Усовершенствованный метод количественного определения днк в биологическом образце

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ В изобретении описывается усовершенствованная методика количественного определения нуклеиновых кислот, уникальных для трансгенной кукурузы с обозначением Bt11, в биологическом образце, а также композиций для применения в данной методике. Кроме того, изобретение касается использованных в настоящей методике пар праймеров, которые являются уникальными для объекта Краткая информация Настоящее изобретение касается усовершенствованной методики количественного определения нуклеиновых кислот, уникальных для трансгенной кукурузы с обозначением Bt11, в биологическом образце, а также композиций, рекомендуемых к использованию в данной методике. В связи с применением нормативных требований, в частности Директивы Европейской комиссии(ЕС) 1139/98, Директивы ЕС 49/2000 и Директивы ЕС 50/2000, регламентирующих использование трансгенных культурных растений, возникла необходимость в точном измерении уровней ДНК трансгенных видов, которые могут присутствовать, к примеру, в зерне, используемом для пищевых целей. Причиной значительного внимания, уделяемого аналитическим методам обнаружения и количественного анализа ДНК этих трансгенных растений, является то обстоятельство, что пороговое значение для маркировки,установленное Постоянным комитетом Европейской комиссии в 1999 году, составляет 1%. Трансген можно распознать с помощью хорошо известного метода обнаружения нуклеиновых кислот, который включает, помимо прочего, термическую амплификацию (полимеразная цепная реакция(ПЦР с использованием полинуклеотидных праймеров или гибридизацию ДНК с использованием зондов нуклеиновой кислоты. В большинстве случаев для простоты и однотипности реагентов и методов,используемых для обнаружения определенной конструкции ДНК, которая применялась для преобразования различных видов растений, эти методы обнаружения, как правило, сосредоточены на часто применяемых генетических элементах, например промоторах, терминаторах и маркерных генах, поскольку для многих конструкций ДНК области кодирующей последовательности являются взаимозаменяемыми. В результате такие методы могут быть малоинформативными для дифференциации конструкций, которые различаются только в кодирующей последовательности. Кроме того, такие методы могут быть непригодны для дифференциации различных трансгенных объектов, в особенности полученных с использованием аналогичной конструкции ДНК. С целью разграничения трансгенных объектов были разработаны методы ПЦР для конкретных объектов. Включение гетерологичной конструкции ДНК в геном растения создает уникальные, специфические для объектов стыки между интегрированной последовательностью ДНК и геномной последовательностью растения. Для трансгенных объектов, в том числе Bt11, была разработана количественная методика ПЦР (количественная ПЦР) для конкретных объектов. К факторам, которые могут ограничивать применимость таких методов, могут относиться, например, влияние исходной концентрации ДНК, установленные надзорными органами стандарты, выбор праймеров и протокола ПЦР, повторяемость от образца к образцу, воспроизводимость результатов между различными лабораториями, а также пороговые значения для обнаружения низких уровней и высокой чувствительности. По вышеизложенным причинам существует необходимость в совершенствовании количественного обнаружения нуклеиновых кислот трансгенной кукурузы Bt11 в биологическом образце. Резюме Настоящее изобретение касается трансформированной кукурузы (Zea mays) линии Bt11, включающей две гетерологичные экспрессионные кассеты, одна из которых содержит кодирующую последовательность Cry1Ab, которая кодирует инсектицидный белок Cry1Ab, придающий растениям кукурузыBt11 устойчивость к насекомым-вредителям, а вторая содержит кодирующую последовательность pat,которая кодирует белок PAT, придающий растениям кукурузы Bt11 устойчивость к гербицидам на основе глюфосината аммония. Создание объекта Bt11 описано в патенте США 6114608, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. Две экспрессионные кассеты были включены в пределах области 15 сМ на длинном плече хромосомы 8, возле положения 117, и в промежутке были фланкированы двумя общими маркерами: ZIB3 и UMC150a. Настоящее изобретение предлагает композиции и усовершенствованные методы количественного обнаружения специфичной для Bt11 ДНК в биологических образцах, имеющих отношение к эндогенному гену кукурузы adhl. Такое количественное определение ДНК Bt11, например, в смеси зерен кукурузы,включающей зерно линии Bt11 и зерно, отличное от Bt11, основано на использовании пары праймеров и зонда, предназначенных для обнаружения последовательности 5' соединения в Bt11. В одном варианте настоящего изобретения предлагается метод для определения количества ДНК объекта Bt11 в биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы; в этом варианте осуществления метод включает (а) вступление биологического образца в контакт с первой парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из SEQ ID NO: 1, и второй праймер, который состоит из SEQ ID NO: 2, и зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержитSEQ ID NO: 3, в котором первая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы линии Bt11 образует первый ампликон, содержащийSEQ ID NO: 4, и в котором первый ампликон указывает на наличие объекта Bt11; (b) вступление биологического образца в контакт со второй парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из SEQ ID NO: 5, и второй праймер, который состоит из SEQ ID NO: 6, и со вторым зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержит SEQ ID NO: 7, в котором вторая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы образует второй ампликон, содержащий SEQ ID NO: 8, и в котором второй ампликон