Рекомбинантный α1-антитрипсин человека

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному 1-антитрипсину человека (rhAAT) с увеличенным средним временем удержания (MRT) по сравнению с АТТ 1 из плазмы, где rhAAT содержит N-связанные гликаны, среди которых 10% представляют собой тетраантенные гликаны и у которых степень сиалирования (Z/A) составляет по меньшей мере 50%, причем по меньшей мере 50% сиалированных N-связанных гликанов являются -2,3-сиалированными. Также изобретение относится к способу получения рекомбинантного 1-антитрипсина человека (rhAAT) в клетках Бринкман Элизабет К.М., Хак Корнелис Эрик, Ван Ден Ньивенхоф Ингрид (NL) Медведев В.Н. (RU) Изобретение относится к области фармацевтических препаратов, в частности к рекомбинантному 1-антитрипсину человека, который может использоваться, в частности, для профилактики и/или лечения эмфиземы, связанной с недостаточностью 1-антитрипсина. Предпосылки изобретения 1-Антитрипсин (ААТ) или 1-ингибитор протеазы (1PI) представляет собой природный ингибитор протеазы, которую высвобождают активированные нейтрофилы. ААТ представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 52 кДа, состоящий из 394 аминокислот. ААТ человека экспрессируется в виде предшественника из 418 аминокислот, из которого отщепляется 24-аминокислотный предшественник с получением конечного продукта, состоящего из 394 аминокислот. Прежде всего, ААТ синтезируется в печени, но его экспрессия также отмечена в нейтрофилах, моноцитах и макрофагах. Низкие или нулевые уровни ААТ в плазме являются фактором риска развития эмфиземы из-за беспрепятственного разрушительного действия протеазы нейтрофилов на легкие. Для профилактики и/или лечения эмфиземы, связанной с недостаточностью ААТ, была разработана восполняющая терапия ААТ(Mulgrew et al., 2007). В настоящее время лечение пациентов с эмфиземой, связанной с недостаточностью ААТ, проводят с помощью высоких доз ААТ, полученного из плазмы pd)AAT) (60 мг/кг/неделя; Проластин от Talecris, Араласт от Baxter и Земайра от ZLB). Требуются большие количества и частое введение инъекций ААТ для облегчения эмфиземы, связанной с недостаточностью ААТ. Основной проблемой материала, полученного из плазмы, является безопасность препаратов. Как и для всех материалов, полученных у человека, возможный риск pdAAT связан с загрязнением прионами или другими посторонними агентами. Другой проблемой является ограниченная доступность плазменного материала. ААТ человека, полученный из плазмы, содержит три N-связанных гликана по остаткам аспарагина 46, 83 и 247. Эти гликаны содержат, главным образом, ди- и триантенные структуры. Высокая степень сиалирования гликанов в рекомбинантных белках имеет важное значение для оптимальной фармакокинетики (ФК). До настоящего времени получение рекомбинантного ААТ было затруднено из-за низкой экспрессии в большинстве рекомбинантных систем (Karnaukhova et al., 2006). Рекомбинантный ААТ вырабатывается на высоком уровне в трансгенных системах, но их клиническое развитие было остановлено из-за неоптимальной фармакокинетики (ФК) и вопросов безопасности, связанных с чужеродными для человека загрязнениями (Spencer et al., 2005). Таким образом, сохраняется необходимость в активном рекомбинантном ААТ человека (rhAAT),который может быть получен в достаточных количествах и который имеет полезные фармакокинетические свойства. Краткая сущность изобретения В настоящем изобретении показано, что рекомбинантный 1-антитрипсин человека (rhAAT) с подходящим фармакокинетическим профилем может быть получен в больших количествах в клеткахPER.С 6. В исследовании, которое привело к осуществлению настоящего изобретения, клеточные линии,экспрессирующие ААТ человека и коэкспрессирующие -2,3-сиалилтрансферазу (ST3) или -2,6 сиалилтрансферазу (ST6), получали в бессывороточных условиях. Клеточные линии были способны экспрессировать высокие уровни rhAAT. Таким образом, была достигнута выработка до 22 пикограммовrhAAT на клетку в сутки (pcd). Важно отметить, что было показано, что rhAAT по изобретению является активным ингибитором эластазы нейтрофилов. Анализ гликановых профилей показал хорошую общую степень кэпирования сиаловой кислотой. Интересным фактом является увеличение по тетраантенным гликанам на rhAAT по изобретению по сравнению с ААТ, полученным из плазмы (Проластин). Кроме того, rhAAT, который вырабатывался в клетках, коэкспрессирующих ST3, показал повышенное среднее время удержания (MRT) у крыс по сравнению с ААТ, полученным из плазмы. RhAAT, который вырабатывался в клетках, коэкспрессирующих ST6, показал сниженное среднее время удержания по сравнению с ААТ, полученным из плазмы. В одном из аспектов настоящее изобретение, таким образом, относится к рекомбинантному 1 антитрипсину человека (rhAAT), который содержит N-связанные гликаны, где(a) по меньшей мере 10% из указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны; и(b) степень кэпирования сиаловой кислотой указанных N-связанных гликанов (Z/A) составляет по меньшей мере 50%. В другом варианте осуществления по меньшей мере 20% из указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны. В дополнительном варианте осуществления степень кэпирования сиаловой кислотой указанных Nсвязанных гликанов, которые являются тетраантенными, составляет по меньшей мере 30%. В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере 50% от общего сиалирования указанных N-связанных гликанов представляет собой -2,3-сиалирование. Предпочтительно по меньшей мере 90% от общего сиалирования указанных N-связанных гликанов представляет собой -2,3-сиалирование. В дополнительном аспекте изобретение относится к препаратам и фармацевтическим композициям,содержащим указанный rhAAT и, необязательно, один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. В