Способ получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора

Номер патента: 22206

Опубликовано: 30.11.2015

Автор: Врис Де Валтер Герхардус

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген полиомавируса, включающий следующие стадии:

a) обеспечение пермиссивной для полиомавируса дикого типа клеточной линии, кодирующей функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не кодирующей функциональный малый Т-антиген полиомавируса;

b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не кодирующей функциональный малый Т-антиген полиомавируса;

c) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, в которых клеточная линия продуцирует большой Т-антиген in trans и позволяет образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; и

d) сбор частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора из клеточной культуры.

2. Композиция, содержащая частицы рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген и не кодирующего большой Т-антиген полиомавируса, полученные способом по п.1.

3. Композиция, содержащая больше 1 млн частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген полиомавируса и не кодирующего большой Т-антиген полиомавируса, указанные полиомавирусные частицы не способны реплицироваться в пермиссивных для полиомавируса дикого типа клетках, отличающаяся тем, что не содержит ни одной полиомавирусной частицы, способной реплицироваться в пермиссивных для полиомавируса дикого типа клетках, не экспрессирующих функциональный большой Т-антиген полиомавируса.

4. Композиция по п.3, в которой полиомавирус является полиомавирусом приматов.

5. Композиция по п.4, в которой полиомавирус является обезьяньим полиомавирусом.

6. Композиция по п.5, в которой полиомавирус выбирают из группы, состоящей из SV40, SV12, лимфотропного полиомавируса, полиомавируса африканской зеленой мартышки и полиомавируса шимпанзе.

7. Композиция по п.6, в которой полиомавирус является полиомавирусом SV40.

8. Пермиссивная для полиомавируса клеточная линия, кодирующая полиомавирусный большой Т-антиген и не кодирующая функциональный полиомавирусный малый Т-антиген, где указанный ген, кодирующий большой Т-антиген полиомавируса, стабильно интегрирован в геном клетки.

9. Применение клеточной линии по п.8 для получения рекомбинантных белков.

10. Применение композиции по любому из пп.2-7 для получения лекарственного средства для лечения заболевания.

11. Применение по п.10, где заболевание выбрано из генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований.

