Способ получения партий рекомбинантного аденовируса и используемые для этого пакующие клетки

010924 Область изобретения Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии, более конкретно, к пакующим клеткам и их применению для получения партий рекомбинантного аденовируса. Предпосылки изобретения Дефектные по репликации рекомбинантные аденовирусы могут использоваться, например, в генотерапии и для целей вакцинации. Как правило, у них отсутствует область Е 1 аденовируса и, следовательно, они размножаются в комплементирующих клетках, содержащих последовательности Е 1. Пакующие клетки обладают всей информацией, необходимой для репликации вектора, который упаковывается в клетках с получением рекомбинантных вирусных частиц. Примером пакующей клетки является клетка 293, содержащая нуклеотиды 1-4344 генома аденовируса 5 (Louis et al., 1997), включающие в себя 5' инвертированный концевой повтор (ITR), сигнал упаковки, кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В и кодирующие последовательности pIX. Совпадение последовательностей аденовируса в пакующей клетке и вектора может приводить к гомологичной рекомбинации между этими последовательностями, что приводит к получению способного к репликации аденовируса (RCA) (Lochmuller et al., 1994). Эта проблема была решена посредством применения системы упаковки, состоящей из клеточной линии и вектора, которые подобраны таким образом,что не содержат таких совпадающих последовательностей (Fallaux et al., 1998; патент США 5994128). В частности, одним из примеров применяемой клеточной линии в таких случаях является клеточная линияPER.C6 (патент США 5994128; Nichols et al., 2002). Недавно было опубликовано, что при применении клеток PER.С 6 в сочетании с вектором, попрежнему содержащим последовательность 177 п.о., гомологичную последовательностям Е 1 в геномеPER.C6, единичное событие кроссинговера может с небольшой частотой привести к образованию зависимого от хелперной последовательности, способного к репликации вируса (Murakami et al., 2002). Полученный атипичный RCA обозначили как зависимую от хелпера, содержащую Е 1 частицу (HDEP). Как и следовало ожидать, возникновения частиц такого типа избегали при применении вектора с отсутствием перекрывания последовательности с последовательностями Е 1 в геноме клеток PER.C6 (Murakami etal., 2002). Однако неожиданно было обнаружено, что при использовании системы подобранных вектора и клеток PER.C6 в некоторых партиях рекомбинантного аденовируса с низкой частотой происходит загрязнение частицами, которые могут вызывать цитопатологический эффект (СРЕ) в клетках с отсутствующими последовательностями E1. Частица зависит от хелпера и содержит последовательности Е 1, а следовательно также представляет собой HDEP. Эта HDEP образуется в отсутствие существенной гомологии между вектором и пакующей клеткой (см. Murakami et al., 2004). Хотя контролирующие органы считают, что RCA может вызвать трудности при клиническом применении, и визуализация RCA в партиях также осложнена (USDHHS, FDA, CBER. Guidance for Industry, Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy, March 1998), аспекты безопасности HDEP не ясны. HDEP дефектна по репликации,так как у нее отсутствуют необходимые для автономной репликации вирусные гены и, следовательно,HDEP не будет распространяться в организме хозяина. Однако нельзя исключить теоретическую возможность того, что присутствие рекомбинантного вектора или аденовируса дикого типа в той же клетке может вызвать восстановление и распространение HDEP. Следовательно, существует по меньшей мере потенциальная необходимость в средствах и способах для профилактики образования содержащих Е 1 частиц при получении партий частиц рекомбинантных аденовирусов. Для этой цели в настоящем изобретении предоставлены способы получения новых клеточных линий, новые клеточные линии и их применение для получения партий рекомбинантных аденовирусных векторов без RCA и HDEP. Описание фигур Фиг. 1 - карта pIG.E1A; фиг. 2 - карта pIG.E1AB21; фиг. 3 - карта рЕ 1 В; фиг. 4 - карта pCC.E1A; фиг. 5 - карта рСС.Е 1 АВ 21; фиг. 6 - карта pCC101; фиг. 7 - карта рСС 105; фиг. 8 - карта pCC.55Kcol; фиг. 9 - карта pIG.E1B; фиг. 10 - карта pCC.E1Bcol; фиг. 11 - карта pEC.E1B; фиг. 12 - карта pSC.55K; фиг. 13 - пример дизайна макромолекул, которые могут использоваться для трансформации первичных клеток.I: схематическое представление отдельного космидного вектора с кодирующими областями белков Е 1 А и Е 1 В (А и В, соответственно), фланкированных спейсерной ДНК. RE = участок распознавания ре-1 010924 стрикционного фермента, не представленный в спейсерной ДНК или последовательностях Е 1.II: схематическое представление двух отдельных нуклеиновых кислот (например, плазмиды или космидного вектора), несущих кодирующие области или Е 1 А (А) , или Е 1 В (В) , фланкированные спейсерной ДНК.III: Ситуация, которая может произойти после трансформации и интеграции в геном первичной клетки-хозяина молекулы I или двух молекул II. В геноме хозяина вставка состоит из области Е 1 А и области Е 1 В, разделенных спейсерной ДНК и второй копии данного фрагмента/данных фрагментов в инвертированной ориентации. J: соединение между инвертированным повтором. Если в рекомбинантном аденовирусе часть таких последовательностей (указано стрелками) рекомбинирует, то геном становится слишком большим для упаковки. ITR: инвертированный концевой повтор, Ф: сигнал упаковки, FI: фрагмент, вставленный в рекомбинантный аденовирус, содержащий здесь последовательности концевых повторов. Хотя присутствие инвертированного повтора может оказать помощь в необходимой далее стадии удаления из вирусного генома других последовательностей, тем не менее присутствие последовательности инвертированного повтора приводит геном вируса к удвоению в виде зеркального отображения левого конца рекомбинированного вируса в течение репликации и образует геном (удвоенный фрагмент, DF),который опять является слишком большим для упаковки из-за спейсерной ДНК. Фиг. 14 - карта pIG.E1A.E1B; фиг. 15 - карта рСС 200; фиг. 16 - карта рСС 205; фиг. 17 - карта pdys44; фиг. 18 - карта р 44-1.ссЕ 1 А; фиг. 19- Вестерн-блоты белковых лизатов полученных клеточных линий. Дорожки: 1: HER01-B-71,2: HER01-H-86, 3: HER01-H-87, 4: HER01-H-88, 5: HER01-H-89, б: HER01-B-90, 7: клетки HER01 pn06, 8: клетки PER.C6; фиг. 20 - демонстрация комплементации аденовирусных векторов с делецией Е 1 с трансформированными клеточными клонами. -: отрицательный контроль; MOF: средняя флуоресценция; В-71, В-90, Н 86, Н-87, Н-88, Н-89: полученные трансформированные клеточные клоны. Фиг. 21 - схематический обзор конструкций Ad5.El, используемых для трансфекции в примере 3. Указаны участки рестрикции, применяемые для расщепления геномной ДНК и для получения фрагментов-зондов. Фрагменты ДНК Е 1 А и Е 1 В искусственно связаны нуклеотидом, с нумерацией, начиная от 5'-конца содержащего Е 1 А фрагмента. Фиг. 22: Схематическое представление некоторых вариантов осуществления изобретения (без соблюдения масштаба). Регулирующие последовательности (такие как промоторы и сигналы polyA) не показаны.A. Природная конфигурация области Е 1 генома аденовируса: за Е 1 А следует Е 1 В, состоящий из Е 1 В-19K и Е 1 В-55K. Между Е 1 А и Е 1 В отсутствует спейсерная последовательность. Пакующие клетки предшествующей области сконструированы путем введения ДНК в данной конфигурации, и, следовательно, также несут в своем геноме область Е 1 в данной конфигурации.B. Две простейшие из возможных конфигураций по настоящему изобретению, где в области Е 1 находится спейсер (или балласт). 1. Балласт вводили между Е 1 А и Е 1 В-19K. 2. Балласт вводили между Е 1 В-19K и Е 1 В-55K. Основной причиной является увеличение расстояния между Е 1 А, Е 1 В-19K и Е 1 В 55K по сравнению с природным положением для уменьшения вероятности или полного предотвращения одновременного попадания данных трех открытых рамок считывания в одну аденовирусную частицу(предотвращение RCA и HDEP). Для получения клеточной линии по изобретению балласт должен состоять по меньшей мере из 4 т.п.н., где указанная клетка, содержащая в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е 1 А и Е 1 В-55K и Е 1 В-19K, характеризуется тем, что в указанной клетке отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В в указанном геноме разделены менее чем 4 т.п.н. Порядок открытых рамок считывания не имеет значения, поскольку все они присутствуют в геноме так, чтобы экспрессировать Е 1 А, Е 1 В-19K и Е 1 В-55K. Таким образом, порядок может быть E1A-E1B/19k-E1B/55k, E1B/19kЕ 1 В/55k-Е 1 А, E1B/55k-E1B/19k-E1A, E1B/55k-E1A-E1B/19k или E1B19k-E1A-E1B55k. Если E1B/19k иE1B/55k расположены рядом, то они могут находиться в одной транскрипционной единице или в отдельных транскрипционных единицах, это не важно для настоящего изобретения. Обе конфигурации (1 и 2) способны образовывать клеточные линии, которые удовлетворяют критериям изобретения. При длине балласта по меньшей мере 6, 8, 10, 15 или 34,5 т.п.н. могут быть получены клетки по изобретению со всеми тремя открытыми рамками считывания, но с отсутствующими участками последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В в их геноме разделены менее чем 6, 8, 10, 15 или 34,5 т.п.н. Это означает, что когда один фрагмент, содержащий одновременно Е 1 А + Е 1 В-19K + Е 1 В-55K, должен происходить из генома полученных клеток, то данный фрагмент должен состоять по меньшей мере из 7 т.п.н. (балласт из 4 т.п.н.), 9 т.п.н. (балласт из 6 т.п.н.), и тому подобное по меньшей мере до 37,5 т.п.н. (балласт из 34,5 т.п.н.), в отличие от ситуации А, когда последовательности можно найти во фрагменте длиной только 3 т.п.н. генома пакующих клеток, получен-2 010924 ных с такими конструкциями (открытые рамки считывания Е 1 А + Е 1 В-19K + Е 1 В-55K вместе содержат приблизительно 3 т.п.н.). С. Дополнение к варианту В: так как фрагменты, показанные в В, могут интегрировать, примыкая друг к другу, балласт в предпочтительных вариантах осуществления изобретения также может располагаться перед Е 1 А и/или после Е 1 В (предотвращает непосредственную близость Е 1 В первого повтора с Е 1 А второго повтора). Показан геном полученной пакующей клетки, в которой присутствуют две копии области Е 1 вместе с балластной ДНК при интеграции с примыканием друг к другу в тандемный повтор. Эти пакующие клетки по изобретению несут в своем геноме интегрированные Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В 55K, но не содержат в своем геноме участков нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В разделены менее чем 4 т.п.н., и т.д., в зависимости от длин балласта (который должен в данном примере представлять собой по меньшей мере 4 т.п.н. между Е 1 А и Е 1 В-19K(номер 1) или между Е 1 В-19K и Е 1 В-55K (номер 2), и по меньшей мере 2 т.п.н. вверх от Е 1 А и 2 т.п.н. вниз от Е 1 В-55K (вместе составляющих 4 т.п.