Композиции на основе слитого белка ов и способы их применения

1 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Fc-OB, способам получения таких композиций и их применения. Уровень техники При том, что молекулярные основы ожирения в значительной мере остаются неизвестными, идентификация "гена ОВ" и кодируемого им белка ("белок ОВ" или "лептин") пролила свет на механизм, регулирующий отложение жира в организме. См. публикацию РСТ WO 96/05309 (12/22/96), Friedman et al.; Zhang et al.,Nature 372: 425-432 (1994); см. также The Correction at Nature 374: 479 (1995). Белок ОВ активен in vivo как у мутантных мышей ob/ob (мыши, ожиревшие в силу дефекта образования продукта гена ОВ), так и у нормальных мышей дикого типа. Биологическая активность проявляется, помимо прочего, в снижении веса. См.Barrinaga, "Obese" Protein Slim Mice. Science 269: 275-456 (1995). Белок OВ, его производные и применение их в качестве модуляторов для контроля веса и ожирения у животных, включая млекопитающих и человека, были описаны более подробно в публикации РСТ WO 96/05309(12/22/96). Другие биологические эффекты белка ОВ охарактеризованы слабо. Известно, например,что у мутантных мышей ob/ob введение белка ОВ приводит к снижению уровней инсулина и глюкозы в сыворотке. Известно также, что введение белка ОВ приводит к снижению количества жира в организме. Это наблюдалось как на мутантных мышах ob/ob, так и на неожиревших нормальных мышах. Pelleymounter et al., Science 269: 540-543 (1995); Hallas et al., Science 269: 543-546 (1995). См. также Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) (Периферическое и центральное введение микрограммовых доз белка ОВ снижало потребление пищи и веса тела у мышей ob/ob и мышей, ожиревших от специальной диеты, но не у ожиревших мышейdb/db.). Ни в одной из этих работ не отмечено токсичности, даже при наивысших дозах. Несмотря на перспективы клинического применения белка OВ, способ действия белкаOB in vivo не выяснен до конца. Что касается рецептора ОВ, то высокая аффинность связывания белка OВ, характерная для гипоталамуса крыс, указывает на локализацию рецептора OB.db/db характерен тот же фенотип, что и для мышей оb/оb, т.е. крайнее ожирение и диабет типа II; считается, что данный фенотип обусловлен дефектным рецептором OВ, особенно потому, что мыши db/db не отвечают на введение белка OВ. См. Stephens et al., supra. С прогрессом технологий рекомбинантных ДНК доступность для терапевтического применения рекомбинантных белков обусловила успехи в химической модификации белков и в создании новых фармацевтических форм бел 004791 2 ков. Одной из целей таких модификаций является защита белка и снижение деградации. Слитые белки и химические присоединения могут эффективно предотвращать физический контакт протеолитических ферментов с собственно белковым скелетом, предотвращая тем самым деградацию белка. К дополнительным преимуществам при определенных условиях относятся повышение стабильности, времени циркулирования и биологической активности терапевтического белка. Обзорная статья, посвященная слитым белкам и модификациям белков: Fransis,Focus On Growth Factors 3: 4-10 (May 1992)(опубликовано Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK). Одной из таких модификаций предусматривается использование Fc-района иммуноглобулинов. Антитела состоят из двух функционально независимых частей: вариабельного домена, известного как "Fab", который связывает антиген, и константного домена, известного как"Рс", который обеспечивает связь с такими эффекторами, как комплемент или фагоциты. Fcрайон иммуноглобулинов имеет продолжительный срок полужизни в плазме, a Fab - короткоживущ. Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989). Были сконструированы продукты терапевтических белков с использованием Fc-домена с тем, чтобы обеспечить более продолжительный срок полужизни или ввести такие функции, как связывание с Fc-рецептором, связывание с Абелком, фиксация комплемента и перенос через плаценту, которые обусловлены Fc-доменом иммуноглобулинов. Например, Fc-район антитела IgG1 был слит с N-терминальным фрагментом CD30-L, молекулы, которая связывает рецепторы CD30, экспрессирующиеся на клетках лимфомы Ходжкина, анапластических лимфомных клетках, Т-клеточных лейкозных клетках и злокачественных опухолевых клетках других типов. См. патент США 5,480,981. Интерлейкин 10 (IL-10), агент, подавляющий отторжение пересаженных органов и антивоспалительный агент, был слит с мышиным Fс 2 а для увеличения исходно непродолжительного времени циркуляции цитокина. Zheng, X. et al., The Journal ofImmunology, 154: 5590-5600 (1995). Проведены также исследования, направленные на оценку применения рецептора фактора некроза опухолей, соединенного с Fc белком IgG1 человека,для лечения больных с септическим шоком.(1996); Van Zee, К. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996). Fc был также слит с рецептором CD4 для получения терапевтического белка для лечения СПИДа. См.Capon, et al., Nature 337: 525-531 (1989). Кроме того, N-терминальный фрагмент интерлейкина 2 также был слит с Fc фрагментом IgG1 или IgG3 для того, чтобы преодолеть короткий срок полужизни интерлейкина 2 и его общую токсич 3 ность. См. Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95-105 (1995). Поскольку белок OВ был идентифицирован как многообещающий терапевтический белок, имеется потребность в разработке композиций аналогов OВ для клинического применения в сочетании с введением белка OВ или же в качестве альтернативы такому введению. Результатом таких разработок должны быть такие композиции аналогов OВ, в которых благодаря химическим модификациям и соответствующим фармацевтическим формам достигается снижение деградации белка, повышены стабильность и время циркуляции. В настоящем изобретении заявлены такие композиции. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Fc-OB, способам получения таких композиций и их применения. В частности, настоящее изобретение относится к генетически слитому белку, состоящему из Fcрайона (или аналогов) иммуноглобулинов, слитого с N-терминальной областью белка ОВ или его аналогов. Слитый белок Fc-OB способен к димеризации посредством цистеиновых остатков Fc-района. Неожиданно модификации по генетическому слиянию Fc-района с N-концом белка OВ обладали преимуществами в отношении стабильности, скорости выведения (клиренса) и пониженной деградации, которые не наблюдаются у белка ОВ или у слитого белка Fcрайона с С-концом белка ОВ. Удивительно и важно, что N-терминальная модификация обеспечивает неожиданную защиту белка от деградации, повышает время циркулирования и стабильность по сравнению с белком ОВ или Fcмодификацией С-конца белка ОВ. Такие неожиданные преимущества Fc-модификаций белка ОВ будут важны для потребителей белка ОВ,поскольку подобные изменения обусловливают потребность в более низких дозах или более редких введениях. Таким образом, как описано далее более подробно, настоящее изобретение отличается рядом аспектов, относящихся к генетической модификации белков посредством слияния Fc-района с белком ОВ (или его аналогом), а также к специфическим модификациям,препаратам и способам их применения. Соответственно, в качестве одного из аспектов настоящего изобретения заявлен слитый белок Fc-OB, отличающийся тем, что Fc генетически слит с N-концом белка ОВ (или его аналога). Кроме того, фрагмент Fc может быть соединен с N-концом белка ОВ (или его аналога) посредством пептида или химических линкеров,известных из уровня техники. Как отмечалось выше и будет более подробно описано далее,слитый белок Fc-OB неожиданно оказался более защищенным от деградации, что привело к повышению времени циркулирования и стабильности по сравнению с белком ОВ или Fcмодификацией С-конца белка ОВ. Таким обра 004791 4 зом, дополнительным аспектом настоящего изобретения являются не только композиции на основе слитого белка Fc-OB, но и последовательности ДНК, кодирующие такие белки, соответствующие векторы и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, применяемые для получения слитых белков согласно настоящему изобретению. В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены способы получения слитого белка Fc-OB. К этим способам относятся технологии рекомбинантных ДНК, использумые для получения рекомбинантных белков. Кроме того, данный аспект также включает способы ферментации и очистки. В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены способы устранения избыточного веса у больного или животных,включая модуляцию жировых отложений введением слитых белков Fc-OB. С учетом характеристик слитого белка Fc-OB, рассматриваются способы снижения количества и/или частоты введения белка ОВ путем введения слитых белков Fc-OB. В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены терапевтические способы для лечения заболеваний, сопутствующих избыточному накоплению жира, таких как диабет,дис- и гиперлипидемии, атеросклероз, артериальные бляшки, а также для предотвращения образования или снижения вероятности образования желчных камней, повышения чувствительности к инсулину и/или увеличения мышечной массы. В качестве другого аспекта в настоящем изобретении заявлены соответствующие фармацевтические композиции белков Fc-OB, их аналогов и производных, применяемые для такой терапии. Краткое описание фигур Фиг. 1 - Рекомбинантная мышиная (двухцепочечная) ДНК metOB (SEQ.ID. Nos.1 и 2) и аминокислотная последовательность (SEQ.ID.(SEQ.ID. Nos.16 и 17) и аминокислотная последовательность (SEQ.ID. No.18). Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к композициям слитого белка Fc-OB, способам получения таких композиций и их применения. В частности, настоящее изобретение относится к генетически или химически слитому белку, состоящему из Fc-района иммуноглобулинов и Nтерминальной области белка ОВ. Неожиданно слияние Fc-района с N-концом белка ОВ привело к таким преимуществам, которых лишены белок ОВ или слитые белки Fc-района с Сконцом белка ОВ. Удивительно, но Nтерминальная модификация белка Fc-OB обеспечивает неожиданную защиту белка от деградации, повышает время циркулирования и стабильность. Соответственно, слитой белок FcOB, его аналоги и производные, а также способы их получения и применения описаны далее более подробно. КомпозицииFc-последовательность в последовательности рекомбинантного белка Fc-OB человека,приведенная в SEQ.ID. No.9 (см фиг. 3), может быть выбрана из тяжелой цепи иммуноглобулина IgG-1 человека, см. Ellison, J.M. et al., NucleicAcids Res. 10: 4071-4079 (1982), или любой другой последовательности Fc, известной из уровня техники (например, других классов IgG, к которым относятся (без ограничения перечисленными), IgG-2, IgG-3 и IgG-4, или других иммуноглобулинов). Могут быть сконструированы варианты, аналоги или производные Fc-компонента,например, производством различных замен остатков или последовательностей. Остатки цистеина можно делетировать или заменить другими аминокислотами для предотвращения образования дисульфидных связейFc-последовательностей. В частности, аминокислота в положении 5 SEQ.ID. No.9 является цистеиновым остатком. Последовательность рекомбинантного Fс-ОВ, SEQ.ID. No.9, состоит из 378 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Fc-OB на фиг. 3 обозначается как +1 с метионином в положении -1. Можно удалить остаток цистеина в положении 5 или заменить одной или несколькими аминокислотами. Остаток аланина можно заменить остатком цистеина в положении 6 с получением вариантной аминокислотной последовательности, приведенной на фиг. 4 (SEQ.ID.(не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Fc-OB на фиг. 4 обозначается как +1 с метионином в положении -1. Аналогично, цистеин в положении 5 последовательности SEQ.ID. No.9 может быть заменен серином или другим аминокислотным 6 остатком или же делетирован. Можно получить вариант или аналог путем делеции аминокислот в положениях 1, 2, 3, 4 и 5, как в вариантеSEQ.ID. No.15 (см фиг. 5). Замены, произведенные по этим положениям, также входят в объем настоящего изобретения. Рекомбинантный белок Fc-OB, приведенный на фиг. 5, состоит из 373 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Fc-OB на фиг. 5 обозначается как +1 с метионином в положении -1. Могут быть произведены модификации путем замены четырех аминокислот для удаления сайта связывания комплемента (Clq). В этой вариантной модификации последовательностиSEQ.ID. No.15 лейцин в положении 15 будет заменен глутаматом, глутамат в положении 98 будет заменен аланином, и лизин в положениях 100 и 102 будет заменен аланином (см. фиг. 6 иSEQ.ID. No.18). Рекомбинантный белок Fc-OB,приведенный на фиг. 6, состоит из 373 аминокислот (не считая остатка метионина). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Fc-OB на фиг. 6 обозначается как +1 с метионином в положении -1. Аналогично, один или несколько остатков тирозина можно заменить остатками фенилаланина. Дополнительно рассматриваются также другие вариантные аминокислотные вставки,делеции и/или замены, которые включены в объем настоящего изобретения. Кроме того,изменения могут быть осуществлены в виде введения измененных аминокислот, таких как пептидомиметики или D-аминокислоты. БелокFc может быть также соединен с белками ОВ в белке Fc-OB посредством химических или аминокислотных "линкерных" единиц различной длины. Такие химические линкеры хорошо известны из уровня техники. Последовательности аминокислотных линкеров могут включать, без ограничений перечисленными(л) любые комбинации компонентов с (а) до (к). ОВ-часть слитого белка Fc-OB может быть выбрана из набора рекомбинантных белков мыши, приведенного в SEQ.ID. No.3 (см. фиг. 1), или рекомбинантного белка человека, описанного Zhang et al., Nature, supra (работа, упоминаемая в качестве ссылки), или же такого белка с отсутствующим остатком глутаминила в положении 28 (См. Zhang et al., Nature, supra, на стр. 428). Может быть также использован аналог рекомбинантного белка OВ человека, пред 7 ставленный последовательностью SEQ.ID. No.6(см. фиг. 2), который содержит (1) аргинин вместо лизина в положении 35; и (2) лейцин вместо изолейцина в положении 74 (кратким обозначением этого аналога служит рекомбинантный человеческий RL35, IL74). Аминокислотные последовательности рекомбинантного человеческого и рекомбинантного мышиного белков или их аналогов, имеющих или не имеющих слитый фрагмент Fc на N-конце белка ОВ, приведены ниже с метионильным остатком в положении -1; однако, в случае любого из представленных белков ОВ или их аналогов, метионильный остаток может отсутствовать. Мышиный белок существенно гомологичен человеческому белку, что в особенности справедливо в отношении зрелого белка, и особенно по N-концу. Можно получить аналог рекомбинантного человеческого белка путем изменений (таких как замена аминокислотных остатков) в рекомбинантной человеческой последовательности. Поскольку рекомбинантный человеческий белок обладает биологической активностью на мышах, такой аналог, скорее всего, будет активен и в отношении человека. Например, при использовании человеческого белка, имеющего лизин в качестве остатка 35 и изолейцин в качестве остатка 74 согласно нумерации SEQ.ID. No.6, при том, что первая аминокислота является валином, а аминокислота в положении 146 - цистеин, можно заменить другой аминокислотой одну или несколько аминокислот в положениях 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74,77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136,138 и 145. Можно выбрать аминокислоту в соответствующем положении мышиного белка(SEQ.ID. No.3) или другую аминокислоту. Можно также получить "консенсусные" молекулы на основе последовательности белка ОВ крысы. См. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res.Comm. 209: 944-952 (1995), работа,цитируемая в качестве ссылки. Крысиный белок ОВ отличается от белка ОВ человека по следующим положениям (с использованием нумерации SEQ.ID. No.6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74,77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108,111, 118, 136, 138 и 145. Можно заменить другой аминокислотой одну или несколько аминокислот в этих различающихся положениях. Положения, обозначенные подчеркнутыми цифрами, это те положения, по которым белок ОВ мыши и белок ОB крысы отличаются от белкаOВ человека, и потому они особенно пригодны для замен. По одному или нескольким положениям аминокислоту соответствующего белка ОВ крысы можно заменить другой аминокислотой. Положения, которые в крысином и мышином белках ОВ отличаются от таковых в зрелом белке ОВ человека, следующие: 4, 32, 35, 50, 64,68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111,118, 136, 138 и 145. Согласно SEQ.ID. No.6 бе 004791 8 лок ОВ, в котором одна или несколько аминокислот заменены другими аминокислотами, такими, например, которые обнаруживаются в соответствующих крысиной и мышиной последовательности, также может быть эффективным. Аминокислоты, обнаруживаемые в белке ОВ макаки резус и отличающиеся от таковых в зрелом белке ОВ человека, таковы: 8(S), 35(R),48(V), 53(Q), 60(I), 66(I), 67(N), 68(L), 100(L),108(E), 112(D) и 118(L) (совпадения указаны в скобках с использованием однобуквенного кода аминокислот). Поскольку рекомбинантный белок ОВ человека активен в отношении обезьян циномолгус, может быть эффективен и белок ОВ человека с последовательностью SEQ.ID.No.6 (с лизином в положении 35 и изолейцином в положении 74), у которого одна или несколько дивергентных аминокислот заменены другой аминокислотой, такой как аминокислоты в скобках. Необходимо отметить, что отдельные дивергентные аминокислоты такие же, как и обнаруживаемые в мышином белке (положения 35, 68, 89, 100 и 112). Так, можно получить консенсусную молекулу "мышь/макака/человек",имеющую (с использованием нумерацииSEQ.ID. No.6, в которой имеются лизин в положении 35 и изолейцин в положении 74) одну или несколько аминокислот, замещенных другой аминокислотой: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102,105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 и 145. Могут быть получены и другие аналоги путем делеции части аминокислотной последовательности белка. Например, зрелый белок утрачивает лидерную последовательность (от-22 до -1). Можно получить следующие усеченные формы молекул белка OВ человека (с использованием нумерации SEQ.ID. No.6):(д) аминокислоты 1-99 и (соединенные с) 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111, вставленные между аминокислотами 99 и 112. Усеченные формы могут быть изменены по одной или нескольким аминокислотам, по которым белки OВ крысы, мыши или макаки резус отличаются от белка ОВ человека. Более того, изменения могут быть произведены в виде вставки измененных аминокислот, таких как пептидомиметики или D-аминокислоты. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит такой слитый белок Fc-OB, в котором белок ОВ выбран из следующего:(б) аминокислотная последовательность 1146, приведенная в SEQ. ID. No.6, имеющая остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74;(в) аминокислотная последовательность компонента (б), в которой различные аминокислоты заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации SEQ. ID. No.6): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71,74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108,111, 118, 136, 138, 142 и 145;(г) аминокислотная последовательность компонентов (а), (б) или (в), в которой дополнительно отсутствует глутаминиловый остаток в положении 28;(д) аминокислотная последовательность компонентов (а), (б), (в) или (г), имеющая на Nконце метионильный остаток;(е) усеченный аналог белка ОВ, выбранный из следующего (с использованием нумерации SEQ. ID. No.6):(v) аминокислоты 1-99 и 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111,вставленные между аминокислотами 99 и 112;(vi) усеченный ОВ аналог компонента (i), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111,118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(vii) усеченный аналог компонента (ii), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8 и 32 заменена другой аминокислотой;(viii) усеченный аналог компонента (iii), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77,78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 и 122 заменена другой аминокислотой;(ix) усеченный аналог компонента (iv), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64,66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136,138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(х) усеченный аналог компонента (v), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 78, 89,97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136,138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(xi) усеченный аналог любого из компонентов (i)-(х), имеющий N-терминальный метионильный остаток; и(ж) белок ОВ, аналог или производное в виде любого из компонентов от (а) до (е), содержащий химическую