Лиофилизированные препараты fgf-18

Изобретение относится к стабильному лиофилизированному препарату, содержащему FGF-18,фосфатный буфер, поддерживающий pH на уровне от 7,0 до 7,5, полоксамер 188 и сахарозу,и к способу получения данного стабильного лиофилизированного препарата, включающему этапы: а) получения смеси FGF-18 с фосфатным буфером, поддерживающим pH на уровне от 7,0 до 7,5, полоксамером 188 и сахарозой, и b) лиофилизации смеси. Изобретение также относится к изделию, включающему первый контейнер, содержащий указанный стабильный лиофилизированный препарат, и второй контейнер, содержащий растворитель для восстановления. Лиофилизированные препараты по изобретению стабильны при хранении в течение надлежащего периода времени. Черрети Алессандра, Дель Рио Алессандра (IT) Медведев В.Н. (RU) Область техники изобретения Изобретение относится к области фармацевтических препаратов. Более конкретно оно относится к лиофилизированным препаратам белка фактора роста фибробластов 18 (FGF-18) и к способам получения таких препаратов. Лиофилизированные препараты по изобретению стабильны при хранении при комнатной температуре в течение надлежащего периода времени. Уровень техники изобретения Фактор роста фибробластов 18 (FGF-18) является членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF), близкородственным для FGF-8 и FGF-17. Члены семейства FGF характеризуются наличием гепаринсвязывающих доменов. Такой предполагаемый гепаринсвязывающий домен был определен дляFGF-18. Постулировано, что опосредованная рецептором передача сигнала инициируется при связывании FGF-лиганда в комплексе с гепаринсульфатом протеогликанов клеточной поверхности. Показано, что FGF-18 является пролиферативным фактором для хондроцитов и остеобластов (Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320; Shimoaka et al., 2002, J. Bio. Chem. 277(9): 74937500). FGF-18 был предложен для лечения патологий хряща, таких как остеоартрит и травмы хряща, либо самостоятельно (WO 2008/023063), либо в сочетании с гиалуроновой кислотой (WO 2004/032849). Фармацевтические композиции, содержащие полипептид FGF, известны в данной области. В WO 00/21548 описаны фармацевтические композиции, содержащие рекомбинантный FGF в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Примеры подходящих носителей или разбавителей для инъекционных растворов включают воду или изотонические солевые растворы. В WO 2008/121563 описаны фармацевтические препараты, содержащие соединение FGF-21, изготовленные в виде инъекционной стандартной лекарственной формы вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящим носителем может быть, в частности, сахар, буфер и/или сурфактант. В WO 92/01442 раскрыта лиофилизированная композиция, содержащая FGF, фармацевтически приемлемый наполнитель и либо i) соль щелочного металла целлюлозы, либо ii) сочетание сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты с цистеином. Компоненты i) и ii) позволяют стабилизировать композицию FGF. В WO 01/39788 описаны фармацевтические композиции, содержащие соединение FGF-18 вместе с цитотоксином в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, например фосфатно-солевым буферным раствором. В WO 2008/023063 раскрыты препараты, содержащие соединение FGF-18 вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентами или тому подобным. В качестве примера, в нем описан препарат для инъекций, содержащий FGF-18 в таких носителях, как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера. При получении фармацевтической композиции, содержащей биологически активный белок, указанная композиция должна быть сформулирована таким образом, чтобы активность белка сохранялась в течение надлежащего периода времени. Потеря активности/стабильности белка может быть результатом химической или физической неустойчивости белка, в частности, вследствие денатурации, агрегации или окисления. Образующиеся в результате продукты, таким образом, могут быть фармацевтически неприемлемыми. Хотя использование эксципиента(ов), как известно, повышает стабильность конкретного белка, стабилизирующие эффекты этих эксципиентов в значительной степени зависят от природы эксципиентов и от самого биологически активного белка. Все еще существует потребность в новых препаратах, содержащих FGF-18 в качестве активного ингредиента, которые будут стабильны в течение надлежащего периода времени и пригодны для использования в инъекции, предпочтительно внутрисуставной инъекции. Указанные препараты могут быть полезны для введения при лечении патологии хряща у пациента, такой как остеоартрит или травма хряща. Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является создание нового препарата, содержащего белок FGF-18. Более конкретно указанный препарат представляет собой стабильный сублимированный (или лиофилизированный) препарат, содержащий FGF-18. Изобретение также относится к способам получения лиофилизированного препарата по настоящему изобретению. Описанный в данном документе лиофилизированный препарат можно использовать после восстановления для введения при лечении патологий хряща. В первом аспекте изобретение относится к стабильному лиофилизированному препарату, содержащему или состоящему из FGF-18, буфера, полоксамерного сурфактанта и сахара в качестве стабилизирующего вещества. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой фосфатный буфер, полоксамерный сурфактант представляет собой полоксамер 188 и стабилизирующее вещество представляет собой сахарозу. В другом предпочтительном варианте осуществления буфер поддерживает рН на уровне или примерно 6-8 и более конкретно на уровне или примерно 7,2. В еще одном предпочтительном варианте осуществления концентрация полоксамерного сурфактанта составляет ровно или примерно 0,1-0,4 мг/емкость. Предпочтительно FGF-18 выбран из группы, состоящей из 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, соответствующей последовательности, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 207(Ala) в SEQ ID NO: 1,2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы человеческого FGF-18, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) в SEQ ID NO: 1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно FGF-18 представляет собой trFGF-18, описанный далее в данном документе. Во втором аспекте изобретение относится к способу получения стабильного лиофилизированного препарата FGF-18, включающему этапы: 1) получение смеси FGF-18 с буфером, сурфактантом и стабилизирующим веществом и 2) лиофилизация (сублимация) смеси,при этом буфер представляет собой фосфатный буфер, стабилизирующее вещество представляет собой сахар, такой как сахароза, и сурфактант представляет собой полоксамерный сурфактант, такой как полоксамер 188. В предпочтительном варианте осуществления буфер поддерживает pH на уровне или примерно 6-8,и более конкретно на уровне или примерно 7,2. Предпочтительно FGF-18 выбран из группы, состоящей из 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, соответствующей последовательности, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 207(Ala) в SEQ ID NO: 1,2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы человеческого FGF-18, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) в SEQ ID NO: 1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно FGF-18 представляет собой trFGF-18, описанный далее в данном документе. В третьем аспекте изобретение относится к изделию для фармацевтического или ветеринарного применения, включающему: 1) первый контейнер, содержащий стабильный лиофилизированный препарат, содержащий FGF-18,буфер, сурфактант и стабилизирующее вещество, и 2) второй контейнер, содержащий растворитель для восстановления,при этом буфер представляет собой фосфатный буфер, стабилизирующее вещество представляет собой сахар, такой как сахароза, и сурфактант представляет собой полоксамерный сурфактант, такой как полоксамер 188, а растворитель для восстановления представляет собой воду или физиологический раствор (например, 0,9% вес./об. раствор хлорида натрия для инъекций). Предпочтительно FGF-18 выбран из группы, состоящей из 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, соответствующей последовательности, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 207(Ala) в SEQ ID NO: 1,2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы человеческого FGF-18, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) в SEQ ID NO: 1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно FGF-18 представляет собой trFGF-18, описанный далее в данном документе. Определения. Используемый в данном документе термин "белок FGF-18" или "FGF-18" должен означать белок,сохраняющий по меньшей мере одну биологическую активность человеческого белка FGF-18. FGF-18 может быть природным, в его зрелой форме, или его укороченной формой. Биологическая активность человеческого белка FGF-18 включает, в частности, повышение активности остеобластов (см. WO 98/16644) или ускорение формирования хряща (см. WO 2008/023063). Природный, или дикого типа, человеческий FGF-18 представляет собой белок, экспрессируемый хондроцитами суставного хряща. Человеческий FGF-18 сначала был обозначен zFGF-5 и полностью описан в WO 98/16644. SEQ ID NO: 1 соответствует аминокислотной последовательности природного человеческого FGF-18 с сигнальным пептидом, состоящим из аминокислотных остатков от 1 (Met) до 27(Ala). Зрелая форма человеческого FGF-18 соответствует аминокислотной последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 207 (Ala) в SEQ ID NO: 1 (180 аминокислот). FGF-18 обладает специфичностью в отношении FGFR4 и "IIIc" сплайсированных вариантов FGFR3 и FGFR2 (Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritisand Cartilage, 10: 308-320). Зрелая форма