указывает на наличие гена кукурузыadhl; (с) обеспечение условия для реакции амплификации нуклеиновых кислот и инструмента ПЦР, способного провести количественную ПЦР в реальном времени; (d) проведение количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зондов (а) и (b), образуя тем самым первый ампликон и второй ампликон; (е) одновременное обнаружение первого и второго ампликона при их образовании с помощью упомянутого инструмента ПЦР и (f) подсчет относительного количества первого ампликона по сравнению со вторым ампликоном, при котором количество первого ампликона указывает на количество ДНК Bt11 в биологическом образце. В другом варианте настоящее изобретение предлагает пару праймеров, содержащую первый праймер, который состоит из SEQ ID NO: 1, и второй праймер, который состоит из SEQ ID NO: 2, в котором пара праймеров при использовании в ПЦР с геномной ДНК кукурузы линии Bt11 образует первый ампликон, содержащий SEQ ID NO: 4, который указывает на наличие объекта Bt11. В еще одном варианте настоящее изобретение предлагает полинуклеотидный зонд, состоящий изSEQ ID NO: 3, который при маркировке флуоресцентной краской на 5'- и 3'-концах практичен для использования в количественной ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения ампликона Bt11. Вышеупомянутые и прочие варианты настоящего изобретения станут более понятны из нижеследующего подробного описания. Описание последовательностей в перечне последовательностей Подробное описание Предлагаемые ниже определения основных понятий приведены для большей ясности изложения сути настоящего изобретения и с целью оказания помощи специалистам с общим знанием данной области в практическом применении настоящего изобретения. Если не указано иное, используемые в настоящем документе термины следует понимать согласно их общепринятому токованию специалистами в соответствующей области. Определения общих терминов молекулярной биологии можно также найти в толковом словаре по классической и молекулярной генетике Ригера (Rieger et al., Glossary of Genetics:Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1994). В настоящем документе использована номенклатура для оснований ДНК и аминокислот, изложенная в Своде федеральных правил США 371.822."Достоверность" метода ПЦР - близость соответствия между результатом испытания и принятым эталонным значением."Эффективность амплификации" - скорость амплификации, которая приводит к теоретическому наклону в -3,32 с эффективностью 100% в каждом цикле. Эффективность реакции можно рассчитать с помощью следующего уравнения: Эффективность = [10(-1/наклон)] - 1. Термин "амплифицированный" в контексте данного изобретения означает построение множественных копий молекулы нуклеиновой кислоты или множественных копий, комплементарных молекуле нуклеиновой кислоты, с использованием как минимум одной из молекул нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Системы амплификации включают, кроме прочего, систему полимеразной цепной реакции(ПЦР), систему лигазной цепной реакции (ЛЦР), метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот (NASBA, корпорация Cangene, Mississauga, Ontario), системы Q-бета репликазы, метод транскрипционной амплификации (TAS) и амплификации с вытеснением цепи (SDA). См., например, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Диагностическая молекулярная микробиология: принципы и применение), D.H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C.(1993). Продукт амплификации называется ампликоном."Коэффициент линейности (R2)" - это коэффициент корреляции градуировочной кривой, полученной с помощью линейно-регрессионного анализа. Термин "динамический диапазон" в контексте данного изобретения означает диапазон концентраций ДНК Bt11, выше которого метод, предлагаемый в настоящем изобретении, используется линейным способом с приемлемым уровнем достоверности и точности. Термин "трансгенный объект" в контексте данного изобретения относится к рекомбинантному растению, полученному путем трансформации и регенерации клетки или ткани растения с гетерологичной ДНК, например, экспрессионной кассетой, содержащей представляющий интерес ген. Термин "объект" означает исходный трансформант и/или потомство трансформанта с гетерологичной ДНК. Термин "объект" также относится к потомству, полученному путем скрещивания трансформанта и кукурузы другой линии. Даже после повторного обратного скрещивания с рекуррентным родителем введенная ДНК и фланкирующая ДНК трансформированного родителя присутствуют в потомстве гибрида в аналогичной хромосомной локализации. Термин "объект" также относится к ДНК исходного трансформанта, содержащего введенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность в непосредственной близости к введенной ДНК, которая, как ожидается, перейдет к потомству, получающему введенную ДНК, в том числе представляющий интерес трансген, в результате скрещивания одной родительской клеточной линии, которая включает введенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученные в результате самоопыления) с родительской клеточной линией, которая не содержит введенной ДНК. Обычно в результате трансформации ткани растения образуется множество объектов, каждый из которых представляет введение конструкции ДНК в различное расположение генома клетки растения. Определенный объект выбирают на основании экспрессии трансгена или других требуемых характеристик. Таким образом, термины "объект Bt11", "Bt11" "Bt11-объект" являются взаимозаменяемыми. Термин "экспрессионная кассета" в контексте данного изобретения означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную направить экспрессию определенной нуклеотидной последовательности в надлежащую клетку-хозяина, содержащую промотор, активно связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая активно связана с сигналами терминации. Обычно