Стабилизированные жидкие препаративные формы интерферона

010979 Область, к которой относится изобретение Изобретение относится к свободным от HSA (человеческого сывороточного альбумина) фармацевтическим композициям, содержащим интерферон, конкретнее, к препаративным формам интерферона-,включающим буфер, аминокислоту и антиоксидант. Описание предшествующего уровня техники Интерфероны представляют собой цитокины, т.е. растворимые белки, которые передают информацию между клетками и играют существенную роль в иммунной системе, содействуя разрушению микроорганизмов, которые вызывают инфекцию, и восстанавливая любое возникающее в результате этого повреждения. Интерфероны естественно секретируются инфицированными клетками и впервые были идентифицированы в 1957 г. Их название происходит из того обстоятельства, что они вмешиваются("interfere") в вирусную репликацию и продукцию. Интерфероны проявляют как противовирусную, так и антипролиферативную активность. На основании биохимических и иммунологических свойств естественно встречающиеся человеческие интерфероны группируются в 3 основных класса: интерферон- (лейкоцит), интерферон- (фибробласт) и интерферон- (иммунный). -интерферон в настоящее время разрешен в США и других странах для лечения лейкозного ретикулоэндотелиоза, венерических бородавок, саркомы Капоши (рака, обычно поражающего пациентов, страдающих синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД и хронического не-А, не-В гепатита. Интерфероны (IFN) представляют собой гликопротеины, вырабатываемые организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защищенных клетках. IFN состоят из белка с низкой молекулярной массой, они крайне неспецифичны в своем действии, т.е. IFN, индуцированный одним вирусом, эффективен против широкого диапазона других вирусов. Однако они являются видоспецифичными, т.е. IFN, продуцируемый одним видом, будет только стимулировать противовирусную активность в клетках того же или близкородственного вида. IFN представляли собой первую группу цитокинов, подлежащих использованию, ввиду их возможной противоопухолевой и противовирусной активности. Три основных IFN именуются IFN-, IFN- и IFN-. Такие основные виды IFN первоначально классифицировались в соответствии с клетками их происхождения (лейкоцит, фибробласт или Т-клетка). Однако стало ясно, что несколько типов могут продуцироваться одной клеткой. Следовательно, лейкоцитарный INF теперь называется IFN-, фибробластный IFN представляет собой IFN- и Т-клеточный IFN представляет собой IFN-. Существует также четвертый тип IFN, лимфобластоидный IFN, продуцируемый в линии клеток "Namalwa" (полученной из лимфомы Буркитта), которые, как представляется, продуцируют смесь лейкоцитарного и фибробластного IFN. Сообщалось об интерфероновой единице или международной единице интерферона (ЕД или ME,для международной единицы) как о показателе активности IFN, определенной как количество, необходимое для защиты 50% клеток против вирусного повреждения. Анализ, который можно использовать для измерения биологической активности, представляет собой анализ ингибирования цитопатического эффекта, как описано в публикации (Rubinstein, et al., 1981; Familletti, P.С, et al., 1981). При этом противовирусном анализе для интерферона примерно 1 единица/мл интерферона представляет собой количество,необходимое для продукции цитопатического эффекта 50%. Единицы определяются в отношении международного эталонного стандарта для человеческого IFN-, предоставленного Национальными Институтами Здоровья (Pestka, S. 1986). Каждый класс IFN содержит несколько определенных типов. Каждый из IFN- и IFN- представляет собой продукт одного гена. Белки, классифицированные как IFN-, представляют собой наиболее разнообразную группу, содержащую примерно 15 типов. Имеется кластер генов IFN- на хромосоме 9, содержащей по меньшей мере 23 члена, из которых 15 являются активными и транскрибированными. Зрелые IFN- не гликозилированы. Все IFN- и IFN- имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) с одинаковыми видами биологической активности. IFN имеют длину 146 аминокислот и менее близко напоминаюти . ТолькоIFN- может активировать макрофаги или индуцировать созревание киллерных Т-клеток. Эти новые типы терапевтических средств могут иногда называться модификаторами биологической реакции (BRM),потому что они оказывают эффект на реакции организма на опухоль, воздействуя на распознавание через иммуномодуляцию. Человеческий фибробластный интерферон (IFN-) обладает противовирусной активностью и может также стимулировать действие натуральных киллерных клеток против неопластических клеток. Он представляет собой полипептид примерно 20000 Да, индуцированный вирусом и двухнитевыми РНК. По нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного технологией рекомбинантной ДНК (Derynk et al., 1980), установлена полная аминокислотная последовательность белка. Он имеет длину 166 аминокислот.Shepard et al. (1981) описали мутацию в основании 842 (CysTyr в положении 141), которая уст-1 010979 раняла его противовирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 119-1121.Mark et al. (1984) провели инсерцию искусственной мутации замещением основания 469 (Т) (А),вызывающей аминокислотное переключение от CysSer в положении 17. Сообщалось, что полученный в результате IFN- активен в качестве нативного IFN- и устойчив в течение длительного храненияRebif (Serono - рекомбинантный человеческий интерферон-), самая последняя разработка в терапии интерфероном по поводу рассеянного склероза (MS), представляет собой (IFN)1 а, продуцируемый из клеточных линий млекопитающих. Его рекомендуемым международным не патентованным названием (INN) является интерферон 1 а. Как и для всех фармацевтических средств на белковой основе одним основным препятствием, которое необходимо преодолеть при использовании IFN- в качестве терапевтического средства, является потеря возможности фармацевтического использования, которая может возникнуть в результате его неустойчивости в фармацевтических препаративных формах. Физическая неустойчивость, которая угрожает активности полипептида и эффективности в фармацевтических препаративных формах, включает денатурацию и образование растворимых и нерастворимых агрегатов, в то время как химическая неустойчивость включает гидролиз, образование имида, окисление, рацемизацию и деаминирование. Известно, что некоторые из этих изменений ведут к потере или снижению фармацевтической активности интересующего белка. В других случаях, точные эффекты этих изменений неизвестны, но полученные продукты разрушения еще считаются фармацевтически неприемлемыми ввиду возможных нежелательных побочных эффектов. Стабилизация полипептидов в фармацевтических композициях остается областью, в которой пробы и ошибки играют основную роль (обзор Wang (1999) Int. J. Pharra. 185: 129-188; Wang and Hanson (1988)J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26). Эксципиенты, которые добавляются к полипептидным фармацевтическим препаративным формам для увеличения их устойчивости, включают буферы, сахара, поверхностноактивные вещества, аминокислоты, полиэтиленгликоли и полимеры, но стабилизирующие эффекты этих химических добавок варьируются в зависимости от белка. В US 2002/0172661 описаны препаративные формы IFN-, которые характеризуются их низкой ионной силой и рН примерно 3,0-5,0. В современных препаративных формах IFN- используется HSA в виде усиливающего растворимость агента для IFN-. Однако применение HSA имеет некоторые недостатки. HSA представляет собой продукт человеческой крови, и поэтому его нужно получать у людей. Хотя предприняты шаги для снижения риска, применение продуктов человеческой крови, таких как HSA, несет с собой возможное внесение человеческих вирусов, таких как ВИЧ и HCV (вирус гепатита В). Следовательно, существует необходимость в дополнительных фармацевтических композициях IFN, включающих физиологически совместимые стабилизаторы, которые улучшают растворимость этого белка и стабилизируют белок против формирования агрегатов, посредством этого повышая возможность фармацевтического использования. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к стабилизированным фармацевтическим композициям, которые включают интерферон (IFN), и к способам их получения. Эти композиции получают при отсутствии человеческого сывороточного альбумина (HSA). Такие композиции именуются как свободные от HSA. Свободные от HSA фармацевтические композиции IFN включают интерферон (IFN) или его изоформу,мутеин, гибридный белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, где указанная композиция представляет собой раствор, который включает буфер, аминокислоту и антиоксидант. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, композиции также включают бактериостатический агент. Используемые термины интерферон или IFN предназначены для включения любой молекулы,определенной так в литературе, включающей, например, любые типы IFN, указанные в приведенном выше разделе Описание предшествующего уровня техники. В частности, в приведенное выше определение включены IFN-, IFN- и IFN-. IFN- представляет собой предпочтительный IFN, в соответствии с настоящим изобретением. IFN-, подходящий в соответствии с настоящим изобретением, имеется в продаже, например, в виде Rebif (Serono), Avonex (Biogen) или Betaferon (Schering). Применение интерферонов человеческого происхождения также предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением. Используемый термин интерферон предназначен для охвата его изоформы, мутеина, гибридного белка, функционального производного, активной фракции или соли. Используемый термин интерферон- (IFN-бета или IFN-) предназначен для включения фибробластного интерферона, в частности, человеческого происхождения, полученного выделением из биологических жидкостей или полученного методиками рекомбинантной ДНК из прокариоцитной или эукариоцитной клеток-хозяев, а также его солей, функциональных производных, вариантов, аналогов и активных фрагментов. Предпочтительно IFN- предназначен для обозначения интерферона -1 а. Используемый термин мутеины относится к аналогам IFN, в которых один или более аминокис-2 010979 лотных остатков натурального IFN замещены различными аминокислотными остатками или подвергнуты делеции, или один или более аминокислотных остатков добавлены к натуральной последовательностиIFN без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с IFN дикого типа. Эти мутеины получают известным синтезом и/или методиками направленного сайта мутагенеза или любой другой известной методикой, подходящей для этого. Предпочтительные мутеины включают, например, мутеины, описанные Shepard et al. (1981) или Mark et al. (1984). Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дупликативную в отношении аминокислотной последовательности IFN, с тем, чтобы иметь, по существу, такую же или даже лучшую активность, чем IFN. Биологическая функция интерферона хорошо известна специалисту в данной области, а биологические стандарты установлены и имеются, например, на сайтеNational Institute for Biological Standards and Control (http://immunology.org/links/NIBSC). Были описаны биологические количественные анализы для определения активности IFN. АнализIFN можно, например, проводить, как описано Rubinstein et al., 1981. Так, посредством обычного экспериментирования можно определить, имеет ли любой данный мутеин, по существу, такую же или даже лучшую активность, чем IFN. Мутеины IFN, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают конечный набор, по существу, соответствующих последовательностей, как у замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые может получить обычным способом специалист в данной области без ненужного экспериментирования на основании положений и представленного руководства. Предпочтительные изменения для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой те, которые известны как консервативные замещения. Консервативные аминокислотные замещения полипептидов или белков по изобретению могут включать синонимные аминокислоты в пределах группы, которые имеют достаточно аналогичные физико-химические свойства, так что замещение между членами группы сохранит биологическую функцию молекулы. Ясно, что инсерции и делеции аминокислот можно также производить в определенных выше последовательностях без изменения их функции, особенно если инсерции или делеции только включают несколько аминокислот, например менее 30, а предпочтительно менее 10, и не удаляют или не замещают аминокислоты, которые имеют решающее значение для функциональной конформации, например цистеиновые остатки. Белки и мутеины,продуцируемые такими делециями и/или инсерциями, входят в сферу действия настоящего изобретения. Предпочтительно синонимическими аминокислотными группами являются аминокислотные группы, определенные в табл. 1. Предпочтительнее синонимическими аминокислотными группами являются аминокислотные группы, определенные в табл. 2; а наиболее предпочтительно синонимическими аминокислотными группами являются аминокислотные группы, определенные в табл. 3. Таблица 1 Предпочтительные группы синонимических аминокислот Таблица 2 Более предпочтительные группы синонимических аминокислот-4 010979 Таблица 3 Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот Примеры продукции аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для получения мутеинов IFN, для применения в настоящем изобретении, включают любые этапы известного способа, такие как представленные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462, Mark et al.;5116943, Koths et al.,4965195, Namen et al.;4879111, Chong et al. и 5017691, Lee et al.; и замещенные лизином белки, представленные в патенте США 4904584 (Shaw et al.). Определенные мутеины IFN- были описаны, например, Mark et al., 1984. Термин слитый белок относится к полипептиду, включающему IFN, или к его мутеину, слитому с другим белком, который, например, имеет продолжительное время нахождения в биологических жидкостях. Таким образом, IFN может быть слит с другим белком, полипептидом или им подобным, например иммуноглобулином или его фрагментом. Используемый термин функциональные производные охватывает производные IFN и их мутеины и слитые белки, которые можно получить из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках или N- или С-концевых группах, средством, известным в данной области, и они включены в изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность белка, которая, по существу, аналогична активности IFN, и не придают токсичные свойства композициям, содержащим его. Эти производные могут, например, включать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные сайты и продлевать нахождение IFN в биологических жидкостях. Другие производные включают сложные алифатические эфиры карбоксильных групп,амидов карбоксильных групп взаимодействием с аммиаком или с первичными или вторичными аминами,N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованных с ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильных групп серильных или треонильных остатков), образованных с ацильными частями. В качестве активных фракций IFN или мутеинов и гибридных белков, настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или предшественников полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, связанными с ней, например сахарными или фосфатными остатками, или агрегатами самих белковой молекулы или сахарных остатков, при условии,что указанная фракция значимо не снизила активность по сравнению с соответствующим IFN. Используемый термин соли относится и к солям карбоксильных групп, и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп описанных выше белков или их аналогов. Соли карбоксильной группы могут образовываться средствами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, трехвалетного железа или цинка и им подобные, и соли с органическими основаниями, как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и им подобные. Кислотные аддитивные соли включают, например, соли с неор-5 010979 ганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно,любая такая соль должна сохранять биологическую активность белков (IFN), относящуюся к настоящему изобретению, т.