Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА АСПАРТ ПРИ ПОМОЩИ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ Изобретение относится к способу производства инсулина аспарт с высокими производительностью и выходом с помощью биотехнологического процесса, включающего трансформацию штамма дрожжей Pichia pastoris векторами, кодирующими предшественник инсулина аспарт,культивирование рекомбинантного штамма, выделение предшественника инсулина аспарт и его энзиматическое расщепление до зрелого инсулина аспарт с последующей очисткой. Также изобретение касается конструкции ДНК и кассет экспрессии, используемых в заявленном способе получения инсулина аспарт. Настоящее изобретение относится к способу производства аналога человеческого инсулина с высокой производительностью и отличным выходом с помощью биотехнологического процесса, включающего трансформацию штамма дрожжей Pichia pastoris. В частности, изобретение относится к биотехнологическому процессу получения инсулина аспарт. Предпосылки создания изобретения Диабет - это болезнь, характеризующаяся уровнями глюкозы в крови выше нормы. Диабет возникает, когда поджелудочная железа не вырабатывает достаточно инсулина или когда организм становится невосприимчивым к воздействию инсулина. В обоих случаях в результате глюкоза не поступает в клетки, а вместо этого накапливается в крови. Инсулин - это гормон, играющий важную роль в углеводном обмене. Он выделяется поджелудочной железой для уравновешивания концентрации глюкозы в кровотоке после приема пищи. Однако некоторые патологии приводят к недостаточному или даже нулевому выделению этого полипептида поджелудочной железой и, таким образом, больным, страдающим от определенных болезней, необходимо вводить различные количества этого гормона. Аналоги инсулина представляют собой вещества, полученные модификацией структуры нативного инсулина, что ведет к значительным вариациям способа его действия. Структурные модификации дали,например, аналоги, обладающие растворимостью, отличающейся от растворимости нативного инсулина,тем самым контролируя после инъекции скорость выделения гормона в кровоток. Это позволяет ускорять или замедлять его биологическое воздействие, удовлетворяя специфические потребности пациента. В настоящее время имеются два коммерчески доступных аналога длительного действия: инсулин гларгин и инсулин детемир. Эти аналоги демонстрируют более длительное действие (20-30 ч для гларгина и 20-22 ч для детемира) без пиков действия, по сравнению с инсулином NPH. Эти фармакокинетические отличия, видимо, преобразуются в положительную динамику при режиме введения (каждые 24 ч для гларгина или 1-2 раза в день в зависимости от потребностей пациента для детемира) и в более равномерные уровни в плазме и теоретическое снижение при гипогликемии (особенно при ночных гипогликемиях). Аналогично этому, в настоящее время имеются три коммерчески доступных быстродействующих аналога: инсулины лизпро, аспарт и глулизин. Указанные три аналога имеют сходные фармакокинетические профили, но отличающиеся от таковых человеческого инсулина быстрого действия. Они имеют более быстрое начало и более короткую продолжительность действия, что лучше моделирует эндогенную реакцию прандиального инсулина. Эти характеристики способствуют их введению непосредственно перед приемом пищи или даже после приема пищи, тем самым исключается рекомендуемый период ожидания 15-30 мин после введения привычного инсулина. Различные научные публикации подтверждают,что использование быстродействующего инсулина обеспечивает улучшенный контроль глюкозы по сравнению с обычным инсулином, что повышает качество жизни больных диабетом."Быстродействующие" производные можно получить путем модификации некоторых аминокислот В цепи инсулина, как представлено, например, в патенте США 5618913. В вышеупомянутом документе описаны аналоги человеческого инсулина, в которых аминокислота в позициях В 9, В 12, В 27 и В 28 была замещена и в которых упомянутое изменение было достаточным для уменьшения самоассоциации и достижения более быстрого действия гормона после введения. Кроме того, в патенте США 6521738 описано большое разнообразие предшественников инсулина и аналога инсулина, которые все содержат различные мини-С пептиды, связывающие инсулиновые В и А цепи. Вышеупомянутые пептиды содержат как минимум одну ароматическую аминокислоту, сайт расщепления для протеаз, представленный лизином или аргинином аминокислот, в которых пептидная связь между А цепью и пептидным линкером разорвана, и ароматический остаток, расположенный непосредственно на N-конце к сайту расщепления протеазы. В патенте США 7378390 представлены примеры предшественников дез-В 30 типа, в котором пролин В 28 замещен аспарагиновой кислотой. Представленные предшественники включают глициновую аминокислоту в пептидном линкере с расположенной сбоку основной аминокислотой, выбираемой из лизина и аргинина. Согласно описанию в вышеупомянутых патентах в предшественниках инсулина или предшественниках аналога инсулина либо отсутствует треониновая аминокислота, присутствующая в позиции В 30,обозначающая молекулы предшественника мини-С-инсулин дез-В 30 или дез-В 30, либо эта аминокислота заменена другой. Следовательно, в этих случаях должен быть добавлен соответствующий остаток посредством химического процесса, названного транспептидацией. Как правило, производство человеческого инсулина с помощью технологий рекомбинантной ДНК выполняется экспрессией проинсулин-подобного предшественника, в котором В и А цепи соединены полной С цепью, таким образом создаются молекулы инсулина мини-С типа, где инсулиновые В и А цепи соединены пептидами разных размеров и последовательностей. Наиболее часто используемые системы экспрессии для получения инсулина и аналогов человеческого инсулина включают микроорганизмы Escherichia coli (кишечная палочка) и Saccharomyces (сахаромицеты) cerevisiae. В первом случае их можно получить в виде цитоплазматического белка (Frank etal., 1981, in Peptides: Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium - Пептиды: Протоколы 7-го американского симпозиума по химии пептидов, RichGross, eds., Pierce Chemical Co., Rockford, III,p. 729-739) или сплавлением с сигнальным пептидом для обеспечения выделения в периплазматическое пространство (Chan et al., PNAS, 1981; 78:5401-5404). Когда экспрессия происходит при посредстве телец включений, высокие концентрации аберрантно свернутого рекомбинантного белка получают с помощью связи типа дисульфидного мостика и связи водородным мостиком, вызывая взаимодействия между молекулами. Для получения биологически активного продукта бактерии должны быть разорваны, а тельца включений должны быть отделены и растворены для выделения представляющего интерес пептида. Последний затем подвергается рефолдингу invitro, пока не будет достигнута его нативная структура. Хотя использование Saccharomyces cerevisiae (Thim, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1986; 83:6766-6770; US 4916212; US 6190883) в качестве хозяина для экспрессии предшественников инсулина или аналогов инсулина не дает такие высокие уровни экспрессии, как достигаемые в бактериях, оно не требует стадий ренатурации, потому что дрожжи могут производить выделение белка во внеклеточное пространство, таким образом создавая пептид с соответствующей вторичной конформацией. Использование этой системы экспрессии включает ферментацию дрожжей для выделения предшественника в культуральную среду; захват продукта из супернатанта, трансформацию предшественника в зрелый продукт и, наконец, окончательную очистку. Во время перемещения из эндоплазматической сети в аппарат Гольджи образуются дисульфидные связи, которые приведут к молекулам инсулина или их аналогам,имеющим должным образом образованные дисульфидные мостики. Однако, несмотря на тот факт, что использование S. Cerevisiae имеет преимущество благодаря своему простому процессу очистки и что фолдинг молекул in vitro не является необходимым, такое использование также имеет недостаток, по сравнению с Е. coli, низких уровней экспрессии и, следовательно,низкий выход инсулина. Использование метилотрофных дрожжей в качестве систем экспрессии для рекомбинантных белков дает значительные преимущества, когда необходимо производить большие массы продукта, требующие больших объемов ферментации (Cregg, J.M. et al., Mol. Cell Biol., 9:1316-1323, 1989; Cregg, J.M. et al.,Bio/Technology 11:905-910, 1993). Использование этой системы предусматривает культуры с высокой плотностью клеток в определенном солевом растворе минимальной питательной среды (Brierley, R.A. et al., Ann NY Acad Sci, 1990; 589:350-362), имеющие эффективные посттрансляционные модификации (Digan, M.E., et al., in: Pierce G.,ed., Development in industrial microbiology - Разработки в промышленной микробиологии, 1988; Vol. 29,Amsterdam: Elsevier Science, P59-65), низкое выделение эндогенных белков во время экспрессии и выделение представляющего интерес белка, кроме того, при сильном метанол-индуцибельном промоторе,поддающиеся точному регулированию. В патенте США 7091032 тех же авторов, что и в настоящей заявке, описано использование вышеупомянутых дрожжей при производстве человеческого инсулина, патент включен в текст данной заявки в качестве ссылки полностью. Наиболее успешные в настоящее время продаваемые аналоги инсулина - это инсулин гларгин(LANTUS) и инсулин аспарт (инсулин Aspart). Первый является аналогом замедленного эффекта, который достигает своего действия за счет добавления двух основных аминокислот на карбоксильном конце В цепи. Эти модификации приводят к сдвигу изоэлектрической точки инсулина с 5,4 до 7, что снизит растворимость при физиологическом значении рН, таким образом продлевая его поглощение из участка инъекции. Этот аналог инсулина получен в Е. coli. Поэтому, как упоминалось ранее, его предшественник должен быть соответствующим образом ренатурализован, снова образуя соответствующие дисульфидные мостики. Второй из вышеупомянутых аналогов, инсулин аспарт, получен в дрожжах Saccharomyces cerevisiae путем экспрессии предшественника мини-С-дезВ 30 типа. В этом случае необходимо выполнить реакции расщепления и транспептидации с целью добавления аминокислоты треонин в позиции В 30. Как указано в предыдущих публикациях авторами настоящего изобретения, использование метилотрофных дрожжей, особенно принадлежащих к роду Pichia pastoris, для получения инсулина и аналогов инсулина в промышленном масштабе обеспечивает гораздо более высокие выходы, чем достигаемые при использовании любой из вышеупомянутых микробиологических систем экспрессии. В этом смысле в патенте США 7091032 указывается, что при использовании предшественников мини-С-типа, в которых В цепь имеет полную аминокислотную последовательность, нет необходимости выполнять процесс транспептидации, который применяется в любом из ранее упомянутых традиционных методов. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения инсулина аспарт, включающему:i) трансформацию штамма дрожжей Pichia pastoris как минимум двумя векторами экспрессии, имеющими различные селектируемые маркеры, при этом каждый вектор включает конструкцию ДНК, кодирующую предшественник инсулина аспарт формулы B(1-30)-X1-Y-X2-A(1-21);ii) отбор из штаммов, трансформированных на стадии i) MUT S рекомбинантных штаммов, которые содержат более 5 копий конструкций ДНК, интегрированной в геном дрожжей;iii) отбор из рекомбинантных штаммов стадии ii) штамма, имеющего самое большое число копий и самый высокий уровень экспрессии предшественника инсулина аспарт;v) выделение предшественника инсулина аспарт из культуральной среды с помощью хроматографии;vi) энзиматическое расщепление предшественника в условиях, пригодных для преобразования как минимум 70% предшественника инсулина аспарт в зрелый инсулин аспарт;vii) очистку инсулина аспарт, полученного с помощью расщепления, обычными хроматографическими методами. В частности, в упомянутой конструкции ДНК, кодирующей предшественник инсулина аспарт, X1 выбирают из Lys и Arg и предпочтительно X1 - это Arg. В другом конкретном примере осуществления настоящего изобретения в упомянутой конструкции ДНК, кодирующей предшественника инсулина аспарт, Y выбирают из Trp, Phe и Tyr и предпочтительно Y - это Trp. Также, в частности, в упомянутой конструкции ДНК, кодирующей предшественник инсулина аспарт, Х 2 выбирают из Lys и Arg и предпочтительно Х 2 - это Arg. Одним из предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения является способ получения инсулина аспарт, включающий клонирование упомянутой конструкции ДНК в вектор экспрессии pPIC-9, который содержит последовательность промотора гена AOXI Pichia pastoris, функционально связанную с сигнальной последовательностьюфактора скрещивания [MF] Saccharomyces cereviciae, функционально связанной с кодирующей последовательностью предшественника аналога человеческого инсулина, которая далее функционально связана с последовательностью завершения транскрипции Pichia pastoris, которая связана с селектируемым маркером HIS4 Pichia pastoris, связанным с 3'конечной последовательностью AOXI гена. В другом предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения в способе получения инсулина аспарт упомянутая конструкция ДНК клонируется в вектор экспрессии pPICZA, состоящий из последовательности промотора AOXI Pichia pastoris, функционально связанной с сигнальной последовательностьюфактора скрещивания Saccharomyces cerevisiae, функционально связанной с кодирующей последовательностью предшественника аналога человеческого инсулина, которая далее функционально связана с последовательностью завершения транскрипции Pichia pastoris, связанной с селектируемым маркером зеоцина [Zeocin]. В следующем предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения способ получения инсулина аспарт в соответствии с настоящим изобретением включает отбор MUTS клона, содержащего 5 или более копий конструкции ДНК. В частности, способ включает ферментацию отобранного MutS клона с помощью ферментативного процесса, где культуральная среда, рН и температура такие, что предшественник инсулина аспарт будет соответствовать мажорному белку, выделенному в культуральную среду. Более подробно, способ получения инсулина аспарт включает i) выращивание упомянутогоMut S клона в биореакторе с применением периодического процесса, с добавлением первого субстрата,ii) выращивание упомянутого Mut S клона в биореакторе с применением периодического процесса с подпиткой с добавлением второго субстрата, iii) индуцирование упомянутого Mut S клона в биореакторе с применением периодического процесса с подпиткой с добавлением третьего субстрата. В вышеупомянутом специфическом процессе первым субстратом может быть минимальная среда, состоящая из водного раствора, включающего источник углерода, следовый солевой раствор и биотин, а вторым субстратом может быть подпитывающая среда, состоящая из водного раствора, включающего источник углерода, следовый солевой раствор, биотин и метанол. Далее, третьим субстратом может быть среда индукции экспрессии, состоящая из 100% раствора метанола, включающего следовый солевой раствор и биотин. В частности, источник углерода выбирают из группы, состоящей из глицерина, глюкозы, фруктозы, сорбита и маннозы, предпочтительно это глицерин или глюкоза. Согласно способу получения инсулина аспарт в соответствии с настоящим изобретением наиболее важные примеси пептида обнаружены в ферментационном супернатанте, содержащем не более 8% предшественника инсулина аспарт, как показывают результаты HPLC хроматографии. В соответствии с одним из конкретных примеров осуществления настоящего изобретения способ получения инсулина аспарт включает отбор из упомянутого супернатанта, предшественника аналога, с помощью процесса хроматографии. Более подробно, процесс включает расщепление предшественника инсулина аспарт формулы I протеазой трипсин-типа при соответствующих значениях рН и температуры,-3 022946 чтобы как минимум 75% упомянутого предшественника трансформировались в промежуточный продукт формулы II: B31Arg инсулин аспарт. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - схема конструкции pPIC9-InsAspRWR; фиг. 2 - схема конструкции pPICZA-InsAspRWR. Подробное описание изобретения Согласно пояснениям в разделе "Предпосылки создания изобретения" выше, существует все возрастающая потребность в аналогах инсулина указанного типа. Кроме того, особенно важно разработать способ эффективного производства "инсулина аспарт" с высоким выходом. Поэтому авторами настоящего изобретения разработан новый способ производства упомянутого аналога, включая экспрессию предшественника типа мини-С-инсулин аспарт в дрожжах Pichiapastoris. Принимая во внимание результаты, полученные авторами настоящего изобретения в способе производства человеческого инсулина, раскрытого в аргентинском патенте AR 025646 В 1, и принимая во внимание, что единственным различием между упомянутой молекулой и инсулином аспарт является замещение пролина аспарагиновой кислотой в позиции 28 В-цепи человеческого инсулина, было принято решение в основном работать над предшественником формулы Asp28 B(1-30)-Lys-Arg-A(1-21). Эту конструкцию гена, клонированную в два разных вектора экспрессии, использовали для трансформации дрожжей Pichia pastoris и затем для отбора клонов с высокой экспрессией с применением способа, подобного способу, описанному в патенте США 7091032. Однако и неожиданно был получен очень низкий уровень экспрессии предшественника аналога при использовании любого из отобранных клонов. После проведения молекулярного анализа определили, что сходные результаты были получены для тех клонов,которые содержали большое количество копий (более 5 копий), а также для клонов с малым количеством копий (менее 5 копий) и для MUT+ или MUTS дрожжей. Основываясь на этих результатах, авторы решили модифицировать линкер пептида, и на основе идей патента США 7087408 решили добавить к этому пептиду ароматическую аминокислоту с расположенными по бокам основными аминокислотами, выбранными из Lys или Arg и предпочтительно Arg аминокислотами. Соответственно с помощью упомянутого линкера пептида был создан новый предшественник, имеющий формулу где AspB28, B(1-30) представляет полную В-цепь человеческого инсулина, в которой аминокислотный пролин В 28 заменен аспарагиновой кислотой; А(1-21) представляет А-цепь человеческого инсулина;X1 выбирают из лизина и аргинина;Y - это ароматическая аминокислота и Х 2 выбирают из лизина и аргинина. Таким образом, как ни удивительно, авторами было установлено, что при трансформации штаммаGS115 HIS- Pichia pastoris этой новой конструкцией гена были получены клоны, способные выделять концентрации как минимум 400 мг/л предшественника инсулина аспарт в культуральную среду. Такой результат наблюдался как для MUT+, так и для MUTs клонов. Кроме того, как указывалось выше, концентрация выделенного продукта пропорциональна количеству копий, интегрированных в Pichia геном. Так был разработан новый способ производства предшественника инсулина аспрат, где аналог присутствует в очень подходящих концентрациях для промышленного производства. Способ включает трансформацию метилотрофных дрожжей рода Pichia конструкцией гена типа мини-С-инсулин аспарт формулы I, которая не использовалась прежде и не