она также содержит последовательности, требуемые для надлежащей трансляции нуклеотидной последовательности. Экспрессионная кассета также может содержать последовательности, которые не являются необходимыми в прямой экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности, но которые присутствуют в связи с удобным сайтом рестрикции для удаления кассеты из вектора экспрессии. Экспрессионная кассета, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть гибридной; это значит, что как минимум один из ее компонентов является гетерологичным по отношению как минимум к одному из ее других компонентов. Экспрессионная кассета также может представлять собой экспрессионную кассету, которая, хотя и встречается в природе, была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако в большинстве случаев экспрессионная кассета является гетерологичной в отношении хозяина, т.е. определенная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессионной кассеты не встречается в клетке-хозяине в природе, и ее необходимо ввести в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью процесса трансформации, применяемого в данной области науки. Экспрессия нуклеотидной последовательности в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцируемого промотора, который начинает транскрипцию только после того, как клетка-хозяин подвергается действию определенного внешнего раздражителя. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным для определенной ткани, органа или стадии развития. Экспрессионная кассета или ее фрагмент после их трансформации в растение могут также называться "вставленная последовательность" или "вставочная последовательность"."Ген" - определенный участок, расположенный в пределах генома, который, кроме кодирующей последовательности, может содержать другие, в первую очередь регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, ответственные за контроль экспрессии, а именно за транскрипцию и трансляцию кодирующей части. Ген также может содержать другие нетранслируемые 5'- и 3'-последовательности и терминирующие кодоны. Другими возможными компонентами являются, например, интроны."Гетерологичная" последовательность нуклеиновых кислотэто последовательность нуклеиновых кислот, которая не связана естественным образом с принимающей ее клеткой-хозяином, включая не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности нуклеиновых кислот."Предел обнаружения (LOD)" - минимальное количество или концентрация ДНК в образце, которые могут быть достоверно обнаружены, но не всегда выражены в количественной форме. ПоказательLOD применительно к методу, предлагаемому настоящим изобретением, составляет менее 1/20 целевой концентрации. В условиях эксперимента с помощью метода, составляющего предмет настоящего изобретения, наличие ДНК Bt11 идентифицируется как минимум в 95% случаев при LOD, что обеспечивает 5% ложноотрицательных результатов."Предел количественного определения (LOQ)" - минимальное количество или концентрация ДНКBt11 в образце, которые могут быть количественно определены с приемлемым уровнем достоверности и точности. Показатель LOQ для метода, составляющего предмет настоящего изобретения, составит менее 1/10 значения целевой концентрации с RSDr 25%. Целевая концентрация используется в качестве порога, предписанного нормативными требованиями. Под "осуществимостью" следует понимать простоту использования, применимость и эффективность внедрения и/или сопутствующие удельные затраты (например, стоимость образца в долларах) описанного здесь метода. Термин "праймеры" в контексте данного изобретения означает изолированные нуклеиновые кислоты, которые присоединены к комплементарной нити целевой ДНК путем гибридизации нуклеиновой кислоты для образования гибрида праймера и нити целевой ДНК, а затем протянуты вдоль нити целевой ДНК с помощью полимеразы, такой как ДНК-полимераза. Для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться пары или наборы праймеров, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других традиционных методов амплификации нуклеиновых кислот."Зонд" - это изолированная нуклеиновая кислота, к которой прикреплен обычный обнаруживаемый маркер или репортерная группа, такая как хемилюминесцентный агент, радиоактивный изотоп, лиганд или фермент. Такой зонд является дополнительным к нити ДНК кукурузы объекта Bt11 или традиционной линии кукурузы. ДНК Bt11 может происходить из растения кукурузы Bt11 или из образца, который включает ДНК из Bt11. Зонды согласно настоящему изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но и полиамиды, а также другие материалы, используемые в качестве зондов, которые, в частности, крепятся к целевой последовательности ДНК и могут использоваться для обнаружения наличия этой целевой последовательности ДНК. Длина праймеров и зондов обычно составляет не менее 10-15 нуклеотидов. Длина праймеров и зондов может также составлять не менее 20 нуклеотидов, или не менее 25 нуклеотидов, или не менее 30 нуклеотидов. Такие праймеры и зонды, в частности, скрещиваются с целевой последовательностью в высокоточных условиях скрещивания. Согласно настоящему изобретению праймеры и зонды могут полностью дополнять целевую последовательность, хотя отличающиеся от целевой последовательности зонды, которые сохраняют способность к скрещиванию с целевыми последовательностями, могут разрабатываться с помощью традиционных методов. В контексте настоящего изобретения термин "стандартное отклонение повторяемости (сходимости)(RSDr)" означает стандартное отклонение результатов исследований, полученных в условиях повторяемости. "Условия повторяемости" - это условия, при которых результаты испытаний получают одним и тем же методом, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в течение коротких промежутков времени. В контексте настоящего изобретения термин "стандартное отклонение воспроизводимости (RSDR)" означает стандартное отклонение результатов исследований, полученных в условиях воспроизводимости. Условия воспроизводимости - это условия, при которых результаты исследования получают одним и тем же методом, на идентичных объектах испытаний в разных лабораториях разными операторами, с использованием различного оборудования. Стандартное отклонение воспроизводимости описывает отклонение между лабораториями."