Стабилизированные жидкие композиции интерферона, не содержащие человеческий сывороточный альбумин

009995 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится в целом к фармацевтическим композициям, содержащим интерферон, более конкретно к стабилизированным препаратам интерферона-, не содержащим человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в качестве дополнительного фармацевтического эксципиента. Предпосылки создания изобретения Интерфероны (INF) представляют собой цитокины, т.е. растворимые белки, которые обеспечивают передачу информации между клетками и играют существенную роль в иммунной системе, способствуя разрушению микроорганизмов, вызывающих инфекцию, и восстанавливая любые вызванные этим повреждения. Интерфероны в естественных условиях секретируются инфицированными клетками и они впервые были идентифицированы в 1957 г. Их название произошло от того, что они оказывают влияние (интерферируют) на репликацию и продуцирование вирусов. Интерфероны обладают как антивирусной, так и антипролиферативной активностью. На основе их биохимических и иммунологических свойств встречающиеся в естественных условиях человеческие интерфероны подразделяют на три основных класса: интерферон- (лейкоцитарный),интерферон- (фибробластный),интерферон- (иммунная система).-интерферон в настоящее время утвержден в Соединенных Штатах и других странах в качестве средства лечения лейкемического ретикулза, остроконечных кондилом, саркомы Капоши (тип рака, как правило, поражающий пациентов, страдающих синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) и хроническим не-А- и не-В-гепатитом). Кроме того, интерфероны представляют собой гликопротеины, продуцируемые организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защищенных ими клетках. Поскольку они представляют собой низкомолекулярный белок, IFN характеризуются неспецифичностью действия,т.е. IFN, индуцируемый одним типом вируса, обладает эффективностью в отношении широкого спектра других вирусов. Однако они являются видоспецифичными, т.е. IFN, продуцируемый одним видом, может стимулировать антивирусную активность только в клетках тех же самых или близкородственных типов. IFN представляли собой первую группу цитокинов, которые нашли применение из-за присущей им противоопухолевой и антивирусной активности. Три основных класса IFN обозначают как IFN-, IFN- и IFN-. Первоначально эти основные классы IFN классифицировали согласно типам продуцирующих их клеток (лейкоцит, фибробласт или Т-клетка). Однако имеются данные о том, что одна клетка может продуцировать несколько типов IFN. Поэтому в настоящее время лейкоцитарный IFN называют IFN-, фибробластный IFN называют IFN- и Т-клеточный IFN называют IFN-. Существует также четвертый тип IFN, а именно лимфобластоидныйIFN, продуцируемый клетками линии "Namalwa" (выведенный из клеток лимфомы Беркитта), который,по-видимому, является смесью лейкоцитарного и фибробластного IFN. В качестве единицы интерферона или Международной единицы интерферона (Е или ME для международной меры) принято количество, необходимое для защиты 50% клеток от вирусного повреждения. В качестве метода анализа, пригодного для измерения биологической активности, можно применять описанный ниже метод анализа ингибирования цитопатического действия (Rubinstein и др., 1981;Familletti P.С. и др., 1981). Согласно этому методу анализа антивирусной активности интерферона количество интерферона, необходимое для оказания 50% цитопатического действия, составляет примерно 1 ед./мл. Единицы определяют в соответствии с Международным референс-стандартом для человеческого IFN- (Hu-IFN-), разработанным Национальным институтом здравоохранения (National Institutes ofHealth) (Pestka S., 1986). Каждый класс IFN состоит из нескольких различных типов. IFN- и IFN-, каждый, являются продуктом индивидуального гена. Белки, относящиеся к классу IFN-, представляют собой наиболее разнообразную группу, насчитывающую примерно 15 типов. Существует кластер генов IFN- на хромосоме 9, включающий по меньшей мере 23 представителя, из которых 15 обладают активностью и способностью к транскрипции. ЗрелыеIFN- являются негликозилированными. Все IFN- и IFN- имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) и обладают близкой биологической активностью. IFN- состоят из 146 аминокислот и обладают меньшим сходством с представителями - и -классов. Только IFN- могут активировать макрофаги или индуцировать созревание Т-клеток-киллеров. Эти новые типы терапевтических агентов иногда называют биологическими модификаторами (БМ), поскольку они оказывают влияние на ответную реакцию организма на опухоль, воздействуя на распознавание посредством иммуномодуляции. Человеческий фибробластный интерферон (IFN-) обладает антивирусной активностью и может также стимулировать действие естественных клеток-киллеров в отношении опухолевых клеток. Он представляет собой полипептид с молекулярной массой примерно 20000 Да, индуцируемый вирусами и двух-1 009995 цепочечными РНК. Из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированной с помощью метода рекомбинантной ДНК (Derynk и др., 1980), была выведена полная аминокислотная последовательность белка. Она состоит из 166 аминокислот.Shepard и др., 1981 описали мутацию на основании 842 (CysTyr в положении 141), которая устраняет антивирусную активность интерферона, и клон варианта с делецией нуклеотидов 1119-1121.Mark и др., 1984 создали искусственную мутацию путем замены основания 469 (Т) на (А), что привело к аминокислотной замене CysSer в положении 17. Было установлено, что образовавшийся IFNобладал такой же активностью, что и "нативный" IFN-, и сохранял стабильность при хранении в течение продолжительного периода времени (при -70 С).Rebif (рекомбинантный человеческий интерферон-, разработанный фирмой Serono) является последней разработкой в области терапии рассеянного склероза (PC), основанной на использовании интерферона, и он представляет собой интерферон (IFN)1a, полученный из линий клеток млекопитающих. Его рекомендованное Международное непатентованное название (INN) "Интерферон -1 а". Как и для всех фармацевтических лекарственных средств на основе белков, основным препятствием, которое необходимо преодолевать при применении IFN- в качестве терапевтического агента, является потеря фармацевтической пригодности вследствие его нестабильности в фармацевтических композициях. К обусловленным физическими факторами нестабильностям, влияющим на активность и эффективность полипептида в фармацевтических композициях, относятся денатурация и образование растворимых и нерастворимых агрегатов, тогда как к химическим нестабильностям относятся гидролиз, образование имидов, окисление, рацемизация и деаминирование. Известно, что некоторые из таких изменений приводят к потере или уменьшению фармацевтической активности представляющего интерес белка. В других случаях воздействия таких изменений точно неизвестны, однако образующиеся продукты разложения следует рассматривать как неприемлемые с фармацевтической точки зрения вследствие возможных нежелательных побочных действий. Стабилизация полипептидов в фармацевтических композициях остается областью, в которой главную роль играет метод проб и ошибок (см. обзор Wang, Int. J. Pharm., 185, 1999, p. 129-188; Wang и Hanson, J. Parenteral Sci. Tech., 42, 1988, S3-S26). К эксципиентам, которые добавляют к полипептидным фармацевтическим композициям для повышения их стабильности, относятся буферы, сахара, поверхностно-активные вещества, аминокислоты, полиэтиленгликоли и полимеры, однако стабилизирующие действия этих химических добавок варьируются в зависимости от белка. В современных композициях IFN- применяют ЧСА в качестве агента, повышающего растворимость IFN-. Однако использование ЧСА имеет некоторые недостатки. ЧСА представляет собой продукт, получаемый из человеческой крови, и поэтому его необходимо получать из организма человека. Хотя для снижения степени риска предпринимают определенные шаги, использование продуктов, полученных из человеческой крови, таких как ЧСА, сопряжено с возможным внесением человеческих вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирус гепатита C (ВГС). Таким образом, существует необходимость разработки дополнительных фармацевтических композиций IFN-, содержащих физиологически совместимые стабилизаторы, которые повышают растворимость этого белка и стабилизируют белок, предупреждая образование агрегатов, и тем самым повышают их фармацевтическую применимость. Описание изобретения В настоящем изобретении предложены стабилизированные фармацевтические композиции, содержащие интерферон (IFN), и способы их получения. Эти композиции получают без использования человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и поэтому они не содержат указанный фармацевтический эксципиент. Такие композиции в настоящем описании названы "не содержащими ЧСА" фармацевтическими композициями IFN, и они могут содержать интерферон (IFN) или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию или ее соль, где указанная композиция представляет собой раствор, содержащий буфер, поверхностно-активное вещество, агент для придания изотоничности и антиоксидант. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции содержат также бактериостатический агент. Подразумевается, что понятие "интерферон", или "IFN", в контексте настоящего описания относится к любой молекуле, обозначенной таким образом в литературе, в том числе к любому типу IFN, указанному выше в разделе "Предпосылки создания изобретения". В частности, под указанное выше определение подпадают IFN-, IFN- и IFN-. Предпочтительным IFN согласно настоящему изобретению является IFN-. IFN-, который можно применять согласно настоящему изобретению, поступает в продажу под товарными знаками Rebif (фирма Serono), Avonex (фирма Biogen) или Betaferon (фирмаSchering). Предпочтительно также применять согласно настоящему изобретению интерфероны человеческого происхождения. Подразумевается, что в контексте настоящего описания под понятие интерферон подпадают его изоформа, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активная фракция или-2 009995 соль. Подразумевается, что в контексте настоящего описания под понятие "интерферон- (IFN-)" подпадает фибробластный интерферон прежде всего человеческого происхождения, который получают путем выделения из биологических жидкостей или с помощью методов рекомбинантной ДНК из прокариотических или эукариотических клеток, а также его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и активные фрагменты. Подразумевается, что IFN- предпочтительно обозначает интерферон -1 а. В контексте настоящего описания понятие "мутеины" относится к аналогам IFN, в которых один или несколько аминокислотных остатков встречающегося в естественных условиях IFN заменены другими аминокислотными остатками