Способ лечения заболевания

Описаны способы лечения заболеваний, включая злокачественные новообразования, рассеянный склероз и нервные заболевания, с использованием пептидов кортикотропин-релизинг-фактора 015272 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к лекарственному средству и, в частности, к фармацевтической композиции. Лекарственное средство считается особенно подходящим для лечения неврологических расстройств, хотя ряд других расстройств также можно лечить с использованием изобретения. Аспекты изобретения также относятся к способам изготовления указанного лекарственного средства и к способам лечения заболеваний с использованием указанного лекарственного средства. Уровень техники В РСТ публикациях WO 03/004049 и WO 03/064472 описываются терапевтические агенты и способы лечения, которые основаны на сывороточной композиции, имеющие множество неожиданных благоприятных эффектов. Соответствующее содержание каждого из указанных двух текстов целиком включено в настоящий документ в качестве ссылки. В частности, указанные ссылки даются для лучшего понимания того, каким образом может быть изготовлен терапевтический агент, а также показаний к его применению. Обычно козу иммунизируют лизатом вируса ВИЧ-3 В, выращенного на клетках H9. Полученную сыворотку считают активной в отношении, среди прочих заболеваний, рассеянного склероза. Дается далее ссылка, в частности, на раздел на страницах 3 и 4 WO 03/004049, озаглавленный Пример получения козьей сыворотки, на предмет дополнительных подробностей получения сыворотки. Указанный раздел включен в настоящий документ в качестве ссылки. Краткое резюме представлено ниже. Приблизительно 400 см 3 крови отбирают у козы при соблюдении стерильных условий. Обычно у животного можно повторно брать кровь через 10-14 дней, когда объем крови восполняется. Может быть полезной методика предварительного забора крови, которая стимулирует выработку активных компонентов сыворотки. Кровь затем центрифугируют для отделения сыворотки, и сыворотку фильтруют для удаления больших сгустков и частиц. Затем сыворотку обрабатывают перенасыщенным раствором сульфата аммония (47% раствор при 4C) для осаждения антител и другого продукта. Полученный раствор центрифугируют на центрифуге Beckman J6M/E при 3500 об./мин в течение 45 мин, после чего удаляют надосадочную жидкость. Осажденный иммуноглобулин и другой твердый продукт ресуспендируют в PBS буфере (забуференный фосфатом физиологический раствор), достаточном для повторного растворения осадка. Затем раствор подвергают диафильтрации в отношении PBS буфера с отсеканием молекулярной массы 10000 дальтон при 4C. После диафильтрации продукт фильтруют через фильтр 0,2 мкм в стерильный контейнер и доводят концентрацию белка до 4 мг/мл. Раствор помещают во флаконы для введения однократных доз по 1 мл и хранят при -22C до использования. Указанный продукт называется в настоящем документе сывороточной композицией, композицией или продуктом, в то время как лечение пациента включает введение композиции пациенту подходящим путем (обычно подкожно). Использование лизата вируса ВИЧ-3 В в качестве иммуногена, как полагают, не является существенным для продукции активной сыворотки; полагают, что среда, которую использовали для выращивания вирусной культуры, или которая является подходящей для указанного выращивания, также может вызвать подходящий ответ, когда используется в качестве иммуногена. Надосадочная жидкость ростовой среды для клеточных культур, таких как PBMC или раковая бессмертная клеточная линия., которую используют для выращивания ВИЧ-3 В, приводится в качестве примера. Для создания композиции нет необходимости в присутствии ВИЧ или другого вируса, чтобы продуцировать эффективный иммуноген. Другие подходящие иммуногены перечислены на страницах 12 и 13 WO 03/064472. Пирогенное вещество (например, RIBI или адъювант Фрейнда) может быть использовано для того,чтобы стимулировать продукцию активного компонента в сыворотке. Другим возможным фактором может быть воздействие на животное дневного света; при этом более продолжительные часы дневного света (или воздействие эквивалента дневного света) может повысить уровни активного компонента в сыворотке. Применение сывороточной композиции Композиция, как полагают, является активной в отношении ряда заболеваний. Ссылка также дается в указанных ранее публикациях на композицию, пригодную для лечения воспалительных заболеваний,таких как ревматоидный артрит; неврит зрительного нерва; аутоиммунные заболевания; повреждение аксонов или нервов и злокачественные новообразования. Композиция, как полагают также, вызывает уменьшение вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных пациентов и возрастание количества клетокCD4+. Описаны несколько других заболеваний, которые можно лечить с использованием композиции, и дается ссылка на указанные более ранние публикации для более полного понимания диапазона и природы состояний, которые можно лечить. В частности, содержание WO 03/004049 и WO 03/064472 конкретно включено в настоящий документ в качестве ссылки. Не являющийся исчерпывающим перечень заболеваний, в отношении которых сывороточная композиция, как полагают, является эффективной, помимо указанных выше, включает злокачественные новообразования, в частности, миеломы, меланомы и лимфомы; сердечно-сосудистые заболевания. Примеры заболеваний, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включа-1 015272 ют цереброваскулярную ишемическую болезнь; смешанные коллагенозы; склеродерму; анафилаксию; септический шок; кардит и эндокардит; заживление ран; контактный дерматит; профессиональные заболевания легких; гломерулонефрит; отторжение трансплантата; височный артериит; воспалительные сосудистые заболевания; гепатит и ожоги. Все указанные заболевания могут иметь воспалительный компонент, но, как полагают, их можно дополнительно