другом аспекте изобретение относится к применению указанного rhAAT, препаратов и/или фармацевтических композиций, содержащих указанный rhAAT, для профилактики и/или лечения, в частности, эмфиземы, связанной с ААТ, и/или воспалительных заболеваний, при которых возникает повреждение тканей, опосредованное нейтрофилами. В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения рекомбинантного 1-антитрипсина человека, предусматривающему стадии введения в клетку PER.C6 нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-антитрипсин человека, так, что указанная клетка PER.C6 содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессирующейся форме; и культивирования указанной клетки PER.C6 в условиях, способствующих выработке указанного рекомбинантного ААТ человека, где указанная клеткаPER.C6 модифицирована так, что коэкспрессирует -2,3-сиалилтрансферазу или -2,6 сиалилтрансферазу. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - гистограмма специфической продуктивности полунепрерывных культур как для клеточных линий, сверхэкспрессирующих -2,3-сиалилтрансферазу (A: PER.C6-AAT-ST3), так и для клетки, сверхэкспрессирующей -2,6-сиалилтрансферазу (В: PER.C6-AAT-ST6). Фиг. 2 - 4-12% бис-трис-полиакриламидный гель с добавлением SDS (SDS-PAGE) с образцами, полученными из клеточной культуры PER.C6-rAAT (неочищенными), окрашенный коллоидным синим. Фиг. 3 - схематический обзор анализа для определения степени сиалирования гликанов ААТ при помощи соотношения Z/A. Фиг. 4 - специфическая продуктивность клеточных линий PER.C6, экспрессирующих ААТ, не коррелирует со степенью сиалирования гликанов PER.C6-rAAT (коэффициент Спирмана r = -0,024, р=0,893).(: PER.C6-AAT-ST3; о: PER.C6-AAT-ST6). Фиг. 5 - сиалирование (фиг. 5 А) и антенность (фиг. 5 В) гликанов PER.C6-rAAT от ECLотрицательных образцов по сравнению с гликанами PER.C6-rAAT от ECL-положительных образцов и Проластином. Фиг. 6 - степень сиалирования всех гликанов (фиг. 6 А) и тетраантенных гликанов (фиг. 6 В) PER.C6rAAT-ST3 по сравнению с гликанами PER.C6-rAAT-ST6 и Проластином. Фиг. 7 - плазменные профили зависимости концентрации от времени для различных доз Проластина в буфере (PBS/T) или в PER.C6-CM после однократного внутривенного введения крысам. : Проластин в PER.C6-CM, 50 мкг/кг; : Проластин в PER.C6-CM, 100 мкг/кг; : Проластин в PER.C6CM, 200 мкг/кг; о: Проластин в PBS/T, 2000 мкг/кг. Фиг. 8 - плазменные профили зависимости концентрации от времени для PER.C6-rAAT-ST3,PER.C6-rAAT-ST6 и Проластина. : PER.C6-rAAT-ST3, MRT 18-23 ч; : PER.C6-rAAT-ST6, MRT 44 ч; : Проластин, MRT 11-12 ч. Фиг. 9 - плазмидные карты векторов pAATopt-ST3 (А) и pAATopt-ST6 (В), экспрессирующих ААТ.CMV = промотор цитомегаловируса, BGHp(А) = последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, fl ori = участок начала репликации fl, SV40 = промотор вируса SV40, Neo = маркер устойчивости к неомицину, SV40p(A) = последовательность полиаденилирования вируса SV40, ААТ = 1 антитрипсин, ColE1 = участок начала репликации ColE1, Amp = маркер устойчивости к ампициллину,SIAT4C = ген, кодирующий ST3 = сиалилтрансфераза человека IV (L23767) (фиг. 9 А), SIAT1 = ген, кодирующий ST6 = сиалилтрансфераза I человека (NM003032). Подробное описание изобретения 1-Антитрипсин (ААТ) является природным ингибитором протеазы, которая высвобождается активированными нейтрофилами. ААТ секретируется в плазму крови, но местом его действия, в первую очередь, является паренхима легких. Эластаза лейкоцитов человека (HLE) (также известная как эластаза нейтрофилов человека (HNE представляет собой сериновую протеазу, которая высвобождается из азурофильных гранул нейтрофилов, как часть воспалительного ответа в норме. При нормальных условиях гомеостаза ААТ служит важным регулятором протеолиза, который опосредуется эластазой лейкоцитов человека (HLE), тем самым предотвращая повреждение альвеолярного матрикса легких. Помимо HLE,ААТ также ингибирует две другие протеазы, которые высвобождаются нейтрофилами в легких, а именно катепсин G (catG) и протеазу 3 (Pr3). Для лечения пациентов, страдающих от эмфиземы, связанной с недостаточностью ААТ (т.е. имеющих низкие или нулевые уровни ААТ в плазме), были разработаны и в настоящее время используются продукты ААТ, получаемые из плазмы, такие как Проластин (Talecris), Араласт (Baxter) и Земайра(ZLB). Пациенту, как правило, необходимы большие количества такого продукта (приблизительно 60 мг/кг/неделю). Помимо эмфиземы ААТ также может использоваться для (потенциальной) терапии воспалительных заболеваний, сопровождающихся повреждениями, опосредованными нейтрофилами. Продукция рекомбинантного ААТ, например в E.coli, затруднена из-за низкой экспрессии на большинстве рекомбинантных систем (Karnaukhova et al., 2006). Рекомбинантный ААТ продуцируется на высоком уровне в трансгенных системах, но их клиническое развитие было остановлено из-за неоптимальной фармакокинетики (ФК) и вопросов безопасности,связанных с не принадлежащими человеку загрязнителями (Spencer et al., 2005). Настоящее изобретение относится к рекомбинантному 1-антитрипсину человека (rhAAT) с подходящими фармакокинетическими свойствами, который может быть получен в больших количествах, например, в клетках PER.