Композиции, содержащие поксвирус, и способ изготовления устойчивых композиций, содержащих поксвирус

006880 Настоящее изобретение относится к композиции, в частности, водной композиции, включающей (i) поксвирус одного из родов Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Parapoxvirus, Capripoxvirus и Suipoxvirus, (ii) дисахарид, (iii) фармацевтически приемлемый полимер и, необязательно, (iv) буфер. Водная композиция особенно подходит для способов лиофилизации, приводящих к изготовлению устойчивой, лиофилизированной, содержащей поксвирус композиции. Изобретение, кроме того, касается способа изготовления лиофилизированной, содержащей поксвирус композиции и полученного таким образом продукта. Предпосылки изобретенияPoxviridae включают большое семейство комплексных ДНК вирусов, которые реплицируются в цитоплазме клеток позвоночных и беспозвоночных. У людей натуральная оспа была самой важной инфекцией поксвирусами. Возбудителем натуральной оспы является вирус натуральной оспы, член рода Orthopoxvirus. Вирус коровьей оспы, также член рода Orthopoxvirus в семействе Poxviridae, использовали в качестве живой вакцины для иммунизации против натуральной оспы. Кульминацией успешной всемирной вакцинации вирусом коровьей оспы было искоренение вируса натуральной оспы (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History ofPublic Health, .4, Geneva: World Health Organization, 1980). Тем временем, большинство находящихся на хранении штаммов инфекционных вирусов натуральной оспы было разрушено. Однако нельзя исключить, что поксвирусы, индуцирующие натуральную оспу и заболевания, подобные натуральной оспе,могут опять стать серьезной проблемой здравоохранения. Таким образом, необходимо иметь возможность изготовить устойчивые вакцины против поксвирусных инфекций, в частности, инфекций натуральной оспы, такие как вакцины на основе вируса коровьей оспы. В прошлом вирусы коровьей оспы также использовали для создания методами генной инженерии вирусных векторов для экспрессии рекомбинантного гена и для потенциального использования в качестве рекомбинантных живых вакцин (Mackett, М., Smith, G.L and Moss, В. [1982] P.N.A.S. USA 79, 74157419; Smith, G.L., Mackett, M. and Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383407). Это, наряду с прочим, приводит к последовательностям ДНК (генам), которые кодируют чужеродные антигены, вводимым в геном вирусов коровьей оспы с помощью методик рекомбинации ДНК. Если ген интегрирован в участке вирусной ДНК, который не существен для жизненного цикла вируса, то возможно, что вновь созданный рекомбинантный вирус коровьей оспы будет инфекционным, т.е. будет способен инфицировать чужеродные клетки и, таким образом, экспрессировать интегрированную последовательность ДНК (ЕР 83286 и ЕР 110385). Полученные таким путем рекомбинантные вирусы коровьей оспы можно использовать, с одной стороны, в качестве живых вакцин для профилактики инфекционных заболеваний, а, с другой стороны, для изготовления гетерологичных белков в эукариотических клетках. Другими примерами рекомбинантных вирусов коровьей оспы являются вирусы, включающие терапевтические гены, такие как суицидные гены, рибозимные гены или антисмысловые гены. Известно, что модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA) исключительно безопасен.MVA был генерирован длительными серийными пассажами штамма Анкара вируса коровьей оспы(CVA) на фибробластах куриных эмбрионов (обзор см. Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H.[1975] Infection 3, 6-14; патент Швейцарии 568392). Примерами штаммов вируса MVA, депонированных в соответствии с требованиями Будапештского договора, являются штаммы MVA 572, депонированные в Европейской коллекции культур клеток животных (ЕСАСС), Salisbury (UK) под номером депозита ЕСАСС V94012707, MVA 575, депонированный под номером ЕСАСС V00120707 и MVA-BN с номером депозита ЕСАСС V00083008.MVA характеризуется тем, что является в значительной степени ослабленным, то есть, другими словами, характеризуется уменьшенной вирулентностью или инфекционной способностстью, в то же самое время сохраняя хорошую иммуногенность. Был проведен анализ вируса MVA для определения изменений в геноме относительно штамма CVA дикого типа. Были идентифицированы 6 основных делеций геномной ДНК (делеция I, II, III, IV, V и VI), всего охватывающей 31000 пар оснований (Meyer, Н.,Sutter, G. and Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Полученный вирус MVA стал крайне ограниченным по клеткам-хозяевам птичьими клетками. Кроме того, MVA характеризуется его чрезвычайным ослаблением. При испытании на разнообразных экспериментальных моделях было доказано, что MVA является авирулентным даже у животных с подавленным иммунитетом. Важнее то, что отличные свойства штамма MVA были продемонстрированы в обширных клинических испытаниях (Mayr et al., Zbl.Bakt. Hyg. I, Abt. Org. В 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Во время данных исследований у более чем 120000 людей, включая пациентов с высоким риском, не было побочных эффектов, связанных с использованием вакцины MVA. Рекомбинантные MVA, которые можно использовать в качестве вакцин, уже были сконструированы (см., например, WO 97/02355) и используются в клинических испытаниях. WO 98/13500 раскрывает рекомбинантные MVA, содержащие и способные экспрессировать последовательности ДНК, кодирующие антигены вируса денге. Чужеродные последовательности ДНК встраивали в вирусную ДНК в участке естественно встречающейся делеции в геноме MVA.-1 006880 Штаммом MVA, проявляющим характеристики даже более сильного ослабления и усиленной безопасности, является штамм MVA-BN, депонированный в Европейской коллекции культур клеток животных (ЕСАСС), Salisbury UK под номером депозита V00083008. Кроме вируса коровьей оспы, в качестве векторов для доставки генетической информации в клетки млекопитающих использовали другие поксвирусы. В данном контексте делается ссылка на птичьи поксвирусы, такие как поксвирус домашней птицы. Поксвирусы домашней птицы, содержащие гены ВИЧ в геноме, раскрыты в патентах США 5736368 и 6051410. Способы изготовления содержащих поксвирус композиций, пригодных в качестве вакцин, известны специалисту в данной области (см., например, Joklik W.K., Virology (1962), 18, 9-18; Richter, K.H., Abhandlungen aus dem Bundesgesundheitsarat (1970), 9, 53-57). Известная очистка приводит к изготовлению водных, содержащих поксвирус растворов или содержащих поксвирус осадков. Поксвирусы в указанных растворах и осадках неустойчивы, т.е., инфекционная активность вирусов быстро уменьшается. Однако необходимо, чтобы вакцину можно было хранить и распределять в стабилизированной форме, особенно,когда вакцины необходимо транспортировать в тропических регионах с ограниченной инфраструктурой распределения. Лиофилизированный продукт можно хранить при температурах в диапазоне от 4 до 25 С. Это очевидное преимущество, по сравнению со стандартными условиями хранения для жидких композиций, которые необходимо хранить при температуре ниже -20 С (Cryopreservation and freeze-drying protocols" Day J., McLellan M.; Methods in Molecular Biology, 38, 1995, Humana Press). Способы лиофилизации поксвирусов, в частности, вируса коровьей оспы, и содержащих вирусы композиций и растворов, пригодных для этой цели, известны (Burke et al., Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems (1999), 16, 1-83). В общем смысле, лиофилизация вакцины включает замораживание вакцины, содержащей водную композицию, пригодную для лиофилизации, с последующим удалением воды сублимацией в условиях пониженного давления и низких температур и следуемым далее удалением воды десорбцией в условиях пониженного давления и более высоких температур. Известные, содержащие поксвирус, композиции для лиофилизации имеют важные недостатки. Многие из известных, содержащих вирус коровьей оспы, композиций для лиофилизации содержат пептон или гемаццел, которые часто имеют животное происхождение. Однако имеются опасения, что заболевания животных, такие как губчатый энцефалит коров, может передаваться от животного человеку через животные продукты, такие как пептон, желатин или гемаццел. Кроме того, поксвирусы в известных, содержащих поксвирус, композициях для лиофилизации не были очищены. Таким образом, содержащие поксвирус композиции для лиофилизации, известные в предшествующем уровне техники, содержат, наряду с другими веществами, большое количество белков, происходящих соответственно из клеток системы культуры клеток или ткани и из бычьей сыворотки, используемой во время культивирования клеток. Специалисту в данной области также известны подвергнутые лиофилизации композиции, которые не содержат дополнительных соединений животного происхождения (которые представляют собой, например, пептон или гемаццел). В данном случае композиции содержат следующие соединения отдельно или в определенных комбинациях: глутамат натрия, сорбит, лактозу, соли, аминокислоты и глицерин. Однако продукт, полученный после процесса лиофилизации, часто является достаточно неустойчивым,т.