res. 53, 2970-2975; патент США 5965528). С другой стороны, АФП оказывает выраженное стимулирующее действие на рост незрелых клеток костного мозга, стволовых клеток и эмбриональных клеток (Dudich E.I., et al.(1998) Tumor Biol. 19, 30-40; патент США 6627440). Эти свойства АФП, а также повышенная селективность поглощения АФП раковыми клетками inBoca Raton, CRC Press, vol. 2:103-117), являются основой для использования АФП в медицине в качестве терапевтического препарата при лечении аутоиммунных (патент США 5965528) и онкологических заболеваний (патент США 6416734; Mizejewsky G.J. (2002) Expert Rev. Anticancer. Ther. 2: 89-115). Кроме того, традиционно АФП применяют в качестве онкоэмбрионального маркера для ранней диагностики онкологических заболеваний и патологий эмбрионального развития (Deutsch, H.F. (1991)Adv.Canc. Res. 56, 253-312). Однако применение природного АФП в качестве лекарственного средства техногологически невозможно из-за дефицита сырья. Традиционно источником для получения АФП является сыворотка крови беременных женщин, пуповинная эмбриональная сыворотка или асцитная жидкость раковых больных. Все эти источники, очевидно, являются неприемлемыми для получения белкового препарата медицинского назначения, вопервых, в связи с крайне ограниченным доступом к сырьевому источнику и низкому содержанию в нем АФП, и, во-вторых, в связи с постоянно возрастающим риском заражения вирусами или прионами. Ранее были опубликованы данные об экспрессии и очистке рекомбинантного АФП (рАФП) в различных микроорганизмах (Yamamoto R., et al. (1990) Life Sciences, 46:1679-1686; Nishi S., et al. (1988) J.Biochem. 104: 968-972 Патент США 5206153; патент США 6331611). Так, внутриклеточная продукция рАФП человека была получена в Saccharomyces cerevisiae (Yamamoto R., et al. (1990) Life Sciences,46:1679-1686; патент США 5206153) и Escherichia coli (патент США 6331611; Boismenu R., et al.(1997) Protein Expression and Purification. 10:10-26). Было показано, что рекомбинантный АФП, экспрессированный в Escherichia coli, сохраняет иммунорегуляторную и онкосуппрессивную активность эмбрионального аналога (Boismenu R., et al. (1997) Protein Expression and Purification. 10:10-26; Bennett, J. A.et al., (1997) Breast Cancer Res. Treat. 45, 169-179). Основными недостатками этих экспрессионных систем являются неспособность к секреции гетерологичного белка и крайне низкий уровень его продукции. Кроме того, получение целевого продукта из биомассы рекомбинантных штаммов-продуцентов требовало проведения дополнительных процедур денатурации и ренатурации, что приводило к значительному снижению выхода продукта и, как следствие, значительно повышало его себестоимость. Также, в случае использования бактериальных экспрессионных систем немаловажной является проблема загрязнения продукта липополисахаридами оболочки, обладающими известной эндотоксической активностью. Наиболее близким техническим решением для данного изобретения является штамм-продуцент АФП человека, описанный в работах (Yamamoto R., et al. (1990) Life Sciences, 46:1679-1686; патент США 5206153). В этих источниках раскрыт дрожжевой штамм-продуцент Saccharomyces cerevisiae с внутриклеточной продукцией АФП человека, аминокислотная последовательность которого содержит дополнительный участок, соответствующий сигнальному пептиду АФП крысы. Данное изобретение идентифицирует продукт секреции дрожжевого штамма, обладающий свойствами зрелого АФП человека и имеющий первичную последовательность SEQ ID No: 2, полностью соответствующую последовательности зрелого АФП человека. Эта особенность отличает продукт, описанный в настоящем изобретении, от заявленных ранее в работах (Yamamoto R., et al. (1990) Life Sciences, 46:1679-1686; патент США 5206153). Кроме того, недостатком этого штамма, описанного в цитируемых работах, является отсутствие механизмов внутриклеточной сборки и секреции АФП в культуральную жидкость, что существенно удорожает и усложняет процесс получения очищенного рекомбинантного АФП в препаративных количествах и дает крайне низкий уровень продукции АФП. Кроме того, авторы работ (Yamamoto R., et al.(1990) Life Sciences, 46:1679-1686; патент США 5206153) получили модифицированный рекомбинантный АФП, последовательность которого содержит также сигнальный и линкерный пептид, что ограничивает возможность его медицинского применения из-за модификации структуры белка, приводящей к изменению иммунологической специфичности и, как следствие, увеличению риска иммунореактивной патологии при внутривенном или подкожном введении. В случае гетерологичной секреционной продукции дрожжевыми клетками белков, для которых правильное сворачивание происходит с формированием дисульфидных связей (в том числе, АФП),большое значение имеет уровень продукции дрожжевой дисульфидизомеразы (Pdi) клетками продуцента(Shusta E.V., et al. (1998). Nat. Biotechnol. 16: 773-777). Кроме того, синергичное с этим ферментом действие оказывает повышенное количество шапероно-подобного дрожжевого белка BiP (Robinson A.S., et al.-2 011606 Несмотря на то, что дрожжи традиционно считаются организмами, свободными от секретируемых протеиназ (Chung B.H.Park K.S. (1998) Biotechnol. Bioeng. 57:245-249), для ряда белков, в том числе для HSA, показана их деградация в ходе культивирования дрожжей, связанная с наличием не идентифицированных пока протеиназ, ассоциированных с клеткой (Chung B.H.Park K.S. (1998) Biotechnol. Bioeng. 57:245-249; Kang H.A., et al. (2000). Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 575-582). Все перечисленные факторы требуют учета при создании дрожжевого продуцента АФП, эффективно секретируемого в культуральную жидкость. Учитывая недостатки существующих на настоящий момент способов получения рекомбинантного АФП, становится очевидным необходимость дальнейшего совершенствования технологии систем экспрессии и секреции рекомбинантного АФП, а именно разработка новых рекомбинантных штаммов, обладающих способностью к повышенной экспрессии гетерологичного белка с обеспечением внутриклеточной сборки нативной третичной структуры и последующей секреции целевого продукта в культуральную жидкость. Таким образом, из уровня техники объективно следует потребность в разработке промышленно применимых способов получения АФП, который по своим свойствам был бы идентичен или аналогичен сывороточному АФП человека, что позволило бы применять его в тех областях, где традиционно применялся сывороточный АФП человека. Достижение поставленной цели возможно за счет создания нового штамма микроорганизмов, который мог бы продуцировать в среду культивирования полипептид, идентичный или аналогичный по своим свойствам сывороточному АФП человека. Краткое описание сущности изобретения Для получения рекомбинантного АФП, свойства которого идентичны или аналогичны свойствам сывороточного АФП человека, потребовалось разработать штамм-продуцент, обеспечивающий синтез и продукцию АФП в секретируемой растворимой форме. Штамм-продуцент был получен с использованием генно-инженерных способов путем трансформации родительского штамма плазмидой, которая содержала последовательность ДНК, кодирующую протеин, обладающий активностью зрелого АФП человека. Рекомбинантный секретируемый АФП, продуцируемый в дрожжевой системе экспрессии, имеет свойства, идентичные или аналогичные свойствам зрелого АФП человека, определяемые в иммунологическом анализе и по его способности подавлять рост клеток В-клеточной лимфомы Raji и других чувтвительных к апоптогенному действию клеточных линий человека, в культуре in vitro. Это обеспечивает идентичный механизм действия полученного АФП и зрелого сывороточного АФП человека, получаемого традиционным способом, имеющего аминокислотную последовательность, представленную как SEQID No: 2. Режим осуществления способа получения АФП по настоящему изобретению обеспечивает сборку полипептида с минимальными дефектами по сравнению с нативным АФП человека. Близость свойств рекомбинантного АФП человека, продуцируемого в дрожжах, и сывороточного АФП человека обеспечивается тем, что в состав плазмиды включена экспрессионная кассета, содержащая последовательность ДНК, кодирующая зрелый АФП человека, и тем, что процесс не требует стадий денатурации-ренатурации и в то же время обеспечивает гликозилирование получаемого полипептида, а также укладку молекулы и образование дисульфидных связей. Рекомбинантный АФП человека, продуцируемый в секретируемой форме в дрожжевой системе экспрессии, отличается от рекомбинантного аналога, продуцируемого в прокариотической системе экспрессии тем, что он гликозилирован по N-типу,в то время как рекомбинантный бактериальный АФП, описанный в патентах (Murgita R.A. US Patents 6331611; 6627440; 6416734), негликозилирован. От сывороточного аналога рекомбинантный АФП человека, продуцируемый в секретируемой форме в дрожжевой системе экспрессии, отличается составом и структурой олигосахаридной цепи, которая определяется штаммом дрожжей и составом сахаров, входящих в питательную среду. Для получения высокого выхода секретируемого белка с требуемой активностью из клеткихозяина, в плазмиду, кодирующую ген АФП, были введены нескольких дополнительных генов, обеспечивающих высокий уровень транскрипции гена, сворачивания белков в ходе секреции и правильного образования дисульфидных связей. В результате была получена плазмида pKX, обладающая способностью трансформировать клетки для экспрессии и секреции АФП. При помощи указанной плазмиды была получена эукариотическая клетка-продуцент, обладающая способностью секретировать рекомбинантный альфа-фетопротеин. В предпочтительном варианте в качестве исходной клетки использован реципиентный штамм Saccharomyces cerevisiae YBS723, который был трансформирован плазмидой pKX с получением штаммапродуцента Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Y-3115. При культивировании трансформированного штамма, АФП секретируется в среду, из которой он может быть выделен в чистом виде с применением традиционных биохимических методов. Выделенный АФП, полученный из трансформированных клеток, применяется в составе фармацев-3 011606 тической композиции, ингибирующей рост опухолевых клеток, которая содержит полученный АФП и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Выделенный АФП применяется в составе синергической композиции, ингибирующей рост опухолевых клеток, которая содержит полученный АФП и химиотерапевтические препараты и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. С использованием выделенного АФП, фармацевтической композиции на его основе или содержащей его синергической композиции разработан способ лечения рака или предотвращения его развития,который предполагает введение пациенту эффективного количества АФП, фармацевтической композиции или синергической композиции. Так как полученный АФП аналогичен по свойствам сывороточному АФП человека, то полученный АФП применим в составе синергической композиции, оказывающей иммуносуппрессивное и иммунорегулирующее действие, при этом композиция содержит АФП и циклоспорин С с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями. С использованием выделенного АФП или вышеуказанной синергической композиции разработан способ лечения аутоиммунных заболеваний и коррекции иммунного статуса, включающий введение пациенту эффективного количества АФП или синергической композиции с циклоспорином С. Исходя из способности АФП стимулировать рост стволовых клеток, авторами изобретения предложена фармацевтическая композиция, стимулирующая рост стволовых клеток, которая содержит полученный АФП и фармацевтически приемлемые носители и наполнители, а также предложена синергическая композиция, стимулирующая рост стволовых клеток, содержащая полученный АФП и производные витаминов A, E, Д, антиоксиданты, стероидные гормоны, изофлавиноиды растительного происхождения с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями. С использованием выделенного АФП, вышеуказанных фармацевтической или синергической композиций предложен способ стимуляции роста стволовых клеток in vitro, предусматривающий воздействие на клетки эффективного количества АФП или соответствующих композиций. Кроме того, предложен способ стимуляции роста стволовых клеток in vivo, предусматривающий введение пациенту эффективного количества АФП или вышеуказанной