лечить на основе недемиелинизирующего неврального аспекта заболевания. Дополнительные недемиелинизирующие заболевания, которые можно лечить, включают каналопатии; боль при злокачественном новообразовании; синдром хронической усталости; фибромиозит; синдром раздраженного кишечника; профессиональное заболевание верхней конечности; гистаминовую головную боль; мигрень и хроническую дневную головную боль. Композиция может быть пригодной для лечения аутоиммунных заболеваний, включая волчанку,псориаз, экзему, тиреоидит и полимиозит. Композиция также, как полагают, является эффективной для лечения воспалительных состояний. Композиция также может обладать антиангиогенными свойствами, обусловленными молекулами тромбоспондина-1 (TSP-1) и тромбоцитарным фактором-4 (PF-4). Полагают, что композиция также может быть эффективной для лечения животных, в частности, но не исключительно, для лечения атопического дерматита у собак, меланомы полости рта у собак и легочных болезней у лошадей. Природа сыворотки Несмотря на то, что сывороточная композиция демонстрирует множество неожиданных эффектов и широко изучалась, до настоящего времени активный компонент или компоненты сыворотки все еще не идентифицированы. Это является недостатком, как с точки зрения выделения активного компонента для дальнейшего изучения, так и с точки зрения поиска возможных альтернативных источников активного компонента или компонентов. Кроме того, необходимо осуществлять лечение пациентов с использованием сыворотки, что требует инъекций, и представляет собой некоторые ограничения с точки зрения изготовления композиции и обращения с ней. Полагают, что сыворотка содержит биологически активные компоненты, чувствительные к протеазному расщеплению. Заявители в настоящее время идентифицировали ряд потенциально активных компонентов сыворотки. Данная идентификация позволяет изготавливать новые фармацевтические композиции, содержащие один или более активных компонентов в разнообразных формах, и осуществлять лечение одного или более заболеваний, перечисленных выше и в более ранних заявках авторов, с использованием активного компонента (компонентов). Идентификация также открывает новые подходы к лечению различных заболеваний на основе активного компонента (компонентов), а не просто самой сыворотки. Сущность изобретения Изобретение относится к биологически активной композиции, которая служит пусковым механизмом для молекулярного каскада у подвергаемых лечению пациентов. Первый аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид кортикотропин-релизинг-фактор (CRF). CRF известен также как кортикотропин-релизинг-гормонCRF представляет собой пептид, вырабатываемый в гипоталамусе, и, как полагают, он участвует в ответе на стресс. Человеческий CRF подробно описан в записи 122560 OMIM (он-лайновый сайт менделевской наследственности у человека по адресу http://www.ncbi.niin.nih.gov/). Нуклеотидная и аминокислотная последовательность человеческого CRF также известна и имеет номер BC011031 в GENBANK. Известная последовательность и данные по размерам человеческого CRF позволит специалисту выявить эквивалентную информацию для не относящегося к человеку CRF, включая CRF козы. Под пептидом CRF подразумевается любой пептид, имеющий соответствующую последовательность, структуру или функцию. Специалисту будет понятно, что канонические нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, приведенные для человеческого CRF в записи GENBANK, упомянутой выше, можно до определенной степени изменять без влияния на структуру или функцию пептида. В частности, аллельные варианты и функциональные мутанты включены в данное определение. Мутанты могут включать консервативные аминокислотные замещения и фрагменты и производные CRF. Введение CRF пациенту, как полагают, стимулирует выработку эндогенного CRF, что, в свою очередь, стимулирует выработку проопиомеланокортина (POMC) и родственных ему составляющих пептидов. РОМС представляет собой пептид (прогормон), вырабатываемый гипофизом (а также рядом других органов, некоторыми опухолями, такими как меланомы, и нормальными клетками кожи), который является предшественником ряда кортикотропных гормонов, которые вызывают ряд эффектов у хозяина. РОМС представляет собой предшественник альфа-, бета- и гамма-меланоцитостимулирующего гормона(MSH); адренокортикотропина (ACTH); бета- и гамма-липотропина (LPH) и бета-эндорфина. Все указанные гормоны образуются в результате расщепления одного большого предшественника, РОМС, и называются в настоящем документе продуктами РОМС.-2 015272 Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит не относящийся к человеку CRF; удобно, CRF копытного животного, и наиболее предпочтительно, CRF козы. Неожиданно было установлено,что козья сыворотка содержит CRF, особенно, если коза стимулирована физиологическим стрессом, таким как кровопускание или иммунизация. Это обеспечивает удобный источник CRF для фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Полагают также, что CRF может иметь самоподдерживающийся эффект у пациента, заключающийся в том, что введение первоначального количества CRF приводит к выработке эндогенного CRF у пациента; таким образом, первоначальное введение низкого уровня CRF может оказывать значительное действие на пациента, включая возрастание уровней пептидов РОМС. Введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению можно осуществлять перорально или парентерально. Способы парентеральной доставки включают местное, внутриартериальное,внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, внутривенное,интраперитонеальное или интраназальное введение. Помимо активных ингредиентов, указанные композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая эксципиенты и другие компоненты, которые облегчают изготовление из активных соединений препаратов, подходящих для фармацевтического