Текст

Смотреть все

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧАСТИЦ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИОМАВИРУСНОГО ВЕКТОРА Изобретение относится к улучшенным способам получения вирусных частиц, вирусных векторов,частиц вирусных векторов и рекомбинантных белков. В частности, изобретение относится к улучшенным способам получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора и клеточных линий-продуцентов полиомавирусных векторов. Конкретнее, изобретение относится к способам получения частиц вектора на основе обезьяньего полиомарвируса, таких как частицы вектора на основе обезьяньего вируса 40 (SV40). Изобретение также относится к композициям, содержащим вирусные векторы, к их применениям и к частицам вирусного вектора для лечения генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний,инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований. Изобретение также относится к способам получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих и к способам повышения производства рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Врис де Валтер Герхардус (NL) Воробьева Е.В. (RU) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к улучшенным способам получения вирусных частиц, вирусных векторов, частиц вирусных векторов и рекомбинантных белков. В частности, изобретение относится к улучшенным способам получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора и клеточных линий-продуцентов полиомавирусных векторов. Конкретнее, изобретение относится к способам для получения обезьяньих полиомавирусных векторов, таких как вирусные векторы обезьяньего вируса 40 (англ.simian virus 40, SV40). Изобретение относится к композициям, содержащим вирусные векторы, к их применениям и к частицам вирусного вектора для лечения генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований. Изобретение также относится к способам получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих и к способам повышения производства рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Предшествующий уровень техники За последние 10 лет много усилий было потрачено на разработку эффективных технологий доставки генов и нуклеиновых кислот для внедрения и надлежащей экспрессии генов и нуклеиновых кислот в клетках-мишенях. Терапевтические гены или нуклеиновые кислоты могут быть использованы при восстановлении неправильно работающих генов для лечения генетических заболеваний, для индукции иммунного ответа при лечении онкологических и инфекционных заболеваний или для подавления иммунного ответа, например для индукции/восстановления иммунной толерантности при предотвращении отторжения трансплантата или для лечения аутоиммунных заболеваний и аллергий. Терапевтические гены или нуклеиновые кислоты могут быть введены в виде "оголенных" молекул или в виде нуклеиновых кислот, упакованных в липидные и/или белковые соединения. В связи с эволюцией вирусов в направлении доставки и экспрессии своей генетической информации в хозяев, в клетки-мишени вирусные векторы исследовали в качестве носителей для доставки генов, и они оказались наиболее эффективными средствами доставки генетической информации в живую клетку. Множество вирусных векторных систем доставки генов были разработаны и протестированы в преклинических и клинических исследованиях. Эти исследования показали, что используемые в настоящее в настоящее время векторы, которые получены из аденовирусов, поксвирусов, герпесвирусов, альфавирусов, ретровирусов, парвовирусов, полиомавирусов, как правило, безопасны для применения и эффективны при доставке терапевтических генов к клеткам-мишеням. Основной недостаток применяемых в нестоящее время вирусных векторов для доставки генов заключается в том, что они не могут быть получены в достаточных количествах для лечения значительного количества пациентов. Большинство вирусных векторов получают трансфекцией клеток-продуцентов плазмидной ДНК, кодирующей вектор и компоненты вектора. Как правило, это дает от 1 до 10 млн векторных частиц на 1 мл объема клеточной культуры. В клинических исследованиях, как правило, пациенту вводят от 11010 до 11012 векторных частиц в целях достижения полезных клинических эффектов. Это означает, что для лечения 1000 пациентов требуется более 1 млн л клеточной культуры для получения достаточных количеств векторных частиц. Кроме того, преклинические и клинические исследования показали, что большинство протестированных вирусных векторов для доставки генов, таких как аденовирусные, поксвирусные, герпесвирусные, альфавирусные и ретровирусные векторы, индуцируют в пациентах сильный иммунный ответ, направленный на компоненты вирусного вектора и продукты терапевтического гена. Вследствие этого данные векторы могут быть введены пациенту только однократно,несмотря на то, что уровни экспрессии введенного терапевтического гена быстро снижаются. Вирусные векторы, полученные из аденоассоциированного вируса (AAV), не индуцируют иммунные ответы в животных и являются иммунологически инертными. Однако большая часть человеческой популяции встречала AAV дикого типа вместе с его вирусом-помощником, например аденовирусом, и в результате в ней развилась сильная память ЦТЛ против капсидных белков AAV. Как следствие, трансдуцированные AAV клетки быстро удаляются и уровни экспрессии терапевтического гена или нуклеиновой кислоты, введенной вирусным вектором AAV, быстро снижаются. Выход рекомбинантных белков, полученных в клетках млекопитающих, по сравнению с выходом,полученным в прокариотических клетках, в целом является низким, несмотря на применение сильных промоторов и/или многокопийных трансгенных вставок или других путей усиления транскрипции. Вирусные репликативно-компетентные векторы или репликоны применяли в течение длительного периода времени в качестве систем экспрессии для получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Целевой ген в таких векторах может экспрессироваться под транскрипционным контролем вирусных промоторов, в результате чего требуемые мРНК могут накапливаться до очень высоких уровней в цитоплазме сразу после трансфекции, что дает большие количества целевого белка. До настоящего времени успехи с системами экспрессии на основе репликонов были ограничены. Репликоновые системы,основанные на РНК-вирусах, в целом производят рекомбинантные белки только в течение короткого периода времени, тогда как те, что получены из ДНК-вирусов, в целом плохо реплицируются в коммерческих клеточных линиях. Насколько известно, существует только один вирусный вектор доставки генов, который иммунологически инертен в людях и который может быть получен в значительных количествах для лечения значительного числа пациентов. Более того, этот вирусный вектор доставки генов может быть использован в качестве репликоновой системы для получения рекомбинантных белков в клеточных линиях млекопитающих. Данная вирусная векторная система получена из обезьяньего вируса 40 (SV40), обезьяньего полиомавируса. Полиомавирусы относятся к семейству безоболочечных ДНК-вирусов с икосаэдрическими капсидами. Они выделены из различных видов животных, включая людей, обезьян, грызунов и птиц. Было описано пять человеческих полиомавирусов, которые назвали BK, JC, WU, KI и полиомавирус клеток Меркеля. Было описано множество обезьяньих полиомавирусов, среди которых SV40 является наиболее известным. SV40 плохо реплицируется в человеческих клетках, и инфекции среди людей очень редки. Случайные инфекции SV40 происходят при передаче вируса от обезьян людям, живущим в тесном контакте с этими животными, или посредством вакцинации партиями инактивированных полиовирусных частиц, контаминированных SV40. SV40 имеет геном в виде кольцевой двухцепочечной ДНК длиной 5,25 тыс. пар оснований. Геном SV40 состоит из двух регуляторных областей, промотора/точки начала репликации и области полиаденилирования. Промотор/точка начала репликации имеет длину 500 пар оснований и содержит два противоположно направленных промотора: ранний и поздний промоторы(SVEP и SVLP соответственно), точку начала репликации и сигнал упаковки. Область полиаденилирования имеет 100 пар оснований в длину и содержит сигналы полиаденилирования как для ранних, так и для поздних транскриптов. SVEP управляет экспрессией раннего первичного транскрипта, который сплайсируется кодируемыми хозяином факторами сплайсирования в 2 различных мРНК, которые кодируют малый и большой опухолевые (T-tumor) антигены. Большой Т-антиген является белком, ассоциированным с репликазой, который необходим для репликации ДНК и для активации SVLP. Хотя точная роль малого Т-антигена в репликации вируса остается неясной, малый Т-антиген в сочетании с большим Т-антигеном требуется для трансформации нескольких типов клеток млекопитающих. Первичные эффекты малого Т-антигена проявляются через его взаимодействие с серин/треониновой протеинфосфатазой 2 А. Домен малого Т-антигена, связывающий фосфатазу 2 А, расположен в уникальном С-конце малого Т-антигена. В предшествующем уровне техники хорошо