Способ изготовления вакцин

013374 Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам проведения реакций карбодиимидной конденсации. В частности, оно относится к конъюгации сахаридов и белков с применением карбодиимидной конденсации. Оно также относится к иммуногенным композициям, которые могут быть изготовлены с использованием сахаридно-белковых конъюгатов по изобретению. Применение бактериальных капсульных полисахаридов широко используют в иммунологии в течение многих лет для профилактики бактериального заболевания. Проблема с таким применением, тем не менее, представляет собой Т-независимую природу иммунного ответа. Эти антигены, таким образом,недостаточно иммуногенны у детей младшего возраста. Эту проблему преодолевали посредством конъюгации полисахаридных антигенов и белкового носителя (источника Т-хелперных эпитопов), который может быть затем использован для того, чтобы вызвать Т-зависимый иммунный ответ, даже на первом году жизни. В данной области техники известны различные методики конъюгации. Конъюгаты могут быть приготовлены способами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) иUS 4673574 (Anderson). Другие способы описаны в ЕР-0-161-188, ЕР-208375 и ЕР-0-477508. Способ конъюгации может альтернативно быть основан на активации гидроксильных групп в сахариде тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием эфира циановой кислоты. Активированный сахарид можно, таким образом, сочетать непосредственно или посредством спейсерной(линкерной) группы с аминогруппой на белке-носителе. Например, эфир циановой кислоты можно сочетать с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH или АН), и аминодериватизированный сахарид конъюгируют с белком-носителем, используя карбодиимидную (например, EDAC илиEDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид химию посредством карбоксильной группы, на белковом носителе. Такие конъюгаты описаны в заявке WO 93/15760 (Uniformed Services University) иWO 95/08348, 96/29094, опубликованных согласно РСТ. См. также Chu С. et al. Infect. Immunity, 1983,245 256. В общем, следующие типы химических групп на белковом носителе могут быть использованы для сочетания/конъюгации:A) карбоксильная (например, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту), которая может быть конъюгирована с естественными или дериватизированными аминогруппами на сахаридных группировках с применением карбодиимидной химии; Б) аминогруппа (например, через лизин), которая может быть конъюгирована с естественными или дериватизированными карбоксильными группами на сахаридных группировках с применением карбодиимидной химии;B) сульфгидрильная (например, через цистеин); Г) гидроксильная группа (например, через тирозин); Д) имидазолильная группа (например, через гистидин); Е) гуанидильная группа (например, через аргинин) и Ж) индолильная группа (например, через триптофан). На сахариде, в общем, следующие группы могут быть использованы для сочетания ОН, СООН илиNH2. Альдегидные группы могут быть образованы после различных воздействий, известных в данной области техники, таких как периодат, кислотный гидролиз, пероксид водорода и т.п. Методы прямого сочетания: сахарид-ОН + CNBr или CDAPэфир циановой кислоты + NH2-белокконъюгат; сахарид-альдегид + NH2-белокоснование Шиффа + NaCNBH3 конъюгат; сахарид-СООН + NH2-белок + EDACконъюгат; сахарид-NH2 + СООН-белок + EDACконъюгат. Методы непрямого сочетания через спейсер (линкер): сахарид-ОН + CNBr или CDAPэфир циановой кислоты + NH2NH2 сахаридNH2 + СООН-белок +(нативный белок с доступным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка, например, посредством SPDP)сахарид-S-S-белок; сахарид-ОН + CNBr или CDAPэфир циановой кислоты + NH2SHсахаридSH + малеинимид-белок (модификация аминогрупп)конъюгат; сахарид-СООН + EDAC + NH2NH2 сахаридNH2 + EDAC + СООН-белокконъюгат; сахарид-СООН + EDAC + NH2SHсахаридSH + SH-белок (нативный белок с доступным цистеином или полученный после модификации аминогрупп белка, например, посредством SPDP)сахарид-S-S-белок; сахарид-СООН + EDAC + NH2SHсахаридSH + малеинимид-белок (модификация аминогрупп)конъюгат; сахарид-альдегид + NH2NH2 сахаридNH2 + EDAC + СООН-белокконъюгат. Как может быть замечено, карбодиимидная химия (например, с применением EDAC) очень подхо-1 013374 дит для реакций конъюгации, потому что она использует группы на сахариде и/или белке, которые могут присутствовать естественным образом или легко быть включены посредством дериватизации. Она также легко соединяет группировки посредством пептидной связи. Карбодиимиды (RN=C=NR') представляют собой ненасыщенные соединения с алленовой структурой (Nakajima and Ikada, 1995, Bioconjugate Chem., 6: 123-130; Hoare and Koshland, 1967, JBC, 242:24472453). Это химическое вещество относительно нестабильно при его рН (4,5-6,5) в реакции, и, следовательно, все компоненты реакции сахаридной/белковой/карбодиимидной конъюгации имеют тенденцию быть добавленными вместе согласно информации из уровня техники. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в зависимости от природы сахарида и белка, подлежащих конъюгации, лучшие характеристики конечного конъюгата для вакцины могут быть достигнуты путем медленного добавления определенного компонента реакции к смеси. При этом может быть реализовано одно или более преимуществ/усовершенствований, таких как выход сахарида в конъюгате,стерильная фильтруемость конъюгата, лучший контроль конъюгации, более простая воспроизводимость и/или предотвращение сшивок внутри группировок. Соответственно, в одном воплощении предложен способ конъюгации сахарида и белкового носителя с применением химии карбодиимидной конденсации, где сахарид содержит (например, как часть его повторяющегося звена) аминогруппы и/или карбоксильные группы или дериватизирован, чтобы содержать аминогруппы и/или карбоксильные группы, и где белковый носитель содержит аминогруппы и/или карбоксильные группы или дериватизирован, чтобы содержать аминогруппы и/или карбоксильные группы, включающий стадии:I) если белковый носитель содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы и сахарид содержит или аминогруппы, или карбоксильные группы: а) смешивания сахарида и аликвоты карбодиимида, необходимого для проведения конъюгации, и б) добавления аликвоты белкового носителя, необходимой в течение периода от 35 с до 6 ч;II) если сахарид содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы и белковый носитель содержит или аминогруппы, или карбоксильные группы: а) смешивания белкового носителя и аликвоты карбодиимида, необходимой для проведения конъюгации, и б) добавления аликвоты сахарида, необходимой в течение периода от 35 с до 6 ч;III) если сахарид содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы и белковый носитель содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы: а) смешивания белкового носителя и сахарида и б) добавления аликвоты карбодиимида, необходимой для проведения конъюгации в течение периода от 35 с до 6 ч. Подробное описание Любой подходящий карбодиимид может быть использован, если он способен конъюгировать сахариды и белки в водной среде. В одном воплощении карбодиимид может представлять собой EDAC(1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) (также известный как EDC) или он может представлять собой карбодиимид, отличный от EDAC. Термин сахарид во всем этом описании может обозначать полисахарид или олигосахарид и включает и то, и другое. Он может обозначать липополисахарид (LPS) или липоолигосахарид (LOS). Перед применением полисахариды (такие как бактериальные полисахариды) могут быть выделены из штамма-источника (например, бактерий) или выделены из штамма-источника и в некоторой степени отсортированы по размеру посредством известных способов (см., например, ЕР 497524 и ЕР 497525;Shousun Chen Szu et al. Carbohydrate Research, Vol. 152, p.7-20 (1986, например посредством микрофлюидизации. Полисахариды могут быть отсортированы по размеру с целью снизить вязкость в образцах полисахаридов и/или улучшить фильтруемость для конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют низкое число повторяющихся звеньев (обычно 5-30 повторяющихся звеньев) и обычно представляют собой гидролизованные полисахариды. Термин белковый носитель имеет целью охватить и небольшие пептиды, и большие полипептиды( 10 кДа). Очевидно, большие полипептиды с большей вероятностью содержат и реакционноспособные аминогруппы, и карбоксильные группы без какой-либо модификации. Для целей изобретения нативный полисахарид относится к сахариду, который не был подвергнут процессу, целью которого является уменьшение размера сахарида. Полисахарид может быть немного уменьшен в размере во время нормальных процедур очистки. Такой сахарид еще является нативным. Только если полисахарид был подвергнут методам сортировки по размеру, его не считают нативным. Для целей изобретения сортированный по размеру с коэффициентом до 2 означает, что сахарид представляет собой объект процесса, направленного на уменьшение размера сахарида, но сохранение размера, превышающего половину размера нативного полисахарида. Х 3, 4 и тому подобное следует интерпретировать таким же образом, то есть сахарид представляет собой объект процесса, направленного на уменьшение размера полисахарида, но сохранение размера, превышающего треть, четверть и т.д.