С 6. Было продемонстрировано, что рекомбинантный ААТ по настоящему изобретению является функционально активным, что было установлено при помощи хромогенного анализа,основанного на ингибировании эластазы нейтрофилов человека, и имеет перспективные фармакокинетические свойства по сравнению с продуктом ААТ, полученным из плазмы, таким как Проластин. Настоящее изобретение, таким образом, относится к rhAAT, содержащему N-связанные гликаны,гдеa) по меньшей мере 10% из указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны; иb) степень кэпирования сиаловой кислотой указанных N-связанных гликанов (Z/A) составляет по меньшей мере 50%.N-связанные гликаны представляют собой цепи сахаров, которые ковалентно связаны с аспарагиновыми остатками полипептида (Varki et al. 1999). Процесс N-гликозилирования начинается с присоединения предшественника долихолового олигосахарида к предшественнику аспарагина. Этот предшественник затем модифицируют до олигосахарида с высоким содержанием маннозы, гибридный или сложного типа. В сложном типе N-связанные сахара, как 3-, так и 6-связанные остатки маннозы, замещены остатками N-ацетилглюкозамина (GlcNAc). N-гликаны сложного типа могут содержать от двух до пятиGlcNAc-несущих ветвей, которые обозначают как антенны. Конечная структура N-связанных сахаров сложного типа может широко изменяться и зависит от белка, к которому они прикреплены, от клеткихозяина и от условий, в которых культивируют клетку-хозяина. GlcNAc-несущие ветви можно модифицировать галактозой (Gal) или N-ацетилгалактозамином (GalNAc) с образованием так называемых LacNAc или LacdiNAc структур. Также GlcNAc-несущие ветви могут содержать множественные LacNAc структуры, образующие так называемые полилактозаминовые структуры. Концевые галактозы могут быть модифицированы посредством -2,3- или -2,6-связанной сиаловой кислоты, в то время как концевые N-ацетилгалактозамины могут быть модифицированы только посредством -2,6-связанной сиаловой кислоты. Добавление сиаловых кислот к конечной Gal или GalNAc происходит при помощи сиалилтрансфераз. Вероятно, более чем 20 различных сиалилтрансфераз кодируются геномом человека (Harduin-Lepers et al., 2001). Они различаются по субстратной специфичности, распределению в тканях и различным биохимическим параметрам. Природный ААТ имеет три участка гликозилирования. Таким образом, ААТ содержит три Nсвязанных гликана, по которым может происходить ветвление. Эти гликаны могут иметь 2, 3 или 4 так называемых "антенны" или ветви. Неожиданно было показано, что по меньшей мере 10%, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 50% из указанных N-связанных гликанов rhAAT по изобретению представляют собой тетраантенные гликаны. В другом варианте осуществления по меньшей мере 20% из указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны, предпочтительно приблизительно от 20 до 40% из указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны. По настоящему изобретению неожиданно было показано, что характер гликозилирования, например, в отношении антенности, а также фармакокинетические свойства, например среднее время удержания rhAAT по изобретению, отличаются от ААТ, полученного из плазмы, такого как Проластин. Поскольку полное сиалирование гликанов на рекомбинантных белках является важным для получения оптимальных фармакокинетических свойств, rhAAT по настоящему изобретению экспрессируется в клетках PER.C6 в сочетании с сиалилтрансферазой для получения высокосиалированной изоформыrhAAT. Клетки PER.C6, таким образом, были котрансфецированы либо с -2,3-сиалилтрансферазой(PER.C6-ST3), либо с -2,6-сиалилтрансферазой (PER.C6-ST6). В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере 50% от общего сиалирования указанных N-связанных гликанов представляет собой -2,3-сиалирование. Например, по меньшей мере 50, 70 или 80% от общего сиалирования указанных N-связанных гликанов представляет собой -2,3-сиалирование. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере 90% от общего сиалирования указанных N-связанных гликанов представляет собой -2,3-сиалирование. Неожиданно было показано, что в этих вариантах осуществленияrhAAT по настоящему изобретению имеет различные фармакокинетические свойства по сравнению с ААТ, полученным из плазмы, таким как Проластин, в частности, пролонгированное среднее время удержания. Под сиалированием имеется в виду количество сиаловых остатков, присутствующих на углеводных структурах ААТ: -2,3-сиалирование означает сиалирование по 2,3 положению, т.е. -2,3 связанная сиаловая кислота (хорошо известная в данной области), и -2,6-сиалирование означает сиали-3 025021 рование по 2,6 положению, т.е. -2,6-связанная сиаловая кислота (также известная в данной области). В случае "по меньшей мере 50% от общего сиалирования указанных N-связанных гликанов представляет собой -2,3-сиалирование", это, таким образом, обозначает, что по меньшей мере 50% от общего количества остатков сиаловой кислоты, присутствующих в rhAAT, сиалированы по 2,3 положению. В настоящем изобретении было показано на фармакокинетических исследованиях на крысах, что среднее время удержания (MRT) как rhAAT, который вырабатывается PER.C6-ST3 (rhAAT-ST3), так иrhAAT, который вырабатывается PER.C6-ST6 (rhAAT-ST6) значительно отличается от такового у ААТ,полученного из плазмы (Проластин). Таким образом, было показано, что MRT у крыс с rhAAT-ST3 находится в диапазоне приблизительно 18-23 ч, в то время как MRT у крыс с Проластином составляет приблизительно 11-12 ч. Использование rhAAT с пролонгированным MRT может, например, уменьшить дозу, необходимую пациенту. Напротив, MRT у крысы с rhAAT-ST6 было снижено по сравнению с таковым у Проластина(приблизительно 3-4 ч). Применение rhAAT-ST6 по настоящему изобретению может иметь преимущества из-за "более естественной" 2,6-связи сиаловой кислоты, которая соответствует связи сиаловой кислоты с ААТ, полученным из плазмы, таким как Проластин. Применение rhAAT-ST6 может, кроме того,быть выгодно в тех случаях, когда может быть полезным сниженное MRT. Как указано выше, степень сиалирования гликанов на рекомбинантных белках имеет важное значение для оптимальных фармакокинетических свойств. В предпочтительном варианте осуществления суммарная степень кэпирования сиаловой