описано, что для эффективной репликации полиомавируса требуются как большой, так и малый Т-антигены (Fahrbach K.M. et al., Virology, 370 (2): 255-263,2008).SVLP управляет экспрессией позднего первичного транскрипта, который сплайсируется кодируемыми хозяином факторами сплайсирования в две различные мРНК, кодирующие белки вирусного капсида VP1, 2 и 3. Т-антигены являются основными, а капсидные белки - второстепенными иммуногенными компонентами полиомавирусов, стимулирующими клеточный и гуморальный иммунные ответы на клетки, инфицированные SV40. Т-антигены SV40 совместно иммортализуют первичные клетки млекопитающих, трансформируют стабильные клеточные линии и стимулируют образование опухолей у новорожденных грызунов с ослабленным иммунитетом. Множество сообщений подтверждают факт того, что инфекции SV40 ассоциированы с неоплазиями у человека, вызванными онкогенной активностью постоянно экспрессируемых Т-антигенов (Butel J.S. and Lednicky J.A. Journal of the National Cancer Institute, 91: 119-134, 1999). Поскольку экспрессия вирусных капсидных белков зависит от присутствия большого Т-антигена,специфичные для Т-антигена последовательности были удалены из полиомавирусных векторов не только для того, чтобы сделать векторы репликативно некомпетентными, но также для того, чтобы полностью исключить иммуногенность в людях. Были изготовлены и проверены полученные из SV40 полиомавирусные векторы с удаленным Т-антигеном, в которых терапевтические гены и нуклеиновые кислоты экспрессируются in trans в клетках-мишенях в условиях транскрипционного контроля вирусным SVEP. Указанные векторы известны в течение длительного периода времени в качестве потенциальных векторов для переноса генов во множество типов человеческих тканей и клеток, например в костный мозг (Rund D. et al., Human Gene Therapy,9: 649-657, 1998), печень (Strayer D.S. and Zern M.A., Seminars in Liver Disease, 19: 71-81, 1999) и дендритные клетки (Vera M. et al., Molecular Therapy, 12: 950-959, 2005). Полиомавирусные векторы, например, на основе SV40, как известно, инфицируют неделящиеся клетки, а также активно делящиеся клетки. Поскольку в векторах отсутствует область, кодирующая Т-антигены и, как следствие, они не экспрессируют вирусные капсидные белки, они не являются иммуногенными (Strayer D.S. and Zern M.A., Seminars in Liver Disease, 19: 71-81, 1999), что позволяет проводить повторное введение тому же самому индивидууму. Более того, поскольку экспрессия конструктов с вставленным терапевтическим геном находится под транскрипционным контролем SVEP, слабого, но конститутивного промотора, указанные векторы индуцируют длительную экспрессию терапевтических белков in vivo. Таким образом, известно, что полиомавирусные векторы, такие как векторы, полученные из SV40, являются перспективными кандидатами для переноса терапевтических генов и нуклеиновых кислот, которые могут применяться в вышеупомянутых приложениях. Из-за своего репликативного потенциала репликоны на основе полиомавируса также представляют большой интерес при усилении продуцирования в клетках млекопитающих рекомбинантных белков, таких как антитела, факторы роста и гормоны. Частицы SV40 с удаленным Т-антигеном были получены в обезьяньих клетках, которые являются пермиссивными для литического роста SV40 и которые предоставляют Т-антигены in trans. В настоящее время для упаковки SV40-векторов применяются клеточные линии COS, в частности COS-1 и COS-7(Gluzman Y., Cell, 23: 175-182, 1981). Клеточные линии COS были получены трансформацией ДНК SV40 обезьяньих клеток CV1. Другой клеточной линией, экспрессирующей Т-антиген SV40 in trans, является СМТ 4. Полученные из CV1 клеточные линии СМТ были образованы с помощью ДНК SV40, в которой экспрессия Т-атигенов находится под транскрипционным контролем промотора мышиного металлотионеина (Gerard R.D. and Gluzman Y., Molecular and Cellular Biology, 5: 3231-3240, 1985). Однако существует серьезный недостаток применения таких клеточных линий. ПассированиеSV40-векторов с удаленными Т-антигенами в сконструированных упаковывающих клеточных линиях(COS или СМТ) во многих случаях приводит к появлению репликативно-компетентных частиц SV40 дикого типа (Gluzman Y., Cell, 23: 175-182, 1981; Oppenheim A. and Peleg A., Gene, 77: 79-86, 1989; VeraM. et al., Molecular Therapy, 10: 780-791, 2004). Наиболее вероятно это происходит из-за гомологичной рекомбинации нуклеотидных последовательностей между встроенной в хромосому последовательностью, специфичной для SV40, и ядерными последовательностями, специфичными для SV40-вектора. Появление репликативно-компетентных вирусных частиц дикого типа и присутствие онкобелков Т-антигенов в таких обычных упаковывающих клеточных линиях делает применение SV40-векторов непригодным для медицинских целей. Клеточная линия человеческих эмбриональных клеток почки 293 (HEK-293) является полупермиссивной для инфекции SV40, это означает, что только малый процент инфицированных клеток поддерживает репликацию вируса. Основная часть клеток является персистентно инфицированными и демонстрирует очень низкие уровни репликации вируса. Производным клеточной линии HEK-293 является клеточная линия HEK-293 Т, в которой экспрессия ранней области SV40 находится под транскрипционным контролем промотора длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса. Было показано, что из-за ошибки сплайсирования в пользу мРНК малого Т-антигена SV40 клетки HEK-293 Т экспрессируют весьма незначительные количества большого Т-антигена и большие количества малого Т-антигена. Vera et al. обнаружили, что HEK-293 Т плохо поддерживают продуцирование вектора на основе вируса SV40 (Vera M., et al., Molecular Therapy, 10: 780791, 2004). Поскольку онкобелки Т-антигенов присутствуют в клетках HEK-293 Т и существует риск появления репликативно-компетентных вирусов SV40, применение этой клеточной линии для получения SV40 векторов для медицинских целей является нежелательным и непрактичным. Клеточную линию HEK-293 ТТ, разработанную как производное HEK-293 Т, получали стабильной трансфекцией генным конструктом, который кодирует большой Т-антиген SV40. Клетки HEK-293 ТТ применяют для получения псевдовирусных частиц рекомбинантного человеческого вируса папилломы(HPV). Частицы рекомбинантного псевдовектора HPV получают в HEK-293 ТТ трансфекцией клеток плазмидой, которая несет точку начала репликации SV40 и капсидные гены HPV, и плазмидой, которая несет точку начала репликации SV40 и псевдогеном HPV (Buck С.В. et al., Methods in Molecular Medicine,119: 445-462, 2005). Поскольку HEK-293 ТТ, как производное HEK-293 Т, накапливают онкобелки малого и большого Т-антигенов и плохо поддерживают репликацию SV40, применение данной клеточной линии для продуцирования рекомбинантных векторов SV40 в медицинских целях также является нежелательным и практически нецелесообразным. В WO 03/025189 описаны упаковывающие комплементирующие клеточные линии, в которых возможно продуцирование частиц вектора SV40, которое якобы безопасно для медицинского применения. Однако описанные в данном документе упаковывающие клеточные линии по-прежнему накапливают значительные количества онкобелков малого и большого Т-антигенов.Vera M. et al., Molecular Therapy, 10: 780-791, 2004 показали, что способность к продуцированию частиц представляющего интерес рекомбинантного SV40-вектора в некоторых клеточных линиях, таких как СМТ 4 и HEK-293 Т, может быть очень низкой, и утверждают, что клеточные линии, описанные вWO 03/025189, такие как СОТ-2, также не являются эффективными клеточными линиями-продуцентами для частиц рекомбинантного SV40-вируса возможно из-за ошибки сплайсирования в пользу мРНК малого Т-антигена SV40 в данных типах клеток. В WO 08/000779 описан способ преодоления проблемы путем получения стоков подходящих векторов на основе вируса SV40 с высоким титром при помощи вирусных супрессоров РНК интерференции(РНКи), таких как белки E3L вируса осповакцины и NS1 вируса гриппа А. Упаковывающие клеточные линии, описанные в WO 08/000779, не обеспечивают решение недостатков упаковывающих клеточных линий предшествующего уровня техники, описанных в данном документе выше. В клетки яичника китайского хомяка (СНО) встраивали раннюю область мышиного полиомавируса,что привело к получению клеточных линий CHOP (Heffernan and Dennis, Nucleic Acids Research, 19: 8592, 1991). Несколько клеточных линий CHOP поддерживают репликацию плазмиды CDM8 (Invitrogen),экспрессирующего в млекопитающих вектора, который несет точку начала репликации мышиного полиомавируса. Уровень репликации в клеточных линиях CHOP был недостаточен для того, чтобы сделать данную систему привлекательной для коммерческого применения, возможно из-за ошибки сплайсирования в пользу мРНК малого или среднего Т-антигена в клетках СНО. В данной области существует потребность в эффективных системах продуцирования частиц рекомбинантного полиомавируса, которые безопасны при использовании и дают высокие титры частиц вирусного вектора. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении способов безопасного и эффективного получения частиц полиомавируса и композиций, получаемых из них. Следует понимать, что способы настоящего изобретения также могут быть применены для получения больших количеств рекомбинантных белков в клетках млекопитающих. Сущность изобретения Вышеуказанные задачи решены настоящим изобретением путем обеспечения способа продуцирования частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не способного экспрессировать функциональный малый Т-антиген, который включает следующие стадии: а) обеспечение пермиссивной для полиомавируса дикого типа клеточной линии, способной экспрессировать функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не способной экспрессировать функциональный малый Т-антиген полиомавируса;b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не способной кодировать функциональный малый Т-антиген; с) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, позволяющих образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; иd) сбор частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора из клеточной культуры. Частицы рекомбинантного полиомавирусного вектора, полученные данным способом, не способны экспрессировать функциональный малый Т-антиген и не могут ревертировать в частицы полиомавируса дикого типа. Это может происходить из-за полной утраты генов, кодирующих функциональный малый Т-антиген в полиомавирусном векторе, а также в клеточной линии-продуценте полиомавирусного вектора. Это впервые позволило получить композицию, содержащую значительное количество частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора без единичных частиц полиомавируса дикого типа. Полученные данным способом частицы вирусного вектора не способны реплицироваться в клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа и которые не экспрессируют функциональный большой Т-антиген. Следовательно, эта композиция является безопасной при применении в медицине. До сих пор было невозможно получить большие количества частиц полиомавирусного вектора,свободные от полиомавирусных ревертантов к дикому типу, полученных в результате рекомбинации. При применении данного изобретения можно получить большие количества однообразных частиц вирусного вектора в отсутствие единичных вирусов дикого типа. Соответственно, изобретение относится к композиции, содержащей больше чем 106 полиомавирусных частиц, не способных экспрессировать функциональный малый Т-антиген и, следовательно, не способных реплицироваться в дефицитных по большому Т-антигену клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа. Клеточные линии для применения в данном изобретении могут быть обычными клеточными линиями, пермиссивными для полиомавируса млекопитающих, которые генетически модифицированы так,чтобы они экспрессировали функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не экспрессировали функциональный малый Т-антиген полиомавируса. Клеточные линии по изобретению могут преимущественно использоваться для получения рекомбинантных белков, поскольку они способны реплицировать молекулы кольцевой ДНК, несущие точку начала репликации полиомавируса. Изобретение также относится к описанной выше композиции для применения в качестве лекарственного средства. Подробное описание изобретения Автор обнаружил, что большой Т-антиген полиомавируса сам по себе промотирует экспрессию полиомавирусных капсидных белков и что для этих целей не требуется малый Т-антиген полиомавируса. Это означает, что при отсутствии полиомавирусных Т-антигенов в клетке SVEP является конститутивным, но слабым промотором, по сравнению с другими вирусными промоторами, такими как цитомегаловирусный (CMV) немедленно-ранний промотор, при этом SVLP выключен на транскрипционном или посттранскрипционном уровне. Неожиданно было обнаружено, что в пермиссивных для SV40 клетках большой Т-антиген SV40 сам по себе способен поддерживать мультиплицирование ДНК вектора на основе вируса SV40 и активировать SVLP, что ведет к накоплению капсидных белков и приводит к эффективному продуцированию частиц вектора на основе вируса SV40. На предшествующем уровне техники были получены штаммы SV40, которые являются дефицитными по кодированию малого Т-антигена. Gauchat et al. (Nucleic Acids Research, 14: 9339-9351, 1988) описывают делеционный мутант SV40, d1883, который потерял малый Т-антиген, но продуцирует в ин-4 022206 фицированных клетках функциональный большой Т-антиген. Впоследствии данный мутантный вирусный штамм применяли для инфекции клеток почек обезьяны и клеточных культур CV-1, и штамм мутантного вируса оказался менее эффективным при индукции клеточного деления, опосредованного большим Т-антигеном, и последующей вирусной репликации, чем SV40 дикого типа. Авторы пришли к выводу, что малый Т-антиген имеет вспомогательную функцию, помогая большому Т-антигену индуцировать клеточное деление и вирусную репликацию. Предшествующий уровень техники, таким образом,уводит в сторону от настоящего изобретения, поскольку демонстрирует, что по сравнению с клетками,инфицированными SV40 дикого типа, многие клетки, инфицированные dl883, не делятся и не продуцируют вирусные частицы. Указывается, что отсутствие малого Т-антигена в клетке неблагоприятно для продуцирования вирусного вектора.Gauchat et al. неубедительны в ответе на вопрос, продуцируются вирусные частицы или нет. Они всего лишь измеряют продуцирование вирусной ДНК в клетках, что не является эквивалентным продуцированию интактных вирусных частиц. Настоящее изобретение, следовательно, не является интуитивным для специалиста. Более того, специалистам известно, что малый Т-антиген является эффективным ингибитором РНКи. Поскольку, как известно, РНКи выполняет функцию антивирусного механизма, то можно было бы ожидать, что снижение количества внутриклеточного малого Т-антигена приводит к увеличению антивирусной активности, основанной на РНКи, что приводит к сниженному продуцированию вирусных частиц. Авторы с удивлением обнаружили, что верно обратное. Если большой Т-антиген представлен intrans, т.е. клеточная линия продуцирует большой Т-антиген, то в случае, если клеточная линия и полиомавирусный штамм потеряли функциональный малый Т-антиген, частицы полиомавируса продуцируются в больших количествах. Различия между настоящим изобретением и результатами Gauchat et al. заключаются в том, что в экспериментах, описанных в работе Gauchat et al., функциональный большой Т-антиген представлен in cis, т.е. на полиомавирусном векторе, который реплицируется в инфицированной клетке. Очевидно это приводит к частичной клеточной смерти и к очень неэффективному продуцированию вирусного вектора. Настоящее изобретение обеспечивает способы репликации частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, упаковывающие клеточные линии для полиомавирусного вектора и клеточные линии,поддерживающие репликацию полиомавирусных репликонов, где указанные полиомавирусные вектора и репликоны неспособны экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген. В настоящем изобретении в продуцирование полиомавирусного вектора вносят вклад все клетки и в способе по изобретению могут быть получены уровни от 1106 или даже 11011 частиц вирусного вектора на 1 мл клеточной культуры. Выражение "функциональный большой Т-антиген" или "его функциональные части" в данном контексте означает большой Т-антиген или его фрагмент или аналог, полученный из полиомавируса, который способен осуществлять такую же функцию, что и та, которая требуется для осуществления изобретения как присущая большому Т-антигену, из которого они получены, более конкретно, который способен поддерживать мультиплицирование полиомавирусной векторной ДНК и активировать SVLP в клетках пермиссивных для полиомавируса. Функциональность большого Т-антигена может быть проверена коэкспрессией экспрессирующей плазмиды, кодирующей большой Т-антиген полиомавируса или его фрагмент или аналог вместе с ДНК полиомавирусного вектора с удаленным Т-антигеном в клетках, пермиссивных для полиомавируса дикого типа и определением факта продуцирования частиц полиомавирусного вектора. Вывод о том, что полиомавирусный большой Т-антиген или его фрагмент или аналог является функциональным большим Т-антигеном в данном анализе, можно сделать на основании продуцирования индивидуальных полиомавирусных частиц. Факт продуцирования может быть определен электронной микроскопией или любым другим подходящим способом, известным в данной области. Выражение "функциональный малый Т-антиген" или "его функциональные части" в данном контексте означает, что малый Т-антиген или его фрагмент или аналог, полученный из полиомавируса, который способен осуществлять ту же функцию, что и та, которая требуется для осуществления изобретения как присущая малому Т-антигену, из которого они получены, более конкретно, который способен взаимодействовать с протеинфосфатазой 2 А и/или ингибировать е. Функциональность малого Т-антигена может быть проверена с помощью анализа связывания между полиомавирусным