-2 013374 размера нативного полисахарида. Период времени от 35 с до 6 ч на стадии (б) способа добавления полной аликвоты конечного компонента может составлять от 50 с до 5 ч, от 1 мин до 4 ч, от 2 мин до 3 ч, от 3 мин до 2 ч, от 4 до 60 мин,от 5 до 50 мин, от 6 до 40 мин, от 7 до 30 или от 8 до 20 мин. Он может составлять от 1 мин до 5 ч, от 10 мин до 4 ч, от 20 мин до 3 ч, от 30 мин до 2 ч, от 40 до 90 или от 50 до 70 мин. Это время может быть скорректировано в соответствии с определенным конъюгируемым сахаридом и белком. В одном воплощении аликвоту конечного компонента (например, карбодиимида, сахарида или белка) добавляют к реакционной смеси с постоянной скоростью в течение периода времени (этого легко достигают, используя насос, работающий с постоянной скоростью). Альтернативно, она может быть добавлена постадийно в течение периода времени. Несмотря на то что это может быть сделано разными путями, в общем, части аликвоты следует добавлять на всем протяжении этого периода. Например, по меньшей мере одна четверть аликвоты может быть добавлена в течение первой половины периода и по меньшей мере одна четверть аликвоты - в течение второй половины периода. Общее количество аликвоты а, измеряемое, например, в миллилитрах или миллиграммах, может быть добавлено за 4-100 стадий(s) на всем протяжении периода. В одном воплощении стадии могут быть организованы так, что равное количество (a/s) вводят на всех стадиях. В одном воплощении стадии равномерно расположены на всем протяжении периода р (в секундах). Таким образом, если одна стадия происходит в нулевое время периода р, то каждая последующая стадия может происходить во время, составляющее p/(s-1). Объем аликвоты конечного компонента, добавляемой на стадии (б), может быть скорректирован на основании простоты добавления аликвоты к реакционной смеси в пределах желаемого периода времени. Карбодиимид может быть добавлен как водный раствор (обычно забуференный при рН 7,5 перед добавлением к реакционной смеси) или как твердый порошок (EDAC, например, высоко растворим в водных средах). Конечно, если карбодиимид представляет собой последний компонент, добавляемый к реакционной смеси (ситуация III, стадия (б, медленно растворяющийся карбодиимид может быть использован так,что целую аликвоту порошка добавляют к реакционной смеси сразу, но она растворяется со скоростью,соответствующей желаемому периоду, в течение которого аликвоту следует сделать доступной для реакции. Если белок и/или сахарид не имеет аминогруппы или карбоксильной группы (или имеет только одну из них), он может быть дериватизирован, чтобы дать ему такую группу (или дать ему другую группу,которой у него еще нет). Например, для сахарида, содержащего только реакционноспособные гидроксильные группы (например, капсульного сахарида менингококка серогруппы А), такая группа может быть использована для дериватизации на аминогруппах или карбоксильных группах так, что может быть проведена EDAC-конденсация. Она может занять место в пределах повторяющейся субъединицы или может представлять собой группу, присутствующую только в конце молекулы сахарида. Следует отметить, что там, где происходит дериватизация, может быть выгодно дериватизировать группировку лишь частично. Для сахаридов с повторяющимися субъединицами целевой эпитоп может присутствовать в каждом повторе. Таким образом, если происходит частичная дериватизация (здесь это означает, что 0,5-20, 1-15, 3-12 или 5-10% целевых реакционноспособных групп в действительности дериватизируют), это может иметь преимущество сохранения большинства эпитопов и предотвращения слишком большого количества сшивок. Если сахарид или белок уже имеет только аминогруппы или карбоксильные группы (например, Vi сахарид от Salmonella typhi, который естественным образом имеет карбоксильные группы, но не аминогруппы), дериватизация может происходить, чтобы дать ему другой тип группы (то есть аминогруппы для Vi). Тем не менее, следует отметить, что поскольку дериватизация может быть частичной, это действие может изменять предпочтительную реакцию по изобретению с типа I на тип III. Например, если Vi сахарид конъюгируют с белковым носителем, содержащим и аминогруппы, и карбоксильные группы, в ситуации I медленно добавляют аликвоту белка на стадии (б). Если карбоксильную группу Vi сахарида частично дериватизируют с аминогруппами, он будет иметь и карбоксильные группы, и аминогруппы,таким образом, ситуация III, медленное добавление аликвоты карбодиимида на стадии (б), становится наиболее уместной. Дериватизация может происходить посредством добавления гетеро- или гомобифункционального линкера. Это может происходить с похожей химией, как описано выше для стадии сахаридно-белковой конъюгации (например, CDAP- или карбодиимидной химией). Линкер может иметь от 4 до 20, от 4 до 12 или от 5 до 10 атомов углерода. Он может иметь две реакционноспособные аминогруппы, две реакционноспособные карбоксильные группы или по одной из каждой (например, гександиамин, 6-аминокапроновая кислота или дигидразид адипиновой кислоты). Обычно дериватизация происходит посредством взаимодействия большого избытка линкера с сахаридом и/или белковым носителем, подлежащими дериватизации. Это позволяет дериватизации происходить с образованием минимального количества сшивок внутри группировок (которые, в противном случае, могут быть возможны, если, например, карбоксильную группу на сахариде дериватизировали с аминогруппами, используя карбодиимидную конденсацию). Избыток линкера легко удаляют, используя такие методы, как диафильтрация. В одном воплощении сахарид содержит реакционноспособную гидроксильную группу как часть его-3 013374 повторяющегося звена, которую частично дериватизируют через аминогруппу на линкере (например,CDAP-химией). В другом воплощении сахарид содержит реакционноспособную аминогруппу как часть его повторяющегося звена, которую частично дериватизируют через карбоксильную группу на линкере(например, карбодиимидной химией). В еще одном воплощении сахарид содержит реакционноспособную карбоксильную группу как часть его повторяющегося звена, которую частично дериватизируют через аминогруппу на линкере (например, карбодиимидной химией). Аликвота карбодиимида, необходимая для проведения конъюгации (любая из двух, присутствующих на стадии (а) или (б) реакции по изобретению), составляет от 0,01 до 3, от 0,05 до 2 или от 0,09 до 1 мг карбодиимида/мг сахарида. Хотя эти цифры рассчитаны в отношении EDAC, представляющего собой карбодиимид, эти цифры могут быть скорректированы, если используют любой другой карбодиимид, посредством умножения цифр в пределах по формуле (молекулярная масса другого карбодиимида)/(молекулярная масса EDAC). В общем, сахарид может присутствовать в способах по изобретению в конечной концентрации 0,5-50 мг/мл на стадии (б). Это будет зависеть от размера и природы сахарида и от степени какой-либо дериватизации. Например, для олигосахаридов будет необходима большая концентрация, но для больших полисахаридов более подходящей будет намного меньшая концентрация. Если это относится к верхнему пределу частично дериватизированных с аминогруппами или карбоксильными группами,меньшая концентрация может быть подходящей, чтобы снизить возможность какого-либо образования сшивок. Белковый носитель может присутствовать в конечной концентрации 1-50 мг/мл на стадии (б). Начальное отношение белкового носителя к сахариду в способах по изобретению может составлять от 5:1 до 1:5, от 4:1 до 1:1 или от 3:1 до 2:1 (мас./мас. (w/w. Снова, это будет зависеть от размера и природы сахарида и от степени какой-либо дериватизации. Солевые условия (например, NaCl) также могут быть изменены в соответствии с природой сахарида/белка. Обычно около 0,2 М NaCl может присутствовать на стадии (б) способов по изобретению, но может представлять собой 0-2, 0,1-1 или 0,2-0,5 М. В отношении рН на стадии (б) способов по изобретению рН реакции может представлять собой любой рН, при котором карбодиимид активирован, например рН 4,5-6,5, 4,7-6,0 или 5-5,5. Этот рН обычно поддерживают на всем протяжении реакции посредством добавления кислоты/основания, как необходимо. EDAC обычно стабилен при рН 7,5, однако, если необходимо проводить конъюгацию при более высоком рН, в реакции на стадии (б) могут также присутствовать соединения, о которых известно, что они поддерживают стабильным промежуточный продукт реакции (такие как N-гидроксисукцинимид), и в этом случае рН реакции на стадии (б) можно поддерживать при рН 4,5-7,5. Температура реакции в течение стадии (б) способов по изобретению может составлять 4-37, 10-32,17-30 или 22-27 С, и ее обычно поддерживают на всем протяжении реакции. В способах по изобретению, как только на стадии (б) была добавлена целая аликвота, реакцию обычно поддерживают в течение еще от 10 мин до 72 ч, от 20 мин до 48 ч, от 30 мин до 24 ч, от 40 мин до 12 ч, от 50 мин до 6 ч или 1-3 ч. Как только реакция закончена, рН доводят до 7,5-9 (по направлению к верхнему пределу этого, если присутствует N-гидроксисукцинимид), чтобы вернуться к пределам стабильного рН карбодиимида. Как только сахаридно-белковый конъюгат конъюгирован, он может быть очищен от непрореагировавших компонентов, свободного сахарида и т.