введения. Фармацевтические композиции для перорального введения можно изготавливать с использованием фармацевтически приемлемых носителей, известных специалистам, в дозах, подходящих для перорального введения. Такие носители делают возможным изготовление композиций в виде таблеток, пилюль,драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., удобных для глотания субъектом. Фармацевтические композиции для перорального использования можно получить посредством объединения активных соединений с твердым эксципиентом, необязательно, измельчения полученной смеси и изготовления из смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных соединений, если желательно получить таблетки или ядра драже. Подходящие эксципиенты включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит, сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлоза, такая как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натрийкарбоксиметилцеллюлоза; и камеди, включая аравийскую камедь и трагакант; а также белки, такие как желатин и коллаген. Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон,агар, альгиновая кислота или ее соль. Ядра драже могут быть изготовлены с подходящими покрытиями, такими как концентрированные сахарные растворы, которые также могут содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон,гель карбопола, полиэтиленгликоль, диоксид титана, растворы лаков и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красящие вещества или пигменты могут быть добавлены в покрытия таблеток или драже для идентификации продуктов или указания на количество активного соединения. Фармацевтические препараты, которые могут быть использованы перорально, включают капсулы из плотно пригнанных частей, изготовленные из желатина, а также мягкие, запечатанные капсулы, изготовленные из желатина и покрытия, такого как глицерин или сорбит. Капсулы из плотно пригнанных частей могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителем или связующими агентами,такими как лактоза или крахмалы, лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно,стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без них. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений. Для инъекций фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в водных растворах, предпочтительно, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть изготовлены в виде соответствующих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Необязательно,суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений, чтобы сделать возможным изготовление высококонцентрированных растворов. Для местного или назального введения в композиции можно использовать агенты, усиливающие проникновение через определенный барьер. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены, преимущественно, в соответствии со стандартными производственными методиками, известными специалистам. Композиция может также содержать один или более пептидных регуляторных факторов или релизинг-факторов, которые могут индуцировать каскад высвобождения других пептидов из ряда клеток пациента. Такие дополнительные факторы предпочтительно получают из того же самого источника, что иCRF, в частности козьей сыворотки. Подходящие факторы включают, среди прочих, -HLA, TGF- и IL-10. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может содержать один или более из вазопрессина, бета-эндорфина и энкефалина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция может содержать CRF-связывающий белок, CRF-BP. Последний связывает CRF и может действовать как резервуар для последующего высвобождения CRF для пациента. Композиция может дополнительно содержать пептид РОМС или продукт РОМС; определенные продукты РОМС могут быть пригодными для введения пациенту с целью стимуляции дальнейшей продукции, или для получения желаемого ответа до того, как станет возможной продукция эндогенного РОМС. Человеческий РОМС подробно описан в записи 176830 OMIM (он-лайновый сайт менделевской наследственности у человека по адресу http://www.ncbi.nim.nih.gov/). Нуклеотидная и аминокислотная последовательность человеческого РОМС также известна и имеет номер BC065832 в GENBANK. Человеческий РОМС дает начало гликозилированному белковому предшественнику, имеющему молекулярную массу 31 кДа. Под пептидом РОМС подразумевается любой пептид, имеющий соответствующую последовательность, структуру или функцию. Специалисту будет понятно, что канонические нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, приведенные для человеческого РОМС в записи GENBANK, упомянутой выше, можно до определенной степени изменять без влияния на структуру или функцию пептида. В частности, аллельные варианты и функциональные мутанты включены в данное определение. Мутанты могут включать консервативные аминокислотные замещения. Термин пептид РОМС, используемый в настоящем документе, относится к любому пептиду, действующему как предшественник по меньшей мере одной формы MSH, ACTH, по меньшей мере одной формы LPH, -эндорфина, метэнкефалина и лей-энкефалина; и предпочтительно всех из -, - и -MSH; ACTH; - и -LPH; и эндорфина, мет-энкефалина и лей-энкефалина. Несмотря на то, что были проведены исследования, посвященные фармацевтическому потенциалу некоторых отдельных продуктов пептида РОМС, полагают, что не было установлено какой-либо медицинской пользы от введения самого РОМС. Возможно, что сам РОМС не является активным и должен быть расщеплен до своих продуктов, чтобы приобрести активность. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит не относящийся к человеку РОМС; удобно, РОМС копытного животного, и наиболее предпочтительно, РОМС козы. Несмотря на то, что РОМС вырабатывается в гипофизе, и, таким образом, не должно ожидаться его присутствие в сыворотке крови, по меньшей мере, в значительных количествах, неожиданно было установлено, что козья сыворотка содержит РОМС, родственные РОМС пептиды и молекулы, связанные с каскадом РОМС, особенно, если коза стимулирована физиологическим стрессом, таким как кровопускание или иммунизация. Это обеспечивает удобный источник РОМС для фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Полагают также, что РОМС может иметь самоподдерживающийся эффект у пациента, заключающийся в том, что введение первоначального количества РОМС приводит к выработке эндогенного РОМС у пациента; таким образом, первоначальное введение низкого уровня РОМС может оказывать значительное действие на пациента. Полагают, что после введения РОМС и связанных с ним молекул субъекту пептид подвергается протеолизу, с образованием одного или более продуктов РОМС в легко доступной для субъекта форме; имеет место также индукция молекулярного каскада, который стимулирует гипоталамо-гипофизарнонадпочечную ось (НРА). Это согласовывалось бы с ранее наблюдавшимися эффектами неочищенной козьей сыворотки; например, быстрый эффект приятного опьянения после сублингвального введения может иметь место в результате протеолиза РОМС с высвобождением -эндорфина, который затем может всасываться через слизистые оболочки. Кроме того, известно, что -MSH оказывает влияние на выработку IL-10 и TGF-, что вызывает противовоспалительный эффект, согласующийся с эффектом, который наблюдается в случае козьей сыворотки. Известно также, что -MSH ингибирует высвобождение провоспалительных цитокинов. Композиция также может обладать противовоспалительными свойствами. Заявители полагают, что имеет место пассивный перенос противовоспалительного ответа от козы или другого животного, использованного для получения сыворотки, пациенту. Это является следствием процесса очистки, используемого для изготовления композиции, при котором в сывороткесохраняются разнообразные активные факторы. Композиция может также содержать дополнительные активные компоненты, которые оказывают противовоспалительное действие. Как было упомянуто выше, полагают, что первоначальное введение РОМС (необязательно вместе сCRF и/или вазопрессином) может стимулировать нативную выработку РОМС и его регуляторных пептидов. Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид РОМС.-4 015272 В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей два или более из альфа-, бета- и гамма-меланоцитостимулирующего гормона (MSH); адренокортикотропина (ACTH); бета- и гамма-липотропина (LPH) и бета-эндорфина. Принимая во внимание вероятный протеолиз РОМС после введения, может быть возможным достижение аналогичных эффектов путем введения двух или более отдельных гормонов, полученных из РОМС. Фармацевтическая композиция может доставлять указанные гормоны в виде отдельных пептидов или в виде одной или более молекул-предшественников (например, продуктов частичного расщепления РОМС). Предпочтительно в фармацевтическую композицию включают три, четыре, пять, шесть или семь гормонов, которые(необязательно вместе с CRF) индуцируют каскад продолжительной выработки указанных молекул. Различные компоненты могут быть изготовлены в комбинации с одной или более молекулами-носителями,которые связывают один или более компонентов и, таким образом, действуют как депо или резервуар для высвобождения компонента. Молекула-носитель также может быть использована в комбинации с РОМС и родственными ему пептидами. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, выбранного из ревматоидного артрита; неврита зрительного нерва; аутоиммунных заболеваний,включая волчанку, псориаз, экзему, тиреоидит и полимиозит; злокачественных новообразований, в частности миелом, меланом и лимфом; воспалительных состояний; ожирения и сексуальной дисфункции, в частности эректильной дисфункции; способ включает введение CRF пациенту, который в этом нуждается. Альтернативно, способ может включать введение РОМС. Оптимальная доза лекарственного средства до сих пор не установлена; однако может быть подходящим введение лекарственного средства субъекту в дозе от 0,01 до 10 мг/кг; более предпочтительно от 0,01 до 5 мг/кг, от 0,025 до 2 мг/кг и наиболее предпочтительно от 0,05 до 1 мг/кг. В ходе предварительных исследований сывороточный продукт вводили пациентам при общей концентрации белка 4 мг/мл. Точная доза, которую следует ввести, может варьировать в зависимости от таких факторов, как возраст, пол и масса тела пациента, способ и композиция для введения, а также природа и тяжесть заболевания, подлежащего лечению. Другие факторы, такие как диета, время введения, состояние пациента, лекарственные комбинации и реакционная чувствительность, могут быть приняты во внимание. Эффективную схему лечения может устанавливать клиницист, ответственный за лечение. Можно осуществлять одно или более введений, и обычно улучшение наблюдается после серии, состоящей из по меньшей мере трех, пяти или более введений. Повторное введение может быть желательным для поддержания благоприятных эффектов композиции. Лекарственное средство можно вводить любым эффективным путем, предпочтительно путем подкожной инъекции, хотя можно использовать и альтернативные пути, включая внутримышечную инъекцию или инъекцию в место поражения, пероральное, аэрозольное, парентеральное или местное введение. Лекарственное средство предпочтительно вводят в виде жидкой композиции, хотя можно использовать и другие виды композиций. Например, лекарственное средство можно смешивать с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями, и можно изготавливать в виде твердых форм (таблеток,пилюль, капсул, гранул и т.