кислотой указанных N-связанных гликанов rhAAT (как рассчитано при помощи соотношения Z/A) по настоящему изобретению, таким образом, составляет по меньшей мере 70%. Более предпочтительно степень кэпирования сиаловой кислотой указанных N-связанных гликанов (Z/A) составляет по меньшей мере 80%, даже более предпочтительно степень кэпирования сиаловой кислотой указанных N-связанных гликанов (Z/A) составляет по меньшей мере 90%. В дополнительном варианте осуществления степень кэпирования сиаловой кислотой указанных Nсвязанных гликанов, которые являются тетраантенными, составляет по меньшей мере 20%, например между 20 и 65%. Относительно низкая степень сиалирования указанных тетраантенных N-гликанов может давать продукт rhAAT со сниженным MRT по сравнению с ААТ, полученным из плазмы. В другом варианте осуществления степень кэпирования сиаловой кислотой указанных тетраантенных N-связанных гликанов составляет по меньшей мере 50%, например между 50 и 97%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно между 70 и 95%. Более высокий уровень сиалирования в этом варианте осуществления может способствовать пролонгированию MRT по сравнению с ААТ, полученным из плазмы. Изобретение, кроме того, относится к препаратам и фармацевтическим композициям, которые содержат указанный rhAAT и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Под "фармацевтически приемлемым эксципиентом" понимают любое инертное вещество, которое комбинировано с активной молекулой (такой как лекарственное средство, вещество или белок) с получением подходящей или удобной лекарственной формы. "Фармацевтически приемлемый эксципиент" представляет собой эксципиент, который нетоксичен для пациента в используемых дозах и концентрациях и который совместим с остальными ингредиентами состава, содержащего активную молекулу. Фармацевтические композиции по изобретению можно составлять в любые композиции для любых путей введения, хорошо известных специалисту. Выбор оптимального пути введения фармацевтических композиций будет зависеть от нескольких факторов, в том числе, например, от физико-химических свойств активной молекулы в составе композиции, экстренности клинической ситуации и взаимосвязи между концентрациями активной молекулы в плазме и желаемым терапевтическим эффектом. Препараты и фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно составлены для внутривенного или аэрозольного введения. Фармацевтически подходящие составы rhAAT можно получать в соответствии со способами, известными специалисту в данной области (см. Remington's PharmaceuticalPharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000. Как правило, фармацевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Препараты и/или фармацевтические композиции, содержащие rhAAT по изобретению, могут быть в форме порошка для разведения в фармацевтически приемлемом эксципиенте в момент введения или перед ним. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются высушивание под вакуумом и сублимационная сушка (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их предварительно стерильно профильтрованного раствора. Альтернативно, rhAAT по настоящему изобретению может быть в виде раствора, и подходящий фармацевтически приемлемый эксципиент можно добавлять и/или смешивать перед введением или во время введения для получения дозированной лекарственной инъекционной формы.RhAAT, препараты или фармацевтические композиции, содержащие указанный rhAAT, можно ис-4 025021 пользовать в качестве лекарственных средств. RhAAT, препараты и фармацевтические композиции могут быть соответствующим образом использованы для профилактики и/или лечения заболеваний и/или нарушений, для которых была доказана эффективность введения ААТ. Они могут быть, в частности, использованы для профилактики и/или лечения или их сочетания эмфиземы, вызванной недостаточностью ААТ. RhAAT, препараты или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно быть использованы для профилактики и/или лечения эмфиземы, вызванной курением, кистозного фиброза (CF), хронического обструктивного заболевания легких (ХОБЛ). Поскольку было описано,что ААТ обладает противовоспалительным и противоапоптотическим действием, rhAAT, препараты или фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно использовать в качестве противовоспалительных средств (Lewis et al., 2008; Koulmanda et al., 2008). В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения рекомбинантного 1-антитрипсина человека, предусматривающему стадии введения в клетку PER.C6 нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-антитрипсин человека, таким образом, что указанная клетка PER.C6 содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессирующейся форме; и культивирования указанной клетки PER.C6 в условиях, способствующих выработке указанного рекомбинантного 1-антитрипсина человека, где указанная клетка дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сиалилтрансферазу, предпочтительно -2,6-сиалилтрансферазу или -2,3-сиалилтрансферазу под контролем гетерологичного промотора. В варианте осуществления сиалилтрансфераза представляет собой сиалилтрансферазу человека. RhAAT по настоящему изобретению может, однако, также вырабатываться другими клетками млекопитающих, необязательно, коэкспрессирующих сиалилтрансферазу,таких как, например, клетки 293. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу получения рекомбинантного 1-антитрипсина человека, предусматривающему стадии введения в клетку PER.C6 нуклеиновой кислоты, кодирующей 1-антитрипсин человека, таким образом, что указанная клетка PER.C6 содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессирующемся формате, где указанная клетка дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сиалилтрансферазу, предпочтительно-2,6-сиалилтрансферазу или -2,3-сиалилтрансферазу под контролем гетерологичного промотора; культивирования указанной клетки PER.C6 в бессывороточной среде, позволяющей экспрессию указанного 1-антитрипсина человека в указанной клетке; выделения экспрессировавшегося 1-антитрипсина человека из указанной клетки и/или из указанной среды для культивирования; и, необязательно, очистки указанного 1-антитрипсина человека. Получение клеток PER.C6 в качестве системы для продукции интересующих белков описано в WO 00/63403, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. Как показано в WO 00/63403, PER.C6 могут соответствующим образом использоваться для получения рекомбинантных белков. Для достижения широкомасштабной (непрерывной) продукции рекомбинантных белков с использованием клеточной культуры предпочтительно иметь клетки, способные к росту без необходимости прикрепления к субстрату. Клетки по настоящему изобретению обладают такой способностью. КлеткаPER.C6 по настоящему изобретению представляет собой клетку из предшествующего или последующего пассажа или потомка предшествующего или последующего пассажа клеток, которые хранились в Центре прикладной микробиологии и исследований и европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС) на 29 февраля 2006 г. под номером ЕСАСС 96022940 (см., например, патент США 5994128). Использование клеток PER.C6 для промышленных процессов было подробно описано, например, у Nichols et al., 2002 и еще более подробно для получения рекомбинантного белка, например, у Yallop et al., 2005a и 2005b. Клетки по изобретению, в частности клетки PER.C6, имеют дополнительное преимущество, заключающееся в том, что их можно культивировать в отсутствие сыворотки, полученной у человека или животных, или компонентов сыворотки, полученной у человека или животных. Таким образом, выделять их проще, в то время как безопасность повышается из-за отсутствия дополнительных белков человека или животных в культуре, и эта система является очень надежной (синтетические среды обладают лучшей воспроизводимостью). Кроме того, наличие раннего района 1 А ("Е 1 А") аденовируса является дополнительным преимуществом по сравнению с клеточными линиями (человека), в которых отсутствует этот конкретный ген. Е 1 А известен как активатор транскрипции, который усиливает транскрипцию с энхансера/промотора генов первичного ответа цитомегаловируса (CMV) (Olive et al., 1990, Gorman et al., 1989). Если рекомбинантный белок, который будет вырабатываться, находится под контролем энхансера/промотора CMV, уровни экспрессии в этих клетках повышаются и не повышаются в клетках, в которых отсутствует Е 1 А. В основном, выработка рекомбинантного белка, такого как rhAAT, в клетке-хозяине, такой как клетка PER.C6, включает введение в клетку-хозяина нуклеиновой кислоты в экспрессирующемся формате, культивирование клетки в условиях, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты и допускающих экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в указанных клетках. Альтернативно, белок, который естественным образом экспрессируется в желаемых клетках-хозяевах, но в недостаточном количестве может быть экспрессирован на повышенном уровне за счет введения подходящих регуляторных после-5 025021 довательностей, таких как сильный промотор, функционально связанный с желаемым геном (см., например, WO 99/05268, в котором эндогенный ген ЕРО сверхэкспрессирован за счет вставки сильного промотора перед геном в клетках человека). Нуклеиновая кислота, кодирующая ААТ в экспрессирующемся формате, может быть в форме экспрессирующей кассеты, и, как правило, требуется наличие последовательностей, способных обеспечить экспрессию нуклеиновой кислоты, таких как энхансер(ы), промотор, сигнал полиаденилирования и т.п. Некоторые промоторы можно использовать для экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, и эти промоторы могут включать вирусные промоторы, промоторы млекопитающих, синтетические промоторы и т.п. В определенных вариантах осуществления промотор, управляющий экспрессией нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, представляет собой промотор первичного ответа CMV, например,включающий от -735 до +95 нуклеотида из энхансера/промотора гена первичного ответа CMV, поскольку было показано, что этот промотор обеспечивает высокие уровни экспрессии в клетках, экспрессирующих Е 1 А аденовируса (см., например, WO 03/051927). Нуклеиновая кислота, представляющая интерес, может быть геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК их комбинацией и т.д. Среды для культивирования клеток доступны у различных производителей, и бессывороточные среды для культивирования в настоящее время часто используют для клеточной культуры, поскольку они более определенные, чем среда, содержащая сыворотку. Клетки по настоящему изобретению хорошо растут в среде, содержащей сыворотку, а также в бессывороточной среде. Клетки по изобретению в среде, содержащей сыворотку, в основном растут, прикрепляясь к подложке, но они весьма успешно растут в суспензии до высоких плотностей клеток (10106 клеток/мл и выше) в бессывороточных средах для культивирования, что означает, что они не нуждаются в поверхности для прикрепления, а остаются относительно свободны друг от друга и от стенок посуды для культивирования в течение большей части времени. Процессы для культивирования клеток по изобретению с высокими плотностями и/или для получения очень высокого выхода продукта из этих клеток описаны в WO 2004/099396. Концепция генетической инженерии об изменении гликозилирования рекомбинантных белков, которые вырабатываются в клетке, была достаточно обоснована и подробно обсуждается, например, в US 2005/0164386. С этой целью нуклеиновая кислота, кодирующая