субстанцию, присоединенную к белку;(з) производное компонента (ж), при том,что данная химическая субстанция представляет собой водорастворимый полимер;(и) производное компонента (з), при том,что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;(к) производное компонента (з), при том,что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную субстанцию;(л) производное любого из компонентов от(з) до (к), при том, что данная субстанция присоединена исключительно к N-концу данного белка;(м) белок ОВ, аналог или производное в виде любого из компонентов от (а) до (л) в фармацевтически приемлемом носителе. Производные Заявленные слитые белки Fc-OB (термин"белок" включает понятия "пептид", Fc, OB или аналоги, описываемые в настоящей заявке, если не указано обратное) были дериватизированы присоединением одной или нескольких химических сущностей к слитому белку Fc-OB. Эти химически модифицированные производные могут впоследствии вводиться в состав фармацевтических форм, предназначенных для внутриартериального, внутрибрюшинного, внутримышечного,подкожного,внутривенного,орального, назального, пульмонарного, местного и других способов введения, которые обсуждаются далее. Показано, что при определенных условиях химические модификации биологически активных белков обеспечивают дополнительные преимущества, такие как повышенная стабильность и время циркулирования терапевтического белка и пониженная иммуногенность. См. патент США 4,179,337, Davis et al., опубликованный 18 декабря 1979. См. обзор: Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J.S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp.367-383 (1981; Francis et al., supra. Химические сущности, пригодные для подобной дериватизации, могут быть выбраны из различных водорастворимых полимеров. Выбранный полимер должен быть водорастворимым, с тем чтобы присоединенный к нему белок не преципитировал в водной среде, такой как физиологическое окружение. Для терапевтического применения конечного препарата предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Квалифицированный специалист способен выбрать нужный полимер с учетом изложенных соображений в зависимости о того, будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически, и если будет, то с учетом нужной дозировки, времени циркулирования, устойчивости к протеолизу и других условий. В отношении заявленных в настоящем изобретении белков и полипептидов эффективность дериватизации можно подтвердить введением производного в желаемой форме (например, при помощи осмотического насоса, или,что более предпочтительно, инъекцией или вливанием, или же в виде формы, предназначенной 11 для орального, легочного или назального применения) и отслеживанием биологических эффектов, как описано. Водорастворимый полимер может быть выбран из группы, включающей, например, полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу,декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6 триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры), декстран или поли(n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль,гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы и поливиниловый спирт. Пропиональдегид-полиэтиленгликоль может иметь преимущества для производства из-за его стабильности в воде. Могут использоваться также сукцинат и стирен. Белки OВ или Fc, используемые для получения слитого белка Fc-OB, можно модифицировать присоединением полиаминокислот или единичных боковых аминокислот к белку OВ или Fc (или аналогу). Например, полиаминокислота может служить дополнительным белком-носителем, который подобно белку Fc слит с белком OВ или его аналогом, и служить для увеличения срока циркулирования белка в дополнение к аналогичному эффекту, достигаемому за счет слияния Fc-OB. С учетом терапевтических и косметических целей настоящего изобретения, такие полиаминокислоты не должны обладать или не должны индуцировать антигенный ответ или другие нежелательные реакции. Такие полиаминокислоты могут быть выбраны из группы, включающей сывороточный альбумин (такой как альбумин сыворотки человека), дополнительное антитело или его фрагмент (например, Fc-район) или другие полиаминокислоты, например лизины. Как указывается далее, местом присоединения полиаминокислоты может быть N-конец белка Fc-OB,или С-конец, или другие места между ними; она может быть также присоединена к белку Fc-OB посредством химического "линкера". Полимер может иметь любой молекулярный вес и быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля, с учетом удобства в работе и целей производства, предпочтителен средний молекулярный вес от, примерно, 2 kDa до, примерно, 100 kDa (термин"примерно" указывает, что в препаратах полиэтиленгликоля некоторые молекулы имеют больший молекулярный вес, чем указано, а некоторые - меньший). В зависимости от желаемого терапевтического профиля (например,продолжительности поддерживаемого высвобождения, возможных эффектов на биологическую активность, простоты обращения, степени или отсутствия антигенности и других известных воздействий полиэтиленгликоля на тера 004791 12 певтический белок или его аналог), можно применять полиэтиленгликоль другого молекулярного веса. Количество присоединенных молекул полимера может варьировать, и квалифицированный специалист способен контролировать эффект данного фактора на функцию белка. Может быть осуществлена монодериватизация, или ди-, три-, тетра- или какая-либо комбинации дериватизаций с одной и той же или другой химической сущностью (например, такими полимерами, как полиэтиленгликоли различных молекулярных весов). Соотношение молекул полимера и молекул белка (или пептида) будет варьировать, так же, как и их концентрация в реакционной смеси. Вообще, оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, в которой нет избытка непрореагировавшего белка или полимера) может определяться такими факторами, как заданная степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.),молекулярный вес выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или линейным,и применяемыми условиями реакции. Химические субстанции должны присоединяться к белку с учетом воздействия на функциональные или антигенные домены белка. Имеется ряд способов присоединения, доступных квалифицированному специалисту, например ЕР 0 401 384, упоминаемый в качестве ссылки (присоединение ПЭГа к G-CSF), см. также Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035(1992) (описано пэгирование GM-CSF при помощи трезилхлорида). Например, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с белком через реакционноспособную группу, такую как свободная амино- или карбоксильная группа. Реакционноспособными группами являются такие, с которыми может быть связана активированная молекула ПЭГ. Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу,могут включать остатки лизина и N-концевой остаток аминокислоты. Таковые, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевой остаток аминокислоты. В качестве реакционноспособной группы для связывания с молекулой(-ами) ПЭГ могут быть использованы сульфгидрильные группы. Для терапевтических целей обычно предпочтительно присоединение по аминогруппе, например присоединение по N-концу или группе лизина. Присоединения по остаткам, важным для рецепторного связывания, надо избегать, если требуется рецепторное связывание. Может возникнуть потребность в получении слитого белка Fc-OB, специфически модифицированного по N-концу. Используя полиэтиленгликоль для иллюстрации заявленных композиций, исследователь может сделать выбор из разнообразия молекул полиэтиленгликоля (по молекулярному весу, разветвленности и 13 т.д.), определить соотношение молекул полиэтиленгликоля и молекул белка (или пептида) в реакционной смеси, тип проводимой реакции пэгирования и способ получения конкретногоN-терминально пэгированного белка. Способ получения N-терминально пэгированного препарата может включать очистку N-терминально пэгированного материала из популяции всех пэгированных молекул. СелективнаяNтерминальная химическая модификация может быть достигнута путем восстановительного алкилирования, при котором используется дифференциальная реактивность различных типов первичных аминогрупп (лизиновых против Nтерминальных), доступных для дериватизации в конкретном белке. При соответствующих условиях реакции достигается преимущественно селективная дериватизация белка по N-концу полимером, присоединенным через карбонильную группу. Например, можно селективно пэгировать белок по N-концу, проводя реакцию при таких значениях рН, которые позволяют использовать различия между рКа аминогруппой остатков лизина и таковым аминогруппы N-концевого остатка белка. Такой селективной дериватизацией контролируется присоединение водорастворимого полимера к белку: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концу белка и никакой существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи, не происходит. При применении восстановительного алкилирования водорастворимый полимер имеет единственную реакционноспособную альдегидную группу для соединения с белком. Можно использовать полиэтиленгликоль пропиональдегид, содержащий одну реакционноспособную альдегидную группу.N-терминально монопэгированное производное является предпочтительным в силу легкости получения терапевтического препарата.N-терминальное пэгирование обеспечивает получения гомогенного продукта, поскольку характеристика продукта облегчена по сравнению с ди-, три - или другими мультипэгированными продуктами. Применение описанного выше процесса восстановительного алкилирования для получения пэгированного по N-концу продукта является предпочтительным из-за простоты коммерческого производства. Комплексы Слитой белок Fc-OB, его аналог или производное можно назначать в виде комплекса со связывающей композицией. Такие связывающие композиции могут оказывать воздействие на пролонгирование времени циркулирования за те пределы, которые достижимы для слитого белкаFc-OB, его аналога или производного. Такой композицией может быть белок (или, синонимично, пептид). Примером связывающего белка служит рецептор белка ОВ или его фрагмент,такой как его растворимый фрагмент. Другие 14 связывающие белки могут быть определены исследованием белка ОВ или белка Fc-OB в сыворотке или эмпирическим скринингом на наличие связывания. Используемые связывающие белки обычно не должны интерферировать со способностью белка ОВ, слитых белков FcOB, их аналогов или производных связываться с эндогенным рецептором белка ОВ и/или влиять на передачу сигнала. Фармацевтические композиции В настоящем изобретении также заявлены способы применения фармацевтических композиций слитых белков Fc-OB и их производных. Такие фармацевтические композиции могут назначаться для инъекций, оральной, пульмонарной, назальной, трансдермальной и других форм введения. В целом, изобретением охватываются фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества белка и его производных, полученные согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции содержат растворители с различными буферами (например, Тris-НСl, ацетат, фосфат), различного рН и ионной силы; такие добавки, как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, Твин 80,Полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия),консерванты (например, тимерзол, бензиловый спирт и наполнители (например, лактоза, маннитол). Терапевтический материал может быть введен в конкретные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота,полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Может применяться гиалуроновая кислота, которая способствует поддержанию препарата в циркуляции. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность скорость высвобождения in vivo и скорость выведения invivo заявленных белков и их производных. См. например, Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), стр. 1435-1712, упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки. Композиции могут быть приготовлены в жидком виде или в виде сухого порошка, такого как лиофилизированная форма. Рассматриваются также имплантируемые формы для поддерживаемого высвобождения, так же, как и трансдермальные формы. Рассматриваются также оральные твердые дозировочные формы, которые описаны в целом в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) в Главе 89, работа, упоминаемая в настоящем описании в качестве ссылки. К твердым дозировочным формам относятся таблетки, капсулы,пилюли, пастилки или лепешки. Для создания фармацевтических форм заявленных композиций можно использовать липосомальную или протеиноидную инкапсуляцию (как, например, 15 протеиноидные микросферы, описанные в патенте США 4,925673). Можно использовать липосомпую инкапсуляцию, а липосомы дериватизировать различными полимерами (например, патент США 5,013,556). Описание возможных твердых дозировочных форм терапевтических средств дано Marshall, K. In: ModernRhodes, Глава 10, 1979, работа, упоминаемая в настоящем описании в качестве ссылки. В целом, фармацевтическая форма будет включать слитой белок Fc-OB, (его аналог или производное) и инертные ингредиенты, создающие защиту от желудочного окружения и высвобождающие биологически активный материал в кишечнике. Также специально рассматриваются оральные дозировочные формы дериватизированных белков. Слитой белок Fc-OB можно так химически модифицировать, что оральное применение производного окажется эффективным. Вообще, под химической модификацией подразумевают присоединение к молекуле белка (или пептида) по меньшей мере одной химической сущности, при том, что данная сущность делает возможным (а) подавление протеолиза и (б) поступление в кровоток из желудка или кишечника. Также желательно повысить общую стабильность белка и повысить время его циркулирования в организме. Примерами таких сущностей служат полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт,поливинилпирролидон и полипролин. Abuchowski"Enzymes as Drugs", Hocenberg and Roberts, eds.,Wiley-Interscience, New York, NY, (1981),стр.367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). К другим используемым полимерам относятся поли-1,3-диоксолан и поли 1,3,6-тиоксокан. Как указывалось выше, для фармацевтического применения предпочтительным является полиэтиленгликоль. В случае слитого белка Fc-OB, его аналога или производного местом высвобождения может быть тонкий кишечник (например, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка) или толстый кишечник. Квалифицированный специалист может выбрать такую конечную лекарственную форму, которая не будет растворяться в желудке, а будет высвобождать действующее начало в двенадцатиперстной кишке или еще где-либо в кишечнике. Предпочтительно при высвобождении избежать неблагоприятного воздействия среды желудка или защитой слитого белка Fc-OB, его аналога или производного, или же путем высвобождения биологически активного материала за пределами желудка, например в кишечнике. Для того чтобы противостоять агрессивному окружению в желудке, покрытие должно быть непроницаемо по меньшей мере при рН 16 5,0. Примерами наиболее обычных инертных ингредиентов, используемых для создания покрытий, устойчивых к желудочному соку, служат тримеллитат ацетатцеллюлозы (CAT), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР),НРМСР 50, НРМСР 55, Aquateric, фталат поливинилацетата (PVAP), Eudragit L30D, Eudragit L,Eudragit S и шеллак. Эти покрытия могут применяться в виде смешанных пленок. Покрытие или смесь покрытий может наноситься на таблетки не только для целей защиты от желудочного сока. К таким покрытиям относятся сахарное, а также покрытия, способствующие проглатыванию таблеток. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (например,желатиновой) для доставки сухого терапевтического агента, например порошка; для жидких форм можно использовать мягкую желатиновую оболочку. В качестве материала капсул можно использовать крахмал или другой съедобный углевод. Для приготовления пилюль, лепешек,сплавленных таблеток и порошковых таблеток можно использовать способ влажной формовки. Терапевтический агент может содержаться в конечной лекарственной форме в виде микрочастиц, гранул или чешуек размером около 1 мм. Материал, используемый для заполнения капсул, может иметь вид порошка, слегка спрессованных пробок или даже таблеток. Конечную лекарственную форму можно получить под давлением. Могут вводиться оцветители и ароматизирующие агенты. Например, белок (или производное) можно ввести в состав конечной формы(например, в липосомы или микросферы), а затем смешать со съедобным продуктом, таким как охлажденный напиток, содержащий оцветители и ароматизаторы. При необходимости разбавить терапевтический препарат или увеличить его объем, это достигается добавлением инертного материала. К таким наполнителям относятся углеводороды,особенно маннитол, -лактоза, безводная лактоза, целлюлоза, сахароза, модифицированные декстраны и крахмал. В качестве наполнителей могут применяться некоторые неорганические соли, такие как трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид калия. Среди коммерчески доступных наполнителей можно назвать FastFlo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress и Avicell. В твердую дозировочную форму терапевтического препарата могут входить разрыхлители. К материалам, используемым в качестве разрыхлителей, относятся, без ограничения перечисленными, крахмал и коммерческий разрыхлитель на основе крахмала, Explotab. Можно применять натриевый гликолат крахмала, амберлит, натриевую карбоксиметилцеллюлозу,ультрамилопектин, альгинат натрия, желатин,апельсиновую кожуру, кислую карбоксиметилцеллюлозу, натуральные губки и бентонит. Другим видом разрыхлителей являются нераство 17 римые катионобменные смолы. Как разрыхлители и связующие применяют такие порошковые смолы, как агар, карайя или трагакант. Альгиновая кислота и ее натриевая соль также используются в качестве разрыхлителей. Для поддержания препарата в виде твердой таблетки применяются связующие вещества, среди которых такие природные продукты,как гуммиарабик, трагакант, крахмал и желатин. Среди других связующих можно назвать метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу (ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (CMC). Поливинилпирролидон (PVP) и гидроксипропилметилцеллюлоза(НРМС) могут применяться для гранулирования терапевтического препарата в спиртовых растворах. Для предотвращения слипания в процессе приготовления конечной лекарственной формы в фармацевтический состав можно включать антифрикционные агенты. Любриканты можно использовать как прослойку между терапевтическим агентом и формовочной ячейкой. К ним относятся, без ограничения перечисленными,стеариновая кислота, включая ее магниевую и кальциевую соли, политетрафторэтилен (PTFE),жидкий парафин, растительные масла и воски. Могут применяться такие жидкие любриканты,как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различного молекулярного веса, Carbowax 4000 и 6000. Для повышения текучести препарата в процессе приготовления конечной лекарственной формы и для облегчения формовки под давлением могут применяться глиданты. К ним относятся крахмал, тальк, пирогенный кремний и гидратированный кремний алюминат. Для облегчения растворения терапевтического агента в водной среде в качестве увлажняющего агента может быть добавлено поверхностно-активное вещество. К таким поверхностно-активные веществам относятся такие катионные детергенты, как лаурилсульфат, диоктилнатрийсульфосукцинат и диоктилнатрийсульфонат. К используемым катионным детергентам относятся бензалкониумхлорид или бензетониумхлорид. В список возможных неионных детергентов, которые могут включаться в состав конечных форм в качестве поверхностноактивных веществ, входят также лауромакроголь 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрогенированное касторовое масло 10, 50 и 60, глицерин моностеарат, полисорбат 40, 60, 65 и 80, жирнокислый эфир сахарозы, метилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Эти поверхностно-активные вещества могут присутствовать в конечной форме белка или производного сами по себе или в смеси в различных пропорциях. К добавкам, которые значительно усиливают проникновение белка (или производного),относятся, например, такие жирные кислоты, 004791 18 как олеиновая кислота, линолевая кислота и леноленовая кислота. Могут потребоваться конечные формы для контролируемого высвобождения. Препарат можно заключить в инертный матрикс, который делает возможным высвобождение диффузией или выщелачиванием, например, в смолы или губки. В конечную форму могут быть также введены медленно дегенерирующие матриксы, например альгинаты, полисахариды. Другой формой контролируемого высвобождения является способ, основанный на терапевтической системеOros (Alza Corp.), согласно которой препарат заключен в полупроницаемую мембрану, через которую проникает вода и в силу осмотического эффекта вымывает препарат через небольшое