Устойчивость" метода - это его способность оставаться незатронутым незначительными, но намеренными отклонениями от экспериментальных условий, описанных в настоящей процедуре."Селективность" метода - это способность метода реагировать исключительно на представляющую интерес характеристику или аналит. Например, селективность метода ПЦР, описанного в примере 1, в котором используются праймеры, раскрытые в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, состоит в том, что с его помощью можно обнаружить исключительно ДНК Bt11."Достоверность" метода - это близость соответствия между средним значением, полученным из крупной серии результатов испытаний, и принятым эталонным значением. Мера точности обычно выражается в процентах отклонения. Достоверность метода, предлагаемого настоящим изобретением, составляет во всем динамическом диапазоне 5%. В контексте настоящего изобретения термин "уникальный" применительно к Bt11 означает явно характерный или отличительный признак объекта Bt11. Таким образом, уникальные для объекта Bt11 нуклеиновые кислоты не содержатся в других растениях кукурузы, которые не принадлежат к линииBt11. Настоящее изобретение предлагает композиции и усовершенствованные методы для количественного обнаружения специфичной для Bt11 ДНК в биологических образцах, имеющих отношение к эндогенному гену кукурузы adhl. Такое количественное определение ДНК Bt11, например, в смеси зерен кукурузы, включающей зерно линии Bt11 и зерно, отличное от Bt11, основано на использовании пары праймеров и зонда, предназначенных для обнаружения последовательности 5' соединения в Bt11. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает метод для определения количества ДНК объекта Bt11 в биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы; в этом варианте осуществления метод включает (а) вступление биологического образца в контакт с первой парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из SEQ ID NO: 1, и второй праймер, который состоит из SEQ ID NO: 2, и зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержитSEQ ID NO: 3, в котором первая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы линии Bt11 образует первый ампликон, содержащийSEQ ID NO: 4, и в котором первый ампликон указывает на наличие объекта Bt11; (b) вступление биоло-4 021136 гического образца в контакт со второй парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из SEQ ID NO: 5, и второй праймер, который состоит из SEQ ID NO: 6, и со вторым зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержит SEQ ID NO: 7, в котором вторая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы образует второй ампликон, содержащий SEQ ID NO: 8, и в котором второй ампликон указывает на наличие гена кукурузыadhl; (с) обеспечение условия для реакции амплификации нуклеиновых кислот и инструмента ПЦР, способного провести количественную ПЦР в реальном времени; (d) проведение количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зондов (а) и (b), образуя тем самым первый ампликон и второй ампликон; (е) одновременное обнаружение первого и второго ампликона при их образовании с помощью настоящего инструмента ПЦР и (f) подсчет относительного количества первого ампликона по сравнению со вторым ампликоном, при котором количество первого ампликона указывает на количество ДНК Bt11 в биологическом образце. В одном варианте осуществления данного варианта изобретения предел количественного определения (LOQ) метода составляет не более 0,08% концентрации ДНК Bt11. В другом варианте осуществления данного варианта изобретения предел обнаружения (LOD) метода составляет не более 0,04% концентрации ДНК Bt11. В еще одном варианте осуществления данного варианта изобретения средний коэффициент линейности (R2) метода составляет не менее 0,99. В еще одном варианте осуществления данного варианта изобретения относительное стандартное отклонение воспроизводимости (RSDR) метода составляет не более 24% при концентрации ДНК Bt11 0,090%. В другом варианте осуществления данного варианта изобретения относительное стандартное отклонение повторяемости (RSDr) метода составляет не более 17% при концентрации ДНК Bt11 0,090%. В еще одном варианте осуществления данного варианта изобретения достоверность метода составляет во всем динамическом диапазоне не более 5%. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает пару праймеров, включающих первый праймер, содержащий SEQ ID NO: 1, и второй праймер, состоящий из SEQ ID NO: 2, которые действуют совместно в ПЦР в присутствии матрицы ДНК кукурузы линии Bt11 в биологическом образце для получения ампликона, указывающего на наличие кукурузы линии Bt11. В одном варианте осуществления данного варианта изобретения ампликон содержит SEQ ID NO: 4. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает маркированный флуоресцентной краской зонд, содержащий SEQ ID NO: 3. Описанные ниже примеры предназначены исключительно для иллюстрации одного или более предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничивающие область настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Разработка метода количественной ПЦР Bt11 в реальном времени (RT-qPCR). В этом примере описан усовершенствованный, специфический для Bt11 метод количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) для определения относительного количества ДНК Bt11 к общему количеству ДНК кукурузы в биологическом образце. Анализ TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) является техническим приемом обнаружения с помощью количественной ПЦР в реальном времени, при котором накопление продукта ПЦР отслеживается непосредственно в ходе реакции ПЦР. Расщепление молекул зонда, предназначенных для заданной цели, вследствие деятельности экзонуклеазы от 5' до 3' полимеразы ДНК Taq в течение каждого цикла амплификации приводит к накоплению флуоресценции. Увеличение уровней флуоресценции напрямую связано с накоплением продукта ПЦР и обнаруживается в течение каждого цикла амплификации с помощью использования специализированной установки ПЦР, включая ABI PRISM 770 или ABIPRISM 7900 НТ (Applied Biosystems, Foster City, CA). Пороговые значения цикла (Ct) автоматически определяются инструментом ПЦР для каждого образца в соответствии с циклом, при котором флуоресценция превышает определенный фоновый уровень. Образцы с более высокими уровнями матрицы в начале реакции увеличиваются до обнаруживаемых уровней быстрее и вырабатывают меньшие значения Ct. Для определения количества ДНК объекта Bt11 в опытном образце для расчета с помощью линейной регрессии формулы Ct эталонной кривой используются нормализованные значения Ct калибровочных образцов. Затем измеряются нормализованные значения Ct неизвестных образцов и с помощью рассчитанной формулы регрессии подсчитывается относительное количество ДНК объекта Bt11 в неизвестном образце. Описанный здесь анализ TaqMan может использоваться для точного количественного определения уровня ДНК Bt11, связанного с эндогенным калибровочным геном кукурузы. Поскольку эндогенная калибровочная последовательность остается неизменной относительно общего количества геномной ДНК кукурузы, любое отклонение в уровне ДНК, специфичной для Bt11, в отношении эндогенного гена указывает на различие в количестве копий. 1.1. Система ПЦР, специфичная для объекта кукурузы линии Bt11. Системы ПЦР, полученные из обеих областей соединения между введенной и геномной ДНК объекта Bt11, были протестированы на основании информации о последовательности вставки ДНК и ее фланкировании 5'- и 3'-граничных последовательностей. С помощью программного обеспечения для разработки дизайна олигонуклеотидов (Primer Express V2.0) были созданы три зонда и шесть амплификационных праймеров для 5'-конца, а также один зонд и три амплификационных праймера для 3'-конца. Затем экспериментальным путем были испытаны все возможные комбинации этих праймеров и зондов. Сравнение значений Ct, значений Rn, форм графиков амплификации и эффективности ПЦР привели к выбору для дальнейшей оптимизации комбинации одной пары праймера/зонда. Оптимальная пара праймера и зонд расположены на соединении 5' генома-вставки; они дали лучшие результаты, чем праймеры на 3'-соединении. Прямой праймер расположен в геномной ДНК; место связывания обратного праймера расположено в пределах вставки объекта Bt11, в то время как зонд охватывает соединение вставки-5'-генома. Для конкретного обнаружения ДНК объекта Bt11 фрагмент нуклеиновой кислоты из 68 пар оснований, перекрывающий гетерологичную вставную ДНК и геномную ДНК кукурузы, фланкирующую 5'-конец вставки, амплифицируется с помощью следующих праймеров:Bt11-ev-f1: 5'-TGTGTGGCCATTTATCATCGA-3' (SEQ ID NO: 1),Bt11-ev-r5: 5'-CGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3' (SEQ ID NO: 2). Продукты ПЦР измеряются при каждом цикле (в реальном времени) посредством следующего специфичного для заданной цели олигонуклеотидного зонда:Bt11-ev-p1: 5'-TTCCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-3' (SEQ ID NO: 3), маркированного репортерным красителем, флуоресцеином (FAM), на своем 5'-конце и красителем-тушителем, тетраметилродамином (TAMRA) на своем 3'-конце. С помощью этих праймеров в реакции с ДНК кукурузы Bt11 в качестве матрицы образуется ампликон SEQ ID NO: 4, который является уникальным и отличительным для объекта Bt11. 1.2. Эталонная система ПЦР, специфичная для кукурузы (adhl). Для относительного количественного определения ДНК объекта Bt11 была использована предсуществующая специфичная для кукурузы эталонная система ПЦР Hernandez et al. 2004. J. Agric. FoodChem. 52:4632-4637), которая амплифицирует фрагмент из 135 пар оснований эндогенного гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (adhl) (Genbank accession no. AY691949) в качестве конкретного обнаружения последовательностей Zea mays. В данной эталонной системе используются следующие праймеры:Zmadhl-F: 5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 5),Zmadhl-R: 5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3' (SEQ ID NO: 6). Продукты ПЦР измеряются при каждом цикле (в реальном времени) посредством следующего специфичного для заданной цели олигонуклеотидного зонда:Zmadhl-P: 5'-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3' (SEQ ID NO: 7), который маркирован с помощью красителя VIC (Applied Biosystems, Foster City, CA) на 5'-конце и TAMRA на 3'-конце. С помощью этих праймеров в реакции с ДНК кукурузы в качестве матрицы образуется ампликон,содержащий SEQ ID NO: 8, который указывает на наличие кукурузы adhl. 1.3. Расчет калибровочной кривой. Калибровочная кривая состоит из пяти образцов с фиксированным процентным содержанием ДНКBt11 в общем количестве 250 нг ДНК кукурузы. Концентрация ДНК Bt11 в стандартных образцах колебалась от 10 до 0,08%. Калибровочную кривую получают путем нанесения значений Ct калибровочных образцов в зависимости от логарифма соответствующей концентрации Bt11%; наклон (а) и отрезок между двумя точками (b) калибровочной кривой (у = ах + b) затем используются для расчета среднего содержания Bt11% контрольных образцов, основываясь на их нормализованных значениях Ct. В ходе реакции TaqMan программное обеспечение, поставляемое с устройством ABI PRISM 7900 НТ, обнаруживает накопление продукта