фармацевтической или синергической композиции. Исходя из функциональной активности выделенного АФП, предложена косметическая композиция для омоложения кожи и профилактики старения кожи, которая содержит полученный АФП с приемлемыми в косметологии носителями и наполнителями и, необязательно, производные витаминов A, E, Д,антиоксиданты, стероидные гормоны, изофлавиноиды растительного происхождения. В рамках настоящего изобретения предлагается способ применения полученной косметической композиции для омоложения кожи и профилактики старения кожи, предусматривающий нанесение указанной композиции на кожу индивидуума. Краткое описание фигур Представленные объекты изобретения иллюстрируют следующие фигуры. Фиг. 1 представляет структуру плазмиды pKX, кодирующей последовательность зрелого альфафетопротеина человека, включающей в себя экспрессионную кассету с геном альфа-фетопротеина человека; фрагмент бактериальной плазмиды pUC18; область инициации репликации 2-мкм дрожжевой плазмиды; селективный дрожжевой маркер PGK1, ген PDI1, кодирующий фермент дисульфидизомеразу и ген KAR2, обеспечивающий правильную сборку белка и секрецию целевого продукта в культуральную среду. На фиг. 2 представлена структура экспрессионной кассеты, содержащей кодирующую последовательность альфа-фетопротеина человека, в составе плазмиды pKX. Курсивом обозначена промоторная область гена дрожжей GAL1. Жирным шрифтом обозначена пре-про область секреции гена дрожжейMF1. Аминокислотная последовательность молекулы альфа-фетопротеина человека показана заглавными буквами. Фиг. 3 демонстрирует структуру синтетического гена, кодирующего АФП и состоящего из наиболее употребимых кодонов дрожжей. Жирным шрифтом выделена аминокислотная последовательность АФП, которая идентична аминокислотной последовательности сывороточного АФП человека. Фиг. 4 показывает результаты ДСН-ПААГ электрофореза (А) и иммуноблоттинг-анализа (В) различных количеств, нанесенных на дорожку, очищенного рекомбинантного альфа-фетопротеина, полученного из культуральной жидкости дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX. 1. Маркерные белки (94, 67, 43, 30, 20 кД). 2. рАФП после аффинной хроматографии на колонке с анти-АФП-сефарозой (0,3 мкг). 3. рАФП после гель-хроматографии на колонке с Sephacryl S-200 (0,4 мкг). 4. рАФП (0,1 мкг). 5. рАФП после Sephacryl S-200 (0,6 мкг). 6. рАФП после Sephacryl S-200 (0,5 мкг). 7. Эмбриональный эАФП (0,4 мкг). Фиг. 5 показывает дозовую зависимость пролиферации клеток B-лимфомы Raji от двух различных-4 011606 образцов очищенного АФП, полученных из эмбриональной пуповинной сыворотки эАФП и рекомбинантного рАФП, экспрессированного дрожжевым штаммом-продуцентом Saccharomyces cerevisiaeYBS723/pKX. Пролиферацию клеток измеряли по включению [H3]-тимидина и выражали в процентах ингибирования роста в экспериментальных культурах после 12-часовой инкубации с АФП по отношению к контролю без добавок. Фиг. 6 демонстрирует: (А) синергическое усиление онкосуппрессивного действия доксорубицина в отношении клеток миелобластомы U937 при сочетанном применении с рАФП по настоящему изобретению;(Б) синергическое усиление общего онкосуппрессивного эффекта при сочетанном применении рАФП по настоящему изобретению и ретиноевой кислоты (провитамин А, кислота). Пролиферацию клеток измеряли по включению [H3]-тимидина и выражали в процентах ингибирования роста в экспериментальных культурах после 12-часовой инкубации с АФП по отношению к контролю без добавок. Фиг. 7 показывает стимулирующее действие рАФП по настоящему изобретению на рост стволовых эмбриональных клеток полученных из первичной культуры клеток эмбрионального легкого и ретины. Пролиферацию клеток измеряли стандартным способом по включению [H3]-тимидина в течение последних 4-х часов культивирования и выражали в процентах стимуляции роста в опытных культурах по отношению к контролю без АФП. Перечень последовательностей содержит последовательности SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2, которые соответственно представляют нуклеотидную последовательность экспрессионной кассеты, содержащей кодирующую последовательность альфа-фетопротеина человека, в составе плазмиды pKX и аминокислотную последовательность зрелого АФП человека. Нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты содержит промоторную область гена дрожжей GAL1, пре-про-область секреции гена дрожжей MF1, кодирующую последовательность гена альфа-фетопротеина человека и область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей. Данная экспрессионная кассета входит в состав плазмиды pKX, кодирующей последовательность зрелого альфафетопротеина человека в системе дрожжевого штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiaeYBS723/pKX. Подробное описание изобретения Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание штамма дрожжей - продуцента АФП, способного к эффективной секреции целевого белка в культуральную жидкость. Поставленная задача решена путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pKX, кодирующей регулируемый синтез АФП человека и штамма Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, обеспечивающего синтез и продукцию в секретируемой растворимой форме АФП с уровнем экспрессии не ниже 10 мг/л. Высокий уровень синтеза целевого белка в секретируемой растворимой форме обеспечивается тем, что плазмида pKX содержит промотор гена GAL1 с одновременной амплификацией гена KAR2(Robinson A.S., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:10017-10022), кодирующего шаперонный белок BiP (heavychain binding protein). В геноме штамма реципента проведена амплификация гена PDI1(Robinson A.S., etal. (1996) J. Biol. Chem. 271:10017-10022), кодирующего фермент дисульфидизомеразу, который участвует в формировании дисульфидных связей в ходе секреторного процесса белков. Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит ген АФП человека под контролем промотора генаGAL1, обеспечивающего высокий уровень транскрипции гена, и ген KAR2, кодирующий шаперонный белок BiP, участвующий в сворачивании белков в ходе секреторного процесса белков, и обеспечивающую высокий уровень продукции целевого белка в культуральную жидкость. Кроме того, для обеспечения правильного образования дисульфидных связей и формирования нативной третичной структуры белка используется ген PDI1, кодирующий дисульфидизомеразу. Рекомбинантная плазмидная ДНК pKX (фиг. 1), кодирующая ген АФП человека, характеризуется следующими признаками: является экспрессионной плазмидой для эффективной секкреции АФП человека; имеет размер 13301 п.н.; содержит фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность зрелого альфафетопротеина человека SEQ ID NO 2; содержит фрагмент бактериальной плазмиды pUC18; область инициации репликации 2-мкм дрожжевой плазмиды; селективный дрожжевой маркер PGK1; ген дрожжей KAR2, кодирующий шаперонный белок BiP; ген PDI1, кодирующий фермент дисульфидизомеразу; экспрессионную кассету с геном АФП; в структуру экспрессионной кассеты, представленной нуклеотидной последовательностью SEQ IDNo: 1, входят: область промотора гена GAL1 дрожжей; пре-про-область секреции гена MF1 дрожжей; кодирующая область зрелого АФП человека; область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей. При введении данной плазмиды в клетку достигается высокий уровень транскрипции гена АФП благодаря использованию высокоэффективного промотора GAL1. Введение пре-про-бласть секреции MF1 обеспечивает правильный секреторный процессинг АФП-сопровождающийся эффективной секрецией белка с ожидаемой аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, если кодирующая область будет-5 011606 соответствовать последовательности ДНК, кодирующей зрелый АФП человека, в культуральную жидкость. Существенным отличием предложенной плазмидной конструкции является то, что ген afp находится под контролем высокоэффективного промотора GAL1, а для обеспечения правильного образования дисульфидных связей и формирования нативной третичной структуры белка используются гены PDI1 иKAR2. При помощи созданной плазмиды можно трансформировать любую эукариотическую клетку, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор клетки не является критическим,поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалистам. Однако в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии АФП может варьироваться, однако факт экспрессии требуемого пептида будет иметь место, при условии успешной трансформации родительской клетки. Для получения штамма Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX использован реципиентный штаммYBS723 генотипа pgk1/pgk1. Гомозиготность pgk1/pgk1 обеспечивает неспособность этого штамма к росту на всех средах, содержащих любой единственный источник углерода, в норме усваиваемый дрожжами S. cerevisiae. Гомозиготность ga180PDI1/ga180PDI1 приводит к изменению регуляции промотора гена GAL1 с одновременной амплификацией в геноме гена PDI1, кодирующего фермент дисульфидизомеразу, участвующего в формировании дисульфидных связей в ходе секреторного процесса белков. Штамм YBS723 трансформирован плазмидой pKX по методу (Ito H., et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163-168). Трансформанты отбирали по способности расти на полноценной дрожжевой среде (бактопептон - 20 г/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л, бактоагар - 20 г/л)содержавшей 2% глюкозы в качестве источника углерода. Один из таких клонов обозначен YBS723/pKX. Полученный диплоидный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX характеризуется следующими признаками: Генетические признаки: генотип pgk1/pgk1 ga180PDI1/ga180PDI1; Морфологические признаки: вегетативные клетки двухсуточной культуры, выращенной на твердой питательной среде с 2% глюкозы в качестве единственного источника углерода, имеют овальную форму,размер клеток 3,67,1 мкм, протоплазма гомогенная, размножение почкованием. При выращивании на твердой среде, содержащей дрожжевой экстракт и пептон (YEP)при 30C через 72 ч роста колонии имеют следующий вид: 1) на среде YEP с глюкозой колонии белого цвета с ровным краем, блестящей поверхностью, конусообразным профилем, сметанообразной консистенцией; 2) на среде YEP с крахмалом колонии белого цвета с узорчатым краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и крупинчатой консистенцией; 3) на среде YEP с мелассой колонии белого цвета с матовой морщинистой поверхностью, узорчатым краем, выпуклым профилем и сметанообразной консистенцией. Рост в жидкой среде - на среде YEP с крахмалом при 32 С в течение первых 24 ч культивирования жидкость мутная, осадок белый, не комкуется, пристеночных пленок не образует. Физико-химические признаки: факультативный анаэроб. Температура роста - 23-33C (оптимум - 31). рН культивирования 3,8-6,7 (оптимум - 5,0). Наивысший уровень секреции АФП наблюдается при рН 6,8-7,0. Ассимиляция источников углерода: сбраживает глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу,декстрины, крахмал. Ассимиляция источников азота: усваивает аминокислоты, мочевину, сернокислый аммоний, азотнокислый аммоний. Отличительные особенности: при культивировании на богатой среде с крахмалом (2%) вокруг колоний образуются зоны просветления крахмала, окруженные темным ободком после инкубации чашек при +4C в течение 24 ч. Патогенность: штамм Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX непатогенен. Способ хранения: штамм хранится на агаризованной богатой среде с глюкозой в течение 3 месяцев при +4C. Полученный штамм Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX - продуцент АФП - в секретируемой форме депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Y-3115. Предлагаемый заявителями штамм-продуцент рекомбинантного АФП обладает рядом преимуществ перед уже существующими прототипами: продукция целевого продукта осуществляется в секретируемой форме в культуральную жидкость; аминокислотная последовательность конечного продукта соответствует последовательности зрелого АФП человека SEQ ID NO 2; аналогично сывороточному эмбриональному аналогу, рАФП, продуцируемый штаммом продуцентом Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, гликозилирован; существенно увеличен выход целевого продукта за счет увеличения экспрессии гена, кодирующего-6 011606 фермент дисульфидизомеразу PDI1, обеспечивающую