п. посредством введения его в колонку для гельхроматографии (например, Sephacryl S400HR, Pharmacia). Ее обычно проводят при 2-8 С. Конъюгат можно подвергать стерильной фильтрации, затем хранить. В конечном счете, эффективная доза (например, 1-20, 2-15 или 3-10 мкг сахарида/доза) сахаридно-белкового конъюгата может быть приготовлена с фармацевтически приемлемым эксципиентом (например, солью или адъювантом) для изготовления иммуногенной композиции или вакцины. В отношении сахаридов по изобретению любой сахарид из вирусного, грибкового, бактериального или эукариотического источника может быть конъюгирован с применением способов по изобретению. Он может представлять собой Vi сахарид от Salmonella typhi или сахарид, отличный от Vi. Он может представлять собой капсульный сахарид Hib из Н. influenzae типа b или может представлять собой сахарид, отличный от Hib. В одном воплощении сахарид представляет собой бактериальный капсульный сахарид, например, имеющий происхождение от бактерии, выбранной из перечня, состоящего из N. meningitidis серогруппы А (MenA), В (MenB), С (MenC), W135 (MenW) или Y (MenY), Streptococcus pneumoniae серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F или 33F, группы Ia, Ib, II, III, IV, V, VI или VII Streptococcus группы В, Staphylococcus aureus типа 5,Staphylococcus aureus типа 8, Salmonella typhi (Vi сахарид), Vibrio cholerae или H. influenzae типа b. Среднемассовая молекулярная масса сахарида может составлять 1000-2000000, 5000-1000000,10000-500000, 50000-400000, 75000-300000 или 100000-200000. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида здесь относится к среднемассовой молекулярной массе (Mw) сахарида, измеряемой перед конъюгацией, и ее измеряют посредством многоугловой лазерной спектроскопии(MALLS). Методика MALLS хорошо известна в уровне техники, и ее обычно проводят, как описано в примере 2. Для MALLS-анализа сахаридов могут быть использованы две колонки (TSKG6000 и-4 013374 5000PWxl) в комбинации, и сахариды элюируют в воде. Сахариды выявляют, используя детектор светорассеяния (например, Wyatt Dawn DSP, оборудованный 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и интерференционный рефрактометр (например, Wyatt Otilab. DSP, оборудованный ячейкой Р 100 и красным фильтром на 498 нм). В одном воплощении полидисперсность сахарида составляет 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2,1-1,1 или 1-1,05, и после конъюгации с белком-носителем полидисперсность конъюгата составляет 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 или 1,5-2,0. Все измерения полидисперсности осуществляют посредством MALLS. Сахарид может представлять собой или нативный полисахарид, или он может быть сортирован по размеру с коэффициентом не более 2, 4, 6, 8, 10 или 20 (например, посредством микрофлюидизации (например, посредством прибора Emulsiflex C-50) или другой известной методики (например, тепловыми,химическими, окислительными, ультразвуковыми способами. Олигосахариды могут быть еще существенно сортированы по размеру (например, посредством известных тепловых, химических или окислительных способов). Известны структуры большинства этих сахаридов (и, таким образом, имеют ли они естественным образом аминогруппы или карбоксильные группы для карбодиимидной химии или какую-либо другую реакционноспособную группу, которая может быть дериватизирована с аминогруппами или карбоксильными группами (см. табл. ниже). Сахарид может представлять собой бактериальный липоолигосахарид или липополисахарид (см. табл. выше), например, имеющий происхождение от бактерии, выбранной из перечня, состоящего изN. meningitidis, H. influenzae, Е. coli, Salmonella или М. catarrhalis. LOS может представлять собой менингококковый иммунотип L2, L3 или L10. Он может быть детоксифицирован посредством щелочной обработки его группировки липида А. В одном воплощении капсульный сахарид MenA, по меньшей мере, частично О-ацетилирован так, что по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев О-ацетилированы по меньшей мере в одном положении. О-ацетилирование, например, присутствует по меньшей мере в О-3-положении по меньшей мере 50,60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. В одном воплощении капсульный сахарид MenC, по меньшей мере, частично О-ацетилирован так, что по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98%(29)-связанных NeuNAc повторяющихся звеньев О-ацетилированы по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование, например, присутствует в О-7-положении и/или О-8-положении по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. В одном воплощении капсульный сахаридMenW, по меньшей мере, частично О-ацетилирован так, что по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев О-ацетилированы по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование, например, присутствует в О-7-положении и/или O-9-положении по меньшей мере 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. В одном воплощении капсульный сахаридMenY, по меньшей мере, частично О-ацетилирован так, что по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,95 или 98% повторяющихся звеньев О-ацетилированы по меньшей мере в одном или двух положениях. О-ацетилирование присутствует в 7- и/или 9-положении по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся звеньев. Процент О-ацетилирования относится к проценту повторяющихся звеньев, содержащих О-ацетилирование. Это может быть измерено в сахариде перед конъюгацией и/или после конъюгации.-6 013374 Белковый носитель может представлять собой любой пептид или белок. Он может содержать один или более Т-хелперных эпитопов. В одном воплощении по изобретению белковый носитель выбран из группы, состоящей из ТТ (столбнячный анатоксин), DT (дифтерийный анатоксин), CRM197, фрагмента С ТТ, белка D H. influenzae, пневмококкового PhtD и пневмококкового пневмолизина. Белок-носитель может представлять собой столбнячный анатоксин (ТТ), фрагмент С столбнячного анатоксина, нетоксичные мутанты столбнячного токсина (примечание: в целях этого изобретения все такие варианты ТТ рассматривают как один и тот же тип белка-носителя), дифтерийный анатоксин (DT), CRM197, другие нетоксичные мутанты дифтерийного токсина (такие как CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida etal. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 и CRM107 и другие мутации, описанные Nicholls и Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc., 1992; делеция или мутация Glu-148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 на Gly, и другие мутации, раскрытые вUS 4709017 или 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, раскрытые в US 5917017 или 6455673; или фрагмент, раскрытый СШАUS 5843711) (примечание: в целях этого изобретения все такие варианты DT рассматривают как один и тот же тип белка-носителя), пневмококковый пневмолизин (Kuo et al. (1995) Infect Immun., 63; 2706-13),OMPC (менингококковый белок наружной мембраны, обычно получаемый из N. meningitidis серогруппы В, ЕР 0372501), синтетические пептиды (ЕР 0378881, 0427347), белки теплового шока (WO 93/17712,94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные человеческие CD+ Т-клеточные эпитопы из антигенов, имеющие происхождение от различных патогенов (Falugi et al.(2001) Eur. J. Immunol., 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun., 72; 4884-7), пневмококковый поверхностный белок PspA (WO 02/091998), белки поглощения железаBVH-3). В еще одном аспекте изобретения предложен конъюгат сахарида и белкового носителя (или иммуногенная композиция, или вакцина) которую можно получить или получают способом по изобретению. Также предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по изобретению в изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения заболевания и способ профилактики или лечения заболевания, включающий стадию введения эффективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом. Применение или способ могут представлять собой такие, при которых заболевание вызвано бактерией, выбранной из списка, состоящего из N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, М. catarrhalis, группы В Streptococcus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli и Н. influenzae. Иммуногенные композиции по изобретению могут также содержать вакцину DTPa или DTPw (например, содержащую DT, ТТ и или цельноклеточную коклюшную (Pw) вакцину, или бесклеточную коклюшную (Ра) вакцину (содержащую, например, коклюшный анатоксин, FHA (фимбриальный гемагглютинин), пертацин и, возможно, агглютиногены 2 и 3. Такие комбинации могут также содержать вакцину против гепатита В (например, она может содержать поверхностный антиген гепатита В (НерВ), возможно, адсорбированный на фосфате алюминия). В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит сахаридные конъюгаты Hib, MenA и MenC, или сахаридные конъюгаты Hib и MenC,или сахаридные конъюгаты Hib, MenC и MenY, или сахаридные конъюгаты MenA, MenC, MenW иMenY, где по меньшей мере один, два или все сахаридные конъюгаты изготовлены в соответствии со способом по изобретению. Иммуногенные композиции по изобретению, возможно, содержат дополнительные вирусные антигены, предоставляющие защиту от болезни, вызванной корью, и/или эпидемическим паротитом, и/или краснухой, и/или ветряной оспой. Например, иммуногенная композиция по изобретению содержит антигены от кори, эпидемического паротита и краснухи (MMR) или кори, эпидемического паротита, краснухи и ветряной оспы (MMRV). В воплощении эти вирусные антигены, возможно, присутствуют в той же упаковке, что и конъюгат (конъюгаты) менингококкового и/или Hib сахарида, присутствующий в композиции. В воплощении эти вирусные антигены лиофилизированы. В воплощении иммуногенная композиция по изобретению также содержит антиген от N. meningitidis серогруппы В. Антиген, возможно, представляет собой препарат везикул наружной мембраны отN. meningitidis серогруппы В, как описано в ЕР 301992, WO 01/09350, 04/14417, 04/14418 и 04/14419. В общем, иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 2 до 10 мкг, от 2 до 6 мкг или от 4 до 7 мкг сахарида. В целях изобретения около или приблизительно определены как в пределах 10% больше или меньше данного показателя. В воплощении иммуногенная композиция по изобретению скорректирована к, или забуферена до,или скорректирована к рН от 7,0 до 8,0, рН от 7,2 до 7,6 или около или точно рН 7,4.