требует выполнения процедур транспептидации. Кроме того, авторами разработан ферментативный процесс, который минимизирует появление ряда загрязнителей, спонтанно образующихся в условиях дрожжевой культуры. Поэтому были определены необходимые ферментативные условия для минимизации появления таких побочных продуктов, которые приводят к значительному снижению выхода представляющего интерес продукта. В частности, были внесены модификации в ранее разработанный ферментативный процесс получения человеческого инсулина. А именно, были изменены значения рН и температуры и созданы новые условия для добавления метанола на стадии индукции. В другом конкретном примере осуществления настоящего изобретения были установлены оптимальные условия для энзиматической обработки и последующей очистки, чтобы получить инсулин аспарт высокой чистоты с помощью простого и дешевого способа производства. Авторами также разработан новый способ получения аналога человеческого инсулина. В новом способе используются метилотрофные дрожжи в качестве хозяев экспрессии и новый предшественник типа мини-С-инсулин; новый способ дает высокие концентрации предшественника пептида, который может трансформироваться в зрелую форму аналога под действием двух ферментов. При использовании способа в соответствии с настоящим изобретением становятся ненужными дополнительные химические процессы, например конструкция дисульфидных мостиков или процессы транспептидации. Используемый для получения предшественника процесс ферментации был оптимизирован регули-4 022946 рованием рН, температуры и скорости добавления субстрата на стадии периодического процесса с подпиткой и индукции. Было установлено, что, неожиданно, небольшие модификации этих переменных привели к удивительным изменениям концентрации предшественника и количества некоторых примесей, образующихся при разложении основного продукта. Дополнительный пример осуществления настоящего изобретения включает процесс ферментации, который может обеспечить концентрацию предшественника как минимум 400 мг/л при содержании примесей в пределах от 3 до 8% на окончательной стадии процесса ферментации. Согласно процессу в соответствии с настоящим изобретением экспрессированный дрожжами продукт высвобождается в культуральную среду и захватывается с помощью процесса ионообменной хроматографии. В соответствии с настоящим изобретением последовательность предшественника мини-Синсулина, описанного в аргентинском патенте AR 025646 В 1 того же заявителя, модифицируется заменой остатка Пролин В 28 аспарагиновым остатком. Один предпочтительный пример способа в соответствии с настоящим изобретением включает использование вектора pPIC9InsAspRWR для трансформацииGS115 P. pastoris дрожжей (His4) (Invitrogen), отбор Muts и Mutr клонов и их отделение в минимальной питательной среде при наличии гистидина. После этого выполняется ретрансформация Muts клонов при помощи вектора pPICZAInsAspRWR и отбора высокопроизводительных клонов. Другие аспекты изобретения для получения высокопродуктивных дрожжевых клонов состоят в трансформации GS115 штамма (His4) двумя векторами экспрессии pPIC9InsAspRWR и pPICZAInsAspRWR одновременно. В каждом из этих клонов сайт интеграции кассеты экспрессии в геноме дрожжей анализируется так же, как и количество копий гена, кодирующих предшественник аналога "инсулина аспарт" (SEQ ID NO: 1). Клоны, демонстрирующие наилучшую экспрессию, культивировали в масштабе, в ферментативном процессе, подобном раскрытому в аргентинском патенте AR 025646 В 1; предшественник выделили из ферментативной среды с помощью хроматографического процесса с использованием ионообменной смолы SP-SEPHAROSE-FF или QA-SEPHAROSE-HP типа. Продукт, элюирующий из колонны, расщепляется трипсином и одновременно или последовательно он расщепляется ферментом карбоксипептидазы В, в результате получается зрелый продукт или аналог инсулина. Неожиданно обнаружить предшественника мини-С типа, как, например, используемого в способе в соответствии с настоящим изобретением,который, хотя и отличается от предшественника в соответствии с аргентинским патентом AR 025646 В 1 для получения человеческого инсулина, обеспечивает получение высоких концентраций пептида во время ферментативного процесса. Важным решением, приводящим к способу в соответствии с настоящим изобретением, является использование линкера пептида X1YX2 типа, объединяющего ароматическую аминокислоту, расположенными сбоку двумя основными аминокислотами Lys или Arg типа. Выбор этой последовательности улучшает расщепление предшественника ферментом трипсина, тем самым минимизируется нежелательный разрыв на других остатках основных аминокислот, как, например, В 29 Lys. Таким образом, как ни удивительно, авторы установили, что последовательное добавление трипсина и карбоксипептидазы В ферментов вызывает процессы расщепления, воспроизводимые и легко стандартизируемые согласно повторяющейся структуре расщепления и трансформации предшественника в зрелый продукт или инсулин аспарт. Дополнительной целью изобретения является новый штамм метилотрофных дрожжей. В прототипе отсутствует доктрина, описывающая штаммы метрофильных дрожжей, в особенности штаммы P.pastoris, способные продуцировать предшественника аналога "инсулина аспарт", в котором получен аналог человеческого инсулина, известный как аспарт аналог. Штамм дрожжей в соответствии с настоящим изобретением экспрессирует некоторые количества молекулы мини-С-инсулина аспарт. Упомянутый штамм дрожжей был получен с помощью нового способа, включающего последовательную или одновременную трансформацию и ретрансформацию дрожжей новой конструкцией ДНК. Мини-С-инсулин аспарт, выделяемый в питательную среду новым штаммом, является предшественником аналога "инсулина аспарт". Упомянутый предшественник - это предпочтительно предшественник, у которого С-пептид заменен последовательностью трех аминокислот и где в процессе получения активного инсулина аспарт вырабатывается незначительное количество загрязнителей, тем самым исключаются стадии транспептидации, не вызывая снижения требуемого промышленного выхода продукта. Кроме того, упомянутые конструкции ДНК были клонированы таким образом, что стадия удаления оставшихся аминокислот из сигнального пептида становится ненужной. При использовании штамма и конструкций ДНК в соответствии с настоящим изобретением достигаются уровни производства предшественника инсулина аспарт как минимум 400 мг/л ферментации, которые считаются в значительной степени отвечающими требованиям производства в промышленном масштабе. Структура предшественника инсулина аспарт (miniC-Asp), которая также является целью изобретения, была получена из предшественника пептида человеческого инсулина типа мини-С-инсулин, как описано в патенте США 7091032. Способ получения упомянутой структуры включает использование последовательности предшественника мини-С-инсулина (SEQ ID NO: 1) формулы B(1-30)-Lys-Arg-A(121) в качестве матрицы, с Pichia pastoris кодонами, описание которых дано в патенте США 7091032. В эту последовательность введены следующие модификации: а) пролин В 28 аминокислота предшественника заменена аспарагиновым остатком; а) дипептид -Lys-Arg-, соединяющий цепи В и А инсулина, заменен трипептидом -Arg-Trp-Arg-. Таким способом был получен предшественник инсулина аспарт формулы В 28 Asp(1-30)-Arg-TrpArg-A(1-21). Были выполнены последовательно три ПЦР (PCR) реакции. В первой реакции вектор pPIC9Ins, содержащий мини-С-инсулин с Pichia кодонами и мини С Lys Arg последовательность, описанную в SEQID NO: 1, был использован в качестве матрицы; при этом праймерами были SEQ ID NO: 2, которая скрещивается с АОХ 1 промотором, и SEQ ID NO: 3, гомологичная 3'-части гена и содержащая модификации кодона сса на gac, которые кодируют остаток 28 в цепи В, и aag aga на aga tgg aga, которые кодируют 3 аминокислоты мини-С. Продукт первой ПЦР реакции использовали в качестве матрицы во второй ПЦР реакции, которая была проведена для увеличения молекулы инсулина аспарт. Праймерами были SEQ ID NO: 2, которая вступает в реакцию с АОХ 1 промотором, и SEQ ID NO: 4, гомологичная 3'-концу синтезированного фрагмента. Продукт второй ПЦР реакции использовали в качестве матрицы в третьей PCR реакции, которая была проведена для добавления клонирующего сайта AvrII на 3'-конце гена. Праймерами были SEQ IDNO: 2 и SEQ ID NO: 5, гомологичные 3'-концу синтезированного фрагмента, содержащего последовательность расщепления для AvrII фермента. Продукт реакции (SEQ ID NO: 6), расщепленный ферментами BamHI и AvrII, был лигирован при 16 С в течение 12 ч, с вектором pPIC9, предварительно расщепленным обоими ферментами. Из реакции лигирования взяли 5 мкл для трансформации 100 мкл компетентных DH5-бактерий. Анализ рекомбинантных колоний был проведен рестрикционным картированием плазмидных ДНК с помощью HpaI иPCR с праймерами, указанными в последовательностях SEQ ID NOs: 2 и 4. С помощью этого способа был получен показанный на фиг. 1 вектор pPIC9InsAspRWR. Трансформации дрожжей штамма Pichia pastoris GS115 вектором pPIC9InsAspRWR, расщепленнымI), происходит с частотой 5-35% между His+ трансформантами. Фрагмент ДНК, содержащий конструкцию ДНК в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой "кассету экспрессии", которая используется для трансформации метилотрофных дрожжей. Эта кассета экспрессии включает промотор, чувствительный к метанолу, который соответствует АОХ I гену метилотрофных дрожжей, последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, конструкцию ДНК, соответствующую предшественнику аналога "инсулина аспарт", последовательность завершения транскрипции и HIS4 ген, кодирующий гистидинол