отверстие. При получении конечных форм можно использовать и другие покрытия. К ним относятся различные сахара, применяемые для карамелизации. Терапевтический агент может также назначаться в виде покрытых пленкой таблеток, и используемые в этом случае материалы делятся на две группы. В первую входят такие неперевариваемые материалы, как метилцеллюлоза,этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилгидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, провидон и полиэтиленгликоли. Во вторую группу входят перевариваемые материалы, среди которых эфиры и фталевая кислота. Для получения оптимального пленочного покрытия можно использовать смесь материалов. Пленочное покрытие можно наносить карамелизацией, жидким способом или под давлением. Рассматривается также легочный (пульмонарный) способ доставки заявленного белка(или производного). Белок (или производное) попадает в легкие млекопитающего при вдыхании и через эпителиальную выстилку легких проникает в кровоток. (К другим работам на эту тему относятся: Adjei et at., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., InternationalInternal Medicine 3: 206-212 (1989) (1 антитрипсин); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989) (1-протеиназа); Oswein et al.,"Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on respiratory Drug Delivery II, Keystone,Colorado, March, 1990 (рекомбинантный гормон роста человека); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (интерферон- и фактор некроза опухолей ) и Platz et al., патент США 5,284,656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор).) 19 Для осуществления настоящего изобретения возможно применение широкого спектра механических устройств, разработанных для пульмонарного способа доставки терапевтических продуктов, включая, без ограничения перечисленными, распылители, дозирующие ингаляторы, порошковые ингаляторы, которые известны квалифицированным специалистам. К конкретным примерам коммерчески доступных устройств, приемлемых для осуществления настоящего изобретения, относятся распылитель Ultravent, производимый Mallinkrrodt, Inc., St. Louis, Missouri; распылительTriangle Park, North Carolina; распылитель Spinhaler, производимый Fisons Corp., Bedford,Massаchusets. Все подобные устройства предусматривают применение таких конечных лекарственных форм, которые приемлемы для дозировки белка(его аналога или производного). Обычно в состав таких конечных лекарственных форм, специфичных для типа используемого устройства,в дополнение к растворителям, адъювантам и/или носителям, необходимым для достижения терапевтического эффекта, входит веществопропеллант. Белок (или производное) предпочтительно приготавливать в виде диспергированной формы со средним размером частиц менее 10 мкм(или микрон), наиболее предпочтительно от 0,5 до 5 мкм для наиболее эффективной доставки в отдаленные альвеолы легких. К носителям относятся такие углеводороды, как трегалоза, маннитол, ксилитол, сахароза, лактоза и сорбитол. К другим ингредиентам,используемым в конечных формах, относятсяDPPC, DOPE, DSPC и DOPC. Можно применять природные или синтетические поверхностноактивные вещества. Используется полиэтиленгликоль (независимо от его применения для дериватизации белка или аналога). Можно применять декстраны, такие как циклодекстран. Можно применять желчные соли и другие подобные усилители. Можно применять целлюлозу и производные целлюлозы. Применимы аминокислоты, подобно тому, как они входят в состав буферов. Рассматривается также применение липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включений и других типов носителей. Конечная лекарственная форма, предназначенная для применения с помощью "реактивного" или ультразвукового распылителя,будет, как правило, содержать белок Fc-OB, его аналоги или производные, растворенные в воде в концентрации от около 0,1 до 25 мг биологически активного белка на мл раствора. Конечная форма может также содержать буфер и простой сахар (например, для стабилизации белка и под 004791 20 держания осмотического давления). Конечная форма, предназначенная для доставки с помощью распылителя, может содержать поверхностно-активное вещество для предотвращения или снижения поверхностно-индуцированной агрегации белка, вызванной атомизацией раствора при образовании аэрозоля. Конечные формы, предназначенные для доставки с помощью дозирующего ингалятора,обычно будут включать мелкодисперсный порошок, содержащий белок (или производное),суспендированный в пропелланте при помощи поверхностно-активного вещества. Пропеллантом может быть любой удобный материал, используемый для этой цели, такой как хлорфторкарбон, гидрохлорфторкарбон, гидрофторкарбон или гидрокарбон, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол, и 1,1,1,2-тетрафторэтан или их сочетания. К приемлемым поверхностно-активным веществам относятся сорбитан триолеат и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества может использоваться олеиновая кислота. Конечные формы, предназначенные для доставки в виде порошка с помощью порошкового ингалятора, будут включать мелкодисперсный сухой порошок, содержащий белок(или производное), а также могут включать наполнитель, такой как лактоза, сорбитол, сахароза, маннитол, трегалоза или ксилитол, в таких количествах, которые способствуют диспергированию порошка из дозатора, например, от 50 до 90% по весу. Рассматривается также назальный способ доставки белка (его аналога или производного). Назальное введение обеспечивает попадание белка в кровоток непосредственно после введения терапевтического препарата в нос, без необходимости депонирования продукта в легких. Формы для назального введения содержат декстран или циклодекстран. Рассматриваются также возможности транспорта через другие слизистые оболочки. Дозировка Квалифицированный специалист сможет убедиться в эффективности назначенной дозировки после ее назначения и отслеживания желаемого терапевтического эффекта. В силу Nтерминальной модификации белка ОВ настоящее изобретение обеспечивает неожиданную защиту белка от деградации, повышенное время циркулирования и стабильность по сравнению с белком ОВ или С-терминальной модификацией белка ОВ. Квалифицированный специалист сможет убедиться в том, что вследствие таких изменений эффективные дозировки могут предусматривать меньшие дозы или более редкие введения препарата. Предпочтительна такая конечная форма препарата, чтобы ее дозировка от около 0,10 мкг/кг/день до около 10 мг/кг/день обеспечива 21 ла желаемый терапевтический эффект. Эффективные дозировки можно определить при постоянном использовании диагностических тестов. Например, диагностический тест для определения белка ОВ или слитого белка Fc-OB в крови (или в плазме, или сыворотке) может быть применен исходно для определения эндогенного уровня белка. Такие диагностические инструменты могут иметь вид антительного теста, такого как сэндвич-тест на основе антител. Исходно оценивается эндогенный уровень белка и определяется его базальный уровень. Терапевтические дозировки назначаются с учетом количественных определений эндогенного и экзогенного белка ОВ или слитого белка FcOB (т.е. белка, аналога или производного, обнаруживаемого в организме, как уже имеющегося,так и введенного) в ходе лечения. По ходу лечения дозировки могут меняться от относительно высоких в начале курса до достижения положительного эффекта к более низким, поддерживающим дозировкам для сохранения терапевтического эффекта. Идеально, чтобы в тех ситуациях, когда требуется только снижение количества липидов в крови, поддержание низкого уровня липидов в крови или повышение мышечной массы тела,дозировки были бы недостаточны для потери веса. Так, в начальном курсе терапии ожиревшего больного могут назначаться такие дозировки, которые обеспечивают снижение веса и сопутствующее снижение уровня липидов крови или сопутствующее уменьшение жировой ткани/медленное нарастание массы. Когда достигается потеря веса, можно назначать дозу, достаточную для предупреждения обратного нарастания веса, достаточную для поддержания желаемых уровней липидов крови,медленного нарастания массы (или предупреждения медленного истощения). Эти дозировки могут быть определены эмпирически, поскольку эффекты белка ОВ и белка Fc-OB обратимы (напр., Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) на стр. 547). Так, если назначенная дозировка приводит к потере веса в тех случаях, когда она нежелательна, должны назначаться меньшие дозы для достижения нужного уровня липидов в крови или увеличения мышечной массы без потери веса. Для повышения индивидуальной чувствительности к инсулину должны приниматься во внимание аналогичные соображения. Увеличение мышечной массы без потери веса может быть достаточным для снижения доз инсулина(или, возможно, амилина, тиазолидинедионов или других сильных препаратов для лечения диабета), назначаемых больному для лечения диабета. Для повышения общей силы могут применяться аналогичные дозировки. Увеличение мышечной массы с сопутствующим повышением общей силы может быть достигнуто при 22 применении доз, недостаточных для потери веса. К другим положительным эффектам, достигаемым также без потери веса, относятся увеличение количества красных клеток крови (и, соответственно, оксигенации крови) и снижение резорбции костей или остеопороза. Сочетания Заявленные в настоящем изобретении способы могут быть использованы в сочетании с другими препаратами, такими как применяемые для лечения диабета (например, инсулин, возможно - тиазолидинедионы, амилин или их антагонисты), холестерин и медикаменты, снижающие кровяное давление (подобные тем, что снижают количество липидов в крови), или другие сердечно-сосудистые препараты, а также препараты, повышающие активность (напр. амфетамины). Могут также применяться препараты, подавляющие аппетит (такие, которые влияют на уровни серотонина или нейропептидаY). Подобные назначения могут осуществляться одновременно или последовательно. Кроме того, заявленные способы могут применяться в сочетании с хирургическими методами, такими как косметическая хирургия с целью изменения общего вида тела (например,липосакция или лазерная хирургия для снижения массы тела). Положительные эффекты сердечной хирургии, например аорто-коронарного шунтирования и других операций, направленных на ослабление болезненных состояний, которые вызваны закупоркой кровеносных сосудов жировыми отложениями, такими как артериальные бляшки, могут быть повышены сопутствующим