н. при интеграции в непосредственной близости). Описание изобретения В изобретении описаны способы получения пакующих клеток, содержащих аденовирусные последовательности Е 1 А и Е 1 В, где кодирующие области Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В в геноме клетки отделены друг от друга. Для этой цели предоставлены по меньшей мере три варианта осуществления. В первом варианте осуществления Е 1 А и Е 1 В можно вводить в клетку-предшественника в различные моменты времени, уменьшая шанс совместной интеграции Е 1 А и Е 1 В в одном и том же хромосомном положении. Во втором варианте осуществления шансы совместной интеграции в том же самом локусе уменьшают посредством введения кодирующих последовательностей Е 1 А и Е 1 В в клеткупредшественника посредством двух разных молекул, у которых отсутствуют перекрывающиеся последовательности, которые в ином случае могут приводить к гомологичной рекомбинации между данными последовательностями. В третьем варианте осуществления кодирующие области Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В вводят посредством молекулы нуклеиновой кислоты, в которой данные последовательности разделены заданным расстоянием. Должно быть понятным, что в третьем варианте осуществления вместо одной молекулы нуклеиновой кислоты также можно ввести больше молекул нуклеиновых кислот,которые удовлетворяют условию, что кодирующие области Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В, разделены заданным расстоянием, если две или более молекул будут образовывать одну молекулу, например, посредством лигирования, рекомбинации и тому подобное. Полученные в результате пакующие клетки характеризуются тем, что кодирующие области Е 1 А и обоих Е 1 В находятся на расстоянии друг от друга и, следовательно, шансы того, что кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В вместе включатся в геном рекомбинантного аденовируса, размножающегося в таких пакующих клетках, снижены. Изобретение относится к способу получения клетки, способной к комплементации аденовирусных векторов в отсутствие Е 1, без получения зависимых от хелпера, содержащих Е 1 частиц, предусматривающему стадии: а) введения в предшественник или клетку-прародитель последовательности(ей) нуклеиновой кислоты, кодирующих функциональные гены Е 1 А и функциональные гены Е 1 В, или если клетка-предшественник уже содержит один из функциональных генов Е 1 А или Е 1 В, другие функциональные гены Е 1 А и Е 1 В; и b) отбор или идентификация клеток с приобретенными Е 1 А и Е 1 В в хромосомной конфигурации, предотвращающей формирование зависимых от хелпера содержащих Е 1 частиц,когда клетки применяют для комплементации рекомбинантного аденовирусного вектора с отсутствием одного или нескольких функциональных генов Е 1, где у указанного вектора отсутствуют последовательности нуклеиновой кислоты, обладающие значительным перекрыванием с расположенной на хромосоме последовательностью Е 1, которое, в ином случае, может приводить к гомологичной рекомбинации. В одном из аспектов изобретение относится к способу получения клетки, несущей в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В-55K, где последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие указанные последовательности вводят в клетку-предшественник, где способ отличается тем, что а) в клетку-предшественник вводят по меньшей мере две молекулы нуклеиновой кислоты, совместно содержащие указанные последовательности, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В находятся на различных молекулах нуклеиновой кислоты, которые вводят в клетку-предшественник в различные моменты времени и где указанная клетка-предшественник не является клеткой почки детеныша крысы; или b) в клетку-предшественник вводят молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую последовательность Е 1 А, и молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующие последовательности Е 1 В, где у указанных молекул нуклеиновой кислоты отсутствует существенное перекрывание, которое в ином случае могло бы приводить к гомологической рекомбинации между указанными по меньшей мере двумя молекулами; или с) указанные последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В разделены по меньшей мере 4 т.п.н. на одной молекуле нуклеиновой кислоты или на двух или более молекулах нуклеиновой кислоты, когда они могут формировать одну молекулу нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления с) указанные последовательности разделены по меньшей мере 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 34,5-3 010924 т.п.н. или более. Предпочтительно разделяющие последовательности не являются последовательностями Е 1, так что интеграция обеих экспрессионных кассет Е 1 А и Е 1 В вместе в один вирусный геном представляется очень маловероятной или невозможной. Альтернативно, когда последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В разделены посредством 0-15 т.п.н., можно применять скрининг на отсутствие инвертированных повторов последовательностей Е 1 в полученных клетках для выбора клеток, где возможность получения HDEP при размножении рекомбинантного аденовируса в полученных клетках уменьшена или отсутствует. Изобретение также относится к клеткам, полученным способом по изобретению. Кроме того, изобретение относится к клеткам, содержащим в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е 1 А и Е 1 В-55K и Е 1 В-19K, характеризующиеся тем, что в указанных клетках отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В в указанном геноме разделены менее чем 4 т.п.н. Предпочтительно, в указанных клетках отсутствуют последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В в указанном геноме разделены менее чем 10 т.п.н., более предпочтительно в указанных клетках отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты,где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В в указанном геноме разделены менее чем 34,5 т.п.н. В другом аспекте изобретение относится к способу получения клеток, содержащих аденовирусные последовательности Е 1, где указанные последовательности Е 1 включают кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В, отличающемуся тем, что указанный способ предусматривает стадию отбора клеток с отсутствием инвертированных повторов, содержащих указанные последовательности Е 1. Кроме того, изобретение относится к клеткам, содержащим в своем геноме аденовирусные последовательности Е 1, где указанные последовательности Е 1 включают кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В, отличающимся тем, что указанные последовательности Е 1 не представлены в указанном геноме в форме инвертированных повторов. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные клетки содержат в своем геноме по меньшей мере две копии указанных аденовирусных последовательностей, которые могут находиться на одной и той же хромосоме. В другом варианте осуществления указанные клетки содержат в своем геноме одну копию указанных последовательностей Е 1, и у них в геноме дополнительно отсутствуют последовательности, кодирующие (функциональный) pIX аденовируса. В другом аспекте изобретение относится к способу получения партии рекомбинантного аденовируса с делецией в области Е 1, предусматривающему стадии а) введения указанного рекомбинантного аденовируса в клетку, содержащую последовательности Е 1 аденовируса, способную к комплементации удаленных последовательностей Е 1 указанного рекомбинантного аденовируса; b) культивирования указанных клеток и сбора указанного рекомбинантного аденовируса, где способ отличается тем, что клетка представляет собой клетку по данному изобретению. Специалистам в данной области понятно, что вместо введения указанного рекомбинантного аденовируса также возможно осуществить получение рекомбинантного аденовируса, применяя один или несколько фрагментов нуклеиновой кислоты, способных формировать геном указанного рекомбинантного аденовируса, и которые после репликации и упаковки в указанных клетках формируют указанный рекомбинантный аденовирус. Таким образом, для данного варианта осуществления рекомбинантный аденовирус также может представлять собой геном рекомбинантного аденовируса. В предпочтительном варианте осуществления, у указанного рекомбинантного аденовируса, по существу, отсутствует перекрывание последовательностей с последовательностями Е 1,находящимися в указанной клетке, которое в противном случае могло бы привести к гомологичной рекомбинации. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к пакующей системе, включающей в себя пакующую клетку, содержащую в своем геноме последовательности Е 1 и рекомбинантный аденовирусный вектор с делецией в области Е 1, где в геноме указанного вектора по существу отсутствует перекрывание с последовательностями Е 1 в геноме указанной пакующей клетки, отличающейся тем, что указанная пакующая клетка представляет собой клетку по настоящему изобретению. Подробное описание изобретения Способныйк репликации аденовирус (RCA) представляет собой аденовирусную частицу, способную к репликации в клетках без необходимости в аденовирусе-хелпере. Как используется здесь, под"HDEP" (зависимая от хелпера частица, содержащая Е 1) понимают вирусную частицу, содержащую, по меньшей мере, кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В-55K аденовируса, где указанная частица не способна к репликации в клетке в отсутствие функциональных Е 1 А и/или Е 1 В-55K без "вируса-хелпера". Вирус-хелпер может представлять собой аденовирус дикого типа или мутантный аденовирус, а также любой аденовирусный вектор, обеспечивающий функции, отсутствующие в HDEP, и, следовательно,может быть обеспечен посредством (дефектного по Е 1) рекомбинантного аденовируса с желательным продуктом, размноженного в пакующих клетках. Для размножения аденовируса необходимы последовательности Е 1 А и Е 1 В 55K. Как правило, HDEP дополнительно содержит кодирующие последовательности Е 1 В-19 К. Последовательности Е 1, находящиеся в HDEP, должны быть способны комплементировать дефектные по Е 1 рекомбинантные аденовирусы, которые могут служить в качестве вируса-хелпера дляHDEP. HDEP можно получить посредством гомологической рекомбинации на участках перекрывания между последовательностями Е 1 в пакующей клетке и векторе (Murakami et al., 2002), но как было не-4 010924 ожиданно показано в нескольких исследованиях, HDEP также может образовываться в отсутствие существенной гомологии/перекрывания между последовательностями в пакующей клетке и векторе, т.е. посредством процесса, называемого здесь как негомологичная рекомбинация (см., например, Murakami etal., 2004 для обзора возможных структур HDEP). Следовательно, как используется здесь, "существенное перекрывание" определяют как перекрывание, достаточное для гомологичной рекомбинации. В любом варианте осуществления, когда изобретение относится к "отсутствию существенного перекрывания",полагают, что данное условие выполнено, если перекрывание присутствует не более чем в 50 нуклеотидах (нт), предпочтительно, менее чем 40 нт, более предпочтительно, менее чем 30 нт, еще более предпочтительно, менее чем 20 нт, еще более предпочтительно, менее чем 10 нт, наиболее предпочтительно полное отсутствие перекрывания. Хотя механизм формирования HDEP в настоящее время понят не полностью, ясно, что последовательности Е 1 происходят из генома пакующей клетки. Присутствие последовательностей Е 1 в партиях рекомбинантных аденовирусов нежелательно, если оно в форме RCA или HDEP. Изобретение относится к способам и средствам, минимизирующим шанс образования HDEP. Кроме того, предоставлены способы получения клеток и образующиеся в результате клетки, где указанные клетки несут Е 1 А и Е 1 В в хромосомной конфигурации, предотвращающей одновременное введение в рекомбинантный аденовирус кодирующих последовательностей Е 1 А и Е 1 В, и, следовательно, формирование HDEP в отсутствие существенного перекрывания последовательностей между вектором и расположенных на хромосомах комплементирующих клеток по изобретению последовательностей Е 1, когда клетки применяют для комплементации рекомбинантных аденовирусных векторов с отсутствием Е 1. С этой целью конформация хромосом клеток по одному из вариантов осуществления изобретения такова, чтобы кодирующие области Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В в геноме новых клеток были разделены. Так как полагают, что инвертированные повторы вносят вклад в формирование HDEP посредством стимуляции делеции аденовирусных последовательностей, то в другом варианте осуществления изобретение относится к клеткам,содержащим кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В, где последовательности Е 1 в геноме указанных пакующих клеток не представлены в конформации инвертированных повторов. Клетки по изобретению содержат в своем геноме аденовирусные кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В, а предпочтительно они содержат в своем геноме кодирующие последовательности для всех функциональных белков Е 1 А и обоих Е 1 В (Е 1 В-55 К и Е 1 В-19 К). Белки Е 1 А и по меньшей мере один из Е 1 В по изобретению могут быть одного и того же серотипа или, необязательно, могут быть различных серотипов. Предпочтительно, в вариантах осуществления по меньшей мере один из Е 1 А и Е 1 В регулируется промотором, отличным от промотора Е 1 А и Е 1 В, соответственно. Клетки по изобретению Рекомбинантный аденовирус может быть способен к включению в себя более 20 т.п.н. ДНК клеточной пинии, в которой он размножается, а максимум длины генома аденовируса, позволяющей эффективную упаковку, составляет приблизительно 38 т.п.к. (для вектора, основанного на аденовирусе типа 5; эта цифра может до некоторой степени зависеть от серотипа). Такую особенность используют для получения новых комплементирующих клеток по изобретению, где указанные клетки содержат кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В и указанные клетки характеризуются тем, что указанные последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В в указанном геноме разделены посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно, по меньшей мере 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. Это обозначает, что в геноме таких клеток отсутствуют участки последовательности нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В разделены менее чем 4, 10 или 34,5 т.п.