или подвергнуты делеции, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к встречающейся в естественных условиях последовательности IFN без существенного изменения активности образовавшихся продуктов по сравнению с активностью IFN дикого типа. Такие мутеины получают с помощью известных методов синтеза и/или сайт-направленного мутагенеза или с помощью любого другого известного пригодного для данной цели метода. К предпочтительным мутеинам относятся, например мутеины, описанные у Shepard и др., 1981 или у Mark и др., 1984. Предпочтительно любой такой мутеин имеет аминокислотную последовательность, достаточно близкую к последовательности IFN для того, чтобы он обладал практически одинаковой или даже более высокой активностью по сравнению с IFN. Специалисту в данной области хорошо известна биологическая функция интерферона и соответствующие биологические стандарты утверждены и могут быть получены от Национального института по биологическим стандартам и контролю (National Institute for Biological Standards and Control) (http://immunology.org/links/NIBSC). В литературе описаны методы биологического анализа, позволяющие определять активность IFN. Анализ IFN можно осуществлять, например, согласно методу, описанному у Rubinstein и др., 1981. Таким образом, путем стандартных экспериментов можно определять, обладает ли рассматриваемый мутеин практически такой же или даже более высокой активностью, чем IFN. Мутеины IFN, которые можно применять согласно настоящему изобретению, или кодирующая их нуклеиновая кислота включают конечный набор практически совпадающих последовательностей, например несущие замены пептиды или полинуклеотиды, которые специалист в данной области может получать без излишних экспериментов, основываясь на указаниях и руководстве, представленных в настоящем описании. Предпочтительными заменами в мутеинах согласно настоящему изобретению являются замены, известные как "консервативные". Консервативные аминокислотные замены в полипептидах или белках,предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой замены аналогичных аминокислот внутри группы аминокислот, которые обладают достаточно близкими физико-химическими свойствами,так что при замене одних представителей группы другими сохраняется биологическая функция молекулы. Очевидно, что в вышеуказанных последовательностях можно осуществлять также инсерции и делеции аминокислот без изменения их функции, прежде всего в том случае, когда инсерции или делеции касаются лишь небольшого количества аминокислот, например менее 30 и предпочтительно менее 10, и при этом не происходит удаления или замены аминокислот, которые имеют решающее значение для функциональной конформации, например цистеиновых остатков. Белки и мутеины, получаемые в результате таких делеций и/или инсерций, подпадают под объем настоящего изобретения. Предпочтительно группы аналогичных аминокислот представляют собой группы, перечисленные в табл. I. Более предпочтительно группы аналогичных аминокислот представляют собой группы, перечисленные в табл. II; и наиболее предпочтительно группы аналогичных аминокислот представляют собой группы, перечисленные в табл. III.-3 009995 Таблица I Предпочтительные группы аналогичных аминокислот Таблица II Более предпочтительные группы аналогичных аминокислот-4 009995 Таблица III Наиболее предпочтительные группы аналогичных аминокислот Примерами методов получения аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для создания мутеинов IFN, которые можно применять согласно настоящему изобретению, могут служить любые стадии известного метода, такие как описанные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462(Mark и др.); 5116943 (Koths и др.), 4965195 (Namen и др.); 4879111 (Chong и др.) и 5017691 (Lee и др.); и метод получения белков, несущих замены на остатках лизина, представленный в патенте США 4904584(Shaw и др.). Конкретные мутеины IFN- описаны, например, у Mark и др., 1984. Понятие "слитый белок" относится к полипептиду, содержащему IFN, или его мутеину, слитому с другим белком, который, например, обладает более продолжительным временем жизни в общей воде организма. Следовательно, IFN можно сливать с другим белком, полипептидом и т.п., например иммуноглобулином или его фрагментом. Понятие "функциональные производные" в контексте настоящего описания относится к производным IFN и их мутеинам, а также слитым белкам, которые можно получать с помощью методов, известных в данной области, на основе функциональных групп, которые представляют собой боковые цепи на остатках или на N-, или С-концевых группах, и они подпадают под объем изобретения, если при этом остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. если они не нарушают активность белка, которая остается практически аналогичной активности IFN, и не придают токсические свойства содержащим их композициям. Такие производные могут включать, например, боковые полиэтиленгликольные цепи, которые могут маскировать антигенные сайты и увеличивать время жизни IFN в общей воде организма. К другим производным относятся алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные путем взаимодействия с аммиаком или первичными или вторичными аминами,N-ацильные производные свободных аминогрупп на аминокислотных остатках, образованные с ацильными группами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами) или О-ацильными производными свободных гидроксильных групп (например, серильных или треонильных остатков), образованными с ацильными группами. Понятие "активные фракции" IFN или мутеины и слитые белки в контексте настоящего описания относится к любой группе или предшественникам полипептидной цепи молекулы белка индивидуально или в сочетании со связанными с ней молекулами или остатками, например остатками сахара или фосфата, или к агрегатам самих молекул белка или остатков сахара при условии, что указанные фракции не приводят к существенному снижению активности по сравнению с соответствующим IFN.-5 009995 В контексте настоящего описания понятие "соли" относится как к солям, образованным с карбоксильными группами, так и к кислотно-аддитивным солям, образованным с аминогруппами указанных выше белков или их аналогов. Соли, образованные с карбоксильной группой, можно получить методами,известными в данной области, к которым относятся неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., и соли, образованные с органическими основаниями, например с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидином, прокаином и т.п. К кислотноаддитивным солям относятся, например, соли таких минеральных кислот, например, как соляная кислота или серная кислота, и соли органических кислот, таких, например, как уксусная кислота или щавелевая кислота. Очевидно, что любые такие соли должны сохранять биологическую активность белков (IFN),предлагаемых в настоящем изобретении, т.е. обладать способностью связываться с соответствующим рецептором и инициировать проведение сигнала рецептором. Согласно настоящему изобретению особенно предпочтительно применять также рекомбинантный человеческий IFN- и соединения, предлагаемые в изобретении. В настоящее время описан особый тип варианта интерферона. Так называемые "консенсусные интерфероны" представляют собой не встречающиеся в естественных условиях варианты IFN(US 6013253). Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения соединения, предлагаемые в изобретении, применяют в сочетании с консенсусным интерфероном. В контексте настоящего описания человеческий консенсусный интерферон (IFN-con) обозначает не встречающийся в естественных условиях полипептид, который содержит преимущественно аминокислотные остатки, являющие общими для поднабора IFN-, характерных для большинства встречающихся в естественных условиях последовательностей подтипа человеческого лейкоцитарного интерферона и включающими в одном или нескольких положениях, в которых нет аминокислот, общих для всех подтипов, аминокислоту, преимущественно встречающуюся в этом положении, и ни в коем случае не включают никаких аминокислотных остатков, которые не присутствуют в этом положении по меньшей мере в одном встречающемся в естественных условиях подтипе. К IFN-con относятся (но, не ограничиваясь ими) аминокислотные последовательности, обозначенные как IFN-con1, IFN-con2 и IFN-con3, которые описаны в US 4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие IFN-con, можно получать согласно методам, описанным в указанных выше патентах, или любыми другими стандартными методами. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения слитый протеин включает Ig-слияние. Слияние может быть непосредственным или через короткий линкерный пептид, состоящий из 1-3 или более аминокислотных остатков, например 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой, например, трипептид, имеющий последовательность E-F-M (Glu-Phe-Met) или состоящую из 13 аминокислот линкерную последовательностьGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, встроенную между последовательностью IFN и последовательностью иммуноглобулина. Образовавшийся слитый протеин может обладать улучшенными свойствами, такими как удлиненное время нахождения в общей воде организма (время полужизни),повышенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии или облегченная очистка слитого протеина. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения IFN сливают с константной областью молекулы Ig. Предпочтительно ее сливают с областями тяжелой цепи, такими, например, как СН 2- и СН 3-домены человеческого IgG1. Для создания слитых белков, предлагаемых в настоящем изобретении, можно применять также другие изоформы молекул Ig, такие изоформы, как IgG2, IgG3 илиIgG4, или другие типы Ig, такие, например, как IgM или IgA. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения функциональное производное содержит по меньшей мере один фрагмент, присоединенный к одной или нескольким функциональным группам, которые представляют собой одну или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно фрагмент представляет собой полиэтиленгликолевый (ПЭГ) фрагмент. ПЭГилирование можно осуществлять любыми известными методами, например такими, которые описаны вWO 99/55377. Вводимая индивидууму доза в виде однократной дозы или нескольких доз может варьироваться в зависимости от различных факторов, включая фармакокинетические характеристики, путь введения, состояние пациента и его особенности (пол, возраст, вес тела, состояние здоровья, размер), серьезность симптомов, применяемые одновременно методы лечения, частоту обработок и требуемое действие. Стандартные дозы человеческого IFN- составляют от 80000 до 200000 МЕ/кг в день или от 6 до 12 ММЕ (миллион международных единиц) на пациента в день или от 22 до 44 мкг на пациента. Согласно настоящему изобретению IFN предпочтительно можно вводить в дозе примерно от 1 до 50 мкг,более предпочтительно примерно от 10 до 30 мкг или примерно от 10 до 20 мкг на пациента в день. Введение действующих веществ согласно настоящему изобретению можно осуществлять внутривенным, внутримышечным или подкожным путем. Предпочтительным путем введения IFN являетсяIFN можно вводить ежедневно, или через день, или реже. Предпочтительно IFN вводят один, два или три раза в неделю. Предпочтительным путем введения является подкожное введение, которое можно осуществлять,например, три раза в неделю. Другим предпочтительным путем введения является внутримышечное введение, которое можно осуществлять, например, один раз в неделю. Предпочтительно подкожную инъекцию вводят три раза в неделю от 22 до 44 мкг или от 6 до 12 ММЕ IFN-.IFN- можно вводить подкожно через день в дозе от 25 до 30 мкг или от 8,0 до 9,6 ММЕ. Кроме того, можно вводить внутримышечно один раз в неделю 30 мкг или 6 ММЕ IFN-. Понятие "стабильность" относится к физической, химической и конформационной стабильности композиций интерферона, предлагаемых в настоящем изобретении (включая сохранение биологической активности). Нестабильность содержащих белок композиций может вызываться химическим разложением или агрегацией молекул белка с образованием высокомолекулярных полимеров, дегликозилированием, модификацией гликозилирования, окислением или любой другой структурной модификацией, которая приводит к снижению по меньшей мере одного вида биологической активности полипептида интерферона, предлагаемого в настоящем изобретении."Стабильный" раствор или композиция представляют собой раствор или композицию, в которых степень разложения, модификации, агрегации, потери биологической активности и т.п. белков сохраняется на приемлемом уровне и не становится с течением времени неприемлемой. Предпочтительно композиция сохраняет от 12 до 24 месяцев по меньшей мере или примерно 60%, более предпочтительно по меньшей мере или примерно 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере или примерно 80% заявленной активности интерферона. Стабилизированные не содержащие ЧСА композиции IFN, предлагаемые в изобретении, предпочтительно имеют срок хранения по меньшей мере примерно 6, 12, 18 месяцев,более предпочтительно по меньшей мере 20 месяцев, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 22 месяца, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 24 месяца при хранении при 2-8 С. В данной области техники известны методы определения стабильности не содержащих ЧСА фармацевтических композиций IFN, предлагаемых в изобретении, в том числе к ним относятся методы, указанные в примерах, приведенных в настоящем описании. Так, образование агрегатов IFN в процессе хранения жидкой фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, можно легко определять путем измерения изменения содержания растворимого IFN в растворе с течением времени. Содержание растворимого полипептида в растворе можно определять количественно с помощью многих методов аналитического анализа, пригодных для обнаружения IFN. К таким анализам относятся, например, жидкостная хроматография высокого разрешения с обращенной фазой ОФ-ЖХВР и абсорбционная УФ-спектроскопия, описание которых будет рассмотрено в приведенных ниже примерах. Определение как растворимых, так и нерастворимых агрегатов в жидких композициях в процессе хранения можно осуществлять, например, путем аналитического ультрацентрифугирования, как указано в приведенных ниже примерах, для оценки того, какая часть растворимого полипептида присутствует в виде растворимых агрегатов, и какая часть присутствует в не агрегированном состоянии, т.е. в биологически активной молекулярной форме. Подразумевается, что понятие "применение нескольких доз" относится к применению композиции интерферона, содержащейся в одном пузырьке, ампуле или картридже, более чем для одной инъекции,например для 2, 3, 4, 5, 6 или большего количества инъекций. Инъекции предпочтительно осуществляют в течение периода времени, составляющего по меньшей мере или приблизительно 12, 24, 48 ч и т.д.,предпочтительно в течение периода времени, равного или составляющего примерно 12 дней. Инъекции можно осуществлять с интервалом, составляющим, например, 6, 12, 24, 48 или 72 ч. Понятие "буфер" или "физиологически приемлемый буфер" относится к растворам соединений, в отношении которых известно, что они являются безопасными при применении в фармацевтических или ветеринарных композициях и которые обладают способностью поддерживать или контролировать значение pH композиции в диапазоне значений pH, требуемых для композиции. Приемлемыми буферами для контроля значений pH в диапазоне от умеренно кислых значений pH до умеренно основных значенийpH являются (но не ограничиваясь ими) такие соединения, как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, Трис и гистидин. "Трис" обозначает 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол и любую его фармакологически приемлемую соль. Предпочтительными буферами являются ацетатные буферы, содержащие физиологический раствор или приемлемую соль."Агент для придания изотоничности" представляет собой соединение, которое является физиологически переносимым и придает композиции требуемую тоничность для предупреждения чистого тока воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с композицией. Для этих целей, как правило, используют такие соединения, как глицерин, в известных концентрациях. Другие пригодные для при-7 009995 дания изотоничности агенты включают (но не ограничиваясь ими) аминокислоты или белки (например,глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, декстрозу, маннит, сахарозу и лактозу). Предпочтительным агентом для придания изотоничности является маннит. Понятие "антиоксидант" относится к соединению, которое препятствует взаимодействию кислорода или полученных из кислорода свободных радикалов с другими субстанциями. Антиоксиданты представляют собой одни из многочисленных эксципиентов, которые, как правило, добавляют в фармацевтические системы для повышения физической или химической стабильности. Антиоксиданты добавляют для того, чтобы минимизировать или замедлить процессы окисления при воздействии кислорода или в присутствии свободных радикалов. Эти процессы часто можно катализировать с помощью света, температуры, определенной концентрации водорода, присутствия редких металлов или пероксидов. В качестве антиоксидантов в лекарственных средствах часто применяют сульфиты, бисульфиты, тиомочевину, метионин, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), бутилированный гидрокситолуол (БГТ) и бутилированный гидроксианизол (БГА). Установлено, что натрий ЭДТК повышает активность антиоксидантов путем образования хелатных комплексов с ионами металла, которые в противном случае катализируют окислительную реакцию. Наиболее предпочтительным антиоксидантом является метионин. Понятие "бактериостатический" относится к соединению или композициям, которые добавляют к препарату для того, чтобы они действовали в качестве антибактериального агента. Пригодные для хранения содержащие интерферон композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, предпочтительно удовлетворяют установленным или регуляторным требованиям к эффективности консервации для поступающего в продажу жизнеспособного (содержащего живой организм) продукта, предназначенного для многократного использования. Примерами бактериостатических агентов являются фенол,метакрезол, паракрезол, ортокрезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-,пропил-, бутил- и т.п.), бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал. Предпочтительным бактериостатическим агентом является бензиловый спирт. Понятие "поверхностно-активное вещество" относится к растворимому соединению, которое снижает поверхностное натяжение жидкостей или снижает межфазное натяжение на границе раздела двух жидкостей или жидкости и твердого тела, где поверхностное натяжение представляет собой силу, действующую на поверхность жидкости, которая направлена на минимизацию площади поверхности. Поверхностно-активные вещества иногда применяют в фармацевтических композициях, включая композиции,предназначенные для доставки низкомолекулярных лекарственных средств и полипептидов, для модификации абсорбции лекарственного средства или его доставки к тканям-мишеням. Хорошо известными поверхностно-активными веществами являются полисорбаты (полиоксиэтиленовые производные; Твин),а также соединения из класса Pluronic. Было установлено, что согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения при приготовлении композиции, содержащей интерферон вместе с поверхностно-активным веществом, выбранным из Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88 и Pluronic F68, особенно предпочтительноPluronic F68 (фирма BASF, Pluronic F68 также известен под названием Poloxamer 188), получают стабильные композиции, позволяющие минимизировать потерю действующего вещества вследствие адсорбции на поверхности пузырька и/или устройства для введения (например, шприца, насоса, катетера и т.д.). Было установлено, что при приготовлении композиции, содержащей интерферон вместе с поверхностно-активным веществом, выбранным из Pluronic F77, Pluronic F87, Pluronic F88 и Pluronic F68,особенно предпочтительно Pluronic F68 (фирма BASF, Pluronic F68 также известен под названиемPoloxamer 188) получают стабильную композицию, которая обладает большей устойчивостью к окислению и образованию агрегатов белков. Поверхностно-активные вещества, относящиеся к группе Pluronic, представляют собой блоксополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО). Пропиленоксидный блок (ПО) расположен в виде сэндвича между двумя этиленоксидными (ЭО) блоками Поверхностно-активные вещества, относящиеся к группе Pluronic, синтезируют с помощью двухстадийного процесса: 1. Создают гидрофобное вещество требуемой молекулярной массы путем контролируемого добавления пропиленоксида к двум гидроксильным группам пропиленгликоля. 2. Добавляют этиленоксид в сэндвич гидрофобных веществ между гидрофильными группами. В Pluronic F77 процент полиоксиэтиленовых (гидрофильных) групп составляет 70%, а молекулярная масса гидрофобных (полиоксипропиленовых) групп составляет примерно 2306 Да. В Pluronic F87 процент полиоксиэтиленовых (гидрофильных) групп составляет 70%, а молекулярная масса гидрофобных (полиоксипропиленовых) групп составляет примерно 2644 Да. В Pluronic F88 процент полиоксиэтиленовых (гидрофильных) групп составляет 80%, а молекуляр-8 009995 ная масса гидрофобных (полиоксипропиленовых) групп составляет примерно 2644 Да. В Pluronic F68 процент полиоксиэтиленовых (гидрофильных) групп составляет 80%, а молекулярная масса гидрофобных (полиоксипропиленовых) групп составляет примерно 1967 Да. Ниже приведены типичные свойства Pluronic F77. Средняя молекулярная масса: 6600. Температура плавления/точка текучести: 48 С. Физическая форма при 20 С: твердое вещество. Вязкость (по Брукфилду), сП: 480 [жидкость при 25 С, пастообразное вещество при 60 С и твердые частицы при 77 С]. Поверхностное натяжение при 25 С, дин/см: концентрация 0,1%: 47,0; концентрация 0,01%: 49,3; концентрация 0,001%: 52,8. Межфазное натяжение при 25 С по методу Nujol, дин/см: концентрация 0,1%: 17,7; концентрация 0,01%: 20,8; концентрация 0,01%: 25,5. Смачивание по методу Draves при 25 С, с: концентрация 1,0%: 360; концентрация 0,1%: 360. Высота пены, мм: по методу Ross Miles, 0,1% при 50 С: 100; по методу Ross Miles, 0,1% при 26 С: 47; динамическая, 0,1% при скорости 400 мл/мин: 600. Температура помутнения в водном растворе, С: концентрация 1%: 100; концентрация 10%: 100. ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс): 25. Ниже приведены типичные свойства Pluronic F87. Средняя молекулярная масса: 7700. Температура плавления/точка текучести: 49 С. Физическая форма при 20 С: твердое вещество. Вязкость (по Брукфилду), сП: 700 [жидкость при 25 С, пастообразное вещество при 60 С и твердые частицы при 77 С]. Поверхностное натяжение при 25 С, дин/см: концентрация 0,1%: 44,0; концентрация 0,01%: 47,0; концентрация 0,001%: 50,2. Межфазное натяжение при 25 С по методу Nujol, дин/см: концентрация 0,1%: 17,4; концентрация 0,01%: 20,3; концентрация 0,01%: 23,3. Смачивание по методу Draves при 25 С, с: концентрация 1,0%: 360; концентрация 0,1%: 360. Высота пены, мм: по методу Ross Miles, 0,1% при 50 С: 80; по методу Ross Miles, 0,1 % при 26 С: 37; динамическая, 0,1% при скорости 400 мл/мин: 600. Температура помутнения в водном растворе, С: концентрация 1%: 100; концентрация 10%: 100. ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс): 24. Ниже приведены типичные свойства Pluronic F88. Средняя молекулярная масса: 11400. Температура плавления/точка текучести: 54 С. Физическая форма при 20 С: твердое вещество. Вязкость (по Брукфилду), сП: 2300 [жидкость при 25 С, пастообразное вещество при 60 С и твердые частицы при 77 С]. Поверхностное натяжение при 25 С, дин/см: концентрация 0,1%: 20,5; концентрация 0,01%: 23,3;-9 009995 концентрация 0,001%: 55,7. Межфазное натяжение при 25 С по методу Nujol, дин/см: концентрация 0,1%: 20,5; концентрация 0,01%: 23,3; концентрация 0,01%: 27,0. Смачивание по методу Draves при 25 С, с: концентрация 1,0%: 360; концентрация 0,1%: 360. Высота пены, мм: по методу Ross Miles, 0,1% при 50 С: 80; по методу Ross Miles, 0,1% при 26 С: 37; динамическая, 0,1% при скорости 400 мл/мин: 600. Температура помутнения в водном растворе, С: концентрация 1%: 100; концентрация 10%: 100. ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс): 28 Ниже приведены типичные свойства Pluronic F68. Средняя молекулярная масса: 8400. Температура плавления/точка текучести: 52 С. Физическая форма при 20 С: твердое вещество. Вязкость (по Брукфилду), сП: 1000 [жидкость при 25 С, пастообразное вещество при 60 С и твердые частицы при 77 С]. Поверхностное натяжение при 25 С, дин/см: концентрация 0,1%: 50,3; концентрация 0,01%: 51,2; концентрация 0,001%: 53,6. Межфазное натяжение при 25 С по методу Nujol, дин/см: концентрация 0,1%: 19,8; концентрация 0,01%: 24,0; концентрация 0,01%: 26,0. Смачивание по методу Draves при 25 С, с: концентрация 1,0%: 360; концентрация 0,1%: 360. Высота пены, мм: по методу Ross Miles, 0,1% при 50 С: 35; по методу Ross Miles, 0,1% при 26 С: 40; динамическая, 0,1% при скорости 400 мл/мин: 600. Температура помутнения в водном растворе, С: концентрация 1%: 100; концентрация 10%: 100. ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс): 29. В композициях, предлагаемых в изобретении, можно использовать также другие полимеры, которые имеют свойства, аналогичные перечисленным выше. Предпочтительным поверхностно-активным веществом является Pluronic F68 и поверхностно-активные вещества с аналогичными свойствами.Pluronic, прежде всего Pluronic F68, предпочтительно присутствует в композиции в концентрации,которая является достаточной для поддержания стабильности интерферона в течение требуемого периода хранения (например, от 6 до 12 или до 24 месяцев), а также в концентрации, которая является достаточной для предупреждения потери белков из-за адсорбции на поверхностях, таких как пузырек, ампула,или картридж, или шприц. Предпочтительно концентрация Pluronic, прежде всего Pluronic F68, в жидких композициях имеет величину от равной или составляющей примерно 0,01 до равной или составляющей примерно 10 мг/мл,более предпочтительно от равной или составляющей примерно 0,05 до равной или составляющей примерно 5 мг/мл, еще более предпочтительно от равной или составляющей примерно 0,1 до равной или составляющей примерно 2 мг/мл, наиболее предпочтительно она равна или составляет примерно 1 мг/мл. Предпочтительно концентрация IFN- в композиции имеет величину от равной или составляющей примерно 10 до равной или составляющей примерно 800 мкг/мл, более предпочтительно от равной или составляющей примерно 20 до равной или составляющей примерно 500 мкг/мл, еще более предпочтительно от равной или составляющей примерно 30 до равной или составляющей примерно 300 мкг/мл,наиболее предпочтительно она равна или составляет примерно 22, 44, 88 или 264 мкг/мл. Предпочтительно pH композиций ФСГ, предлагаемых в настоящем изобретении, имеет значение от равного или составляющего примерно 3,0 до равного или составляющего примерно 5,0, более предпочтительно значение, равное или составляющее примерно 3,7 или 4,7. Предпочтительным буфером являет- 10009995 ся ацетатный буфер, в котором предпочтительные противоионы представляют собой ионы натрия или калия. Забуференные ацетатом физиологические растворы хорошо известны в данной области. Концентрации буферов в общем растворе могут варьироваться и быть равными или составлять примерно 5, 9,5, 10, 50, 100, 150, 200, 250 и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера равна или составляет примерно 10 мМ. Наиболее предпочтительным является буфер с концентрацией ацетатных ионов 10 мМ,имеющий значение pH 3,50,2 или 4,50,2. Предпочтительно в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, антиоксидант, например метионин, присутствует в концентрации от равной или составляющей примерно 0,01 до равной или составляющей примерно 5 мг/мл, более предпочтительно от равной или составляющей примерно 0,05 до равной или составляющей примерно 0,3 мг/мл, наиболее предпочтительно равной или составляющей примерно 0,1 мг/мл. Предпочтительно концентрация агента для придания изотоничности (например, маннита) в жидких композициях составляет от равной или составляющей примерно 0,5 до равной или составляющей примерно 500 мг/мл, более предпочтительно от равной или составляющей примерно 1 до равной или составляющей примерно 250 мг/мл, еще более предпочтительно от равной или составляющей примерно 10 до равной или составляющей примерно 100 мг/мл, наиболее предпочтительно она равна или составляет примерно 55 мг/мл. Изобретение относится также к жидким композициям. Предпочтительным растворителем является вода для инъекций. Жидкие композиции могут находиться в форме однократной дозы или нескольких доз. Жидкие композиции интерферона, предлагаемые в изобретении, которые предназначены для применения в форме нескольких доз, предпочтительно содержат бактериостатический агент, такой как фенол, метакрезол,паракрезол, ортокрезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и т.п.), бензалконийхлорид, бензетонийхлорид, дегидроацетат натрия и тримеросал. Особенно предпочтительными являются фенол, бензиловый спирт и метакрезол, более предпочтительными является бензиловый спирт. Бактериостатический агент применяют в количестве, обеспечивающем концентрацию, которая является эффективной для поддержания композиции в практически не содержащем бактерии состоянии (пригодном для инъекции) в течение периода времени, когда для инъекции применяют состоящую из нескольких доз композицию, который может быть равен или составлять от примерно 12 или 24 ч до равного или составляющего примерно 12 дней, предпочтительно от равного или составляющего примерно 6 до равного или составляющего примерно 12 дней. Бактериостатический агент предпочтительно присутствует в концентрации от равной или составляющей примерно 0,1% (масса бактериостатического агента/масса растворителя) до равной или составляющей примерно 2,0%, более предпочтительно от равной или составляющей примерно 0,2% до равной или составляющей примерно 1,0%. В случае бензилового спирта наиболее предпочтительными являются концентрации 0,2 или 0,3%. При этом применение консерванта, например бензилового спирта, не ограничено только композициями в форме нескольких доз, его можно добавлять также к композиции в форме однократной дозы. Интерферон в композициях, предлагаемых в изобретении, присутствует в таких количествах, при которых после восстановления его концентрации составляют от примерно 1 мкг/мл до примерно 50 мг/мл, хотя возможно применение более низких и более высоких концентраций, и это зависит от предполагаемого устройства для введения, например методы введения композиций в виде раствора могут отличаться от методов введения, основанных на использовании трансдермальной бляшки, легочного,трансмукозального пути введения или введения с помощью осмотического насоса или микронасоса. Концентрация интерферона предпочтительно имеет величину от равной или составляющей примерно 5 мкг/мл до равной или составляющей примерно 2 мг/мл, более предпочтительно от равной или составляющей примерно 10 мкг/мл до равной или составляющей примерно 1 мг/мл, наиболее предпочтительно от равной или составляющей примерно 30 до равной или составляющей примерно 100 мкг/мл. Предпочтительно в композициях, предлагаемых в изобретении, сохраняется в течение 24 месяцев по меньшей мере или примерно 60%, более предпочтительно по меньшей мере или примерно 70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере или примерно 80% активности интерферона от активности в момент упаковки. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения предложен способ приготовления описанной выше жидкой фармацевтической композиции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предложен способ приготовления упакованной фармацевтической композиции, заключающийся в том, что в упаковку вносят раствор,содержащий действующее вещество и описанные выше эксципиенты. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения предложено изделие для применения в фармацевтических целях для человека, представляющее собой пузырек, содержащий описанные выше фармацевтические композиции и письменную информацию о том, что раствор можно хранить после первого применения в течение периода времени, равного или составляющего примерно 24 ч или более. Предпочтительно в письменной информации указано, что раствор можно хранить в течение периода времени, равного или составляющего примерно 12 дней.