дегидрогеназу, все расположены между 5'- и 3'-концами АОХ I гена. В соответствии с настоящим изобретением любой линейный или круговой сайт-специфичный вектор взаимодействия может использоваться для трансформации дрожжей без изменения их ориентации. В кассете экспрессии в соответствии с настоящим изобретением можно использовать любую сигнальную последовательность, способную к надлежащему экспорту предшественника инсулина. Предпочтительно может использоватьсяMF сигнальная последовательность S. cerevisiae, представляющая собой пептид 13 аминокислотных остатков. Лидерная последовательность или сигнальный пептид с фактором скрещивания [MF] имеет сайт расщепления протеазы, определяемый аминокислотной последовательностью Lys-Arg-Glu-Ala. В дрожжах есть несколько метанол-чувствительных генов. Экспрессия каждого из этих генов контролируется 5' регуляторными областями, чувствительными к метанолу, известными как промоторы. Любая из таких 5' регуляторных последовательностей пригодна для использования в качестве промоторов в конструкции ДНК в соответствии с настоящим изобретением. Примеры регуляторных областей включают, без ограничения, промотор первичного гена фермента алкогольоксидазы (АОХ 1) Pichia pastoris, промотор вторичного гена фермента алкогольоксидазы II (АОХ 2), промотор гена диоксиацетон синтетазы (DAS) P. Pastoris, промотор Р 40 гена P. Pastoris, промотор гена каталазы P. Pastoris и GAP промотор глицеральдегид Р дегидрогеназы. Предпочтительно может использоваться промотор первичного гена фермента алкогольоксидазы (АОХ 1) Pichia pastoris, поскольку он очень эффективен для обеспечения высоких уровней экспрессии гена. Специалисту в данной области будет понятно, как выбрать наиболее пригодный промотор или регуляторные области для осуществления настоящего изобретения. В конкретном примере осуществления настоящего изобретения предпочтительно использовать 5' регуляторные области, чувствительные к метанол-содержащей питательной среде. 3'-последовательности завершения транскрипции в соответствии с настоящим изобретением пригодны для завершения, полиаденилирования и стабилизации мРНК, кодированной геном предшественника аналога "инсулина аспарт". Могут использоваться характеристические последовательности завер-6 022946 шения семейства метилотрофных дрожжей и предпочтительно 3'-последовательности завершения Pichiapastoris. Кассета экспрессии также содержит ген селектируемого маркера. Для этого может использоваться любой ген селектируемого маркера, функциональный в метилотрофных дрожжах, отобранный, без ограничения, из любого гена, сообщающего метилотрофным дрожжам селектируемый фенотип, который обеспечивает положительный отбор дрожжей, трансформированных конструкцией ДНК в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с настоящим изобретением любая система, включающая P. Pastoris штамм-хозяин ауксотрофного мутанта и биосинтетический ген дикого типа, дополняющий дефекты хозяина, может использоваться в качестве маркера. Предпочтительно может использоваться HIS4 ген, кодирующий гистидинол дегидрогеназу, и штамм ауксотрофного мутанта. Кассета экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, используемая для трансформации метилотрофных дрожжей, представляет специфическую характеристику способности быть вставленной в геном дрожжей-хозяина с помощью гомологичной рекомбинации 5'- и 3'-концами эндогенного гена дрожжей АОХ 1. Таким образом, упомянутый эндогенный ген заменяется кассетой экспрессии в соответствии с настоящим изобретением. Конструкция ДНК в соответствии с настоящим изобретением может вставляться в любой вектор,функциональный в бактериях (химерный вектор), где векторы включали бы селектируемые маркеры и сайты репликации, пригодные для бактерий. Векторы могут быть кольцевыми, образующими плазмиды с внехромосомной репликацией в бактериях. Конструкции ДНК, содержащиеся в кассетах экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться для трансформации метилотрофных дрожжей согласно любому стандартному методу трансформации для дрожжей. Методы трансформации включают, но не ограничиваются этим,методику электропорации, продуцирование сферопластов, трансформацию в хлориде лития и трансформацию с использованием PEG 1000. Предпочтительно можно использовать продуцирование сферопластов и методы электропорации. Трансформация может выполняться линейными или кольцевыми плазмидами или векторами экспрессии, или их фрагментами. Кассета экспрессии, содержащая конструкцию ДНК предшественника, направлена на ген-мишень в геноме дрожжей между последовательностями достаточной гомологии к гену-мишени для кассеты экспрессии, интегрируемой на сайте, на который она была направлена. В одном предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения как минимум одна копия кассеты экспрессии, содержащая конструкцию ДНК в соответствии с настоящим изобретением, интегрируется в геном-хозяин с соответствующей ориентацией. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой штамм метилотрофных дрожжей. Примеры метилотрофных дрожжей включают, но не ограничиваются этим, род Pichia, Torulopsis, Hansenula и Candida. Однако предпочтительные дрожжи - это штамм GS115 рода Pichia pastoris(ATCC NO. 20864), который содержит мутировавший HIS4 ген и, следовательно, представляет собойHIS". Среди His+ трансформантов интеграция кассеты экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, которая заменяет структурный АОХ 1 ген в геноме штамма GS115, происходит с частотой примерно от 5 примерно до 35%. Событие замены структурного АОХ 1 гена в геноме дрожжей вырабатывает дрожжи, обозначенные Muts, чувствительные к использованию метанола в качестве источника углерода. Любой специалист в данной области признает, что кассета экспрессии в соответствии с настоящим изобретением может быть также интегрирована одним из ее 5'- или 3'-концов АОХ 1 гена, при этом получаются Mutr дрожжи, устойчивые к использованию метанола в качестве источника углерода (потому что они сохранили функциональный АОХ 1 ген). Кроме того, кассета экспрессии в соответствии с настоящим изобретением может быть также интегрирована в геном дрожжей рекомбинацией с дрожжевымHis геном, последовательность которого является также частью кассеты экспрессии. Аналогичным образом конструкция ДНК может быть интегрирована на различных сайтах в геноме дрожжей. Клоны, трансформированные конструкцией ДНК в соответствии с настоящим изобретением, можно отбирать любым из известных в данной области методов. Для различия клонов His+ Mutr и His+ Muts предпочтительно проводятся эксперименты по репликации планшета. Альтернативно, клоны продуцента можно отбирать с помощью иммунохимических методов. Каждый из Muts и Mutr клонов, отобранных с использованием любого из вышеупомянутых методов,может быть субклонирован и выделен в виде чистых клонов. Из отобранных клонов выбрали клоны, которые продуцируют адекватные количества предшественника инсулина. Их охарактеризовали, а количество копий конструкции ДНК в соответствии с настоящим изобретением проанализировали. Таким образом, определили несколько клонов, продуцирующих соответствующие количества предшественника аналога, некоторые из них Muts, а другие Mutr. В другом конкретном примере осуществления настоящего изобретения мини-С-InsAspRWR вставка может быть субклонирована в вектор pPICZA. Для этой цели вектор pPIC9InsAspRWR был расщеплен ферментами SaCI и NotI; фрагмент, содержащий представляющий интерес ген, был очищен от геля с помощью реагента QIAEX II (Promega) и лигирован с вектором pPICZA, предварительно расщепленным теми же рестриктивными ферментами. Полученную таким образом конечную конструкцию обозначилиpPICZAInsAspRWR, показана на фиг. 2. Упомянутый вектор содержит новую кассету экспрессии (вторую кассету экспрессии), включающую чувствительный к метанолу промотор АОХ 1 гена метилотрофных дрожжей, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, конструкцию ДНК, кодирующую предшественник мини-СInsAspRWR, последовательность завершения транскрипции и селектируемый ген, отличающийся от используемого в первой кассете экспрессии. В соответствии с настоящим изобретением может использоваться любая сигнальная последовательность, обеспечивающая выделение предшественника инсулина. Среди возможных сигнальных последовательностей имеются последовательности, отобранные из, но не ограниченные этим, сигнальных последовательностей изMF сахаромицетов (S. cerevisiae), и сигнальная последовательность щелочной фосфатазы. В конкретном примере осуществления настоящего изобретения использование сигнальной последовательности изMF сахаромицетов (S. cerevisiae) предпочтительно, что соответствует пептиду 13 аминокислотных остатков. В соответствии с настоящим изобретением любая 5' регуляторная последовательность пригодна в качестве промотора во второй кассете экспрессии. Примеры регуляторных областей включают, но не ограничиваются этим, промотор первичного гена фермента алкогольоксидазы (АОХ 1) Pichia pastoris,промотор вторичного гена фермента алкогольоксидазы II (АОХ 2), промотор гена диоксиацетон синтетазы (DAS) P. Pastoris, промотор Р 40 гена P. Pastoris, промотор гена каталазы Р. Pastoris и GAP промотор гена глицеральдегид дегидрогеназы. Предпочтительно может использоваться промотор первичного гена фермента алкогольоксидазы (АОХ 1) Pichia pastoris, поскольку он очень эффективен для обеспечения высоких уровней экспрессии гена. Также предпочтительны 5' регуляторные области, чувствительные к метанол-содержащей питательной среде. Однако специалист в данной области сможет выбрать другие промоторы или регуляторные области, которые можно использовать в кассете экспрессии в соответствии с настоящим изобретением. 