н., соответственно (см., например, фиг. 22 для схематического представления). Понятно, что везде, где в настоящем изобретении указано, что две последовательности в геноме клетки разделены по меньшей мере заданным расстоянием, это требование также считают выполненным, если две последовательности находятся в разных хромосомах. Таким образом, как используют здесь, вариант осуществления, где две последовательности находятся на разных хромосомах, однозначно включен в значение "по меньшей мере х т.п.н. одна от другой" или "разделенные посредством по меньшей мере х т.п.н." в геноме. Такой вариант осуществления можно легко проверить известными специалистам в данной области способами, например, посредством флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), которую можно использовать для определения местоположения хромосомы и/или определения местоположения на хромосоме,где находится данная последовательность. Клетки по изобретению содержат в своем геноме аденовирусные последовательности и, предпочтительно, указанные аденовирусные последовательности кодируют все белки Е 1, но отсутствуют последовательности, кодирующие pIX или его часть (т.е. такие клетки, предпочтительно, не содержат последовательностей из открытой рамки считывания pIX (для клеток с последовательностями E1 Ad5 это означает что они, предпочтительно, не содержат нуклеотиды 3609-4031 из wt Ad5 или части из них), а более предпочтительно, у них также существуют делеции в промоторе pIX (для клеток с последовательностями Е 1Ad5, предпочтительно, нет последовательностей промотора pIX ниже нуклеотида 3550, более предпочтительно, 3525 для предотвращения значительного перекрывания с аденовирусными векторами, несу-5 010924 щими pIX под контролем его собственного промотора. Отсутствие последовательностей pIX в геноме пакующих клеток помогает предотвратить перекрывание между указанным геномом и рекомбинантным аденовирусным вектором (патент США 5994128). Клетки по изобретению можно получать из иммортализованных клеток, таких как А 549, Hela и т.п.,при этом для определения клеток необходим селективный маркер. Предпочтительно клетки по изобретению получают из первичных клеток, при этом селекцию обеспечивают посредством трансформирующей активности Е 1 А и Е 1 В (см. примеры). В предпочтительных аспектах указанные клетки получают из клеток сетчатки. Они могут представлять собой клетки любого происхождения, включая человеческие клетки. Для размножения человеческого аденовируса предпочтительны клетки человека. Также клетки могут быть, например, бычьими для размножения рекомбинантного бычьего аденовируса (патент США 6379944). Специалисты в данной области могут выбрать источник клеток, сочетающийся с выбранным рекомбинантным аденовирусом. В одном из аспектов клетки получают из первичных клеток сетчатки человека (также обозначаемых как клетки HER). Иммортализация таких клеток аденовирусными последовательностями Е 1 описана,например, в патенте США 5994128, у Byrd et al., 1982, 1988 и Gallimore et al., 1986. Первичные клеткиHER могут быть выделены из эмбрионов (Byrd et al., 1982, 1988). В других вариантах осуществления клетки получают из первичных клеток эмбриональной почки человека (см., например, Graham et al.,1977). В других вариантах осуществления клетки получают из первичных амниоцитов, таких как первичные человеческие амниоциты (см., например, патент США 6558948 о способах иммортализации первичных амниоцитов аденовирусными последовательностями Е 1). Получение клеток Клетки по настоящему изобретению могут быть получены посредством введения кодирующих последовательностей аденовирусных Е 1 А и Е 1 В-55K и Е 1 В-19K в клетку-предшественник или клеткупрародитель (таким образом, клетки получают из клетки-предшественника или клетки-прародителя введением в них последовательностей Е 1). По данному изобретению указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В следует вводить в указанные клетки-предшественники в разъединенном виде. Как используется в данном дополнительном значении, "разъединенный" означает указание на конфигурацию, отличающуюся от природной конфигурации Е 1 А и Е 1 В, обнаруженной в аденовирусе, т.е. непосредственно примыкая друг к другу (см., например, фиг. 14, где показана природная, т.е. "соединенная", конфигурация Е 1 А и Е 1 В, как находится в плазмиде pIG.E1A.E1B). Необходимо отметить, что до настоящего изобретения специалисты в данной области, желающие получить пакующие клетки, содержащие в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е 1 А и обоих Е 1 В,не рассматривали введение последовательностей Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В в разъединенном виде, так как а) это является более трудоемким и, следовательно, менее удобным, и так как b) для иммортализации необходимы обе последовательности Е 1 А и Е 1 В. В предыдущих исследованиях, проведенных для понимания трансформирующих возможностей белков Е 1 А и Е 1 В, показано, что введение кодирующих последовательностей Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1B может приводить к определенным клонам (van den Elsen et.al., 1982; Gallimore et al., 1986; Jochemsen et al., 1987; Rao et al., 1992;Nevels et al., 2001). Однако, совместное введение таких плазмид и/или перекрывание между вводимыми последовательностями, например, в плазмидных последовательностях, регуляторных последовательностях, таких как промотор и/или сигнале полиаденилирования, и перекрывающейся последовательности Е 1 В-55K и Е 1 В-19K, вероятно, приводит к совместной интеграции кодирующих областей Е 1 А и обоих Е 1 В в один и тот же локус генома. В самом деле, такую совместную интеграцию наблюдали van den Elsen et al. (1982). В одном из случаев (Jochemsen et al., 1987) для изучения влияния экспрессии Е 1 В на экспрессию Е 1 А клетки почки детеныша крысы (BRK) сначала трансфицировали Е 1 А, а отобранные клоны затем трансфицировали плазмидой с Е 1 В. Очевидно, что данное исследование проводили на конкретном типе клеток и по причине, не связанной с описанным в данной заявке изобретением. До настоящего изобретения не существовало причины для отдельной трансфекции кодирующих последовательностей Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В, с целью получения пакующих клеток. Формирование HDEP в отсутствие существенного перекрывания между геномом рекомбинантного аденовируса и пакующей клетки до настоящего времени описано не было. Кроме того, Gallimore et al. (1986) описали, что клетки человека очень редко морфологически трансформируются посредством только экспрессии Е 1 А и большинство клонов погибало in situ или сразу после выделения, что служило веским аргументом против использования специалистом в данной области такого способа для получения клеток, отличных от клеток, полученных из BRK, например, клеток человека. Единственный случай, когда плазмида, экспрессирующая E1AAd12 (подгруппа А), приводила к образованию клона, выявили через 114 суток после трансфекции, а смогли отобрать только после того, как клон разросся в чашке. Очевидно, что специалист в данной области мог быть не мотивирован к введению генов Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В в клеткипредшественники в различные моменты времени, основываясь на предшествующем уровне техники. Достоинством настоящего изобретения является то, что в нем предоставлены такие способы получения клеток, несущих в их геноме разделенные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одну из Е 1 В. В определенных аспектах клетки по настоящему изобретению предпочтительно представляют-6 010924 собой клетки, не являющиеся клетками почки детеныша крысы (BRK). В одном из предпочтительных аспектов клетки по изобретению являются человеческими клетками. В предпочтительном аспекте клетки получают из клеток HER. Следует понимать, что в геноме клеток, в которые по настоящему изобретению вводят последовательности Е 1, перед указанным введением предпочтительно нет кодирующих последовательностей аденовирусных Е 1 А и Е 1 В, и только при введении последовательностей они приобретают в своем геноме последовательности Е 1, становясь, таким образом, иммортализованными и способными к упаковке рекомбинантного аденовируса с делецией в области Е 1. Например, в WO 03/031633 описано введение E1B-55k Ad11 в клетки 293: это, очевидно, не дает преимущества настоящего изобретения, так как последовательности Е 1, как уже присутствующие в 293, остаются в оригинальной конфигурации и клетки несут ORF E1B, расположенную менее чем на 4 т.п.н. от ORF E1A. Напротив, настоящее изобретение относится к способам получения клеток, несущих в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В-55K, а также к полученным в результате применения способов клеткам, где последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В в достаточной степени отделены друг от друга, чтобы предотвратить одновременное введение всех последовательностей Е 1 А и Е 1 В из генома клеток в геном одной аденовирусной частицы. В первом варианте осуществления для получения клеток по настоящему изобретению кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В раздельно вводят в указанные клеткипредшественники, помещая из в отдельные молекулы, которые вводят в указанные клетки в различные моменты времени, а указанные клетки-предшественники не являются клетками BRK. В одном из вариантов осуществления этого, сначала вводят кодирующие последовательности, кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В-21K, тогда как кодирующую последовательность Е 1 В-55K вводят в более поздний момент времени. Во втором варианте осуществления для получения клеток по настоящему изобретению по меньшей мере две молекулы нуклеиновой кислоты, вместе содержащие кодирующие последовательности указанного Е 1 А и указанного Е 1 В, вводят в указанную клетку-предшественник, отличающуюся тем, что в указанных по меньшей мере двух молекулах нуклеиновой кислоты отсутствует значительное перекрывание последовательностей. Полагают, что наличие таких перекрывающихся последовательностей могло бы увеличить вероятность по меньшей мере какого-либо взаимодействия между указанными по меньшей мере двумя молекулами и последующей совместной интеграции последовательностей указанных молекул в один и тот же локус генома клетки-предшественника, в которую вводят данные молекулы, тогда как объектом настоящего изобретения является преодоление этого. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одну из кодирующих областей Е 1 А и Е 1 В помещают под контроль различных регуляторных последовательностей, таких как промоторы и сигналы полиаденилирования. В другом варианте осуществления последовательности Е 1 В-55K и Е 1 В-19K, которые перекрываются, разделены и все перекрывания между данными кодирующими последовательностями удалены посредством методов генной инженерии с использованием знания о вырожденности генетического кода известными специалистам в данной области способами, таким образом, обеспечивая введение данных кодирующих последовательностей Е 1 В независимо и не связанно друг с другом. Введение кодирующих областей Е 1 А и Е 1 В в данном варианте осуществления можно проводить в одно и то же время, например, посредством совместной трансфекции указанных по меньшей мере двух молекул, но очевидно, первый и второй варианты осуществления также можно объединять, т.е. вводить по меньшей мере две молекулы, содержащие последовательности нуклеиновой кислоты, вместе содержащие кодирующие последовательности Е 1 А и обоих Е 1 В, где в указанных по меньшей мере двух молекулах отсутствует значительное перекрывание по отношению друг к другу, и где указанные по меньшей мере две молекулы вводят в клетку-предшественник в различные моменты времени. В третьем варианте осуществления последовательности, кодирующие Е 1 А и кодирующие последовательности по меньшей мере одного из Е 1 В разъединены посредством помещения в одну молекулу нуклеиновой кислоты, где указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В (очевидно это также могут быть обе кодирующие последовательности Е 1 В) разделены посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 6 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 8 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 10 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 15 т.п.