Пептидный аналог оксинтомодулина

Согласно изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, подходящий для лечения диабета и/или ожирения. Алсина-Фернандес Хорхе, Кон Вэйн Дэвид (US) Медведев В.Н. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Изобретение относится к пептидным аналогам оксинтомодулина и к их пегилированным производным для применения в лечении диабета и/или ожирения. Оксинтомодулин (ОХМ) представляет собой пептидный гормон, состоящий из 37 аминокислот, который высвобождается наряду с глюкагоноподобным пептидом-1 (GLP-1) из L-клеток тонкого кишечника пропорционально потреблению питательных веществ. Он состоит из целой последовательности глюкагона (Gcg), состоящей из 29 аминокислотных остатков, и содержит на С-конце октапептид, образовавшийся в результате тканеспецифичного альтернативного процессинга препроглюкагона. Эндогенный ОХМ быстро разрушается in vivo под действием дипептидилпептидазы IV и других пептидаз. Отдельные рецепторы для ОХМ на сегодняшний день обнаружены не были. ОХМ связывает и полностью активирует in vitro как рецептор GLP-1 (GLP-1R), так и рецептор глюкагона (GcgR) с аналогичными эффективностями для обоих рецепторов. ОХМ участвует в регуляции потребления пищи и в регуляции массы тела. Разовое введение ОХМ людям с нормальной массой тела позволяло снизить чувство голода и уменьшить размер порции на 19%. В 4-недельном исследовании субъектов с избыточной массой тела и ожирением трехкратное ежедневное подкожное введение ОХМ перед приемом пищи вызывало потерю массы тела у данных субъектов на 2,3 кг по сравнению с 0,5 кг в группе плацебо. В данном исследовании тошнота, наиболее частое побочное действие, связанное с терапией, основанной на GLP-1 (такой как эксенатид и лираглутид), встречалась значительно реже. ОХМ повышал потребление энергии, вызывая повышенную физическую активность у людей с избыточной массой тела и ожирением, хотя механизм данного эффекта не совсем ясен. Существует несколько проблем для разработки на основе ОХМ коммерчески рентабельного терапевтического агента. Выше упоминалось, что ОХМ быстро разрушается in vivo, a также подвергается быстрому почечному клиренсу вследствие его малого размера. Следовательно, желательно идентифицировать пептидные аналоги ОХМ, обладающие улучшенной метаболической стабильностью и для которых характерна сниженная скорость клиренса. Более того, агонистическая активность в отношенииGcgR, характерная для ОХМ, приводит к риску негативного влияния на гликемический контроль. Таким образом, также необходимо оптимизировать эффективность пептидного аналога ОХМ, разработанного для применения в терапии, с сохранением подходящего равновесия между активностями в отношении рецепторов GLP-1R и GcgR. Активация GLP-1R отвечает за инсулинотропное действие, тогда как активация обоих рецепторов GLP-1R и GcgR может играть роль в потере массы тела. Следовательно, необходимо получить пептидный аналог ОХМ, который обладает сильной инсулинотропной активностью и вызывает такую потерю массы тела, что его можно применять для лечения инсулиннезависимого диабета и/или ожирения. Пептиды ОХМ с заменами аминокислот для улучшения стабильности и с дополнительными модификациями для замедления клиренса, такими как пегилирование или липидизация, описаны в WO 2008101017, WO 2006134340, WO 2007100535 и Pocai и др. Diabetes 58:2258-2266, 2009. Несмотря на то что данные полученные из ОХМ пептиды могут быть потенциально лучше, чем пептид дикого типа, дозы, необходимые для достижения значительного снижения массы тела в модели алиментарного ожирения (DIO) у мышей, обычно выше, чем те, которые считаются целесообразными для коммерциализации лекарственных средств. Например, Pocai и др. (2009) сообщали о средней потере массы тела на 11 г(25%) через 13 дней введения дозы 1900 нмоль/кг (8 мг/кг) через день (QOD). Несмотря на доступность различных пептидов ОХМ и их аналогов сохраняется потребность в более эффективных, стабильных, длительно действующих и хорошо переносимых пептидных аналогах ОХМ,обладающих соотношением активностей в отношении GcgR/GLP-1R, которое оптимизировали таким образом, что эффективность и инсулинотропная активность данного пептида обеспечивает эффективное лечение диабета, предпочтительно диабета 2 типа, и связанных с ним расстройств. Также необходимо предложить пептидные аналоги ОХМ, которые обеспечивают эффективные способы лечения для снижения массы тела. Соответственно в настоящем изобретении добиваются обеспечения эффективного лечения диабета и/или ожирения. Настоящее изобретение включает пептидный аналог ОХМ с заменами аминокислот, введенными для оптимизирования метаболической стабильности и модулирования относительных активностей в отношении GcgR/GLP-1R, с одновременной оптимизацией общей эффективности. Кроме того, пептидный аналог ОХМ согласно настоящему изобретению пегилирован по выбранным положениям для увеличения действия во времени, что позволяет вводить дозы менее часто. Согласно настоящему изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот в которой Хаа 38 представляет собой Cys, Cys-ПЭГ или отсутствует, Хаа 39 представляет собой Cys,Cys-ПЭГ или отсутствует и в которой С-концевая аминокислота необязательно амидирована. Согласно настоящему изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот Более того, согласно настоящему изобретению предложен пептидный аналог оксинтомодулина, содержащий последовательность аминокислот в которой остаток Cys в положении 38 необязательно пегилирован, и в которой остаток Cys в положении 39 необязательно пегилирован, и карбоксильная группа остатка Cys в положении 39 необязательно амидирована. Предпочтительно пептидный аналог оксинтомодулина с последовательностью SEQ ID NO: 2 пегилирован либо по остатку Cys в положении 38, либо по остатку Cys в положении 39, или по обоим остаткам, при этом молекула полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 40 кДа ковалентно связана с тиольной группой остатка Cys в данных положениях. Более предпочтительно пептидный аналог оксинтомодулина пегилирован по каждому из остатков Cys в положении 38 и положении 39, при этом молекула ПЭГ с молекулярной массой 20 кДа ковалентно связана с каждой тиольной группой каждого остаткаCys в данных положениях. Возможно, остаток Cys в положении 39 может отсутствовать в последовательности SEQ ID NO: 2, оставляя лишь один сайт пегилирования в положении 38. Более предпочтительный пептидный аналог оксинтомодулина содержит последовательность аминокислот в которой карбоксильная группа пегилированного Cys в положении 39 необязательно амидирована. Наиболее предпочтительный пептидный аналог оксинтомодулина содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, в которой карбоксильная группа пегилированного Cys в положении 39 амидирована. Молекула ПЭГ, применяемая в настоящем изобретении, может быть линейной или разветвленной и предпочтительно представляет собой линейную молекулу ПЭГ. Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Дополнительно согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом и необязательно другими терапевтическими ингредиентами. Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инсулиннезависимого диабета (2 типа) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина. Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен способ лечения инсулинозависимого диабета (1 типа) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина. Настоящее изобретение включает способ лечения ожирения у нуждающегося в этом субъекта,включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пеп-2 022820 тидного аналога оксинтомодулина. Более того, настоящее изобретение включает способ лечения инсулиннезависимого диабета и ожирения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина. Согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения в качестве лекарственного средства. Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения инсулиннезависимого диабета. Более того, согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения инсулинозависимого диабета. Более того, согласно настоящему изобретению предложен описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения ожирения. Изобретение включает описанный выше пептидный аналог оксинтомодулина для применения для лечения инсулиннезависимого диабета и ожирения. Согласно настоящему изобретению предложено применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения инсулиннезависимого диабета. Кроме того, настоящее изобретение включает применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения инсулинозависимого диабета. Более того, согласно настоящему изобретению предложено применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения ожирения. Более того, согласно настоящему изобретению предложено применение описанного выше пептидного аналога оксинтомодулина для получения лекарственного средства для лечения инсулиннезависимого диабета и ожирения. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению эффективно связывают и активируют как рецептор GLP-1 (GLP-1R), так и рецептор глюкагона (GcgR). Также было обнаружено, что пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению более устойчивы к расщеплению пептидазами, в частности дипептидилпептидазой IV, чем нативный ОХМ человека. В результате, пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению обладают улучшенной стабильностью in vivo по сравнению с нативным ОХМ человека. Различные варианты реализации настоящего изобретения способны вызывать снижение потребления пищи у субъектов с избыточной массой тела и ожирением. Особое преимущество настоящего изобретения состоит в том, что частота побочных эффектов, таких как тошнота, которая обычно связана с терапией, основанной на GLP-1, такой как терапия эксенатидом и лираглутидом, снижена или исключена. Настоящее изобретение, следовательно, обладает меньшими побочными эффектами по сравнению с терапией, основанной на GLP-1. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению обеспечивают лучший эффект потери массы тела по сравнению с диким типом ОХМ человека. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения пептидные аналоги оксинтомодулина обеспечивают улучшенную толерантность к глюкозе и липидный профиль у субъектов с диабетом 2 типа и/или связанными с ним метаболическими нарушениями и обеспечивают это эффективнее, чем дикий тип ОХМ человека. Оксинтомодулин (ОХМ) представляет собой слабый коагонист с полной эффективностью и сбалансированной активностью в отношении рецепторов человека hGLP-1R и hGcgR со значениями ЕС 50, составляющими 6,72,7 и 4,11,7 нМ соответственно, в клетках НЕК 293, стабильно сверхэкспрессирующих соответствующие рецепторы. Последовательность нативного ОХМ человека приведена ниже Пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, представляет собой полностью эффективный и активный пептидный аналог оксинтомодулина со значениями EC50, составляющими 59,94,14 и 2,750,55 нМ, в отношении hGcgR иhGLP-1R соответственно. Следовательно, пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3,в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, обладает балансом функциональных активностей in vitro, которые в 22 раза более селективны в отношении hGLP-1R по сравнению с hGcgR. Сравнимые результаты получили для аффинности связывания, Ki, где пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, оказался в 28 раз более селективным в отношении hGLP-1R, по сравнению с hGcgR, при этом значения Ki составляли 7323 и 205070 нМ соответственно. Ковалентное присоединение одной или более молекул ПЭГ к определенным остаткам пептидного аналога ОХМ позволяет получить пегилированный пептидный аналог ОХМ с увеличенным временем полужизни и уменьшенной скоростью клиренса по сравнению с таковыми для непегилированного пеп-3 022820 тидного аналога ОХМ и активностью in vitro в отношении GLP-1R, аналогичной таковой для нативного ОХМ человека. Принимая во внимание малый размер пептидного аналога ОХМ и относительно большой размер молекулы (молекул) ПЭГ, будут ожидать, что пептидный аналог ОХМ, как только он окажется пегилированным, потеряет свою активность в результате стерического препятствия. Тем не менее было обнаружено, что, если поместить молекулу(ы) ПЭГ в конце пептидного аналога оксинтомодулина, а не в середине, активность пептидного аналога в большей степени сохранится. Несколько замен в последовательности повышают эффективность, тем самым компенсируя потерю эффективности вследствие пегилирования, сохраняя при этом подходящее соотношение активностей в отношении GLP-1R и GcgR. Более того, было обнаружено, что присутствие двух молекул ПЭГ на С-конце пептидного аналога оксинтомодулина предпочтительнее, чем присутствие одной молекулы ПЭГ. Последовательности согласно настоящему изобретению включают стандартные однобуквенные или трехбуквенные коды двадцати встречающихся в природе аминокислот. Другие используемые обозначения описаны далееAib - альфа-аминоизомасляная кислота; ПЭГ - полиэтиленгликоль; 20 кДа ПЭГ - молекула ПЭГ со средней молекулярной массой 20000 Да. Термин "ПЭГ" в данной заявке означает молекулу полиэтиленгликоля. В обычной форме ПЭГ представляет собой линейный полимер с гидроксильными группами на концах и отвечает формуле НОСН 2 СН 2-(CH2CH2O)n-СН 2 СН 2-ОН, где n равен от приблизительно 8 до приблизительно 4000. Обычно n представляет собой не конкретное значение, а диапазон с приблизительно нормальным распределением около среднего значения. Атом водорода на конце может быть замещен на кэпирующую группу, такую как алкильная или алканольная группа. Предпочтительно ПЭГ содержит по меньшей мере одну гидроксильную группу, более предпочтительно она представляет собой концевую гидроксильную группу. Данная гидроксильная группа предпочтительно присоединена к линкерному фрагменту, который может реагировать с пептидом с образованием ковалентной связи. В данной области известны многочисленные производные ПЭГ (см., например, патенты США с номерами: 5445090; 5900461; 5932462; 6436386; 6448369; 6437025; 6448369; 6495659; 6515100 и 6514491 и Zalipsky S. Bioconjugate Chem. 6:150-165,1995). Средняя молекулярная масса молекулы ПЭГ, ковалентно присоединенной к пептиду ОХМ согласно настоящему изобретению, может составлять приблизительно 10000, 20000, 30000 или 40000 Да. Предпочтительно молекулярная масса указанной молекулы ПЭГ составляет от 18000 до 22000 Да. Более предпочтительно она составляет от 19000 до 21000 Да. Наиболее предпочтительно она составляет от 20000 до 21000 Да. Еще более предпочтительно она составляет приблизительно 20000 Да. Пегилирующие реагенты могут представлять собой линейные или разветвленные молекулы и могут присутствовать отдельно или последовательно. Пегилированные пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат расположенные последовательно молекулы ПЭГ, присоединенные к Сконцу пептида. Указанные молекулы ПЭГ предпочтительно присоединены к двум остаткам цистеина на С-конце пептида посредством метоксиПЭГ-20 кДа-малеимида (фиг. 1) или метоксиПЭГ-20 кДа-йодацетамида(фиг. 2) . На фиг. 1 и 2, n имеет значения от 10 до 2500. Предпочтительно n имеет значения от 350 до 600. Более предпочтительно n имеет значения от 425 до 475. В частности, указанные молекулы ПЭГ предпочтительно представляют собой метоксиПЭГ-20 кДамалеимид (CH3O(CH2CH2O)n-(СН 2)3NHCO(СН 2)2-малеимид) (NOF Sunbright ME-200MA) и присоединены к двум остаткам цистеина на С-конце пептида. Наиболее предпочтительный пептидный аналог оксинтомодулина содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, в которой молекулы ПЭГ представляют собой метоксиПЭГ-20 кДа-малеимид(CH3O(CH2CH2O)n-(СН 2)3NHCO(СН 2)2-малеимид)(NOF Sunbright МЕ-200 МА) и в которой карбоксильная группа пегилированного Cys в положении 39 амидирована (фиг. 3) . На фиг. 3 представлен стандартный однобуквенный код аминокислот, за исключением обведенных прямоугольниками областей, структуры аминокислотных остатков которых были модифицированы. Термин "пегилирование" в данной заявке означает ковалентное присоединение одной или более молекул ПЭГ, как описано выше, к такой молекуле, как пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению."Инсулинотропная активность" относится к способности стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенные уровни глюкозы, тем самым вызывая поглощение глюкозы клетками и снижение уровней глюкозы в плазме. Инсулинотропную активность можно оценить с помощью способов, известных в данной области, включая эксперименты in vitro, в которых измеряют секрецию инсулина линиями клеток инсулиномы или островками, или эксперименты in vivo, такие как внутривенный глюкозотолерантный тест (IVGTT), интраперитонеальный глюкозотолерантный тест (IPGTT) и пероральный глюкозотолерантный тест (OGTT). Инсулинотропную активность у людей обычно измеряют путем измерения уровней инсулина или уровней С-пептида. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению обладают сильной инсулинотропной активностью."Эффективность in vitro" в данной заявке представляет собой меру способности пептидного аналога ОХМ активировать GLP-1R или GcgR в тесте на клетках. Эффективность in vitro выражают в виде"ЕС 50", которая представляет собой эффективную концентрацию соединения, которая приводит к половине от максимального повышения измеряемого ответа (в данном случае продукции циклического АМФ) в эксперименте по дозозависимому эффекту. Термин "время полужизни в плазме" относится к времени, необходимому для выведения половины соответствующих молекул из плазмы. Альтернативно используется термин "время полувыведения". Термин "увеличенный" или "более длительный", используемый в контексте времени полужизни или времени полувыведения из плазмы, указывает на существенное увеличение времени полужизни пегилированного пептидного аналога ОХМ по сравнению с исходной молекулой (например, непегилированной формой пептида или нативным пептидом), определенного при аналогичных условиях. Ожидаемое время полужизни нативного ОХМ у обезьян, например, составляет менее чем 1 ч. Пегилированные пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению характеризуются временем полувыведения у обезьяны,составляющим по меньшей мере 24 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере 48 ч. Время полужизни, описанное в данной заявке, представляет собой время полувыведения, которое соответствует конечной линейно-логарифмической скорости выведения. Для специалиста в данной области очевидно, что время полужизни представляет собой выведенный параметр, который изменяется как функция клиренса и объема распределения. Термин "агонист GLP-1R длительного действия" в данной заявке относится к пептидному аналогуGLP-1, ковалентно присоединенному к одной или более молекулам полиэтиленгликоля (ПЭГ). Пегилированные соединения GLP-1 описаны в патенте США 7557183. Клиренс представляет собой меру способности организма выводить лекарственное средство из кровотока. При снижении клиренса вследствие, например, модификаций лекарственного средства, ожидаемое время полужизни увеличится. Тем не менее такая обратная взаимообусловленность соблюдается только когда нет изменений в объеме распределения. Пригодное приближенное соотношение между конечным линейно-логарифмическим временем полужизни (t1/2), клиренсом (С) и объемом распределения(V) определяется уравнением: t1/2=0,693 (V/C). Клиренс указывает не на выведенное количество лекарственного средства, а на объем биологической жидкости, такой как кровь или плазма, который должен будет полностью освободиться от лекарственного средства, чтобы считать его выведенным. Клиренс выражают в виде объема на единицу времени. Пегилированные пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению предпочтительно обладают значением клиренса у обезьян, равным 200 мл/ч/кг или менее, более предпочтительно 180, 150, 120, 100, 80, 60 мл/ч/кг или менее и наиболее предпочтительно 50, 40 или 20 мл/ч/кг или менее. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению как правило вводят парентерально. Парентеральное введение включает, например, системное введение, например, путем внутримышечной,внутривенной, подкожной, внутрикожной или интраперитонеальной инъекции. Пептидный аналог ОХМ вводят субъекту совместно с приемлемым фармацевтическим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом в составе фармацевтической композиции для лечения инсулиннезависимого (2 типа) сахарного диабета (NIDDM) или обсуждаемых ниже расстройств. Указанная фармацевтическая композиция может представлять собой раствор или суспензию, например такую, в которой пептидный аналог ОХМ образует комплекс с катионом двухвалентного металла, такого как цинк. Пептидный аналог также можно включить в состав твердой лекарственной формы, например, путем лиофилизации или распылительной сушки, которую перед введением снова растворяют в подходящем растворе разбавителя. Подходящие фармацевтические носители могут включать инертные ингредиенты, которые не взаимодействуют с пептидом или производным пептида. Подходящие фармацевтические носители для парентерального введения включают, например, стерильную воду, физиологический солевой раствор, бактериостатический солевой раствор (солевой раствор, содержащий приблизительно 0,9% бензилового спирта), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Хэнкса, раствор лактат Рингера и тому подобные носители. Некоторые примеры подходящих вспомогательных веществ включают лактозу, декстрозу, сахарозу, трегалозу, сорбит и маннит и консерванты, такие как фенол и м-крезол. Можно применять стандартные методики приготовления фармацевтических лекарственных форм,такие как описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания). В качестве альтернативы, пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению могут входить в состав лекарственной формы для введения буккальным, пероральным, трансдермальным, назальным или легочным путем. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению могут входить в состав формы с пролонгированным высвобождением, такой что уровни в плазме крови поддерживаются в эффективном диапазоне в течение более длительных периодов времни после введения. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению можно применять для лечения диабета, особенно, диабета 2 типа (инсулиннезависимого сахарного диабета, NIDDM). Дополнительные субъекты, которым может помочь лечение пептидными аналогами ОХМ согласно настоящему изобретению,включают субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак, субъектов, масса тела которых приблизительно на 25% или более выше нормальной массы тела для роста и телосложения данного субъекта, субъектов, у которых один или более родителей страдает отNIDDM, субъектов, которые страдают от гестационного диабета, и субъектов с метаболическими расстройствами, такими как расстройства, возникшие в результате снижения секреции эндогенного инсулина. Пептидный аналог ОХМ можно применять для предотвращения развития у субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе диабета 2 типа, предотвращения истощения бета-клеток поджелудочной железы, индукции пролиферации бета-клеток, улучшения функционирования бета-клеток, активации покоящихся бета-клеток, индукции дифференцировки клеток в бета-клетки, стимуляции деления бетаклеток и ингибирования апоптоза бета-клеток. Другие заболевания и состояния, которые можно лечить или предотвращать с помощью соединений согласно настоящему изобретению в способах согласно настоящему изобретению, включают: сахарный диабет взрослого типа у молодых (MODY) (Herman и др.,Diabetes 43:40, 1994); латентный аутоиммунный сахарный диабет взрослых (LADA) (Zimmet и др., Diabetes Med. 11:299, 1994); нарушенную толерантность к глюкозе (IGT) (Expert Committee on Classification ofDiabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Прил. 1):S5, 1999); нарушенный уровень глюкозы натощак (IFG)(Charles и др., Diabetes 40:796, 1991); гестационный диабет (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); метаболический синдром X, дислипидемию, гипергликемию, гиперинсулинемию, гипертриглицеридемию и устойчивость к инсулину. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению также можно применять в способах согласно настоящему изобретению для лечения вторичных причин диабета (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Прил. 1):S5, 1999). Такие вторичные причины включают избыток глюкокортикоидов, избыток гормона роста, феохромоцитому и лекарственный диабет. Лекарственные средства, которые могут вызвать диабет, включают, но не ограничены перечисленными, пириминил, никотиновую кислоту, глюкокортикоиды, фенитоин, тиреоидный гормон, -адренергические агенты, -интерферон и лекарственные средства, используемые для лечения ВИЧ-инфекции. Пептидные аналоги ОХМ согласно настоящему изобретению могут эффективно уменьшать потребление пищи и лечить ожирение."