е., общая потеря титра вируса неприемлемо высока во время хранения. Кроме того, было показано, что поксвирус имеет тенденцию образовывать агрегаты в некоторых из указанных композиций, и что другие соединения осаждаются перед замораживанием или во время него. Патент США 3577526 раскрывает вакцину против натуральной оспы, характеризуемую тем, что она изготовлена из основного вирусного материала вакцины, диспергированного в сахарозе. Количество сахарозы находится в диапазоне от 20 до 40%. Композиция может, кроме того, включать 5% декстрана. Термин основной вирус относится к вирусу, полученному из пульп и пустул. В основном, лимфу перемалывают для разрушения комков и отделения жидкости от мертвых волос и кожи. Таким образом,белковая нагрузка препарата вакцины очень высокая и вносит вклад в стабилизацию вируса. Цель изобретения Целью настоящего изобретения является предоставление композиции, содержащей поксвирус, в частности, водной композиции, содержащей поксвирус, для лиофилизации, которая приводит к изготовлению устойчивого лиофилизированного продукта, в котором поксвирус предпочтительно представляет собой очищенный или, по меньшей мере, частично очищенный вирус. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление водной композиции, содержащей поксвирус, в которой поксвирусы не имеют тенденции к агрегации, и в которой компоненты не осаждаются перед замораживанием или во время него. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление композиции, содержащей поксвирус, в частности, водной композиции, содержащей поксвирус, включающей низкие количества белков, не связанных с поксвирусом. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление устойчивой, лиофилизированной композиции, содержащей поксвирус, и способа изготовления указанной композиции.-2 006880 Подробное описание изобретения Настоящее изобретение предоставляет композицию, содержащую поксвирус, в частности, водную композицию, содержащую поксвирус. Композиция, в частности, водная композиция, может подходить для лиофилизации указанного поксвируса. Кроме того, изобретение предоставляет лиофилизированный продукт, содержащий поксвирус. Композиция в соответствии с настоящим изобретением, в частности,водная композиция, включает поксвирус, дисахарид, фармацевтически приемлемый полимер и, необязательно, кроме того, буфер. Хотя лиофилизированная композиция в соответствии с настоящим изобретением не содержит ни стабилизирующие добавки животного происхождения, такие как пептон, желатин,гемаццел, ни высокие количества белков, происходящих из системы, используемой для амплификации вируса (такой как системы культуры клеток), вирус в композиции удивительно устойчив, т.е., поксвирус в лиофилизированной композиции остается инфекционным в течение длительных периодов времени,даже при высоких температурах хранения, таких как комнатная температура или 37 С. При отсутствии других определений, используемый в настоящем описании термин комнатная температура соответствует температуре от 20 до 25 С. Поксвирусы, подлежащие лиофилизации, представляют собой любые поксвирусы, выбранные из группы, состоящей из ортопоксвирусов, авипоксвирусов, парапоксвирусов, каприпоксвирусов и суипоксвирусов. Указанные вирусы можно использовать в качестве вакцины для людей или животных(Virology, 3rd edition, 1995 ed.-in-chief: Fields, B.N.). Особенно предпочтительными поксвирусами являются вирусы родов Orthopoxvirus или Avipoxvirus. Предпочтительными примерами поксвирусов, относящихся к роду Avipoxvirus, являются поксвирус канареек и поксвирус домашней птицы. Предпочтительными примерами, относящимися к семейству Orthopoxvirus, являются поксвирус коров и вирус коровьей оспы. Поксвирус, содержащийся в композиции в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой естественно встречающийся поксвирус, ослабленный поксвирус или рекомбинантный поксвирус. Для вакцинации людей против натуральной оспы поксвирус в композиции представляет собой предпочтительно штамм вируса коровьей оспы. Примерами штаммов вируса коровьей оспы, подходящих для данной цели, являются штаммы Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP,Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health,Elstree, Ikeda и WR. Наиболее предпочтительными штаммами вируса коровьей оспы являются штамм модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA) и его производные, в частности, штамм, который был депонирован в ЕСАСС с номером депозита V00083008 и штамм Elstree. Поксвирус в композиции в соответствии с настоящим изобретением представляет собой предпочтительно поксвирус, который является по существу непатогенным для животного или лица, подлежащего вакцинации. Для данной цели предпочтительно или использовать ослабленные штаммы вируса, или использовать поксвирус, который естественно реплицируется у вида хозяина, отличного от вида, подлежащего вакцинации, и который не является патогенным для гетерологичного хозяина. Ослабленный вирус представляет собой вирус, происходящий от патогенного вируса, но который при инфицировании организма хозяина приводит к более низкой смертности и/или заболеваемости, по сравнению с не ослабленным родительским вирусом. Примеры ослабленных поксвирусов известны специалисту в данной области. Наиболее предпочтительным является модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA). Типичными штаммами MVA являются MVA 575 и MVA 572, которые были депонированы в Европейской коллекции культур клеток животных под номерами депозитов ЕСАССV00120707 и ЕСАСС V94012707, соответственно. Наиболее предпочтительным штаммом является MVABN или производный от него штамм, который был описан в WO 02/42480 (РСТ/ЕР 01/13628). Содержание указанной заявки включено в настоящую заявку в качестве ссылки. MVA-BN был депонирован в Европейской коллекции культур клеток животных под номером депозита ЕСАСС V00083008. Примерами поксвирусов, для которых люди представляют собой гетерологичных хозяев и которые являются не патогенными для людей, включают поксвирус домашней птицы и поксвирус канареек. Термин рекомбинантный вирус относится к любому вирусу, имеющему вставленный в вирусный геном гетерологичный ген, который не является естественной частью вирусного генома. Гетерологичный ген может представлять собой терапевтический ген, ген, кодирующий пептид, включающий по меньшей мере один эпитоп для индукции иммунного ответа, кассету антисмысловой экспрессии или рибозимный ген. Способы конструирования рекомбинантных вирусов известны специалисту в данной области. Наиболее предпочтительным вектором поксвируса является MVA, в частности, MVA 575 и MVA-BN (см. выше). Специалисту в данной области известно, как можно амплифицировать и выделить поксвирусы