3'-последовательности завершения транскрипции второй кассеты экспрессии в соответствии с настоящим изобретением пригодны для завершения, полиаденилирования и стабилизации мРНК, кодированной геном предшественника инсулина. Согласно настоящему изобретению могут использоваться характеристические последовательности завершения, принадлежащие к семейству метилотрофных дрожжей, предпочтительно могут использоваться 3' последовательности завершения из Pichia pastoris. Вторая кассета экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, содержит ген селектируемого маркера. Любой ген селектируемого маркера, функциональный в метилотрофных дрожжах, может использоваться, пока он отличается от гена, используемого в предыдущей трансформации. В частности, предпочтительным геном селектируемого маркера является ген зеоцина, кодирующий устойчивость к антибиотическому зеоцину. Для целей ретрансформации выбранные клоны - это клоны, отобранные и выделенные после первой трансформации, имеющие His+ Muts фенотип и в которых потеря АОХ 1 гена может быть продемонстрирована PCR реакцией и Саузерн [Southern] блотом. Дрожжи электропорировали согласно протоколу,предложенному Invitrogen, с помощью 10 мкг плазмиды pPICZInsAspRWR, предварительно расщепленной ферментом SacI. Дрожжи посеяли на планшеты, содержащие MDS минимальную питательную среду с различными концентрациями зеоцина (0,1; 0,5 и 1 мг/мл). Вышеупомянутые ретрансформации вторым вектором экспрессии предназначены для увеличения возможности найти рекомбинантные штаммы с большим количеством копий представляющего интерес гена, интегрированного в геном дрожжей. Это увеличивает возможность найти дрожжи, содержащие суперпродуцентные клоны предшественника аналога "инсулина аспарт". При этом дополнительно к процессу трансформации и ретрансформации, который включает промежуточную стадию отбора рекомбинантного Muts, разработан очень эффективный способ получения высокопродуктивных клонов. Этот способ включает одновременную трансформацию с использованием более одного вектора экспрессии,включая одновременную трансформацию GS115 His- штамма Pichia pastoris векторами pPIC9InsAspRWR и pPICZAInsAspRWR. Штамм GS115 электропорировали с помощью 5 мкг вектора pPICZInsAspRWR, линеаризованного ферментом SacI, и 5 мкг вектора pPIC9InsAspRWR, предварительно расщепленного с помощью BglII. Процесс электропорации был выполнен в нормальных условиях согласно протоколу, рекомендованномуInvitrogen. Дрожжи посеяли на планшеты, содержащие MDS питательную среду (MD, 1 M сорбит), с различными концентрациями зеоцина (0,1; 0,5 и 1 мг/мл). Любой известный в данной области метод для трансформации дрожжей можно использовать для ретрансформации, включая, но не ограничиваясь этим, формирование сферопластов, электропорацию,трансформацию с помощью PEG 1000 и трансформацию хлоридом лития. Предпочтительно использовать метод трансформации сферопластов или метод электропорации. Вектор линеаризован конструкцией ДНК в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно характеризующейся вставкой в геном-хозяин на одном сайте, а затем генерирующей in vivo мно-8 022946 жество геномных копий. После выращивания устойчивых к зеоцину колоний наличие предшественника аналога инсулина определяется по следующей схеме. На каждый из планшетов, подлежащих анализу, помещают нитроцеллюлозную мембрану таким образом, чтобы она контактировала с каждой из колоний. Затем мембрану удаляют и переворачивают так,чтобы колонии оставались на планшете с минимальной питательной средой, содержащей метанол, и инкубируют в течение 24-48 ч при 30 С, после этого проводится иммуноферментный анализ с помощью меченых пероксидазой антител антиинсулина. Наконец, наличие пероксидазы было выявлено с помощью раствора Н 2 О 2 0,012%, DAB 0,08% в 100 мМ Tris/ClH при рН 7,5. Положительные колонии идентифицировали и выделили из исходного планшета. Высокопродуктивные клоны были отобраны путем сравнения скорости их реакции. Отобранные положительные клоны выделили и очистили, а последовательности, интегрированные в геном дрожжей,охарактеризовали. Наличие конструкций ДНК в соответствии с настоящим изобретением было определено Саузерн-блотом и геномным анализом с использованием ПЦР. Для определения количества копий последовательности предшественника аналога инсулина аспарт,присутствующей в различных трансформантных клонах, может использоваться дот-блот технология с применением зондов гибридизации АОХ 1 и pGAP. Поскольку ген предшественника инсулина аспарт клонируется при АОХ 1 промоторе, сигнал, полученный зондом АОХ 1, который гибридизируется в АОХ 1 промоторе, эквивалентен сигналу, который может быть получен от гена инсулина аспарт. Для стандартизации посева ДНК выбрали GAP ген, присутствующий во всех однокопийных клонах. Зонд,pGAP, распознает промотор упомянутого гена. Количество копий АОХ 1 промотора, эквивалентного инсулину аспарт, определяется из соотношений между сигналами, полученными обоими зондами и с пользованием однокопийного АОХ 1 клона, GS115, в качестве эталона. Все трансформированные и ретрансформированные штаммы, отобранные по требуемым фенотипическим и генотипическим признакам, выращиваются в колбах Эрленмейера. Представляющие интерес колонии и штаммы отбираются для дальнейшей культуры в биореакторах. Для крупномасштабного производства предшественников инсулина можно применять типовые методы и процессы для метилотрофных дрожжей. Предпочтительно ферментация проводится путем выращивания штаммов дрожжей на первой стадии в питательной среде, содержащей избыток неиндуцирующего источника углерода, как, например, глицерин. На этой стадии экспрессия конструкций в соответствии с настоящим изобретением, содержащих кодирующий ген для предшественника аналога инсулина аспарт, полностью подавляется, в результате чего вырабатывается значительная биомасса без продуцирования представляющего интерес пептида. Вторая стадия разделена на две части в соответствии со скоростью добавления субстратов. В первой фазе стадии периодического процесса с подпиткой дрожжи выдерживаются при удельной скорости роста в диапазоне примерно от 0,04 до 0,08 л/ч. Во второй фазе этой стадии, соответствующей главным образом индуцированию экспрессии, удельная скорость роста составит примерно 0,005 л/ч. Добавление метанола на стадии индуцирования регулируется таким образом, чтобы получить максимальную концентрацию примерно 0,2% об./об. упомянутого субстрата в биореакторе. Обе стадии выполняются при постоянном значении рН (приблизительно от 4,5 до 6), а температура поддерживается при постоянном значении температуры примерно 30 С на стадиях роста закладки и примерно 23 С на стадии индуцирования. После ферментации клетки удаляются центрифугированием или фильтрацией, а содержавшийся в супернатанте предшественник собирается с помощью ионнообменной хроматографии. Для этой процедуры можно использовать любую сильную анионную смолу, например SP Sepharose-FF, SP SepharoseHP, Capto SP или SP-Fractogel, через которую предшественник адсорбируется на хроматографическую смолу при значениях рН в диапазоне от 3 до 6. В качестве альтернативы можно использовать хроматографию гидрофобного взаимодействия, как,например, Octyl Sepharose [Октил Сефароза] или Phenyl Sepharose [Фенил Сефароза]. В отличие от идей патента США 7091032 целью способа захвата предшественника аналога инсулина аспарт, а не концентрации предшественника, является выделение некоторых связанных с продуктом примесей. Такие примеси образуются во время ферментативного процесса, и если их не удалить на этой стадии, они останутся вместе с основным продуктом на всем протяжении энзиматического процесса, и их удаление будет очень сложным. Продукт элюции подвергается энзиматическому процессу с использованием трипсина и ферментов карбоксипептидазы В, которые преобразовывают "предшественник аналога" в зрелый инсулин аспарт. Трипсин разрушает пептидные связи лизиновой и аргининовой аминокислот в любом пептиде или белке. В частности, предшественник аналога инсулина аспарт, прежде всего, расщепляется в двух аргининовых аминокислотах линкера пептида RWR, который удерживает цепи В и А соединенными. Это расщепление преобразует однонитевый пептид в дипептид, соединенный двумя дисульфидными мостиками. Одновременно фермент карбоксипептидазы В воздействует на промежуточный продукт, удаляя Ферменты могут вступать в реакцию одновременно или последовательно. В первом случае трипсин и карбоксипептидаза В добавляются совместно в виде смеси. В последнем случае предшественник инсулина аспарт вступает в реакцию с трипсином при рН и в температурных условиях и при соотношении концентраций фермент/субстрат, обеспечивающих 70-80% преобразование упомянутого предшественника инсулина аспарт в открытую форму предшественника, и таким образом, что ни одни из загрязнителей или побочных продуктов расщепления не превысит 5% полных пиков, измеренных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Расщепленный продукт представляет собой IP (промежуточный продукт), который должен подвергнуться действию второй стадии хроматографии, а затем воздействию карбоксипептидазы В для удаления R остатка из карбоксильного конца В цепи. После расщепления карбоксипептидазой В продукт приобретает свои конечные, первичную и вторичную, структуры. В конкретном примере осуществления настоящего изобретения используется третья хроматографическая стадия анионного обмена или гидрофобного взаимодействия, предназначенная для удаления остатков ферментов и любых загрязнителей, оставшихся от расщепления. Конкретная цель настоящего изобретения - способ преобразования однонитевого предшественника