Эффективное количество" пептидного аналога ОХМ представляет собой такое количество, которое приводит к желательному терапевтическому и/или профилактическому эффекту, не вызывая неприемлемых побочных эффектов при введении субъекту. "Желательный терапевтический эффект" включает один или более из следующих эффектов: 1) снижение выраженности симптома(ов), связанного(ых) с заболеванием или состоянием; 2) задержку возникновения симптомов, связанных с указанным заболеванием или состоянием; 3) увеличение продолжительности жизни по сравнению с отсутствием лечения и 4) лучшее качество жизни по сравнению с отсутствием лечения. Например, "эффективное количество" пептидного аналога ОХМ для лечения NIDDM представляет собой такое количество, которое приведет к лучшему контролю за концентрацией глюкозы в крови, чем при отсутствии лечения, что, таким образом,приведет к задержке возникновения осложнений диабета, таких как ретинопатия, невропатия или болезнь почек. "Эффективное количество" пептидного аналога ОХМ для предупреждения NIDDM, например, у субъектов с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак,представляет собой такое количество, которое задержит, по сравнению с отсутствием лечения, возникновение повышенных уровней глюкозы в крови, которые требуют лечения противогипергликемическими лекарственными средствами, такими как сульфонилмочевины, тиазолидиндионы, инсулин и/или бисгуанидины."Эффективное количество" пептидного аналога ОХМ, которое вводят субъекту, также будет зависеть от типа и тяжести заболевания и от особенностей субъекта, таких как общее состояние здоровья,возраст, пол, масса тела и переносимость лекарственных средств. Доза пептидного аналога ОХМ, эффективная для нормализации уровня глюкозы в крови субъекта, будет зависеть от множества факторов, среди которых включены, без ограничения, пол, масса тела и возраст субъекта, тяжесть неспособности регулировать уровень глюкозы в крови, путь введения и биодоступность, фармакокинетический профиль пептида, его активность и лекарственная форма. Типичная еженедельная доза пегилированных пептидных аналогов ОХМ согласно настоящему изо-6 022820 бретению предпочтительно будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг (общая масса конъюгата). Более предпочтительно еженедельная доза будет находиться в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг. Наиболее предпочтительно еженедельная доза будет находиться в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг или от приблизительно 1 до приблизительно 5 мг."Субъект" представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека, но также может представлять собой животное, включая домашних животных (например, собак, кошек и тому подобных животных), сельскохозяйственных животных (например, коров, овец, свиней, лошадей и тому подобных животных) и лабораторных животных (например, крыс, мышей, морских свинок и тому подобных животных). Различные предпочтительные особенности и варианты реализации настоящего изобретения далее будут описаны исключительно в качестве примеров. Пример 1. Синтез пептида. Пептидный аналог с последовательностью SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 согласно настоящему изобретению получали путем твердофазного пептидного синтеза на автоматизированном синтезаторе пептидов Symphony от Protein Technologies Inc. или 433 А от Applied Biosystems. Синтез осуществляли на амидполистирольной смоле Fmoc-Rink (Rapp Polymere, Тюбинген, Германия) с заменами, составляющими приблизительно 0,7 ммоль/г. Синтез осуществляли, применяя стратегию использования защитных групп Fmoc для основной цепи. Используемые производные боковых цепей аминокислот представляли собой: Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(OtBu),Thr(OtBu), Trp(Boc) и Tyr(OtBu). Присоединение осуществляли приблизительно с 10 эквивалентами аминокислоты, активированной диизопропилкарбодиимидом (DIC) и гидроксибензотриазолом (HOBt)(молярное отношение 1:1:1), в диметилформамиде (DMF) или N-метилпирролидоне (NMP). Присоединение осуществляли в течение от 45 до 90 мин при комнатной температуре. Одновременное отщепление от смолы и снятие защитной группы боковой цепи осуществляли в растворе,содержащем трифторуксусную кислоту(TFA):триизопропилсилан:3,6-диокса-1,8 октандитиол:метанол :анизол 90:4:2:2:2 (об./об.) в течение от 1,5 до 2 ч при комнатной температуре. Раствор фильтровали и концентрировали до объема 2 мл и пептиды повторно осаждали холодным диэтиловым эфиром, повторно растворяли в 30-40 мл 10% ацетонитрила и очищали на колонке C18 для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (как правило, Waters SymmetryPrep, 7 мкм, 19300 мм) при скорости потока, равной 12-15 мл/мин. Образцы элюировали двухступенчатым линейным градиентом АВ от 0 до 25% В в течение 20 мин, а затем от 25 до 75% В в течение 100 мин, где А=0,05% TFA/вода и В=0,05% TFA/ацетонитрил. Продукт, как правило, элюировался при 30-35% ацетонитрила. Чистоту и молекулярную массу пептида подтверждали с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ/МС) на системе Agilent 1100 Series с одноквадрупольным МСдетектором. Разделение методом аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке Zorbax Eclipse XDBС 8, 5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм 15 см, с линейным градиентом АВ от 6 до 60% В, в котором А=0,05% TFA/H2O и В=0,05% TFA/ацетонитрил, в течение 15 мин и при скорости потока 1 мл/мин. Пептидный аналог очищали до чистоты 95% и подтверждали, что он обладает молекулярной массой, соответствующей рассчитанному значению с точностью до 1 атомной единицы массы (а.е.м.). Пример 2. Пегилирование пептида, содержащего два остатка Cys с метоксиПЭГ-мал-20 кДа. Лиофилизированный пептидный аналог (SEQ ID NO: 2), полученный согласно примеру 1, взвешивали (обычно 30-50 мг) . Взвешивали 2,1-кратный молярный эквивалент метоксиПЭГ-20 кДа-малеимида(CH3O (CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-малеимида) (NOF Sunbright МЕ-200 МА) и объединяли с пептидом. Реагенты растворяли в смеси 50/50 (об./об.) воды/ацетонитрила до концентрации пептида, равной приблизительно 20 мг/мл. Раствор пептидного аналога разбавляли в два раза 100 мМ ацетатом аммония,10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA), рН 7. Полученную смесь затем перемешивали при комнатной температуре. Осуществляли контроль реакционной смеси с помощью аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ (разделение путем аналитической ВЭЖХ осуществляли на колонке С 18 WatersSymmetryShield, 3,5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм 10 см при 50 С, с использованием двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 5 мин и от 30 до 90% В в течение последующих 30 мин, в котором А=0,05% TFA/H2O и В=0,05% TFA/ацетонитрил и скорость потока составляла 1 мл/мин),и обычно через 1-2 ч реакции наблюдалось почти полное исчезновение пика пептида. Появлялось два пика, обусловленных моно- и дипегилированным пептидом, при этом дипегилированный пептид обычно составлял 90-95% общей площади пиков. Образец затем разбавляли до приблизительно 20 мл водой и очищали, как описано в примере 1, с помощью двухступенчатого линейного градиента АВ от 0 до 30% В в течение 20 мин, а затем от 30 до 80% В в течение 100 мин. Продукт, как правило, элюировался при 3540% ацетонитрила. Осуществляли количественный анализ очищенного пептида по поглощению ультрафиолета (УФ) на 280 нм, применяя рассчитанный на основании последовательности пептида молярный коэффициент поглощения. Выход после очистки был в диапазоне от 70 до 80% в зависимости от количества исходного пептида. Пример 3. Анализ на связывание рецептора глюкагона (hGcgR). В анализе на связывание рецептора глюкагона использовали клонированный рецептор глюкагона человека (hGcgR) (Lok S., Kuijper J.L., Jelinek L.J., Kramer J.M., Whitmore T.E., Sprecher C.A., MathewesS., Grant F.J., Biggs S.H., Rosenberg G.B. и др. Gene 140 (2), 203-209 (1994, выделенный из мембран 293 НЕК. КДНК hGcgR субклонировали в экспрессионную плазмиду phD (Trans-activated expression offully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell B.W., Berg D.T.,Walls J. и Yan S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987. Данной плазмидной ДНК трансфицировали клетки 293 НЕК и осуществляли отбор клеток в 200 мкг/мл гигромицина. Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, которые растили в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 1 мМ MgCl2, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от Roche. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4 С при 1800g в течение 15 мин. Супернатант отбирали и осадок ресуспендировали в гипотоническом буфере и повторно гомогенизировали. Смесь центрифугировали при 1800g в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты центрифугировали при 1800g в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000g в течение 30 мин при 4 С. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот при -80 С до использования. Глюкагон метили радиоактивным йодом посредством процедуры с 125I-лактопероксидазой и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в Perkin-Elmer/NEN (NEX207). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение KD осуществляли с помощью гомологичного конкурирования, вместо насыщения связывания, вследствие высокого содержания пропанола в материале 125I-меченого глюкагона. KD оценили равной 2,62 нМ и использовали для расчета значений Ki для всех тестируемых соединений. Анализ на связывание рецептора осуществляли, применяя сцинтилляционный анализ сближения(SPA) с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (WGA), предварительно блокированными в 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА), свободном от жирных кислот. Буфер для связывания содержал 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), рН 7,4, 2,5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Tween20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от Roche. Глюкагон растворяли в 0,01 N HCl до концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80 С в аликвотах по 30 мкл. Аликвоту глюкагона разбавляли и использовали в анализе на связывание в течение 1 ч. Пептидный аналог ОХМ растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) и подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленных соединений или ФБР переносили в аналитические планшеты с прозрачным дном Corning 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного глюкагона (неспецифичное связывание (НСС) при конечной концентрации 1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (3 мкг/лунку), 50 мкл меченого 125I глюкагона (конечная концентрация в реакционной смеси 0,15 нМ) и 50 мкл WGA-гранул(150 мкг/лунку). Планшеты запечатывали, перемешивали опрокидыванием и считывали с помощью сцинтилляционного счетчика MicroBeta после 12 ч отстаивания при комнатной температуре. Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания 125I-меченого глюкагона в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию IC50 соединения получали с помощью нелинейной регрессии процента специфичного связывания 125I-меченого глюкагона в зависимости от добавленной концентрации соединения. Дозу IC50 преобразовывали в Ki, применяя уравнение Ченга-Прусоффа (ChengY., Prusoff W.H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). Ki пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, составляла 2050+70 нМ для связывания hGcgR. Пример 4. Анализ на связывание рецептора глюкагоноподобного пептида 1 (hGLP-1-R). В анализе на связывание рецептора GLP-1 использовали клонированный рецептор глюкагоноподобного пептида 1 человека (hGLP-1R) (Graziano M.P., Hey P.J., Borkowski D., Chicchi G.G., Strader C.D.,Biochem Biophys Res Commun, 15 октября 1993 г.; 196(1):141-6), выделенный из мембран 293HEK. КДНКS.B. Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987. Данной плазмидной ДНК трансфицировали клетки 293 HEK и осуществляли отбор клеток в 200 мкг/мл гигромицина. Неочищенные плазматические мембраны получали из клеток, которые растили в суспензионной культуре. Клетки лизировали на льду в гипотоническом буфере, содержащем 25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 1 мМ MgCl2, 20 мкг/мл ДНКазы 1 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от Roche. Суспензию клеток гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора Даунса, совершая 25 движений тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугировали при 4 С при 1800g в течение 15 мин. Супернатант отбирали, и осадок ресуспендировали в гипотоническом буфере, и повторно гомогенизировали. Смесь центрифуги-8 022820 ровали при 1800g в течение 15 мин. Второй супернатант объединяли с первым супернатантом. Объединенные супернатанты центрифугировали при 1800g в течение 15 мин для осветления. Осветленный супернатант переносили в пробирки для высокоскоростного центрифугирования и центрифугировали при 25000g в течение 30 мин при 4 С. Осадок мембран ресуспендировали в буфере для гомогенизирования и хранили в виде замороженных аликвот при -80 С до использования. Глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) метили радиоактивным йодом посредством процедуры с 125Iлактопероксидазой и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в Perkin-Elmer/NEN (NEX308). Удельная активность составляла приблизительно 2200 Ки/ммоль. Определение KD осуществляли с помощью гомологичного конкурирования, вместо насыщения связывания, вследствие высокого содержания пропанола в материале меченого 125I GLP-1. KD оценили равной 0,96 нМ и использовали для расчета значений Ki для всех тестируемых соединений. Анализ на связывание рецептора осуществляли, применяя сцинтилляционный анализ сближения(SPA) с гранулами, покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (WGA), предварительно блокированными в 1% БСА, не содержащем жирных кислот (ICN). Буфер для связывания содержал 25 мМHEPES, рН 7,4, 2,5 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 0,1% свободный от жирных кислот БСА, 0,003% Tween20 и смесь ингибиторов протеаз без ЭДТА от Roche. GLP-1 растворяли в ФБР до концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80 С в аликвотах по 30 мкл. Аликвоты GLP-1 размораживали, разбавляли и использовали в анализе на связывание в течение 1 ч. Пептидный аналог ОХМ растворяли в ФБР и подвергали серийному разведению в буфере для связывания. Затем 10 мкл разбавленных соединений или ФБР переносили в аналитические планшеты с прозрачным дном Corning 3632, содержащие 40 мкл тестового буфера для связывания или холодного GLP-1 (HCC при конечной концентрации 1 мкМ). Затем добавляли 90 мкл мембран (1 мкг/лунку), 50 мкл меченого 125I GLP-1 (конечная концентрация в реакционной смеси 0,15 нМ) и 50 мкл WGA-гранул (150 мкг/лунку). Планшеты запечатывали, перемешивали опрокидыванием и считывали с помощью сцинтилляционного счетчика MicroBeta после 12 ч отстаивания при комнатной температуре. Результаты рассчитывали в виде процента специфичного связывания 125I-меченого GLP-1 в присутствии соединения. Абсолютную концентрацию IC50 соединения получали с помощью нелинейной регрессии процента специфичного связывания 125I-меченого GLP-1 в зависимости от добавленной концентрации соединения. Концентрацию IC50 преобразовывали в Ki, применяя уравнение Ченга-Прусоффа(Cheng Y., Prusoff W.H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, 1973). Ki пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, составляла 73+3 нМ для связывания hGLP-1R. Пример 5. Функциональный анализ стимулирования цАМФ рецептором глюкагона (hGcgR). В функциональном анализе стимулирования цАМФ глюкагоном использовали ту же линию клеток,экспрессирующую клонированный hGcgR, что и для анализа на связывание hGlucR, описанного выше в примере 3. Клетки стимулировали пептидным аналогом ОХМ и осуществляли количественный анализ цАМФ, образованного в клетке, применяя гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции (ALPHAScreen) от Perkin Elmer (6760625R). Вкратце, цАМФ, образование которого было индуцировано в клетке, конкурирует с биотинилированным цАМФ из набора за связывание с