из инфицированных клеточных культур. В целом, на первом этапе эукариотические клетки инфицируют поксвирусом, который, как предполагается, является частью композиции в соответствии с настоящим изобретением. Эукариотические клетки представляют собой клетки, которые восприимчивы к инфицированию соответствующим поксвирусом и обеспечивают возможность репликации и продукции инфекционного вируса. Такие клетки известны специалисту в данной области для всех поксвирусов. Для MVA-3 006880 примерами данного типа клеток являются фибробласты куриных эмбрионов (CEF) (Dexler I. et al., J. Gen.Virol. (1998), 79, 347-352). Клетки CEF можно культивировать в условиях, известных специалисту в данной области. Предпочтительно клетки CEF культивируют в бессывороточной среде. Время инкубации предпочтительно составляет от 48 до 96 ч при 37 С 2 С. Для инфицирования поксвирусы используют при множественности заражения (MOI) от 0,05 до 1 TCID50 (TCID = инфекционная доза культуры ткани),и инкубация происходит в течение 48-72 ч при такой же температуре. Развитие инфекции можно наблюдать слежением за цитопатическими эффектами (СРЕ), обычно,значительным округлением инфицированных клеток. Известно, что поксвирусы существуют в двух различных формах: поксвирус, прикрепленный к клеточным мембранам в цитоплазме инфицированных клеток (внутриклеточный зрелый вирион (IMV и вирусы, вышедшие наружу (внеклеточные, покрытые оболочкой вирионы (EEV (Vanderplasschen A. etal. , J. Gen. Virol. (1998), 79, 877-887). Обе вирусные формы можно использовать в композициях в соответствии с настоящим изобретением. EEV можно просто получить из надосадочной жидкости центрифугированием, и их можно непосредственно суспендировать в водной композиции, включающей дисахарид и фармацевтически приемлемый полимер. Однако фракции, содержащие вирус, могут включать клеточный дебрис и другие примеси. Поэтому, особенно для вакцинации людей предпочтительно, чтобы вирус был подвергнут дальнейшей очистке перед тем, как он будет включен в композицию в соответствии с настоящим изобретением. Способы очистки поксвирусов известны специалисту в данной области. Этап очистки может представлять собой, например, серийное центрифугирование (например, с использованием сахарозных подушек) или ультрацентрифугирование с непрерывным протоком (градиенты сахарозы),ультрафильтрацию (например, фильтрацию в поперечном потоке с использованием мембраны с размером пор более, чем 500 кДа, но равным или меньшим чем, 0,1 мкм), колоночную хроматографию (например, ионообменную, гидрофобного взаимодействия, исключения по размеру или их комбинацию) или комбинацию некоторых или всех из указанных выше методов очистки (Masuda N. et al., J. Bacterid (1981) 147, 1095-1104). Для получения IMV клетки необходимо собрать на первом этапе и разрушить на втором этапе. Если инфицированные клетки представляют собой клетки, которые можно культивировать в суспензионной культуре, то инфицированные клетки можно легко собрать центрифугированием. Если инфицированные клетки являются более или менее интактными прикрепленными клетками, то можно собрать клетки, т.е.,удалить клетки из флакончика для культур, перед тем как они будут подвергнуты этапам разрушения. Способы сбора известны специалисту в данной области. Методики, которые можно использовать, представляют собой механические способы (например, использованием резинового скребка для клеток), физические способы (например, замораживание ниже -15 С и оттаивание сосудов для культивирования при температуре выше +15 С) или биохимические способы (обработку ферментами, например, трипсином,для открепления клеток от сосудов для культивации). Если ферменты используют с данной целью, время инкубации следует контролировать, поскольку ферменты могут также повредить вирус после длительных периодов инкубации. Способы разрушения клеток также известны специалисту в данной области. Описанный выше способ оттаивания-замораживания уже приводит к частичному разрушению клеток. Другие известные методики для разрушения клеток включают использованием ультразвука. Обработка клеток ультразвуком приводит к изготовлению гомогената, содержащего вирус. Для вакцинации животных гомогенат, содержащий поксвирус, можно использовать в композициях в соответствии с настоящим изобретением. Однако снова предпочтительно использовать поксвирусы,которые были очищены, по меньшей мере, частично. Как подчеркнуто выше, такие способы очистки известны специалисту в данной области. Поксвирусы содержатся в композиции, в частности, в водной композиции, в диапазоне концентраций от 104 до 109 TCID50/мл, предпочтительно в диапазоне концентраций, например, от 105 до 5 х 108TCID50/мл, наиболее предпочтительно, в диапазоне концентраций, например, от 106 до 108 TCID50/мл. Действительная концентрация зависит от количества вируса, которое предстоит ввести человеку или животному, которое, в свою очередь, зависит от типа вируса, который предстоит ввести. Для штамма вируса коровьей оспы Elstree типичная доза вакцинации для людей включает 2,5 х 105 TCID50/мл. Для штамма вируса коровьей оспы MVA-BN типичная доза вакцинации для людей включает 1 х 108 TCID50. Как указано выше, поксвирус в композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой очищенный или, по меньшей мере, частично очищенный вирус. Термин очищенный или, по меньшей мере, частично очищенный вирус относится к тому обстоятельству, что вирус, используемый в композиции в соответствии с настоящим изобретением, имеет чистоту, которая выше, чем чистота неочищенного вируса (основного вируса), который использовали в вакцинах, применявшихся до искоренения натуральной оспы (таких как раскрытые в патенте США 3577526). Такую более высокую чистоту можно получить, например, одним или несколькими следующими способами: например, серийным центрифугированием (например, с использованием сахарозных подушек) или ультрацентрифугированием с непрерывным протоком (градиенты сахарозы), ультрафильтрацией (например,фильтрацией в поперечном потоке с использованием мембраны с размером пор более чем 500 кДа, но-4 006880 равным или меньшим, чем 0,1 мкм), колоночной хроматографией (например, ионообменной, гидрофобного взаимодействия, исключения по размеру или их комбинацией). Особенно предпочтительной является ультрафильтрация и/или серийное центрифугирование с использованием сахарозных подушек. В более общем смысле термин очищенный или, по меньшей мере, частично очищенный вирус относится к вирусным препаратам (таким как препараты, включающие MVA или Eltree), имеющим титр по меньшей мере 106, предпочтительно по меньшей мере 107, предпочтительнее по меньшей мере 108, еще предпочтительнее по меньшей мере 5 х 108 TCID50 на 1 мг общего количества белка. Для штамма Eltree типичные препараты имеют титр 8 х 108 TCID50 на 1 мг общего количества белка. Способы определения титра препарата, содержащего поксвирус, известны специалисту в данной области; один из данных способов описан в разделе примеров. Общее содержание белка предпочтительно определяют в соответствии со способом Kjeldahl (Lynch, J.M. and Barbano, D.M., Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products. J. AOAC Int. 1999 Nov.