п.) в подходящей композиции для перорального, местного или парентерального введения. Изобретение также относится к применению CRF для изготовления лекарственного средства для лечения одного или более заболеваний, перечисленных выше. Также описывается применение РОМС для изготовления лекарственного средства для лечения одного или более заболеваний, перечисленных выше. CRF или РОМС могут быть изолированными, очищенными, хотя предпочтительным является их введение в комбинации с различными другими компонентами, как обсуждалось выше. В частности,можно использовать биологически активные белки-носители и вазопрессин. Предпочтительно коза является иммунизированной. Полагают, что иммунизация козы стимулирует выработку CRF и вазопрессина, так что они присутствуют в сыворотке в более высоких концентрациях. Альтернативно, козу можно подвергнуть физиологическому стрессу, например кровопусканию. Полагают также, что в некоторых обстоятельствах использование иммуногена может не быть необходимым и что полезный продукт можно получить от неиммунизированного животного (т.е. от животного, которое не было предварительно иммунизировано специфичным иммуногеном). Общеизвестно, что нормальная коза с высокой вероятностью могла ранее подвергаться воздействию иммуногенов окружающей среды, и таких коз можно использовать при изготовлении композиций по настоящему изобретению. Настоящее изобретение, таким образом, относится также к фармацевтическим композициям, содержащим сыворотку, полученную от неиммунизированной козы. Изобретение также относится к применению таких композиций или такой сыворотки для лечения или для изготовления лекарственных средств для лечения различных заболеваний или нарушений, перечисленных выше в разделе применение сывороточной композиции. Краткое описание чертежей Указанные и другие аспекты настоящегоизобретения далее описываются только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых-5 015272 фиг. 1-4 показывают масс-спектрометрические анализы триптического гидролизата сывороточных компонентов; фиг. 5-7 - масс-спектрометрические анализы сывороток пациентов до и после лечения композицией; фиг. 8 и 9 - анализы индукции пептидов РОМС при лечении композицией; фиг. 10-14 - данные по изменению воспалительного профиля пациентов после лечения композицией; фиг. 15 - уровни вазопрессина в человеческой сыворотке и в композиции; фиг. 16 - уровни CRF в человеческой сыворотке и в композиции и фиг. 17 - суммарную диаграмму предполагаемых элементов композиции и способ их действия. Подробное описание изобретения Изготовление сывороточной композиции Приблизительно 400 см 3 крови берут у козы при соблюдении стерильных условий. Обычно у животного можно повторно брать кровь через 10-14 дней, когда объем крови восполняется. Схема предварительного кровопускания может быть полезной для стимуляции выработки активных компонентов сыворотки. Кровь затем центрифугируют для отделения сыворотки, и сыворотку фильтруют для удаления больших сгустков и частиц. Сыворотку затем обрабатывают перенасыщенным раствором сульфата аммония (47% раствор при 4C) для осаждения антител и другого продукта. Полученный раствор центрифугируют на центрифуге Beckman J16M/E при 3500 об/мин в течение 45 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют. Осажденный иммуноглобулин и другой твердый продукт ресуспендируют в буфереPBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), достаточном для повторного растворения осадка. Раствор затем подвергают диафильтрации в отношении буфера PBS с отсеканием молекулярной массы 10000 дальтон при 4C. После диафильтрации продукт фильтруют через фильтр 0,2 микрон в стерильный контейнер и доводят концентрацию белка до 4 мг/мл. Раствор помещают во флаконы для введения однократных доз по 1 мл и хранят при -22C до использования. Обсуждение Эффекты сыворотки были описаны ранее, в то время как определение активных компонентов ранее проведено не было. Анализ сывороточной композиции Образец композиции фракционировали по размеру в геле и выполняли вестерн-блоттинг с использованием антител против -эндорфина. Был выявлен сильный сигнал, указывающий на присутствие эндорфина, хотя средняя молекулярная масса составляла приблизительно 31 кДа, что намного больше ожидаемого размера -эндорфина. Это позволяет предположить, что -эндорфин присутствовал в образце в качестве части более крупного пептида; размер соответствовал размеру РОМС. Заявители провели также масс-спектрометрию композиции и выявили по меньшей мере два полученных из РОМС пептида, -эндорфин и молекулы, родственные кортикотропину. Был также выявленCRH-BP (белок, связывающий кортикотропин-релизинг-гормон). Фигуры 1-4 Пептиды РОМС и CRF-BP были идентифицированы в продукте путем масс-спектрометрии Thermofinnegan LCQ. CRF, главным образом, регулирует синтез и секрецию ACTH в переднем гипофизе. Введение РОМС и/или его составляющих пептидов, помимо CRF и CRF-BP, как полагают, инициирует каскадный эффект, увеличивая, таким образом, продукцию системных и пролонгированно повышенных концентраций пептидов РОМС. CRF-BP обладает способностью действовать как резервуар для CRF. Фиг. 1-4 показывают пики, полученные при масс-спектрометрическом анализе триптического гидролизата продукта, отделенного от контаминирующих белков путем SDS-PAGE. Как было упомянуто выше, некоторые из указанных молекул представляют собой индукторы и регуляторы каскада РОМС. Дополнительное исследование с использованием более сфокусированных анализов (например, пептидного фракционирования, иммунопреципитации и концентрации) выявит больше имеющихся пептидов. Фиг. 1 указывает на присутствие полученного из РОМС кортикотропина, фиг. 2 - CRG-BP, фиг. 3 - проэнкефалина А, а фиг. 4 - проэнкефалина В. Присутствие CRG-BP позволяет предположить, что продукт содержит некоторое количество CRF, в то время как РОМС и родственные ему пептиды также четко присутствуют. Заявители изучали также влияние лечения сывороточной композицией на собственные сыворотки пациентов. Эти эффекты описаны ниже. Лечение индуцирует экспрессию белков/пептидов в сыворотках пациентов. Фиг. 5 показывает результаты масс-спектрометрии сывороток пациентов до и после лечения. Сравниваются спектры от 2 до 10 кДа. Указанные