желаемый фермент гликозилирования в экспрессирующемся формате, была введена или вводится в клетки по изобретению, и желаемый фермент гликозилирования экспрессируется в течение периода культивирования клеток по изобретению, когда экспрессируется белок, представляющий интерес. Это приводит к измененному характеру гликозилирования интересующего белка по сравнению с ситуацией, когда рекомбинантный фермент гликозилирования не экспрессируется в клетках. В настоящем изобретении фермент гликозилирования является сиалилтрансферазой, более предпочтительно -2,3-сиалилтрансферазой и/или -2,6-сиалилтрансферазой. Предпочтительно кодируемая сиалилтрансфераза представляет собой сиалилтрансферазу млекопитающего, более предпочтительно сиалилтрансферазу человека. Нуклеиновая кислота, кодирующая сиалилтрансферазу, предпочтительно находится под контролем гетерологичного промотора, который должен быть активным, или должна быть возможность его регуляции в клетках по изобретению. Предпочтительно нуклеиновая кислота, кодирующая сиалилтрансферазу, интегрирована в геном клеток для того,чтобы обеспечить стабильное наследование и стабильную экспрессию сиалилтрансферазы в последующих поколениях клеток. Изобретение, кроме того, относится к рекомбинантному ААТ человека, который можно получить способами по изобретению. По изобретению rhAAT обладает человеческим характером гликозилирования, отличным от выделенного природного двойника белка человека. Настоящее изобретение, в частности, относится к rhAAT, содержащему N-связанные гликаны, где по меньшей мере 10% из указанных Nсвязанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны. Кроме того, rhAAT, который можно получать по настоящему изобретению, обладает неожиданными фармакокинетическими свойствами. Рекомбинантный ААТ человека по изобретению включает полноразмерный ААТ человека, но также может включать биологически активные полипептидные фрагменты, такие как фрагменты ААТ человека с одной или несколькими аминокислотными делециями, например, на N-конце белка, а также биологически активные варианты ААТ человека, такие как ААТ с одной или несколькими заменами аминокислот (например, консервативные замены), одной или несколькими делециями или добавлением аминокислот, которые значительно не изменяют функциональную активность белка. В варианте осуществления rhAAT по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, приведенную в настоящем документе как SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные последовательности вариантов ААТ по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичныSEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими неограничивающими примерами. Примеры Пример 1. Создание клеточных линий и специфическая продуктивность. Семьсот клеточных линий PER.C6, экспрессирующих ААТ человека и коэкспрессирующих или -6 025021 2,6-сиалилтрансферазу (SIAT1; NM003032), или -2,3-сиалилтрансферазу (SIAT4C; L23767) (PER.C6AAT-ST3/PER.C6-AAT-ST6), получали в бессывороточных условиях, как описано в WO 2006/070011. Сорок семь бессывороточных клеточных линий PER.C6, вырабатывающих или AAT-ST3 (27 клеточных линий), или AAT-ST6 (20 клеточных линий) выбирали, основываясь на максимальном выходе продукта,который определяли посредством твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (ААТ Elisa Kit, USBiologicals), из независимых программ создания клеточных линий с использованием нуклеофекции в качестве способа трансфекции. Экспрессионная плазмида содержала кодирующую последовательность ААТ человека (SEQ ID NO: 2) и кодирующую последовательность ST3GalIV человека, обе под управлением промотора цитомегаловируса, который был модифицирован для обеспечения высоких уровней экспрессии гена в клетках PER.C6 (Yallop et al., 2005). Плазмидные карты векторов, экспрессирующих ААТ(pAATopt-ST3 и pAATopt-ST6), показаны на фиг. 9. Продуктивность клеточных линий варьировала между 8-22 пг на клетку в сутки (pcd) (PER.C6AAT-ST3) и 7-19 pcd (PER.C6-AAT-ST6) (см. фиг. 1 и табл. 1 и 2). Клеточные линии замораживали для хранения в среде Proper-1 (Lonza) (6 пробирок, 3-5106 клеток/мл), отвечающей всем критериям приемлемости (жизнеспособность 80%, хороший рост в двух пассажах после реанимации). Были созданы полунепрерывные культуры (в среде Proper-1), которые использовали для биохимического анализа (см. пример 2). Пример 2. Биохимический анализ. Целостность FER.C6-r.AAT. Супернатанты 47 полунепрерывных культур анализировали на полиакриламидном геле с добавлением SDS (SDS-PAGE), окрашенном коллоидным синим. Образцы собранных клеточных культурPER.C6-rAAT (неочищенные) продемонстрировали ААТ в качестве основной белковой полосы на SDSPAGE. Кроме того, гели продемонстрировали полосы интактного ААТ (показано на фиг. 2), что указывает на целостность материала. Активность PER.C6-rAAT. Первоначально (вместо хромогенного анализа активности) показатель активности определяли путем анализа формирования комплекса PER.C6-rAAT с эластазой нейтрофилов человека. С этой целью образцы собранных клеточных культур PER.C6-rAAT инкубировали с 0, 0,1, 0,2 и 0,4 мкг эластазы в течение 30 мин при 37 С и затем наносили на 4-12% BIS-Tris SDS-PAGE и окрашивали коллоидным синим. Все исследованные образцы PER.C6-rAAT формировали комплекс с эластазой (данные не показаны), что указывает на активность препаратов. Дальнейшее исследование активности проводили с помощью хромогенного анализа, основанного на ингибировании эластазы нейтрофилов человека с использованием Проластина в качестве эталона (взято из Bruin et al., 2005. Все исследованные образцыPER.C6-rAAT, за исключением одного (PER.C6-rAAT-ST3-234c), были, по меньшей мере, также активны как Проластин (90%) (табл. 1 и 2). Гликановый анализ PER.C6-rAAT. Для отбора образцов