н., наиболее предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. нуклеиновой кислоты, обозначаемой здесь как "спейсерная" или "балластная" нуклеиновая кислота. Спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты преимущественно может обладать характеристиками, как описано ниже, спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты, конкретно в указанной последовательности отсутствуют кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В, может быть построена по меньшей мере частично из интронных последовательностей и может содержать регуляторные последовательности кодирующих последовательностей Е 1 А и/или Е 1 В. Специалисту понятно, что в эквивалентном варианте третьего варианта осуществления указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В могут присутствовать на различных молекулах нуклеиновой кислоты вместо одной молекулы (см., например, фиг. 13 I, II, и, например, пример 3), пока последовательности остаются разделен-7 010924 ными посредством, по меньшей мере, указанного расстояния, когда указанные различные молекулы нуклеиновой кислоты будут формировать одну молекулу, например, посредством (гомологичной) рекомбинации, или лигирования, или соединения конец-в-конец. Идея представляет собой то, что также в таком случае кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного Е 1 В при интеграции в геном клетки-предшественника остаются разделенными посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 6 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 8 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 10 т.п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 15 т.п.н., наиболее предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. (см., например, пример 3 и фиг. 21). Другими словами, третий вариант осуществления изобретения можно, следовательно, проводить посредством введения в клеткупредшественника одной молекулы нуклеиновой кислоты ("молекула А"), содержащей кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В-55K, где по меньшей мере две из данных трех кодирующих последовательностей являются разделенными посредством по меньшей мере 4 т.п.н. (вариант осуществления 3 а); или, с тем же успехом, посредством введения двух или более молекул нуклеиновой кислоты,которые при формировании одной молекулы нуклеиновой кислоты будут формировать "молекулу А"(вариант осуществления 3b). В определенных аспектах третьего варианта осуществления, для уменьшения шанса взаимодействия и возможной гомологичной рекомбинации между данными отдельными последовательностями, отсутствует существенное перекрывание последовательностей и между спейсерными нуклеиновыми кислотами, фланкирующими Е 1 А и Е 1 В, и в регуляторных последовательностях для кодирующих последовательностей Е 1 А и Е 1 В. Кодирующие Е 1 А и Е 1 В рекомбинантные молекулы В одном из аспектов изобретение относится к рекомбинантной молекуле, содержащей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие аденовирусные белки Е 1 А, и по меньшей мере один из аденовирусных белков Е 1 В, отличающейся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белки Е 1 А, и указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере один белок Е 1 В, разделены посредством по меньшей мере 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере 34,5 т.п.н. Такую молекулу можно использовать в способе по изобретению для получения клеток по изобретению. Такая молекула может принимать различные известные специалистам в данной области формы, такие как плазмида, космида,искусственная бактериальная хромосома, YAC, и тому подобное. В эквивалентном варианте осуществления также возможно получать кодирующую белки Е 1 А и Е 1 В указанную нуклеиновую кислоту, исходно находящуюся в виде раздельных молекул. Такие молекулы могут, необязательно, быть способны к формированию одной молекулы посредством гомологичной рекомбинации, лигирования, сайт-специфической рекомбинации, соединения конец-в-конец и тому подобное. Таким образом, аспект изобретения относится к набору по меньшей мере из двух молекул нуклеиновой кислоты, содержащему: а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белки Е 1 А аденовируса, где указанная молекула нуклеиновой кислоты несет по меньшей мере 5 т.п.н, предпочтительно по меньшей мере 17 т.п.н. последовательности спейсерной нуклеиновой кислоты на обеих сторонах указанной кодирующей последовательности Е 1 А, где указанная спейсерная нуклеиновая кислота не кодирует белок Е 1 В; и b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок Е 1 В аденовируса, где указанная молекула нуклеиновой кислоты несет по меньшей мере 5 т.п.н, предпочтительно по меньшей мере 17 т.п.н. последовательности спейсерной нуклеиновой кислоты на обеих сторонах указанной кодирующей последовательности Е 1B, где указанная спейсерная нуклеиновая кислота не кодирует белок Е 1 А. Указанная спейсерная нуклеиновая кислота может быть любой другой нуклеиновой кислотой, а предпочтительно ее выбирают таким образом, чтобы она являлась инертной, то есть не содержала кодирующих последовательностей, предпочтительно, без известных регуляторных элементов, без высокоповторяющихся областей, что может приводить к нестабильности хромосом и тому подобному. Предпочтительно указанная спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты, фланкирующая кодирующие последовательности Е 1 А, не имеет существенной гомологии с указанной спейсерной последовательностью нуклеиновой кислоты, фланкирующей кодирующую белок Е 1 В последовательность. Спейсерный фрагмент может включать в себя регуляторные последовательности экспрессионных кассет Е 1 А или Е 1 В, такие как гетерологичный промотор и/или участок полиаденилирования. Размножение рекомбинантных молекул в хозяине, как правило, можно без труда проводить, когда молекулы находятся в кольцевой форме. В определенных аспектах рекомбинантные молекулы по изобретению находятся в линейной форме. Это может способствовать трансфекции линий клетокпредшественников, которая, как правило, более эффективна при использовании линейных молекул. Например, линеаризацию можно проводить посредством расщепления рекомбинантной молекулы одними или несколькими подходящими рестрикционными ферментами, как известно специалистам в данной области. Клеточные линии с отсутствующими последовательностями Е 1 в ориентации инвертированного повтора Каков бы ни был механизм образования HDEP в отсутствие существенного перекрывания между пакующей клеткой и рекомбинантным аденовирусом, вероятно, что первой стадией в данном процессе-8 010924 является событие интеграции последовательности Е 1 из генома пакующей клетки в геном вируса. Для приспособления к данным добавочным последовательностям у вируса впоследствии должна произойти делеция аденовирусных последовательностей (Murakami et al., 2002). Данная стадия может являться более эффективной, когда присутствуют инвертированные повторы (Steinwaerder et al., 1999). Клеточная линия PER.C6 содержит в своем геноме несколько повторов плазмиды pIG.E1A.E1B, которую применяли для получения клеточной линии, где некоторые из повторов находятся в инвертированной ориентации по отношению друг к другу. Таким образом, присутствие в геноме клеток PER.C6 инвертированных повторов области Е 1 может влиять на частоту образования HDEP. Необходимо отметить, что формирование частиц HDEP также может происходить в других пакующих аденовирусы клеточных линиях, но в таких клеточных линиях они остаются необнаруженными вследствие появления классических RCA. Отсутствие в линиях пакующих клеток последовательностей Е 1 в ориентации инвертированных повторов будет, вероятно, приводить к меньшей частоте или даже к полному отсутствию образования HDEP, когда рекомбинантный аденовирус размножается в таких пакующих клетках. Таким образом, при получении или селекции новых клеточных линий, содержащих в своем геноме области Е 1, может быть желательным селекция новых клонов, в которых отсутствуют инвертированные повторы, но, предпочтительно несущие только прямые повторы или даже единственную интеграцию последовательностей Е 1. Таким образом, аспект изобретения относится к клеткам, а также к способам получения содержащих аденовирусные последовательности Е 1 клеток, отличающихся тем, что указанный способ предусматривает стадию отбора клеток с отсутствием инвертированных повторов, содержащих указанные последовательности Е 1. Изобретение относится к клеткам, содержащим в своем геноме последовательности аденовирусного Е 1, где указанные последовательности Е 1 включают в себя по меньшей мере одну функциональную копию кодирующих последовательностей Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В-55K,отличающуюся тем, что указанные последовательности Е 1 или их часть не существуют в указанном геноме в форме инвертированных повторов. В данном варианте осуществления указанные клетки не являются клетками 293 или их производными. Если инвертированные повторы присутствуют, то предпочтительно, такие инвертированные повторы не находятся в указанной клетке в пределах 10 т.п.н., а в настоящем изобретении инвертированные повторы по меньшей мере с 10 т.п.н. промежуточной последовательности, не содержащей Е 1, далее как инвертированные повторы не рассматривают. Обоснование состоит в том, что когда одна копия последовательности Е 1 где-либо интегрируется в хромосому, а инвертированная копия может интегрироваться на той же хромосоме, но на расстоянии, достаточно большом,чтобы предотвратить захват всего содержащего оба повтора сегмента ДНК в аденовирусную частицу, не представляют никаких проблем. Также когда расстояние является таким, что захват фрагмента возможен(т.е. 10 т.п.н.), дупликация левого конца являющаяся результатом последовательности инвертированных повторов приводит к вирусному геному, который слишком велик для упаковки (проиллюстрировано на фиг. 13). Участок вставки последовательностей Е 1 в геном вируса важен для конечной общей длиныHDEP. Очевидно, что вероятность, что включение содержащего Е 1 геномного фрагмента приведет к пакующемуся геному, увеличивается, если вставка находится ближе к левому концу вируса. Если участок вставки находится точно на 3'-конце минимального сигнала упаковки, тогда вставка может составлять до 18,5 т.п.н. (в том числе 1 копия Е 1 А и Е 1 В и последовательность инвертированного повтора) и все еще оставаться пакующейся (при условии, что концевая дупликация слева направо включает в себя 350 п.н.HDEP, так как возможные участки интеграции такого фрагмента, которые еще приводят к вирусу пакуемого размера, ограничены до 1,5 т.п.н. только на 3'-конце минимальной пакующейся последовательности. Таким образом, частота образования HDEP при увеличении расстояния между кодирующими областями Е 1 А и Е 1 В будет уменьшаться и еще может быть достаточно ниже уровня детекции, когда расстояние является значительно меньшим, чем указанные 18,5 т.п.н. Эти же аргументы справедливы и для прямой вставки Е 1 А и Е 1 В в отсутствие последовательностей прямых повторов. В этом случае общая длина вставки в геном аденовируса не должна превышать 37,5 т.п.н. (включая сюда приблизительно 3 т.п.н. для области Е 1 А и Е 1 В), но только когда она вставляется непосредственно на 3'-конце минимального сигнала упаковки. Таким образом, когда кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В разделены в геноме пакующей клетки посредством по меньшей мере 34,5 т.п.н., вставка обеих данных последовательностей в рекомбинантный аденовирус предотвращается. Кроме того, затем в полном геноме аденовируса на последующей стадии должна произойти делеция, каковой процесс может быть дополнительно намного менее эффективным в отсутствие последовательностей инвертированных повторов (Steinwaerder et al., 1999). В любом случае независимо от присутствия в геноме инвертированных последовательностей Е 1, вероятность образования частиц,содержащих последовательности Е 1 А и Е 1 В уменьшается, если кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В дополнительно разделены в геноме. Таким образом, в определенных вариантах осуществления указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В разделены в геноме клеток по настоящему изобретению посредством по меньшей мере 4 т.п.н., 6-9 010924 т.п.н., 8 т.п.н., 10 т.п.н., 12 т.п.н. В этих вариантах осуществления предпочтительно, чтобы последовательности Е 1 не присутствовали в форме инвертированных повторов. Предпочтительно, указанные последовательности разделены посредством по меньшей мере 15 т.п.н. и в них отсутствуют инвертированные последовательности Е 1, что гарантирует теоретическую возможность образования в такой клеточной линии HDEP посредством введения последовательностей Е 1 из генома указанной клеточной линии в аденовирус практически уменьшится до нуля (см. фиг. 13). В других вариантах осуществления, указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В разделены посредством по меньшей мере 18 т.п.н., 20 т.п.н., 25 т.