пределы молекулярных масс связаны с биологически активными пептидами, представляющими интерес. Четкие различия в экспрессии пептидов в области от 2 до 6 кДа можно было наблюдать при сравнении профилей сывороток до и после лечения. Для простоты сравнения приведен также вид перекрывающихся профилей. Фиг. 6 показывает сравнительную экспрессию пептидов/белков у шести пролеченных больных. У каждого пациента наблюдались повышенные уровни индуцированной экспрессии пептидов/белков, осо-6 015272 бенно в области 4 кДа. Фиг. 7a показывает масс-спектрометрические профили необработанной козьей сыворотки до вакцинации (преиммунный профиль, верхняя панель), необработанной сыворотки через 53 дня после иммунизации и обработанного продукта. Можно видеть, что в двух нижних панелях профиль сыворотки достоверно отличается от преиммунного профиля, что указывает на индукцию экспрессии белка. Профили,присутствующие здесь, представляют активный продукт, а протокол специфичной иммунизации/кровопускания, как было показано, является полезным для индукции данного сывороточного профиля. Показан вид перекрывающихся профилей (фиг. 7b). Данные по индукции пептидов РОМС Фиг. 8 показывает сравнительные уровни ACTH в сыворотках пациентов до и после полученного лечения. Данные также сравниваются с уровнями ACTH в сыворотках здоровых добровольцев и в продукте, который вводили пациентам. Сыворотки разводили 1:100 и проводили количественный анализ сывороток по сравнению с продуктом, используя ELISA. Данные представляют собой среднее от трех определений +/- стандартные ошибки. Количество образцов: после лечения, n=5; до лечения, n=3; нормальная человеческая сыворотка, n=5. Данные показывают, что лечение повышает уровни ACTH. На фиг. 9 сравниваются уровни -эндорфина в сыворотке пациентов, получавших лечение, с сыворотками тех же пациентов до проведения лечения. Эти данные сравниваются с уровнями в сыворотках здоровых добровольцев и в продукте. Сыворотки разводили 1:100 и проводили количественный анализ сывороток по сравнению с продуктом, используя ELISA. Данные представляют собой среднее от трех определений +/- стандартные ошибки. Данные показывают, что лечение повышает уровни -эндорфина. Данные по переключению с профиля провоспалительных цитокинов TH-1 на профиль противовоспалительных цитокинов TH-2 у пациентов, подвергавшихся лечению. Фиг. 10 показывает уровни TGF- в сыворотках двух групп пациентов до и после лечения. Две группы пациентов (n=3 для каждой группы) демонстрируют отличающиеся друг от друга ответы в том,что касается концентраций выработанного TGF-, но у всех пациентов наблюдалось повышение сывороточных уровней в ответ на лечение (сыворотки до лечения = сывороточные уровни пациентов до лечения; после 2-го и после 5-го = после 2-го и 5-го введения). Данные показывают, что лечение индуцирует повышенную концентрацию противовоспалительного цитокина TGF-. Фиг. 11 показывает уровни IL-4 в сыворотках одной группы пациентов до (сыворотки до лечения) и после лечения. Как можно видеть, после лечения (после 2-го) уровни IL-4 в сыворотках пациентов (n=5) достоверно повышаются. Однако после 5-го введения уровни IL-4 понизились у всех пациентов, но оставались более высокими, чем они были до лечения. Известно, что IL-4 регулирует выработку провоспалительных цитокинов клетками TH-1 в сторону уменьшения. Может быть, что стойкие изменения в концентрации, наблюдаемые у всех пациентов, согласуются с ролью IL-4 в переключении с TH-1 на TH-2. Фиг. 12 показывает уровни IL-6 в сыворотках одной группы пациентов до и после лечения. Как можно видеть, после лечения (после 2-го и после 5-го) уровни IL-6 в сыворотках пациентов (n=4) уменьшаются. Фиг. 13 показывает уровни IFN- в сыворотках одной группы пациентов до и после лечения. Как можно видеть, после лечения (после 2-го и после 5-го) уровни IFN- в сыворотках пациентов уменьшаются. Фиг. 14 показывает, что обработка клеток периферической крови человека (PBMC) индуцирует выработку противовоспалительного цитокина IL-10 в субпопуляции моноцитов. T- и B-лимфоциты и моноциты отделяли от PBMC, полученных от добровольцев. Все клеточные типы обрабатывали эквивалентными дозами продукта в течение 16 ч, а их надосадочные жидкости анализировали на содержание IL-10 с использованием ELISA. Как можно видеть, на уровни IL-10, вырабатываемые популяцией T-клеток,обработка не действовала, и только очень незначительное повышение IL-10 было индуцировано в Bклетках. Однако достоверное увеличение концентрации IL-10 было индуцировано в популяции моноцитов в результате обработки. Данные представляют собой среднее от трех определений +/- стандартные отклонения. Эти данные являются репрезентативными по меньшей мере для трех отдельных экспериментов. Данные по индукции вазопрессина и CRF Фиг. 15 показывает сравнительные уровни вазопрессина в продукте у контрольных пациентов и у пациентов до и после полученного лечения. Фигура показывает отсутствие достоверной разницы между всеми сывороточными группами, однако продукт содержит значительные уровни вазопрессина, достаточные для получения реакции на него у пациентов. Известно, что вазопрессин действует синергически сCRF в том, ЧТО касается высвобождения РОМС. Данные представляют собой среднее от трех определений +/- стандартные отклонения. Эти данные являются репрезентативными по меньшей мере для 3 отдельных экспериментов. Пациенты до лечения, n=3; пациенты после лечения, n=6. Фиг. 16 показывает возросшее количество CRF в продукте по сравнению с плацебо, и возросшее количество у пациентов по сравнению с нелеченными индивидуумами; последнее является свидетельством индукции CRF у пациентов в ответ на лечение. Данные представляют собой среднее от трех опреде-7 015272 лений +/-стандартные отклонения. Эти данные являются репрезентативными по меньшей мере для 3 отдельных экспериментов. Контрольные