образование дисульфидных связей и гена KAR2,кодирующего шаперонный белок BiP, обеспечивающий правильную сборку белка и секрецию целевого продукта в культуральную среду. Вполне очевидно, что кодирующая ДНК последовательность может содержать замены, связанные с вырожденностью генетического кода, а также некоторые замены, инсерции, делеции, которые в целом не приводят к получению неактивных форм фетопротеина. Возможные вариации известны специалистам. Получаемый полипептид может также включать в рамках аминокислотной последовательности консервативные аминокислотные замены, предполагающие замену одной аминокислоты на другую с близкими свойствами. Однако в пределах притязаний настоящего изобретения находятся только те полипептиды,которые имеют первичную, вторичную и третичную структуру, не нарушающую требуемую активность получаемого полипептида, а именно - иметь свойства, идентичные или аналогичные свойствам зрелого АФП человека, определяемые в иммунологическом анализе и по его способности подавлять рост клеток В-клеточной лимфомы Raji в культуре in vitro. Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный полипептид будет обладать свойствами зрелого сывороточного АФП человека, определяются по иммунологической реакции и по его способности ингибировть in vitro рост клеток В-клеточной лимфомы Raji, на уровне не ниже 10 % от активности зрелого сывороточного АФП человека. При практическом применении полученного полипептида в составе композиций используются традиционные дополнительные компоненты, такие как наполнители, разбавители, консерванты, буферные растворы, физиологический раствор, 0,9% раствор хлорида натрия, технологические добавки, используемые при изготовлении лекарственных форм и т.п. Композиции могут быть жидкими (растворы, суспензии, кремы, эмульсии и т.п.), твердыми (лиофилизированный порошок, восстанавливаемый перед применением, адсорбированный препарат на носителе и т.п.), предназначенными для парентерального,перорального, внутривенного, внутримышечного и т.п. введения или для наружного применения. При этом составы для наружного применения могут содержать добавки, способствующие абсорбции и диффузии действующего вещества в ткани. Синергические композиции настоящего изобретения предусматривают присутствие в композиции другого активного вещества, причем при совместном присутствии двух активных веществ, одно из которых представляет собой АФП по настоящему изобретению, эффект их действия достоверно выше, чем в случае применения каждого вещества по отдельности. Вполне очевидно, что синергические композиции представляют собой один из предпочтительных вариантов выполнения изобретения, поскольку для специалиста очевиден вариант введения каждого действующего компонента по отдельности. Например, при противораковой терапии можно вводить по отдельности каждый препарат активного компонента одновременно, с разделением по времени, или разными путями введения. Конкретный выбор зависит от состояния пациента, тяжести заболевания, предшествующего лечения и т.п. Выбор терапевтических дозировок при лечении может составлять любую дозу в широком диапразоне от 0,001-10 мг/кг веса пациента, при условии обеспечения требуемого терапевтического эффекта. Он соответствует традиционным дозировкам АФП человека, поскольку получаемый АФП будет обладать или аналогичными, или близкими по активности свойствами. Предельные дозировки АФП по изобретению соответствуют дозировкам АФП человека, поскольку они имеют сходную аминокислотную последовательность, которая не распознается нормальной иммунной системой человека как "чужеродная". Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не носят ограничительного характера, а предназначены для демонстрации выполнения изобретения и реализации наилучшего варианта его осуществления. Пример 1. Выделение суммарной РНК и конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pTrcafp. Суммарную мРНК выделяли из клеточной линии гепатомы человека HepG2 при помощи Trizol Reagent (Gibco BRL, США) по методу производителя. кДНК, получали используя First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas), в присутствии праймеров олиго(dT)18 или GAAGTAATTTAAACTCCCAAAGC(3R), комплементарного 3'-концу гена afp. Амплификацию полученной матрицы для последующего клонирования проводили в присутствии праймеров:CTTCCAAGCTTAAACTCCCAAAGCAG (Hind),первый из которых соответствует 5'-последовательности гена зрелого белка (выделена жирным шрифтом) и содержит сайт узнавания рестриктазой Cla I, а второй комплементарен 3'-концевому участку гена (выделен жирным шрифтом) и содержит сайт узнавания Hind III. Амплификацию гена проводили в объеме 100 мкл. Реакционная смесь содержала 10 нг cDNA, по 30 пмолей праймеров (1) и (2), смесьdNTP (по 0.2 mM каждого), 10 mM Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 2.5 ед.акт. Pfu ДНКполимеразы (фирмы Stratagene) и 1 ед.акт. Taq ДНК-полимеразы (фирмы Fermentas). Проводили 25 циклов по схеме: 95 С/40 с, 39 С/40 с, 72 С/1 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1%-7 011606 ном агарозном геле; полосы длиной около 1790 п.о. вырезали, ДНК экстрагировали из геля, обрабатывали рестриктазами ClaI и HindIII и клонировали в плазмиду pTrcTEGF, полученную ранее на основе вектора pTrc99A (Amann E., et al. (1988) Gene, 69, 301-315) и обработанную этими же рестриктазами. В результате получили плазмиду pTrcafp; ее строение подтверждали рестриктным анализом, используя рестриктазы ClaI и HindIII, по которым производили клонирование, а также Spe I, Mun I, Sec I и Sty I, сайты узнавания которых содержатся внутри гена АФП, и определением нуклеотидной последовательности участка ДНК, клонированного при помощи ПЦР. Секвенирование проводили по методике и с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва). Пример 2. Получение синтетической кДНК, кодирующей ген АФП человека. Для получения синтетического гена АФП были химически синтезированы 36 олигонуклеотидов длиной 62-68 н. На основе этих олигонуклеотидов методом полимеразной цепной рекции получено 6 двуцепочечных фрагментов, каждый из которых клонирован в вектор pUC18. Первичная структура всех клонированных фрагментов была подтверждена секвенированием. Фрагменты с правильной нуклеотидной структурой были затем последовательно собраны в целевой ген методом рестрикции/лигирования в виде фрагмента плазмиды pUC18. Аналогичным образом получали кДНК для экспрессии модифицированных форм АФП, содержащих делеции, мутации или добавочные аминокислотные остатки. Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pKX. Плазмиду pTrcafp использовали в качестве матрицы для ПЦР в присутствии праймеров:CCAACCCATGGCTAAGAGAACACTGCATAGAAA-TG. В последовательность праймеров заложены сайты рестрикции NcoI и XhoI (подчеркнуты). Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК после обработки эндонуклеазами рестрикцииNcoI/XhoI клонировали на вектор pUC18/GAL1-pp, содержащий промотор GAL1 и пре-про-область секреции MF1. В результате получили плазмиду pUC18/GAL1-pp/afp. Для исключения возможных ошибок ПЦР NcoI/XhoI фрагмент плазмиды секвенировали. HindIII/XhoI фрагмент плазмиды pUC18/GAL1pp/afp, содержащий промотор GAL1, пре-про-область секреции MF1 и кодирующую часть гена АФП человека (фиг. 2), переносили на HindIII/XhoI бирепликонный (дрожжи-Е.coli) вектор pPDX. B результате получена плазмида pPDX/GAL1-pp/afp. ClaI/XhoI фрагмент плазмиды pPDX/GAL1-pp/afp переносили на ClaI/XhoI вектор pPK, отличающийся от pPDX наличием гена KAR2. Полученная в результате плазмида названа pKX (фиг. 1). Аналогичным образом получена плазмида pKX-1, содержащая синтетический ген АФП человека, состоящий из наиболее употребимых кодонов дрожжей (фиг. 3). Плазмида pKX-1 отличается от pKX тем, что содержит синтетический ген зрелого АФП человека. Пример 4. Получение штамма-продуцента АФП человека. Для получения штамма Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX реципиентный штамм YBS723 был трансформирован плазмидой pKX по методу (Ito H., et al.(1983) J. Bacteriol. 153: 163-168). Трансформанты отбирали по способности расти на полноценной дрожжевой среде (бактопептон - 20 г/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л, бактоагар - 20 г/л), содержавшей 2% глюкозы в качестве источника углерода. Один из таких клонов обозначен YBS723/pKX. Пример 5. Определение продуктивности штамма-продуцента АФП человека Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX. Клетки штамма-продуцента YBS723/pKX выращивали в колбах при 26 С на качалке (250 об/мин) на среде следующего состава: глюкоза - 2%, глицерин - 1,5%, дрожжевой экстракт - 1%, пептон -2%, вода дистиллированная. рН среды поддерживали 7,0 добавлением 0,1 M фосфатного буфера. Исходный титр клеток составлял 5106. Через 72 ч выращивания культуры после перехода в стационарную фазу роста при титре 7-8108 отбирали ее образцы. Образец культуральной жидкости получали после центрифугирования культуры при 10000 об/мин в течение 1 мин и использовали в последующих анализах. Пробы КЖ анализировали электрофорезом в 12,5% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гели окрашивали Кумасси R-250 (фиг. 4) и сканировали для определения общего белка и относительного содержания АФП-специфичного белка. По данным электрофореза и сканирования, общее содержание АФП в КЖ составляет около 10-25% от суммарного белка, однако наблюдается частичная внутриклеточная деградация белка. Относительное содержание АФП в КЖ определяли методом иммуноблоттинга в присутствии поликлональных антител к АФП (фиг. 4). Также, количественное содержание АФП в культуральной жидкости определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора моноклональных и поликлональных антител к АФП человека. По данным ИФА, среднее содержание АФП в КЖ в жидких средах достигало 5 мг/л. Пример 6. Определение продуктивности штамма-продуцента АФП человека Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX в высокоплотных средах. Проведено feed-batch культивирование штамма YBS723/pKX в ферментере при 26 С и рН 7,0 (автоматическое поддержание). Содержание растворимого кислорода рО поддерживали 20%. В ходе ферментации осуществляли подпитку средой следующего состава: дрожжевой экстракт - 30 г/л, пептон - 60 г/л, глюкоза - 100 г/л. Скорость подачи подпитки была такой, чтобы обеспечить скорость роста культуры=0,03. По достижении OD590, равной 280 оптических единиц, было проанализировано содержание АФП в КЖ. Относительное и общее содержание АФП в КЖ высокоплотных култур YBS723/pKX определяли,как описано выше в примере 4. При культивировании в высокоплотных средах содержание рАФП в КЖ по данным ИФА достигало 70 мг/л. Пример 7. Выделение и характеризация рекомбинантного АФП человека из КЖ штаммапродуцента YBS723/pKX. Выделение рАФП из КЖ штамма-продуцента YBS723/pKX производили, как описано ранее(Dudich et al. (1999) Biochemistry, 38:10406-10414), с небольшими изменениями. Культуральную жидкость из 3 л концентрировали ультрафильтрацией на концентрирующей ячейкеMillipore до 200 мл и диализовали против 0,005 М Трис-HCl буфера рН 7,5, 0,1 М NaCl, 4 С, затем центрифугировали 0,5 часа при 10 000 об/мин. Ионообменная хроматография. Полученный после центрифугирования супернатант наносили на ионообменную колонку DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 274 см), уравновешенную 0,01 M ТрисHCl, рН 7,5, 0,1 M NaCl. Не связавшиеся с сорбентом компоненты смывали с колонки стартовым буфером, а элюцию целевого продукта проводили 0,2 M NaCl в Трис-HCl буфере, рН 7,5 при скорости 1 мл/мин. Аффинная хроматография. Фракции, содержащие рАФП, объединяли, доводили концентрациюNaCl до 0,5 М и наносили на аффинную колонку с Sepharose CL-4B, конъюгированной с поликлональными анти-АФП антителами кролика, уравновешенную 0,05 М Трис-HCl, рН 7,5 и 0,5 М NaCl. После выхода несвязавшихся с антителами белков адсорбированный рАФП элюировали 0,005 М HCl. Пик выхода материала при достижении рН от 5,0 до 3,5 определяли по поглощению при 280 нм. Раствор рАФП нейтрализовали до рН 7,5 добавлением 2 М раствора Трис-HCl, рН 7,5. Гель-хроматография. Дальнейшую очистку рАФП проводили гель-хроматографией на колонке сSephacryl S-200 (1,870 см) в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,0; 0,15 М NaCl, со скоростью 0,5 мл/мин. Раствор очищенного