п.н., 30 т.п.н. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные последовательности были разделены посредством по меньшей мере 34,5 т.п.н. Это будет гарантировать, что не произойдет однократной интеграции обоих Е 1 А и Е 1 В, происходящих из генома клетки, которая сможет привести к образованию HDEP. Как указано выше, очевидно, что в определенных эквивалентных вариантах осуществления указанные кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного Е 1 В в геноме клетки находятся на различных хромосомах. Способы скрининга полученных клонов на присутствие инвертированных повторов последовательностей Е 1 известны специалистам в данной области и могут включать в себя PCR, саузерн-блоттинг,анализ рестрикционными ферментами, Fiber-FISH и тому подобное. При образовании клеточных клонов с применением плазмиды, содержащей гены Е 1, такой как плазмида pIG.E1A.E1B (патент США 5994128), сначала можно получать клоны, а затем в цикле скрининга отбирать для дальнейшего применения те клоны, в которых отсутствуют указанные инвертированные повторы. Клетки из отобранных клонов затем можно соответствующим образом применять для получения рекомбинантного аденовируса,и следует ожидать, что частота образующихся в данных клетках HDEP будет значительно ниже (или даже отсутствовать), чем в клетках, содержащих указанные инвертированные повторы. Таким образом,существует другой аспект настоящего изобретения, относящийся к клетке, содержащей в своем геноме кодирующие последовательности аденовирусных Е 1 А и Е 1 В, характеризующийся тем, что указанные последовательности Е 1 не находятся в указанном геноме в форме инвертированных повторов. Для данного аспекта настоящего изобретения последовательности, разделенные посредством по меньшей мере 10 т.п.н. последовательности, не содержащей Е 1, не рассматривают как инвертированные повторы. В конкретном аспекте указанные последовательности Е 1 А и Е 1 В находятся в указанном геноме по меньшей мере в количестве двух копий на геном. В одном из аспектов указанные по меньшей мере две копии содержат по меньшей мере две копии, находящиеся на одной хромосоме. В другом варианте осуществления указанные клетки содержат в своем геноме только одну копию кодирующих областей Е 1 А и Е 1 В,при отсутствии последовательностей, кодирующих аденовирусный pIX. Конечно, следует ожидать, что в клетке, содержащей в своем геноме только одну копию указанных последовательностей Е 1 будет уменьшена (или даже отсутствовать) частота образования HDEP. Применение клеток В другом аспекте изобретение относится к способу получения рекомбинантного аденовируса в клетках по изобретению. Это приводит к образованию партий рекомбинантного аденовируса со значительно сниженной по сравнению с полученными в известных в данной области системах партиями частотой HDEP, предпочтительно совсем без HDEP. В особенно предпочтительных вариантах осуществления в векторе и пакующей клетке, применяемых для получения указанного рекомбинантного аденовируса, отсутствует значительное перекрывание последовательностей (т.е. предпочтительно менее чем 10 нт,или более предпочтительно, совсем без перекрывания), а, предпочтительно, перекрывание отсутствует,тем самым сводя к минимуму шанс гомологичной рекомбинации между вектором и последовательностями в пакующей клетке, что приводит к партиям вируса с частицами, не содержащими E1 (HDEP,RCA). Следует отметить, что новые клетки, предоставленные по настоящему изобретению также можно применять для получения рекомбинантных белков, как описано ранее (WO 00/63403), и для получения других (не являющихся аденовирусами) вирусов, как описано ранее (WO 01/38362). Специалистам в данной области должно быть понятно, что серотип или природа трансгена не важны для изобретения. Например, сразу же будет понятным, что последовательности аденовирусного Е 1,кодирующие последовательности, применяемые для получения клеток, можно взять из любого подходящего серотипа, совместимого с аденовирусом, который необходимо размножать в клетках, такого какAd5, Ad35, Ad11, Ad16, Ad49 и т.д., или их сочетания, т.е. кодирующие последовательности Е 1 А из одного серотипа, и по меньшей мере одного из Е 1 В из другого серотипа (см., например, WO 02/40665). Также должно быть понятным, что во многих других аспектах изобретение можно изменять без отклонения от его объема и сущности. Изобретение далее будет проиллюстрировано посредством нижеследующих примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Примеры В практическом осуществлении данного изобретения применяют, пока не указано иначе, традиционные способы молекулярной биологии, клеточной биологии и рекомбинантных ДНК, которые известны специалистам в данной области. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: ABD, Taylor GR, eds, 1995. Пример 1. Получение комплементирующих клеточных линий с применением отдельных нуклеиновых кислот, кодирующих белки Е 1 А и Е 1 В Полная морфологическая трансформация первичных клеток аденовирусными генами Е 1 представляет собой результат совместной активности белков, кодируемых областями Е 1 А и Е 1 В. Роли различных белков Е 1 в литической инфекции и трансформации широко изучены (рассмотрено в Zantema and van der Eb, 1995; White, 1995, 1996). Аденовирусные белки Е 1 А необходимы для трансформации первичных клеток. Сопутствующую индукцию апоптоза нейтрализуют и Е 1 В-19K, и Е 1 В-55K,хотя и различными механизмами. Хотя область Е 1 А кодирует несколько белков, как кодирующую область Е 1 А, как правило, обозначают всю область, а во всех вариантах осуществления, как применяют здесь, "кодирующая последовательность Е 1 А" обозначает последовательности, кодирующие все белки Е 1 А. В клетках грызунов активности Е 1 А вместе с любым из Е 1 В-19K или -55K достаточно для полной трансформации, хотя экспрессия обоих белков Е 1 В вместе эффективнее в два раза (Gallimore et al., 1985;Rao et al., 1992). Однако представляется, что в человеческих клетках активность белка Е 1 В-55K является более важной, принимая во внимание наблюдение, что Е 1 В-55K необходим для получения бессмертной трансформированной клеточной линии (Gallimore et al., 1986). При аденовирусной инфекции и размножении вируса белки Е 1 А функционируют при активации аденовирусных генов, включая сюда Е 1 В и другие ранние области, вероятно, посредством взаимодействия с ТАТА-связывающими белками (рассмотрено у Zantema and van der Eb, 1995). Экспрессия Е 1 В-55K важна на поздней фазе инфекции для отключения синтеза белков хозяина и селективного транспорта кодируемых вирусом белков из ядра в цитоплазму (Babiss et al., 1985; Pilder et al., 1986). У аденовирусов с делецией Е 1 В-55 К в линиях некомплементирующих человеческих клеток показана уменьшенная репликация (Harada and Berk, 1999). Таким образом, кодируемые Е 1 А и Е 1 В-55K белки необходимы для трансформации первичных человеческих клеток и для эффективной репликации вируса в человеческих клетках. Негомологическая рекомбинация может приводить к включению последовательностей Е 1 из клеточного генома пакующей клетки в рекомбинантный аденовирус. Зависимые от хелпера содержащие Е 1 частицы, которые в результате возникают из исходного рекомбинированного аденовируса, способны комплементировать репликацию не способных к репликации векторов в некомплементирующих (человеческих) клетках, но не способны к автономной репликации. Данная комплементация опосредована функциями и Е 1 А, и Е 1 В-55K, а возможно и Е 1 В-19K. Таким образом, если возможность того, что обе функции Е 1 А и Е 1 В-55K (а предпочтительно Е 1 В-19K) окажутся в аденовирусном зекторе исключена или уменьшена, тогда формирование HDEP будет исключено или уменьшено. Здесь авторы описывают примеры функциональных плазмид, экспрессирующих любой из Е 1 А,Е 1 А и Е 1 В-19K, Е 1 В (Е 1 В-19K + Е 1 В-55K) или Е 1 В-55K, который применяют для получения пакующих аденовирусы клеточных линий, с областями Е 1 А и Е 1 В-55k, отделенными друг от друга. Ранее описана (патент США 5994128) конструкция pIG.E1A.E1B (фиг. 14; SEQ ID NO:1), содержащая область Ad5-El (нуклеотиды 459-3510 генома Ad5 (инвентарный номер GenBank M73260), функционально связанную с промотором человеческой фосфоглицераткиназы (PGK) и последовательностью полиаденилирования вируса гепатита В. Получение конструкции pIG.E1A Конструкцию pIG.E1A получали расщеплением pIG.E1A.E1B с Hindi с последующей очисткой полученного в результате фрагмента длиной 5 т.п.н. из геля с применением набора экстракции из геля QIAEX II (Qiagen) по инструкциям производителя. Повторное лигирование выделенного фрагмента и трансформирование в компетентные клетки STBL2 (Invitrogen) приводило к получению pIG.E1A (фиг. 1). Данная конструкция содержит нуклеотиды от 459 до 1578 из генома Ad5 (инвентарный номер GenBank M73260). Получение конструкции pIG.E1AB21 Конструкцию pIG.E1A расщепляли XbaI и HpaI, а полученный фрагмент длиной 4,8 т.п.н. выделяли из геля, как указано выше. Конструкцию pIG.E1A.E1B расщепляли BsrGI и обрабатывали фрагментом Кленова (New England Biolabs) для создания тупых концов из выступающих 5'-концов. Затем ДНК очищали набором для очистки продуктов ПЦР QIAquick (Qiagen) по инструкциям производителя и далее расщепляли XbaI. Полученный фрагмент длиной 913 нуклеотидов, содержащий 3'-часть Е 1 А и кодирующую последовательность Е 1 В-19K выделяют из геля, как описано. Лигирование двух выделенных фрагментов и трансформация в клетки DH5-T1r (Invitrogen) дает в результате конструкцию pIG.E1AB21(фиг. 2). Таким образом, данная конструкция содержит нуклеотиды от 459 до 2253 генома Ad5 (инвентарный номер GenBank M73260), в результате чего последовательность Е 1 А попадает под контроль промотора PGK, а промотор Е 1 В управляет геном Е 1 В-19K. Иногда ген Е 1 В-19K Ad5 обозначают как ген Е 1 В-21K Ad5, так как ожидаемая аминокислотная последовательность образует белок массой 20,6 кДа (например, некоторые из плазмид и праймеров в данной заявке имеют 21K как часть их названий).- 11010924 Получение конструкции pCR5B Затем, как указано ниже, получали конструкцию, содержащую область Е 1 В Ad5. Вначале получали фрагмент ПЦР с праймерами 5E1Bfor-1: 5'-CGG AAT TCG GCG TGT TAA ATG GGG CG-3' (SEQ IDpIG.E1A.E1B в качестве матрицы и ДНК-полимеразы Pwo (Roche) по инструкциям производителя сDMSO в конечной концентрации 3%. Программа амплификации представляла собой 94 С в течение 2 мин с последующими 30 циклами, состоящими из (94 С в течение 30 с, 50 С в течение 30 с и 72 С в течение 1 мин) и заканчивалась 72 С в течение 10 мин. Полученный амплифицированный фрагмент длиной 481 нуклеотид очищали с применением набора очистки продуктов ПЦР QIAquick (Qiagen) и лигировали в вектор pCR-ScriptAmp с применением набора для клонирования продуктов ПЦР (Stratagene) в присутствии фермента SrfI по инструкциям производителя. Лигирование (по тупым концам) приводило в результате к двум ориентациям вставки в векторе, из которых произвольно выбирали одну с наибольшим фрагментом между участком EcoRI на 5'-конце представляющей интерес вставки и участком EcoRI в векторе. В результате это приводило к конструкции pCR5B. Корректность амплификации последовательности-мишени (между участками KpnI и EcoRI) контролировали секвенированием. Получение конструкции рЕ 1 ВpCR5B расщепляли KpnI и EcoRI, а фрагмент длиной 415 нуклеотидов выделяли из геля с применением набора экстракции из геля QIAquick (Qiagen). Затем конструкцию pIG.E1A.E1B также расщеплялиEcoRI и KpnI, а полученный в результате фрагмент вектора длиной 5,2 т.п.