малым Т-антигеном или его фрагментом или аналогом и протеинфосфатазой 2 А, как описано СНО U.S. et al.,PLoS Biology, 5(8): e202, 2007. Вывод о том, что малый Т-антиген или его фрагмент или аналог является функциональным малым Т-антигеном, можно сделать, если в данном анализе взаимодействие и/или ингибирование выше фона. Полезные для настоящего изобретения клеточные линии могут экспрессировать полиомавирусный большой Т-антиген или его функциональные части и не способны экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген. Как следствие, клеточные линии по изобретению не накапливают кодируемые полиомавирусом онкобелки Т-антигенов, и репликативно-компетентные полиомавирусы дикого типа не могут выйти из клеток по изобретению вследствие рекомбинации между полиомавирусным вектором и хромосомно вставленными последовательностями полиомавирусного большого Т-антигена. Клеточные линии для применения в настоящем изобретении могут быть получены специалистом в данной области с помощью обычных навыков. Кроме того, для того чтобы получить клеточную линию для применения по изобретению специалист может следовать руководству, предоставленному в примерах. Также задача настоящего изобретения заключается в обеспечении пермиссивной по отношению к полиомавирусу клеточной линией, предпочтительно клеточной линии из приматов или даже более предпочтительно обезьяньей клеточной линией, такой как клеточная линия Vero (клеточная линия из почек африканской зеленой мартышки, ЕСАСС 88020401 из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, Уилтшир, Великобритания), содержащей ген, который кодирует функциональный полиомавирусный большой Т-антиген или его функциональный фрагмент, и генную последовательность, не способную экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген, полученную, например, делецией последовательностей, специфичных для малого Т-антигена. Указанная клеточная линия способна мультиплицировать и упаковывать полиомавирусные векторы с удаленным Т-антигеном. Квалифицированному читателю понятно, что рекомбинантные полиомавирусные векторы, такие как SV40-векторы, которые продуцируются в клеточных линиях изобретения, могут не содержать специфичные последовательности для гена Т-антигена и, таким образом, не будут способны реплицироваться в клетках млекопитающих, утративших большой Т-антиген. Примерные репликоны с удаленным Т-антигеном SV40 оказались способными к репликации с высокой скоростью при продуцировании в клеточных линиях по изобретению. Термин "гомология нуклеотидных последовательностей" при использовании в данном документе служит для обозначения наличия гомологии между двумя полинуклеотидами. Полинуклеотиды имеют"гомологичные" последовательности, либо если последовательности нуклеотидов в двух полинуклеотидах являются одинаковыми, либо если смысловая последовательность одного полинуклеотида и антисмысловая последовательность другого являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравнение последовательностей между двумя или большим количеством полинуклеотидов, как правило, осуществляют путем сравнения части, по меньшей мере двух, последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. Длина окна сравнения, как правило, равна от 20 до 200 смежных нуклеотидов. "Процент гомологии последовательностей" для полинуклеотидных последовательностей по изобретению, такой как 50, 60, 70,80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологии последовательностей, может быть определен путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения для оптимального выравнивания двух последовательностей может включать вставки или делеции (т.е. разрывы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит вставки или делеции). Процент рассчитывается следующим образом:(а) определением количества позиций, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты встречается в обеих последовательностях для получения количества совпадающих позиций; (b) делением количества совпадающих позиций на общее количество позиций в окне сравнения и (с) умножением результата на 100 для получения % гомологии последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено компьютерными реализациями известных алгоритмов или визуальным осмотром. Общедоступными алгоритмами сравнения последовательностей и выравнивания нескольких последовательностей являются, соответственно, "Basic Local Alignment Search Tool"Research 25: 3389-3402, 1997) и программы "ClustalW", которые доступны в сети интернет. Другие подходящие программы включают "GAP", "BESTFIT" и "FASTA" в пакете программ "Wisconsin Genetics"(Genetics Computer Group (GCG), Мэдисон, Висконсин, США). Гомология между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определена со ссылкой на способность последовательностей нуклеиновых кислот гибридизоваться друг с другом после денатурации (например, в условиях 400 мМ NaCl, 40 мМ ПИПЕС рН 6.4, 1 мМ ЭДТА, при температуре от 50 до 65C и при гибридизации в течение 12-16 ч с последующей отмывкой) (Molecular Cloning: a LaboratoryMolecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John WileySons, 1992). Вообще говоря, специалист в данной области вполне способен сконструировать полиомавирусные векторы и спроектировать протоколы для экспрессии рекомбинантных генов. Подходящие векторы могут быть выбраны или сконструированы с тем, чтобы содержать подходящие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминирующие фрагменты, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности по мере необходимости. Более подробную информацию см., например, в Molecular Cloning: a LaboratoryManual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Термин "гетерологичный" применяется в широком смысле на протяжении всего документа для указания того, что рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты, полинуклеотидная последовательность, ген или последовательность нуклеотидов были введены в указанную клеточную линию-6 022206 продуцент полиомавирусного вектора с помощью генной инженерии, т.е. посредством вмешательства человека. Гетерологичный ген, в принципе, может заменять эндогенный эквивалентный ген или может быть дополнительным к эндогенным генам генома клетки-хозяина или полиомавируса, т.е. не встречаться в естественных условиях в виде хозяина или в полиомавирусах. Под "промотором" понимается последовательность ДНК, с которой может инициироваться транскрипция функционально связанной ДНК, расположенной ниже (т.е. в направлении 3' на смысловой цепи двухцепочечной ДНК). "Функционально связанный" означает присоединение в виде части к той же молекуле нуклеиновой кислоты, соответствующим образом позиционированной и ориентированной для транскрипции, которая будет инициироваться с промотора. "Регуляция инициации транскрипции" функционально связанной с промотором ДНК находится под контролем промотора. Промотор может быть конститутивным, индуцибельным или тканеспецифичным промотором. Термины "конститутивный", "индуцибельный" и "тканеспецифичный" применительно к промотору вполне понятны специалистам. Промоторы предпочтительно получают из вирусов, включая длинные 5'-концевые повторы ретровирусов и лентивирусов, немедленно-ранний промотор цитомегаловируса(CMVie), промотор человеческого фактора элонгации альфа (EF-1 alpha) и т.п. Такие промоторы легкодоступны и хорошо известны в данной области."Сигналы полиаденилирования" означают последовательности нуклеотидов, на которых может быть терминирована транскрипция и на которых к транскрипту добавляется поли-А хвост. В качестве сигнала полиаденилирования может быть использован любой сигнал полиаденилирования, применяемый в человеческих и животных клетках. Клеточная линия по изобретению может быть получена из любой подходящей клеточной линии,известной в данной области, такой как MDCK, PER.C6, HEK-293, CV1 и т.