-7 013374 Иммуногенная композиция или вакцины по изобретению, возможно, лиофилизированы в присутствии стабилизирующего агента, например полиола, такого как сахароза или трегалоза. Возможно, иммуногенная композиция или вакцина по изобретению содержит количество адъюванта, достаточное, чтобы вызвать иммунный ответ на иммуноген. Подходящие адъюванты включают, но не ограничены солями алюминия (фосфат алюминия или гидроксид алюминия), скваленовыми смесями(SAF-1), мурамил-пептидом, производными сапонина, препаратами клеточной стенки микобактерий,монофосфорил-липидом А, производными миколовой кислоты, неионными блок-сополимерными сурфактантами, Quit A, субъединицей В холерного токсина, полифосфазеном и производными и иммуностимулирующими комплексами, такими как те, которые описаны Takahashi et al. (1990) Nature, 344:873875. Для N. meningitidis или комбинаций HibMen может быть выгодно не использовать никаких алюминиевых солей-адъювантов или никаких адъювантов вообще. Как со всеми иммуногенными композициями или вакцинами, иммунологически эффективные количества иммуногенов должны быть определены эмпирически. Факторы, которые следует учитывать,включают иммуногенность, будет или нет иммуноген конъюгирован или ковалентно связан с адъювантом или белком-носителем, или другим носителем, путь введений и число иммунизирующих доз, подлежащих введению. Активный агент может присутствовать в различных концентрациях в фармацевтической композиции или вакцине по изобретению. Обычно минимальная концентрация вещества представляет собой количество, необходимое для достижения его предполагаемого применения, в то время как максимальная концентрация представляет собой максимальное количество, которое будет оставаться в растворе или гомогенно суспендировано в пределах начальной смеси. Например, минимальное количество терапевтического агента, возможно, представляет собой такое, которое будет обеспечивать однократную терапевтически эффективную дозу. Для биологически активных веществ минимальная концентрация представляет собой количество, необходимое для биологической активности на основании восстановления, и максимальная концентрация находится на уровне, на котором гомогенная суспензия не может быть поддержана. В случае однократно дозируемых единиц количество представляет собой таковое однократного терапевтического применения. В общем, ожидают, что каждая доза будет содержать 1-100 мкг белкового антигена, возможно 5-50 или 5-25 мкг. Например, дозы бактериальных сахаридов составляют 10-20, 5-10,2,5-5 или 1-2,5 мкг сахарида в конъюгате. Вакцинные препараты по настоящему изобретению могут быть применены для защиты или лечения млекопитающего (например, пациента-человека), восприимчивого к инфекции, посредством введения указанной вакцины системным или мукозальным способом. Пациент-человек, возможно, представляет собой ребенка первого года жизни (до 12 месяцев), ребенка ясельного возраста (12-24, 12-16 или 12-14 месяцев), ребенка (2-10, 3-8 или 3-5 лет), подростка (12-21, 14-20 или 15-19 лет) или взрослого. Эти введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного, внутрибрюшинного, внутрикожного или подкожного способов или посредством мукозального введения в желудочно-кишечный/пищеварительный, респираторный или урогенитальный тракты. Предпочтительно интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (потому что носительство пневмококков в носоглотке может быть более эффективно предотвращено, таким образом ослабляя инфекцию на ее ранней стадии). Хотя вакцина по изобретению может быть введена как однократная доза, ее компоненты могут также быть введены совместно в то же время или в разное время (например, если в вакцине присутствуют сахариды, они могут быть введены раздельно в то же время или через 1-2 недели после введения бактериальной белковой вакцины для оптимальной координации иммунных ответов в отношении друг друга). В дополнение к однократному пути введения могут быть применены 2 разных способа применения. Например, вирусные антигены могут быть введены ID (внутрикожно), в то время как бактериальные белки могут быть введены IM (внутримышечно) или IN (интраназально). Если присутствуют сахариды, они могут быть введеныIM (или ID), и бактериальные белки могут быть введены IN (или ID). В дополнение, вакцины по изобретению могут быть введены IM для примирующих доз и IN для ревакцинирующих доз. Приготовление вакцин, в общем, описано в Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach (eds.Powell M.F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fullerton, патент США 4235877. Другой аспект изобретения представляет собой способ изготовления иммуногенной композиции или вакцины по изобретению, включающий стадию смешивания с фармацевтически приемлемым эксципиентом сахаридов MenA и MenC по изобретению, изготовленных способом по изобретению, с MenW иMenY, которые не были изготовлены в соответствии с изобретением. Подразумевается, что термины включающий, включать и включает в каждом отдельном случае, возможно, могут быть заменены терминами состоящий из, состоять из и состоит из соответственно. Все ссылки или патентные заявки, приводимые в этом патентном описании, включены сюда посредством ссылки. Изобретение иллюстрировано в сопровождающих примерах. Примеры ниже проведены с примене-8 013374 нием стандартных методик, которые хорошо известны и обычны для специалистов в данной области техники, за исключением, где иначе описаны подробно. Примеры являются иллюстративными и не ограничивают изобретение. Примеры Пример 1. Приготовление полисахаридных конъюгатов. Пример 1 а. Приготовление конъюгата менингококкового капсульного полисахарида MenA и MenC по изобретению. Конъюгаты MenC-ТТ изготавливали с применением нативных полисахаридов (более 150 кДа, как измерено посредством MALLS) или незначительно микрофлюидизировали. Конъюгаты MenA-ТТ изготавливали с применением или нативного полисахарида, или незначительно микрофлюидизированного полисахарида более 60 кДа, как измерено посредством MALLS-способа примера 2. Сортировку по размеру проводили посредством микрофлюидизации с применением аппарата-гомогенизатора EmulsiflexC-50. Полисахариды затем фильтровали через 0,2-мкм фильтр. С целью конъюгировать капсульный полисахарид MenA и столбнячный анатоксин через спейсер применяли следующий способ. Ковалентное связывание полисахарида и спейсера (ADH) проводят посредством химии сочетания, посредством которой полисахарид активируют в контролируемых условиях посредством цианилирующего агента, тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP). Спейсер взаимодействует с цианилированным полисахаридом (PS) через его гидразиногруппы с образованием стабильной изокарбамидной связи между спейсером и полисахаридом. Раствор MenA 10 мг/мл (рН 6,0) (3,5 г) обрабатывали свежеприготовленным раствором CDAP 100 мг/мл в ацетонитриле/воде (50/50 по объему (v/v, чтобы получить CDAP/MenA отношение 0,75(по массе (w/w. Через 1,5 мин рН повышали до рН 10,0. Через три минуты добавляли ADH, чтобы получить ADH/MenA отношение 8,9. рН раствора снижали до 8,75 и реакцию продолжали в течение 2 ч,поддерживая этот рН (при поддержании температуры 25 С). Раствор PSAAH концентрировали до четверти его начального объема, затем подвергали диафильтрации с 30 объемами 0,2 М NaCl с применением мембраны Filtron Omega с отсеиванием 10 кДа и ретентат фильтровали. Перед реакцией конъюгации (карбодиимидной конденсации) очищенный раствор ТТ и растворPSAAH разводили, чтобы достичь концентрации 10 мг/мл для PSAAH и 10 мг/мл для ТТ.EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) добавляли к раствору PSAH (2 г сахарида) с целью достичь конечного отношения 0,9 мг EDAC/мг PSAAH. pH корректировали до 5,0. Очищенный столбнячный анатоксин добавляли перистальтическим насосом (за 60 мин), чтобы достичь 2 мг ТТ/мгPSAAH. Образующийся раствор оставляли на 60 мин при +25 С при перемешивании для получения конечного времени сочетания 120 мин. Раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 (1/10 конечного объема) и оставляли на 30 мин при +25 С, затем на ночь при от +2 до +8 С. Конъюгат осветляли с применением 10 мкм фильтра и очищали с применением колонки SephacrylS400HR (Pharmacia, Sweden). Колонку уравновешивали в 10 мМ трис-HCl (рН 7,0), 0,075 М NaCl и конъюгат (приблизительно 660 мл) наносили на колонку (от +2 до +8 С). Объем элюирования выбирали как функцию оптической плотности при 280 нм. Сбор начинали, когда коэффициент поглощения увеличивался до 0,05. Сбор продолжали до тех пор, пока Kd не достигал 0,30. Конъюгат стерилизовали фильтрацией при +20 С, затем хранили при от +2 до +8 С. Образовавшийся конъюгат имел отношение полисахарид:белок 1,2-1,4 (w/w). С целью конъюгировать капсульный полисахарид MenC и столбнячный анатоксин через спейсер применяли следующий способ. Ковалентное связывание полисахарида и спейсера (ADH) проводят посредством химии сочетания, посредством которой полисахарид активируют в контролируемых условиях посредством цианилирующего агента, тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP). Спейсер взаимодействует с цианилированным PS через его гидразиногруппы с образованием стабильной изокарбамидной связи между спейсером и полисахаридом. Раствор MenC 20 мг/мл (рН 6,0) (3,5 г) обрабатывали свежеприготовленным раствором CDAP 100 мг/мл в ацетонитриле/воде (50/50 (v/v, чтобы получить CDAP/MenC отношение 1,5 (w/w). Через 1,5 мин рН повышали до рН 10,0. При рН активации добавляли 5 М NaCl, чтобы достичь конечной концентрации 2 М NaCl. Через три минуты добавляли ADH, чтобы получить ADH/MenC отношение 8,9. рН раствора снижали до 8,75 и реакцию (поддерживаемую при 25 С) продолжали в течение 2 ч. Раствор PSCAH концентрировали минимум до 150 мл, затем подвергали диафильтрации с 30 объемами 0,2 М NaCl с применением мембраны Filtron Omega с отсеиванием 10 кДа и ретентат фильтровали. Перед реакцией конъюгации очищенный раствор ТТ и раствор PSCAH (загрузка 2 г) разводили в 0,2 М NaCl, чтобы достичь концентрации 15 мг/мл для PSCAH и 20 мг/мл для ТТ. Очищенный столбнячный анатоксин добавляли к раствору PSCAH с целью достичь 2 мг ТТ/мгPSCAH. рН корректировали до 5,0. EDAC (16,7 мг/мл в трис 0,1 М рН 7,5) добавляли перистальтическим насосом (за 10 мин) для достижения конечного отношения 0,5 мг EDAC/мг PSCAH. Образующийся раствор оставляли на 110 мин при +25 С при перемешивании и регулировании рН для получения конечного времени сочетания 120 мин. Раствор затем нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 9,0 (1/10 ко-9 013374 нечного объема) и оставляли на 30 мин при +25 С, затем на ночь при от +2 до +8 С. Конъюгат осветляли с применением 10 мкм фильтра и очищали с применением колонки SephacrylS400HR (Pharmacia, Sweden). Колонку уравновешивали в 10 мМ трис-HCl (рН 7,0), 0,075 М NaCl и конъюгат (приблизительно 460 мл) наносили на колонку (от +2 до +8 С). Объем элюирования выбирали как функцию оптической плотности при 280 нм. Сбор начинали, когда коэффициент поглощения увеличивался до 0,05. Сбор продолжали до тех пор, пока Kd не достигал 0,20. Конъюгат стерилизовали фильтрацией при +20 С, затем хранили при от +2 до +8 С. Образовавшийся конъюгат имел отношение полисахарид:белок 1,2-1,4 (w/w). Проводили различные эксперименты, добавляя EDAC на протяжении 10-45 мин, в каждом случае были образованы конъюгаты MenC хорошего качества. Если, тем не менее, носитель ТТ медленно добавляли к смеси MenC-ADH + EDAC в последнюю очередь, это приводило к гелю, конъюгату, который не мог быть очищен. Проводили также эксперименты, добавляя весь EDAC в реакцию одномоментно, но конечное отношение TT/PS (2,7/1) (w/w) конъюгата было ниже, чем для конъюгата, полученного посредством реакции, где EDAC добавляли на протяжении 10 мин (3,3/1), более того, и ТТ, и PS антигенность была ниже, чем измеренная в отношении конъюгата, изготовленного по реакции, где EDAC добавляли на протяжении 10 мин. Примечание о приблизительном % дериватизации полисахаридов.MenCAH: после обработки CDAP посредством ADH около 3,47% гидроксильных групп были дериватизированы посредством ADH (с оценкой две доступные гидроксильные группы на повторяющуюся субъединицу). Для MenA: около 11,5% гидроксильных групп дериватизированы посредством ADH (рассматривая, что на повторяющееся звено приходится только одна доступная гидроксильная группа). Пример 1 б. Приготовление конъюгата пневмококкового капсульного полисахарида PS 3. 1. PS03-TTAH способ: PS03-TTAH208. Сортировка по размеру посредством EmulsiflexPS взвешивали из расчета 10% теоретической влажности. Нативный PS в течение ночи растворяли в 2 М NaCl при начальной концентрации 3 мг/мл. Перед сортировкой по размеру раствор нативного PS осветляли на фильтре с отсеиванием 5 мкм. Аппарат-гомогенизатор EMULSIFLEX C-50 применяли для уменьшения молекулярной массы и вязкости полисахарида перед стадией активации. Эффективность сортировки по размеру зависит от давления в контуре, давления поддержания плунжера и общего числа циклов. С целью улучшить эффективность сортировки по размеру (и, следовательно, уменьшить общее число циклов), гомогенизирующая ячейка Emulsiflex была заменена ячейкой с фиксированной геометрией (Microfluidics F20Y, ячейка взаимодействия 0,75 мкм). Целью сортировки по размеру было уменьшение молекулярной массы и вязкостиPS без критического снижения его антигенности. Уменьшение размера проводили при 6000500 фунт/кв. дюйм (413703447,5 кПа) и в ходе процесса сопровождали измерением вязкости. Сортировку по размеру останавливали, когда достигали цели 2,00,2 сП (2,0 мПас 0,2 мПас). Фильтрация сортированного по размеру PS на 0,22 мкм Сортированный по размеру PS фильтровали на мембране Millipak 40 (отсеивание 0,22 мкм) при скорости потока 10 мл/мин. Дериватизация ТТ Стадию дериватизации проводили при 25 С при продолжающемся перемешивании на водяной бане с контролируемой температурой. ТТ разводили в NaCl 0,2 М, чтобы получить конечную концентрацию ТТ 25 мг/мл. ADH добавляли в твердой форме к раствору ТТ, чтобы достичь конечной концентрации 0,2 М. После полного растворения ADH рН раствора на рН 6,20,1 посредством HCl. Затем к раствору TT/ADH добавляли EDAC, чтобы достичь конечной концентрации 0,02 М. рН устанавливали на 6,2 0,1 посредством HCl и продолжали регулировать рН на протяжении 1 ч. После стадии дериватизации рН повышали до рН 9,5 посредством NaOH, чтобы остановить реакцию. Раствор оставляли на 2 ч, регулируя рН до стадии диафильтрации. Диафильтрация Производное TTAH подвергали диафильтрации с целью удалить побочные продукты непрореагировавших ADH и EDAC. Диафильтрацию проводили на центраматной мембране (0,09 м 2, отсеивание 10 кДа). Раствор диализировали против 20 объемов 0,2 М NaCl. Контроль стадии диафильтрации проводили посредством количественного определения ADHTTAH окончательно фильтровали на мембране с отсеиванием 0,22 мкм (Millipak 40) при скорости потока 10 мл/мин. Фильтрованный TTAH затем хранили при -70 С. Конъюгат PS3-TTAH Условия процесса были следующими.- 10013374 Начальная концентрация PS3 2 мг/мл в 2 М NaCl, начальное отношение TTAH/PS3 1,5/1 (w/w), концентрация EDAC 0,5 мг/мг PS и концентрация ТТ 10 мг/мл в 0,15 М NaCl. 50 мг PS3 разводили в 2 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию PS 2 мг/мл. Очищенный раствор TTAH разводили в 0,2 М NaCl, чтобы достичь концентрации 10 мг/мл. Раствор PS3 корректировали до рН 5 посредством HCl.EDAC добавляли в твердой форме к раствору PS3 с целью достичь конечной концентрации 0,5 мгEDAC/мг PS. рН корректировали до 5,00,05 посредством HCl и TTAH добавляли вручную за 11 мин(аликвоты/мин). Образующийся раствор инкубировали 109 мин при +25 С при перемешивании и регулировании рН для получения конечного времени сочетания 120 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 и оставляли на 30 мин при +25 С. В заключение, конъюгат осветляли на 5 мкм мембране и наносили на колонку Sephacryl S400HR. 2) PS03-TTAH способ: PS03AH-TT215. Сортировка по размеру посредством Emulsiflex По вышесказанному. Фильтрация сортированного по размеру PS на 0,22 мкм По вышесказанному. Дериватизация PS3 Стадию дериватизации проводили при 25 С при продолжающемся перемешивании на водяной бане с контролируемой температурой. PS3 разводили в NaCl 2 М, чтобы получить конечную концентрациюPS 3 мг/мл. Перед добавлением CDAP (0,25 мг/мг PS, растворение при 100 мг/мл в смеси ацетонитрил/WFI (вода для инъекций рН раствора PS устанавливали на рН 6,0. Перед добавлениемADH (8,9 мг ADH/мг PS, растворение 100 мг/мл в 0,2 М NaCl) рН повышали до рН 9,5 посредствомNaOH. рН 9,5 поддерживали и регулировали на протяжении 60 мин. Процент дериватизации составлял 2,4% (2,4 мг ADH/100 мг PS). Это может быть измерено известными техниками: TNBS для оценки ADH и DMAB или резорцин (Monsigny et al. (1988) Anal. Biochem., 175, 525-530) для количественной оценкиPS. В данном случае, доза TNBS составила 228 мкг/мл и доза PS - 5250 мкг/мл. При условии, что Mw ADH составляет 174,2 и Mw повторяющегося звена PS (имеющего 1 СООН-группу и 4 ОН-группы) составляет 338,27, имеется 1,3 мкмоль ADH/15,52 мкмоль повторяющихся единиц или 1,3 мкмоль ADH/62,08 мкмоль реакционноспособных гидроксильных групп. 2,09% гидроксильных групп PS3 представляли собой ADH-модифицированные гидроксильные группы. Диафильтрация Производное PS3AH подвергали диафильтрации с целью удалить побочные продукты непрореагировавших ADH и CDAP. Диафильтрацию проводили на мембране UFP-30-C-H24LA (42 см 2, отсеивание 30 кДа). Раствор диализировали против 20 объемов 0,2 М NaCl. Контроль стадии диафильтрации проводили посредством количественного определения ADHPSAH окончательно фильтровали на мембране с отсеиванием 0,22 мкм (Millipak 40) при скорости потока 10 мл/мин. Фильтрованный PS3AH затем хранили при 4 С. Конъюгат PS3AH-TT Условия процесса были следующими. Начальная концентрация PS3 2 мг/мл в 2 М NaCl, начальное отношение TT/PS3AH 1,5/1 (w/w), концентрация EDAC 0,5 мг/мг PS и концентрация ТТ 10 мг/мл в 0,15 М NaCl. 50 мг PS3AH разводили в 0,2 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию PS 2 мг/мл. Очищенный раствор ТТ разводили в 0,2 М NaCl, чтобы достичь концентрации 10 мг/мл. Раствор PS3AH корректировали до рН 5 посредством HCl.EDAC добавляли в твердой форме к раствору PS3AH с целью достичь конечной концентрации 0,5 мгEDAC/мг PS. рН корректировали до 5,00,05 посредством HCl и ТТ добавляли за 10 мин, используя перистальтический насос. Образующийся раствор инкубировали 110 мин при +25 С, перемешивая и регулируя рН, для получения конечного времени сочетания 120 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 и оставляли на 30 мин при +25 С. В завершение, конъюгат осветляли на 5 мкм мембране и наносили на колонку Sephacryl S400HR. 3) PS03AH-TT способ: PS3AH-TT217. Сортировка по размеру посредством Emulsiflex По вышесказанному. Фильтрация сортированного по размеру PS на 0,22 мкм По вышесказанному. Дериватизация PS3 Как для конъюгата 215. Диафильтрация Как для конъюгата 215.