применением заявленных композиций и способов. Такие методы удаления желчных камней, как ультразвуковой или лазерный,могут применяться до, во время или после использования заявленных терапевтических подходов. Более того, заявленные способы можно применять как дополнительные при хирургических и терапевтических способах заживления сломанных костей, поврежденных мускулов или в других случаях, когда повышение мышечной массы способствует выздоровлению. Следующие примеры приведены с целью более полного иллюстрирования изобретения и не ограничивают его объем. Пример 1. Применение мышиного белкаFc-OB для подкожных инъекций. Данный пример показывает, что подкожные инъекции мышиного белка Fc-OB приводят к потере веса у нормальных мышей. Нормальным (неожиревшим) мышам С 57 проводили подкожные инъекции мышиного белка Fc-OB в течение 22 дней. Дозировка в 10 мг белка/кг веса тела/день приводила к 14%-ной (+/-1,1%) потере веса от исходного значения к 22-му дню инъекций. Введение PBS приводило к 3,9%-ной(+/-3,3%) потере веса от исходного значения к 22-му дню инъекций. Потеря веса при дозировке 10 мг белка/кг веса тела/день у ожиревших 23 мышей CD1 составляла 10% (+/-4,3%) от исходного значения, а введение PBS приводило к 8,7%-ной (+/-1,3%) потере, в обоих случаях - к 22-му дню инъекций. Ниже приведены проценты (%) разницы от исходного значения в весе мышей CD1 (в возрасте 8 недель). Таблица 1 Снижение веса при подкожном введении Время,дни 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 13-14 15-16 17-18 19-20 21-22 Худые/Реком- Ожиревшие/Рекомбинантный слитой бинантный слитой белок Fc-OB белок Fc-OB Можно видеть, что к концу 22-дневного срока подкожных введений животные, получавшие белок Fc-OB, потеряли более 14,1% весаFc-OB 22 дня, продолжали терять в весе до 28 дня, т.е. 4 дня спустя после последней инъекции. Нормальные (неожиревшие) мыши CD1,которым подкожно вводили мышиный белокFc-OB в течение 22-х дней, потеряли 21% веса к 28-му дню по сравнению с исходными значениями, к 22-му дню эта потеря составляла 14%. Аналогично, ожиревшие мыши CD1, которым вводили мышиный белок Fc-OB в течение 22-х дней, потеряли 13% веса к 28-му дню по сравнению с исходными значениями, к 22-му дню эта потеря составляла 10%. На 34-й день потеря веса сохранялась на уровне 10% у ожиревших мышей и 5% у худых мышей. В контролях для каждой системы на сроках с 22-го по 34-й день отмечена средняя прибавка в весе, равная 4% для ожиревших мышей и 7% для худых. Пример 2. Использование белка Fc-OВ человека для подкожных инъекций мышам С 57. Данный пример показывает, что подкожные инъекции белка Fc-OB человека приводят к потере веса у нормальных мышей. Нормальным(неожиревшим) мышам С 57 проводили подкожные инъекции белка Fc-OB человека в течение 7 дней. Дозировка в 10 мг белка/кг веса тела/день приводила к 12%-ной (+/-1,3%) потере веса от исходного значения к 7-му дню инъекций. Дозировка в 1 мг белка/кг веса тела/день приводила к 8,9%-ной (+/-1,5%) потере веса от исходного значения к 7-му дню инъекций. Потеря веса при дозировке 10 мг белка/кг веса тела/день у ожиревших мышей С 57 составляла 1,1% (+/-0,99%) от исходного значения, а при(+/-1,1%), в обоих случаях - к 7-му дню инъекций. Результаты Ниже приведены проценты (%) разницы от исходного значения в весе мышей С 57 (в возрасте 8 недель). Таблица 2 Снижение веса при подкожном введении Время,дни 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 13-14 15-16 17-18 Можно видеть, что к 17-му дню после 7 дней инъекций в дозе 10 мг/кг/день животные,получавшие белок Fc-OB, восстановили 8% веса тела. Животные, получавшие дозировку 1 мг/кг/день в течение 7 дней, восстановили 6,4% веса тела через 12 дней. Эксперимент показал, что в течение восстановительного периода с 7-го по 22-й день,после последней инъекции на 7-й день, восстановление веса происходит медленнее у мышей,получавших Fc-OB, нежели у мышей, получавших OВ. Следовательно, белок Fc-OB выводится не столь быстро, как белок OВ, обусловливая тем самым более продолжительный эффект снижения веса. Пример 3. Дозозависимый ответ мышейCF7 на введение слитого белка Fc-ОВ. Дополнительное исследование показывает,что существует дозозависимый ответ на постоянное введение белка Fc-OB. В данном эксперименте ожиревшим мышам CF7 весом 35-40 г вводили рекомбинантный белок Fc-OB человека с использованием метода, описанного в предыдущем примере. Результаты приведены в табл. 3 ниже (% снижения веса тела сравнен с исходным значением, определенным, как описано выше). Таблица 3 Дозозависимый ответ при постоянном введении Доза Время % снижения веса тела 0,25 мг/кг/день День 5 4 0,5 мг/кг/день День 5 12 1 мг/кг/день День 5 16 Можно видеть, что повышение дозы с 0,25 до 1 мг/кг/день повышало потерю веса с 4 до 16%. Примечательно также, что на 5-й день дозировка 1 мг/кг/день приводила к снижению веса на 16%. В данном исследовании отмечена низкая скорость восстановления веса до 0%, что свидетельствует о медленном выведении белкаFc-OB, которое обусловливает продолжительный эффект снижения веса. Пример 4. Фармакокинетика рекомбинантного Fc-OB человека у мышей CD1 и собак. Целью настоящего эксперимента было исследование фармакокинетитических свойств рекомбинантного met-Fc-OB белка человека на мышах CD1 и собаках. После внутривенных или подкожных введений в дозе 1 мг/кг/день в сыворотках с помощью фермент-связанного иммуносорбентного теста (ELISA) определяли концентрации рекомбинантного met-Fc-OB человека. Для обоих видов отмечено более длительное воздействие по сравнению с рекомбинантным белком met-Fc-OB человека, которое количественно оценивали по более высоким пикам концентраций в сыворотке и большим площадям под кривыми концентраций (AUC). Fc-OB обладал более низким системным клиренсом,чем рекомбинантный met-OB белок человека. Это видно из низкого клиренса и более продолжительной полужизни по сравнению с белком ОВ. Это увеличение обусловлено не только увеличением стабильности белка, но также и снижением эффективности почечного клиренса. В результате, Fc-OB выводился из системной циркуляции медленнее. Повышенные пиковое время, пиковые концентрации в сыворотке и AUC для белка Fc-OB согласуются с низким клиренсом. Белок Fc-OB будет обеспечивать значительно более высокое системное воздействие,нежели белок ОВ. Результаты приведены ниже в табл. 4. Таблица 4 Фармакокинетические свойства Вид Способ введения Белок Белок Белок Белок Белок Белок ОВ Fc-OB OB Fc-OB OB Fc-OB 1 1 1 1 1 1 Пример 5. Данный пример показывает, что введение рекомбинантного белка Fc-OB человека нормальным, неожиревшим мышам с нормальным уровнем липидов в крови приводит к снижению уровней холестерина, глюкозы и триглицеридов. Кроме того, из данного примера следует,что эти уровни остаются низкими в течение трехдневного восстановительного периода. Нормальным мышам CD1 подкожно вводили рекомбинантный Fc-OB белок человека. Образцы крови брали через 24 ч после 23-го дня, последнего для инъекций. Как обсуждалось 26 выше, при используемых дозировках животные теряли в весе. Как видно из табл. 5, у мышей наблюдалось существенное дозозависимое снижение холестерина в сыворотке, глюкозы и триглицеридов по сравнению с контролем. Таблица 5 Доза Глюкоза Холестерин Триглицериды+/+/+/ Эти данные показывают, что белок Fc-OB или его аналоги и производные являются эффективными агентами, снижающими уровень липидов в крови. Пример 6. Пациенту, страдающему ожирением, вводили человеческий белок Fc-OB, его аналог или производное с целью снижения веса. У данного пациента также отмечено повышенное содержание липидов в крови, включая холестерин, до 200 мг/100 мл. В ходе терапии Fc-OB у пациента достигнуто удовлетворительное снижение веса. Похудевшему пациенту вводили поддерживающие дозы белка Fc-OB, его аналога или производного для поддержания низких уровней липидов в крови, включая сниженные (менее 200 мг/100 мл) уровни холестерина. Вводимые дозы были недостаточны для дальнейшего снижения веса. Введение препарата было постоянным. Количество циркулирующего белка FcOB, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо). Пример 7. Не страдающий ожирением пациент подвергся операции аорто-коронарного шунтирования или другому инвазивному лечению по поводу продвинутой стадии образования артериальных бляшек. После операции больному вводили поддерживающие дозы белка Fc-OB, его аналога или производного для предотвращения повторного образования артериальных бляшек. Вводимые дозы были недостаточны для снижения веса. Введение препарата было постоянным. Количество циркулирующего белка белка FcOB, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо). Пример 8. Не страдающий ожирением пациент страдал от гипертонии, обусловленной сниженным кровотоком по закупоренным артериям. Больному вводили дозу белка Fc-OB, его аналога или производного, достаточную для снижения 27 количества артериальных бляшек, обусловливающих закупорку артерий. Затем состояние больного контролировали в отношении гипертонии и последующего образования артериальных бляшек. Если гипертония возобновлялась,больному опять вводили эффективноое количество белка Fc-OB, его аналога или производного, достаточное для восстановления кровотока,но недостаточное для снижения веса. Количество циркулирующего белка белка Fc-OB, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо). Пример 9. Больной страдал желчекаменной боезнью. Желчные камни или не удаляли, и при этом считалось, что удастся избежать образования новых камней, или камни удаляли, но оставляли желчный пузырь (например, при использовании лазерной или ультразвуковой хирургии) и также предполагали, что удастся избежать образования новых камней. Пациенту вводили эффективное количество белка Fc-ОВ, его аналога или производного, что предотвращало накопление желчных камней и образование новых камней,мышечной массы. Количество циркулирующего белка белка Fc-OB, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо). Пример 10. Больному диабетом требовалось снижение доз инсулина, применяемых для лечения диабета. Пациенту вводили эффективное количество белка Fc-OB, его аналога или производного, что приводило к увеличению мышечной массы. Чувствительность больного к инсулину возрастала, и дозировки инсулина, необходимые для снятия симптомов диабета, можно было снизить как в отношении необходимого количества единиц инсулина, так и в отношении количества инъекций инсулина в день. Количество циркулирующего белка белка Fc-OB, его