индивидуумы, n=4; пациенты после лечения, n=13. Резюме и выводы В настоящее время данные, хотя и являются предварительными, согласуются, таким образом, с тем,что главным активным компонентом является CRF, действующий во взаимодействии с остальными компонентами, который, как полагают индуцирует выработку РОМС. Имеются также данные, свидетельствующие о том, что сам РОМС и полученные из РОМС пептиды можно использовать в качестве лекарственного средства. Это предполагает новые фармацевтические композиции и способы применения дляCRF и РОМС, а также указывает на дополнительные заболевания, которые можно лечить с использованием CRF и РОМС. Заявители описали также удобный способ получения CRF и РОМС от коз. Данные в настоящее время говорят о том, что продукт не только содержит CRF, пептиды РОМС и противовоспалительные цитокины (IL-10 и TGF-), но также индуцирует экспрессию и высвобождениеCRF, и, следовательно, пептидов РОМС, у пациента, которые затем трансформируют иммунологический профиль пациента с провоспалительного профиля TH-1 в преимущественно противовоспалительный профиль TH-2. Другие наблюдения, относящиеся к эффектам композиции, согласуются с тем, что активным компонентом является CRF, который приводит к выработке РОМС. Например, влияние на адгезию лейкоцитов может быть проявлением действия бета-эндорфина. Сывороточный продукт увеличивает выработкуIL-10 человеческими PBMC; альфа-MSH влияет на продукцию IL-10. Влияния на нервную проводимость и нейропротективные эффекты можно отнести на счет ACTH и вазопрессина; влияния на аппетит могут быть проявлением действия альфа-MSH. Продукт сам по себе содержит значительные уровни IL-10 иTGF- (данные не представлены). Альфа-MSH обладает мощным противовоспалительным действием при всех основных формах воспаления, и он является антагонистом эффектов провоспалительных цитокинов, таких как TNF и IL1-. Существует взаимное влияние между системами цитокинов и системой РОМС, которое наблюдали у пациентов, которых лечили композицией, в результате чего уменьшалось количество провоспалительных цитокинов и устанавливался профиль противовоспалительных цитокинов TH-2, включая повышенные уровни IL-10 и TGF- (сохранявшийся после курса лечения). Заявители также идентифицировали повышенные уровни IL1- в сывороточном продукте. Сывороточный продукт, как было показано ранее, является весьма чувствительным к протеолитическому разложению; это согласуется с теорией о том, что РОМС после введения подвергается протеолизу с образованием отдельных гормонов, но что дальнейшее разложение устраняет активность. В частности, альфа-MSH, как полагают, обладает значительно сниженной активностью, если удалена концевая трипептидная последовательность; и вновь это согласуется с тем, что активный компонент содержит РОМС. Сам продукт по своей природе является нестабильным, поскольку его активные компоненты являются недолговечными, но демонстрирует мощные эффекты. Заявители также проводили эксперименты, которые говорят о том, что сыворотка модулирует выработку оксида азота лейкоцитами; это согласуется с эффектами бета-эндорфина. Заявители также полагают, что сыворотка ингибирует РНА-индуцированную пролиферацию PBMC, позволяя предположить объяснение для иммуномодулирующих эффектов сыворотки. Заявители также наблюдали уменьшение ответа PBMC на LPS-индуцированную стимуляцию и смешанные лимфоцитарные реакции в присутствии продукта (данные не представлены). Продукт также может индуцировать фосфорилирование тирозина в клетках микроглии головного мозга человека и, как было показано вестерн-блоттингом, модулирует пути NFkB (данные не представлены). Известно, что NFkB регулирует транскрипцию генов, участвующих в регуляции провоспалительных цитокинов, таким образом, ингибирование NFkB будет действовать в сторону уменьшения провоспалительного цитокинового ответа при аутоиммунном заболевании и уменьшать воспалительные реакции. Дальнейшие эксперименты по изучению указанного вопроса находятся в разработке. Рецепторы (MCR3 и MCR4) для некоторых пептидов РОМС обнаружены в ганглионарных клетках сетчатки, которые формируют зрительный нерв и которые можно стимулировать пептидами РОМС, продуцированными после лечения. На этот счет можно отнести некоторые случаи быстрого улучшения зрения у пациентов с MS, имеющих неврит зрительного нерва, который был описан ранее. Известно, чтоACTH инициирует пути кортикостероидов, которые могут демонстрировать свои эффекты уже через 2030 мин. Предварительные данные говорят о том, что концентрации пептидов в продукте могут быть недостаточными для получения терапевтического ответа у пациентов после разбавления в крови пациента. Однако продукт может действовать локально (поскольку он инъецируется в виде подкожного болюса),индуцируя биохимический каскад, который инициирует синтез и высвобождение биологически активных пептидов у получающих лечение пациентов. В настоящее время известно, что следует избегать любых медицинских лекарственных средств, которые препятствуют действию продукта, например, конкурируя с ним за рецепторы или блокируя моле-8 015272 кулы НРА. В подтверждение данной гипотезы, масс-спектрометрией продукта идентифицированы дополнительные молекулы, некоторые из которых участвуют в индукции и регуляции системы кортикотропина; а именно CRH-связывающий белок и лей-энкефалин, предшественник кортикотропина-липотропина и предшественники про-энкефалина А (см. фиг. 1-4). Кроме того, и возможно более важно, заявители установили, что два из основных пептидов РОМС значительно регулируются в сторону повышения в сыворотках подвергнутых лечению пациентов, по сравнению с уровнями до лечения, а также по сравнению с уровнями у здоровых добровольцев, являвшихся контролями. Указанное открытие, совместно с иммунологическими данными, говорит о том, что лечение индуцирует экспрессию и высвобождение пептидов РОМС у