е. способность связываться с соответствующим рецептором и инициировать передачу сигналов рецепторами. В соответствии с настоящим изобретением, кроме того, особенно предпочтительно применение рекомбинантного человеческого IFN- и соединений по изобретению. Недавно был описан определенный вид варианта интерферона. Так называемые консенсусные интерфероны представляют собой не натурально встречающиеся варианты IFN (патент США 6013253). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения соединения по изобретению применяются в комбинации с консенсусным интерфероном. Используемый термин консенсус человеческого интерферона (IFN-con) должен означать не натурально встречающийся полипептид, который преимущественно включает те аминокислотные остатки,которые являются общими для подтипа IFN-, репрезентативного для большинства последовательностей натурально встречающегося подтипа человеческого лейкоцитарного интерферона, и который включает, в одном или более из этих положений, где нет аминокислоты, общей для всех подтипа, аминокислоту, которая преимущественно встречается в этом положении, и ни в коем случае не включает любой аминокислотный остаток, который не существует в этом положении, по меньшей мере, у одного натурально встречающегося подтипа. IFN-con охватывает, но не ограничивается этим, аминокислотные последовательности, обозначенные IFN-con1, IFN-con2 и IFN-con3, которые раскрыты в патентах США 4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие IFN-con, можно получить, как описано в указанных выше патентах, или другими стандартными способами. В еще одном предпочтительном варианте осуществления гибридный белок включает слияние Ig. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может иметь столь маленькую длину, как 1-3 аминокислотных остатка, или иметь длину, например, 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой трипептид последовательности, например, E-F-M(Glu-Phe-Met), или последовательность линкера из 13 аминокислот, включающую Glu-Phe-Gly-Ala-GlyLeu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, введенную между последовательностью IFN и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок может иметь улучшенные свойства, такие как продленное пребывание в биологических жидкостях (период полувыведения), увеличенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии, или облегчается очистка гибридного белка. В еще одном предпочтительном варианте осуществления IFN слит с константной областью молекулы Ig. Предпочтительно, он слит с областями тяжелой цепи, подобными доменам СН 2 и СН 3, например человеческого IgG1. Другие изоформы молекул Ig также подходят для создания гибридных белков в соответствии с настоящим изобретением, таких как изоформы IgG2, IgG3 или IgG4, или другие классы Ig,подобные, например, IgM или IgA. Гибридные белки могут быть мономерными или многомерными, гетеро- или гомомногомерными. В еще одном предпочтительном варианте осуществления функциональное производное включает по меньшей мере одну часть, присоединенную к одной или более функциональным группам, которые встречаются в виде одной или более боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно часть представляет собой полиэтиленовую (PEG, полиэтиленгликолевую) часть. Пэгилирование можно проводить известными способами, такими как способы, описанные, например, в WO 99/55377. Дозировка, введенная индивидууму в виде одной или множественных доз, будет варьироваться в зависимости от различных векторов, включая фармакокинетические свойства, путь введения, состояния и характеристики пациента (пол, возраст, масса тела, здоровье, рост), степени симптомов, сопутствующих способов лечения, частоты лечения и желательного эффекта. Дозировка IFN- при лечении рецидивирующего, ремитирующего MS в соответствии с изобретением зависит от типа используемого IFN-. В соответствии с настоящим изобретением, где IFN представляет собой рекомбинантный IFN1b,продуцируемый в Е. coli, имеется в продаже под торговым названием Betaseron, его можно предпочтительно вводить подкожно через день в дозировке примерно от 250 до 300 мкг или от 8 до 9,6 ME на человека. В соответствии с настоящим изобретением, где IFN представляет собой рекомбинантный IFN1a,продуцируемый клетками яичников китайских хомячков (клетки СНО), имеющихся в продаже под торговым названием Avonex, его можно предпочтительно вводить внутримышечно 1 раз/нед. в дозировке от приблизительно 30 до 33 мкг или от 6 до 6,6 ME на человека. В соответствии с настоящим изобретением, когда IFN представляет собой рекомбинантный IFN-1 а, продуцируемый клетками яичников китайских хомячков (клетки СНО), имеющихся в продаже под торговым названием Rebif, его можно предпочтительно вводить подкожно 3 раза/нед. (TIW) в дозировке от 22 до 44 мкг или от 6 до 12 ME на человека. Введение активных ингредиентов в соответствии с настоящим изобретением может осуществляться-6 010979 внутривенным, внутримышечным или подкожным путем. Предпочтительным путем введения IFN является подкожное введение. Еще одним предпочтительным путем введения является внутримышечное введение, которое может, например, осуществляться 1 раз/нед.IFN можно также вводить ежедневно, или через день, или реже. Предпочтительно IFN вводится 1, 2 или 3 раза/нед. Термин устойчивость относится к физической, химической и конформационной устойчивости препаративных форм интерферона по настоящему изобретению (включая поддержание биологической активности). Неустойчивость белковой препаративной формы может быть вызвана химическим разложением или агрегацией молекул белка для образования полимеров высшего порядка, дегликозилирования, модификации гликозилирования, окисления или любой другой структурной модификации, которая снижает по меньшей мере одну биологическую активность полипептида интерферона, включенного в настоящее изобретение. Устойчивый раствор или препаративная форма представляет собой раствор или композицию, в которой степень разложения, модификации, агрегации, потери биологической активности и тому подобное, содержащихся в них белков регулируется приемлемым образом и не увеличивается неприемлемо с течением времени. Предпочтительно препаративная форма удерживается, по меньшей мере, на уровне примерно 60%, предпочтительнее, по меньшей мере, на уровне примерно 70%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на уровне примерно 80% активности меченого интерферона в течение периода от 12 до 24 мес. Стабилизированные лишенные HSA композиции IFN по изобретению предпочтительно имеют срок хранения по меньшей мере примерно 6, 12, 18 мес., предпочтительнее по меньшей мере 20 мес., еще предпочтительнее по меньшей мере примерно 22 мес., наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 24 мес. при хранении при 2-8 С. Способы мониторинга устойчивости лишенных HAS фармацевтических композиций IFN по изобретению имеются в данной области, включая те способы, которые описаны в раскрытых примерах. Так,образование агрегатов INF во время хранения жидкой фармацевтической композиции по изобретению можно легко определить измерением изменения растворимого IFN в растворе с течением времени. Количество растворимого полипептида в растворе можно количественно определить рядом аналитических количественных определений, приспособленных для выявления IFN. Такие анализы включают, например, ВЭЖХ в обращенной фазе (RP) -HPLC и УФ абсорбционную спектроскопию, как описано ниже в примерах. Определения и растворимых, и нерастворимых агрегатов во время хранения в жидких препаративных формах можно достичь, например, с использованием аналитического ультрацентрифугирования, как отмечено ниже в примерах для различения той части растворимого полипептида, которая присутствует в виде растворимых агрегатов, и той части, которая присутствует в не агрегированной, биологически активной молекулярной форме. Кроме того, скорость ультрацентрифугирования способна выявить и не ковалентные, и ковалентные олигомеры и количественно, и качественно. Аналогичным образом, новый способ (SE)-HPLC с исключением по размеру (описанный в примерах), именуемый здесь "NEW SEC",способен выявить и ковалентные, и не ковалентные олигомеры и количественно, и качественно. Выражение многодозовое применение предназначено для включения применения одного флакона, ампулы или кассеты препаративной формы интерферона для более чем одной инъекции, например 2,3, 4, 5, 6 или более инъекций. Инъекции предпочтительно производятся в течение периода, по меньшей мере составляющего или примерно 12, 24, 48 ч и т.