аналога или производного можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо). Пример 11. Не страдающему ожирением пациенту требовалось увеличение мышечной массы в терапевтических целях, в частности в ходе выздоровления от заболевания, приводящего к потере мышечной массы. Пациенту вводили эффективное количество белка Fc-OB, его аналога или производного, что приводило к желаемому увеличению мышечной массы. За увеличением мышечной массы следили при помощи DEXAсканирования. Количество циркулирующего белка Fc-OB, его аналога или производного 28 можно контролировать с помощью диагностического набора, такого как тест на основе антител к белку ОВ (или другого источника антигена, если это было применимо). Материалы и методы Животные В приведенных выше примерах использованы мыши DC1 дикого типа и мыши(+/+)С 57 В 16. Возраст мышей в начале эксперимента составлял 8 недель, а их вес был стабилизирован. Кормление и взвешивание Мыши получали измельченный корм для грызунов (PMI Feeds, Inc.) в кормушках для сухого корма (Allentown Caging and Equipment). Использование такого рациона давало возможность более точных и чувствительных замеров по сравнению с использованием обычного брикетированного корма. Взвешивание проводили в одно и то же время (2 часа дня) ежедневно в течение всего эксперимента. Вес тела за день до инъекции принимали за отправную точку. Вес использованных в экспериментах мышей составлял 18-22 г. Содержание Мышей рассаживали по одной в клетки, и их содержание соответствовало гуманитарным нормам. Введение белка или растворителя Белок (как описано ниже) или носитель(фосфатный буферный раствор, рН 7,4) вводили подкожными или внутривенными инъекциями. Контроли Контрольным животным вводили только носитель без слитого белка Fc-OB или белка ОВ. Белок Последовательности SEQ.ID. Nos.1, 2 и 3 кодируют рекомбинантные ДНК и белок ОВ мыши (фиг. 1), а последовательности SEQ.ID.Nos.4, 5 и 6 кодируют аналогичные рекомбинантные ДНК и белок ОВ человека (фиг. 2). Как упоминалось выше, рекомбинантный белок ОВ человека, кодируемый последовательностьюSEQ.ID. No.6, имеет остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74. Кроме того, рекомбинантный белок человека описан Zhang еt al., Nature, supra, и в публикации РСТ WO 96/05309, (обе работы включены в качестве ссылок, включая рисунки), а мышиный и человеческий аналоги рекомбинантных белков на фиг. 1 и 2 являются примерами белка ОВ,который можно использовать для получения слитого белка Fc-OB описанными способами,применяемыми для получения лекарства и для лечения. Для получения слитого белка Fc-OB могут быть использованы другие ОВ или Fc белки, их аналоги или производные. Соответственно, первая аминокислота в аминокислотной последовательности рекомбинантного белка ОВ обозначается как +1 и является валином, а аминокислота в положении -1 метионин. С-терминальная аминокислота имеет 29 номер 146 (цистеин) (см. фиг. 1 и 2). Первая аминокислота в последовательности рекомбинантного белка Fc-OB человека на фиг. 3 обозначается как +1 и является глутаматом, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота с номером 378 - цистеин. Первая аминокислота в последовательности вариантного рекомбинантного белка Fc-OB человека на фиг. 4 обозначается как +1 и является глутаматом, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота имеет номер 378 (цистеин). Первая аминокислота в последовательности вариантного рекомбинантного белка Fc-OB человека на фиг. 5 обозначается как +1 и является аспарагиновой кислотой, а аминокислота в положении-1 является метионином. С-терминальная аминокислота имеет номер 373 (цистеин). Первая аминокислота в последовательности вариантного рекомбинантного белка Fc-OB человека на фиг. 6 обозначается как +1 и является аспарагиновой кислотой, а аминокислота в положении -1 является метионином. С-терминальная аминокислота имеет номер 373 (цистеин). Вектор экспрессии и штамм-хозяин Использовали плазмидный вектор экспрессии pAMG21 (номер доступа в АТСС 98113),который является производнымpCFM1656 (номер доступа в АТСС 69576) и содержит соответствующие сайты рестрикции для вставки генов "ниже" промотора lux PR (см. патент США 5,169,318, в котором описана система экспрессии lux). Была получена ДНКpAMG21, линеаризованный эндонуклеазами рестрикции NdeI и BamHI, и полученным лигатом трансформировали клетки-хозяева E. coli,штамма FM5. Клетки Е.соli FM5 получены вcoli K-12 (Bachman, et al., Bacterial. Rev. 40: 116167 (1976 и содержат интегрированный ген репрессора фага лямбда cI857 (Sussman et al.,C.R. Acad. Sci. 254:1517-1579 (1962. Получение вектора, трансформацию клеток и отбор колоний осуществляли стандартными методамиLaboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Клетки-хозяева выращивали на среде LB. Конструкция ДНК Fc-OB Плазмида pFc-А 3 (описана ниже) служила источником последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина человека IgG-1 от аминокислоты номер 99 (Glu) до природного карбоксиконца. Последовательность IgG-1 человека можно получить из Genebank (P01857). Последовательность ОВ человека описана выше, а также Zhang et al., Nature, supra, и в публикации РСТ WO 96/05309, упоминаемых в качестве ссылок, включая рисунки. ДНК ОВ лигировали в вектор экспрессии pCFM1656, 004791XbaI и BamHI с использованием стандартных процедур клонирования, например, Sambrook, etEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. Плазмида pCFM1656,несущая последовательность ДНК ОВ, служила источником последовательности для рекомбинантного гена ОВ человека. Генетическое слияние двух данных последовательностей осуществляли методом перекрывающейся полимеразной цепной реакцииChain Reaction, Gene 77:51-59 (1989. Продукт ПЦР разрезали эндонуклеазой рестрикции NdeI с получением липкого 5'-конца и эндонуклеазой рестрикции BamHI с получением липкого 3'конца. Вектор pAMG21 рестрицировали аналогично. Лигирование проводили со слитым фрагментом и линеаризованным вектором. Лигированной ДНК трансформировали посредством электропорации хозяйский штамм E. coli. Клоны, выросшие на чашках с агаром (50 мкг/мл), проверяли на экспрессию белка,имеющего размер Fc-OB. Выделяли плазмиды из индивидуальных клонов и секвенировали для установления кодирующей области гена. Когда требовались дополнительные модификации гена Fc-OB, для создания таких изменений опять же использовали метод ПЦР. Два набора изменений было осуществлено на Nконце Fc-фрагмента слитого белка (SEQ.ID.No.9) с получениeм вариантов SEQ.ID. Nos.12 и 15. Был получен другой вариант с введением четырех аминокислотных замен с тем, чтобы удалить сайт связывания Fc-рецептора (лейцин в положении 15 заменен глутаматом) и сайт связывания комплемента (Clq) (глутамат в положении 98 заменен аланином, лизин в положении 100 заменен аланином, и лизин в положении 102 заменен аланином) (cм. Xin Xiao Zhenget al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995. Матрицей для данного конструкта служила SEQ.ID.No.15, а полученный вариант был обозначенSEQ.ID. No.18. Конструирование вектора pFC-А 3 Плазмида pFC-А 3, содержащая Fcфрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина IgG-1 человека (cм. Ellison, J.W. et al., Nucleic Acidsres. 10: 4071-44079 (1982 от первой аминокислоты Glu-99 смыслового домена до карбоксиконца плюс 5'-NotI сайт слияния и 3'-SalI и XbaI сайты, была получена ПЦР-амплификацией кДНКовой библиотеки селезенки человека. ПЦР проводили в конечном объеме 100 мкл с использованием 2 единиц ДНК полимеразы Vent в 20 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 10 мМ KCl, 10 мМ(NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0,1% Тритон Х-100 с 40 мМ каждого dNTP и 1 нг кДНКовой библиотеки, которая должна быть амплифицирована, с 1 мкМ каждого праймера. Реакцию начинали с денатурации при 95 С в течение 2 мин, за которой следовали 30 циклов: 95 С 30 с, 55 С 30 с и 73 С 2 мин. 5'-праймер содержал сайт NotI в непосредственной близости к первому 5' остатку (Glu-99) основного домена IgG-1. 3'-праймер содержал сайты SalI и XbaI. Продукт ПЦР размером 717 пар оснований рестрицировали NotI и SalI, полученный фрагмент ДНК выделяли электрофорезом в 1% агарозе, очищали и клонировали в рестрицированный NotI и SalI вектор Bluescript II KS (Stratagene). Вставку в полученную плазмиду, pFC-А 3, секвенировали для подтверждения надежности ПЦР. Методы получения Описанные ниже методы получения были использованы для продукции биологически активного рекомбинантного метионилированного аналога белка OВ мыши и человека, а также слитых белков Fc-OB. Аналогичные методы можно использовать для получения биологически активного метионилированного белка OВ человека. Процесс ферментации Использовали прерывистый процесс ферментации. Состав среды приведен ниже. Ту часть среды, которая содержала в основном источники азота, стерилизовали (поднятием температуры до 120123 С на 25-35 мин) в ферментере. После охлаждения асептически добавляли углерод, магний, фосфат и микроэлементы (соли металлов). В ферментер вносили 500 мл ночной культуры (выращенной в LB бульоне) рекомбинантных бактерий, продуцирующих мышиный белок. Когда оптическое поглощение культуры (определенное при 600 нм, оно является показателем плотности культуры) достигало 15-25 единиц поглощения, к культуре добавляли раствор аутоиндуктора (0,5 мг/мл гомосерин лактона) (1 мл/л) для индукции экспрессии рекомбинантного гена. Процесс ферментации продолжали еще 10-16 ч, а затем бульон собирали центрифугированием. Состав среды: 34 г/л Дрожжевой экстракт 78 г/л Соевый пептон 0,9 г/л Хлорид калия 5,0 г/л Гексафос 1,7 г/л Лимонная кислота 120 г/л Глицерин 0,5 г/лMgSO47H2O 0,2 мл/л Раствор солей металлов 0,5 мл/л Антивспениватель Р 2000 Раствор солей металлов: Хлорид железа (FеСl36 Н 2 О) Хлорид цинка (ZnCl24H2O) Хлорид кобальта (CoCl26 Н 2O) Молибдат натрия (NaMoO42H2O) Хлорид кальция (CaCl22 Н 2O) Сульфат меди (CuSO45H2O) Борная кислота (Н 3 ВО 3) Процесс очистки слитого человеческoго белка Fc-OB Очистку слитого белка Fc-OB человека проводили согласно описанным ниже этапам(все этапы осуществляли при температуре 4 С,если специально не оговорено другое). Очистка белка OВ мыши и человека описана в публикации РСТ WO 96/05309, supra, упоминаемой в качестве ссылки. 1. Клеточная паста. Клеточную пасту E.coli суспендировали в пятикратном объеме дистиллированной воды. Затем суспенидированные в воде клетки разрушали двукратным пропусканием через микрогомогенизатор. Разрушенные клетки центрифугировали 1 ч при 4,2 тыс.