FGF-18 имеет среднюю массу 21,04 кДа.FGF-18 по настоящему изобретению можно получать рекомбинантным методом, таким как метод,описанный в заявке WO 2006/063362. В зависимости от систем и условий экспрессии FGF-18 по настоящему изобретению экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине со стартовым метионином (остатком Met) или с сигнальной последовательностью для секреции. При экспрессии в прокариотическом хозяине, таком как E. coli, FGF-18 содержит дополнительный остаток Met на N-конце своей последовательности. Например, аминокислотная последовательность человеческого FGF-18 при экспрессии в Е. coli начинается с остатка Met на N-конце (положение 1) с продолжением от остатка 28 (Glu) до остатка 207(Ala) в SEQ ID NO: 1. Используемый в данном документе термин "укороченная форма" FGF-18 означает белок, который содержит или состоит из остатков от 28 (Glu) до 196 (Lys) в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно укороченная форма белка FGF-18 представляет собой полипептид, обозначенный "trFGF-18" (170 аминокислот),который начинается с остатка Met (на N-конце) с продолжением от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) человеческого FGF-18 дикого типа. Аминокислотная последовательность trFGF-18 приведена в SEQ IDNO: 2 (аминокислотные остатки 2-170 в SEQ ID NO: 2 соответствуют аминокислотным остаткам 28-196 вSEQ ID NO: 1). trFGF-18 представляет собой рекомбинантную укороченную форму человеческого FGF18, продуцируемую в E. coli (см. WO 2006/063362). Показано, что trFGF-18 проявляет сходные активности со зрелым человеческим FGF-18, например повышает пролиферацию хондроцитов и отложение хряща, что приводит к заживлению и восстановлению различных хрящевых тканей (см. WO 2008/023063).trFGF-18 имеет среднюю массу 19,83 кДа. Используемый в данном документе термин "стабильность" означает физическую, химическую и конформационную стабильность FGF-18 в препаратах по настоящему изобретению (и в том числе сохранение биологической активности). Нестабильность белкового препарата может быть вызвана химической деградацией или агрегацией белковых молекул с образованием полимеров более высокого порядка, дегликозилированием, изменением гликозилирования, окислением или любой другой структурной модификацией, которая снижает по меньшей мере одну биологическую активность белка FGF-18 по настоящему изобретению. Используемый в данном документе термин "стабильный" раствор или препарат означает раствор или препарат, в котором степень деградации, модификации, агрегации, потери биологической активности и тому подобного, находящихся в нем белков соответствующим образом контролируется и не увеличивается недопустимо с течением времени. Предпочтительно препарат сохраняет по меньшей мере более чем 80% активности FGF-18 за период времени по меньшей мере 12 месяцев при комнатной температуре. Стабилизированный препарат по настоящему изобретению, содержащий FGF-18, предпочтительно имеет срок годности по меньшей мере примерно 12 месяцев, 18 месяцев, более предпочтительно по меньшей мере 20 месяцев, еще более предпочтительно примерно 24 месяцев при хранении при комнатной температуре. Методы мониторинга стабильности препарата FGF-18 по настоящему изобретению известны в данной области и включают методы, описанные в примерах, приведенных в данном документе. Используемый в данном документе термин "буфер" означает растворы соединений, которые, как известно, являются безопасными в препаратах для фармацевтического или ветеринарного применения и которые имеют эффект поддержания или регулирования pH препарата в диапазоне pH, необходимом для препарата. Приемлемые буферы для регулирования pH в диапазоне от умеренно кислого pH до умеренно основного pH включают, но не ограничиваются ими, фосфатные, ацетатные, цитратные, аргининовые,трис и гистидиновые буферы. "Трис" означает 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол, а также любые его фармакологически приемлемые соли. Предпочтительными буферами по настоящему изобретению являются фосфатные буферы. Используемый в данном документе термин "сурфактант" означает растворимое соединение, которое можно использовать, в частности, чтобы повысить растворимость в воде гидрофобных, маслянистых веществ или иным образом увеличить способность к смешиванию двух веществ с различной степенью гидрофобности. По этой причине данные полимеры широко используются в промышленности, косметике и фармацевтических препаратах. Их также используют в качестве модельных систем для доставки лекарственных средств, в частности, с целью изменения поглощения лекарственного средства или его доставки в целевые ткани. Хорошо известные сурфактанты включают полисорбаты (производные полиоксиэтилена; твин), а также полоксамеры (т.