ПЦР путем накопления флуоресценции. Строится зависимость нормализованной флуоресценции, относящейся к установленным исходным уровням (Rn), от номера цикла. Значение Ct получают путем нанесения производного порога через реакции, так чтобы линия проходила через логарифмическую фазу каждой реакции. Программное обеспечение системы обнаружения последовательности с устройством ABI PRISM 7900 НТ предоставляет номер цикла, при котором накопление флуоресценции (продукта ПЦР) определенной реакции выходит за пределы порогового значения (Ct). Значение FAM Ct (Bt11) сравнивается со значением VIC Ct (adhl) для нормализации значения FAM Ct каждой реакции до уровня общего количества имеющихся нуклеиновых кислот для получения Ct[Ct = Ct(FAM) - Ct(VIC)]. Благодаря такому расчету устраняются любые отклонения,вызванные неравноценными матрицами на входе реакций. Поскольку количество копий эндогенного гена кукурузы на один геном остается неизменным, изменение значения Ct соответствует изменению в количестве (или копии) ДНК Bt11. Сравнивая значения Ct неизвестных образцов со значениями Ct известной контрольной группы, получают Ct [Ct = Ct (неизвестный) - Ct (известный)]. Затем количество копий может быть рассчитано с помощью значения Ct, используя уравнение: Количество копий = 2(Ct). 1.4. Порядок проведения ПЦР в реальном времени. ПЦР проводят в 96-луночных плашках. Процедура представляет собой нерезервированную систему, в которой одновременно в отдельных лунках проводят эндогенный анализ калибровочной кукурузыadhl и анализ целевого Bt11. В двух реакционных пробирках, одной для системы Bt11 и одной для системы adhl, на льду добавляют компоненты (за исключением ДНК), представленные в табл. 1 и 2, в перечисленном порядке для приготовления мастер-миксов. Микс 2 Х Sigma Jumpstart Ready Mix дополняют 550 мкл 1 моля MgCl2 и 20 мкл 10000 сульфородамина 101. Затем осторожно смешивают и быстро центрифугируют. Готовят еще две реакционные пробирки, одну для Bt11 и одну для мастер-миксов adhl, для образцов ДНК со стандартной кривой, неизвестных образцов ДНК и контрольных образцов ДНК. В каждую реакционную пробирку добавляют надлежащее количество мастер-микса (например, 203=60 мкл мастер-миксов для трех повторов ПЦР-реакций). В каждую пробирку добавляют надлежащее количество ДНК, указанное в табл. 1 и 2 (например, 53=15 мкл ДНК для трех повторов ПЦР-реакций). Таблица 1 Смесь для реакции амплификации в конечном объеме/концентрации на одну реакционную лунку для эталонной системы кукурузы adhl Таблица 2 Смесь для реакции амплификации в конечном объеме/концентрации на одну реакционную лунку для системы, специфичной для Bt11 Каждую пробирку встряхивают в течение около 10 с, чтобы помочь снизить изменчивость между повторами каждого образца. Пробирки замедленно вращают в микрофуге. 25 мкл расфасовывают аликвотами в каждую реакционную лунку для ПЦР. Плашку герметизируют с помощью оптического колпака или оптических крышек. Плашку центрифугируют при 250g в течение около 1 мин в диапазоне температур от 4 С до температуры, близкой к комнатной. Плашку устанавливают в устройство для проведения ПЦР и проводят ПЦР в условиях цикла, описанного в табл. 3. Таблица 3 Цикловая программа для систем кукурузы Bt11/adhl 1.5. Анализ данных. После проведения вышеописанного протокола ПЦР в реальном времени результаты анализируются с помощью следующей процедуры. Для установки порогового значения кривые амплификации одной системы (например, Bt11) отображаются в логарифмическом режиме. Пороговую линию располагают в зоне кривой, где профили амплификации параллельны (экспоненциальная фаза ПЦР). В случае необходимости значения Ct актуализируются. Переход к линейному режиму осуществляют, щелкнув на оси Y графика амплификации, а за-7 021136 тем проверяют, чтобы предварительно установленный порог находился в геометрических пределах кривых. Для установки исходного уровня определяют номер цикла, при котором пороговая линия пересекает первую кривую амплификации, и устанавливают исходный уровень за три цикла до этого значения(например, самое раннее значение Ct=25, пересечение исходного уровня следует установить при значении Ct=25-3=22). Описанную выше процедуру повторяют на графиках амплификации другой системы (например, системы adhl). После определения порогового значения в пределах логарифмической фазы амплификации согласно вышеприведенному описанию с помощью программного обеспечения устройства рассчитывают значения Ct для каждой реакции. Эталонную кривую Ct создают путем нанесения значений Ct, измеренных для калибровочных точек, в зависимости от логарифма процентного содержания Bt11 и путем включения в эти данные линии линейной регрессии. После этого для расчета относительного количества ДНК Bt11 в неизвестных образцах ДНК используют формулу регрессии. Селективность анализа Bt11 (прямые/обратные праймеры и зонд) была проверена опытным путем в ПЦР в реальном времени в зависимости от ДНК, выделенной из образцов, содержащих известную в данной области трансгенную кукурузу, включая Bt11, Bt10, NK603, MON810, MON863, MON810 MON863,ТС 1507, MIR604, Bt176, GA21, MON88017, Т 25 и Herculex RW (DAS-59122-7). Результаты демонстрируют, что ни одна из протестированных вышеупомянутых линий трансгенной кукурузы, за исключением положительного контроля Bt11, не образовывала ампликоны в повторных выборках в случае использования для одной реакции всего 100 нг ДНК. Пример 2. Подтверждение наличия Bt11 методом количественной ПЦР в реальном времени(RT-qPCR). Описанный в примере 1 метод оптимизирован с целью количественного определения ДНК Bt11 в биологических образцах, состоящих из смесей семян Bt11 и традиционной кукурузы. Данный метод использует уникальную последовательность ДНК в области между вставкой и геномом растения. Эта последовательность специфична для кукурузы линии Bt11 и, таким образом, обеспечивает селективность этого метода применительно к объекту. 