д., предпочтительно до периода, равного или примерно 12 д. Инъекции могут быть разделены во времени, например, периодом 6, 12, 24, 48 или 72 ч. Термин аминокислота относится к аминокислоте или комбинации аминокислот, где любая данная аминокислота присутствует или в форме его свободного основания, или в форме его соли. Когда используется комбинация аминокислот, все аминокислоты могут присутствовать в их формах свободного основания, все могут присутствовать в их солевых формах или некоторые могут присутствовать в их формах свободного основания, в то время как другие присутствуют в их солевых формах. Предпочтительные аминокислоты для применения в настоящем способе или препаративной форме по настоящему изобретению представляют собой те, которые несут заряженную боковую цепь, именуемые аминокислота(ы) с заряженной боковой цепью, такие как аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Предпочтительнее аминокислота представляет собой лизин. Любой стереоизомер (т.е. L-, Dили DL-изомер) определенной аминокислоты или комбинации этих стереоизомеров можно использовать в настоящем способе или препаративной форме по изобретению, пока определенная аминокислота присутствует в ее форме свободного основания или его солевой форме. Предпочтительно используется Lстереоизомер. Аналоги этих предпочтительных аминокислот можно также использовать в настоящей препаративной форме по изобретению. Термин аминокислотный аналог относится к производному натурально встречающейся аминокислоты. Подходящие аналоги аргинина включают, например, аминогуанидин и N-моноэтил-L-аргинин. Как и предпочтительные аминокислоты, аналоги аминокислот используются в настоящей препаративной форме или в их форме свободного основания, или в их солевой форме. Аминокислоты здесь также именуются стабилизаторами. Аминоксилота(ы), используемая в настоящей препаративной форме по изобретению, защищает те-7 010979 рапевтически активный полипептид против разнообразных стрессов, увеличивая или/и поддерживая посредством этого устойчивость препаративной формы интерферона-. Используемый термин стресс включает, но не ограничивается, нагревание, замораживание, рН, свет, перемешивании, окисление, дегидратацию, сдвиг, замораживание/оттаивание, лиофилизацию, давление, тяжелые металлы, фенольные соединения, денатураты и т.д. Термин стресс охватывает любой фактор, который модулирует (т.е. уменьшает, поддерживает или увеличивает) устойчивость препаративной формы, содержащей интерферон-. Увеличение и/или сохранение устойчивости при добавлении аминокислоты происходит зависимым от концентрации образом. Т.е. увеличение концентраций аминокислоты ведет к увеличенной и/или сохраненной устойчивости препаративной формы, содержащей интерферон- по настоящему изобретению, когда эта препаративная форма, содержащая интерферон-, обычно проявляет образование агрегатов или олигомеров в отсутствие аминокислоты. Определение количества определенной аминокислоты,которую предстоит использовать в настоящей препаративной форме по изобретению, для уменьшения образования олигомеров или агрегатов и, посредством этого, увеличения устойчивости мономерного белка, можно легко произвести без ненужного экспериментирования, используя способы, в целом известные специалисту в данной области. Термин буфер или физиологически приемлемый буфер относится к растворам соединений, которые, как известно, безопасны для фармацевтического или ветеринарного применения в препаративных формах и которые оказывают эффект поддержания или регулирования рН препаративной формы в диапазоне рН, желательном для препаративной формы. Приемлемые буферы для регулирования рН в пределах от умеренно кислотного рН до умеренно основного рН включают, но не ограничиваются, такие соединения как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, TRIS и гистидин. "TRIS" относится к 2-амино-2 гидроксиметил-1,3-пропандиолу и к любой его фармакологически приемлемой соли. Предпочтительными буферами являются ацетатные буферы с солевым раствором или приемлемой солью. Агент, придающий изотоничность, представляет собой соединение, которое физиологически переносимо и придает подходящую изотоничность препаративной форме для предотвращения чистого потока воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с препаративной формой. Соединения, такие как глицерин, обычно используются для таких целей в известных концентрациях. Другие подходящие агенты, придающие изотоничность, включают, но не ограничиваются, маннит, аминокислоты или белки (например, глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, декстроза, маннит, сахароза и лактоза). Термин антиоксидант относится к соединению, которое предотвращает взаимодействие кислорода или происходящих из кислорода свободных радикалов с другими веществами. Антиоксиданты находятся среди ряда эксципиентов, обычно добавляемых к фармацевтическим системам, для увеличения физической и химической устойчивости. Антиоксиданты добавляются для минимизации или задержки окислительных процессов, которые происходят с некоторыми препаратами или эксципиентами после контакта с кислородом или в присутствии свободных радикалов. Эти процессы могут часто катализироваться светом, температурой, водородом, концентрацией, присутствием металлических микроэлементов или пероксидов. Сульфиты, бисульфиты, тиомочевина, метионин, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) и бутилированный гидроксианизол (ВНА) часто используются в качестве антиоксидантов в препаратах. Было обнаружено, что натрий EDTA усиливает активность антиоксидантов образованием хелатов ионов металлов, которые в противном случае катализировали бы реакцию окисления. Наиболее предпочтительный антиоксидант представляет собой метионин. Антиоксиданты также именуются стабилизаторами. Метионин может присутствовать или в форме его свободного основания, или в его солевой форме. Любой стереоизомер (т.е. L-, D- или DL-изомер) метионина можно использовать в настоящем способе или препаративной форме по изобретению, пока метионин присутствует в форме его свободного основания, или в его солевой форме. Предпочтительно используется L-стереоизомер. Аналоги метионина можно также использовать в настоящей препаративной форме по изобретению. Термин аналог метионина относится к производному натурально встречающегося метионина. Аналоги метионина также можно использовать в настоящей препаративной форме, или в форме его свободного основания, или в его солевой форме. Повышение и/или сохранение устойчивости при добавлении антиоксидантов (например, метионина) происходит зависимым от концентрации образом. То есть увеличение концентрации антиоксидантов ведет к повышенной и/или сохраненной устойчивости препаративной формы, содержащей интерферонпо настоящему изобретению, когда эта препаративная форма, содержащая интерферон-, обычно проявляет окисление или образование агрегатов/олигомеров в отсутствие антиоксиданта. Определение количества антиоксиданта (например, метионина), который предстоит использовать в настоящей препаративной форме по изобретению, для уменьшения окисления или образования олигомеров/агрегатов, можно легко определить без ненужного экспериментирования с использованием способов, в целом известных специалисту в данной области. Термин бактериостатическое относится к соединению или композициям, добавляемым к препа-8 010979 ративной форме, для действия в качестве антибактериального средства. Примеры бактериостатических средств включают фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен(метил, этил, пропил, бутил и им подобные), бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал. Предпочтительно бактериостатическое средство представляет собой бензиловый спирт. Термин поверхностно-активное вещество относится к растворимому соединению, которое снижает поверхностное натяжение жидкостей или снижает межповерхностное натяжение между жидкостями или жидкостью и твердым веществом, причем поверхностное натяжение представляет собой силу,действующую на поверхность жидкости, имея тенденцию минимизировать площадь поверхности. Поверхностно-активные вещества иногда использовались в фармацевтических препаративных формах,включая доставку препаратов с низкой молекулярной массой и полипептиды, для модификации всасывания препарата или его доставки к тканям-мишеням. Хорошо известные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (производные полиоксиэтилена; Tween), a также Pluronic. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения было обнаружено, что путем включения в состав интерферона с поверхностно-активным веществом, выбранным из PluronicF68, также известного как Poloxamer 188), получается устойчивая препаративная форма, которая минимизирует потерю активного ингредиента, вызванную адсорбцией на поверхности флакончика и/или устройства доставки (например, шприца, насоса, катетера и т.д.). Было обнаружено, что путем включения в состав интерферона с поверхностно-активным веществом, выбранным из Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88 и Pluronic F68, особенно предпочтительно Pluronic F68 (BASF, Pluronic F68, также известным как Poloxamer 188), получается устойчивая препаративная форма, которая более устойчива к окислению и к образованию агрегатов белков. Поверхностно-активные вещества Pluronic представляют собой блок-сополимеры этиленоксида(ЕО) и пропиленоксида (РО). Блок пропиленоксида (РО) вставляется между двумя блоками этиленоксида Поверхностно-активные вещества Pluronic синтезируются способом из двух стадий: 1. Гидрофобное вещество с желательной молекулярной массой создается контролируемым добавлением пропиленоксида к двум гидроксильным группам пропиленгликоля; и 2. Этиленоксид добавляется для прослойки гидрофобного вещества между гидрофильными группами. В Pluronic F77 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 70%, а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 2306 Да. В Pluronic F87 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 70%,а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 2644 Да. В Pluronic F88 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 80%,а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 2644 Да. В Pluronic F68 процентное содержание полиоксиэтилена (гидрофильного вещества) составляет 80%,а молекулярная масса гидрофобного вещества (полиоксипропилена) составляет приблизительно 1967 Да. Типичные свойства Pluronic F77 перечислены ниже. Средняя молекулярная масса: 6600 Точка плавления/температура потери текучести: 48 С Физическая форма 20 С: твердое вещество Вязкость (Brookfield), спз: 480 [жидкости при 25 С, пасты при 60 С и твердые вещества при 77 С] Поверхностное натяжение, дин/см 25 С 0,1% концентрация: 47,0 0,01% концентрация: 49,3 0,001% концентрация: 52,8 Межповерхностное натяжение, дин/см 25 С в сравнении с Nujol 0,1% концентрация: 17,7 0,01% концентрация: 20,8 0,01% концентрация: 25,5 Смачивание Draves, секунды 25 С 1,0% концентрация: 360 0,1% концентрация: 360 Высота пеныHLB (гидрофильно-липофильный баланс): 25 Типичные свойства Pluronic F87 перечислены ниже. Средняя молекулярная масса: 7700 Точка плавления/температура потери текучести: 49 С Физическая форма 20 С: твердое вещество Вязкость (Brookfield), спз: 780 [жидкости при 25 С, пасты при 60 С и твердые вещества при 77 С] Поверхностное натяжение, дин/см 25 С 0,1% концентрация: 44,0 0,01% концентрация: 47,0 0,001% концентрация: 50,2 Межповерхностное натяжение, дин/см 25 С в сравнении с Nujol 0,1% концентрация: 17,4 0,01% концентрация: 20,3 0,01% концентрация: 23,3 Смачивание Draves, секунды 25 С 1,0% концентрация: 360 0,1% концентрация: 360 Высота пеныHLB (гидрофильно-липофильный баланс): 24 Типичные свойства Pluronic F88 перечислены ниже. Средняя молекулярная масса: 11400 Точка плавления/температура потери текучести: 54 С Физическая форма 20 С: твердое вещество Вязкость (Brookfield), спз: 2300 [жидкости при 25 С, пасты при 60 С и твердые вещества при 77 С] Поверхностное натяжение, дин/см 25 С 0,1% концентрация: 48,5 0,01% концентрация: 52,6 0,001% концентрация: 55,7 Межповерхностное натяжение, дин/см 25 С в сравнении с Nujol 0,1% концентрация: 20,5 0,01% концентрация: 23,3 0,01% концентрация: 27,0 Смачивание Draves, секунды 25 С 1,0% концентрация: 360 0,1% концентрация: 360 Высота пеныHLB (гидрофильно-липофильный баланс): 28 Типичные свойства Pluronic F68 перечислены ниже. Средняя молекулярная масса: 8400 Точка плавления/температура потери текучести: 52 С Физическая форма 20 С: твердое вещество Вязкость (Brookfield), спз: 1000 [жидкости при 25 С, пасты при 60 С и твердые вещества при 77 С] Поверхностное натяжение, дин/см 25 С 0,1% концентрация: 50,3HLB (гидрофильно-липофильный баланс): 29 Другие полимеры, имеющие свойства, аналогичные свойствам, перечисленным выше, можно также использовать в препаративных формах по изобретению. Предпочтительным поверхностно-активным является Pluronic F68 и поверхностно-активные вещества, имеющие аналогичные свойства.Pluronic, в частности Pluronic F68, предпочтительно присутствует в концентрации, которая достаточна для поддержания устойчивости интерферона в течение желательного периода хранения (например,12-24 мес.), а также в концентрации, которая достаточна для предотвращения потерь белка вследствие адсорбции на поверхностях, таких как флакон, ампула или кассета или шприц. Предпочтительно концентрация Pluronic, в частности Pluronic F68, в жидких препаративных формах составляет от или примерно от 0,01 мг/мл до или примерно до 10 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 0,05 мг/мл до или примерно до 5 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 0,1 мг/мл до или примерно до 2 мг/мл, наиболее предпочтительно на уровне или около 0,5 мг/мл. Предпочтительно концентрация IFN1 а в препаративной форме составляет от или примерно от 10 мкг/мл до или примерно до 800 мкг/мл, предпочтительнее от или примерно от 20 мкг/мл до или примерно до 500 мкг/мл, еще предпочтительнее от или примерно от 30 до или примерно до 300 мкг/мл, наиболее предпочтительно на уровне 22, 44, 88 или 264 мкг/мл. Предпочтительно препаративные формы по настоящему изобретению имеют рН от или примерно от 3,5 до или примерно до 5,5, предпочтительнее на уровне или примерно 4,7. Предпочтительным буфером является ацетат, причем предпочтительными противоионами являются ионы натрия или калия. Ацетатные солевые буферы хорошо известны в данной области. Концентрации буфера во всем растворе могут варьироваться на уровне или примерно 5, 9,5, 10, 50, 100, 150, 200, 250 и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера находится на уровне или примерно 10 мМ в ацетатных ионах при рН 4,70,2. Предпочтительно в композиции по изобретению антиоксидант, например метионин, присутствует в концентрации от или примерно от 0,01 до или примерно до 5,0 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 0,05 до или примерно до 0,3 мг/мл, наиболее предпочтительно на уровне или примерно 0,12 мг/мл. Предпочтительно в композиции по изобретению антиоксидант, аминокислота, например лизин,присутствует в концентрации от или примерно от 1 до или примерно до 100 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 10 до или примерно до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно на уровне или примерно 27,3 мг/мл. Изобретение включает жидкие препаративные формы. Предпочтительным растворителем является вода для инъекций. Жидкие препаративные формы могут быть однодозовыми или многодозовыми. Те жидкие препаративные формы интерферона по изобретению, которые предназначены для многодозового применения,предпочтительно включают бактериостатическое средство, такое как фенол, м-крезол, п-крезол, окрезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и им подобные), бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал. Особенно предпочтительными являются фенол, бензиловый спирт или м-крезол, более предпочтителен бензиловый спирт. Бактериостатическое средство используется в количестве, которое даст концентрацию, которая эффективна для поддержания препаративной формы, по существу, свободной от бактерий (подходящей для инъекций) в течение периода инъекций множественных доз, который может составлять от или примерно от 12 или 24 ч до или примерно до 12 дней, предпочтительно от или примерно от 6 до или примерно до 12 дней. Бактериостатическое средство предпочтительно присутствует в концентрации от или примерно от 0,1% (масса бактериостатического средства/масса растворителя) до или примерно до 2,0%, предпочтительнее от или примерно от 0,2% до или примерно до 1,0%. В случае бензилового спирта особенно предпочтительными являются концентрации 0,2 или 0,3%).