п., но предпочтительно из клеточных линий Vero или СНО. Подходящей клеточной линией по изобретению является пермиссивная для полиомавируса клеточная линия, не способная экспрессировать полиомавирусный малый Т-антиген и предпочтительно содержащая следующие генетические элементы:i) домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген или его часть; и необязательноii) селективный маркер, такой как ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к пуромицину,ген устойчивости к гигромицину, или другие маркеры. Такая клеточная линия может быть лишена большого интрона полиомавирусного раннего транскрипта, несущего последовательности, специфичные для малого Т-антигена. Клеточная линия в предпочтительном воплощении может включать транскрипционную энхансерную последовательность, стабильно интегрированную в хромосомную ДНК клеточной линии, так чтобы она могла быть дополнительно отобрана на основе активности транскрипционного энхансера. Такие маркеры и такие процедуры отбора хорошо известны в данной области. Различные клеточные линии для продуцирования полиомавирусных векторов, например клеточные линии-продуценты вектора на основе вируса SV40, могут быть получены трансфекцией клеток различными векторами, такими как плазмиды, в зависимости от их происхождения. Методология трансфекции клеточных линий хорошо известна в данной области. Например, клеточная линия Vero широко используется для продуцирования вирусных частиц для вакцин. Это нашло широкое применение при профилактике вирусных заболеваний. Подходящая клеточная линия может быть получена трансфекцией первой плазмидой, содержащей следующие компоненты:i) домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген или его часть, лишенный большого интрона раннего транскрипта полиомавируса, охватывающего последовательности, специфичные для малого Т-антигена; и необязательноii) селективный маркер, такой как ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к пуромицину,ген устойчивости к гигромицину, и другие маркеры. Таким образом, одиночный вектор или плазмида могут нести как домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген, так и последовательность селективного маркера. Также возможно применение двух отдельных ДНК-векторов или плазмид, одна из которых несет домен, кодирующий полиомавирусный большой Т-антиген, а другая несет селективный маркер, в зависимости от дизайна. Любые дополнительные генетические элементы, которые могут быть необходимы для придания клеточной линиипродуценту способности производить полиомавирусные векторы, также могут быть помещены на один или на несколько ДНК-векторов или плазмид, которые затем могут применяться для трансфекции выбранной клеточной линии-продуцента. Например, клеточная линия-продуцент Vero не содержит последовательности полиомавирусного Т-антигена, так что в нее может быть добавлен домен, кодирующий большой Т-антиген, и полученные в результате клетки-продуценты, несущие в себе домен, кодирующий большой Т-антиген, могут быть отобраны в системе с селективным маркером. Изобретение впервые обеспечивает получение в достаточных количествах композиций, содержащих рекомбинантные полиомавирусные векторы, для терапевтических целей, без риска контаминации полиомавирусом дикого типа, который появляется в результате рекомбинации между полиомавирусной векторной ДНК и ДНК клетки-хозяина. Данный феномен хорошо описан в литературе (Gluzman Y., Cell,23: 175-182, 1981; Oppenheim A. and Peleg A., Gene, 77: 79-86, 1989; Vera M. et al., Molecular Therapy, 10: 780-791, 2004). Частота, с которой данная рекомбинация происходит, менее хорошо документирована. Оценки сильно разнятся. Shaul et al. подсчитали, что рекомбинация происходит с частотой по меньшей мере 10-6 (Shaul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3781-3784, 1985), в то время как более недавние оценки демонстрируют более высокую величину рекомбинации, порядка 10-3 (Arad et al., Virology, 304: 155-159, 2002). Осложняющий фактор в оценке частоты рекомбинации заключается в том, что полиомавирус дикого типа реплицируется быстрее, чем рекомбинантный полиомавирусный вектор, потерявший гены, кодирующие функциональные Т-антигены. В силу вышесказанного было установлено максимальное количество частиц рекомбинатного SV40 вектора, которое может быть произведено в обычной клеточной культуре в соответствии с предшествующим уровнем техники, без проявления каких-либо ревертантов к дикому типу. В силу вышесказанного авторы инфицировали клетки COS-1 частицами рекомбинантного SV40 вектора в соответствии со стандартным протоколом (Vera M. et al., Molecular Therapy, 10: 780-791, 2004) и подсчитали максимальное число частиц вирусного вектора, которое может быть получено без появления индивидуального детектируемого генома вируса дикого типа, который можно обнаружить с помощью очень чувствительного количественного ПЦР-анализа. Было установлено, что в большинстве проведенных экспериментов вплоть до 1104 частиц вирусного вектора может быть получено безопасно без появления детектируемого количества ревертантов дикого типа. Значимое количество препаратов, содержащих 1105 частиц вирусного вектора, однако,было положительно по ревертантам дикого типа, тогда как все препараты, содержащие 1106 частиц вирусного вектора были контаминированы вирусами дикого типа и, таким образом, являлись небезопасными для применения в медицине. Факт того, что препараты полиомавирусного вектора в соответствии с предшествующим уровнем техники являются небезопасными для применения в медицине, подчеркивается тем, что частицы SV40 дикого типа в препаратах, содержащих больше чем 1106 частиц рекомбинантного вектора SV40, были способны инфицировать пермиссивные к SV40 клетки in vitro при проверке в соответствии со способом предшествующего уровня техники, описанным Katzman R.B. et al. (Journal of Virological Methods, 150: 713, 2008). Изобретение впервые делает возможным получение композиции, содержащей больше чем 1106 частиц полиомавирусного вектора без какого-либо присутствия в композиции полиомавирусных частиц дикого типа. Следовательно, изобретение относится к композиции, содержащей больше чем 1106 полиомавирусных частиц, не способных экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген и не способных реплицироваться в клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа. Такие препараты преимущественно могут содержать 1107 векторных частиц или больше, например, вплоть до 1108, 1109, 11010 или 11011 векторных частиц или больше. Выражение "не способные реплицироваться в клетках, которые являются пермиссивными для полиомавируса дикого типа" означает, что в композиции по меньшей мере среди 1106 частиц полиомавирусного вектора нет одиночных частиц полиомавируса-ревертанта к дикому типу. Это может быть измерено либо количественным ПЦР-анализом, как описано Vera M. et al., Molecular Therapy, 10: 780-791,2004, либо инфекцией клеточной линии, пермиссивной для полиомавируса дикого типа, присутствующего в композиции. В последнем случае отсутствие одиночной бляшки в анализе бляшкообразования(Katzman R.В. et al., Journal of Virological Methods, 150: 7-13, 2008) указывает на отсутствие одиночной частицы полиомавируса дикого типа. В предпочтительном воплощении препарат по изобретению относится к композиции, содержащей полиомавирус приматов, такой как обезьяний полиомавирус, более конкретно SV40, обезьяний вирус 12(SV12), лимфотропный полиомавирус, полиомавирус африканской зеленой мартышки или полиомавирус шимпанзе. Клеточные линии, пермиссивные для приматного полиомавируса, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток Vera, CV1, PerC.6, HEK-293 и т.п. В другом воплощении препарат по изобретению относится к композиции, содержащей полиомавирус грызунов, такой как полиомавирус мышей или хомяков, более конкретно мышиный полиомавирус или хомячий полиомавирус. Клеточные линии, пермиссивные для полиомавируса мышей или хомяков,предпочтительно выбирают из группы, состоящей из клеток СНО и т.п. Настоящее изобретение также раскрывает получение вектор-продуцирующих клеточных линий для продуцирования частиц вирусного вектора рекомбинантной полиомы, являющихся безопасными при применении в медицине. Соответственно, изобретение относится к пермиссивной для полиомавируса клеточной линии, способной экспрессировать функциональный полиомавирусный большой Т-антиген и не способной экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген. Такая клеточная линия адекватно поддерживает безопасное продуцирование частиц рекомбинатного полиомавирусного вектора без риска получения частиц полиомавируса, ревертировавших к дикому типу, поскольку хромосомная ДНК данных клеток утратила какие-либо последовательности, имеющие гомологию с ДНК рекомбинатного полиомавируса. Ген, кодирующий большой Т-антиген, предпочтительно является стабильно интегрированным в геном клетки. Термин "рекомбинантный полиомавирусный вектор" в данном контексте интерпретируется как полиомавирус, не способный экспрессировать функциональный полиомавирусный большой Т-антиген,предпочтительно не способный экспрессировать функциональные большой и малый Т-антигены. Такой рекомбинантный вирусный вектор может, например, утратить кодирующую последовательность либо для большого Т-антигена, либо и для большого, и для малого Т-антигенов. Выражение "пермиссивная для полиомавирусов" в данном контексте означает, что клеточная линия поддерживает репликацию полиомавирусных частиц при инфекции полиомавирусом или при внедрении полиомавирусной ДНК трансфекцией или другими средствами доставки ДНК в клетку. В другом аспекте изобретение обеспечивает способ продуцирования рекомбинтных полиомавирусных частиц, не способных экспрессировать функциональный малый Т-антиген, включающий следующие стадии:a) обеспечение пермиссивной для полиомавируса клеточной линии, способной экспрессировать функциональный полиомавирусный большой Т-антиген и не способной экспрессировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген;b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не способной кодировать функциональный полиомавирусный малый Т-антиген;c) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, позволяющих образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; иd) сбор частиц рекомбинантного полиомавируса из клеточной культуры. В предпочтительном воплощении полиомавирусную ДНК вводят в клетку трансфекцией ДНК. В дополнительных аспектах изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для лечения индивидуума, страдающего от заболевания. Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество одного или нескольких полиомавирусных векторов, таких как SV40-вектора,приготовленных в соответствии со способом изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть составлены в любой подходящей форме для введения индивидууму, нуждающемуся в этом. Такие составы могут быть в форме для любого введения, например для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, внутрилимфатического, подкожного, внутриглазного или даже для чрескожного введения. Фармацевтические композиции изобретения, как правило, содержат буферный агент, который корректирует их осмолярность и, необязательно, один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и/или добавок, известных в данной области. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции по изобретению. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси и растительные масла. Правильная текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с помощью поверхностно-активных веществ. Далее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на следующие примеры. Примеры Пример 1. Конструирование SV40-вектора для доставки генов. Разработали шесть олигонуклеотидов:(SEQ ID NO: 3) (содержит последовательно от 5'- к 3'-концу липкий сайт рестрикции для NotI, интактные сайты рестрикции для PadI, SbfI, PmeI и AscI и липкий сайт рестрикции для ClaI);(SEQ ID NO: 4) (содержит последовательно от 5'- к 3'-концу липкий сайт рестрикции для NotI, интактные сайты рестрикции для PadI, SbfI, PmeI и AscI и липкий сайт рестрикции для ClaI);WdV105: CGGGATCCAGACATGATAAGATACATTG (SEQ ID NO: 5) (содержащий сайт рестрикции для BamHI) иWdV106: ATAGTTTAGCGGCCGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGG (SEQ ID NO: 6) (содержащий сайт рестрикции для NotI). Очищенную плазмидную ДНК SV40-вектора pSL-PL (De La Luna, S. et al., Journal of General плифицированный фрагмент ДНК, содержащий сигнал полиаденилирования SV40, фланкирован сайтом рестрикции BamHI на 5'-конце и сайтом рестрикции NotI на 3'-конце. Данный фрагмент с сигналом полиаденилирования SV40 расщепляли с помощью BamHI и NotI, полученный фрагмент ДНК длиной 150 п.н. выделяли из агарозного геля и клонировали в плазмиду pBluescript SK-(Promega), расщепленную таким же образом, для получения рАМ 002. Очищенную ДНК плазмиды pEF5/FRT/5-DEST (Invitrogen) подвергали ПЦР с олигонуклеотидамиWdV101 и WdV102. Полученный амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (БГР), фланкирован последовательно сайтами рестрикции XhoI и NotI на 5'-конце и сайтом рестрикции KpnI на 3'-конце. Данный фрагмент с сигналом полиаденилирования БГР расщепляли с помощью KpnI и NotI, полученный фрагмент ДНК длиной 250 п.н. выделяли из агарозного геля и клонировали в плазмиду рАМ 002, расщепленную таким же образом. Осуществляли трансформацию данной лигазной смесью чувствительного к метилированию штамма E.coli. Это привело к получению плазмиды рАМ 003. Два комплементарных олигонуклеотида WdV103 и WdV104 гибридизовали инкубацией в водяной бане, которая автономно охлаждалась от температуры кипения до комнатной температуры, с получением ДНК-линкера, последовательно содержащего липкий сайт рестрикции NotI, интактные сайты рестрикцииPadI, SbfI, PmeI и AscI и липкий сайт рестрикции ClaI. Данный линкер лигировали в плазмиду рАМ 002,которую расщепляли с помощью NotI и ClaI и выделяли из агарозного геля. Лигазную смесь затем использовали для трансформации чувствительного к метилированию штамма Е.coli, для получения рАМ 004. Очищенную плазмидную ДНК SV40-вектора, pSL-PL, расщепляли с помощью ClaI и BamHI. Полученный в результате фрагмент ДНК длиной 2,6 тыс. п.о., содержащий точку начала репликации SV40 и позднюю область SV40, выделяли из агарозного геля и клонировали в рАМ 004, расщепленную таким же образом. Это привело к получению нового SV40-вектора плазмиды рАМ 005. Пример 2. Молекулярное клонирование экспрессирующего люциферазу SV40-вектора и получение частиц рекомбинантного SV40-вектора с люциферазой. Экспрессирующую плазмиду pGL3 (Promega) использовали в качестве матрицы для клонирования люциферазы светлячка с помощью ПЦР. Разработали два олигонуклеотида:WdV407: 5'-CCCTTAATTAATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 8),содержащие соответственно сайты рестрикции AscI и PacI. Амплифицированный ПЦР фрагмент с люциферазой последовательно расщепляли AscI и PacI и лигировали в рАМ 005 для получения рАМ 006. Разработали два олигонуклеотида:WdV442: ATAGTTTAGCGGCCGCAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTG (SEQ ID NO: 10),содержащие соответственно сайты рестрикции BamHI и NotI. Вектор pSL-PL использовали в качестве матрицы для клонирования трейлерной последовательности большого Т-антигена с помощью ПЦР. Полученный фрагмент ПЦР расщепляли с BamHI и NotI и клонировали по BamHI и NotI в (частично расщепленную) рАМ 006 для получения рАМ 020. Частицы рекомбинантного SV40-вектора, кодирующие люциферазу (SV-Luc), получали по Vera M.et al., Molecular Therapy, 10: 780-791, 2004. Клетки COS-1 трансфицировали расщепленной по NotI и рециркуляризованной ДНК рАМ 020 и через три дня после трансфекции неочищенные лизаты получали из клеточной культуры после многократного проведения замораживания-оттаивания. Частицы вектора SVLuc амплифицировали в один раунд в клетках COS-1, растущих во флаконе Т 175. Окончательно частицы вектора SV-Luc концентрировали и очищали из неочищенного лизата ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы, с получением стока вектора с 51011 копий генома SV-Luc на 1 мл клеточной культуры. Пример 3. Конструирование экспрессирующей плазмиды, кодирующей большой Т-антиген SV40. Синтетический участок множественного клонирования (англ. multiple cloning site, MCS) сконструировали так, чтобы он содержал сайты для NotI, PacI, SbfI, PmeI, AscI и ClaI. Разработали два олигонуклеотида:SK-(Promega) для получения рекомбинантной плазмиды рАМ 007. Разработали два олигонуклеотида для введения дополнительного сайта рестрикции NotI:WdV453: GCGGCCGC. Оба олигонуклеотида гибридизовали и лигировали в рАМ 007 для получения рекомбинантного вектора рАМ 008. Экспрессирующий вектор pLenti6.3A/5DEST - verA (Invitrogen) применяли в качестве матрицы для клонирования цитомегаловирусного немедленно раннего (CMVie) промотора с помощью ПЦР. Разработали два олигонуклеотида:(SEQ ID NO: 15),фланкирующие промотор CMV. Олигонуклеотиды WdV286 и WdV220 содержат сайты рестрикции для AscI и HindIII соответственно. Далее очищенную pLenti6.3A/5DEST verA подвергали ПЦР с олигонуклеотидами WdV286 и WdV220 для получения фрагмента ДНК с промотором CMV. Этот фрагмент расщепляли по AscI и HindIII и лигировали в pBluescript SK- для получения рАМ 009. Экспрессирующий вектор pGL4.22 (Promega) применяли в качестве матрицы для клонирования с помощью ПЦР гена устойчивости к антибиотику, пуромицин N-ацетилтрансферазы. Разработали два олигонуклеотида:WdV455: 3'-TATCCGCTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGC-5' (SEQ ID NO: 17),фланкирующие ген устойчивости к антибиотику, пуромицин N-ацетилтрансферазу и содержащие сайты рестрикции для HindIII и XhoI соответственно. Плазмиду pGL4.22 подвергали ПЦР с олигонуклеотидами WdV454 и WdV455 для получения кДНК пуромицин N-ацетилтрансферазы. Данный фрагмент расщепляли по HindIII и XhoI и лигировали в рАМ 009 для получения рАМ 010. Экспрессирующий вектор pEF5/FRT/5-DEST (Invitrogen) применяли в качестве матрицы для клонирования с помощью ПЦР сигнала полиаденилирования БГР. Разработали два олигонуклеотида:WdV457: 3'-CGGGGTACCCCATAGAGCCCACCGCATCCCC-5' (SEQ ID NO: 19),фланкирующие сигнал полиаденилирования и содержащие сайты рестрикции для XhoI и KpnI соответственно. Плазмиду pEF5/FRTA/5-DEST подвергали ПЦР с олигонуклеотидами WdV456 и WdV457 для получения кДНК сигнала полиаденилирования БГР. Данный фрагмент расщепляли по XhoI и KpnI и лигировали в рАМ 010 для получения pAM011. Плазмиду рАМ 008 расщепляли по AscI и PmeI, фрагмент ДНК, содержащий домен, кодирующий пуромицин N-ацетилтрансферазу, выделяли из агарозного геля и лигировали в рАМ 008 для получения рАМ 012. ДНК полноразмерного клона SV40 (номер АТСС: VRMC-2) применяли в качестве матрицы для клонирования с помощью ПЦР области, кодирующей Т-антиген SV40. Разработали два олигонуклеотида:WdV408: ACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGC (SEQ ID NO: 20), содержащий сайт рекомбинации attB1, иWdV409: TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGG (SEQ ID NO: 21), содержащий сайт рекомбинации attB2.WdV408 и WdV409 применяли для амплификации с помощью ПЦР области генома, кодирующей Тантиген. Затем из образованного фрагмента ДНК и pDONR221 