-Dec.; 82(6): 1389-98. Review). Следует отметить, что общее содержание белка представляет собой сумму вирусных белков и клеточных белков. Было неожиданно, что композиция, включающая очищенный или частично очищенный вирус, дисахарид и фармацевтически активный полимер, устойчива, поскольку считали, что большие количества не вирусного белка в неочищенных вирусных препаратах способствуют устойчивости композиций предшествующего уровня техники. Композиция в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водная композиция, включает дисахарид. В отличие от моносахаридов, таких как глюкоза, которые дают хорошую биологическую защиту во время лиофилизации, но которые имеют низкую температуру разрушения и часто лиофилизируются с разрушением, было показано, что дисахариды являются эффективными протекторами при лиофилизации, проявляющими более высокие температуры разрушения, чем моносахариды. Дисахариды, содержащиеся в композициях в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой фармацевтически приемлемые дисахариды, имеющие температуру разрушения (Тс) в диапазоне приблизительно от -25 до -35 С. Типичные температуры разрушения составляют -31 С для сахарозы, -28,5 С для трегалозы и -30,5 С для лактозы. Типичные температуры разрушения для всей композиции в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно находятся в диапазоне от -50 до -20 С. Предпочтительными субдиапазонами являются, например, от -37 до -30 С от -36 до -31 С или от -35,7 до -31,2 С. Предпочтительно, дисахарид выбирают из группы, состоящей из трегалозы, лактозы и сахарозы. Наиболее предпочтительным дисахаридом является сахароза. Дисахарид, предпочтительно сахароза, содержится в композиции в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водной композиции,предпочтительно в диапазоне концентраций 10-100 г/л, предпочтительнее, в диапазоне 20-80 л/г, наиболее предпочтительно, в диапазоне 25-60 г/л. Для сахарозы типичная концентрация составляет 45 г/л. Композиция в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водная композиция, кроме того, включает фармацевтически приемлемый полимер. Полимер предпочтительно выбирают из группы,состоящей из декстрана и поливинилпирролидона (PVP). Используемый полимер должен быть растворим в композиции в соответствии с настоящим изобретением. Если используют декстран, его молекулярная масса предпочтительно находится в диапазоне от 20000 до 100000, предпочтительнее в диапазоне от 30000 до 70000, наиболее предпочтительно в диапазоне от 36000 до 44000. Самый предпочтительный декстран имеет среднюю молекулярную массу 40000. Концентрация декстрана находится в диапазоне от 1 до 50 г/л, предпочтительно в диапазоне от 2 до 40 г/л или от 3 до 30 г/л. Особенно хорошие результаты наблюдали в диапазонах от 5 до 50 г/л, от 5 до 40 г/л или от 5 до 30 г/л. Даже более предпочтительным является диапазон от 8 до 30 г/л. Наиболее предпочтительным диапазоном является от 10 до 27 г/л. Примером предпочтительной концентрации является 18,9 г/л. Предпочтительные концентрации и диапазоны концентрации декстрана, как показано выше, в частности, диапазон от 5 до 50 г/л и соответствующие субдиапазоны, имеют особое преимущество в том, что температура разрушения композиции сравнительно высокая, что обеспечивает возможность проведения процесса в промышленном масштабе. Если используют PVP, его молекулярная масса находится предпочтительно в диапазоне от 50000 до 400000, предпочтительнее в диапазоне от 70000 до 360000. Концентрация PVP находится в диапазоне от 5 до 200 г/л, предпочтительнее в диапазоне от 5 до 100 г/л, наиболее предпочтительно в диапазоне от 10 до 40 г/л. Композиция в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водная композиция, кроме того, включает буфер. Как указано выше, одной из целей настоящего изобретения является предоставление водной композиции, содержащей поксвирус, в которой поксвирусы не агрегируют и в которой при сушке не происходит осаждение. Неожиданно было показано, что такие нежелательные эффекты коррелируют с присутствием буфера, содержащего фосфат, в водной композиции. Примерами буферов, содержащих фосфат, являются PBS (солевой забуференный фосфатный раствор) и фосфатный буфер. Следовательно,данную конкретную цель изобретения достигают водной композицией для лиофилизации, которая не содержит фосфатный буфер. Таким образом, буфер, содержащийся в композиции в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из TRIS, TBS, MOPS, HEPES и (би-)карбонатных буферов. Наиболее предпочтительными являются TRIS и TBS.-5 006880 Буфер используют в концентрации, которая достаточна для придания требуемой буферной емкости. Для TRIS-буферов предпочтительным диапазоном концентрации является от 1 до 50 мМ; наиболее предпочтительной концентрацией является 10 мМ. рН предпочтительно доводят до величины, которая, с одной стороны, является фармацевтически приемлемой для введения людям или животным, а с другой стороны, не оказывает повреждающее действие на вирус. Таким образом, рН должен быть в диапазоне от 6,0 до 9,0, предпочтительнее в диапазоне от 7,2 до 7,8. Наиболее предпочтительный рН составляет 7,4. Неожиданно хорошие результаты при использовании лишенного фосфата буфера получают независимо от того, является ли вирус в композиции неочищенным, очищенным или частично очищенным. Предпочтительными являются очищенные или частично очищенные вирусы. Композиция в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водная композиция, может содержать соли, такие как NaCl. Типичные концентрации для NaCl находятся в диапазоне от 10 до 200 мМ. Примером предпочтительной концентрации NaCl является 140 мМ. Композиция в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водная композиция, кроме того, может содержать соли L-глутаминовой кислоты. Соль представляет собой предпочтительно монокалиевую соль или мононатриевую соль. Концентрация соли L-глутаминовой кислоты находится предпочтительно в диапазоне от 0,05 до 0,5 г/л, предпочтительнее, в диапазоне от 0,1 до 0,15 г/л. Некоторые особенно предпочтительные водные композиции в соответствии с настоящей заявкой перечислены в следующей табл.1. Во всех композициях, приведенных в табл. 1, буфер представляет собой 10 мМ TRIS, рН=7,4, количество NaCl составляет 140 мМ. Таблица 1 Водная композиция в соответствии с настоящим изобретением подходит для лиофилизации. Для введения лиофилизированный продукт необходимо растворить соответствующим растворителем. В соответствии с одним вариантом реализации стерильную воду добавляют к лиофилизированному продукту для того, чтобы ввести соединения в раствор. Предпочтительно количество добавленной воды более или менее соответствует количеству воды, которая была удалена во время лиофилизации. Таким образом, в соответствии с данным вариантом реализации композиция продукта с восстановленным влагосодержанием более или менее идентична исходной водной композиции. Поэтому в пределах диапазона притязаний настоящего изобретения находится то, что водную композицию в соответствии с настоящим изобретением используют в качестве вакцины. В соответствии с альтернативным вариантом реализации, лиофилизированный продукт можно также растворить в любом другом фармацевтически приемлемом разбавителе, который можно использовать в соответствующих количествах. В качестве примера разбавитель может представлять собой воду, включающую один или более из соединений, выбранных из фенола, глицерина и буфера. Концентрация фенола в продукте с восстановленным влагосодержанием составляет, например, 0,5%. Как указано выше, буфер предпочтительно не является фосфатным буфером. Резюмируя, данный аспект изобретения касается, наряду с другими вариантами, следующих особенно предпочтительных вариантов реализации: (I) Композиция, в частности водная композиция, включающая или даже состоящая из очищенного или частично очищенного поксвируса, выбранного из группы, состоящей из ортопоксвирусов, авипоксвирусов, парапоксвирусов, каприпоксвирусов и суипоксвирусов, дисахарида, фармацевтически приемлемого полимера и, необязательно, буфера, причем буфер представляет собой предпочтительно не фосфатный буфер. Предпочтительно полимер представляет собой декстран, предпочтительно в количествах, как определено выше. (II) Композиция, в частности водная композиция, включающая или даже состоящая из поксвируса, выбранного из группы, состоящей из ортопоксвирусов, авипоксвирусов, парапоксвирусов, каприпоксвирусов и суипоксвирусов, дисахарида,фармацевтически приемлемого полимера и, необязательно, буфера, где буфер представляет собой не-6 006880 фосфатный буфер, и где поксвирус