аспарт инсулина в зрелый продукт "инсулин аспарт", включающий одновременное добавление трипсина и прокарбоксипептидазы В, последняя в неактивной форме карбоксипептидазы В. Таким способом во время выработки открытого предшественника он расщепляется карбоксипептидазой В, образующейся в результате действия трипсина на прокарбоксипептидазу В. После этой стадии расщепления любые ферменты и примеси, связанные с процессом, удаляются за один или несколько циклов ионнообменной хроматографии. В качестве альтернативного метода было проведено одновременное добавление обоих ферментов в соответствии с протоколами, описанными в Европейском патенте [ЕПАВ]195691 и в публикации LilaR. Castellanos-Serra et al., FEBS Letters 378:171-176; 1996 [Письма Федерации европейских биохимических обществ]. В объеме настоящего изобретения для получения инсулина аспарт из однонитевого предшественника может использоваться любой из способов расщепления, описанных в данном документе. Окончательная очистка инсулина, полученного ферментативным действием, может включать любую хроматографическую технологию, как, например, технологии, описанные в патенте США 5663291; европейском патенте 195691, и технологии, описанные в публикации Kroeff, Eugene et al.,Journal of Chromatography, 461:45-61; 1989, после выполнения которых продукт можно кристаллизовать для хранения. Если специально не определено иначе, все используемые в данном документе технические и научные термины имеют такое же значение, какое обычно понимает специалист в области, к которой заявляемый объект принадлежит. Все публикации и патенты, упомянутые в данном описании, включены по ссылке. В соответствии с их использованием в настоящем описании термины "лидерная последовательность" или "сигнальный пептид" - взаимозаменяемые выражения и относятся к пептиду, названному сигнальный пептид, который является частью слитого белка с другим белком, который транспортируется через мембрану эндоплазматической сети таким образом, что последний белок может следовать по клеточному пути экспорта. В соответствии с его использованием в настоящем описании термин "аналог инсулина" относится к любой молекуле инсулина, в которой при использовании процедур молекулярной биологии одна или несколько аминокислот заменены или к которой добавлены другие природные аминокислоты или другие радикалы, тем самым ускоряется или замедляется биологическая активность. Термины "предшественник аналога инсулина аспарт" и "предшественник инсулина аспарт" эквивалентны и в соответствии с их использованием в настоящем описании относятся к однонитевому пептиду,предшественнику аналога быстродействующего человеческого инсулина, который после ферментативной обработки порождает аналог "инсулина аспарт". Выражение "биологическая активность" в соответствии с его использованием в настоящем описании относится к биологической активности, связанной с инсулином, по оценке с помощью анализов, известных специалисту в данной области. В соответствии с его использованием в настоящем описании выражение "конструкция ДНК" относится к последовательности ДНК, кодирующей предшественник инсулина аспарт. В соответствии с его использованием в настоящем описании выражение "кассета экспрессии" касается конструкции ДНК в соответствии с настоящим изобретением, а также других последовательностей ДНК, получаемых в результате расщепления рестриктивного фермента любого из векторов экспрессии для Pichia pastoris, используемого в настоящей заявке, и включающих:a) 5'-последовательность AOXI гена, соответствующую промотору AOXI гена, который регулирует транскрипцию конструкции гена, и как первая последовательность интеграции кассеты экспрессии в геном дрожжей; функционально связанную сc) конструкцией ДНК, кодирующей предшественник инсулина аспарт; функционально связанной сd) последовательностью завершения транскрипции Pichia pastoris; связанной сe) кодирующей последовательностью для селектируемого маркера Pichia pastoris; связанной сi) второй последовательностью интеграции генома, соответствующей AOXI 3'-концу. Настоящее изобретение иллюстрируется примерами, описанными ниже, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем данного изобретения. Примеры Пример 1. Создание предшественника инсулина аспарт из предшественника типа мини-С-инсулин. При таком создании в качестве матрицы использована последовательность предшественника миниС-инсулина формулы B(1-30)-Lys-Arg-A(1-21) с Pichia кодонами, как представлено в последовательностиa) замена предшественника пролин В 28 аминокислоты остатком аспарагиновой кислоты;b) замена дипептида -Lys-Arg-, связывающего В и А цепей инсулина, трипептидом -Arg-Trp-Argдля получения предшественника инсулина аспарт формулы B28Asp(1-30)-Arg-Trp-Arg-A(1-21). Процедура включала три последовательных ПЦР реакции. В первой реакции вектор pPIC9Ins, содержащий мини-С-инсулин с Pichia кодонами и с мини-С LysArg, представленным в последовательности SEQ ID NO: 1, использовали в качестве матрицы. Последовательность SEQ ID NO: 2, которая скрещивается с промотором АОХ 1, и SEQ ID NO: 3, гомологичную 3' части гена, использовали в качестве праймеров; в последней последовательности кодоны сса были заменены на gac, кодирующие остаток 28 из В цепи, aag aga на aga tgg aga, кодирующие 3 аминокислоты типа мини-С. ПЦР реакция 1 была проведена согласно следующему протоколу: матрица ДНК: 1 нг из PIC9-INS,праймеры: 0,5 мкМ dNTPs [дНТФ]: 0,2 мМ каждый (Promega),буфер (с Mg2+) и 1,25 ед. из FideliTaq (USB),конечный объем составил 50 мкл. Денатурация была выполнена при 95 С в течение 3 мин. Затем сразу последовали 30 циклов, как указано: 30 с 95 С,30 с 55 С,1 мин 68 С. Наконец, 5-минутное удлинение при 68 С. Продукт первой ПЦР реакции был использован в качестве матрицы во второй ПЦР реакции, посредством чего молекула предшественника инсулина аспарт была удлинена. SEQ ID NO: 2, которая вступает в реакцию с АОХ 1 промотором, и SEQ ID NO: 4, гомологичная 3'-концу синтезированного фрагмента, использовались в качестве праймеров. ПЦР реакция 2 была проведена согласно следующему протоколу: матрица ДНК: 2 мкл из PCR1,праймеры: 0,5 мкМ dNTPs: 0,2 мМ каждого (Promega),Буфер (с Mg2+) и 1,25 ед. из FideliTaq (USB); конечный объем составил 50 мкл. Денатурация была выполнена при 95 С в течение 3 мин. Затем сразу последовали 30 циклов, как указано: 30 с 95 С,30 с 57 С,1 мин 68 С. Наконец, 5-минутное удлинение при 68 С. Продукт второй ПЦР реакции был использован в качестве матрицы в третьей ПЦР реакции, предназначенной для добавления клонирующего сайта AvrII на 3'f-конце гена. Последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, гомогенные 3'-концу синтезированного фрагмента, содержащего последовательность для расщепления AvrII ферментом, использовались в качестве праймеров. ПЦР реакция 3 была проведена согласно следующему протоколу: матрица ДНК: 2 мкл из PCR2; праймеры: 0,5 мкМ;- 11022946 буфер (с Mg2+) и 1,25 ед. из FideliTaq (USB); конечный объем составил 50 мкл. Денатурация была выполнена при 95 С в течение 3 мин. Затем сразу последовали 30 циклов, как указано: 30 с 95 С,30 с 57 С,1 мин 68 С. Наконец, 5-минутное удлинение при 68 С. Продукт реакции был расщеплен ферментами BamHI и AvrII и лигирован при 16 С в течение 12 ч с вектором pPIC9, предварительно расщепленным обоими ферментами. Из реакции лигирования взяли 5 мкл, чтобы трансформировать 100 мкл компетентных DH5 бактерий. Анализ рекомбинантных колоний был проведен рестрикционным картированием плазмидных ДНК с помощью HpaI и ПЦР с использованием праймеров, указанных в последовательностях, обозначенных как SEQ ID NOs: 2 и 4. С помощью этого способа был получен показанный на фиг. 1 вектор pPIC9InsAspRWR. Пример 2. Клонирование InsAspRWR гена в вектор pPICZA. Вставка InsAspRWR SEQ ID6 была субклонирована в вектор pPICZA. ВекторpPIC9InsAspRWR был расщеплен ферментами SaCI и NotI, фрагмент, содержащий представляющий интерес ген, был очищен от геля с помощью реагента QIAEX II (Promega) и лигирован с векторомpPICZA, предварительно расщепленным теми же рестриктивными ферментами. Конечная конструкция была обозначена pPICZAInsAspRWR, схема которой показана на фиг. 2. Пример 3. Отбор и выделение рекомбинантных дрожжей. Трансформации дрожжей Pichia pastoris, штамм GS115, вектором pPIC9InsAspRWR, расщепленным при помощи Bgl II, способствуют рекомбинации в локусе АОХ I. Замена структурного гена, алкогольоксидазы (АОХ I), происходит с частотой примерно от 15 до 35% среди His+ трансформантами. His+ колонии из трансформации были отобраны в соответствии со следующим протоколом. Каждую колонию подхватывали стерильным наконечником и делали посев меткой или штрихом,сначала на ММ планшете, а затем на MD планшете. Для различия обоих фенотипов использовали контрольные образцы GS115/His+ Mut+ и GS115/His+Mut (Invitrogen). Планшеты были инкубированы при 30 С в течение примерно 48-72 ч. Этим методом можно было различить клоны Muts, как клоны, растущие обычно на планшетах MD, и не растущие на планшетах ММ. Каждый из Muts или Mutr клонов, отобранный по этому методу, был очищен, и чистые клоны выделены. Выделение проводилось путем посева штриховкой каждой колонии в минимальную питательную среду без Гистидина. Пример 4. Ретрансформация клонов дрожжей, полученных в примере 10. Клоны, имеющие фенотип His+ Muts и в которых потеря гена АОХ 1 была продемонстрирована ПЦР реакцией и Саузерн-блотом, отобрали для ретрансформации. Дрожжи электропорировали согласно протоколу, предложенному Invitrogen, с помощью 10 мкг плазмиды pPICZInsAspRWR, предварительно расщепленной ферментом SaCI Дрожжи посеяли на планшеты, содержащие MDS минимальную питательную среду с различными