н. выделяли из геля, как указано выше. Лигирование выделенных фрагментов и трансформация в клетки DH5-T1r (Invitrogen) дает в результате конструкцию рЕ 1 В (фиг. 3). Последовательность Е 1 В в данной конструкции состоит из нуклеотидов от 1642 до 3510 из генома Ad5. Затем тестировали трансформирующую способность новых конструкций в сравнении с полноразмерной экспрессирующей Ad5E1 конструкцией. Для этого выделяли первичные человеческие клетки эмбриональной сетчатки (HER) (см., например, Byrd et al., 1982, 1988) и высевали в 6-см чашки в средеDMEM (Gibco BRL) дополненной инактивированной нагреванием 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS, Gibco BRL). При 60-70% конфлюентности клетки трансфицировали в совокупности 20 мкг ДНК/чашку с применением набора для сопреципитации с СаРО 4 (Invitrogen) по инструкциям производителя. Через две недели трансформированные клоны становились видимыми как очаги в монослое первичных клеток. У клеток в очаге наблюдали совершенно отличную морфологию по сравнению с первичными клетками. В табл. II приведено количество трансформированных клонов, полученных при каждой из трансфекций. Результаты подтвердили предыдущие наблюдения, что первичные клетки можно трансформировать генами Ad5-E1A и Е 1 В 19K (pIG.E1AB21). Следует отметить, что данные очаги, как правило, были меньше, чем очаги, полученные трансфекцией, где находилась полная область Е 1 В. Также, после отбора очагов, полученных в результате трансфекций конструкцией pIG.E1AB21, и высеванием в 96-луночные планшеты не получали длительного роста клеток и все клетки погибали. Во всех остальных случаях большинство отобранных очагов в результате давали жизнеспособные клеточные клоны. Так как трансфекция pIG.E1AB21 вначале приводит к трансформированным клеткам, возможно повторно трансфицировать клетки экспрессирующей Е 1 В-55K конструкцией, например, через 5-10 суток после первой трансфекции. Это обеспечивает то, что получаемые клетки включают в себя обе экспрессирующие кассеты в различных локусах генома. Данный эксперимент дополнительно подтвердил, что возможно получать и создавать трансформированные клеточные клоны посредством применения двух отдельных плазмид для генов Е 1 А и Е 1 В(pIG.E1A + рЕ 1 В). Однако так как обе плазмиды трансфицировали совместно и они содержат значительное перекрывание последовательностей (каркас плазмид и промотор/polyA), возможно, что интеграция Е 1 А и Е 1 В происходила в одном и том же локусе генома. Этого можно избежать, применяя фрагменты только с экспрессионными кассетами (без векторных последовательностей) и без перекрывания последовательностей. Перекрывание последовательностей можно удалить из регуляторных элементов, таких как промоторы и последовательности полиаденилирования (polyA), применяя различные регуляторные последовательности для двух экспрессирующих конструкций с последовательностями Е 1 А и Е 1 В. Предпочтительно данные последовательности в достаточной мере отличаются, чтобы предотвратить перекрывание, которое может приводить к формированию парных структур, создающихся в процессе гомологичной рекомбинации. Можно применять любой промотор и последовательность polyA. Предпочтительно, чтобы регуляторные последовательности отличались от регуляторных последовательностей трансгенов в рекомбинантном аденовирусе, который будет размножаться в данных клетках. Очевидно, что это можно определить только когда данный рекомбинантный аденовирус размножается в данных клетках на поздней стадии и будет зависеть от конкретного рекомбинантного аденовируса. Таким образом, удобно выбирать регуляторные последовательности таких трансгенов позднее, так чтобы они отличались от последовательностей Е 1 А и Е 1 В в клетках, полученных по настоящему изобретению. Однако так как многие доступные в настоящее время рекомби- 12010924 нантные аденовирусные векторь несут трансгены, регулируемые промотором CMV и последовательностью polyA SV40, предпочтительные регуляторные последовательности для конструкций с Е 1 А и Е 1 В,как проиллюстрировано здесь, отличаются от промотора CMV и последовательности polyA SV40. Ввиду проблем с регулированием, дополнительно данные регуляторные последовательности предпочтительно не являются вирусного происхождения. С этой целью описанные выше плазмиды дополнительно модифицируют, как описано ниже. Получение конструкций pCC.E1A и рСС.Е 1 АВ 21 Последовательность Е 1 А амплифицировали с указанными ниже праймерами: 5E1A-for: 5'-CCGAAG-3' (SEQ ID NO:5). Реакцию проводили на матрице ДНК pIG.E1A.E1B с применением ДНКполимеразы Pwo (Roche) по инструкциям производителя, но с конечной концентрацией DMSO 3%. Программу ПЦР устанавливали как 94 С в течение 2 мин с последующими 30 циклами (94 С в течение 30 с,58 С в течение 30 с и 72 С в течение 120 с) и заканчивали при 72 С в течение 8 мин. Полученный в результате фрагмент длиной 1,2 т.п.н. содержал последовательность Е 1 А из Ad5 (нуклеотиды от 459 до 1655 как в инвентарном номере GenBank M73260) и был фланкирован участками EcoRI (5') и BamHI (3'). Второй фрагмент ПЦР получали с применением праймера 5 Е 1 А-for с обратным праймером: 5E1AB21-rev: 5' -CGG GAT CCT CAT ТСС CGA GGG ТСС AG-3' (SEQ ID NO:6), с применением таких же условий. Полученный в результате фрагмент длиной 1,8 т.п.н. содержал последовательности Е 1 А и Е 1 В-19 К из Ad5 (нуклеотиды от 459 до 2244 как в инвентарном номере GenBank М 73260), фланкированные участками EcoRI (5') и BamHI (3'). Оба фрагмента ПЦР выделяли из агарозного геля, очищали с применением набора экстракции из геля QIAEX II (Qiagen) и клонировали в векторе для клонирования продуктов ПЦР; pCR-TOPOblunt (Invitrogen) и последовательность подтверждали. Затем конструкции расщепляли EcoRI и BamHI, а инсерционные фрагменты выделяли из геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen), как указано выше. Затем каждый из выделенных фрагментов лигировали в вектор pCC101 (см. ниже), который сначала расщепляли EcoRI и BamHI и очищали из геля, как указано выше. Трансформация в электрокомпетентные клетки DH10B (Invitrogen) приводила к конструкциям pCC.E1A (фиг. 4) и рСС.Е 1 АВ 21 (фиг. 5). Синтетический сигнал полиаденилирования (SPA) находится на данных плазмидах (полученных из конструкции рСС 271, как описано в WO 02/40665). Получение pCC101 рСС 100 (см. ниже) расщепляли XbaI и полученный в результате линейный фрагмент очищали из геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II, как указано выше. Посредством отжига олигонуклеотидов X-SM-1: 5'-CTAGGTCGACCAATTG-3' (SEQ ID NO:7) с X-SM-2: 5'CTAGCAATTGGTCGAC-3' (SEQ ID NO:8) получали линкер. Для этого 1 мкг каждого олигонуклеотида смешивали с 2 мкл 10 буфера NEB2 (NEB) и milliQ H2O в конечном объеме 20 мкл. Смесь помещали в 98 С и медленно охлаждали до 4 С на устройстве для ПЦР (скорость охлаждения 2 С/мин). Затем отожженный линкер лигировали с выделенным фрагментом после расщепления XbaI с применением 4 молярного избытка линкера по отношению к фрагменту. Цитированную ДНК очищали набором для очистки продуктов ПЦР QIAquick (Qiagen) по инструкциям производителя и расщепляли XbaI для удаления самолигировавшейся векторной ДНК. После тепловой инактивации фермента XbaI, смесь затем применяли для трансформации компетентных клеток DH5-T1r, получая в результате pCC101 (фиг. 6). Получение рСС 100 Конструкцию рСС 271 (описанную в WO 02/40665) расщепляли EcoRI и PstI, а фрагмент вектора длиной 3 т.п.н. выделяли из геля, как описано выше. Посредством отжига олигонуклеотида EcoPst-3: 5'AAT TGA TAT CGA ATT CGC CGA GCT CGT AAG CTT GGA ТСС CTG СА-3' (SEQ ID NO:9) с олигонуклеотидом EcoPst-4: 5'-GGG АТС САА GCT TAC GAG CTC GGC GAA TTC GAT АТС-3' (SEQ IDNO:10) получали линкер. Для этого олигонуклеотиды смешивали, как описано выше, и отжигали посредством инкубации при 98 С в течение 2 мин, 65 С в течение 30 мин и комнатной температуре в течение 2 ч. Затем выделенный фрагмент вектора лигировали до избытка отжигаемого олигонуклеотида и трансформировали в компетентные клетки DH5-T1r, получая в результате конструкцию рСС 100. Получение рСС 200 Плазмиду pBR322 (GenBank J01749.1) расщепляли EcoRI, a затем формировали тупые концы с применением фрагмента Кленова с последующей очисткой набором для очистки продуктов ПЦР QTAquick (Qiagen). После второго расщепления с применением NheI фрагмент вектора длиной 4150 п.н. выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen). Параллельно конструкцию рСС 100 расщепляли BsaAI, фрагментом Кленова формировали тупые концы и очищали набором для очистки продуктов ПЦР QIAquick (Qiagen), с последующим вторым расщеплением с применением XbaI и выделением фрагмента длиной 350 п.н. из агарозного геля. Затем фрагменты лигировали и трансформировали в компетентные клетки STBL-2 (Invitrogen), получая в результате рСС 200 (фиг. 15).- 13010924 Получение рСС 105 Конструкция рСС 105 содержит человеческий промотор PGK и сигнал полиаденилирования человеческого гена COL1A2. Вначале из человеческой геномной ДНК посредством ПЦР амплифицировали последовательность полиаденилирования COL1A2 (Natalizio et al., 2002), как описано авторами с применением рекомбинантной полимеразы Taq (Invitrogen) и праймеров COL1A2F: 5'-CAG СТА GCC TGC AGGGAG ATG С-3' (SEQ ID NO:12). При этом опубликованную последовательность достраивают на 5' -конце посредством последовательности для рестрикции SbfI, а на 3'-конце посредством последовательности для рестрикции SalI. Полученный фрагмент ПЦР клонировали в pCR-TOPO-TA с применением набора для клонирования pCR-TOPO4 ТА (Invitrogen). После проверки вставки посредством секвенирования посредством расщепления SbfI и SalI из вектора ТОРО выделяли вставку длиной 277 п.н. и очищали с применением набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick (Qiagen). Параллельно плазмиду pCC1O1 также расщепляли посредством SbfI и SalI, с последующим электрофорезом в геле. Фрагмент вектора длиной 2965 п.н. выделяли из агарозного геля с применением GeneClean Kit (Bio101) по инструкциям производителя. Данный фрагмент вектора лигировали с очищенным фрагментом COLiA2 рА в эквимолярных количествах и трансформировали в химически компетентные клетки STBL-2 (Invitrogen). Это приводило к плазмиде рСС 105 (фиг. 7). Получение рСС 205 Конструкцию рСС 205 получали расщеплением рСС 200 SalI и EcoRI, с последующей очисткой фрагмента вектора длиной 4225 нуклеотидов из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen). Параллельно, из конструкции рСС 105 посредством расщепления EcoRI и SalI с последующим электрофорезом в геле и очисткой фрагмента с применением набора для экстракции из геля QIAEX II выделяли 310 нуклеотидов COL1A2 polyA. Затем два фрагмента лигировали в эквимолярных количествах и трансформировали в DH5-T1r, получая в результате рСС 205 (фиг. 16). Клонирование pCC.55Kcol Вектор рСС 205 применяли для конструирования плазмиды, экспрессирующей белок Ad5 E1B-55k. Для этого получали продукт ПЦР с применением следующих праймеров: 55KfoгE:5'-GGA ATT CGC САС CAT GGA GCG AAG AAA CCC АТС TGA-3' (SEQ ID NO:13) и 55KrevB: 5'-gga tcc TCA АТС TGT АТС ТТС АТС GCT AGA GCC-3' (SEQ ID NO:14). ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pwo по протоколу производителя в присутствии 3% DMSO. Амплификацию проводили с pIG.E1A.E1B, а программу устанавливали как 94 С в течение 2 мин с последующими 30 циклами, состоящими из (94 С в течение 30 с, 60 С в течение 30 с и 72 С в течение 90 с) и заканчивали 72 С в течение 8 мин. Полученный в результате амплифицированный фрагмент длиной 1510 п.н. содержит последовательность нуклеотидов Е 1 В-55K от 2019 до 3510 из последовательности Ad5. Фрагмент очищают с применением набора для очистки продуктов ПЦР QIAquick (Qiagen), расщепляют EcoRI и BamHI с последующим электрофорезом в геле для удаления отщепленных концов. Затем данный фрагмент очищают из агарозного геля с применением набора GeneCleanII (Bio101) и лигируют с рСС 205, которую также расщепляют EcoRI иBamHI и выделяют из агарозного геля, как указано выше. Смесь после лигирования трансформировали в химически компетентные клетки STBL2 (Invitrogen), получая в результате конструкцию pCC.55Kcol(фиг. 8). Клонирование pIG.E1B Получали фрагмент ПЦР с применением ДНК-полимеразы Pwo (Roche) по инструкциям производителя в присутствии 3% DMSO. В реакции амплификации применяли следующие праймеры: 5E1Bstart: 5'-GGA ATT CCT CAT GGA GGC TTG GG-3' (SEQ ID NO:15) и 5E1Brev2: 5'-GTG TCT CAC AAC CGCTCT C-3' (SEQ ID NO:16). Амплификацию проводили с pIG.E1A.E1B, а программу устанавливали как 94 С в течение 2 мин с последующими 5 циклами, состоящими из (94 С в течение 30 с, 56 С в течение 30 с и 72 С в течение 60 с), затем за этими циклами следовали другие 35 циклов из (94 С в течение 30 с,60 С в течение 30 с и 72 С в течение 60 с) и заканчивали 68 С в течение 8 мин. Затем фрагмент ПЦР длиной 390 нуклеотидов расщепляли KpnI и EcoRI, получая в результате фрагмент длиной 347 нуклеотидов, который выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II(Qiagen). Затем данный фрагмент лигировали с фрагментом вектора pIG.E1A.E1B длиной 5713 п.