является предпочтительно очищенным или частично очищенным вирусом. Предпочтительно полимер представляет собой декстран, предпочтительно в количествах, как определено выше. (III) Композиция, в частности водная композиция, включающая или даже состоящая из поксвируса, выбранного из группы, состоящей из ортопоксвирусов, авипоксвирусов, парапоксвирусов,каприпоксвирусов и суипоксвирусов, дисахарида, фармацевтически приемлемого полимера и, необязательно, буфера, где полимер представляет собой декстран в количествах, как определено выше, в качестве примера, предпочтительно в диапазоне от 5 до 40 г/л. Предпочтительно буфер представляет собой не фосфатный буфер. Предпочтительно поксвирус является очищенным или частично очищенным вирусом. Термин состоящая, используемый выше в контексте вариантов (I), (II) и (III), относится к композициям, состоящим только из упомянутых выше соединений, и к композициям, содержащим, кроме того,одну или более солей. Примерами солей, которые можно добавить к композициям (I), (II) и (III), состоящим из определенных выше соединений, являются KCl, NaCl, глутамат натрия. Таким образом, термин состоящая в определении определенных выше композиций (I), (II) и (III), не исключает возможности добавления одной или более солей. В качестве примера, конкретный вариант реализации настоящего изобретения включает водную композицию, включающую очищенный или частично очищенный поксвирус, выбранный из группы, состоящей из ортопоксвирусов, авипоксвирусов, парапоксвирусов, каприпоксвирусов и суипоксвирусов,дисахарид, фармацевтически приемлемый полимер и буфер, где дисахарид представляет собой сахарозу в определенных выше количествах, где полимер представляет собой декстран в определенном выше количестве, и где буфер является не фосфатным буфером. В качестве примера, другой конкретный вариант реализации настоящего изобретения включает водную композицию, состоящую из поксвируса, выбранного из группы, состоящей из ортопоксвирусов, авипоксвирусов, парапоксвирусов, каприпоксвирусов и суипоксвирусов, дисахарида, фармацевтически приемлемого полимера и, необязательно, буфера. Поксвирус предпочтительно представляет собой очищенный или частично очищенный поксвирус. Предпочтительные количества и примеры дисахарида, полимера и буфера очерчены выше. В пределах навыков практикующего врача находится то, как такие композиции, в частности, водные композиции, содержащие поксвирусы, можно вводить, и какие количества вируса использовать для вакцинации. Как указано выше, вакцины можно использовать для индукции иммунного ответа против самих поксвирусов, в частности, если используют ослабленные или не патогенные, не рекомбинантные поксвирусы. Если поксвирусы представляют собой рекомбинантные поксвирусы, иммунный ответ дополнительно возникает против рекомбинантного белка/пептида, экспрессируемого вектором поксвируса. Если нет других указаний, используемый выше термин композиция обычно относится к жидким композициям, предпочтительно водным композициям. Если концентрации или диапазоны концентрации определены в мМ, г/л и т.д., это является указанием на то, что соответствующая композиция является жидкостью или даже водной композицией. Термин водная композиция относится к тем композициям, в которых разбавитель представляет собой воду. Однако диапазон притязаний настоящего изобретения также охватывает те сухие композиции, которые можно изготовить из жидкости или даже водной композиции в соответствии с настоящим изобретением удалением жидкости, независимо от способа,который используют для указанного удаления. Таким образом, изобретение также охватывает те сухие композиции, которые получают способами, отличными от лиофилизации. В частности, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу изготовления устойчивой,содержащей поксвирус композиции, отличающейся тем, что композицию в соответствии с настоящим изобретением, в частности, водную композицию, лиофилизируют. Если нет других указаний, в настоящей заявке термины устойчивая композиция, содержащая поксвирус, и лиофилизированная композиция, содержащая поксвирус, используются взаимозаменяемо. Термин устойчивая композиция, содержащая поксвирус, используется в настоящей заявке для определения композиций, содержащих поксвирус, в которых общая потеря титра вируса при температуре инкубации 37 С в течение 28 дней составляет менее чем 0,5 log., предпочтительно менее чем 0,4 log. Подробный протокол для определения титра вируса, а, следовательно, общей потери титра вируса приведен в разделе примеров. Однако можно также использовать любой другой протокол для определения вирусного титра. Способы лиофилизации в целом известны специалисту в данной области (Day, J. and McLellan, M.,Methods in Molecular Biology, Humana Press, (1995) vol. 38). Процесс лиофилизации обычно состоит из следующих этапов, которые подробнее объяснены ниже: 1. Изготовление вакцины; 2. Замораживание образца; 3. Первичная сушка (сублимация); 4. Вторичная сушка (десорбция); 5. Укупорка и перемещение продукта; 6. Хранение вакцины; 7. Восстановление влагосодержания.-7 006880 Изготовление вакцины Продуцирование и амплификация поксвирусов, которые предстоит использовать в качестве вакцин,было подробно объяснено выше. Поксвирусы являются необязательно очищенными. Композицию в соответствии с настоящим изобретением получают добавлением определенных выше дисахаридов, полимеров и, необязательно, буфера, L-глутаминовой кислоты и, необязательно, дополнительных добавок к препарату поксвируса. Замораживание образца Замораживание образца иммобилизует компоненты в растворе, предотвращая посредством этого вспенивание продукта, когда снижено давление. Замораживание представляет собой двухэтапный процесс, в течение которого вода первоначально образует центры кристаллизации с последующим ростом кристаллов льда, приводя к образованию смеси льда и концентрата растворенных веществ. Образование центров кристаллизации стимулируется снижением температур и перемешиванием охлажденной суспензии. В отличие от образования центров кристаллизации увеличение количества льда стимулируется увеличением температуры, уменьшая посредством этого вязкость суспензии. Независимо от точного типа замораживания, распространение льда по среде приводит к увеличению концентрации растворенного вещества. Биополимеры в растворе или суспензии повреждаются или инактивируются под воздействием указанных увеличивающихся концентраций растворенного вещества. Быстрое охлаждение минимизирует контакт биопродукта с концентратом. Выше критической температуры (температуры стеклования) вязкость массы может достаточно уменьшаться с тем, чтобы стекло стало мягче и деформировалось. Оно высыхает с образованием бесструктурного, липкого остатка внутри флакончика. Температуру деформации называют температурой разрушения. Конкретнее, температуру разрушения определяют как температуру, при которой подвижность воды в интерстициальной области матрицы становится значительной. Во избежание деформации температура замораживания должна быть ниже температуры разрушения водной композиции. Температуру разрушения можно определить в соответствии со способами, известными специалисту в данной области, например, дифференциальным термическим анализом (Jennings, Т.