концентрациями зеоцина (0,1; 0,5 и 1 мг/мл). Пример 5. Одновременная трансформация Pichia pastoris GS115 His- штамма векторамиpPIC9InsAspRWR и pPICZAInsAspRWR. Штамм GS115 электропорировали с помощью 5 мкг вектора pPICZInsAspRWR, линеаризованного с ферментом SacI, и 5 мкг вектора pPIC9InsAspRWR, предварительно расщепленного с помощью BglII. Процесс электропорации был выполнен в нормальных условиях согласно протоколу, рекомендованномуInvitrogen. Дрожжи посеяли на планшеты, содержащие MDS питательную среду с различными концентрациями зеоцина (0,1; 0,5 и 1 мг/мл). Пример 6. Идентификация и выделение колоний, продуцирующих предшественник инсулина аспарт. После выращивания устойчивых к зеоцину колоний наличие предшественника аналога инсулина определили по следующей схеме. На каждом из планшетов, подлежащих анализу, нитроцеллюлозная мембрана контактировала с каждой из колоний. Затем мембрану удалили, перевернули и поместили на культуральные планшеты с агар ММ средой. Планшеты инкубировали с присоединенными к ним фильтрами в течение 24 ч при 30 С. После этого мембраны удалили и промыли в растворе 0,05-0,1% PBS/Tween-20 в течение 30 мин. Нитроцеллюлозные мембраны блокировали 5% раствором обезжиренного молока в 0,1%PBS/Tween-20 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с поликлональным антителом античеловеческого инсулина морской свинки и промыли в течение 30 мин раствором 0,1% PBS/Tween-20. После этого фильтры инкубировали в течение 1 ч и при комнатной температуре с пероксидазаконъюгированным анти-IgG поликлональным антителом морской свинки и затем промыли раствором 0,1% PBS/Tween-20 в течение 30 мин. Наконец, наличие пероксидазы выявили раствором 0,012% Н 2 О 2; 0,08% DAB в 100 мМ Tris/ClH при рН 7,5. Положительные колонии идентифицировали и выделили из исходного планшета. Путем сравнения интенсивности реакций отобрали высокопродуктивные клоны. Пример 7. Экспрессия рекомбинантных клонов. Производительность в отобранных колониях определили с помощью экспериментов по выращиванию и индукции в BMGY/BMMY среде. Первая культуральная среда содержала глицерин, который является источником углерода, используемым микроорганизмом для производства биомассы. Вторая среда содержала метанол, индуктор промотора AOXI. Колонии вырастили в колбах Эрленмейера в BMGY среде при 30 С до достижения OD600nm: 6-20. Затем клетки центрифугировали для замены культуральной среды на BMMY в объеме, соответствующем пятой части среды, используемой в фазе роста. Культивирование продолжалось в течение 120 ч, рассчитанное по изменению среды, при температуре 30 С и при постоянном перемешивании. Каждые 24 ч добавляли 0,5% об./об. метанола и брали образцы для оценки с помощью 15% полиакриламид Трис/Трицин гель-электрофореза. Каждый образец центрифугировали, клетки удалили, а супернатант обработали буфером для образца согласно протоколам, установленным LaemMli (LaemMli, U.K. Nature 227:680-685; 1970). По результатам полиакриломидных гелей можно было выбрать клоны, способные к выделению пептида, имеющего электрофорезную подвижность, согласующуюся с предшественником аналога инсулина, с MW [молекулярный вес] от 5800 до 5900. Отобранные клоны показали очень высокую экспрессию белка. После этого провели молекулярное исследование геномов продуктивных клонов.BMGY среда [забуференная глицерин-комплексная среда]: 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ фосфат калия рН 6,0, 1,34% YNB, 10-5% 4 х биотин, 1% глицерин.BMMY среда [забуференная метанол-комплексная среда]: 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ фосфат калия рН 6,0, 1,34% YNB, 10-5% 4 х биотин, 0,5% метанол. Пример 8. Количественный анализ числа копий с помощью методики дот-блота. 3 мкг геномной ДНК дрожжей, денатурированной 0,4 Н NaOH, 10 мМ EDTA, посеяли и нагрели в течение 10 мин при 95 С в Zeta Probe Gt найлоновой мембране (Bio Rad) при помощи прибора микрофильтрации Био-Дот производства Bio Rad. Лунки промыли с помощью 0,4 Н NaOH и затем ДНК закрепили УФ-излучением. Был выполнен шестикратный посев таким образом, что одна половина образцов была скрещена с зондом АОХ 1, а другая с pGAP. Зонды были помечены [32 Р] dCTP с использованием RadPrime набора системы мечения производства Life Technologies. Гибридизация выполнялась в течение 12 ч при 65 С в растворе: 5 Х Denhardt, 5XSSPE, 0,5 % SDS, и 20 мкг/мл ДНК сперматозоида лосося. Мембраны были обработаны с помощью системы отображения Storm [Storm image system] производства GE Healthcare. Данные проанализировали с помощью программы Image Quant. Количество копий, кодирующих предшественник инсулина генов в каждом клоне, было следующее: клон IAsp 8.1: 12,клон GS115: 1,АОХ 1 зонд: фрагмент промотора АОХ 1, полученный расщеплением вектора pPIC9 ферментамиSEQ ID NO: 8 в качестве праймеров. Пример 9. Характеризация колоний Muts или Mut+ с помощью PCR. Праймеры детализировали для SEQ ID NO: 2, которая скрещивается с промотором АОХ 1, и дляSEQ ID NO: 9, которая скрещивается с кодирующей АОХ 1 ген областью. Был использован протокол в соответствии со следующей схемой: хромосомная ДНК: 10-20 нг,5'АОХ: (праймеры) 0,5 мкМ,3'АОХ IN: 0,5 мкМ,dNTP: 0,2 мМ,Cl2Mg: 1,5 мМ,Taq: 2 ед. (Go Taq, Promega),10 Х буфер 1x. Конечный объем составил 50 мкл. Денатурация была выполнена при 95 С в течение 3 мин. Затем сразу последовали 30 циклов, как указано: 30 с 95 С,1 мин 57 С,1 мин 72 С.Mut+ клоны продемонстрировали бэнд с 730 парами оснований, тогда как в Muts клонах он отсутствовал. Пример 10. Процесс ферментации предшественника аналога "инсулина аспарт" в биореакторе объемом 2,5 л. Сначала 0,4 мл штамма продуцирующих предшественник инсулина метилотрофных Pichia pastoris дрожжей, хранящихся при -80 С, разморозили и культивировали в 125-мл колбе Эрленмейера, содержащей 20 мл YPD среды (20 г/л глюкоза, 20 г/л пептон и 10 г/л дрожжевой экстракт). Культуру инкубировали в орбитальном встряхивателе при 220 об/мин, при температуре 30 С в течение 8 ч. 20 мл предыдущей культуры (инокулят) переместили в биореактор объемом 2,5 л, содержащем 1,5 л реформулированной основной солевой среды. Эта среда включает 40 г/л глицерина; 0,36 г/лCaSO42H2O; 12,0 мл/л 85% Н 3 РО 4; 6,40 г/л K2SO4; 3,40 г/л MgSO47H2O; 1,80 г/л KOH; плюс 4 мл/л следового солевого раствора (РТМ 4), включающего: 2,0 г/л CuSO45H2O; 0,08 г/л NaI; 3,0 г/л MnSO4; 0,2 г/лNaMoO42H2O; 0,02 г/л Н 3 ВО 3; 0,5 г/л CoCl26 Н 2 О; 7,0 г/л ZnCl; 22,0 г/л FeSO47H2O; 5,0 мл/л H2SO4 и 8 мл/л раствора 0,20 г/л D-биотина. Значение рН полной среды отрегулировали до 5,0 добавлением 28% гидроокиси аммония, а вспенивание контролировали добавлением к культуральной среде 0,5 мл противовспенивающего вещества. Температура поддерживалась при 28 С, а процентное содержание растворенного кислорода в питательной среде поддерживалось на уровне 35% регулированием перемешивания и аэрации. Культуру вырастили периодическим способом, пока не закончилось потребление исходного глицерина. В этот момент оптическая плотность биомассы, измеренная при 600 нм, составила 80 оптических единиц. рН культуры отрегулировали до значения рН 4,5 добавлением 28% гидроокиси аммония. После завершения начальной закладки была выполнена стадия смешанной подпитки, включающая добавление смеси из 43,5% ч. об. глицерина и 5% об./об. метанола, дополненных 6 мл/л следового солевого (РТМ 4) и 18 мл/л D-биотин раствора. Поток смешанной подпитки регулировался таким образом,чтобы скорость роста культуры составляла 0,065 h-1. Через 15 ч культивирования в периодическом процессе с подпиткой глицерином/метанолом началась фаза индукции. Культуру поддерживали при рН 5 путем добавления 28% гидроокиси аммония. Для фазы индукции смешанную глицерин-метаноловую подпитку уменьшили до достижения скорости роста культуры 0,005 л/ч. Одновременно с этим начали подпитку чистым метанолом с добавлением 6 мл/л следового солевого (РТМ 4) и 18 мл/л биотин раствора. Поток подпитки метанола отрегулировали до концентрации 0,2% об./об., как определено газовой хроматографией. Фаза индукции продолжалась 24 ч, и конечная биомасса показала оптическую плотность меньше 200 оптических единиц, измеренных при 600 нм. Профиль выхода оценили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии при использовании С-8 и С-18 колонн, а конечный выход достиг примерно 400 мг/л предшественника инсулина аспарт. Пример 11. Захват и очистка предшественника инсулина аспарт. Захват: супернатант ферментации разбавили до получения проводимости не более 12 мСм/см. Разбавленный продукт пропустили через катионообменную колонну типа SP-Sepharose FF или подобного типа или смолу гидрофобного взаимодействия при скорости от 60 до 100 см/ч и рН в диапазоне от 3 до 6. Колонку для хроматографии промыли соляным буфером в объеме 2 колонок, имеющего проводимость от 6 до 12 мСм/см. Элюция выполнялась за счет увеличения концентрации соли буфера элюции от 0,1 до 1 М NaCl, чтобы отделить основные загрязнители, сопутствующие продукту. Пример 12. Энзиматическое процессирование предшественника инсулина аспарт путем одновременной обработки трипсином и прокарбоксипептидазой В. Концентрацию предшественника отрегулировали до диапазона от 1 до 10 мг/мл добавлением трипсина при концентрации от 0,001 до 0,01 мг/мл и прокарбоксипептидазы В при концентрации от 1:100 до 1:1000, при температуре от 20 до 30 С, рН от 9 до 11,5 и проводимости от 10 до 25 мСм/см. Реакция контролировалась с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и считалась завершенной, когда как минимум 75% зоны под пиком составлял инсулин аспарт, а зоны, соответствующие другим загрязнителям, не превышали 5%. Пример 13. Энзиматическое процессирование предшественника