- 11009995 После первого применения композицию в форме нескольких доз можно хранить и применять в течение периода времени, равного или составляющего примерно 24 ч, предпочтительно в течение периода времени, равного или составляющего примерно 4, 5 или 6 дней, более предпочтительно вплоть до 12 дней. После первого применения композицию предпочтительно хранят при температуре ниже комнатной(т.е. ниже или составляющей примерно 25 С), более предпочтительно ниже или составляющей примерно 10 С, еще более предпочтительно ниже или составляющей примерно 2-8 С, наиболее предпочтительно при температуре, равной или составляющей примерно 4-6 С. Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать методом, который заключается в том, что к забуференному раствору добавляют рассчитанные количества эксципиентов и затем добавляют интерферон. Затем образовавшийся раствор вносят в пузырьки, ампулы или картриджи. Специалисту в данной области должны быть очевидны варианты указанного метода. Факторами, которые можно оптимизировать для обеспечения требуемой концентрации и путей введения, являются, например, порядок добавления компонентов, применение дополнительных вспомогательных веществ, если это требуется, температура и значение pH, при которых приготавливают композицию. В случае композиции в форме нескольких доз к раствору, содержащему действующее вещество (интерферон), можно добавлять бактериостатический агент или в альтернативном варианте его можно хранить в отдельном пузырьке или картридже и затем в момент применения смешивать с раствором, содержащим действующее вещество. Композиции, предлагаемые в изобретении, можно вводить с помощью известных устройств. Примеры систем на основе одного пузырька включают автоматические инжекторные или ручные инжекторные устройства для введения растворов, такие как Rebiject. Заявляемые продукты включают упаковочный материал. На упаковочном материале находится помимо информации, требуемой регулирующими органами, информация об условиях, при которых продукт можно применять. Упаковочный материал, предлагаемый в настоящем изобретении, включает инструкции для пациентов о том, как при необходимости приготавливать конечный раствор, и о том, как применять такой конечный раствор в течение 24 ч или более, в случае содержащегося в двух пузырьках влажного/сухого продукта. Для продукта, представляющего собой один пузырек с раствором, этикетка содержит информацию о том, что такой раствор можно хранить после первого применения в течение 24 ч или более. Заявляемые продукты можно применять в качестве фармацевтического продукта для человека. Стабильные пригодные для хранения композиции могут поступать к пациентам в виде прозрачных растворов. Раствор может быть предназначен для однократного применения или для повторного многоразового применения, а также для одного или нескольких циклов лечения пациента, что является более удобной схемой применения по сравнению с существующими в настоящее время. Интерферон в любых стабильных или пригодных для хранения композициях или растворах, представленных в настоящем описании, можно вводить пациенту согласно настоящему изобретению с помощью различных методов введения, включая SC- или IM-инъекцию; трансдермально, легочно, трансмукозально, путем имплантации, с помощью осмотического насоса, картриджа, микронасоса, орально или с использованием других хорошо известных в данной области путей введения, выбранных лечащим врачом. Понятие "пузырек" относится в широком смысле к резервуару, пригодному для сохранения интерферона в твердой или жидкой форме в герметичном стерильном состоянии. Примерами пузырька, который можно применять согласно изобретению, являются ампулы, картриджи, блистерные упаковки или другие аналогичные резервуары, которые можно применять для введения интерферона пациенту с помощью шприца, насоса (в том числе осмотического), катетера, трансдермальной бляшки, легочного или трансмукозального спрея. Пузырьки, пригодные для упаковки продуктов, предназначенных для парентерального, легочного, трансмукозального или трансдермального введения, хорошо известны и применяются в данной области. Понятие "лечение" в контексте настоящего изобретения относится к любому благоприятному действию на развитие заболевания, включая ослабление, редукцию, снижение или уменьшение патологического развития после возникновения заболевания. Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, которые содержат IFN или изоформу,мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, можно применять для установления диагноза, предупреждения и лечения (местного или системного) клинических показаний, поддающихся лечению с помощью указанного полипептида. К таким клиническим показаниям относятся, например нарушения или заболевания центральной нервной системы (ЦНС), головного мозга и/или спинного мозга,включая рассеянный склероз; аутоиммунные заболевания, в том числе ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона; и различные типы рака, включая рак молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки и ободочной кишки. Все процитированные в настоящем описании ссылки, в том числе журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патент США или иностранные заявки на патент,опубликованные в США или в иностранных патентах, или любые другие ссылки полностью включены в- 12009995 настоящее описание в качестве ссылки, включая все данные, таблицы, чертежи и текст, приведенные в процитированных ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, процитированных в ссылках, процитированных в настоящем описании, также полностью включено в описание в качестве ссылки. Ссылки на стадии известного метода, стадии стандартных методов, известные методы или стандартные методы никоим образом не свидетельствуют о том, что какой-либо предмет, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описан, изложен или подразумевается в соответствующем прототипе. Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления изобретения должно отображать общую сущность изобретения в такой полноте, что другие специалисты в данной области на основе своих знаний (включая содержание процитированных в настоящем описании ссылок), не осуществляя излишних экспериментов, легко могут модифицировать и/или адаптировать такие конкретные варианты осуществления для различных приложений без отклонения от общей концепции настоящего изобретения. Таким образом, подразумевается, что такие адаптации и модификации считаются эквивалентами представленных в описании вариантов осуществления изобретения с учетом доктрины и руководства,представленных в описании. Следует иметь в виду, что использованная в описании фразеология или терминология применяется только для целей описания, а не для ограничения, так что специалисту в данной области следует интерпретировать терминологию или фразеологию настоящего описания в свете доктрины и руководства, представленных в описании, и с учетом знаний специалиста в данной области. Описание чертежей На чертежах показано: фиг. 1 - процентное содержание окисленных форм, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, имеющих различные концентрации бензилового спирта, после хранения при 40 С; фиг. 2 - процентное содержание окисленных форм, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, имеющих различные концентрации бензилового спирта, после хранения при 25 С; фиг. 3 - процентное содержание окисленных форм, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, имеющих различные концентрации бензилового спирта, после хранения при 2-8 С; фиг. 4 - процентное содержание всех агрегатов, которые присутствуют в композициях интерферона-1 а в форме нескольких доз, имеющих различные концентрации бензилового спирта, после хранения при 40 С; фиг. 5 - процентное содержание всех агрегатов, которые присутствуют в композициях интерферона-1 а в форме нескольких доз, имеющих различные концентрации бензилового спирта, после хранения при 25 С; фиг. 6 - процентное содержание всех агрегатов, которые присутствуют в композициях интерферона-1 а в форме нескольких доз, имеющих различные концентрации бензилового спирта, после хранения при 2-8 С; фиг. 7 - процентное содержание окисленных форм, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, содержащих альтернативные бактериостатические агенты, после хранения при 25 С; фиг. 8 - процентное содержание окисленных форм, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, содержащих альтернативные бактериостатические агенты, после хранения при 2-8 С; фиг. 9 - процентное содержание всех агрегатов, которые присутствуют в композициях интерферона-1 а в форме нескольких доз, содержащих альтернативные бактериостатические агенты; фиг. 10 - процентное содержание окисленных форм, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, содержащих ЭДТК, после хранения при 25 С; фиг. 11 - процентное содержание всех агрегатов, которые присутствуют в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз, содержащих ЭДТК, после хранения при 25 С; фиг. 12 - эффективность 0,012% L-метионина в качестве антиоксиданта (при 2-8 С); фиг. 13 - эффективность 0,012% L-метионина в качестве антиоксиданта (при 252 С). Примеры Пример 1. Жидкая не содержащая ЧСА композиция интерферона -1 а в форме одной дозы, находящаяся в предварительно заполненных шприцах. 1.1. Предварительные опыты по оценке совместимости. Для проверки защитного действия, оказываемого некоторыми эксципиентами, такими как антиоксидант и поверхностно-активные вещества, проводили предварительные эксперименты, поскольку ожидалось, что исключение человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) из рассматриваемого продукта может оказывать влияние на продукт с точки зрения окисления, образования агрегатов и адсорбции к поверхностям.- 13009995 Приготавливали композиции интерферона -1 а с концентрацией 44 и 88 мкг/мл в натрий-ацетатном буфере, содержащем 54,6 мг/мл маннита в сочетании с несколькими эксципиентами, такими как 0,4% ЧСА, 0,012% L-метионин, Твин 20 (0,005, 0,007, 0,01%), Poloxamer 188 (0,05, 0,1, 0,5%). Различные комбинации подвергали воздействию стрессовых условий (либо хранение при 40 С, либо перемешивание) и тестировали в отношении окисления (с помощью ОФ-ЖХВР) и агрегации (с помощью ГФ (гельфильтрация)-ЖХВР). В табл. DEP-1 и -2 обобщены данные об уровнях окисления и агрегации после хранения в течение 2 недель при 40 С. Комбинация интерферона -1 а с обоими тестируемыми поверхностно-активными веществами (Твин 20 и Poloxamer 188) приводила к повышению уровня окисления, который для каждого типа поверхностно-активного вещества зависел от концентрации (табл. DEP-1, комбинации 4-6 и 7-9); при процентном содержании Poloxamer 188 (также обозначаемый как плуроник F-68, или F-68),составляющем 0,5%, происходило полное разложение лекарственной субстанции (табл. DEP-1,9). При использовании Твин 20 была выявлена более высокая скорость разложения, которая, по-видимому,обусловлена наличием окислителей (например, пероксидов), которые могут присутствовать в остаточных количествах после синтеза. Оба поверхностно-активные вещества в различных тестированных концентрациях не оказывали влияния на уровень агрегации при хранении при 40 С (табл. DEP-2). Таблица DEP-1 Содержание окисленных форм (%) по данным ОФ-ЖХВР после хранения при 40 С н.