рАФП концентрировали в ячейке "Amicon" (мембрана YM-30) под давлением азота. Анализ образцов. Идентификацию и чистоту полученного препарата рАФП контролировали методами гель-электрофореза по Лэммли в 12,5% ДСН-ПААГ с -меркаптоэтанолом с последующим окрашиванием Кумасси (фиг. 4A), вестерн-блот-анализом на PVDF-мембране при титре первичных антител 1:500 и вторичных 1:5000, дот-блотом на Hybond ECL-нитроцеллюлозной мембране (фиг. 4 В), ИФА. Определение концентрации белка в растворах проводили по методу Брэдфорда, используя в качестве контроля стандартный раствор эмбрионального АФП, а также спектрофотометрически при 278 нм,учитывая коэффициент экстинкции E1%, 278 nm = 0,53. Пример 8. Определение биологической активности рекомбинантного АФП человека in vitro. Функциональную активность рАФП и его модифицированных форм определяли по его способности подавлять рост клеток В-клеточной лимфомы Raji в культуре in vitro, как описано ранее (Semenkova L.N.(1997) Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al.(1998) Tumor Biol. 19, 30-40). Предварительно промытые свежей средой клетки Raji помещали в каждую ячейку 96-луночного планшета по 5103 в 0,1 мл средыRPMI-1640 в присутствии 10% фетальной сыворотки теленка, затем добавляли различные дозы АФП на 12 ч. Пролиферацию клеток измеряли стандартным способом по включению [H3]-тимидина в течение последних 4 ч культивирования. Для сравнения была изучена дозозависимая реактивность для двух образцов АФП эмбрионального происхождения эмбрАФП и дрожжевого рАФП (фиг. 5). Видно, что оба препарата проявляют выраженную цитостатическую активность в отношении этих клеток. Аналогично,для определения активности препаратов на основе АФП in vitro могут быть использованы любые другие линии раковых клеток, чувствительные к суппрессивному действию АФП, такие как гепатокарцинома человека HepG2, рак молочной железы MCF-7, рак простаты LnCap, миелобластома U-937 и др. (Semenkova L.N. (1997) Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al. (1998) Tumor Biol. 19, 30-40). Пример 9. Применение рекомбинантного АФП в качестве антиракового препарата. Антираковые препараты на основе рАФП и его модифицированных форм могут применяться для ингибирования роста злокачественных новообразований, таких как первичный или метастатический рак печени, рак крови (лейкоз, миелобластоз, лимфома), рак груди, рак простаты. Для определения чувствительности данного типа опухолевых клеток к АФП возможно использование различных методов как invitro так и in vivo. Метод определения активности in vitro описан в предыдущем примере 8. Для определения онкосуппрессивного действия препаратов на основе АФП in vivo могут быть использованы модели на животных, например с использованием мышей Nude с привитыми подкожно или внутрибрюшинно человеческими линиями раковых клеток, таких как Raji, HepG2, LnCap, MCF-7 и др. Например, клетки В-клеточной лимфомы Raji вводили подкожно в количестве 1-5106/мышь. АФП и его производные начинали вводить за 7 дней до имплантации опухолевых клеток интраперитонеально или в/в количестве 1-10 мг/кг. В качестве контроля использовали физраствор. Размер опухоли оценивали еженедельно измерениями с помощью микрометра. Таблица 1. Результат испытаний рАФП на модели мышей линии Nude привитых клетками Вклеточной лимфомы Raji Способ введения препаратов на основе дрожжевого рАФП или его производных может также включать в себя введение химиотерапевтических препаратов одновременно или последовательно. В качестве примеров таких химиотерапевтических препаратов могут быть приведены следующие: доксорубицин, винкристин, фторурацил, метатрексат, актиномицин D, митомицин С, тамоксифен, флутамид,винкристин, винбластин, циклоспорин, ретиноиды, каротеноиды и др. Обычно химиотерапевтический препарат может вводиться в стандартных дозах или в субоптимальных дозах, ниже обычных терапевтических. В качестве примера на фиг. 6 приведен эффект сочетанного действия рАФП и доксорубицина (А) и рАФП и all-trans-Retinoic acid (tRA). При одновременном введении этих препаратов наблюдали синергическое онкосуппрессивное действие при использовании субоптимальных доз. Пример 9. Применение рекомбинантного АФП для стимуляции роста стволовых клеток. Первичная культура эмбриональных фибробластов легкого и ретины человека была получена с помощью обработки 0,2% раствором трипсина соответствующих тканей 5-10-недельных эмбрионов, полученных после легальных абортов. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 в присутствии 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ). Цитостатическую активность АФП измеряли, как описано ранее (Semenkova L.N. (1997) Tumor Biol. 18, 261-274; Dudich E.I., et al. (1998) Tumor Biol. 19, 30-40). Клетки в количестве 4104 в 0,15 мл среды интенсивно промывали свежей средой и помещали в каждую ячейку 96-луночного планшета, затем добавляли различные дозы АФП и культивировали 24 ч. Пролиферацию клеток измеряли стандартным способом по включению [H3]-тимидина в течение последних 4-х часов культивирования. Дозовая зависимость влияния АФП на клеточный рост также исследовалась для первичной культуры эмбриональных фибробластов человека. АФП оказывал на эти клетки стмулирующее действие, достигающее 50-90% относительно контроля (фиг. 7). Пример 10. Применение рекомбинантного АФП в косметологии. В связи с тем, что АФП обладает способностью стимулировать рост стволовых клеток и является фактором роста для эмбриональных клеток, предлагается его возможное применение для приготовления косметических масок, кремов и лосьонов. рАФП может быть использован в качестве наполнителя для липосом, микросом и наносом. B связи с тем, что АФП способен связывать гидрофобные лиганды, в частности жирорастворимые витамины, стероиды, изофлавиноиды, полиненасыщенные жирные кислотыCommun. 119: 1122-1127; Deutsch H.F. (1994) J. Tumor Marker Oncol. 