инсулина аспарт путем одновременной обработки трипсином и карбоксипептидазой В. Концентрацию предшественника отрегулировали до диапазона от 1 до 10 мг/мл добавлением трипсина при концентрации от 0,001 до 0,01 мг/мл и карбоксипептидазы В при концентрации от 1:500 до 1:2000, при температуре от 20 до 30 С, рН (9-11,5) и проводимости от 10 до 25 мСм/см. Реакция контролировалась с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и считалась завершенной, когда как минимум 75% зоны под пиком составлял инсулин аспарт, а зоны, соответствующие другим загрязнителям, не превышали 5%. Пример 14. Двустадийное энзиматическое процессирование предшественника инсулина аспарт путем обработки трипсином и карбоксипептидазой В. Предшественник инсулина аспарт при концентрации от 1 до 10 мг/мл вступил в реакцию с водным раствором трипсина при концентрации от 0,01 до 0,1 мг/мл, при температуре от 15 до 30 С, рН от 9 до 11.5 и при проводимости от 10 до 25 мСм/см. Реакция контролировалась с помощью HPLC (жидкостная хроматография высокого давления). Реакция завершилась, когда как минимум 75% зоны под пиком соответствовали полурасщепленному предшественнику инсулина аспарт и ни один загрязнитель не превышал 15%, путем добавления 7,5 М уксусной кислоты. Полурасщепленный продукт адсорбировался на сильную катионообменную смолу и элюировал при увеличении концентраций соли буфера элюции от 0,1 до 1 М NaCl. Пример 15. Преобразование полурасщепленного предшественника в зрелый инсулин аспарт. Продукт элюции из предыдущего примера был расщеплен раствором карбоксипептидазы В при соотношении фермент-субстрат от 1:200 до 1:2000. Реакция продолжалась в течение 4-12 ч в температурном диапазоне от 15 до 30 С, рН от 9 до 11 и при проводимости от 10 до 25 мСм/см. Реакция контролировалась с помощью HPLC и считалась завершенной, когда конечный продукт(зрелый инсулин аспарт) достигал как минимум 85-95% общих пиков на хроматограмме. Пример 16. Третья стадия хроматографии. Окончательная очистка продукта инсулина аспарт. Третья стадия хроматографии: продукт, расщепленный обоими ферментами, был нанесен на сильную анионообменную смолу и элюировал за счет увеличения концентраций соли буфера элюции от 0,1 до 1 М NaCl. Элюция контролировалась поглощением при 280 нм и регулировалась с помощью HPLC, а фракции, демонстрирующие соответствующую чистоту для конечного продукта, отбирали. Пример 17. Кристаллизация и гель-фильтрация. Продукт кристаллизовали добавлением 6% об./об. этанола, 50% уксусной кислоты в соотношении 6 мл на каждый грамм продукта, регулированием значения рН от 6,5 до 7,2. После этого добавили 0,2 гCl2Zn на 1 г продукта. Пример 18. Гель-фильтрация. Кристаллы растворили в H2O, рН 2,5 и нанесли на колонку, содержащую Sephadex G-25 или Sephadex G-50 в соотношении 1-2 г белка/л смолы в 0,1 М растворе уксусной кислоты, где максимальный объем посева не превышал 20% объема колонки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения инсулина аспарт, включающий стадии:i) трансформации штамма дрожжей Pichia pastoris как минимум двумя векторами экспрессии, содержащими различные маркеры селекции, причем каждый вектор включает конструкцию ДНК, кодирующую предшественник инсулина аспарт формулы B(1-27)-Asp-Lys-Thr-Arg-Trp-Arg-A(1-21) и представляющую собой последовательность SEQ ID NO: 6, где B(1-27)-Asp-Lys-Thr представляет собой полную В-цепь человеческого инсулина, в которой аминокислотный остаток пролина в положении 28 заменен остатком аспарагиновой кислоты; и А(1-21) представляет собой А-цепь человеческого инсулина;ii) отбора из штаммов, трансформированных на стадии i), рекомбинантных штаммов, содержащих более 5 копий конструкции ДНК, интегрированной в геном клеток дрожжей;iii) отбора из рекомбинантных штаммов стадии ii) штамма, имеющего самое большое число копий и самый высокий уровень экспрессии предшественника инсулина аспарт;iv) культивирования рекомбинантного штамма, отобранного на стадии iii), причем указанная стадия культивирования включает первый этап выращивания указанного рекомбинантного штамма в биореакторе с применением периодического процесса с добавлением первого субстрата, где указанный первый субстрат представляет собой минимальную среду, состоящую из водного раствора, включающего источник углерода, следовое количество солей и биотин, затем второй этап выращивания указанного рекомбинантного штамма в биореакторе с применением периодического процесса с подпиткой с добавлением второго субстрата, где указанный второй субстрат представляет собой подпитывающую среду, состоящую из водного раствора, включающего источник углерода, следовое количество солей, биотин и метанол, и далее индуцирование указанного рекомбинантного штамма в биореакторе с применением перио- 18022946 дического процесса с подпиткой с добавлением третьего субстрата, где указанный третий субстрат представляет собой среду индукции экспрессии, которая состоит из абсолютного метанола с растворенным следовым количеством солей и биотином;v) выделения предшественника инсулина аспарт из культуральной среды с помощью хроматографии;vi) энзиматического расщепления указанного предшественника в условиях, пригодных для преобразования как минимум 70% предшественника инсулина аспарт в зрелый инсулин аспарт;vii) очистки инсулина аспарт, полученного на стадии vi) хроматографией. 2. Способ получения инсулина аспарт по п.1, в котором конструкция ДНК клонирована в вектор экспрессии pPIC-9, включающий последовательность промотора гена AOXI Pichia pastoris, функционально связанную с сигнальной последовательностью -фактора скрещивания Saccharomyces cereviciae,функционально связанной с кодирующей последовательностью предшественника инсулина аспарт, которая далее функционально связана с последовательностью терминации транскрипции Pichia pastoris, соединенной с маркером селекции HIS4 Pichia pastoris, связанным с 3'-концевой последовательностью генаAOXI. 3. Способ получения инсулина аспарт по п.1, в котором указанная конструкция ДНК клонирована в вектор экспрессии pPICZA, состоящий из последовательности промотора AOXI Pichia pastoris, функционально связанной с сигнальной последовательностью -фактора скрещивания Saccharomyces cerevisiae, функционально связанной с кодирующей последовательностью предшественника инсулина аспарт, которая далее функционально связана с последовательностью терминации транскрипции Pichiapastoris, связанной с маркером селекции устойчивости к зеоцину. 4. Способ получения инсулина аспарт по пп.2, 3, включающий последовательную или одновременную трансформацию штамма GS115 HIS-Pichia pastoris векторами экспрессии pPIC-9 и pPICZA. 5. Способ получения инсулина аспарт по п.1, в котором источник углерода выбирают из группы,состоящей из глицерина, глюкозы, фруктозы, сорбита и маннозы. 6. Способ получения инсулина аспарт по п.5, в котором источник углерода представляет собой глицерин. 7. Способ получения инсулина аспарт по п.5, в котором источник углерода представляет собой глюкозу. 8. Способ получения инсулина аспарт по п.5, в котором примеси пептида, присутствующие в культуральной среде, определенные с помощью HPLC, составляют не более 6-8% в сравнении с предшественником инсулина аспарт. 9. Способ получения инсулина аспарт по п.1, в котором энзиматическое расщепление предшественника инсулина аспарт осуществляют при рН от 7 до 11 и при 25 С сначала трипсин-подобной протеазой,трансформирующей как минимум 75% указанного предшественника в промежуточный продукт формулыB(1-27)-Asp-Lys-Thr-Arg, который далее расщепляют протеазой, подобной карбоксипептидазе В и трансформирующей как минимум 90% промежуточного продукта формулы в зрелый инсулин аспарт. 10. Способ получения инсулина аспарт по п.9, в котором указанное энзиматическое расщепление осуществляют при рН около 10. 11. Способ получения инсулина аспарт по п.9, дополнительно включающий удаление всех производственных загрязнителей и примесей из культуральной среды с помощью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, гидрофобного взаимодействия или их комбинации. 12. Способ получения инсулина аспарт по п.1, в котором энзиматическое расщепление включает одновременное расщепление предшественника инсулина аспарт ферментами трипсином и прокарбоксипептидазой В. 13. Способ получения инсулина аспарт по любому из пп.9-12, дополнительно включающий осаждение и кристаллизацию очищенного инсулина аспарт. 14. Конструкция ДНК, используемая для получения инсулина аспарт по п.1, включающая последовательность SEQ ID NO: 6. 15. Кассета экспрессии, используемая в способе получения инсулина аспарт по п.1, включающая последовательность метанол-чувствительного промотора, соответствующую гену AOXI Pichia pastoris вектора pPIC9, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей сигнальный пептид-фактора скрещивания Pichia pastoris вектора pPIC9, функционально связанной с конструкцией ДНК по п.14, которая далее функционально связана с последовательностью терминации транскрипции Pichia pastoris вектора pPIC9, связанной с маркером селекции HIS4 Pichia pastoris, соединенным с 3'-концевой последовательностью гена AOXI. 16. Кассета экспрессии, используемая в способе получения инсулина аспарт по п.1, включающая последовательность метанол-чувствительного промотора, соответствующую гену AOXI Pichia pastoris вектора pPICZA, функционально связанную с последовательностью ДНК, кодирующей сигнальный пептид -фактора скрещивания вектора pPICZА, функционально связанной с конструкцией ДНК по п.14, которая далее функционально связана с последовательностью терминации транскрипции Pichia pas- 19022946toris вектора pPICZA, соединенной с маркером селекции устойчивости к зеоцину.