- 11013374 Фильтрация на 0,22 мкм Как для конъюгата 215. Конъюгат PS3AH-TT Условия процесса были следующими. Начальная концентрация PS3 2 мг/мл в 2 М NaCl, начальное отношение TT/PS3AH 1,5/1 (w/w), концентрация EDAC 0,5 мг/мг PS и концентрация ТТ 10 мг/мл в 0,15 М NaCl. 50 мг PS3AH разводили в 0,2 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию PS 2 мг/мл. Очищенный раствор ТТ разводили в 0,2 М NaCl, чтобы достичь концентрации 10 мг/мл. Растворы PS3AH и ТТ смешивали и корректировали до рН 5 посредством HCl.EDAC растворяли в трис 1 М рН 7,5 буфере. 40 мкл EDAC добавляли каждую минуту (10 мин, чтобы достичь отношения EDAC/PS (0,5 мг EDAC/мг PS. Образующийся раствор инкубировали 110 мин при +25 С, перемешивая и регулируя рН, для получения конечного времени сочетания 120 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 и оставляли на 30 мин при +25 С. В завершение, конъюгат осветляли на 5-мкм мембране и наносили на колонку Sephacryl S400HR. 4) PS03AH-TT способ: PS3AH-TT218. Сортировка по размеру посредством Emulsiflex По вышесказанному. Фильтрация сортированного по размеру PS на 0,22 мкм По вышесказанному. Дериватизация PS3 Стадию дериватизации проводили при 25 С при продолжающемся перемешивании на водяной бане с контролируемой температурой. PS3 разводили в NaCl 2 М, чтобы получить конечную концентрациюPS 3 мг/мл. EDAC добавляли в твердой форме, чтобы достичь отношения EDAC/PS 0,1 мг/мг PS. После полного растворения устанавливали рН раствора 5. Затем, используя перистальтический насос, добавляли ADH (8,9 мг ADH/мг PS, растворение 100 мг/мл в 0,2 М NaCl) за 44 мин (хотя прямое добавление также было возможно, ввиду присутствия такого избытка ADH). Поддерживали рН 5,0 0,1 и регулировали на протяжении 120 мин (44' + 76'). Реакцию останавливали, повышая рН до 7,5, используя гидроксид натрия. Процент дериватизации составлял 3,7% (мг ADH/мг PS). Доза TNBS составила 220 мкг/мл и доза PS составила 5902 мкг/мл, таким образом имеется 1,26 мкмоль ADH/17,44 мкмоль повторяющихся единиц (= мкмоль реакционноспособных СООН-групп). Таким образом, 7,22% карбоксильных групп PS3 представляли собой ADH-модифицированные СООН-группы. Диафильтрация Производное PS3AH подвергали диафильтрации с целью удалить побочные продукты непрореагировавших ADH и EDAC. Диафильтрацию проводили на мембране UFP-30-C-H24LA (42 см 2, отсеивание 30 кДа). Раствор диализировали против 23 объемов 0,2 М NaCl. Контроль стадии диафильтрации проводили посредством количественного определения ADHPSAH окончательно фильтровали на мембране 0,22 мкм с отсеиванием (Millipak 40) при скорости потока 10 мл/мин. Фильтрованный PS3AH затем хранили при 4 С. Конъюгат PS3AH-TT Условия процесса были следующими. Начальная концентрация PS3AH 2 мг/мл в 2 М NaCl, начальное отношение TT/PS3AH 1,5/1 (w/w),концентрация EDAC 0,5 мг/мг PS и концентрация ТТ 10 мг/мл в 0,15 М NaCl. 50 мг PS3AH разводили в 0,2 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию PS 2 мг/мл. Очищенный раствор ТТ разводили в 0,2 М NaCl, чтобы достичь концентрации 10 мг/мл. Растворы PS3AH и ТТ смешивали между собой. рН корректировали до рН 5,00,05 посредством HCl и EDAC добавляли вручную за 10 мин (равные части-аликвоты добавляли каждую минуту). Образующийся раствор инкубировали 110 мин при+25 С, перемешивая и регулируя рН, для получения конечного времени сочетания 120 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 и оставляли на 30 мин при +25 С. В завершение,конъюгат осветляли на 5 мкм мембране и наносили на колонку Sephacryl S400HR. Заключение Различные конъюгаты изготавливали с применением карбодиимидной химии на стадии конъюгации. Последний компонент, добавляемый в реакционный раствор, может представлять собой или белок ТТ, или реагент EDAC. Время добавления может оказывать влияние на образующиеся конъюгаты. Конъюгаты PS3AHTT215 и PS3AHTT217 Для приготовления обоих конъюгатов применяли одинаковые компоненты и условия. Различался способ, которым добавляли последний компонент. Конъюгат PS3AHTT217 приводил к продукту, удовлетворявшему in-vitro критериям. Этот конъюгат изготавливали посредством добавления EDAC за 10 мин. Конъюгат PS3AHTT215, тем не менее, не мог быть отфильтрован на стерильной мембране. Для этого- 12013374 конъюгата последний компонент, добавляемый в реакционную среду, представлял собой ТТ (за 10 мин). Конечные отношения TT/PS для обоих конъюгатов сильно различались (0,98/1 против 0,50/1). ЕслиEDAC сначала добавляют к PSAH (имеющему и реакционноспособные аминогруппы, и реакционноспособные карбоксильные группы), это может приводить к образованию внутримолекулярных сшивок между гидразиновыми и карбоксильными группами, присутствующими на полисахариде, и, таким образом,может приводить к конъюгату с большим количеством сшивок и с менее точным конечным отношением после добавления ТТ за 10 мин. Этого эффекта не наблюдали для конъюгата PS3AHTT217. Встраивание ТТ действовало лучше посредством добавления EDAC за 10 мин, возможно, благодаря меньшей интенсивности образования внутримолекулярных сшивок и большей интенсивности образования межмолекулярных сшивок между гидразиновыми группами PS3AH и карбоксильными группами белка. В случае конъюгата 218, поскольку EDAC-дериватизация PS3 лишь частично дериватизирует полисахарид (чтобы оставить большинство эпитопов полисахаридов интактными), снова присутствуют и реакционноспособные аминогруппы, и реакционноспособные карбоксильные группы, именно поэтому также выгодно медленное добавление EDAC в конечной стадии конъюгации. Медленное добавление ТТ в конечной стадии конъюгации было выгодно, тем не менее, для конъюгата 208, где ТТ представлял собой ADH-дериватизированный (и содержит аминогруппы и карбоксильные группы), в то время как PS3 оставляли с его нативными ОН-группами и СООН-группами, как частью его повторяющейся субъединицы. Добавление EDAC к PS3 не оказывало дополнительного эффекта на образование сшивок, и медленное добавление дериватизированного ТТ давало конъюгату хорошие in Пример 1 в. Приготовление конъюгата полисахарида Vi S.thyphi по изобретению. Сортировка по размеру посредством EmulsiflexPS взвешивали из расчета 15% теоретической влажности. Нативный PS в течение ночи растворяют в WFI при начальной концентрации 7 мг/мл. Перед сортировкой по размеру раствор нативного PS осветляют на фильтре с отсеиванием 10 мкм при скорости потока 50 мл/мин. Аппарат-гомогенизатор EMULSIFLEX С-50 применяли для уменьшения молекулярной массы и вязкости полисахарида перед стадией активации. Эффективность сортировки по размеру зависит от давления в контуре, давления поддержания плунжера и общего числа циклов. С целью улучшить эффективность сортировки по размеру (и, следовательно, уменьшить общее число циклов) гомогенизирующая ячейка Emulsiflex была заменена ячейкой с фиксированной геометрией (Microfluidics F20Y, ячейка взаимодействия 0,75 мкм). Целью сортировки по размеру является уменьшение молекулярной массы и вязкости PS без критического снижения его антигенности. Уменьшение размера проводили при 15000500 фунт/кв. дюйм (1034253447,5 кПа) и в ходе процесса сопровождали измерением вязкости. Уменьшение в размерах останавливают, когда достигают цели 5,00,3 сП (5,00,3 мПас). Фильтрация сортированного по размеру PS на 0,22 мкм Сортированный по размеру PS фильтруют на мембране Millipak 40 (отсеивание 0,22 мм) при скорости потока 10 мл/мин. Фильтрованный сортированный по размеру PS хранят при -20 С. Дериватизация полисахарида Vi 1,5 г сортированного по размеру Vi PS при перемешивании растворяли в EPI при 25 С (5 мг/мл). 13,35 г ADH (8,9 мг ADH/мг PS) добавляют к раствору PS. После полного растворения рН корректировали до рН 5,00,05 посредством 1 н. HCl. EDAC (0,1 мг/мг PS) добавляли в твердой форме. Раствор оставляли на 60 мин при 25 С. Затем раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 и оставляли по меньшей мере на 30 мин при 25 С (максимум на 2 ч). Используя дозирование TNBS, оценивали,что уровень дериватизации (мг ADH/100 мг PS) составлял 4,55%. Доза TNBS составила 200 мкг/мл и доза PS составила 4034 мкг/мл, таким образом, 0,0697 мкмоль ADH/16,46 мкмоль повторяющихся единиц(Mw 245). 