создавали внедряющийся клон "Gatewayentry clone", pAM013. Плазмиду для экспрессии Т-антигена, рАМ 014, получали рекомбинацией по технологии "Gateway" между рАМ 013 и pEF5/FRTA/5-DEST. Сайты рестрикции NotI и PmeI в плазмиде рАМ 014 удаляли расщеплением рАМ 014 по NotI и PmeI с последующей обработкой Т 4 ДНК-полимеразой и повторным лигированием для получения рАМ 015. После этого экспрессирующую Т-антиген кассету выделяли расщеплением по SphI с последующей обработкой Т 4 ДНК-полимеразой и расщеплением по NruI. Для создания шаттл-плазмиды сконструировали два олигонуклеотида:(SEQ ID NO: 23). Олигонуклеотиды WdV448 и WdV449 гибридизовали с получением фрагмента ДНК, который содержит сайты рестрикции для KpnI, SbfI, KpnI, XbaI, SacII, PmeI и SacI. Данный фрагмент ДНК лигировали в pBluescript SK-(Promega), расщепленную по сайтам KpnI и SacI для получения рАМ 016. ПлазмидуpBluescript SK- расщепляли по KpnI и XbaI и выделяли из агарозного геля фрагмент ДНК с MCS. Фрагмент ДНК с MCS лигировали в рАМ 016 по сайтам KpnI и XbaI для получения рАМ 017. Кассету из рАМ 015, экспрессирующую Т-антиген под управлением EF1-альфа, выделяли расщеплением по NruI и SphI с последующей обработкой Т 4 ДНК-полимеразой. Полученный в результате фрагмент ДНК клонировали в рАМ 017, расщепленную по EcoRV для получения рАМ 018. Плазмиду рАМ 018 расщепляли по SbfI и PmeI, фрагмент ДНК, содержащий кассету, экспрессирующую Т-антиген, выделяли из агарозного геля и клонировали в рАМ 012, расщепленную по SbfI иPmeI, для получения рАМ 019. Разработали четыре олигонуклеотида:WdV488: 5'-AGGAATGTTGTACACCATGCATTTTAAAAAGTC-3' (SEQ ID NO: 27). Олигонуклеотиды WdV487 и WdV490 и олигонуклеотиды WdV489 и WdV488 использовали для амплификации первого и второго экзонов большого Т-антигена SV40 соответственно. Оба образованных фрагмента ДНК далее подвергали ПЦР со слиянием, используя олигонуклеотиды WdV487 и WdV488. Полученный фрагмент ДНК, содержащий область, которая кодирует большой Т-антиген SV40, расщепляли по NcoI и NsiI и клонировали в расщепленную таким же образом рАМ 019 для получения pAM001. Таким образом, pAM001 содержит промотор EF1-альфа выше области, кодирующей большой Т-антиген, и промотор CMVie выше области, кодирующей пуромицин N-ацетилтрансферазу. Пример 4. Получение клеточной линии-продуцента Vero и продуцирование частиц рекомбинантного SV40-вектора. Клетки Vero (Sigma-Aldrich номер для заказа: 88020401) наращивали и адаптировали к бессывороточной культуральной среде DMEM (Invitrogen, код продукта: 41966-052). Адаптацию к бессывороточным условиям осуществляли постепенным уменьшением эмбриональной бычьей сыворотки до 8, 6, 4, 2 и 0% в среде каждого пассажа. После этого Vero Serum Free (Vero SF)(бессывороточные Vero) культивировали в среде "OptiPro SFM" (Invitrogen), содержащей 2% Lглутамина при 37C и 5% СО 2. Клетки Vero SF трансфицировали ДНК pAM001 с помощью агента для трансфекции "Exgen 500"(Fermentas, код продукта: R0511) в соответствии с предписаниями поставщика. После этого трансфицированные клетки Vero SF отбирали по интеграции генной кассеты, экспрессирующей большой Т-антигенSV40, в хромосомной ДНК путем добавления 2 мкг/мл пуромицина к культуральной клеточной среде. Выжившие колонии выделяли и наращивали в среде "OptiPro SFM", содержащей 2 мкг/мл пуромицина и 2% L-глутамина. Устойчивые к пуромицину клетки переносили в среду "OptiPro SFM", содержащую 2% L-глутамина и 10% ДМСО, и хранили при -156C. Пример 5. Отбор субклонов SuperVero, высокопродуктивных по SV40. Трансфицированные pAM001, устойчивые к пуромицину клоны Vero, и контрольные клетки VeroSF культивировали до достижения ими 50%-ной конфлюэнтности. Клеточные культуры трансдуцировали 50 мкл векторного стока SV-Luc, содержащего примерно 2,51010 копий векторного генома. Через 4 ч после трансдукции культуральную среду заменяли свежей средой "OptiPro SFM", содержащей 2 мкг/мл пуромицина и 2% L-глутамина. Через три дня после трансдукции из трансдуцированных клеток замораживанием-оттаиванием получали неочищенные лизаты (Vera M. et al., Molecular Therapy,10: 780-791, 2004). Клетки COS-1, культивируемые в среде DMEM, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (Invitrogen), трансдуцировали 100 мкл неочищенного лизата каждого устойчивого к пуромицину и трансфицированного pAM001 клона клеток Vero SF. После этого через два дня после трансдукции в клетках COS-1 проверяли экспрессию люциферазы светлячка, которую использовали в качестве количественной меры продуцирования вектора SV-Luc в соответствующем устойчивом к пуромицину и трансфицированном pAM001 клоне клеток Vero SF. Клеточные клоны, продемонстрировавшие уровень экспрессии люциферазы, сопоставимый уровням клеток COS-1, отбирали, размножали и наращивали для образования банка клеток. Клеточный клон Vero SF001-86 неоднократно проверяли на продуцирование SV-Luc и данный клон производит количества частиц рекомбинатного SV40-вектора, сравнимые с количествами в COS-1. Полученный методом серийных разведений клеточный субклон VeroSF001-86, обозначенный как Vero SF001-86-01, постоянно продуцирует количества частиц рекомбинантного SV40-вектора, сравнимые с количеством частиц родительского клона клеток, Vero SF001-86. Количественный ПЦР по Vera M. et al., Molecular Therapy, 10: 780-791, 2004, показал, что клеточный клонVero SF001-86-01, обозначенный как SuperVero, как правило, продуцирует 1-101011 копий генома вектора на 1 мл клеточной культуры. Пример 6. Молекулярное клонирование вектора, используемого для получения рекомбинантных белков в клетках SuperVero. Точку начала репликации SV40 выделяли с помощью ПЦР из pTracer-SV40 (Invitrogen) и клонировали в плазмиду pGL3, экспрессирующую люцефиразу светлячка (Promega), для получения экспрессирующего вектора рАМ 006. Затем клетки SuperVero трансфицировали очищенным рАМ 006 и ДНК контрольного экспрессирующего вектора pGL3. Экспрессию люциферазы измеряли через три дня после трансфекции. Клетки SuperVero, трансфицированные рАМ 6, продуцируют значительно больше люциферазы светлячка по сравнению с клетками, которые были трансфицированы контрольной pGL3. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген полиомавируса, включающий следующие стадии:a) обеспечение пермиссивной для полиомавируса дикого типа клеточной линии, кодирующей функциональный большой Т-антиген полиомавируса и не кодирующей функциональный малый Тантиген полиомавируса;b) введение в указанную клеточную линию полиомавирусной ДНК, не кодирующей функциональный малый Т-антиген полиомавируса;c) культивирование указанных клеток в ростовой среде в условиях, в которых клеточная линия продуцирует большой Т-антиген in trans и позволяет образование частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора; иd) сбор частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора из клеточной культуры. 2. Композиция, содержащая частицы рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген и не кодирующего большой Т-антиген полиомавируса, полученные способом по п.1. 3. Композиция, содержащая больше 1 млн частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора, не кодирующего функциональный малый Т-антиген полиомавируса и не кодирующего большой Т-антиген полиомавируса, указанные полиомавирусные частицы не способны реплицироваться в пермиссивных для полиомавируса дикого типа клетках, отличающаяся тем, что не содержит ни одной полиомавирусной частицы, способной реплицироваться в пермиссивных для полиомавируса дикого типа клетках, не экспрессирующих функциональный большой Т-антиген полиомавируса. 4. Композиция по п.3, в которой полиомавирус является полиомавирусом приматов. 5. Композиция по п.4, в которой полиомавирус является обезьяньим полиомавирусом. 6. Композиция по п.5, в которой полиомавирус выбирают из группы, состоящей из SV40, SV12,лимфотропного полиомавируса, полиомавируса африканской зеленой мартышки и полиомавируса шимпанзе. 7. Композиция по п.6, в которой полиомавирус является полиомавирусом SV40. 8. Пермиссивная для полиомавируса клеточная линия, кодирующая полиомавирусный большой Тантиген и не кодирующая функциональный полиомавирусный малый Т-антиген, где указанный ген, кодирующий большой Т-антиген полиомавируса, стабильно интегрирован в геном клетки. 9. Применение клеточной линии по п.8 для получения рекомбинантных белков. 10. Применение композиции по любому из пп.2-7 для получения лекарственного средства для лечения заболевания. 11. Применение по п.10, где заболевание выбрано из генетических заболеваний, отторжения трансплантата, аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний, аллергий или злокачественных новообразований.

МПК / Метки

МПК: C12N 15/86

Метки: полиомавирусного, получения, рекомбинантного, частиц, вектора, способ

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/19-22206-sposob-polucheniya-chastic-rekombinantnogo-poliomavirusnogo-vektora.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения частиц рекомбинантного полиомавирусного вектора</a>

Похожие патенты