PER.C6-rAAT, в которых гликаны имеют относительно высокую степень кэпирования сиаловой кислотой, необходимую для оптимального ФК профиля, применяли лектиновый анализ с использованием лектина кораллового дерева (Erythrina cristagalli lectin (ECL для выявления свободных галактоз (см. фиг. 3 со схематическим изображением использованного анализа). Из 47 исследованных образцов 15 показали наличие сигнала при OD405 с ECLпустой контроль + 0,2, что указывает на относительно высокую степень свободных концевых галактоз на гликанах этих образцов ААТ. Для нескольких из этих образцов низкую степень кэпирования гликанов сиаловой кислотой подтверждали путем дальнейшего гликанового анализа с использованием способа, основанного на ВЭЖХ (Hermentin etal., 1996; Gervais et al., 2003). Таким образом, rhAAT образцы с сигналом ECL при OD405 пустой контроль + 0,2 не являлись предметом исследования в расширенном гликановом анализе и не тестировались в ФК исследованиях. Расширенный способ гликанового профилирования схематически показан на фиг. 3 и включает в себя высвобождение N-связанных гликанов из ААТ при помощи фермента N-гликозидазы F (PNGaseF),и мечение этих гликанов флуоресцентной 2-антраниловой кислотой (2-аа). Затем гликаны разделяли при помощи анионообменной хроматографии (АОХ) на группы согласно их отрицательному заряду, т.е. разделяли гликаны с различным количеством сиаловой кислоты. При помощи этого профиля определяют число Z, представляющее степень заряда (т.е. сиалирования) N-связанных гликанов. Формула для Z(А = площадь, Hermentin et al., 1996). Кроме того, десиалированные гликаны разделяли посредством нормально-фазовой хроматографии(NP) на группы согласно их размеру, т.е. разделяли гликаны с различной степенью ветвления (антенностью). При помощи этого профиля определяют число А, представляющее степень ветвления Nсвязанных гликанов. Формула для А А = (Адиантенные 2) + (Атриантенные 3) + (Атетраантенные 4). Наконец, путем расчета соотношения Z/A получают степень (процент) кэпирования сиаловой кислотой N-связанных гликанов гликопротеина (Gervais et al., 2003). Гликановые профили для PER.C6-rAAT показаны в табл. 1 и 2. Суммарные профили образцовPER.C6-rAAT (табл. 1 и 2) демонстрируют 12-54% диантенных, 13-39% триантенных и 22-48% тетраантенных и 0-55% дисиалированных, 0-30% трисиалированных, 0-29% тетрасиалированных. Степень кэпирования гликанов сиаловой кислотой у PER.C6-rAAT лежит в диапазоне от 0 до 92%, эта степень кэпирования сиаловой кислотой не коррелирует со специфической продуктивностью клеточных линийPER.C6-rAAT (коэффициент Спирмана r = -0,024, р=0,893) (табл. 1 и 2 и фиг. 4). Как и ожидалось, гликаны ECL-позитивного гААТ имеют низкий уровень заряда (сиалирование)(различия являются достоверными в тесте Манна-Уитни, р 0,001) (см. фиг. 5). Гликаны ECLпозитивного PER.C6-rAAT обладают высоким уровнем антенности (диапазон числа А: 299-322) по сравнению с ECL-негативным PER.C6-rAAT (диапазон числа А: 266-307) (различия являются достоверными в тесте Манна-Уитни, р 0,001) (см. фиг. 5). Кроме того, в наличии более низкая степень сиалирования тетраантенных гликанов PER.C6-rAAT-ST6 (ECL-негативных) в диапазоне от 6 до 62% по сравнению сPER.C6-rAAT-ST3 (ECL-негативных) в диапазоне от 35 до 106% (различия являются достоверными в тесте Манна-Уитни, р 0,001), хотя это не так для суммарной степени сиалирования (табл. 1 и 2, фиг. 6). Более низкий уровень предпочтения ST6 относительно более высокоразветвленных гликанов (Joziasse etal., 1987) может быть причиной более низкой степени сиалирования тетраантенных гликанов PER.C6rAAT-ST6 по сравнению с PER.C6-rAAT-ST3. Гликановые профили указывают на тенденцию к более высокой степени ветвления гликановPER.C6-rAAT по сравнению с ААТ, полученным из плазмы (Проластин), поскольку профиль для Проластина включает: 80% диантенных, 18% триантенных и 2% тетраантенных (табл. 1 и 2). Это явление также ясно из сравнения чисел А (фиг. 5 и табл. 1 и 2). Степень кэпирования гликанов сиаловой кислотой в Проластине составляет 96% (табл. 1 и 2). Пример 3. Фармакокинетика PER.C6-rAAT на крысиной модели. Была создана крысиная модель для определения фармакокинетики (ФК) PER.C6-rAAT. Модель должна быть способна выявлять присутствие ААТ в неочищенной PER.C6-кондиционированной среде(СМ) в концентрациях приблизительно 40-100 мкг/мл (при 2 мл/кг, полученных из доз приблизительно 80-200 мкг/кг). Проводили четыре эксперимента: первые два для настройки модели и второй, третий и четвертый эксперименты для выбора клеточных линий PER.C6-rAAT, вырабатывающих rAAT с наиболее оптимальными ФК характеристиками. В этих исследованиях pdAAT человека (Проластин) применяли для создания модели и в качестве эталона. Методика эксперимента была следующей: крысам (самцы Wistar,возраст 8 недель) вводили внутривенно в хвостовую вену дозу тестируемых образцов ААТ (объем дозы 2 мл/кг, диапазон доз 50-200 мкг/кг, n=3 крысы в группе). Забирали кровь из кончика хвоста перед введением дозы и в различные моменты времени после введения дозы. Кровь собирали в микроветы сK2EDTA и получали плазму. Остаточную концентрацию ААТ в образцах плазмы затем определяли посредством твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (ААТ Elisa Kit, Affinity Biologicals). Полученные данные смоделировали для каждой крысы при помощи двухкомпонентной модели и затем определили ФК параметры. Как видно по данным из эксперимента 1 (см. фиг. 7), было обнаружено, что модель подходит для определения ФК профиля в неочищенных образцах, поскольку кривые зависимости концентрации от времени в плазме для Проластина, добавленного в PER.C6-CM, и буферный контроль (PBS, 0,01% мас./об. Tween-80 (PT) (дозы 200 мкг/кг сходны. Сходный результат был обнаружен для доз Проластина 100 