- 11010979 Однако использование консерванта, например бензилового спирта, не ограничивается многодозовыми препаративными формами, но его можно также добавлять в однодозовые препаративные формы. Один вариант осуществления настоящего изобретения состоит в однодозовых препаративных формах,содержащих бензиловый спирт. В еще одном варианте осуществления препаративных форм в соответствии с настоящим изобретением, интерферон- представлен по меньшей мере примерно на 96% или по меньшей мере примерно на 98% в его мономерной форме (менее чем 4, предпочтительнее менее чем 2% агрегатов) при комнатной температуре или при 2-8 С, по данным измерения описанным ниже анализом скорости осаждения. Предпочтительная препаративная форма состоит из интерферона 1 а, бензилового спирта, лизина,метионина, Pluronic F-68 и водного ацетатного буфера предпочтительно для доведения рН до 3,7-4,7. Диапазон интерферона в препаративных формах по изобретению включает количества, дающие после растворения концентрации от или примерно от 1,0 мкг/мл до или примерно до 50 мг/мл, хотя функциональны и более низкие и более высокие концентрации, и они зависят от предполагаемого носителя доставки, например препаративные формы в виде растворов будут отличаться от способов доставки трансдермальной системой, через легкие, через слизистые оболочки или осмотическим или микронасосом. Концентрация интерферона составляет предпочтительно от или примерно от 5,0 мкг/мл до или примерно до 2 мг/мл, предпочтительнее от или примерно от 10 мкг/мл до или примерно до 1 мг/мл, наиболее предпочтительно от или примерно от 30 мкг/мл до или примерно до 100 мкг/мл. Предпочтительно препаративные формы по изобретению удерживают по меньшей мере или примерно 60%, предпочтительнее по меньшей мере или примерно 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере или примерно 80% активности нтерферона во время упаковки в течение периода 24 мес. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ изготовления жидкой фармацевтической композиции, как описано ранее. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ изготовления упакованной фармацевтической композиции, включающий помещение раствора,включающего активный ингредиент и эксципиенты, как описано ранее. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет изделие изготовления для фармацевтического применения у человека, включающее флакончик, содержащий фармацевтические композиции, как описано выше, и письменный материал, указывающий на то,что такой раствор может храниться в течение периода, составляющего или примерно составляющего 24 ч или более после первого применения. Предпочтительно в письменном материале указано, что раствор можно держать в течение или примерно в течение 12 дней. После первого применения многодозовой препаративной формы ее можно хранить и использовать в течение по меньшей мере 24 ч или примерно 24 ч, предпочтительно по меньшей мере в течение или примерно в течение 4, 5 или 6 дней, предпочтительнее в течение до 12 дней. После первого применения препаративная форма предпочтительно хранится при температуре ниже комнатной (т.е. ниже или примерно ниже 25 С), предпочтительнее ниже или примерно ниже 10 С, предпочтительнее при или примерно при 2-8 С, наиболее предпочтительно при или примерно при 4-6 С. Препаративные формы по настоящему изобретению можно получить способом, который включает добавление рассчитанных количеств эксципиентов к забуференному раствору и затем добавление интерферона. Полученный раствор затем помещают во флакончики, ампулы или кассеты. Специалисту в данной области должны быть понятны возможные изменения этого способа. Например, порядок добавления компонентов, то, используются ли дополнительные добавки, температура и рН, при которых получают препаративную форму, - это все факторы, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и средств введения. В случае препаративной формы многодозового применения бактериостатическое средство можно добавлять к раствору, содержащему активный ингредиент (интерферон) или, альтернативно, ее можно держать в отдельном флакончике или кассете и в последующем смешивать с раствором, содержащим активный ингредиент, в момент применения. Препаративные формы по изобретению можно вводить, используя признанные устройства. Примеры, включающие эти системы одиночных флакончиков, включают устройства в виде автоинжектора или ручки-инжектора для доставки раствора, такого как Rebiject. Заявляемые в настоящее время продукты включают упаковочный материал. Упаковочный материал предоставляет в дополнение к информации, требуемой регуляторными агентствами, условия, в которых можно применять продукт. Упаковочный материал по настоящему изобретению, при необходимости,предоставляет пациенту инструкции по получению конечного раствора и по применению такого конечного раствора в течение периода 24 ч или более для содержащегося в двух флаконах влажного/сухого продукта. Для содержащегося в одном флаконе продукта в виде раствора на этикетке указывается, что такой раствор можно применять в течение периода 24 ч или более. Заявляемые в настоящее время продукты можно использовать для применения в качестве фармацевтического продукта для людей.- 12010979 Устойчивые консервированные препаративные формы могут предоставляться пациентам в виде прозрачных растворов. Раствор может быть для однократного применения или его можно использовать повторно множество раз, и его может быть достаточно для одного и множественных циклов лечения пациентов и, таким образом, он обеспечивает более удобную схему лечения, чем имеющиеся в настоящее время растворы препаративных форм. Интерферон или в устойчивых, или в консервированных препаративных формах или растворах, согласно изобретению, можно вводить пациенту посредством разнообразных способов доставки, включая подкожную или внутримышечную инъекцию; трансдермальную систему, через легкие, через слизистые оболочки, посредством импланта, кассеты, осмотическим насосом или микронасосом, оральное или другое средство доставки, известное специалисту, как хорошо известно в данной области. Термин флакон относится в широком смысле к резервуару, подходящему для удерживания интерферона в твердой или жидкой форме в помещенном в емкость, стерильном состоянии. Примеры флаконов, используемых в настоящем описании, включают ампулы, кассеты, блистерные упаковки или другие такие резервуары, подходящие для доставки интерферона пациенту посредством шприца, насоса(включая осмотический), катетера, трансдермальной системы, аэрозольного распыления через легкие или слизистые оболочки. Флаконы, подходящие для упаковки продуктов для парентерального, легочного,через слизистые оболочки или трансдермального введения, хорошо известны и признаны в данной области. Термин лечение в пределах контекста настоящего изобретения относится к любому благоприятному эффекту на прогрессирование заболевания, включая ослабление, снижение, уменьшение или облегчение патологического развития после начала заболевания. Фармацевтические композиции по изобретению, включающие IFN или его изоформу, мутеин, гибридный белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, можно применять в диагностике, профилактике и лечении (местном или системном) клинических показаний, реагирующих на лечение этим полипептидом. Такие клинические показания включают, например, расстройства или заболевания центральной нервной системы (ЦНС), мозга и/или спинного мозга, включая рассеянный склероз; аутоиммунные заболевания, включая ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона; и различные формы рака, включая рак молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки и толстой кишки. Все приведенные