н., полученного посредством расщепления KpnI и частично EcoRI, последующего выделения из геля и очистки с применением набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen). После лигирования смесь трансформировали в химически компетентные клетки STBL-2, получая в результате плазмиду pIG.E1B (фиг. 9).pIG.E1B содержит нуклеотиды от 2019 до 3510 из генома Ad5. Клонирование pCC.E1Bcol Для конструирования плазмиды, несущей обе кодирующие последовательности Е 1 В Ad5 19K и 55 К, плазмиду рСС.55Kcol расщепляют EcoRI и KpnI. Фрагмент вектора длиной 5970 нуклеотидов выделяют посредством электрофореза в геле и очищают из агарозного геля с применением набора GeneCleanII (Bio101), как указано выше. Затем конструкцию pIG.E1B также расщепляли KpnI и EcoRI, а- 14010924 фрагмент длиной 347 нуклеотидов выделяли из геля и очищали с применением набора для экстракции из геля QIAquick (Qiagen). Лигирование данной вставки и выделенного фрагмента вектора pCC.55Kcol и трансформация в клетки STBL-2 приводит к конструкции pCC.E1Bcol (фиг. 10). Данная конструкция содержит нуклеотиды от 1711 до 3510 из последовательности генома Ad5. Клонирование pEC.E1B Промотор человеческого фактора элонгации 1- (EF1-) выделяют из плазмиды pEF/myc/nuc (Invitrogen) посредством расщепления EcoRI и PmlI. После расщепления у фрагмента формируют тупые концы фрагментом Кленов, а затем фрагмент промотора EF1- длиной 1183 нуклеотида выделяют посредством электрофореза в геле и очищают с применением набора GeneCleanII (Bio101). Параллельно векторpCC.E1Bcol расщепляли посредством BstXI, с последующей обработкой ДНК-полимеразой Т 4 для получения тупых концов и очищали на колонке для очистки продуктов ПЦР (Qiagen). Затем проводят второе расщепление посредством EcoRV с последующим электрофорезом в геле. Затем фрагмент вектора длиной 5827 нуклеотидов очищают с применением набора GeneCleanII (Bio101). И фрагмент EF1-, и фрагмент вектора вместе лигировали в эквимолекулярном количестве и трансформировали в химически компетентные клетки STBL-2 (Invitrogen), что приводило в результате к плазмиде pEC.E1B (фиг. 11), содержащей ту же последовательность Ad5-E1B, что и плазмида pCC.E1Bcol. Клонирование pSC.55K Промотор SV40 амплифицировали с плазмидной ДНК pEF/myc/nuc (Invitrogen) посредством применения рекомбинантной ДНК-полимеразы Taq (Invitrogen) и следующих праймеров: SV40.forS: 5'-САА СТА GTA CAT GTG GAA TGT GTG TCA GTT AGG-3' (SEQ ID NO:17) и SV40.RevERI: 5'-GGA ATTCAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG G-3' (SEQ ID NO:18). Программу амплификации устанавливали как 94 С в течение 2 мин с последующими 5 циклами из (94 С в течение 30 с, 48 С в течение 30 с и 72 С в течение 45 с), а затем дополнительными 25 циклами из (94 С в течение 30 с, 58 С в течение 30 с и 72 С в течение 45 с) и заканчивали 68 С в течение 8 мин. Полученный в результате амплифицированный фрагмент длиной 357 п.н. (нуклеотиды от 266 до -71 из последовательности SV40 инвентарного номера GenBank J02400) выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II(Qiagen). Затем данный фрагмент клонировали в pCR-TOPO, с применением набора для клонированияPCRTOPO4blunt (Invitrogen). После проверки последовательности из вектора ТОРО посредством расщепления EcoRI и SpeI выделяли вставку длиной 357 п.н. и выделяли из агарозного геля с применением набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen). Параллельно посредством AvrII и EcoRI расщепляли плазмиду pCC.55Kcol (обладающую каркасом pBR322), с последующим электрофорезом в геле. Фрагмент вектора длиной 5508 нуклеотидов выделяли из геля, как описано выше, и лигировали в эквимолярном количестве с расщепленным фрагментом ПЦР. Смесь после лигирования трансформировали в химически компетентные клетки STBL-2, получая в результате плазмиду pSC.55K (фиг. 12), содержащую ту же последовательность Ad5 E1B-55K, что и pCC.55Kcol. Для получения трансформированных клонов из первичных клеток HER из геля выделяли фрагменты ДНК, содержащие подходящие экспрессионные кассеты. Полагают, что удаление (перекрывающихся) векторных последовательностей уменьшает шанс совместной интеграции. Для этого pCC.E1A и рСС.Е 1 АВ 21 расщепляют BsaAI и AflIII, а инсерционные фрагменты очищают из геля с применением устройства ELU-Trap (Schleier and Schuell) по инструкциям производителя. Данный аппарат обеспечивает выделение больших количеств фрагмента ДНК. Конструкции pEC.E1B и pSC.55K расщепляютAatII/HincII и AflIII/HincII, соответственно, и инсерционные фрагменты выделяют, как указано выше. Первичные клетки культивируют и трансфицируют, как описано выше. Для трансфекции выделенные изpCC.E1A и pEC.E1B фрагменты объединяют. Фрагменты ДНК, выделенные из рСС.Е 1 АВ 21 объединяют с pSC.55K или трансфицируют отдельно. Затем последние культуры через 7-10 суток после первой трансфекции в зависимости от размера наблюдаемых клонов повторно трансфицируют фрагментом ДНК, выделенным из pSC.55K. За день перед трансфекцией половину чашек трансфицируют только Е 1 АВ 21 и пассируют на 10 см чашках, а затем повторно трансфицируют, другую половину чашек повторно трансфицируют без предшествующего пассажа. Трансформированные клоны, получающиеся в результате данных трансфекции, собирают и наращивают дальше в 96-луночных планшетах и последующих больших масштабах. Участок интеграции и количество копий фрагментов исследуют с применением саузерн-блоттинга и посредством ПЦР для выявления нахождения вставок в непосредственной близости. В дальнейшем предпочтительно применяют клоны, где Е 1 А и Е 1 В-55K в геноме трансфицированных клеток присутствуют в единственной копии или присутствуют более чем в одной копии, но не в конформации инвертированного повтора данных последовательности, или где кодирующие последовательности Е 1 А и по меньшей мере одного из Е 1 В (в данном случае - Е 1 В-55K) разделены по меньшей мере посредством 4 т.п.н., предпочтительно по меньшей мере посредством 10 т.п.н., более предпочтительно по меньшей мере посредством 34,5 т.п.н. Пример 2. Получение комплементирующих клеточных линий с применением нуклеиновых кислот,несущих области Е 1 А и Е 1 В, разделенные большими спейсерными последовательностями Как описано в предыдущем примере, стабильно трансформированные клеточные клоны из первич- 15010924 ных клеток возможно получать с применением отдельных плазмид для Е 1 А и Е 1 В. Однако когда фрагменты ДНК трансфицируют вместе, все еще остается шанс того, что трансфицированные фрагменты окажутся в непосредственной близости друг от друга, хотя этот шанс уменьшен в отсутствие значительного перекрывания последовательностей. Возможности интеграции в хромосому экспрессионных кассет Е 1 А и Е 1 В с менее чем 30 т.п.н. последовательности без E1 между ними можно избежать фланкированием различных экспрессионных кассет Е 1 большими участками последовательностей ДНК, не кодирующими Е 1 (так называемые "спейсерные" фрагменты). Если несущий Е 1 А фрагмент интегрируется в геном полученной пакующей клетки следом за несущим Е 1 В фрагментом, то большие фланкирующие последовательности должны создавать достаточное расстояние для устранения шанса того, что кодирующие Е 1 А и Е 1 В последовательности рекомбинируют в одной и той же векторной молекуле при размножении рекомбинантного аденовирусного вектора в указанной пакующей клетке. Неограничивающие примеры больших спейсерных фрагментов ДНК, которые можно применять, представляют собой большие последовательности, происходящие, например, из человеческого гена дистрофина или человеческого гена Аро-Е 1. Также можно применять другие спейсерные молекулы, причем даже из источников, отличных от человека. Предпочтительно, фланкирующие последовательности не содержат кодирующие области для функциональных белков и, таким образом, могут происходить из интронных последовательностей. Также последовательностям Е 1 А и Е 1 В не обязательно находиться в различных молекулах, но они могут находиться на одной и той же макромолекуле, такой как космида. Примеры данных несущих Е 1 А и Е 1 В молекул приведены на фиг. 13. В предпочтительных вариантах осуществления расстояние между кодирующими областями Е 1 А и Е 1 В составляет более 34,5 т.п.н., так как тогда совместная вставка данных двух областей в вирус приведет к слишком большому для упаковки геному. Данная ситуация может произойти, например, когда применяют два отдельных космидных фрагмента приблизительно из 40 т.п.н., несущих экспрессионные кассеты приблизительно в середине. Однако, допустив, что Е 1 в форме структур инвертированных повторов вносит вклад в частоту возникновения HDEP, конструкции, где кассеты Е 1 А и Е 1 В расположены в одном космидном фрагменте общей длины приблизительно 22 т.п.н.(подобно тому, как на фиг. 13I), достаточно, даже когда вторая копия расположится в геноме клетки в правильной ориентации следом за первой. Затем полная интеграция структуры с зеркальным отражением будет также вовлекать фрагмент длиной более 38 т.п.н. Также если наличие инвертированных повторов увеличивает частоту образования HDEP, тогда ситуацию, где несколько копий интегрируются в виде прямых повторов, рассматривают как менее проблематичную, даже когда фрагмент ДНК, включающий в себя 2 полных копии Е 1 А и Е 1 А, обладает длиной менее или равной 20 т.п.н. В отсутствие инвертированных повторов интеграция любого содержащего Е 1 повтора, большего чем место, оставленное в рекомбинантном вирусе (т.е. 38 т.п.н. минус фактическая длина генома рекомбинантного вируса), в рекомбинантный вирус в виде последующей стадии заставляет его удалить части необходимых вирусных последовательностей для обеспечения упаковки и, таким образом, размножения. Анализ первого геномаHDEP, возникшего вследствие гомологической рекомбинации (Murakami et al., 2002), показал, что делеция вирусных последовательностей возможна. Последовательности ДНК, интегрирующие в геном клетки, не всегда доступны для активирующих факторов транскрипции вследствие ассоциированной с хроматином репрессии. В частности, когда используют большие фрагменты интронной ДНК, происходящие из областей генома, которые обычно неактивны в клетке, которую трансдуцируют данными последовательностями, генная экспрессия может отключаться вследствие неактивного хроматина. Недавно идентифицировали последовательности, способные ингибировать данную репрессию. Примеры представляют собой элемент HS4 куриного глобина (патент США 5610053), функционирующий в виде инсуляторной последовательности, scs или элемент scs Drosophila (Kellum et al., 1991; Farkas et al., 1992), и ряд последовательностей в человеческом геноме (так называемые противорепрессорные элементы или элементы STAR), идентифицированных при специфическом скрининге на противорепрессорные элементы (Kwaks et al., 2003; WO 03/004704). Включение таких последовательностей, которые предотвращают позиционное молчание генов Е 1 А и/или Е 1 В, в экспрессирующие Е 1 А и Е 1 В конструкции, также увеличивает количество иммортализованных клонов. Следовательно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько элементов STAR, например STAR 7 (инвентарный номер GenBank AY190751) или STAR 40(инвентарный номер GenBank AY190756), присутствуют по меньшей мере в одной из экспрессирующих Е 1 А и/или Е 1 В конструкций. Предпочтительно указанные элементы фланкируют обе стороны кодирующих последовательностей Е 1 А и/или Е 1 В, т.е. зкспрессирующие конструкции могут содержать от 5' к 3': элемент STAR регулирующую экспрессию последовательность (например, промотор), кодирующую последовательность Е 1 А; или кодирующие последовательности Е 1 А + одного из Е 1 В; или одну кодирующую последовательность Е 1 В; или обе кодирующие последовательности Е 1 В - последовательность полиаденилирования - элемент STAR. Пример 3. Получение клеточных линий посредством Е 1 А и Е 1 В на отдельных конструкциях и фланкированных балластной ДНК В данном примере описано получение новых клеточных линий по изобретению посредством совместной трансфекции лервого фрагмента ДНК с экспрессионной кассетой Е 1 А, фланкированной большой- 16010924 балластной ДНК и второго фрагмента ДНК с экспрессионной кассетой Е 1 В, фланкированной плазмидной ДНК. В данном примере в качестве балластной ДНК, окружающей экспрессирующую Е 1 А плазмиду, взяли последовательность интрона 44 человеческого дистрофина (инвентарный номер GenBank M86524),клонированную в каркас космидного вектора (pdys44; фиг. 17). Конструкцию pCC.E1A (описанную в примере 1; фиг. 4) расщепляли AflIII и AvrII (New EnglandBiolabs) и выступающие концы делали тупыми фрагментом Кленова (New England Biolabs). Расщепленные фрагменты разделяли в 0,5% агарозном геле в ТАЕ, а фрагмент длиной 2 т.п.н., соответствующий экспрессионной кассете PGK-E1A, очищали с применением набора для экстракции из геля (Qiagen) по инструкциям производителя. Конструкцию pdys44 (фиг. 17) расщепляли BglII (New England Biolabs), а выступающие концы превращали в тупые с применением фрагмента Кленова. Фрагменты разделяли в 0,5% агарозном геле в ТАЕ,а фрагмент длиной 27 т.п.