А. , "Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7,pages 132-134). Если температура слишком низкая, диффузия воды из вируса может быть ингибирована, и может произойти повреждение внутриклеточным льдом. Следовательно, специалист в данной области должен эмпирически испытать несколько температур замораживания, все из которых ниже температуры разрушения водной композиции, и он должен испытать, какая температура приводит к изготовлению лиофилизированного продукта, имеющего самый высокий титр инфекционных поксвирусов. Первичная сушка (сублимация) Первичная сушка представляет собой ту часть процесса лиофилизации, которая запускает сублимацию растворителя (льда) из замороженной матрицы. Процесс первичной сушки начинается после того,как лиофилизатор приобретает требуемую температуру конденсатора и давление в камере. Давление в камере составляет обычно менее чем 1 мбар, предпочтительно менее чем 0,2 мбар. Обычно давление находится в диапазоне от 0,04 до 0,12 мбар. Во всем данном описании данные условия иногда именуют низким давлением. Температуру на полке камеры увеличивают таким образом, что происходит сублимация льда в матрице продукта, и температура продукта значительно ниже, чем температура разрушения композиции для обеспечения полностью замороженной матрицы в течение всего процесса первичной сушки и для обеспечения лиофилизации без разрушения. Температура может оставаться постоянной в течение всего процесса первичной сушки. Альтернативно, температуру на полке камеры можно непрерывно увеличивать в течение первичной сушки. Однако температура продукта должна быть ниже температуры разрушения в течение всего процесса первичной сушки. В конце первичной сушки высушенный продукт еще может содержать более чем 5% влаги (мас./мас.). Для изготовления продукта с содержанием влаги, которое больше не поддержит биологический рост или химические реакции, необходимо провести этап вторичной сушки. Вторичная сушка (десорбция) В течение вторичной сушки происходит десорбция водяного пара с поверхности лепешки, которая образуется в течение первичной сушки. Это осуществляется увеличением температуры, в то время как камера еще находится при низких давлениях с тем, чтобы происходила десорбция воды с поверхности лепешки. Температуры на полке камеры для вторичной сушки определяют устойчивостью продукта, и они могут быть в диапазоне от 0 до +30 С. Температура продукта обычно находится в диапазоне от -5 до 30 С. Предпочтительнее температура в диапазоне от 5 до 20 С. Вторичную сушку можно проводить в 2 этапа. На первом этапе температура продукта может быть в диапазоне от -5 С до +15 С, предпочтительно в диапазоне от 0 до + 10 С, предпочтительнее в диапазоне от 2 до +7 С. Второй этап проводят при более высокой температуре, чем вторичная сушка на первом этапе. Температура может быть в диапазоне от 0 до 30 С, предпочтительно в диапазоне от +5 до +20 С. Также содержание остаточной влаги композиции зависит от требований продукта. Некоторые продукты требуют более высокого, некоторые про-8 006880 дукты - более низкого содержания влаги для достижения наилучшей устойчивости продукта. Оптимальное содержание влаги, а также время для достижения этого следует определить эмпирически. Процесс вторичной сушки продолжают до тех пор, пока не будет достигнута желательная влажность. Способы определения влаги в продукте известны специалисту в данной области. В частности,можно использовать кулометрическое титрование Karl-Fischer (Jennings, T.A., "Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver, CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, pages 415-418). Остаточное содержание влаги составляет предпочтительно менее чем 5%, предпочтительнее в диапазоне от 0,5 до 4%, еще предпочтительнее в диапазоне от 1 до 3%. Укупорка и перемещение продукта Все флакончики, содержащие продукт, укупоривают в соответствии со способами, известными специалисту в данной области. Флакончики можно укупорить при очень низком давлении (например, 0,042,56 мбар) непосредственно в лиофилизаторе. Можно также укупорить флакончики при более или менее нормальном давлении при использовании химически инертного газа, такого как азот или гелий. Обычно флакончики можно укупорить в атмосфере азота при давлении 900 мбар. Флакончики закрывают предпочтительно использованием пробок из синтетического бутилкаучука. Как только продукт укупорен,систему можно вернуть в атмосферное давление, и полку камеры можно разгрузить. После этого флакончики, кроме того, можно укупорить алюминиевыми колпачками для длительного хранения. Хранение вакцины Лиофилизированный продукт можно хранить при комнатной температуре (25 С), и он остается устойчивым в течение по меньшей мере 18 нед., предпочтительно по меньшей мере 20 нед., предпочтительнее по меньшей мере 22 нед. при указанной температуре. Устойчивый при определенной температуре в течение определенного периода времени означает, что потеря вирусного титра при данной температуре составляет менее 0,5 log в течение данного периода времени. Однако если имеется охлаждение,предпочтительно, чтобы лиофилизированный продукт хранился при более низких температурах, таких как 4 С. Предпочтительно продукт хранят в темноте. Если это невозможно, предпочтительно использовать цветное стекло для хранения или любые другие флакончики, которые позволяют избежать повреждающего воздействия света. Восстановление влагосодержания Для восстановления влагосодержания лиофилизированного продукта соответствующее количество растворителя добавляют к лиофилизированному продукту, что приводит к изготовлению фармацевтически приемлемой композиции, обеспечивающей возможность введения людям или животным. Растворитель представляет собой предпочтительно воду. Обычно растворитель добавляют к композиции в количестве, которое соответствует по существу количеству растворителя, потерянному во время процесса лиофилизации. Изобретение относится также к лиофилизированному продукту, полученному способом в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, лиофилизированный продукт в соответствии с настоящим изобретением включает(i) поксвирус, предпочтительно, родов Orthopoxvirus или Avipoxvirus, (ii) дисахарид, (iii) фармацевтически приемлемый полимер и, необязательно, (iv) буфер, где поксвирус, дисахарид, полимер и буфер такие, или определенные выше. Типичные композиции в лиофилизированном продукте показаны в следующей табл. 2. Во всех композициях, показанных в табл. 2, количество вируса составляет 5 х 108 TCID50/мл. Таблица 2-9 006880 Лиофилизированный продукт в соответствии с настоящим изобретением используют для изготовления вакцины. Для этого лиофилизированный продукт повторно растворяют/восстанавливают влагосодержание в нем, как описано выше, и вводят человеку или животному в соответствии со способами, известными специалисту в данной области. Краткое объяснение фигур На фиг. 1 показана устойчивость содержащей MVA лиофилизированной композиции при температуре 31 С. Испытанная композиция представляет собой GT23 (см. раздел примеров и табл. 6). Титр вируса в водной композиции в соответствии с настоящим изобретением определяют перед лиофилизацией. Лиофилизацию проводили, как описано для GT23 (см., примеры и табл. 6). После лиофилизации композицию хранили при 31 С. В указанные моменты времени восстанавливали влагосодержание лиофилизированной композиции, и снова определяли вирусный титр. Фиг. 2 и 3 показывают результаты того же эксперимента, как описано в подписи к фиг. 1, за исключением того, что температура инкубации была 37 С на фиг. 2 и 45 С на фиг. 3. Примеры Следующие примеры дополнительно проиллюстрируют настоящее изобретение. Специалисту в данной области будет понятно, что приведенный пример (примеры) никоим образом нельзя трактовать как ограничение применимости технологии, предоставленной настоящим изобретением. Пример 1. Лиофилизация композиций, содержащих штамм Анкара модифицированного вируса коровьей оспы (MVA). В данном примере композиции в соответствии с настоящим изобретением, содержащие MVA, лиофилизировали в различных условиях. Лиофилизированный продукт хранили при различных температурах. Устойчивость MVA в препарате анализировали определением титра MVA после восстановления влагосодержания лиофилизированного продукта и сравнения его с титром MVA перед лиофилизацией. Определяли влияние различных периодов времени хранения на вирусный титр. Протокол для определения вирусного титра в композиции, содержащей MVA, приведен в примере 2. 