акцепторной гранулой, покрытой антителом против цАМФ, при этом биотинилированный цАМФ также связывается с покрытой стрептавидином донорной гранулой. При повышении уровня цАМФ в клетке происходит разрушение комплекса акцепторная гранула-биотинилированный цАМФ-донорная гранула и наблюдается уменьшение сигнала. Клетки hGcgR-HEK293 собирали с чашек с субконфлюэнтной культурой с помощью свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (Specialty Media 5-004-B). Клетки осаждали при низкой скорости и промывали 3 раза тестовым буфером [25 мМ HEPES в буферном солевом растворе Хенкса(HBSS) с Mg и Са (GIBCO, 14025-092) с 0,1% свободным от жирных кислот БСА], затем разбавляли до конечной концентрации, равной 125000 клеток на мл. Биотинилированный цАМФ из набора ALPHAScreen добавляли к разбавленным клеткам при конечной концентрации, равной 1 ед./0,04 мл. К разбавленным клеткам также добавляли ингибитор фосфодиэстеразы IBMX (250 мМ в диметилсульфоксиде(ДМСО до конечной концентрации, равной 500 мкМ. Глюкагон сначала растворяли в 0,01 н. HCl при концентрации 1 мг/мл и незамедлительно замораживали при -80 С. После размораживания глюкагон следует использовать в течение 1 ч. Глюкагон, стандарт цАМФ и пептидный аналог ОХМ подвергали серийному разведению в тестовом буфере до 6 конечной концентрации. Функциональный анализ осуществляли в белых полистирольных 96-луночных планшетах Costar малого объема (3688). Реакцию инициировали путем добавления 0,01 мл разбавленных пептидов, глюкагона или цАМФ в 0,04 мл смеси клеток. По прошествии одного часа при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,03 мл лизирующего буфера [10 мМ HEPES рН 7,4, 1% NP40 и 0,01% свободного от жирных кислот БСА,содержащего 1 единицу каждой из акцепторных и донорных гранул из набора ALPHAScreen на 0,03 мл]. Добавление лизирующего буфера осуществляли в темноте для предотвращения обесцвечивания детектируемых гранул. Планшеты заворачивали в фольгу, аккуратно встряхивали в течение 1 мин, затем остав-9 022820 ляли для уравновешивания в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты считывали на прибореEnvision от Perkin-Elmer. Единицы ALPHAScreen преобразовывали в пмоли образованного на лунку цАМФ на основании стандартной кривой цАМФ. Пмоли цАМФ, образованного в каждой лунке, преобразовывали в процент от максимального ответа, наблюдаемого для глюкагонового контроля. ЗначениеEC50 получали с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием зависимости процента максимального ответа от добавленной концентрации пептида. Пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, подобно ОХМ дикого типа, был полностью эффективен и активен в отношении hGcgR с EC50, составляющей 59,94,14 нМ. Пример 6. Функциональный анализ стимулирования цАМФ рецептором глюкагоноподобного пептида 1 (hGLP-1R). В функциональном анализе стимулирования цАМФ GLP-1 использовали ту же линию клеток, экспрессирующую клонированный hGLP-1R, что и для анализа на связывание hGLP-1R, описанного выше в примере 4. Клетки стимулировали пептидным аналогом ОХМ и осуществляли количественный анализ цАМФ, образованного в клетке, применяя гомогенный анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции (ALPHAScreen) от Perkin Elmer (6760625R). Вкратце, цАМФ, образование которого было индуцировано в клетке, конкурирует с биотинилированным цАМФ из набора за связывание с акцепторной гранулой, покрытой антителом против цАМФ, при этом биотинилированный цАМФ также связывается с покрытой стрептавидином донорной гранулой. При повышении уровня цАМФ в клетке происходит разрушение комплекса акцепторная гранула-биотинилированный цАМФ-донорная гранула и наблюдается уменьшение сигнала. Клетки hGLP-1R-HEK293 собирали с чашек с субконфлюэнтной культурой с помощью свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток (Specialty Media 5-004-B). Клетки осаждали при низкой скорости и промывали 3 раза тестовым буфером [25 мМ HEPES в HBSS с Mg и Са (GIBCO, 14025-092) с 0,1% свободным от жирных кислот БСА], затем разбавляли до конечной концентрации, равной 125000 клеток на мл. Биотинилированный цАМФ из набора ALPHAScreen добавляли к разбавленным клеткам при конечной концентрации, равной 1 ед./0,04 мл. К разбавленным клеткам также добавляли ингибитор фосфодиэстеразы IBMX (250 мМ в ДМСО) до конечной концентрации, равной 500 мкМ. GLP-1 хранили при концентрации 1 мг/мл в ФБР в виде замороженных аликвот при -80 С. GLP-1, стандарт цАМФ и пептидный аналог ОХМ подвергали серийному разведению в тестовом буфере до 6 конечной концентрации. Функциональный анализ осуществляли в белых полистирольных 96-луночных планшетах Costar малого объема (3688). Реакцию инициировали путем добавления 0,01 мл разбавленного пептидного аналога ОХМ, GLP-1 или цАМФ в 0,04 мл смеси клеток. По прошествии 1 ч при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 0,03 мл лизирующего буфера [10 мМ HEPES рН 7,4, 1% NP40 и 0,01% свободного от жирных кислот БСА, содержащего 1 единицу каждой из акцепторных и донорных гранул из набора ALPHAScreen на 0,03 мл]. Добавление лизирующего буфера осуществляли в темноте для предотвращения обесцвечивания детектируемых гранул. Планшеты заворачивали в фольгу, аккуратно встряхивали в течение 1 мин, затем оставляли для уравновешивания в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты считывали на приборе Envision от Perkin-Elmer. Единицы ALPHAScreen преобразовывали в пмоли образованного на лунку цАМФ на основании стандартной кривой цАМФ. Пмоли цАМФ, образованного в каждой лунке, преобразовывали в процент от максимального ответа, наблюдаемого для контрольного GLP-1. Значение EC50 получали с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием зависимости процента максимального ответа от добавленной концентрации пептида. Пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, подобно ОХМ дикого типа, был полностью эффективен и активен в отношении hGLP-1R с ЕС 50, составляющей 2,750,55 нМ. Пример 7. Влияние на потребление пищи, массу тела и состав тела мышей с алиментарным ожирением (DIO). Использовали самцов мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO) в возрасте от трех до четырех месяцев. Животных поселяли отдельно в помещении с контролируемой температурой (24 С) с 12 часовым циклом света/темноты (свет включали в 22:00) и обеспечивали им свободный доступ к пище и воде. Через 2 недели акклиматизации в помещении мышей произвольно делили на группы лечения (n=810/группу), в каждой группе средняя масса тела и масса жира были аналогичны. Перед началом эксперимента мышам инъецировали подкожно (sc) раствор носителя и взвешивали их в течение 2 дней, чтобы они освоились с процедурами. Носитель или пептидный аналог ОХМ (диапазон доз 6,7-20 нмоль/кг) , растворенный в носителе,вводили путем подкожной инъекции мышам DIO, которых неограниченно кормили, за 30-90 мин до наступления цикла темноты каждый 3 день в течение от 2 до 4 недель. В то же время измеряли массу тела и массу пищи плюс кормушки. Потребленную за предшествующие 24 ч пищу рассчитывали путем вычитания массы пищи плюс кормушки на данный момент из таковой для предыдущего дня. Абсолютные изменения массы тела рассчитывали путем вычитания массы тела данного животного перед первой инъекцией. В дни 1, 14 и 28 измеряли суммарную массу жира путем ядерного магнитного резонанса (ЯМР),применяя прибор Echo Medical System (Хьюстон, Техас). Свободную от жира массу рассчитывали путем вычитания массы жира из общей массы тела. Исследование 1. Двухнедельное лечение. Пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован in vivo, вводили путем подкожной инъекции самцам C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO) в возрасте 4 месяцев. Пептидный аналог ОХМ инъецировали раз в 3 дня в течение 2 недель при дозах, равных 7,5 и 15 нмоль/кг, и сравнивали с мышами, которым вводили носитель, и животными, которым вводили положительный контроль (7,5 нмоль агониста GLP-1R длительного действия/кг, который инъецировали каждый 3 день). Лечение пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, вызывало дозозависимое снижение потребления пищи и массы тела. По окончании 2-недельного периода исследования совокупное потребление пищи в