1,3 мкмоль ADH/16,46 мкмоль реакционноспособных СООН-групп на Vi, таким образом, 7% СООН-групп Vi представляли собой ADH-модифицированные СООН-группы. Диафильтрация Производное PSViAH подвергали диафильтрации с целью удалить побочные продукты непрореагировавших ADH и EDAC. Диафильтрацию проводили на центраматной мембране (0,09 м 2, отсеивание 10 кДа). Раствор диализировали против 20 объемов 0,2 М NaCl. Контроль стадии диафильтрации проводили посредством количественного определения ADHPSViAH окончательно фильтровали на мембране 0,22 мкм с отсеиванием (Millipak 40) при скорости потока 10 мл/мин. Фильтрованный PSViAH хранили при +2/+8 С в течение максимум 4 дней. Конъюгаты PSViAH-TT Условия процесса были следующими. Начальная концентрация PSViAH 2 мг/мл в 0,2 М NaCl, начальное отношение TT/PSViAH 2,5/1 (w/w),концентрация EDAC 0,25 мг/мг PS и концентрация ТТ 10 мг/мл в 0,2 М NaCl. 1 г PSViAH разводили в 0,2 М NaCl, чтобы получить конечную концентрацию PS 2 мг/мл (доза уроновой кислоты). Очищенный раствор ТТ разводили в 0,2 М NaCl, чтобы достичь концентрации 10 мг/мл. ТТ добавляли к раствору PSViAH с целью достичь конечного отношения 2,5 мг ТТ/мг PS. рН коррек- 14013374 тировали до 5,00,05 посредством 1N HCl. Затем добавляли раствор EDAC (7,5 мг/мл в 0,1 М трис рН 7,5) (перистальтическим насосом за 10 мин), чтобы достичь 0,25 мг EDAC/мг PSViAH. Образующийся раствор инкубировали 50 мин при +25 С, перемешивая и регулируя рН, для получения конечного времени сочетания 60 мин. Затем раствор нейтрализовали добавлением 1 М трис-HCl рН 7,5 и оставляли на 30 мин при +25 С. Конъюгат переносили при 4 С и оставляли на ночь, продолжая медленно перемешивать до стадии хроматографии. Очистка Перед элюированием на Sephacryl S400HR конъюгат осветляли, используя 10 мкм фильтр Kleenpak. Скорость потока фиксировали на 100 мл/мин. Затем конъюгат наносили на Sephacryl S400HR, и объем сбора был основан на величине Kd. Для объема сбора использовали следующий критерий: сбор начинали при OD (оптической плотности) = 0,05 при 280 нм и завершали при Kd = 0,22. Стерилизующая фильтрация Перед фильтрацией емкости вновь придавали комнатную температуру. Затем конъюгат фильтровали на стерилизующей мембране Opticap 4". Скорость потока фиксировали на 30 мл/мин. Анализ Образующийся конъюгат имел конечное отношение TT/PS (w/w) 2,44/1, содержание свободного PS 3,7% и PS/PS антигенность 58%. Пример 1 г. Приготовление других полисахаридных конъюгатов. Ковалентное связывание Haemophilus influenzae (Hib) PRP полисахарида и ТТ проводили посредством химии сочетания, разработанной Chu et al. (Infection and Immunity, 1983, 40 (1); 245-256). Полисахарид Hib PRP активировали добавлением CNBr и инкубацией при рН 10,5 в течение 6 мин. рН снижали до рН 8,75 и добавляли дигидразид адипиновой кислоты (ADH), и продолжали инкубацию в течение еще 90 мин. Активированный PRP сочетали с очищенным столбнячным анатоксином посредством карбодиимидной конденсации с применением 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC). EDAC добавляли к активированному PRP, чтобы достичь конечного отношения 0,6 мг EDAC/мг активированного PRP. рН корректировали до 5,0 и добавляли очищенный столбнячный анатоксин, чтобы достичь 2 мг ТТ/мг активированного PRP. Образующийся раствор оставляли на три дня, незначительно перемешивая. После фильтрации через 0,45 мкм мембрану конъюгат очищали на колонке Sephacryl S500HR(Pharmacia, Sweden), уравновешенной в 0,2 М NaCl. Конъюгаты MenC-ТТ изготавливали с применением нативных полисахаридов (более 150 кДа, как измерено посредством MALLS) или незначительно микрофлюидизировали. Конъюгаты MenA-ТТ изготавливали с применением или нативного полисахарида, или незначительно микрофлюидизированного полисахарида более 60 кДа, как измерено посредством MALLS-способа примера 2. Конъюгаты MenW иMenY-TT изготавливали с применением сортированных по размеру полисахаридов около 100-200 кДа,как измерено посредством MALLS (см. пример 2). Сортировку по размеру проводили посредством микрофлюидизации с применением аппарата-гомогенизатора Emulsiflex C-50. Полисахариды затем фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Активацию и прямое сочетание проводили, как описано в WO 96/29094 и 00/56360. Кратко, полисахарид в концентрации 10-20 мг/мл в 2 М NaCl pH 5,5-6,0 смешивали с раствором CDAP (свежеприготовленный 100 мг/мл в ацетонитриле/WFI, 50/50) до конечного отношения CDAP/полисахарид 0,75/1 или 1,5/1. Через 1,5 мин рН увеличивали гидроксидом натрия до рН 10,0. Через три минуты добавляли столбнячный анатоксин, чтобы достичь отношения белок/полисахарид 1,5/1 для MenW, 1,2/1 для MenY, 1,5/1 для MenA или 1,5/1 для MenC. Реакцию продолжали в течение одного или двух часов. После стадии сочетания добавляли глицин до конечного отношения глицин/PS (w/w) 7,5/1 и рН корректировали до рН 9,0. Смесь оставляли на 30 мин. Конъюгат осветляли с применением 10 мкм фильтра Kleenpak и затем наносили на колонку Sephacryl S400HR с применением буфера для элюирования 150 мМ NaCl, 10 мМ или 5 мМ трис рН 7,5. Клинические партии фильтровали на стерилизующей мембране Opticap 4. Образовавшиеся конъюгаты имели среднее отношение полисахарид:белок 1:1-1:5(w/w). Пример 2. Определение молекулярной массы с применением MALLS. Детекторы сочетали с колонкой для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии, с которой элюировали образцы. С одной стороны детектор рассеяния лазерного излучения измерял интенсивности рассеянного макромолекулярным раствором света под 16 углами, и с другой стороны интерферометрический рефрактометр, подключенный к компьютеру, позволял определить количество элюированного образца. Исходя из этих интенсивностей могут быть определены размер и форма макромолекул в растворе.- 15013374 Среднюю молекулярную массу в массе (Mw) определяют как произведение суммы масс всех видов и их относительной молекулярной массы, деленное на сумму масс всех видов: а) среднемассовая молекулярная масса (Mw) б) среднечисловая молекулярная масса (Mn) в) среднее квадратическое значение радиуса (Rw и R2w) представляет собой квадрат радиуса, определяемый как:(mi представляет собой большую часть рассеивающего центра i и ri представляет собой расстояние между центром рассеяния i и центром тяжести макромолекулы); г) полидисперсность определяют как отношение (Mw/Mn). Менингококковые полисахариды анализировали посредством MALLS путем нанесения на две колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (TSKG6000 и 5000PWxl), применяемые в комбинации. 25 мкл полисахарида наносили на колонку и элюировали с 0,75 мл фильтрованной воды. Полисахариды выявляют с применением детектора светорассеяния (Wyatt Dawn DSP, оборудованного 10 мВт аргоновым лазером при 488 нм) и интерферометрического рефрактометра (Wyatt Otilab DSP,оборудованного ячейкой Р 100 и красным фильтром на 498 нм). Полидисперсности молекулярной массы и выходы препарата всех образцов вычисляли по способуDebye с применением подбора многочлена 1 порядка в программном обеспечении Astra 4.72. Пример 3. Клиническое исследование по оценке эффекта линкера в MenA в конъюгатной вакцинеMenACWY. Однократную дозу различных композиций вакцины MenACWY вводили подросткам 15-19 лет в 5 группах по 25 субъектов в 1:1:1:1:1 рандомизированном исследовании. Тестируемые композиции представляли собойF1 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатом MenA, содержащимF2 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатом MenA, содержащим АН-спейсер (изготовленная по примеру 1) - 2,5/5/2,5/2,5 мкг;F3 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатом MenA, содержащим АН-спейсер (изготовленная по примеру 1) - 5/5/2,5/2,5 мкг.F4 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином без спейсера в каком-либо конъюгате - 5/5/5/5 мкг. Контрольная группа - Mencevax ACWY. На 30 день после вакцинации у пациентов брали образец крови. Образцы крови использовали для оценки процента SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW135 и SBAMenY клеток-респондеров через месяц после дозы вакцины. Ответ на вакцину определяли как 1) для изначально серонегативных субъектов - титр антител после вакцинации 1/32 на 1 месяце или 2) для изначально серопозитивных субъектов - титр антителчетырехкратный титр антител до вакцинации. Результаты Как показано в таблице ниже, применение спейсера в конъюгате MenA приводило к повышенному иммунному ответу против MenA. Когда добавляли АН-спейсер, процент клеток-респондеров возрастал с 66 до 90-95%. Это отражали повышение SBA GMT с 4335 до 10000 и повышение GMC с 5 до 20-40. Удивительно, применение АН-спейсера приводило также к повышению иммунного ответа против MenC, как видно из повышения процента клеток-респондеров и повышения SBA GMT. Когда вводили спейсер,также можно было видеть повышение SBA-GMT против MenY (6742-7122) и против MenW (4621-5418). Пример 4. Клиническое исследование по оценке эффекта линкера в конъюгатах MenA и MenC в конъюгатной вакцине MenACWY. Однократную дозу различных композиций вакцины MenACWY вводили подросткам 15-19 лет в 5 группах по 25 субъектов в 1:1:1:1:1 рандомизированном исследовании. Тестируемые композиции представляли собойF1 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатами MenA и MenC, содержащими АН-спейсер (изготовленная по примеру 1) - 2,5/2,5/2,5/2,5 мкг;F2 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатами MenA и MenC, содержащими АН-спейсер (изготовленная по примеру 1) - 5/5/2,5/2,5 мкг;F3 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатами MenA и MenC, содержащими АН-спейсер (изготовленная по примеру 1) - 5/5/5/5 мкг;F4 - MenACWY, конъюгированная со столбнячным анатоксином, с конъюгатом MenA, содержащим АН-спейсер (изготовленная по примеру 1) - 5/5/5/5 мкг. Контрольная