1. Структура экспериментов Изготовление вакцин/композиций Для испытания способа лиофилизации в соответствии с настоящим изобретением использовали несколько препаратов MVA. Для экспериментов по лиофилизации (ряды GT1-4, 6-10 и 13-15 в таблице) использовали штамм Анкара модифицированного вируса коровьей оспы (MVA). Вирус очищали центрифугированием с использованием 36 и 40% - сахарозных подушек с последующим ресуспендированием в 1 мМ Tris-буфера при рН 9. В экспериментах по лиофилизации GT1-4 (табл. 6) добавок не использовали. Использованная буферная система представляла собой 10 мМ Tris со 140 мМ NaCl при рН 7,4. Для лиофилизации, начинающейся с номера GT6 (табл. 6), использовали различные добавки без изменения буферной системы. Выбирали две различные композиции с различными добавками. Добавки вводили в растворы, содержащие вирус, добавлением буфера для разведения. Использованная композиция буферов для разведения показана в следующих табл. 3 и 4. Добавление буфера 1 для разведения (DSG) приводило к изготовлению водной композиции в соответствии с настоящим изобретением. Использование буфера 2 для разведения (DGG) приводило к изготовлению композиции, используемой для сравнительного анализа. Таблица 3 Указанные буферы для разведения использовали при различных концентрациях в конечных композициях. Буфер 1 для разведения (DSG) использовали при 16,7, 23, 30 и 40% (об./об.), буфер 2 для разведения (DGG) использовали при 20% (об./об.). TCID50/мл конечной композиции доводили до 5 х 108- 10006880 Замораживание образца Образцы замораживали внутри лиофилизатора (лиофилизатор Christ, тип альфа 2-4). Для композиции с сахарозой (DSG) сравнение различных температур замораживания (от -30 до -45 С) показало, что суспензию следует замораживать до -40 С, которая ниже температуры разрушения композиции, для изготовления отличной структуры лепешки. При замораживании внутри лиофилизатора, температуру -40 С достигали в пределах приблизительно от 3,5 до 4,5 ч (начиная приблизительно при 20 С). Первичная сушка Для композиции с сахарозой (DSG) температура разрушения приблизительно от -30 до -37 С приобреталась за счет температуры разрушения сахарозы (-31 С). Поэтому температуру продукта доводили до величин в диапазоне от -37 до -41 С для обеспечения полностью замороженной матрицы. Использовали величины давления 0,04 и 0,12 мбар (-50 С и -40 С на фазовой диаграмме воды). Движущей силой сублимации во время первичной сушки является разница давления между продуктом и конденсатором лиофилизатора, созданная разницей их температур. Закон природы состоит в том,что по мере уменьшения температуры воды, давление над данной водой также уменьшается. Конкретная температура воды всегда связана с конкретным давлением. Конденсатор устанавливали на температуры в диапазоне от -83 и -89 С. Давление в камере и температура на полке регулируют температуру продукта. Это указывает на то, что длительность первичной сушки нельзя очень легко укоротить, потому что температура конденсатора фиксирована. Для увеличения температуры продукта Тс композиции является ограничивающим фактором. Вторичная сушка Температуры для вторичной сушки определяют устойчивостью продукта. Содержание остаточной влаги в композиции также зависит от требований продукта. Некоторые требуют более высокого, некоторые более низкого содержания влаги для достижения наилучшей устойчивости продукта. Оптимальное содержание остаточной влаги, а также время до его достижения следует определять эмпирически. Поскольку вторичная сушка начинается, когда продукт достигает температуры выше 0 С, вторичную сушку проводили в 2 этапа. На первом этапе температуру на полке камеры регулировали в течение нескольких часов (в диапазоне от 4 до 7 ч) таким образом, что температура продукта была выше 0 С (в диапазоне от 4 до 6 С) . Таким образом, достигали таяния всего возможно существовавшего льда, который оставался после первичной сушки. При использовании таких мягких условий для начала вторичной сушки повреждения продукта будут минимизированы. Затем начинали второй этап увеличением температуры продукта до величин в диапазоне от 18 до 21 С в течение 20-30 ч. Время для второго этапа сильно зависит от желаемой остаточной влаги лиофилизированного продукта. Для получения различных величин содержания остаточной влаги использовали различные периоды времени. В качестве анализа для измерения содержания остаточной влаги в лиофилизированном материале использовали кулометрическое титрованиеKarl-Fischer (Jennings, Т.A., "Lyophilization, Introduction and Basic Principles", Interpharm Press, Denver,CO, US, 1999, ISBN 1-57491-081-7, pages 415-418). Укупорка и перемещение продукта Все продукты, изготовленные во время разработки способа, укупоривали при очень низком давлении (0,04-2,56 мбар) непосредственно в лиофилизаторе. Флакончики закрывали с использованием пробок из синтетического бутилкаучука. Как только продукт укупоривали, систему возвращали в атмосферное давление, и полку камеры разгружали. Затем флакончики герметизировали алюминиевыми колпачками для длительного хранения. Хранение вакцины Важным аспектом практики составления композиции является производство вакцины, которая устойчива при хранении. Факторы, влияющие на устойчивость, включают содержание остаточной влаги,состав атмосферы при герметизации и условия хранения, включая температуру, влажность и свет. Все различные партии, изготовленные во время разработки способа, хранили при 4 С и при комнатной температуре. Кроме того, несколько партий также хранили при 31, 37 и 45 С. Все образцы хранили в темноте. Восстановление влагосодержания Влагосодержание в лиофилизированных образцах восстанавливали автоклавированной водой MilliQ. Конкретнее, воду (1,2 мл) добавляли к образцу с использованием шприца. Суспензию смешивали легким встряхиванием. Восстановление влагосодержания занимает лишь несколько секунд. Определяли титр вируса в продукте с восстановленным влагосодержанием и сравнивали с титром вируса перед лиофилизацией. Ускоренный тест на устойчивость Устойчивость композиции GT23 (см табл. 6) оценивали при 31, 37 и 45 С. Вирусный титр регулярно контролировали. Результаты показаны на фиг. 1-3. 2. Результаты и выводы:MVA лиофилизировали с использованием различных добавок и без них. Было показано, что композиции без добавок неустойчивы (см. табл. 6). В данном контексте образцы считали устойчивыми, когда титр не падал более, чем на 0,5 log. Таким образом, термин устойчивая при определенной температуре в- 11006880 течение определенного периода времени означает, что потеря вирусного титра при данной температуре составляет менее, чем 0,5 log в течение данного периода времени. Композиция ослабевает, если потеря титра вируса в течение указанного периода времени при указанной температуре составляет 0,5 log или более. Композиции, включающие декстран и глюкозу, проявили очень низкую устойчивость при комнатной температуре. Композиции настоящего изобретения, включающие различные концентрации сахарозы и декстрана, оказались устойчивыми. Устойчивость MVA в композициях в соответствии с настоящим изобретением составляет по меньшей мере 25 нед. при 4 С и комнатной температуре. Подробная информация по отдельным экспериментам представлена в табл. 6: В табл. 6 показано, что устойчивость композиций без добавок (табл. 6, GT1-4) была очень низкой. Лишь через несколько недель они теряли 0,5 log их исходного, первоначального титра, что неприемлемо. Композиция с 20% (об./об.) DGG была неприемлема вследствие разрушения материала во время процесса лиофилизации (данные не показаны). Данное разрушение можно объяснить низкой Тс глюкозы,заметно не увеличивавшуюся при использовании декстрана, который имеет высокую Тс (-11 С). Для первичной сушки использовали самую низкую возможную температуру оборудования для лиофилизации (-45 С). Поэтому было невозможно уменьшить температуру ниже Тс глюкозы. Композиции с 30%(об./об.) DGG не