ссылки, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патенты США или других стран, выданные патенты США или других стран, или любые другие ссылки, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки, включая все данные, таблицы, чертежи и текст, представленный в приведенных ссылках. Кроме того, содержание ссылок, приведенных в указанных ссылках, также полностью включено в качестве ссылок. Ссылка на стадии известных способов, стадии обычных способов, известные способы или обычные способы ни в коей мере не представляют собой допущение, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения раскрывается, описывается или предлагается в релевантной области. Таким образом, предшествующее описание определенных вариантов осуществления полностью выявляет общую природу изобретения, которое другим путем применения знаний в пределах навыков в данной области (включая содержание приведенных ссылок) легко модифицируют и/или адаптируют для различных видов применения без ненужного экспериментирования, не отходя от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах значения диапазона эквивалентов раскрытых вариантов осуществления, на основании представленных положений и руководства. Следует понимать, что используемая фразеология или терминология представлена с целью описания, а не ограничения, так что терминологию или фразеологию настоящего описания опытный специалист должен интерпретировать в свете представленных положений и руководства, в комбинации со знанием среднего специалиста в данной области. Примеры Пример 1. Аналитические методы.(SE)-HPLC с исключением по размеру, также именуемая новой SE-HPLC или НОВОЙ SEC, и скоростное ультрацентрифугирование (AUC) использовали для измерения уровней агрегатов и олигомеров рекомбинантного человеческого интерферона 1a (r-h IFN1a или r-hSIFN-1a). Способы SE-HPLC и AUC, представленные ниже, способны выявить и ковалентные, и не ковалентные олигомеры и количественно, и качественно.a. SE-HPLC. Тест чистоты. Выявление общего содержания агрегатов выполняют на колонке TSK G2000SWXL (TosoHaas) илиBioSuite (Waters); элюирование выполняют изократическим путем при 0,5 мл/мин, используя 50 мМ буфер ацетата натрия, 50 мМ NaCl pH 3,8; длину волн устанавливают на 215 нм. Время цикла составляет 30 мин. Образцы в концентрации 88 мкг/мл анализируют в имеющемся виде, инъецируя 100 мкл.b. Анализ скорости осаждения - AUC. 1. Описание метода.- 13010979 Образцы загружают в ячейки 2-канальным центральным отрезком из активированного угля-эпона с 12-мм оптическим проходом. Центральные отрезки и сапфировые окна очищают детергентом и затем вымачивают в воде для попытки обеспечения наиболее чистых поверхностей. Соответствующее плацебо загружают в эталонный канал (прибор функционирует в качестве двухлучевого спектрофотометра). Затем эти загруженные ячейки помещают в аналитический ротор AN-50Ti, загруженный в аналитическую центрифугу Optima XL-I, и температуру доводят до 20 С. Затем скорость вращения ротора доводят до 3000 об./мин и образцы сканируют (при 280 нм, пике спектральной поглощательной способности) для подтверждения соответствующей загрузки ячеек. Затем скорость вращения ротора доводят до конечной скорости цикла 50000 об./мин. При этой скорости ротора регистрируют 50 сканов для каждого образца. Данные анализируют, используя метод, разработанный Peter Schuck в Национальном институте здоровья и использованный в программе анализа SEDFIT (версия 8.7; Schuck, P. (2000). Анализ распределения макромолекул по размеру ультрацентрифугированием со скоростью осаждения и моделированием уравнением Lamm, Biophys. J. 78, 1606-1619). При этом подходе множество необработанных данных непосредственно подгоняется для получения распределения коэффициентов осаждения, в то же время моделируя влияние диффузии на данные для усиления разрешения. Способ работает определением коэффициента диффузии для каждой величины коэффициента осаждения на основании допущения, что все виды имеют одинаковую общую гидродинамическую форму (при форме, определяемой отношением коэффициента трения относительно такового сферы, f/fo). Затем варьируются величины f/fo для обнаружения наилучшей общей подгонки данных по каждому образцу. Распределения рассчитываются с использованием сглаживания максимальной энтропии 0,51. 2. Аналитические параметры. 3. Оборудование и программное обеспечение. Аналитическая ультрацентрифуга модели XL-I (Beckman Coulter) Программное обеспечение SEDFIT версии 8.70b (Peter Schuck - Национальные институты здоровья) Первоначальная версия 6.03 программного обеспечения (Beckman Coulter) Программное обеспечение Proteome Lab XL-A/XL-I версия 5.0 (Beckman Coulter)c. Количественное определение IFN1a RP-HPLC - QUANT-HPLC. Описанный ниже метод в обращенной фазе обеспечивает возможность количественного определения IFN1a в образцах. Количественное определение белка выполняют на колонке С 4, Wide-Pore Butyl 5 мкм, 4,6250 мм(Baker); длину волны устанавливают на 214 нм и элюирование выполяют при 1 мл/мин, используя следующую подвижную фазу и градиент: А = вода/трифторуксусная кислота 0,1% - В = ацетонитрил/трифторуксусная кислота 0,1% - С = ацетонитрил. Образцы анализируют инжекцией 50 мкл образца в том виде, как он есть (образцы 88 мкг/мл). Время цикла = 65 мин Количественное определение образцов выполняют в сравнении со стандартной кривой в диапазоне 0,0125 мг/мл-0,2 мг/мл, полученной эталонным стандартным материалом.d. Определение чистоты (RP)-HPLC в обращенной фазе DEG/OX. Описанный ниже метод в обращенной фазе обеспечивает возможность выявления окисленных форм IFN1a, которые элюируются иначе, чем интактная молекула. Количественное определение окисленных форм выполняют на колонке C4, Supelcosil LC-304 (Supelco), термостатированной при 40 С; длину волны устанавливают на 208 нм, и элюирование выполняют при 1 мл/мин, используя следующую подвижную фазу и градиент: А = вода 60%/ацетонитрил 40%/гептафторуксусная кислота 0,14% - В = вода 20%/ацетонитрил 80%/гептафтормасляная кислота 0,14% - С = вода 20%/ацетонитрил 80%/трифторуксусная кислота 0,1% Градиент: Таблица Ve. Биологический анализ ингибирования цитопатического эффекта - CPE. Биологическая активность (противовирусная активность). Противовирусную активность IFN1a измеряют биологическим анализом ингибирования цитопатического эффекта (СРЕ). Биологическую активность измеряют антивирусным анализом на основании вызванной IFN- защиты клеток (клеток WISH-амниотической ткани человека) против цитопатического эффекта вируса(вируса везикулярного стоматита). Принцип биологического анализа интерферона основан на том, что ряд вирусов, таких как вирус везикулярного стоматита (VSV), вызывают гибель клеток, которую можно визуализировать витальным окрашиванием. Затем цитопатический эффект можно использовать для количественной характеристики защиты клеток интерфероном. Анализ выполняют косвенным измерением гибели клеток, которую оценивают количеством красителя соли тетразолия МТТ (диметилтиотетразолия), захватываемого живыми клетками. В способе используется автоматическое спектрофотометрическое определение процентной доли защищенных клеток и анализ параллельной линии в трех точках для статистической оценки титра. Процедура: Анализ выполняют в титровочных микропланшетах.a. 50 мкл среды клеточной культуры (MEM/5% FBS) добавляют в каждую лунку.b. 100 мкл образца IFN1a или стандартного раствора (60-100 ME hIFN-/мл) добавляют в лунки иc. 50 мкл суспензии клеток WISH (0,78-0,82106 клеток/мл) добавляют в каждую лунку и планшеты инкубируют при 37 С в течение 18-20 ч в инкубаторе с увлажненным 5% СО 2.d. Суспензию VSV добавляют в каждую лунку, за исключением лунок клеточного контроля, заполненных MEM/2,5% FBS.f. После проверки инвертационным микроскопом, что(1) по меньшей мере 80% повреждения клеток достигнуто в ряду контроля VSV и(2) процентные средние величины защиты стандарта IFN-S подпадают под диапазон 84% для не разбавленного стандарта, 45% для разбавления 1:1,5 и 27% для разведения 1:3. Культуры окрашивают специфическим красителем МТТ.g. Интенсивность окрашивания определяют автоматическим спектрофотометрическим считыванием при 592 нм.h. Для количественного определения активности IFN1a считываемые данные OD (оптической плотности) затем анализируют компьютерной программой (программное обеспечение Colombo). Пример 2. Стабилизация лишенных HSA препаративных форм интерферона 1 а. Следующий эксперимент проводили для проверки защитного эффекта, оказываемого препаративной формой, включающей аминокислоту (т.