группа - Mencevax ACWY. На 30 день после вакцинации у пациентов брали образец крови. Образцы крови использовали для оценки процента SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW135 иSBA-MenY клеток-респондеров через месяц после дозы вакцины. Ответ на вакцину определяли как 1) для изначально серонегативных субъектов - титр антител после вакцинации 1/32 на 1 месяце или 2) для изначально серопозитивных субъектов - титр антителчетырехкратный титр антител до вакцинации. Результаты Введение АН-спейсера в конъюгат MenC приводило к повышению иммунного ответа против MenC,как показано в таблице ниже. Это демонстрируют повышение SBA GMT с 1943 до 4329 и повышение анти-PSC GMC с 7,65 до 13,13. Были сохранены хорошие иммунные ответы против MenA, MenW и ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ изготовления иммуногенной композиции, включающий конъюгацию сахарида с белковым носителем с использованием химии карбодиимидной конденсации, где сахарид содержит (например, как часть его повторяющегося звена) аминогруппы и/или карбоксильные группы или дериватизирован, чтобы содержать аминогруппы и/или карбоксильные группы, и где белковый носитель содержит аминогруппы и/или карбоксильные группы или дериватизирован, чтобы содержать аминогруппы и/или карбоксильные группы, включающий стадии:I) если белковый носитель содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы, и сахарид содержит или аминогруппы, или карбоксильные группы: а) смешивания сахарида и аликвоты карбодиимида, необходимой для проведения конъюгации, и б) добавления аликвоты белкового носителя, необходимой в течение периода от 35 с до 6 ч;II) если сахарид содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы, и белковый носитель содержит или аминогруппы, или карбоксильные группы: а) смешивания белкового носителя и аликвоты карбодиимида, необходимой для проведения конъюгации, и- 18013374 б) добавления аликвоты сахарида, необходимой в течение периода от 35 с до 6 ч;III) если сахарид содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы, и белковый носитель содержит и аминогруппы, и карбоксильные группы: а) смешивания белкового носителя и сахарида и б) добавления аликвоты карбодиимида, необходимой для проведения конъюгации в течение периода от 35 с до 6 ч. 2. Способ по п.1, где на стадии (б) период составляет от 50 с до 5 ч, от 1 мин до 4 ч, от 2 мин до 3 ч,от 3 мин до 2 ч, от 4 до 60 мин, от 5 до 50 мин, от 6 до 40 мин, от 7 до 30 мин или от 8 до 20 мин. 3. Способ по п.1, где на стадии (б) период составляет от 1 мин до 5 ч, от 10 мин до 4 ч, от 20 мин до 3 ч, от 30 мин до 2 ч, от 40 до 90 или от 50 до 70 мин. 4. Способ по пп.1-3, где карбодиимид представляет собой EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) или карбодиимид, отличный от EDAC. 5. Способ по пп.1-4, где аликвота карбодиимида, необходимая для проведения конъюгации, составляет от 0,01 до 3, от 0,05 до 2 или от 0,09 до 1 мг/мг сахарида. 6. Способ по пп.1-5, где сахарид и/или белковый носитель дериватизирован, чтобы содержать аминогруппы или карбоксильные группы. 7. Способ по п.6, где дериватизацию осуществляют посредством добавления гетеро- или гомобифункционального линкера. 8. Способ по п.7, где линкер имеет от 4 до 12 атомов углерода. 9. Способ по п.7 или 8, где линкер имеет две реакционноспособные аминогруппы. 10. Иммуногенная композиция по пп.7-9, где линкер представляет собой ADH (дигидразид адипиновой кислоты). 11. Способ по п.7 или 8, где линкер имеет две реакционноспособные карбоновокислотные группы. 12. Способ по п.7 или 8, где линкер имеет реакционноспособную аминогруппу на одном конце и реакционноспособную карбоновокислотную группу на другом конце. 13. Способ по пп.7-12, где дериватизация происходит посредством взаимодействия большого избытка линкера с сахаридом и/или белковым носителем, подлежащим дериватизации. 14. Способ по пп.7-13, где сахарид содержит реакционноспособную гидроксильную группу как часть его повторяющегося звена, которая частично дериватизирована через аминогруппу на линкере. 15. Способ по п.14, где сахарид частично дериватизирован посредством CDAP-химии (CDAP - тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния). 16. Способ по пп.7-13, где сахарид содержит реакционноспособную аминогруппу как часть его повторяющегося звена, которая частично дериватизирована через карбоксильную группу на линкере. 17. Способ по п.16, где сахарид частично дериватизирован посредством химии карбодиимидной конденсации. 18. Способ по пп.7-13, где сахарид содержит реакционноспособную карбоксильную группу как часть его повторяющегося звена, которая частично дериватизирована через аминогруппу на линкере. 19. Способ по п.18, где сахарид частично дериватизирован посредством химии карбодиимида. 20. Способ по пп.1-19, где на стадии (б) аликвоту карбодиимида, сахарида или белкового носителя добавляют с постоянной скоростью, используя насос. 21. Способ по пп.1-19, где на стадии (б) аликвоту карбодиимида, сахарида или белкового носителя добавляют постадийно в течение указанного периода. 22. Способ по п.21, где по меньшей мере одну четверть аликвоты добавляют в течение первой половины указанного периода и по меньшей мере одну четверть аликвоты - в течение второй половины указанного периода. 23. Способ по п.21 или 22, где аликвоту а добавляют за 4-100 стадий s. 24. Способ по п.23, где на каждой стадии добавляют a/s аликвоты. 25. Способ по п.23 или 24, где если одна стадия происходит в нулевое время периода р, то каждая последующая стадия происходит во время, составляющее p/(s-1). 26. Способ по пп.1-25, где сахарид присутствует в конечной концентрации 0,5-50 мг/мл на стадии(б). 27. Способ по пп.1-26, где исходное отношение белкового носителя к сахариду составляет от 5:1 до 1:5, от 4:1 до 1:1 или от 3:1 до 2:1 (мас./мас.). 28. Способ по пп.1-27, где концентрация соли, например NaCl, присутствующей на стадии (б), составляет 0-2, 0,1-1 или 0,2-0,5 М. 29. Способ по пп.1-28, где белковый носитель присутствует в конечной концентрации 1-50 мг/мл на стадии (б). 30. Способ по пп.1-29, где на стадии (б) поддерживают рН реакции 4,5-6,5, 4,7-6,0 или 5-5,5. 31. Способ по пп.1-29, где в реакции на стадии (б) также присутствует N-гидроксисукцинимид и на стадии (б) поддерживают рН реакции 4,5-7,5. 32. Способ по пп.1-31, где на стадии (б) поддерживают температуру реакции 4-37, 10-32, 17-30 или 22-27 С.- 19013374 33. Способ по пп.1-32, где после добавления всей аликвоты на стадии (б) реакцию поддерживают в течение еще от 10 мин до 72 ч, от 20 мин до 48 ч, от 30 мин до 24 ч, от 40 мин до 12 ч, от 50 мин до 6 ч или 1-3 ч. 34. Способ по пп.1-33, где, как только реакция закончена, рН доводят до 7,5-9. 35. Способ по пп.1-34, включающий последующую стадию (в), где сахаридно-белковый конъюгат очищают на колонке для гель-хроматографии. 36. Способ по пп.1-35, включающий последующую стадию (г), где сахаридно-белковый конъюгат подвергают стерилизующей фильтрации. 37. Способ по пп.1-36, включающий последующую стадию (д), где эффективную дозу сахариднобелкового конъюгата изготавливают с фармацевтически приемлемым эксципиентом для изготовления иммуногенной композиции или вакцины. 38. Способ по пп.1-37, где сахарид представляет собой бактериальный капсульный сахарид, например, имеющий происхождение от бактерии, выбранной из перечня, состоящего из серогруппы А, В, С,W135 или Y N. meningitidis, серотипов Streptococcus pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А,11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F или 33F, группы Ia, Ib, II, III, IV, V, VI или VII группы В Streptococcus, типа 5 Staphylococcus aureus, типа 8 Staphylococcus aureus, Salmonella typhi (Vi сахарид),Vibrio cholerae или типа b H. influenzae. 39. Способ по пп.1-38, где среднемассовая молекулярная масса сахарида составляет 1000-2000000,5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000 или 100000-200000. 40. Способ по пп.1-39, где сахарид представляет собой или нативный полисахарид, или сортированный по размеру с коэффициентом не более 10 (например, посредством микрофлюидизации). 41. Способ по пп.1-37, где сахарид представляет собой бактериальный липоолигосахарид или липополисахарид, например, имеющий происхождение от бактерии, выбранной из перечня, состоящего из:N. meningitidis, H. influenzae, Е. coli, Salmonella или М. catarrhalis. 42. Способ по пп.1-41, где белковый носитель содержит один или более Т-хелперных эпитопов. 43. Способ по пп.1-42, где белковый носитель выбран из группы, состоящей из ТТ (столбнячного анатоксина), DT (дифтерийного анатоксина), CRM197, фрагмента С ТТ, белка D H. influenzae, пневмококкового PhtD и пневмококкового пневмолизина. 44. Иммуногенная композиция или вакцина, полученная способом по пп.1-43. 45. Применение иммуногенной композиции или вакцины по п.44 в изготовлении лекарственного средства для профилактики или лечения заболевания. 46. Способ профилактики или лечения заболевания, включающий стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по п.44. 47. Применение по п.45, где заболевание вызвано бактерией, выбранной из перечня, состоящего изN. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, М. catarrhalis, Streptococcus группы В, Staphylococcus aureus,Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli и Н. influenzae. 48. Способ по п.46, где заболевание вызвано бактерией, выбранной из перечня, состоящего из N.