2.1. Точность/достоверность/динамический диапазон/LOQ/LOD. Для определения точности, достоверности, динамического диапазона, LOQ и LOD был проведен экспериментальный проект, состоящий из восьми независимых серий. Были созданы калибровочные образцы (от Std1 до Std6) путем приготовления растворов 50 нг/мкл(250 нг на реакцию) общего количества геномной ДНК с содержанием 100; 10; 5; 1; 0,5 и 0,1% ДНК объекта Bt11 в фоне ДНК нетрансгенной кукурузы. Схема разведения стандарта Bt11 и соответствующее общее содержание геномной ДНК в ПЦР-реакции показаны в табл. 4. Таблица 4 Схема разведения калибровочных образцов Калибровочную кривую получали путем нанесения средних значений Ct калибровочных образцов в зависимости от логарифма соответствующей концентрации Bt11 в%; наклон (а) и отрезок между двумя точками (b) калибровочной кривой (у = ах + b) затем использовались для расчета среднего процентного содержания Bt11 контрольных образцов, основываясь на их нормализованных значениях Ct. Для подтверждения чистоты реагентов использовали три отрицательных контроля (NTC) на одну систему. Каждый эталонный образец (содержащий различные пропорции ДНК объекта Bt11 в фоне ДНК нетрансгенной кукурузы) анализировали с помощью 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию в трех идентичных копиях. Анализ данных выполняли с использованием установки исходного уровня 3-19 для системы adhl и 3-21 для системы обнаружения, специфичной для объекта Bt11. Пороговые значения составили 0,4 (adhl) и 0,7 (Bt11) на системе обнаружения ABI 7900 НТ. Для каждого из 5 образцов (содержащих от 5,0 до 0,08% ДНК объекта Bt11 в ДНК нетрансгенной кукурузы) с целью определения достоверности и повторяемости рассчитали среднее значение (MEAN),относительное отклонение от ожидаемого значения (BIAS), а также стандартное отклонение (STDEV) и относительное стандартное отклонение (RSDr) результатов количественного определения. Результаты показаны в табл. 5. Таблица 5 Результаты количественного определения 8 независимых серий ПЦР в условиях повторяемости для объекта Bt11 Предел количественного определения (LOQ). Предел обнаружения (LOD). Относительное отклонение среднего значения от ожидаемого (истинного) значения колебалось от-13,8 до 0% во всем динамическом диапазоне. Значения точности (стандартное отклонение повторяемости RSDr) для всех образцов с концентрацией Bt11 в пределах от 5,0 до 0,08% колебались от 5,9 до 16,3% относительного стандартного отклонения. Было определено, что относительный предел обнаружения (LOD) настоящего метода составил не более 0,04% в 250 нг общего количества ДНК кукурузы. Относительный предел количественного определения (LOQ) настоящего метода составил не более 0,08% в 250 нг общего количества ДНК кукурузы. 2.2. Эффективность амплификации и коэффициент R2. Для оценки эффективности амплификации (Е) и коэффициента R2 специфичной для объекта Bt11(единичной) системы ПЦР был проведен линейно-регрессионный анализ значений Ct Bt11 в зависимости от логарифма [% содержание Bt11]. Были оценены линии регрессии стандартов 8 независимых серий (см. подраздел 2.1) и были определены параметры регрессии, включая наклон, отрезок между двумя точками и коэффициент R2. Эффективность амплификации была рассчитана с помощью следующего уравнения: Е = [10(-1/наклон)] - 1. Результаты показаны в табл. 6. Таблица 6 Параметры регрессии и эффективность ПЦР специфичных для объекта Bt11 линий регрессии Для оценки эффективности амплификации Е и коэффициента R2, основанного на значении Ct метода обнаружения объекта Bt11, был проведен линейно-регрессионный анализ значений Ct в зависимости от логарифма [% содержание Bt11]. Были оценены линии регрессии стандартов 8 независимых серий и были определены параметры регрессии, включая наклон, отрезок между двумя точками и коэффициентR2. Эффективность амплификации была рассчитана с помощью следующего уравнения: Е = [10(-1/наклон)] - 1. Результаты показаны в табл. 7. Таблица 7 Параметры регрессии и эффективность ПЦР калибровочных кривых,основанных на значениях Ct калибровочных образцов Для оценки устойчивости метода проводили ПЦР-реакции при переменных концентрациях мастермикса и температурах отжига. Для определения стабильности обеих систем обнаружения в отношении изменений концентрации основных компонентов реакции проводили эксперимент при +20% и при -20% концентрации мастермикса. Три образца (содержащих 0,080, 0,90 и 5,0% ДНК объекта Bt11 в ДНК нетрансгенной кукурузы) анализировались с содержанием 250 нг геномного ДНК на каждую реакцию. Средние значения трипликатов показаны в табл. 8. Таблица 8 Результаты количественного определения при 20% мастер-микса За исключением одного резко отклоняющегося значения. Для оценки влияния изменения температуры отжига были проанализированы три образца (содержащие 0,080, 0,90 и 5,0% ДНК объекта Bt11 в фоне ДНК не модифицированной генетически кукурузы) с содержанием 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию с температурами отжига 58 и 62 С на системе обнаружения последовательности ABI 7900 НТ. Результаты показаны в табл. 9. Таблица 9 Результаты количественного определения с использованием различных температур отжига Для оценки влияния различных платформ ПЦР в реальном времени были проанализированы три образца (содержащие 0,080, 0,90 и 5,0% ДНК объекта Bt11 в фоне ДНК не модифицированной генетически кукурузы) с содержанием 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию, каждый на системе обнаружения ABI PRISM 7700, 7500 fast (использованная в не быстром режиме) и Stratagene Mx 3005 Р. Два результата количественного определения, полученные для каждого образца, показаны в табл. 10. Таблица 10 Результаты количественного определения с использованием различных платформ Для оценки