и. - не измеряли, поскольку происходило полное разложение. Таблица DEP-2 Общее содержание агрегатов (%) по данным ГФ-ЖХВР после хранения при 40 С В табл. DEP-3 показано, что оба поверхностно-активные вещества, Твин 20 и Poloxamer 188 (F-68),применяемые в их критической концентрации мицелл (ККМ), способствуют предупреждению агрегации,индуцируемой перемешиванием в течение 5 мин.- 14009995 Таблица DEP-3 Общее содержание агрегатов (%) по данным ГФ-ЖХВР после перемешивания в течение 5 мин 1.1.1. Физико-химические характеристики. Известно, что физико-химическими характеристиками, которые имеют решающее значение для качества продукта, представляющего собой лекарственное средство, являются содержание продуктов окисления и димеров/агрегатов. Эти характеристики изучали в опытах по оценке совместимости, результаты которых обобщены выше. 1.2. Эксципиенты. 1.2.1. 10 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 3,5. 10 мМ натрий-ацетатный буфер с pH 3,5, содержащий 54,6 мг/мл маннита в качестве агента для придания изотоничности, стабилизирует продукт, как это было показано в процессе предыдущей разработки поступающего в настоящее время продукта (Rebif) и как это описано в ЕР 759775. 1.2.1. Poloxamer 188.Poloxamer 188 (или Pluronic F-68) включали в композицию в количестве 0,1% (критическая концентрация мицелл) для предупреждения адсорбции лекарственной субстанции на поверхности контейнера в процессе производства; более высокие концентрации могут оказывать отрицательное воздействие на стабильность продукта (повышенная степень окисления); более низкие концентрации могут быть менее эффективными с точки зрения ограничения адсорбции. Эффективность применения Poloxamer 188 для предупреждения адсорбции лекарственной субстанции на поверхности в процессе производства была продемонстрирована в следующем опыте. Растворы, содержащие 44 мкг/мл интерферона -1 а, объединяли с растворами, содержащими 3 различные концентрации поверхностно-активного вещества (Твин 20 или Poloxamer 188) или ЧСА, имитируя процесс производства; на различных стадиях отбирали образцы (смешивание, асептическая фильтрация, заполнение) и тестировали с помощью количественного метода ОФ-ЖХВР. Отбирали следующие образцы: до фильтрации (ДФ); после 1-й фильтрации (ПФ 1); после 2-й фильтрации (ПФ 2); после заполнения (конечный продукт при Т=0). Результаты обобщены в табл. DEP-4 и выражены в виде процента выхода (%) по отношению к исходному значению (т.е. в смешанном растворе перед фильтрацией): Poloxamer 188 является более эффективным, чем Твин 20, но менее эффективным по сравнению с ЧСА в отношении предупреждения адсорбции лекарственной субстанции в процессе приготовления. Таблица DEP-4 Выход интерферона -1 а (%) в процессе приготовления Проводили исследование различных степеней очистки Poloxamer 188, полученного от различных поставщиков, с точки зрения содержания продуктов окисления после ускоренного хранения условиях(2 недели при 40 С) для оценки необходимого для применения качества: был выбран Poloxamer 188 от фирмы BASF вследствие более низкого уровня окисления и того, что он поступает в продажу в виде фармацевтически чистого продукта. Результаты обобщены в табл. DEP-5.- 15009995 Таблица DEP-5 Содержание окисленных форм (%), выявленных в композициях, содержащих 0,1% Poloxamer 188 (различные степени чистоты и поставщики)L-метионин (L-Met) включают в состав композиции в концентрации порядка 0,012% для ограничения окисления. Эффективность указанной концентрации продемонстрирована путем сравнения с композицией, не содержащей L-метионин; более высокие концентрации (0,05, 0,1%) L-метионина оказывают близкое влияние на стабильность. Содержание продуктов окисления, обнаруженных после хранения при 40 С, представлено в табл. DEP-6. Таблица DEP-6 Содержание окисленных форм (%) композиций интерферона -1 а,содержащих различные концентрации L-метионина (L-Met) В процессе разработки композиции эффективность L-метионина в качестве антиоксиданта была подтверждена результатами исследования стабильности в течение 3 месяцев при хранении при 2-8 С и 252 С, полученными для композиций, содержащих L-метионин в сочетании с поверхностно-активными веществами: L-метионин обладает эффективностью в качестве антиоксиданта в концентрации 0,012% и может обеспечивать стабильность, сопоставимую со стабильностью поступающего в продажу продукта(см. фиг. 12 и 13). 1.3. Продукт, представляющий собой лекарственное средство. 1.3.1. Разработка композиции. Разработка новой композиции интерферона -1 а, не содержащей ЧСА, была предпринята с целью подтверждения результатов предварительных исследований (эффективности L-метионина в качестве антиоксиданта, включения Poloxamer 188 для предотвращения потерь в процессе производства) применительно к конечному продукту, содержащемуся в контейнере. Получали растворы интерферона -la с концентрацией 44 и 88 мкг/мл, содержащие 54,6 мг/мл маннита в 10 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 3,5, и добавляли следующие эксципиенты: Твин 20 (0,003, 0,007, 0,02%);L-метионин (0, 0,012%); ЧСА (0,4%, поступающая в продажу композиция, обозначенная как "ref"). Составы изученных композиций приведены в табл. DEP-7. Таблица DEP-7 Составы композиций, содержащих интерферон -1 а- 16009995 Композиции приготавливали согласно описанной ниже процедуре. Приготавливали по 90 мл каждой композиции в асептических условиях путем смешения требуемого количества эксципиентов, растворенных в воде для инъекции (WFI), с лекарственной субстанцией(интерферон -1 а); затем композиции фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мкм (фильтрацию осуществляли дважды через два мембранных фильтра) и по 0,5 мл каждого раствора вносили в стеклянные шприцы типа Hypak объемом 1 мл. Размер партии составлял примерно 180 шприцев. Затем композиции помещали на хранение при 2-8 С, 252 С и 402 С и тестировали в отношении стабильности в течение периода времени вплоть до 12 недель (вплоть до 6 недель для образцов, хранившихся при 402 С). В процессе разработки применяли следующие аналитические тесты и методы (более подробно эти методы анализа описаны в примере 2): анализ биологической активности (биологический анализ цитопатогенного действия (ЦПД; анализ (метод ОФ-ЖХВР); анализ продуктов окисления (метод ОФ-ЖХВР); анализ димеров/агрегатов (метод ГФ-ЖХВР и ДСН-ПААГ); определение значения pH (потенциометрический метод); измерение осмотического давления (измерение криоскопическим методом). Результаты и их оценка обобщены в табл. DEP-8-DEP-17. Таблица DEP-8 Биологическая идентичность (ММЕ/мл) Наклоны, рассчитанные методом линейной регрессии и обобщенные в табл. DEP-9, свидетельствуют о снижении биологической активности всех композиций, содержащих Твин 20 ( 1, 2, 3, 9), при хранении при 40 С; снижение биологической активности происходило также у композиций 3 и 6 (наибольшая концентрация поверхностно-активных веществ) после хранения при 25 и 2-8 С.- 17009995 Таблица DEP-9 Анализ методом линейной регрессии биологической идентичности (наклоны выражены в виде ММЕ/млнеделю) Наклоны, рассчитанные методом линейной регрессии и обобщенные в табл. DEP-11, свидетельствуют о более высокой потере содержания белка в композициях, содержащих Твин 20 ( 1, 2, 3, 9), которые хранили при 40 С; такая же тенденция обнаружена при 25 С, а также для композиций 5 и 6. Выявлено существенное снижение содержания белка при хранении при 2-8 С для композиций 1, 2, 3 (содержащих Твин 20), 4, 5 (содержащих Poloxamer 188) и 9 (содержащей Твин 20 и L-метионин). Таблица DEP-11 Анализ методом линейной регрессии (наклоны выражены в мкг/шприцнеделю) Наклоны, рассчитанные методом линейной регрессии и обобщенные в табл. DEP-13, свидетельствуют о том, что композиции, содержащие Твин 20, характеризуются более высокой скоростью окисления по сравнению с композициями, содержащими Poloxamer 188, и что степень окисления зависит от концентрации Твин 20. Путем сравнения композиции 9 (Твин 20+L-метионин) с композицией 3 (Твин 20) и композиции 10 (Poloxamer 188+L-метионин) с композицией 6 (Poloxamer 188) продемонстрирована эффективность L-метионина в отношении ограничения окисления при различных тестированных температурах. Таблица DEP-13 Анализ методом линейной регрессии содержания окисленных форм(наклоны выражены в виде процентного содержания окисленных форм/неделю)- 19009995 Таблица DEP-14 Общее содержание агрегатов по данным ГФ-ЖХВР или ДСН-ПААГ (%) Наклоны, рассчитанные методом линейной регрессии и обобщенные в табл. DEP-15, свидетельствуют о том, что не происходит никакого существенного увеличения общего содержания агрегатов при хранении при различных температурах. Таблица DEP-15 Анализ методом линейной регрессии общего содержания агрегатов(наклоны выражены в виде общего содержания (%) окисленных форм/неделю) При хранении не было обнаружено никакого изменения значения pH. Таблица DEP-17 Осмотическое давление (ОСМ/кг)- 21009995 Осмотическое давление тестируемых композиций соответствует требуемому. На основе результатов, полученных при разработке композиции, была выбрана следующая не содержащая ЧСА композиция: 44 или 88 мкг/мл интерферона -1 а в натрий-ацетатном буфере с pH 3,5, содержащая 54,6 мг/мл маннита; 1 мг/мл Poloxamer 188; 0,12 мг/мл L-метионина. 1.3.2. Продукты с просроченным сроком годности. Продукты с просроченным сроком годности не применяли. 1.3.3. Физико-химические и биологические свойства. Эти характеристики были изучены в процессе указанной выше разработки композиции. 1.4. Разработка процесса приготовления. 1.4.1. Разработка процесса приготовления. Применяемый в настоящее время процесс производства был адаптирован для приготовления опытных партий новой композиции: лекарственную субстанцию смешивали непосредственно с ингредиентами; затем осуществляли двойную фильтрацию для имитации процесса промышленного производства,который предусматривает проведение асептической фильтрации с последующей осуществляемой в процессе приготовления (in-line) фильтрацией перед заполнением шприца. После этого шприцы заполняли вручную конечным стерильным раствором. Как стадии фильтрации, так и заполнение шприца осуществляли в условиях ламинарного потока. Ниже приведено описание каждой стадии процесса. 