группе, которой вводили 15 нмоль/кг, снижалось на 27% по сравнению с группой, которой вводили носитель. Совокупная потеря массы тела в группе, которой вводили 7,5 нмоль/кг, была аналогична наблюдаемой для положительного контроля, которая представляла собой снижение на приблизительно 9% по сравнению с группой, которой вводили носитель. Совокупная потеря массы тела в группе, которой вводили 15 нмоль/кг(по сравнению с контролем, которому вводили носитель), составляла 18%. Анализ состава тела показал,что потеря массы тела, главным образом, происходила за счет потери массы жира (таблица 1). Таблица 1. Изменение веса у мышей DIO за 14-дневный период лечения Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, уменьшает совокупное потребление пищи и массу тела в 14-дневных исследованиях на мышах DIO, по сравнению с мышами, которым вводили носитель. Уменьшение массы тела, главным образом, происходило за счет уменьшения массы жира. р 0,05 по сравнению с носителем (критерий Дуннетта). Исследование 2. Четырехнедельное лечение. Пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (6,7 или 20 нмоль/кг) , и положительный контроль (7,5 или 22,5 нмоль агонистаGLP-1R длительного действия/кг) вводили каждый 3 день путем подкожной инъекции самцам C57BL/6 с алиментарным ожирением (DIO) в возрасте 4 месяцев в течение 4 недель. Лечение высокими дозами пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижало совокупное потребление пищи. При низких дозах пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, снижал массу тела до той же степени, что и в группе положительного контроля. При дозе 20 нмоль/кг пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, вызывал значительно большую потерю массы тела по сравнению с дозой 22,5 нмоль/кг для положительного контроля. Максимальное снижение массы тела(приблизительно 25% от исходной массы тела) было достигнуто через 15 дней лечения. Анализ состава тела подтвердил, что потеря массы тела, связанная с пептидным аналогом ОХМ и положительным контролем, главным образом, происходила за счет потери массы жира (таблица 2). Действие пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, дополнительно оценивали с помощью непрямой калориметрии в дни с 21 по 23. Животные, которым вводили пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован (20 нмоль/кг), расходовали значительно больше энергии, чем контрольные животные, которым вводили носитель (усредненный расход энергии за 24 ч в день 21 был выше на 18%). Пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в которомCys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, не привел к существенному изменению уровня двигательной активности по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель. По завершении исследования уровни инсулина и холестерина в плазме были значительно ниже во всех группах лечения, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель, при этом только в группе, которой вводили высокую дозу пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, наблюдалось значительное снижение уровней лептина. Во всех группах, которым вводили пептид, наблюдались более высокие уровни адипо- 11022820 нектина в плазме, чем у контрольных животных, которым вводили носитель, но статистически достоверное отличие наблюдалось только для группы, которой вводили высокую дозу пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован. Таблица 2. Изменение веса у мышей DIO за 28-дневный период лечения Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, уменьшает совокупное потребление пищи и массу тела в 28-дневных исследованиях на мышах DIO по сравнению с мышами, которым вводили носитель. Уменьшение массы тела, главным образом, происходило за счет уменьшения массы жира. р 0,05 по сравнению с носителем (критерий Дуннетта). Пример 8. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении перорального глюкозотолерантного теста или интраперитонеального глюкозотолерантного теста после 2-недельного или 4 недельного лечения мышей DIO соответственно. Через 56 ч после последней инъекции мышам DIO, как описано в примере 7 (исследование 1), мышей лишали пищи на 16 ч перед началом теста на толерантность к глюкозе. В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг через желудочный зонд или путем интраперитонеальной (IP) инъекции. Кровь отбирали из хвостовой вены через 0, 15, 30, 60 и 120 мин после провокации глюкозой. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Все дозы пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, а также положительный контроль значительно снижали уровень глюкозы в крови, измеренный во все моменты времени перед и после пероральной провокации глюкозой, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (таблица 3). Интраперитонеальный глюкозотолерантный тест (IPGTT) осуществляли в день 29, через 3 дня после последней инъекции мышам DIO, как описано в примере 7 (исследование 2). Низкая доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, снижала уровень глюкозы в крови натощак по сравнению с таковым для контрольных животных,которым вводили носитель, но незначительно влияла на уровни глюкозы после интраперитонеальной провокации глюкозой. Высокая доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, и обе дозы положительного контроля значительно снижали уровень глюкозы в крови, измеренный во все моменты времени перед и после интраперитонеальной провокации глюкозой, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель(таблица 4). Таблица 3. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после пероральной нагрузки глюкозой. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от t+0 до 120 мин) (n=8) Полученные результаты показали, что через 2 недели лечения мышей DIO пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован,наблюдалось существенное уменьшение колебаний уровня глюкозы в крови после пероральной нагрузки глюкозой. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта ( р 0,05 по сравнению с носителем). Таблица 4. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеальной (ip) нагрузки глюкозой. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от t+0 до 120 мин) (n=6) Полученные результаты показали, что через 4 недели лечения мышей DIO пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован,наблюдалось существенное уменьшение колебаний уровня глюкозы в крови после интраперитонеальной(ip) нагрузки глюкозой. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта ( р 0,05 по сравнению с носителем). Пример 9. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении интраперитонеального глюкозотолерантного теста у худых мышей. Для данного исследования использовали самцов мышей C57BL/6 в возрасте девяти недель. Животных произвольно делили на группы на основании массы тела. Животным инъецировали носитель или пептидный аналог ОХМ (доза составляла 5,0-15,0 нмоль/кг) за 16 ч до начала теста. Пищу удаляли во время инъекции пептида или носителя. В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг путем интраперитонеальной инъекции. Кровь брали из хвостовой вены через 0, 3, 6, 12 и 30 мин после провокации глюкозой. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Инсулин измеряли с помощью Mesoscale. Высокая доза пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижала колебания уровня глюкозы в крови, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (таблица 5). Обе дозы пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно повышали концентрации инсулина в плазме по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель (табл. 6). Таблица 5. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ip) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от t+0 до 30 мин) (n=6) Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижал колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ip) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта ( р 0,05 по сравнению с носителем). Таблица 6. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на уровень инсулина в плазме после интраперитонеального(ip) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Результаты представлены в виде площади под кривой инсулина (= интегрированные значения от t+0 до 30 мин) (n=6) Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно увеличивал площадь под кривой уровня инсулина в плазме после интраперитонеального (ip) глюкозотолерантного теста у худых мышей. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта ( р 0,05 по сравнению с носителем). Пример 10. Влияние на колебания уровня глюкозы в крови при проведении перорального глюкозотолерантного теста (OGTT) или интраперитонеального (ip) глюкозотолерантного теста (IPGTT) у мышейob/ob. Самцов мышей ob/ob в возрасте от двух до трех месяцев поселяли отдельно в помещении с контролируемой температурой (24 С) с 12-часовым циклом света/темноты (свет включали в 22:00 ч) и обеспечивали им свободный доступ к стандартной пище и воде. Через по меньшей мере 2 недели акклиматизации в помещении, после 3-часового голодания измеряли уровень глюкозы в крови из хвостовой вены в 9 утра. Мышей с уровнем глюкозы в крови ниже 180 мг/дл не брали в исследование. Остальных животных произвольно делили на группы лечения (N=6-7/группу), в каждой группе средний уровень глюкозы в крови был аналогичен. Мышам обеспечивали доступ к пище до момента инъекции. Животным инъецировали носитель или 7,5 нмоль пептидного аналога ОХМ/кг в 4 ч вечера того же дня. Пищу удаляли во время инъекции. Через 16 ч после инъекции пептида проводили OGTT (таблица 7) или IPGTT (таблица 8). В момент времени 0 животным давали 2 г декстрозы/кг через желудочный зонд (таблица 7) или путем интраперитонеальной инъекции (таблица 8). Кровь брали из хвостовой вены через 0, 15, 30, 60 и 120 мин после провокации глюкозой. Концентрацию глюкозы измеряли с помощью глюкометра. Однократная инъекция пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в которомCys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, нормализовала уровень глюкозы в крови у мышей ob/ob. Уровни глюкозы в крови, измеренные во все моменты времени после провокации глюкозой, были значительно ниже, чем таковые в контрольной группе, которой вводили носитель. Таблица 7. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после перорального глюкозотолерантного теста у мышей ob/ob. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от t+0 до 120 мин) (n=7) Полученные результаты показали, что пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижал колебания уровня глюкозы в крови после перорального глюкозотолерантного теста у мышей ob/ob. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (р 0,05 по сравнению с носителем). Таблица 8. Влияние пептидного аналога ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys(20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, на колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ip) глюкозотолерантного теста у мышей ob/ob. Результаты представлены в виде площади под кривой глюкозы (= интегрированные значения от t+0 до 120 мин) (n=6) Полученные результаты показали, что пептидный аналог с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, значительно снижал колебания уровня глюкозы в крови после интраперитонеального (ip) глюкозотолерантного теста у мышей ob/ob. Статистическую значимость оценивали с помощью критерия Дуннетта (р 0,05 по сравнению с носителем). Пример 11. Мгновенное воздействие на уровни в плазме FGF21, триглицеридов и на экспрессию генов печени у самцов мышей C57BL/6 с алиментарным ожирением. Для того чтобы исследовать метаболические пути, на которые влияет лечение пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован,независимо от потери массы тела, пептидный аналог ОХМ и положительный контроль (агонист GLP-1R пролонгированного действия) вводили путем подкожной инъекции самцам мышей с алиментарным ожирением (DIO) в возрасте 3 месяцев. За день до исследования мышей произвольно делили на группы ле- 14022820 чения (N=7/группу), в каждой группе средняя масса тела была аналогична. В тот же вечер (приблизительно в 10 ч вечера) животных помещали в чистые клетки и вводили им носитель или пептидный аналог ОХМ путем подкожной инъекции. Пептидный аналог ОХМ и контроль вводили при концентрации 22,5 нмоль/кг. Пищу удаляли во время инъекции пептида или носителя. На следующее утро (приблизительно в 10 утра) животных умерщвляли, чтобы собрать плазму и ткань печени. Измеряли концентрации глюкозы и триглицеридов, применяя анализатор химического состава крови Hitachi. Экспрессию генов определяли с помощью ПЦР-РВ. Уровни малонил-КоА и ацетил-КоА измеряли с помощью ВЭЖХ. После однократной инъекции уровень глюкозы в плазме во всех группах лечения был значительно ниже по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель. Уровень триглицеридов в плазме был ниже по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель, только у мышей, которым вводили пептидный аналог ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, но не у мышей, которым вводили агонист GLP-1R пролонгированного действия. Концентрации малонил-КоА и ацетил-КоА в печени были значительно снижены на 63 и 39% соответственно после лечения пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, по сравнению с контрольными животными, которым вводили носитель. Лечение пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован, изменяло экспрессию нескольких генов печени,включая повышение экспрессии гена pgc-1 в 7 в раз и снижение экспрессии генов ChREBP и PCSK9 на 52 и 61% соответственно. Вдобавок, экспрессия гена FGF21 в печени была повышена в 17 раз в соответствии с 6-кратным повышением FGF21 в кровотоке после незамедлительного лечения пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован. Все наблюдаемые изменения были характерны для мышей, которых лечили пептидным аналогом ОХМ с последовательностью SEQ ID NO: 3, в котором Cys (20 кДа ПЭГ) в положении 39 амидирован. Перечень последовательностейHis-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-ValGln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa39 (SEQ ID NO: 5),в которой Хаа 38 представляет собой Cys, Cys-ПЭГ или отсутствует; Хаа 38 представляет собой Cys,Cys-ПЭГ или отсутствует; и в которой С-концевая аминокислота необязательно амидирована. 2. Пептидный аналог оксинтомодулина по п.1, содержащий последовательность аминокислотHis-(Aib)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-ValGln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Gly-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys (SEQ ID NO: 2),в которой остаток Cys в положении 38 необязательно пегилирован; в которой остаток Cys в положении 39 необязательно пегилирован и карбоксильная группа Cys в положении 39 необязательно амидирована. 3. Пептидный аналог оксинтомодулина по п.2, где указанный аналог пегилирован молекулой ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 40 кДа, присоединенной к тиольной группе остатка Cys либо в положении 38, либо в положении 39. 4. Пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1 или 2, где указанный аналог пегилирован по тиолу обоих остатков Cys в положениях 38 и 39 молекулой ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 20 кДа в каждом случае и содержит последовательность аминокислотID NO: 3),в которой карбоксильная группа пегилированного Cys в положении 39 необязательно амидирована. 5. Пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1-4, где молекула ПЭГ является линейной. 6. Пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1-5, где карбоксильная группа остатка Cys в положении 39 амидирована. 7. Пептидный аналог оксинтомодулина по п.1, где остаток Cys в положении 39 отсутствует, а оста- 19022820 ток Cys в положении 38 пегилирован молекулой ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 40 кДа и необязательно амидирован. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая пептидный аналог оксинтомодулина по любому из пп.1-7, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. 9. Способ лечения инсулиннезависимого диабета у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7. 10. Способ лечения ожирения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7. 11. Применение пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7 для лечения инсулиннезависимого диабета. 12. Применение пептидного аналога оксинтомодулина по любому из пп.1-7 для лечения ожирения.