разрушались. Данный феномен, вероятно, связан с более высоким общим количеством декстрана, который увеличивает Тс до величины, более высокой, чем температура, использованная для первичной сушки. Хотя материал не разрушался, устойчивость, особенно при комнатной температуре, была неудовлетворительной, что могло быть вследствие низкой Тс глюкозы в твердом состоянии (табл. 6, GT 10). Буфер для разведения 1 (DSG) использовали в большинстве экспериментов. Стабилизация данной добавкой очень хорошая. Вследствие высокой Тс (-31 С) сахарозы, разрушение не было проблемой с данной композицией. Устойчивость лиофилизированного материала была всегда хорошей (табл. 6). Не было больших различий между использованием 16,7, 20, 23, 28,6, 30 и 40% (об./об.) DSG в композиции. Устойчивость при 4 С и комнатной температуре доказана для всех 6 композиций. Лиофилизированные продукты с 30 и 40% DSG имели несколько лучшую устойчивость. Одну композицию (процесс GT 23, см. табл. 6) подробно анализировали в ускоренном тесте на устойчивость. Результаты показаны на фиг. 1-3 и сведены в следующей ниже табл. 5. Таблица 5 При 31 С вакцину хранили приблизительно в течение 1 мес., и она еще отвечала спецификациям(потеря титра вируса менее половины логарифма). Но даже при более высоких температурах можно было хранить вакцину в течение более 1 мес., что может быть интересным, особенно для тропических регионов. Для старых вакцин против натуральной оспы ВОЗ рекомендовала способ оценки устойчивости. Если вакцина теряла менее 1 log в пределах 4 нед. при 37 С, ее считали устойчивой в течение, по меньшей мере, 1 года при хранении при 4 С (критерием приемлемости для использования старой вакцины была потеря менее, чем 1 log). Как показано, композиция GT23 в соответствии с настоящим изобретением соответствует указанному критерию. Пример 2. Титрование модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA) Титрование модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA) выполняют в анализе на основе TCID50 с использованием 10-кратных разведений в 96-луночной планшете. В конечной точке анализа инфицированные клетки визуализируют с использованием антитела против вируса коровьей оспы и соответствующего окрашивающего раствора. 2-3-дневные первичные клетки CEF (фибробласты куриных эмбрионов) разводят до 1 х 105 клеток/мл в 7% RPMI. 10-кратные разведения производят с 8 повторениями на разведение. После разведения 100 мкл высевают на лунку 96-луночных планшет. Затем клетки инкубируют в течение ночи при 37 С и 5% CO2. Разведения растворов, содержащих вирус, производят 10-кратными шагами (как целесообразно, от 10-1 до 10-12) с использованием RPMI без фетальной бычьей сыворотки. Затем 100 мкл каждого образца вируса добавляют в лунки, содержащие клетки. 96-луночные планшеты инкубируют при 37 С с 5% CO2 в течение 5 дней для обеспечения возможности инфицирования и вирусной репликации. Через 5 дней после инфекции клетки окрашивают антителом, специфичным для вируса коровьей оспы. Для выявления специфического антитела используют вторичное антитело, соединенное с пероксидазой хрена (HRP). Антитело, специфичное для MVA, является антителом против вируса коровьей оспы,кроличья поликлональная фракция IgG (Quartett, Berlin, Germany 9503-2057). Вторичное антитело пред- 12006880 ставляет собой козье поликлональное антитело против кроличьего IgG, связанное с HRP, (Promega,Mannheim, Germany, W4011). Цветную реакцию проводят в соответствии с известными методиками. Каждую лунку с клетками, которые положительны при цветной реакции, маркируют в качестве положительных лунок для расчетаTCID50. Титр рассчитывают с использованием формулы Spearman [11] и Kaerber [2]. Ввиду того, что все параметры анализа поддерживаются на постоянном уровне, используют следующую упрощенную формулу: а = фактор разведения последней колонки, в которой все 8 лунок положительныa = количество положительных лунок в колонке а+1b = количество положительных лунок в колонке а+2c = количество положительных лунок в колонке а+3 Таблица 6. Данные устойчивости поксвирусов в различных лиофилизированных композициях ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция, включающая (i) вирус осповакцины с титром по меньшей мере 106 TCID50 на мг общего белка, (ii) дисахарид, (iii) фармацевтически приемлемый полимер и (iv) буфер, где буфер не является фосфатным буфером. 2. Композиция по п.1, где титр вируса осповакцины составляет по меньшей мере 108 TCID50 на мг общего белка. 3. Композиция по любому из пп.1-2, где вирус осповакцины выбран из штамма Elstree и штамма модифицированного вируса осповакцины Ankara (MVA). 4. Композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что вирус осповакцины представляет собой рекомбинантый вирус осповакцины. 5. Композиция по любому из пп.1-4, где буфер выбран из группы, включающей TRIS, TBS, MOPS,HEPES и (би)карбонатный буфер. 6. Композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что дисахарид выбран из группы, состоящей из сахарозы, лактозы и трегалозы. 7. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что концентрация дисахарида находится в диапазоне от 10 до 100 г/л. 8. Композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый полимер выбран из декстрана и поливинилпирролидона (PVP). 9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что молекулярная масса декстрана находится в диапазоне от 30000 до 70000 и концентрация составляет от 1 до 50 г/л. 10. Композиция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит глутаминовую кислоту. 11. Композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что температура разрушения композиции находится в диапазоне от -37 до -30 С. 12. Композиция по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что вирус осповакцины является вирусом штамма MVA или штамма Elstree, дисахарид является сахарозой и полимер является декстраном. 13. Композиция по любому из пп.1-12, которая является вакциной. 14. Применение композиции по любому из пп.1-12 для получения вакцины. 15. Способ получения стабильной композиции, содержащей вирус осповакцины, характеризующийся тем, что композицию по любому из пп.1-13 лиофилизируют. 16. Способ по п.15, предусматривающий следующие стадии:(i) замораживание композиции по любому из пп.1-12 до температуры ниже температуры разрушения композиции с получением матрицы замороженного продукта;(ii) первичную сушку замороженной композиции при низком давлении и при температуре продукта,обеспечивающей возможность сублимации льда в матрице продукта, где температура продукта ниже,чем температура разрушения композиции;(iii) вторичную сушку при низком давлении и при температуре в диапазоне от 0 до 30 С до тех пор,пока остаточная влажность продукта не будет ниже 5%. 17. Лиофилизированный продукт, включающий (i) вирус осповакцины с титром по меньшей мере 106 TCID50 на мг общего белка, (ii) дисахарид, (iii) фармацевтически приемлемый полимер и (iv) буфер,где вирус осповакцины, дисахарид, полимер и буфер такие, как определено в пп.1-6, 8 и 10. 18. Лиофилизированный продукт, полученный способом по любому из пп.15-16, где используемая для лиофилизации композиция содержит дисахарид в концентрации, как определено в п.7, и/или содержит декстран с молекулярным весом и концентрацией, как определено в п. 9. 19. Лиофилизированный продукт по п.17-18, отличающийся тем, что содержание остаточной влажности находится в пределах 1-3%. 20. Применение лиофилизированного продукта по любому из пп.17-19 для получения вакцины. 21. Способ восстановления лиофилизированного продукта по любому из пп.17-19, характеризующийся тем, что продукт растворяют в соответствующем количестве фармацевтически приемлемого растворителя. 22. Способ вакцинации нуждающегося в ней животного, включая человека, композицией по любому из пп.1-12, вакциной по п.13 или продуктом с восстановленным влагосодержанием, полученным способом по п.21.