1.4.2. Предварительные расчеты. Количество лекарственной субстанции, представляющей собой интерферон -1a, D (мг), требуемое для получения раствора с концентрацией 44 мкг/мл:D (мг)=44 мкг/мл 90 мл=3960 мкг=3,96 мг. Объем лекарственной субстанции, представляющей собой интерферон -1a В (мл), соответствующей количеству D (мг): В (мл)=3,96 мг:объемный титр (мг/мл). Объем раствора эксципиента V (мл), необходимый для получения 90 мл раствора с концентрацией 44 мкг/мл:V (мл)=90 мл-B (мл) плотность d1 г/мл. 1.4.3. Приготовление 1 М раствора гидроксида натрия. 1 М раствор гидроксида натрия получали в WFI. 1.4.4. Приготовление 0,01 М натрий-ацетатного буфера с pH 3,5. К WFI добавляли соответствующее количество ледяной уксусной кислоты и значение pH доводили до 3,50,2 с использованием 1 М NaOH или разбавленной 50% уксусной кислоты. Раствор доводили до конечного объема с помощью WFI. 1.4.5. Приготовление раствора эксципиентов. Рассчитанные количества эксципиентов (маннита, Твин или Poloxamer 188, L-метионина) взвешивали и растворяли в необходимом количестве 0,01 М натрий-ацетатного буфера с pH 3,5; затем проверяли и при необходимости регулировали значение pH до 3,50,2 с помощью 1 М NaOH или разбавленной 50% уксусной кислоты; после чего раствор доводили до конечной массы с помощью 0,01 М натрий-ацетатного буфера. 1.4.6. Смешение с раствором лекарственной субстанции. Требуемое количество В (г) лекарственной субстанции, представляющей собой интерферон -1 а,добавляли к требуемому количеству раствора эксципиента V (г) и осторожно перемешивали до гомогенного состояния. 1.4.7. Первая стадия фильтрации раствора лекарственной субстанции. После этого смешанный раствор фильтровали через нейлоновую мембрану с размером пор 0,2 мкм(типа Ultipor N66 0,2 мкм,2,5 см, Pall), закрепленную на держателе из нержавеющей стали, под давлением азота (максимальное давление 1 бар) и собирали в стеклянный химический стакан. 1.4.8. Вторая стадия фильтрации раствора лекарственной субстанции. Раствор, полученный после предыдущей стадии фильтрации, фильтровали еще раз в тех же условиях через новую мембрану с размером пор 0,2 мкм. 1.4.9. Заполнение шприцев. Стеклянные шприцы объемом 1 мл заполняли в асептических условиях 0,5 мл конечного раствора. 1.4.10. Температура в процессе приготовления. В течение всего процесса приготовления температуру поддерживали по возможности на уровне,максимально близком к условиям охлаждения в холодильнике, путем использования охлажденной в холодильнике WFI и хранения раствора эксципиентов при 2-8 С.- 22009995 Пример 2. Жидкая композиция интерферона -1 а, не содержащая ЧСА, в форме нескольких доз в картриджах, пригодных для автоинжектора. В процессе разработки новой не содержащей ЧСА композиции, предпринятой с целью исключения ЧСА из поступающего в настоящее время в продажу продукта в шприцах, возникла потребность создания продукта в картриджах в форме нескольких доз. Композиция в форме нескольких доз должна обеспечить большее удобство для пациента, позволяя осуществлять самостоятельное введение с помощью автоинжектора. Сначала проводили изучение наиболее часто применяемых бактериостатических агентов (0,3% метакрезола, 0,5% фенола и 0,9% бензилового спирта) в сочетании с действующим веществом и сравнение с композицией в форме одной дозы в шприце, выбранной в рамках разработки препарата в форме одной дозы (44 или 88 мкг/мл интерферона -1 а, 54,6 мг/мл маннита, 1 мг/мл Poloxamer 188, 0,12 мг/млL-метионина в 10 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 3,5); при этом было установлено следующее: включение любого из бактериостатических агентов в концентрациях, обычно используемых для предупреждения загрязнения микроорганизмами, приводит к повышению содержания окисленных форм и стимулирует резкое усиление агрегации; использование 0,3% метакрезола и комбинации 0,5% фенола с 0,1% Poloxamer 188 приводит к резкому усилению агрегации. На основе информации, полученной перед созданием композиции, разработка композиции сначала была сосредоточена на применении бензилового спирта и фенола (без Poloxamer 188), а также дополнительных бактериостатических агентов (хлорбутанола, фенилэтанола); при этом изучали также применение ЭДТК в сочетании с бензиловым спиртом: было установлено, что основными путями разложения являлись окисление и агрегация действующего вещества; было установлено, что уменьшение количества бензилового спирта в композиции приводит к увеличению срока хранения продукта. Все остальные консерванты, тестированные на этой фазе исследования, не приводили к существенному увеличению стабильности продукта. После завершения стадии разработки композиции были выявлены следующие перспективные композиции (композиции-кандидаты) в форме нескольких доз: Композиция А - 264 мкг интерферона -1 а, 163,8 мг маннита, 3 мг Poloxamer 188, 0,36 мгL-метионина в 2,7 мл 11 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 3,5, которую смешивали с 0,3 мл 3% бензилового спирта в WFI, в результате чего получали конечную композицию в форме нескольких доз. Композиция Б - 264 мкг интерферона -1 а, 163,8 мг маннита, 3 мг Poloxamer 188, 0,36 мгL-метионина, 6 мг бензилового спирта в 3 мл 10 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 3,5. Для каждой перспективной композиции приготавливали по три опытные партии и тестировали с помощью методов, позволяющих оценивать стабильность, в течение периода времени вплоть до 6 месяцев: для обеих перспективных композиций не было выявлено существенного разложения при хранении при 2-8 С; основной причиной разложения, которое происходило при ускоренном хранении (25 С), было окисление. По завершении исследования были выявлены две перспективные композиции в форме нескольких доз, обладающие сопоставимым профилем стабильности: Композиция А, представляющая собой композицию в форме нескольких доз, содержащая 0,3% бензилового спирта, которую получали путем смешения содержимого 2 картриджей (одного, содержащего действующее вещество и эксципиенты, и второго, содержащего требуемое количество бензилового спирта, для получения конечного продукта). Композиция Б, представляющая собой готовую к применению композицию в форме нескольких доз, содержащую 0,2% бензилового спирта. 2.1. Цель исследования. Цель этого исследования заключалась в разработке не содержащей ЧСА композиции интерферона-1 а в форме нескольких доз по 264 мкг в картриджах объемом по 3 мл, позволяющих осуществлять введение с помощью автоинжектора. 2.2. Экспериментальная часть. 2.2.1. Материалы. Интерферон 1 а (фирма Serono S.A.). Маннит DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421 (фирма Merck). Ледяная уксусная кислота 100% GR (фирма Merck). Пеллеты гидроксида натрия GR (фирма Merck).L-метионин для биохимических исследований (фирма Merck). Метакрезол для синтеза (фирма Merck). Фенол для синтеза (фирма Merck). Бензиловый спирт Ph Eur, BP, NF (фирма Merck). Хлорбутанол (фирма Aldrich).- 23009995 Фенилэтанол (фирма Sigma). Метилпарабен натрия BP, USP/NF (фирма Formenti). Пропилпарабен натрия BP, USP/NF (фирма Formenti). Динатриевая соль ЭДТК (фирма Fluka). 1,2-пропандиол высшей чистоты DAB, Ph Eur, BP, USP (фирма Merck). Ацетонитрил (фирма Merck). Трифторуксусная кислота (фирма Baker). Гептафтормасляная кислота (фирма Pierce). 2.2.2. Оборудование. Системы ЖХВР (фирма Waters). Программное обеспечение Millenium 32 (фирма Waters). Осмометр (типа Osmomat 030-D, фирма Gonotec).pH-метр (модель 654, фирма Metrohm). Калиброванные пипетки (фирма Gilson). Нейлоновые мембраны типа Ultipor N66 0,2 мкм, FTKNF,4,7 см (фирма Pall). Нейлоновые мембраны типа Ultipor N66 0,2 мкм, NR14225,14,2 см (фирма Pall). Держатели из нержавеющей стали,4,7 см и 10 см (фирма Sartorius). Контейнер из нержавеющей стали (фирма Sartorius). Колонка С 4 5 мкм (0,4625 см) (фирма Baker). Колонка С 4, Supelcosil LC-304, 5 мкм (0,4625 см) (фирма Supelco). Колонка TSK, G2000SWXL (0,4625 см) (фирма TosoHaas). 2.3 Предварительные исследования перед созданием композиции. Сначала проводили изучение наиболее часто применяемых бактериостатических агентов(0,3% метакрезол, 0,5% фенол и 0,9% бензиловый спирт) в сочетании с действующим веществом и различными смесями эксципиентов в конечном контейнере (картриджи объемом 3 мл): ацетатный буфер,ацетатный буфер/маннит, ацетатный буфер/маннит/L-Met/Poloxamer 188. Изучали совместимость действующего вещества с различными средами с точки зрения окисления (с помощью ОФ-ЖХВР) и агрегации(с помощью ГФ-ЖХВР) в условиях хранения при 40 С. Обобщенные данные о композициях, изученных на различных стадиях этого предварительного исследования, представлены в табл. 1. Влияние включения каждого бактериостатического агента сравнивали с композицией в форме одной дозы (композиция, с которой проводили сравнение, референс-композиция), отобранной в рамках разработки композиции в форме одной дозы в шприце (44 или 88 мкг/мл интерферона -1 а, 54,6 мг/мл маннита, 1 мг/мл Poloxamer 188, 0,12 мг/мл L-метионина в 10 мМ натрий-ацетатном буфере с pH 3,5). Таблица 1 Составы композиции интерферона -1 а в форме нескольких доз- 24009995 Разработка композиции. На основе информации, полученной перед созданием композиции, разработка композиции сначала была сосредоточена на применении бензилового спирта и фенола; при этом изучали также применение дополнительных консервантов (хлорбутанол, фенилэтанол) и ЭДТК в сочетании с бензиловым спиртом. Композицию, с которой проводили сравнение (MS-3), представляющую собой новую композицию интерферона -1 а, не содержащую ЧСА, в форме однократной дозы также приготавливали в картриджах и использовали для сравнения. Состав (в мг/мл) композиций, разработанных на этой фазе, представлен в табл. 2-5. Таблица 2 Композиции интерферона -1a в форме нескольких доз, содержащие бензиловый спирт После завершения стадии разработки композиции были определены следующие перспективные композиции в форме нескольких доз: Композиция А - 264 мкг интерферона -1 а в 2,7 мл ацетатного буфера с pH 3,5, содержащая 54,6 мг/мл маннита, 1 мг/мл Poloxamer 188 и 0,12 мг/мл L-метионина, предназначенная для смешения с 0,3 мл 3% бензилового спирта в WFI с получением конечной композиции в форме нескольких доз (0,3% бензилового спирта). Композиция Б - 264 мкг интерферона -1 а в 3 мл ацетатного буфера с pH 3,5, содержащая 54,6 мг/мл маннита, 1 мг/мл Poloxamer 188, 0,12 мг/мл L-метионина и 2 мг/мл бензилового спирта (0,2% бензилового спирта). 