пациента, которые затем трансформируют иммунологический профиль пациента из провоспалительного профиля TH-1 в противовоспалительный профиль TH-2. Дальнейшее выяснение каскадного механизма у пациентов в настоящее время осуществляется в ходе исследований. Следует заметить, что, несмотря на то, что продукт является по своей природе противовоспалительным, он не полностью ингибирует воспалительный ответ. Данные заявителей говорят о том, что продукт индуцирует сдвиг от неблагоприятного цитокинового профиля TH-1, наблюдаемого при аутоиммунных заболеваниях, до более благоприятного сбалансированного уровня цитокинов. Это может первоначально проявляться после лечения в виде быстрого противовоспалительного сдвига TH-2, поскольку сеть TH-1 выключается. Позднее сеть TH-1 все же работает, хотя и на более низком уровне. Имеющиеся сообщения о влиянии сывороточного продукта на опухоли навели заявителей на мысль о возможности антиангиогенных эффектов сыворотки. Принимая это во внимание, в продукте были идентифицированы белки тромбоспондин-1 (TSP-1) и тромбоцитарный фактор 4 (PF-4), с использованием масс-спектрометрического анализа триптических гидролизатов из гелей SDS-PAGE. По компьютерной базе данных, используя программу для идентификации пептидов Biowork Browser, выявили выраженные совпадения по нескольким видам, включая Homo sapiens. Несмотря на то, что точное количественное содержание белков TSP-1 и PF-4 в продукте до сих пор не установлено, видимая природа белковых полос в гелях SDS-PAGE указывает на то, что белки присутствуют в биологически значимых количествах (верхняя нанограмма). Краткое изложение предполагаемых компонентов продукта и способа его действия показано на фиг. 17. Продукт, как полагают, содержит CRF, с некоторыми уровнями CRF-BP, бета-эндорфина, вазопрессина и энкефалинов. CRF индуцирует выработку дополнительного CRF у пациента, как и бетаэндорфин и энкефалины. Эндогенный CRF вызывает выработку РОМС, что приводит к появлению, среди прочих ACTH, альфа-MSH и бета-эндорфина. Указанный последний продукт действует как петля обратной связи, в которой низкие уровни стимулируют дальнейшее высвобождение CRF, в то время как высокие уровни ингибируют высвобождение CRF. Указанный полный каскад CRF/POMC, как полагают,индуцирует иммунологический сдвиг у пациента, чем можно объяснить удивительно благоприятные эффекты, которые наблюдаются при ряде разнообразных состояний. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения заболевания, выбранного из ревматоидного артрита; неврита зрительного нерва; аутоиммунных заболеваний, включающих волчанку, псориаз, экзему, тиреоидит и полимиозит; злокачественных новообразований, в частности миелом, меланом и лимфом; воспалительных состояний; ожирения и сексуальной дисфункции, в частности эректильной дисфункции; включающий введение CRF (кортикотропинрилизинг-фактора) пациенту, нуждающемуся в этом. 2. Способ лечения заболевания, выбранного из ревматоидного артрита; неврита зрительного нерва; аутоиммунных заболеваний, включающих волчанку, псориаз, экзему, тиреоидит и полимиозит; злокачественных новообразований, в частности миелом, меланом и лимфом; воспалительных состояний; ожирения и сексуальной дисфункции, в частности эректильной дисфункции; включающий введение РОМС(проопиомеланокортина) пациенту, нуждающемуся в этом. 3. Способ лечения, облегчения или профилактики заболевания, выбранного из ревматоидного артрита; неврита зрительного нерва; злокачественных новообразований, в частности миелом, меланом и лимфом; аутоиммунных заболеваний, включая волчанку, псориаз, экзему, тиреоидит и полимиозит; цереброваскулярной ишемической болезни, смешанных коллагенозов, склеродермы, анафилаксии, септического шока, кардита и эндокардита, заживления ран, контактного дерматита, профессиональных заболеваний легких, гломерулонефрита, отторжения трансплантата, височного артериита, воспалительных заболеваний кровеносных сосудов, гепатита, ожогов, каналопатий, боли при злокачественном новообразовании, синдрома хронической усталости, фибромиозита, синдрома раздраженного кишечника, профессионального заболевания верхних конечностей; воспалительных состояний; атопического дерматита у собак, меланомы полости рта у собак и легочных болезней у лошадей; включающий введение пациентуCRF. 4. Способ лечения, облегчения или профилактики заболевания, выбранного из ревматоидного артрита; неврита зрительного нерва; злокачественных новообразований, в частности миелом, меланом и-9 015272 лимфом; аутоиммунных заболеваний, включая волчанку, псориаз, экзему, тиреоидит и полимиозит; церебральной ишемической болезни, смешанных коллагенозов, склеродермы, анафилаксии, септического шока, кардита и эндокардита, заживления ран, контактного дерматита, профессиональных заболеваний легких, гломерулонефрита, отторжения трансплантата, височного артериита, воспалительных заболеваний кровеносных сосудов, гепатита, ожогов, каналопатий, боли при злокачественном новообразовании,синдрома хронической усталости, фибромиозита, синдрома раздраженного кишечника, профессионального заболевания верхних конечностей, воспалительных состояний; атопического дерматита у собак,меланомы полости рта у собак и легочных болезней у лошадей; включающий введение пациенту РОМС. 5. Способ по п.1 или 3, где CRF представляет собой CRF козы. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий введение одного или более из вазопрессина, -эндорфина и энкефалина. 7. Способ по любому из пп.1, 3, 5 или 6, дополнительно включающий введение протеина, связывающего CRF. 8. Способ по пп.1, 3, 5, 6 или 7, дополнительно включающий введение пептида РОМС. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий введение одного или более из -, - и -MSH (меланоцитостимулирующего гормона), ACTH (адренокортикотропного гормона), - и -LPH (липотропина) , мет-энкефалина, лей-энкефалина и -эндорфина.