результатов испытания в условиях повторяемости были проведены две серии по количественному определению в двух разных лабораториях, Lab 1 и Lab 2. Были проанализированы различные образцы, содержащие 0,08-5,0% концентрации ДНК Bt11 (каждый в трех идентичных копиях) с содержанием 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию на различных системах обнаружения последовательности. В табл. 11 показаны два результата количественного определения для каждой концентрации ДНК Bt11 в каждой из лабораторий. Было подсчитано, что стандартное отклонение повторяемости(RSDR) составляет приблизительно 9,0% при концентрации Bt11 0,08%. Таблица 11 Результаты количественного определения в условиях повторяемости (между лабораториями) Описанный здесь метод количественного определения был представлен Объединенному научному центру Европейской комиссии (JRC, Отдел биотехнологии и ГМО Института здоровья и защиты потребителей), а также Эталонной лаборатории Сообщества по обнаружению генетически модифицированных пищевых продуктов и кормов (CRL-GMFF). Центром JRC было организовано международное совместное исследование с участием 12 лабораторий. Каждая лаборатория провела испытание пяти концентраций ДНК Bt11, включая концентрации 0,09, 0,40, 0,90, 5,00 и 8,00%. Результаты мультилабораторного валидационного анализа были оглашены в публикации CRL CRLVL10/07VR (2008), которая доступна на веб-сайте gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/. Средний коэффициент линейности метода (R2) составляет 0,99, значение RSDr -17% при концентрации Bt11 0,09%, значение RSDR - 24% при концентрации Bt11 0,09%, а максимальное значение отклонения (точность) равняется -5% при концентрации Bt11 5%. Пример 3. Оценка предыдущего метода. Существуют опубликованные описания других методик количественного определения объекта Bt11(Ronning et al. 2003. Eur. Food Res. Technol. 216:347-354, a также публикация Эталонной лаборатории Сообщества (CRL) JRC Европейской комиссии 2004 г., размещенная на веб-сайте:gmo-crl.jrc.it/summaries/Bt11-protocol.pdf, основанная на использовании метода, описанного у Ronning etal.). Для оценки данного метода количественного определения независимая лаборатория провела анализы ПЦР на смесях ДНК Bt11 и нетрансгенной ДНК согласно описанию в вышеупомянутой публикацииCRL. В этом анализе были использованы праймеры и зонды, предназначенные для связывания участка 3' генома-вставки. Результаты множественных экспериментов позволяют предположить, что эффективность ПЦР-реакций Bt11 с использованием этого метода не является адекватной. Наклоны линий регрессии стандарта Bt11 дают основание предположить отсутствие эффективности ПЦР по сравнению с линиями регрессии стандарта adhl. В 5 из 6 экспериментов соответствие реакций стандарта Bt11 было хуже, чем для реакций стандарта adhl, при идентичных растворах ДНК, используемых для серий стандартаBt11 и adhl. Кроме того, результаты дают основание предположить, что предыдущий метод также имеет недостатки в плане точности, повторяемости и устойчивости. Все публикации и опубликованные патентные документы, упомянутые в настоящем описании изобретения, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентный документ был конкретно и отдельно указаны как подлежащие включению в настоящий документ посредством ссылки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ определения количества ДНК Bt11 в биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы, включающий:(a) приведение биологического образца в контакт с первой парой праймеров, содержащей первый праймер, состоящий из SEQ ID NO: 1, и второй праймер, состоящий из SEQ ID NO: 2, и зондом, маркированным флуоресцентной меткой, содержащим SEQ ID NO: 3, причем указанная первая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы линии Bt11 образует первый ампликон, содержащий SEQ ID NO: 4, являющийся отличительным для Bt11;(b) приведение биологического образца в контакт со второй парой праймеров, содержащей первый праймер, состоящий из SEQ ID NO: 5, и второй праймер, состоящий из SEQ ID NO: 6, и со вторым зондом, маркированным флуоресцентной меткой, содержащим SEQ ID NO: 7, причем вторая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы образует второй ампликон, содержащий SEQ ID NO: 8, который указывает на наличие гена кукурузы adhl;(c) обеспечение условий для реакции амплификации нуклеиновых кислот;(d) проведение количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зондов (а) и (b), получая при этом указанные первый и второй ампликоны;(e) одновременное обнаружение первого и второго ампликонов;(f) подсчет относительного количества первого ампликона по сравнению со вторым ампликоном,при котором количество указанного первого ампликона указывает на количество ДНК Bt11 в биологическом образце. 2. Способ по п.1, в котором предел количественного определения (LOQ) способа составляет не более 0,08% концентрации ДНК Bt11. 3. Способ по п.1, в котором предел количественного определения (LOQ) способа составляет не более 0,04% концентрации ДНК Bt11. 4. Способ по п.1, в котором средний коэффициент линейности (R2) способа составляет не менее 0,99. 5. Способ по п.1, в котором относительное стандартное отклонение воспроизводимости (RSDR) способа составляет не более 24% при концентрации ДНК Bt11 0,090%. 6. Способ по п.1, в котором относительное стандартное отклонение повторяемости (RSDr) способа составляет не более 17% при концентрации ДНК Bt11 0,090%. 7. Способ по п.1, в котором достоверность способа составляет во всем динамическом диапазоне не более 5%. 8. Пара праймеров, содержащих первый праймер, который состоит из SEQ ID NO: 1, и второй праймер, который состоит из SEQ ID NO: 2, действующие совместно в присутствии матрицы ДНК кукурузы линии Bt11 в биологическом образце для получения ампликона, указывающего на наличие кукурузы линии Bt11.