мкг/кг (данные не показаны). На фиг. 7 также показано, что усиление ответа наблюдают с дозами Проластина, добавленными в СМ от 50-200 мкг/кг. Из этих данных рассчитали, что Проластин обладает средним временем удержания (MRT) 11-12 ч. Также были выявлены образцы PER.C6-rAAT сPER.C6-rAAT-ST3-202c, который показывает более медленный клиренс (MRT 20,5 ч) по сравнению с Проластином, и PER.C6-rAAT-ST6-530, который показывает более быстрый клиренс (MRT 3,6 ч) по сравнению с Проластином (табл. 1 и 2). На основании этих наблюдений был, таким образом, сделан вывод, что модель может быть использована для неочищенных образцов PER.C6-rAAT, которые тестировали в экспериментах 2-4 при уровне дозы 100 мкг/кг для всех образцов. На фиг. 8 показаны типичные ФК профили для PER.C6-rAAT-ST3 и PER.C6-rAAT-ST6 в сравнении с Проластином. Последняя колонка в табл. 1 и 2 показывает величины MRT, полученные в ФК экспериментах. Статистическое исследование различий между образцами и группами образцов относительно MRT производили при помощи дисперсионного анализа (ANOVA) на логарифмически преобразованных значениях.MRT как для исследованных препаратов PER.C6-rAAT-ST3, так и для исследованных препаратовPER.C6-rAAT-ST6 значительно отличались от Проластина. MRT для 8 из 10 исследованных препаратов жду этими восемью препаратами PER.C6-rAAT-ST3 различия в MRT были незначительными.MRT для PER.C6-rAAT-ST3-053b и -539 были значительно ниже, чем для Проластина. У PER.C6rAAT-ST3-0539 это связано с относительно низкой степенью сиалирования (49%), что подтверждается разблокированием ФК профиля этого препарата в первый час во время блокирования асиалогликопротеинового рецептора путем совместного введения асиалофетуина (данные не показаны). Гликановый профиль для PER.C6-rAAT-ST3-053b был неинформативным (было невозможно выделить четкие пики),однако также в этом случае недосиалирование является наиболее вероятной причиной низкого MRT. Для всех исследованных препаратов PER.C6-rAAT-ST6 MRT был значительно ниже, чем у Проластин, в диапазоне от 3,4-3,9 ч. Это можно объяснить относительно низкой степенью сиалирования тетраантенных гликанов в PER.C6-rAAT-ST6 (в диапазоне от 6 до 62%) и/или за счет потенциально разного механизма клиренса -2,3-сиалированного ААТ по сравнению с -2,6-сиалированным ААТ. Выводы. По настоящему изобретению были созданы клеточные линии PER.C6, которые вырабатывают ААТ человека с высоким выходом (до 22 pcd) и приемлемого качества, т.е. препараты были активны в анализеin vitro. Неожиданно и интересно, многообещающие ФК профили были продемонстрированы на крысиной модели. Клетки PER.C6, таким образом, образуют подходящую платформу для выработки рекомбинантного ААТ человека для применения, в частности, при эмфиземе, связанной с недостаточностью ААТ, или для применения при других воспалительных заболеваниях с повреждением тканей, опосредованным нейтрофилами. RhAAT по настоящему изобретению может, однако, также соответствующим образом производиться в других типах клеток млекопитающих, коэкспрессирующих 2,3- или 2,6 сиалилтрансферазы. Таблица 1 Специфическая продуктивность, активность и гликановые профили PER.C6-rAAT-ST3SEQ ID NO: 2. Оптимизированная кодирующая последовательность (на основании NM000295)(a) rhAAT имеет увеличенное среднее время удержания (MRT) до приблизительно 18-23 ч по сравнению с АТТ 1 из плазмы, имеющим MRT, равное приблизительно 11-12 ч;(b) по меньшей мере 10% указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны; и(c) степень сиалирования указанных N-связанных гликанов (Z/A) составляет по меньшей мере 50%,причем по меньшей мере 50% сиалированных N-связанных гликанов являются -2,3-сиалированными,где степень заряда (Z) и степень ветвления N-связанных гликанов (А) рассчитываются, соответственно, какZ = (Аасиало 0) + (Амоносиало 1) + (Адисиало 2) + (Атрисиало 3) + (Атетрасиало 4),A = (Адиантенные 2) + (Атриантенные 3) + (Атетраантенные 4). 2. RhAAT по п.1, где по меньшей мере 20% указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны. 3. RhAAT по п.1, где приблизительно от 10 до 50% указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны. 4. RhAAT по п.1 или 2, где приблизительно от 20 до 40% указанных N-связанных гликанов представляют собой тетраантенные гликаны. 5. RhAAT по любому из пп.1-4, где по меньшей мере 90% сиалированных N-связанных гликанов являются -2,3-сиалированными. 6. RhAAT по любому из предшествующих пунктов, где степень сиалирования указанных Nсвязанных гликанов (Z/A) составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%,более предпочтительно по меньшей мере 90%. 7. RhAAT по любому из предшествующих пунктов, где степень сиалирования указанных Nсвязанных гликанов, которые являются тетраантенными, составляет по меньшей мере 20%. 8. RhAAT по любому из предшествующих пунктов, где степень сиалирования указанных Nсвязанных гликанов, которые являются тетраантенными, составляет по меньшей мере 50%. 9. RhAAT по п.8, где степень сиалирования указанных N-связанных гликанов, которые являются тетраантенными, составляет от 50 до приблизительно 97%. 10. RhAAT по любому из предшествующих пунктов, где степень сиалирования указанных Nсвязанных гликанов, которые являются тетраантенными, составляет приблизительно от 70 до приблизительно 95%. 11. Способ получения рекомбинантного 1-антитрипсина человека (rhAAT), определенного в любом из пп.1-10, включающий:(a) введение в клетку PER.C6 нуклеиновой кислоты в экспрессирующейся форме, кодирующей 1 антитрипсин человека по любому из пп.1-10, где указанная клетка дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты в экспрессирующейся форме, кодирующую -2,3-сиалилтрансферазу;(b) культивирование указанной клетки PER.C6 в условиях, способствующих экспрессии указанной