н., содержащий каркас плазмиды и часть интрона дистрофина, вырезали. Затем кусочки геля помещали в шприц, содержащий немного стекловаты, и с применением поршня содержащий ДНК буфер помещали в пробирку "eppendorf". Полученный таким образом раствор ДНК содержал приблизительно 5 нг/мкл и его применяли непосредственно в реакции лигирования с очищенным фрагментом PGK-E1A длиной 2 т.п.н. Трансформация в компетентные клетки DH5T1 приводила в результате к конструкции р 441.ссЕ 1 А (фиг. 18). Конструкция содержит Е 1 А под контролем промотора человеческого PGK и синтетического сигнала polyA. В качестве зкспрессирующей Е 1 В плазмиды в данном примере применяли конструкцию рЕ 1 В (описанную в примере 1; фиг. 3). Плазмида содержит Е 1 В под контролем его собственного промотора и сигнал polyA вируса гепатита В (HBV). Конструкцию р 44-1.ссЕ 1 А расщепляли XhoI и PmeI, а расщепленную ДНК очищали посредством экстракции фенолом/хлороформом (1:1) с последующим осаждением этанолом (получая в результате кодирующие последовательности Е 1 А, фланкированные балластом длиной приблизительно 11,6 т.п.н. вверх (включая сюда промотор PGK) и приблизительно 6,5 т.п.н. вниз (включая сюда синтетический сигнал polyA) от кодирующих последовательностей Е 1 А). Затем ДНК осаждали, отмывали 70% этанолом и асептически растворяли в стерильном ТЕ без эндотоксинов. Плазмиду рЕ 1 В расщепляли ScaI и очищали, как указано выше (получая в результате кодирующие последовательности Е 1 В, фланкированные балластом длиной приблизительно 1,4 т.п.н. вверх и более чем 2,3 т.п.н. вниз от кодирующих последовательностей Е 1 В, где балласт ниже Е 1 В включает в себя последовательность polyA HBV). Первичные человеческие клетки HER культивировали и трансфицировали на пассаже номер 6(PN6) в одной серии трансфекций и на PN9 во второй серии трансфекций. Культивирование клеток HER и трансфекций проводили способами, описанными в примере 1. Содержащие Е 1 А и Е 1 В ДНК, полученные выше, для различных трансфекций смешивали в различных пропорциях (в обоих фрагментах отсутствует значительное перекрывание по отношению друг к другу, происходящее из вирусных последовательностей или регулирующих последовательностей, тем самым снижая шансы гомологичной рекомбинации между двумя фрагментами; если оба фрагмента могут формировать одну молекулу нуклеиновой кислоты (например, посредством соединения конец-в-конец или лигирования, теоретическая возможность), и впоследствии интегрировать в геном как одна единица, кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В в полученных в результате клетках будут разделены более чем 4 т.п.н. балластных последовательностей (по меньшей мере 6,5 т.п.н. (ниже Е 1 А) + 1,4 т.п.н. (выше Е 1 В) = по меньшей мере 7,9 т.п.н. между кодирующих последовательностей Е 1 А и Е 1 В, в теории). Всего трансфицировали 8 чашек приблизительно эквимолярными соотношениями обеих конструкций (17 мкг плазмиды с Е 1 А и 3 мкг плазмиды с Е 1 В), а 3 чашки трансфицировали 10 мкг каждого фрагмента. В обеих сериях трансфекций наблюдали очаги, но в случае 10 мкг каждой конструкции получали относительно больше очагов. КонструкциюpIG.E1A.E1B, расщепленную AseI и BglI, применяли в качестве положительного контроля (20 мкг ДНК/чашку) в отдельных чашках. Как и ожидалось, эффективность формирования очагов была выше при (одной) плазмиде положительного контроля, чем при двух отдельных фрагментах (из р 44-1.ссЕ 1 А и рЕ 1 В). Плазмида pIG.E1A.E1B была приблизительно в 10 более эффективной. Кроме того, при трансфекций и плазмидой положительного контроля, и двумя фрагментами выявили, что приблизительно 8090% отобранных трансформированных клеточных клонов являются жизнеспособными и приняли их в качестве клеточной линии. Данные эксперименты отчетливо показывают, что возможно трансформировать первичные клетки посредством совместной трансфекции генами Е 1 А и Е 1 В в различных фрагментах ДНК и фланкированных посредством (неперекрывающейся) балластной ДНК. Всего дополнительно проанализировали 6 клонов HER01-B-71 (депонированный 1 октября 2004 вEuropean Collection of Cell Cultures (ЕСАСС) под номером 04100101), HER01-H-87 (депонированный 1 октября 2004 в ЕСАСС под номером 04100102), HER01-H-86, HER01-H-88, HER01-H-89 и HER01-B-90. Экспрессию генов E1 анализировали с применением специфических для белков Е 1 антител на вес- 17010924 терн-блоте. Для анализа вестерн-блот применяли белок из лизата полученных клеточных клонов общим количеством 10 мкг. Образцы денатурировали в течение 15 мин при 70 С после добавленияобъема буфера для образца NuPage (Invitrogen). В качестве положительного контроля применяли клеточный лизат PER.C6. Лизат нетрансфицированных первичных клеток HER (пассаж номер 6) служил в качестве отрицательного контроля. Образцы запускали на 10% геле SDS-PAGE BisTris (Invitrogen), рядом с предварительно окрашенным маркером Seeblue plus2 (Invitrogen). Вестерн-блот получали из геля. Применяли следующие антитела: любое из 1) Е 1 А: мышиного против человеческого Ad2.E1A (1:400, Santa Cruz),или 2) Е 1 В.19K: крысиного против человеческого Е 1 В 21K моноклонального (1:500, Oncogene), или 3) Е 1 В.55K: мышиного против человеческого 55Kda (полученное из линии гибридомных клеток С 9 А 1 С 6,полученных от Dr. R. Hoeben, LUMC, Leiden). В качестве вторых антител применяли следующие антитела: 1) Е 1 А: козьи IgG-HRP против мышиных антител (Biorad), 2) E1B.19K: козьи IgG-HRP против крысиных антител (Epcam), 3) Е 1 В.55 К: мкл козьих IgG-HRP против мышиных антител (Biorad). Белки визуализировали посредством применения анализа ECL+ (Amersham). Исходя из данных экспериментов, ясно, что все тестируемые клоны экспрессируют белки Е 1 А и Е 1 В и что уровни сравнимы с уровнями в клетках PER.C6 (фиг. 19). Это подтверждает то, что трансформация первичных клеток в самом деле индуцируется экспрессией E1 Ad5 и не является результатом самопроизвольного события. Функциональную экспрессию генов E1 Ad5 в данных клеточных линиях также можно протестировать, показав то, что данные клетки способны комплементировать вирусы Ad5 с делецией Е 1. Таким образом, 6 различных клеточных клонов тестировали на репликацию вектора Ad5.eGFP, основанного наAd5 с делецией Е 1 (делеция нуклеотидов 455-3510 последовательности Ad5) аденовирусного вектора,экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок. Для этого клетки высевали при плотности 1106 клеток/лунку и заражали на следующие сутки при множественности заражения (MOI) 5 вирусных частиц(VP)/клетку. В качестве положительного контроля также высевали клетки PER.C6 и заражали при MOI 5. Через пять суток во всех лунках наблюдали полный цитопатогенный эффект (СРЕ). Клетки и среду собирали, замораживали/оттаивали три раза и центрифугировали для удаления клеточного дебриса. Затем супернатанты (грубые лизаты) применяли для заражения клеток А 549. Для этого 5105 клеток А 549 высевали в 24-луночные планшеты и через сутки заражали 50 мкл грубых лизатов. Через двое суток клетки А 549 собирали и анализировали на экспрессию GFP посредством FACS. Результаты показывают,что все клоны способны комплементировать вектор Ad5.eGFP (фиг. 20). Примечательно, что в аденовирусном векторе (с делецией Е 1, с отсутствием нуклеотидов 455-3510) не было перекрытия с последовательностями Е 1, присутствующими в клеточной линии (Ad5 нуклеотиды 459-3510), и, следовательно, сочетание аденовирусного вектора с новыми клеточными линиями в данном примере представляет собой пакующую систему по изобретению, а получение рекомбинантного аденовируса в данном примере представляет собой способ получения партии рекомбинантного аденовируса по изобретению. Для демонстрации того, что кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В в геноме клеток разделены более чем 4 т.п.н. геномную ДНК полученных клеточных линий с применением зондов Е 1 А и Е 1 В тестировали на саузерн-блотах. Для этого геномную ДНК расщепляли рестрикционными эндонуклеазамиEcoRV и BglII (фиг. 21). Расщепленную ДНК разделяли по размеру посредством электрофореза в геле(например, с применением гель-электрофореза с инверсией полюсов, FIGE, для обеспечения разделения больших фрагментов ДНК), а затем переносили на нейлоновую мембрану посредством капиллярного переноса. Для гибридизации на блотах радиоактивно метили три различных зонда. Один зонд Ad5.E1A получают из рестрикционного фрагмента EcoRV-SalI (1330 п.н.; см. фиг. 21), расположенного в направлении 3' от участка EcoRV в гене Ad5.E1A. Получают два зонда Ad5.E1B: Ad5.E1B (5'), из фрагментаBssHII-BglII (1354 п.н.) и Ad5.E1B(3'), из фрагмента BglII-BsrGI (652 п.н.), расположенных на 5'-конце и 3'-конце от участка BglII в гене Ad5.Е 1 В, соответственно. Получали идентичные блоты, содержащие расщепленную геномную ДНК полученных клеточных линий или, альтернативно, блот очищали после гибридизации первого зонда, а затем гибридизовали со вторым. Любой способ должен обеспечивать перекрывание сигналов, полученных с зондами к Е 1 А и Е 1B. Если после трансфекции и интеграции в течение получения трансформированной клеточной линии фрагмент Е 1 А интегрируется следом за содержащим Е 1 В фрагментом, зонды для Е 1 А и Е 1 В выявляют на блотах одни и те же полосы, где размер полос идентифицирует дистанцию между данными двумя генами. Так как ориентация фрагментов Е 1 А и Е 1 В относительно друг друга неизвестна, два зонда к Е 1 В применяют раздельно, обеспечивая гибридизацию или с фрагментом в направлении 5' или в направлении 3' от рестрикционного участка BglII. Если фрагмент Е 1 А интегрируется следом за другим фрагментом Е 1 А, тогда полоса, получающаяся в результате расщепления EcoPV, не распознается зондом к Е 1 В. Также полосы, не распознающиеся обоими зондами,будут образовывать одиночные интеграции или концевые фрагменты. В совокупности эксперименты в данном примере ясно показывают, что совместная трансфекция первичных человеческих клеток отдельными плазмидами, одна из которых содержит Е 1 А, фланкированный большой балластной областью, и одна содержит Е 1 В, фланкированный каркасными последователь- 18010924 ностями, приводит в результате к трансформированным клеточным линиям. Кроме того, данные клеточные линии экспрессируют белки Е 1 в количествах, достаточных для эффективного комплементирования векторов Ad5 с делецией Е 1. В альтернативном варианте осуществления последовательности Е 1 А и Е 1 В клонируют в одну конструкцию, с балластным фрагментом между данными последовательностями, после чего с применением данной одиночной конструкции получают клеточные линии. Очевидно, что если желательны большие дистанции между Е 1 А и Е 1 В, кодирующие последовательности Е 1 В также можно фланкировать более длинной балластной нуклеиновой кислотой и/или длину балластов, фланкирующих кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В, можно увеличить посредством стандартных обычных способов молекулярной биологии, следуя указаниям настоящего описания. Таким образом, очевидно, что данный пример не следует рассматривать как ограничивающий объем изобретения фактически проведенными экспериментами, но предпочтительнее как иллюстрацию концепций настоящего изобретения. Таблицы Таблица. Трансформация первичных клеток HER экспрессирующими Ad5-E1 конструкциями ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения клетки с интегрированным в ее геном кодирующими последовательностями Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В-55K аденовируса, где способ включает стадию введения в клеткупредшественник:a) единичной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующие последовательности Е 1 А и Е 1 В-19K и Е 1 В-55K, где по меньшей мере две из этих трех кодирующих последовательностей разделены по меньшей мере 4 т.п.н.; илиb) двух или более молекул нуклеиновой кислоты, содержащих кодирующие последовательности Е 1 А, Е 1 В-19K и Е 1 В-55K, которые в клетке могут образовывать единичную молекулу нуклеиновой кислоты а). 2. Способ по п.1, где указанная кодирующая последовательность Е 1 А и по меньшей мере одна кодирующая последовательность Е 1 В находятся под контролем гетерологичного промотора и/или сигнала полиаденилирования. 3. Способ по п.1, где по крайней мере две указанные кодирующие последовательности разделены по крайней мере 10 т.п.н. 4. Способ по п.3, где по крайней мере две указанные кодирующие последовательности разделены по крайней мере 34,5 т.п.н. 5. Клетка, способная комплементировать аденовирусные векторы, у которых отсутствует область Е 1, без образования зависимых от хелперной последовательности, содержащих Е 1 частиц, где клетка получена способом по любому из пп.1-4. 6. Способ получения партии рекомбинантного аденовируса с делецией в области Е 1, включающий стадии:a) введения указанного рекомбинантного аденовируса или его генома в клетку, содержащую после- 30