2.5. Тестирование эффективности консервантов. Композиции в форме нескольких доз, содержащие различные концентрации бензилового спирта (от 0,2 до 0,9%), подвергали скринингу в отношении эффективности консервации согласно фармакопеям ЕР и USP. Предварительные тесты проводили, используя в качестве индикаторов Staphylococcus aureus, Aspergillus niger и Candida albicans: тот факт, что кислые значения pH композиции сами по себе оказывают бактериостатическое действие на бактерии (Staphylococcus aureus) и имеющиеся сведения о том, что некоторые штаммы Candida albicans выживают даже при низких значениях pH (pH примерно 2) обусловили выбор Candida albicans в качестве индикатора, имеющего решающее значение, при проведении теста. При этом применяли критерии применимости, принятые в опытах по определению эффективности консервантов согласно как фармакопеи ЕР, так и USP. 2.6. Перспективные композиции. 2.6.1. Композиция А. Были приготовлены три опытные партии, содержащие примерно по 140 картриджей в партии, состав которых приведен в табл. 6. Таблица 6 Состав композиции А интерферона -1a в форме нескольких доз Действующее вещество смешивали с раствором эксципиентов и затем фильтровали через нейлоновую мембрану с размером пор 0,22 мкм; картриджи заполняли, используя 2,7 мл конечного раствора. Отбирали образцы до, после фильтрации и после заполнения для мониторинга потерь действующего вещества в этом процессе. Образцы помещали на хранение и тестировали в отношении стабильности при хранении при 2-8 С(6 месяцев), 252 С (3 месяца) и 402 С (1 месяц). Приготавливали шесть опытных партий 3% бензилового спирта в WFI, предназначенных для смешивания с находящимся в картриджах действующим веществом, составы партий приведены в табл. 7. Таблица 7 Состав, содержащий 3% бензиловый спирт в WFI Необходимое количество бензилового спирта добавляли к WFI и затем фильтровали через мембрану типа Durapore с размером пор 0,22 мкм; затем картриджи заполняли продуктом объемом 0,5 мл и окончательно стерилизовали путем автоклавирования.- 26009995 Образцы помещали на хранение при 252 С в течение периода времени вплоть до 1 месяца и определяли содержание бензилового спирта и значение pH. 2.6.2. Композиция Б. Приготавливали три опытные партии объемом примерно 500 картриджей/партию, состав которых приведен в табл. 8. Таблица 8 Состав композиции Б интерферона -1 а в форме нескольких доз Действующее вещество смешивали с раствором эксципиентов и затем фильтровали через нейлоновую мембрану с размером пор 0,22 мкм; картриджи заполняли 3 мл конечного раствора. Отбирали образцы до, после фильтрации и после заполнения для мониторинга потерь действующего вещества в этом процессе. Образцы помещали на хранение и тестировали в отношении стабильности при 2-8 С (6 месяцев),252 С (6 месяцев) и 402 С (3 недели). 2.6.3. Тест по оценке эффективности консервантов. Для обеих перспективных композиций оценивали эффективность консервантов согласно фармакопеям ЕР и USP. 2.7. Аналитические тесты и методы. Для мониторинга стабильности опытных композиций применяли описанные ниже аналитические тесты и методы. Измерение pH (измерение потенциометрическим методом). Количественный анализ белка (ОФ-ЖХВР). Количественный анализ белка осуществляли на колонке С 4, Wide-Pore Butyl 5 мкм (фирма Baker) при длине волны 214 нм и скорости элюирования 1 мл/мин с использованием указанных ниже подвижной фазы и градиента: А=вода/трифторуксусная кислота 0,1%-Б=ацетонитрил/трифторуксусная кислота 0,1%-В=ацетонитрил. Градиент: Время погона = 65 мин. Образцы анализировали путем введения 100 мкл либо исходных образцов (образцы с 44 мкг/мл),либо после их разбавления (1:1) эквивалентным объемом плацебо (для образцов с 88 мкг/мл). Количественную оценку образцов осуществляли с использованием стандартной кривой в диапазоне 0,0125-0,2 мг/мл, полученной для стандартного референс-продукта. Окисленные формы (ОФ-ЖХВР). Количественную оценку окисленных форм осуществляли на колонке С 4, Supelcosil LC-304 (фирмаSupelco), термостатированной при 40 С, при длине волны 208 нм и элюирование осуществляли при скорости потока 1 мл/мин с использованием указанных ниже подвижной фазы и градиента: А=вода 60%/ацетонитрил 40%/гептафтормасляная кислота 0,14%-Б=вода 20%/ацетонитрил 80%/гептафтормасляная кислота 0,14%-В=вода 20%/ацетонитрил 80%/трифторуксусная кислота 0,1%. Время погона: 96 мин (70 мин+уравновешивание в течение 26 мин). Образцы анализировали в исходном виде путем введения 200 мкл (для образцов с 88 мкг/мл) или 400 мкл (для образцов с 44 мкг/мл). Общее содержание агрегатов (ГФ-ЖХВР). Обнаружение общего содержания агрегатов осуществляли на колонке типа TSK G2000SWXL(фирма TosoHaas); элюирование проводили с использованием изократической формы при 0,5 мл/мин с использованием ацетонитрила:воды (30:70)+0,2% трифторуксусной кислоты при длине волны 214 нм. Время погона = 20 мин. Образцы анализировали в исходном виде путем введения 100 мкл (для образцов с 88 мкг/мл) или 200 мл (для образцов с 44 мкг/мл). Биологическая активность (биологический анализ in vitro). Биологическую активность оценивали с помощью анализа антивирусной активности, основанном на определении индуцируемого IFN- защитного действия в отношении клеток (WISH-клетки человеческой амниотической ткани) от цитопатического воздействия вируса (вирус везикулярного стоматита). Осмотическое давление (измерение криоскопическим методом). Измерение осмотического давления осуществляли путем измерения криоскопическим методом, основанного на определении понижения точки замерзания тестируемого раствора. Анализ бензилового спирта (газовая хроматография (ГХ. В ГХ-методе (метод газовой хроматографии) для обнаружения бензилового спирта применяли подход, основанный на одноточечной калибровке с использованием в качестве стандарта бензилового спирта, поступающего в продажу от фирмы Merck. В дополнение к этому использовали внутренний стандарт(фенилэтиловый спирт) для стандартизации площадей пиков обоих тестируемых образцов, раствора контрольного образца и стандартного раствора. Анализ проводили на колонке из нержавеющей стали размером 6 футов 2 мм (внутренний диаметр) с 10% Carbowax 20M на супелкопорте 80/100 меш. В качестве детектора применяли FID (пламенно-ионизационный детектор). Результаты выражали в миллиграммах бензилового спирта на 1 мл. 2.7.1. Результаты. 2.7.1.1. Предварительная композиция. Содержание окисленных форм и общее содержание агрегатов, выявленных в стрессовых условиях- 28009995 Таблица 9 Содержание окисленных форм (в %) в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз после хранения при 40 С (по данным ОФ-ЖХВР) Таблица 10 Общее содержание (в %) агрегатов в композициях интерферона -1 а в форме нескольких доз после хранения при 40 С (по данным ОФ-ЖХВР)- 29009995 Включение каждого из бактериостатических агентов в концентрациях, которые обычно применяют для предупреждения микробного заражения, приводило к увеличению содержания окисленных форм и стимулировало резкое увеличение содержания агрегатов по сравнению с композицией в форме одной дозы (композиция, с которой проводили сравнение, референс-композиция). Комбинация 0,5% фенола и 0,1% Poloxamer 188 оказывала отрицательное влияние на стабильность продукта, поскольку при ее использовании происходила примерно 40% агрегация (композиции Р-С-Т). При дальнейшей разработке 0,3% метакрезол исключали из-за отрицательного воздействия на стабильность продукта в результате увеличения содержания агрегатов (композиция И). 2.7.1.2. Разработка композиции. Все данные о стабильности (необработанные данные) обобщены в соответствующих таблицах; для оценки данных применяли анализ методом линейной регрессии. 2.7.1.2.1. Композиции, содержащие бензиловый спирт. Наиболее высокая концентрация бензилового спирта (0,9%) оказывала отрицательное воздействие на стабильность продукта как с точки зрения содержания окисленных форм, так и агрегатов, что проиллюстрировано на фиг. 1-6. В стрессовых условиях (40 С) увеличение окисления происходило в большей степени в композициях, содержащих 0,9% бензилового спирта (MS-1 и MS-2), что проиллюстрировано на фиг. 1. В условиях ускоренного хранения (25 С) увеличение окисления для всех композиций, содержащих бензиловый спирт, было выше, чем в композиции, не содержащей бензиловый спирт (MS-3, композиция,с которой проводили сравнение), что проиллюстрировано на фиг. 2. При продолжительном хранении (2-8 С) были выявлены более высокие скорости окисления в композициях, содержащих 0,9% бензилового спирта (MS-1 и MS-2); сопоставимые скорости разложения были выявлены для композиций, в которых содержание бензилового спирта составляло менее 0,45%(фиг. 3). В отношении содержания агрегатов было установлено следующее. В стрессовых условиях (40 С) для композиций, содержащих 0,9% бензилового спирта (MS-1 иMS-2), было выявлено увеличение содержания агрегатов (фиг. 4). В условиях ускоренного хранения и при продолжительном хранении (25 и 2-8 С) для всех композиций не было обнаружено увеличения содержания агрегатов, что проиллюстрировано на фиг. 5 и 6. Для композиций, содержащих 0,9% бензилового спирта (MS-1 и MS-2), при хранении при 40 С было обнаружено снижение биологической активности; указанное явление не было обнаружено при хранении тех же самых образцов при 25 и 2-8 С. При хранении при всех температурах не было обнаружено уменьшения титра. При хранении при всех температурах не было обнаружено изменения значения pH. 2.7.1.2.2. Композиции, содержащие альтернативные бактериостатические агенты (фенол, хлорбутанол, фенилэтанол). Фенол (композиции MS-4 и MS-5) оказывал отрицательное влияние на стабильность продукта с точки зрения содержания окисленных форм, в то время как композиции, содержащие хлорбутанол(MS-35) и фенилэтанол (MS-34 и MS-34b), обладали стабильностью, сопоставимой со стабильностью раствора, с которым производили сравнение (MS-3, не содержащий бактериостатического агента), что проиллюстрировано на фиг. 7 и 8. Касательно общего содержания агрегатов было выявлено резкое увеличение содержания агрегатов в стрессовых условиях (40 С) для композиций, содержащих фенол (MS-4 и MS-5), что проиллюстрировано на фиг. 9; при более низких температурах (25 и 2-8 С) не было выявлено увеличения содержания агрегатов. 2.7.1.2.3. Композиции, содержащие ЭДТК. Добавление ЭДТК к композициям, содержащим 0,1-0,2% бензилового спирта (MS-32, MS-33,MS-36), не приводило к понижению уровня окисления (фиг. 10); в условиях ускоренного для композиций, содержащих 0,1% ЭДТК и 0,2% бензилового спирта (MS-32, MS-33) (фиг. 11), было обнаружено увеличение содержания агрегатов; сопоставимый уровень разложения был обнаружен при 2-8 С. 2.7.1.2.4 Результаты исследования эффективности консервантов. Результаты скринингового исследования показали, что критерии фармакопей USP и ЕР удовлетворяются, по меньшей мере, для концентраций бензилового спирта, равных или превышающих 0,3% (в отношении Candida albicans). 2.8. Композиции-кандидаты. Оценку всех данных проводили следующим образом: для каждой партии проводили анализ методом линейной регрессии с последующим ковариантным анализом (значение Р 0,25) для оценки вариабельности между партиями, если не было обнаружено вариабельности при хранении, то не проводили формального статистического анализа.