е. лизин) и антиоксидант (т.е. метионин), на хранение препаративной формы IFN1a при различных температурах (2-8, 25 и 40 С). Следующие аналитические тесты и способы использовали во время разработки (см. пример 1): биологическая активность (биологический количественный анализ in vitro),количественный анализ (метод RP-HPLC),продукты окисления (метод Deg-ox),димеры/агрегаты (NEW SEC-HPLC и AUC, оба метода способны выявить ковалентные и не ковалентные олигомеры),количественный метод RP-HPLC (Quart-HPLC),рН (потенциометрический метод). Результаты представлены в табл. 6-8. 1. Процедура: а. Препаративную форму изготавливали, используя основное количество продукта, хранившееся/траспортировавшееся при 2-8 С. Концентрация r-h IFN1a в основном количестве продукта составила примерно 0,5 мг/мл.a. Препаративную форму, включающую лизин (как указано в п.2), изготавливали разбавлением субстанции препарата в носителе, таким образом достигая конечной композиции (концентрация r-h IFN1a 88 мкг/мл).b. Компаундированный раствор затем асептически фильтровали через нейлоновую мембрану 0,2 мкм и собирали в стерильный контейнер; затем шприцы заполняли 0,5 мл, используя разливочную машину.c. Затем образец хранили в термостатических шкафах при 2-8, 25 и 40 С и тестировали в соответствии с планом устойчивости, используя различные способы/тесты, примерно до 2 мес. хранения (1-3 нед. для образцов, хранившихся при 40 С). 2. Композиция препаративной формы:e. 10 мМ ацетат натрия рН 4,7. 3. Результаты. 4. Выводы. Исследования хранения показывают, что препаративная форма или композиция, включающая лизин, метионин и Pluronic F-68, остается очень устойчивым при 2-8 С, а также при 25 С до 8 нед. Они остаются устойчивыми при 40 С до 3 нед. с точки зрения процентного содержания мономера (процентная доля мономера всегда выше чем 98%). 2 различных способа подтвердили эти результаты (AUC и NEWSE-HPLC). Таким образом, препаративная форма по настоящему изобретению предпочтительно включает комбинацию аминокислоты и антиоксиданта. Предпочтительно поверхностно-активное вещество,кроме того, добавляется к композиции. Предпочтительно аминокислота представляет собой лизин, а антиоксидант представляет собой метионин. Предпочтительно поверхностно-активное вещество выбрано из Tween (например, Tween 20),- 17010979Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88 и Pluronic F68. Предпочтительнее поверхностно-активное вещество представляет собой Pluronic F68. Предпочтительно рН препаративной формы устанавливается в диапазоне от 3,5 до 5,5. Предпочтительнее рН препаративной формы устанавливается на уровне 4,7. Предпочтительно лизин присутствует в концентрации от примерно 1 до примерно 100 мг/мл. Предпочтительнее лизин присутствует в концентрации примерно 27,3 мг/мл. Предпочтительно поверхностноактивное вещество присутствует в концентрации от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл. Предпочтительнее поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации примерно 0,5 мг/мл. Предпочтительно антиоксидант присутствует в концентрации от примерно 0,01 до примерно 5,0 мг/мл. Предпочтительнее антиоксидант присутствует в концентрации примерно 0,12 мг/мл. Предпочтительно интерферон присутствует в концентрации от примерно 10 до примерно 800 мкг/мл. Предпочтительнее интерферон присутствует в концентрации примерно 88 мкг/мл. Ссылки 1. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547. 2. Familletti, P.C, Rubinstein, S., and Pestka, S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon," in Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York,387-394; 3. Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984) . 4. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S.Pestka, ed.), Academic Press, New York 119,14-23. 5. Rubinstein, S., Familletti, P.C, and Pestka, S. Convenient Assay for Interferons. J. Virol. 1981; 37, 755758. 6. Shepard H.M. et al., Nature 1981; 294, 563-565. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стабилизированная, свободная от HAS (человеческого сывороточного альбумина) жидкая фармацевтическая композиция, включающая интерферон-бета (IFN-), где указанная препаративная форма представляет собой раствор, который включает буфер, аминокислоту, которая является лизином, и антиоксидант. 2. Композиция по п.1, где указанная композиция дополнительно включает поверхностно-активное вещество. 3. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный IFN- представляет собой человеческий рекомбинантный IFN-. 4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в количестве, достаточном для поддержания рН указанной композиции, в пределах плюс или минус 0,5 единиц определенного рН, где определенный рН составляет от 3,5 до 5,5. 5. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный рН составляет 4,70,2. 6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в концентрации от 5 до 500 мМ. 7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в концентрации 10 мМ. 8. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буфер представляет собой ацетатный буфер. 9. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная аминокислота выбрана из группы аминокислот с заряженной боковой цепью. 10. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный лизин присутствует в концентрации от 1 до 100 мг/мл. 11. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный лизин присутствует в концентрации 27,3 мг/мл. 12. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество выбрано из Tween, Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88 и Pluronic F68. 13. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой Pluronic F68. 14. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,01 до 10 мг/мл. 15. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации 0,5 мг/мл. 16. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный антиоксидант представляет собой метионин. 17. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный антиоксидант присутствует в концентрации от 0,01 до 5,0 мг/мл. 18. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный антиоксидант присутствует в- 18010979 концентрации 0,12 мг/мл. 19. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный интерферон присутствует в концентрации от 10 до 800 мкг/мл. 20. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный интерферон представляет собой рекомбинантный человеческий интерферон 1 а и присутствует в концентрации 22,44 или 88 мкг/мл. 21. Композиция по п.20, где указанный интерферон присутствует в концентрации 88 мкг/мл. 22. Композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающая бактериостатическое средство, выбранное из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта,алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и им подобных), бензалконийхлорида, бензетонийхлорида,дегидроацетата натрия и тимерозала. 23. Композиция по п.22, где бактериостатическое средство представляет собой бензиловый спирт. 24. Композиция по любому из предыдущих пунктов, состоящая из интерферона 1 а, бензилового спирта, лизина, метионина, Pluronic F-68 и водного ацетатного буфера. 25. Композиция по любому из предыдущих пунктов, в которой интерферон представлен по меньшей мере примерно на 96% или по меньшей мере примерно на 98% в качестве мономера. 26. Композиция по любому из пп.1-25, предназначенная для лечения рассеянного склероза. 27. Контейнер, герметично запаянный в стерильных условиях, соответствующих хранению перед применением, включающий жидкую фармацевтическую препаративную форму по любому из пп.1-25. 28. Контейнер по п.27, где указанный контейнер представляет собой предварительно заполненный шприц, флакон или автоинжектор. 29. Применение IFN- для изготовления лекарственного средства, включающего IFN-, буфер,аминокислоту, которая является лизином, и антиоксидант для лечения рассеянного склероза.