об./мин в центрифуге Beckman JB-6 с ротором J5-4.2. 2. Промывка телец-включений. Полученный супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 5 объемах дистиллированной воды. Смесь центрифугировали так же, как на этапе 1. 3. Солюбилизация. Осадок солюбилизировали 10 объемами 50 мМ трис, рН 8,5, 8 М гуанидингидрохлорид, 10 мМ дитиотрейтол и пeремешивали 1 ч при комнатной температуре. В раствор добавляли цистамин дигидрохлорид и перемешивали еще 1 ч. 4. Раствор со стадии 3 добавляли к 20-30 объемам следующего раствора для рефолдинга: 50 мМ трис, рН 8,5, 0,8 М аргинина, 2 М мочевина и 4 мМ цистеина. Рефолдинг проводили при помешивании в течение 16 ч при 8 С. 5. Смена буфера. Раствор со стадии 4 концентрировали и подвергали диафильтрации в 10 мМ трис, рН 8,5. 6. Преципитация кислотой. рН раствора со стадии 5 доводили до рН 4,75 50%-ной уксусной кислотой и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем раствор фильтровали. 7. Катионобменная хроматография. рН раствора со стадии 6 доводили до рН 7,0 и наносили на колонку CM Sepharose Fast Flow при 10 С. Через колонку пропускали 20 объемов градиента от 0 до 0,1 М NaCl в 10 мМ фосфата,рН 7,0. 8. Анионобменная хроматография. Пул,элюированный с СМ Sepharose на этапе 7, разводили в 5 раз 5 мМ трис, рН 7,5 и наносили на колонку Q Sepharose Fast Flow. Через колонку пропускали 20 объемов градиента от 0 до 0,2 МNaCl в 10 мМ трис, рН 7,5. 9. Хроматография гидрофобного взаимодействия. В собранный с Q Sepharose пул добавляли сульфат аммония до 0,75 М и наносили на колонку гидрофобного взаимодействия Масrорrер при комнатной температуре. Через колонку пропускали 20 объемов градиента от 0,75 до 0 М сульфата аммония в 10 мМ фосфата, рН 7,0. 33 10. Смена буфера. При необходимости собранный на этапе 9 пул концентрировали и диализовали против PBS. При том, что настоящее изобретение описано в терминах предпочтительных вариантов осуществления, для квалифицированного специалиста очевидно, что возможны определенные изменения и модификации. Поэтому считается, что приведенная ниже формула изобретения включает все подобные эквивалентные вариации, которые входят в объем настоящего изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Белок с формулой, выбранной из группыR1-R2 и R1-L-R2, где R1 является белком Fc, его производным или аналогом, R2 является белком лептином, его производным или аналогом, a L представляет собой линкер, причем белок Fc, его производное или аналог выбраны из группы, включающей(а), у которых различные аминокислоты делетированы или заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации SEQ.ID. No.9):(i) один или несколько остатков цистеина заменены остатками аланина или серина;(ii) один или несколько остатков тирозина заменены остатком аланина;(ix) для удаления сайта связывания Fcрецептора один или несколько остатков заменены или делетированы;(х) для удаления сайта связывания комплемента (Clq) один или несколько остатков заменены или делетированы; и(а) или (б) с метионильным остатком на Nконце;(г) белок Fc, аналог или производное в виде любой из последовательностей от (а) до (в),содержащий химическую часть, присоединенную к белку;(д) производное белка (г), характеризующееся тем, что указанная химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;(е) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;(ж) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;(з) производное белка (д), характеризующееся тем, что указанная химическая часть присоединена исключительно к N-концу данного белка; белок лептин, его аналог или производное выбраны из группы, включающей(б) аминокислотную последовательность 1-146, приведенную в SEQ.ID. No.6, имеющую остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74;(б), в которой различные аминокислоты заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации SEQ.ID.(а), (б) или (в), в которой дополнительно отсутствует глутаминиловый остаток в положении 28;(е) усеченный аналог белка лептина, выбранный из следующего (с использованием нумерации SEQ.ID. No.6 с остатком лизина в положении 35 и остатком изолейцина в положении 74):(v) аминокислоты 1-99 и 112-146, имеющие одну или несколько аминокислот 100-111,вставленных между аминокислотами 99 и 112;(е) (i), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 100, 102, 105, 106, 107,108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(е) (ii), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8 и 32 заменена другой аминокислотой;(viii) усеченный аналог последовательности (е) (iii), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 50, 53, 60, 64, 66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107,108, 111 и 122 заменена другой аминокислотой;(е) (iv), в котором одна или несколько из сле 35 дующих аминокислот 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118,136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(е) (v), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71,74, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111,118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(xi) усеченный аналог любой из последовательностей(ж) белок лептин, аналог или производное его в виде любого из вариантов от (а) до (е),содержащий химическую часть, присоединенную к белку;(з) производное белка (ж), характеризующееся тем, что указанная химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;(и) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;(к) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;(л) производное любого из белков от (з) до(к), характеризующееся тем, что указанная химическая часть присоединена исключительно кN-концу данного белка; причем линкер выбран из группы, включающейR1-L-R2, где R1 является белком Fc, его производным или аналогом, R2 является белком лептином, его производным или аналогом, a L представляет собой линкер, у которой белок Fc, его производное или аналог выбраны из группы, включающей(а), у которых различные аминокислоты делетированы или заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации SEQ.ID. No.9):(i) один или несколько остатков цистеина заменены остатками аланина или серина;(ii) один или несколько остатков тирозина заменены остатком аланина;(ix) для удаления сайта связывания Fcрецептора один или несколько остатков заменены или делетированы;(х) для удаления сайта связывания комплемента (Clq) один или несколько остатков заменены или делетированы; и(а) или (б) с метионильным остатком на Nконце;(г) белок Fc, аналог или производное в виде любой из последовательностей от (а) до (в),содержащий химическую часть, присоединенную к белку;(д) производное белка (г), характеризующееся тем, что указанная химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;(е) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;(ж) производное белка (д), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;(з) производное белка (д), характеризующееся тем, что указанная химическая часть присоединена исключительно к N-концу данного белка; белок лептин, его производное или аналог выбраны из группы, включающей(б) аминокислотную последовательность 1-146, приведенную в SEQ.ID. No.6, имеющую остаток лизина в положении 35 и остаток изолейцина в положении 74;(б), в которой различные аминокислоты заменены в одном или нескольких из следующих положений (с использованием нумерации SEQ.ID.(г) аминокислотную последовательность (а),(б) или (в), в которой дополнительно отсутствует глутаминиловый остаток в положении 28;(е) усеченный аналог белка лептина, выбранный из следующего (с использованием нумерации SEQ.ID. No.6 с остатком лизина в положении 35 и остатком изолейцина в положении 74):(v) аминокислоты 1-99 и 112-146, имеющиe одну или несколько аминокислот 100-111,вставленных между аминокислотами 99 и 112;(е) (i), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 100, 102, 105, 106, 107,108, 111, 118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(е) (ii), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8 и 32 заменена другой аминокислотой;(viii) усеченный аналог последовательности (е) (iii), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 50, 53, 60, 64, 66, 67,68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107,108, 111 и 122 заменена другой аминокислотой;(е) (iv), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53,60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118,136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(е) (v), в котором одна или несколько из следующих аминокислот 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71,74, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111,118, 136, 138, 142 и 145 заменена другой аминокислотой;(xi) усеченный аналог любой из последовательностей (е) (i)-(x), имеющий N-терминальный метионильный остаток;(ж) белок лептин, аналог или производное его в виде любого из вариантов от (а) до (е),содержащий химическую часть, присоединенную к белку;(з) производное белка (ж), характеризующееся тем, что химическая часть представляет собой водорастворимый полимер;(и) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль;(к) производное белка (з), характеризующееся тем, что данный водорастворимый полимер представляет собой полиаминокислотную часть;(л) производное любого из белков от (з) до(к), характеризующееся тем, что данная часть присоединена исключительно к N-концу данного белка; причем линкер выбран из группы, включающей(м) любые комбинации с (а) до (л). 3. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.2. 4. Вектор по п.3, отличающийся тем, что вектор является pAMG21, a последовательность нуклеиновой кислоты соответствует п.2. 5. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.3. 6. Способ получения белка по п.1, включающий этапы культивирования в соответствующих условиях клетки-хозяина по п.5 и выделения продуцируемого белка. 7. Способ по п.6, включающий дополнительно этап очистки продуцируемого белка. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество белка по п.1 в фармацевтически приемлемом растворителе,адъюванте или носителе. 9. Способ лечения расстройств, выбранных из группы, включающей избыточный вес, диабет,высокий уровень липидов крови, атеросклероз,артериальные бляшки, предотвращение или снижение образования желчных камней, недостаточную массу тела, недостаточную чувствительность к инсулину и инсульт, отличающийся введением терапевтически эффективного количества белка по п.1.