9: 11-14), показано сочетанное применение рАФП с жирорастворимыми витаминами, такими как производные ретиноидов, каротеноидов,токоферол, витамин Д; стероидами, такими как производные эстрагенов и андрогенов. В качестве примера таких стероидов могут быть использованы эстрадиол и др. Цитируемые источники:- 13011606 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Экспрессионная кассета с последовательностью SEQ ID NO: 1, содержащая область промотора гена GAL1 дрожжей; пре-про-область секреции гена MF1 дрожжей; последовательность ДНК, кодирующую протеин, обладающий активностью зрелого альфа-фетопротеина человека, и область терминации транскрипции гена CYC1 дрожжей. 2. Экспрессионная кассета по п.1, где ДНК, кодирующая протеин, обладающий активностью зрелого альфа-фетопротеина человека, представляет собой синтетический ген, кодирующий зрелый альфафетопротеин человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или его модифицированную форму, имеющую удаления, добавления или замены одного или нескольких аминокислотных остатков, что приводит к образованию модифицированного альфа-фетопротеина человека, последовательность которого по крайней мере на 80% соответствует аминокислотной последовательности зрелого альфа-фетопротеина человека SEQ ID NO: 2, с сохранением у указанного продукта с модифицированной структурой функциональной биологической активности зрелого альфа-фетопротеина человека. 3. Рекомбинантная плазмида pKX, включающая экспрессионную кассету по пп.1, 2; фрагмент бактериальной плазмиды pUC18; область инициации репликации 2-мкм дрожжевой плазмиды; ген KAR2,обеспечивающий правильную сборку белка и секрецию целевого продукта в культуральную среду; генPDI1, обеспечивающий правильное образование дисульфидных связей; селективный дрожжевой маркерURA3 и селективный дрожжевой маркер PGK1. 4. Эукариотическая клетка-продуцент, обладающая способностью секретировать рекомбинантный альфа-фетопротеин человека за счет трансформации ее плазмидой pKX по п.3. 5. Штамм-продуцент Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, обладающий способностью секретировать рекомбинантный альфа-фетопротеин человека, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Y-3115. 6. Способ получения рекомбинантного альфа-фетопротеина, имеющего биологическую активность зрелого альфа-фетопротеина человека сывороточного происхождения, включающий культивирование эукариотической клетки по п.4, обладающей способностью секретировать в среду культивирования рекомбинантный альфа-фетопротеин, и стадию выделения рекомбинантного альфа-фетопротеина из культуральной среды. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве эукариотической клетки используют дрожжевую клетку. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве дрожжевой клетки используют штамм Saccharomyces cerevisiae YBS723/pKX, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером Y-3115, обладающий способностью секретировать рекомбинантный альфа-фетопротеин. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что культивирование осуществляют при температуре 23-33C в среде, содержащей глюкозу - 2%, глицерин - 1,5%, дрожжевой экстракт - 1%, пептон - 2%, дистиллированную воду; с поддержанием рН среды 4,5-7,0 за счет дополнительного забуферивания и добавления растворимого кислорода до рО 20%. 10. Фармацевтическая композиция, ингибирующая рост опухолевых клеток, содержащая рекомбинантный альфа-фетопротеин, полученный способом по любому из пп.6-8, и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. 11. Синергическая композиция, ингибирующая рост опухолевых клеток, содержащая рекомбинантный альфа-фетопротеин, полученный способом по любому из пп.6-8, и химиотерапевтические препараты, такие как доксорубицин, винкристин, фторурацил, метатрексат, актиномицин D, митомицин С, тамоксифен, флутамид, винкристин, винбластин, циклоспорин С, производные ретиноевой кислоты, каротеноиды, стероидные гормоны и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. 12. Способ лечения рака или предотвращения развития рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества рекомбинантного альфа-фетопротеина, полученного способом по любому из пп.6-8, фармацевтической композиции по п.10 или синергической композиции по п.11. 13. Синергическая композиция, оказывающая иммуносупрессивное и иммунорегулирующее действие, содержащая рекомбинантный альфа-фетопротеин, полученный способом по любому из пп.6-8, и циклоспорин С и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. 14. Способ лечения аутоиммунных заболеваний и коррекции иммунного статуса, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества рекомбинантного альфафетопротеина, полученного способом по любому из пп.6-8, с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями или композиции по п.13. 15. Фармацевтическая композиция, стимулирующая рост стволовых клеток, содержащая рекомбинантный альфа-фетопротеин, полученный способом по любому из пп.6-8, и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. 16. Синергическая композиция, стимулирующая рост стволовых клеток, содержащая рекомбинант- 14011606 ный альфа-фетопротеин, полученный способом по любому из пп.6-8, и производные витаминов A, E, D,антиоксиданты, стероидные гормоны, изофлавиноиды растительного происхождения и фармацевтически приемлемые носители и наполнители. 17. Способ стимуляции роста стволовых клеток in vitro, предусматривающий воздействие на клетки эффективного количества рекомбинантного альфа-фетопротеина, полученного способом по любому из пп.6-8, фармацевтической композиции по п.15 или синергической композиции по п.17. 18. Способ стимуляции роста стволовых клеток in vivo, предусматривающий предоставление пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества рекомбинантного альфа-фетопротеина, полученного способом по любому из пп.6-8, фармацевтической композиции по п.15 или синергической композиции по п.16. 19. Косметическая композиция для омоложения кожи и профилактики старения кожи, содержащая рекомбинантный альфа-фетопротеин, полученный способом по любому из пп.6-8, приемлемые в косметологии носители и наполнители и, необязательно, производные витаминов A, E, D, антиоксиданты, стероидные гормоны, изофлавиноиды растительного происхождения. 20. Применение косметической композиции по п.19 для омоложения кожи и профилактики старения кожи, предусматривающее нанесение указанной композиции на кожу индивидуума.