е. сополимеры на основе оксида этилена и оксида пропилена,также известные как плюроники). Предпочтительным сурфактантом по настоящему изобретению является полоксамерный сурфактант и даже более предпочтительно полоксамер 188 (плюроник F68). Используемый в данном документе термин "стабилизирующее вещество", "стабилизатор" или "изотоническое вещество" представляет собой соединение, которое физиологически приемлемо и придает соответствующую стабильность/тоничность препарату. Оно, в частности, предотвращает поток чистой воды через клеточные мембраны, которые находятся в контакте с препаратом. В процессе сублимации(лиофилизации) стабилизатор также эффективен в качестве криопротектора. Для этих целей, как правило, используют такие соединения, как глицерин. Другие подходящие стабилизирующие вещества включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты или белки (например, глицин или альбумин), соли (например, хлорид натрия) и сахара (например, декстрозу, маннит, сахарозу и лактозу). Предпочтительным стабилизирующим веществом по настоящему изобретению является сахар, даже более предпочтительно сахароза. Используемый в данном документе термин "емкость" или "контейнер" означает в широком смысле резервуар, подходящий для хранения препарата FGF-18 в лиофилизированной форме. Аналогичным образом, в нем будет храниться растворитель для восстановления. Примеры емкости, которую можно использовать по настоящему изобретению, включают шприцы, ампулы, картриджи или другой такой резервуар, подходящий для доставки препарата FGF-18 пациенту с помощью инъекции предпочтительно с помощью внутрисуставной инъекции. Альтернативно, емкость, содержащую препарат FGF-18, и ем-3 024937 кость, содержащую растворитель для восстановления, можно предоставлять в виде 2 отделений двухкамерной системы (шприца или картриджа, например). Емкости, подходящие для упаковки препаратов для внутрисуставного введения, хорошо известны и признаны в данной области. Используемый в данном документе термин "растворитель" означает жидкий растворитель, либо водный, либо неводный. Выбор растворителя зависит, прежде всего, от растворимости лекарственного соединения в указанном растворителе и от способа введения. Водный растворитель может состоять только из воды или может состоять из воды плюс один или более смешивающихся растворителей и может содержать растворенные вещества, такие как сахара, буферы, соли или другие эксципиенты. Наиболее часто используемыми неводными растворителями являются органические спирты с короткой цепью,такие как метанол, этанол, пропанол, кетоны с короткой цепью, такие как ацетон, и полиспирты, такие как глицерин. Предпочтительным растворителем по настоящему изобретению является водный растворитель, такой как водный или солевой растворитель. Используемый в данном документе термин "патология хряща" охватывает заболевания, возникающие в результате повреждений вследствие травмы или хондропатии. Примеры патологий хряща, которые можно лечить введением препарата FGF-18, описанного в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, артрит, такой как остеоартрит или ревматоидный артрит, и травму хряща. Термин "остеоартрит" используют для обозначения наиболее распространенной формы артрита. Он может быть вызван разрушением хряща. Кусочки хряща могут отламываться и вызывать боль и отек в суставе между костями. Со временем хрящ может стираться полностью, и кости будут тереться друг о друга. Остеоартрит может поражать любой сустав, но, как правило, бывают поражены руки и несущие весовую нагрузку суставы, такие как бедра, колени, ноги и позвоночник. В предпочтительном примере остеоартрит может быть остеоартритом колена или остеоартритом бедра. Специалисты в полной мере знакомы с классификациями остеоартрита, используемыми в данной области, в частности с системой оценки OARSI (см., например, Custers et al., 2007). Остеоартрит является одной из патологий хряща, которые можно лечить введением препаратов FGF-18 по настоящему изобретению. Используемый в данном документе термин "травма хряща" представляет собой патологию хряща или повреждение хряща, причиной которых является травма. Травмы хряща могут возникать в результате травматического механического разрушения, в частности, как последствие аварии или хирургического вмешательства. Это определение также охватывает травму в результате занятий спортом или износ тканей сустава в результате занятий спортом. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится, главным образом, к стабильному лиофилизированному препарату, содержащему или состоящему из белка FGF-18, буфера, полоксамерного сурфактанта и сахара в качестве стабилизирующего вещества. В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой фосфатный буфер, полоксамерный сурфактант представляет собой полоксамер 188, а стабилизирующее вещество представляет собой сахарозу. Предпочтительно белок FGF-18 выбран из группы, состоящей из 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы человеческого FGF-18, соответствующей последовательности, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 207(Ala) в SEQ ID NO: 1,2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы человеческого FGF-18, содержащей или состоящей из участка от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) в SEQ ID NO: 1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно FGF-18 представляет собой trFGF-18. Концентрация FGF-18 по настоящему изобретению предпочтительно составляет ровно или примерно 20-300 мкг/емкость, предпочтительно составляет ровно или примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,150, 200, 250 или 300 мкг/емкость, даже более предпочтительно составляет ровно или примерно 20, 30,60, 100, 200 или 300 мкг/емкость. FGF-18 можно добавлять с 5% избытком для предотвращения потери белка, которая может возникнуть во время формулирования препарата. Например, в случае концентрации FGF-18 30 мкг/емкость соединение можно добавлять в количестве 31,5 мкг/емкость. Предпочтительно препараты по изобретению сохраняют по меньшей мере 80% от биологической активности FGF-18 в момент лиофилизации и/или упаковки на протяжении периода времени по меньшей мере 12 месяцев (до первого использования). Активность FGF-18 можно измерять, как описано в следующем далее разделе "Примеры". Предпочтительными буферами по настоящему изобретению являются фосфатные буферы, и они поддерживают pH в диапазоне от 6 до 8, предпочтительно в диапазоне от 7 до 7,5 и даже более предпочтительно равным или около 7,2. Концентрация буфера в общем растворе предпочтительно составляет ровно или примерно 5-500 мМ. В предпочтительном варианте осуществления концентрация буфера составляет ровно или примерно 10-100 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет ровно или примерно 10 мМ. Стабилизирующее вещество по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой са-4 024937 хар. Предпочтительным сахаром является сахароза. Предпочтительно концентрация стабилизирующего вещества составляет ровно или примерно 0,5-250 мг/емкость, более предпочтительно ровно или примерно 1-100 мг/емкость, в частности ровно или примерно 15-60 мг/емкость, даже более предпочтительно ровно или примерно 30 мг/емкость. Сурфактант по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой полоксамерный сурфактант и, в частности, полоксамер 188 (т.е. плюроник F68). Предпочтительно концентрация сурфактанта составляет ровно или примерно 0,01-10 мг/емкость, более предпочтительно ровно или примерно от 0,05 примерно до 5 мг/емкость, более предпочтительно ровно или примерно от 0,1 примерно до 1 мг/емкость, даже более предпочтительно ровно или примерно 0,1, 0,2 или 0,4 мг/емкость и в частности ровно или примерно 0,2 мг/емкость. В предпочтительном варианте осуществления стабильный лиофилизированный препарат по настоящему изобретению содержит или состоит из FGF-18 в концентрации ровно или примерно 20, 30, 60,100, 200 или 300 мкг/емкость, 10 мМ фосфатного буфера с pH 7,2, 30 мг/емкость сахарозы и 0,2 мг/емкость полоксамера 188. При включении 5% избытка лиофилизированный препарат по настоящему изобретению содержит FGF-18 в концентрации ровно или примерно 21, 31,5, 63, 105, 210 или 315 мкг/емкость. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к стабильному лиофилизированному препарату, содержащему: 1) FGF-18:сахароза в соотношении концентраций от или примерно от 1:95000 до или примерно до 1:6000, предпочтительно ровно или примерно 1:92000, 1:61000, 1:31000, 1:18450, 1:9200 или 1:6100,2) FGF-18:полоксамер 188 в соотношении концентраций от или примерно от 1:25 до или примерно до 6:10, предпочтительно ровно или примерно 1:25, 5:83, 5:42, 1:5, 2:5 или 6:10. 3) FGF-18:фосфатный буфер при pH 7,2 в молярном соотношении от или примерно от 1:10500 до или примерно до 1:700, предпочтительно ровно или примерно 1:10500, 1:7000, 1:3500, 1:2100, 1:1050 или 1:700,при этом белок FGF-18 предпочтительно выбран из группы, состоящей из 1) полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотных остатков 28 (Glu) - 207 (Ala) вSEQ ID NO: 1,2) полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотных остатков 28 (Glu) - 196 (Lys) вSEQ ID NO: 1, или 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно белок FGF18 содержит или состоит из аминокислотных остатков 28 (Glu) - 207 (Ala) в SEQ ID NO: 1. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к стабильному лиофилизированному препарату, содержащему: 1) FGF-18:сахароза в молярном соотношении от или примерно от 1:90000 до или примерно до 1:5000, предпочтительно ровно или примерно 1:87000, 1:58000, 1:29000, 1:17400, 1:8700 или 1:5800,2) FGF-18:полоксамер 188 в молярном соотношении от или примерно от 5:120 до или примерно до 5:8, предпочтительно ровно или примерно 5:118, 5:79, 10:79, 10:47, 5:12 или 5:8,3) FGF-18:фосфатный буфер при pH 7,2 в молярном соотношении от или примерно от 1:10000 до или примерно до 1:700, предпочтительно ровно или примерно 1:10000, 1:6600, 1:3300, 1:2000, 1:1000 или 1:700,при этом белок FGF-18 предпочтительно выбран из группы, состоящей из 1) полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотных остатков 28 (Glu) - 207 (Ala) вSEQ ID NO: 1,2) полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотных остатков 28 (Glu) - 196 (Lys) вSEQ ID NO: 1, или 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно белок FGF18 содержит или состоит из аминокислотных остатков 28 (Glu) - 196 (Lys) в SEQ ID NO: 1. Даже более конкретно белок FGF-18 содержит или состоит из SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте осуществления белок FGF-18 представляет собой trFGF-18. Кроме того, изобретение относится к способу получения любого из описанных выше стабильных лиофилизированных препаратов FGF-18, включающему этапы: 1) получения смеси FGF-18 с буфером, полоксамерным сурфактантом и сахаром в качестве стабилизирующего вещества и 2) лиофилизации смеси. Этапы 1 и 2 осуществляют с использованием общепринятых методов. В качестве примера для получения подходящего стабильного препарата конкретное количество FGF-18, такого как trFGF-18, смешивают с фосфатным буфером, который поддерживает pH на уровне или примерно 7,2, полоксамером 188 и сахарозой. Каждое из этих соединений (т.е. FGF-18, буфер, сурфактант и стабилизирующее вещество) можно использовать при значениях концентраций, pH и/или соотношений, описанных выше. Полученную смесь лиофилизируют и затем распределяют по емкостям. Любой специалист в данной области признает возможность вариаций данного способа. Изобретение также относится к изделию для фармацевтического или ветеринарного применения,включающему: 1) первый контейнер, содержащий любой стабильный лиофилизированный препарат из описанных выше, содержащий или состоящий из FGF-18, буфера, полоксамерного сурфактанта, сахара в качестве стабилизирующего вещества, и 2) второй контейнер, содержащий растворитель для восстановления. В качестве примера первый контейнер содержит стабильный лиофилизированный препарат, содержащий или состоящий из конкретного количества FGF-18, такого как trFGF-18, фосфатного буфера, который поддерживает pH на уровне или примерно 7,2, полоксамера 188 и сахарозы, а второй контейнер содержит физиологический раствор (0,9% вес./об. раствор хлорида натрия для инъекций). Каждое из этих соединений (т.е. FGF-18, буфер, сурфактант и стабилизирующее вещество) можно использовать при значениях концентраций, pH и/или соотношений, описанных выше. Предпочтительно контейнер, содержащий препарат FGF-18, и контейнер, содержащий растворитель для восстановления, представляют собой два отделения двухкамерной системы (шприца или картриджа, например). Также описан упаковочный материал, содержащий инструкции по восстановлению лиофилизированного препарата FGF-18 (первый контейнер) в растворителе (второй контейнер). Лиофилизированные препараты по изобретению можно хранить в течение, по меньшей мере, срока от примерно 12 месяцев до примерно 24 месяцев. В предпочтительных условиях хранения до первого использования препараты хранят вдали от яркого света (предпочтительно в темноте) при комнатной температуре (ровно или примерно 25C). Стабильный лиофилизированный препарат по изобретению должен быть восстановлен, предпочтительно в стерильных условиях, с помощью растворителя, такого как вода или физиологический раствор(например, 0,9% вес/объем раствор хлорида натрия для инъекций), перед использованием, то есть, перед инъекцией. После восстановления объем, который будет введен, предпочтительно составляет от 0,5 мл до 5 мл, более предпочтительно 0,5, 1 или 2 мл. Препарат FGF-18 следует вводить предпочтительно в течение 1 ч после восстановления. Настоящее изобретение относится к стабильным лиофилизированным препаратам FGF-18, в частности, для однократного использования, подходящим для фармацевтического или ветеринарного применения. Стабильный лиофилизированный препарат, содержащий FGF-18, по настоящему изобретению можно использовать после восстановления для введения с целью восстановления хряща или с целью лечения патологий хряща, таких как остеоартрит или травмы хряща. Эти стабильные лиофилизированные препараты после восстановления подходят для использования в инъекциях и альтернативных системах доставки. В особенно предпочтительном варианте осуществления препараты по настоящему изобретению предназначены для внутрисуставной инъекции. Их можно вводить после восстановления прямой инъекцией в синовиальную жидкость сустава или непосредственно в пораженную область. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения внутрисуставное введение осуществляют в сустав, выбранный из тазобедренного сустава, сустава колена,локтя, запястья, лодыжки, позвоночника, ноги, пальца руки, пальца ноги, руки, плеча, ребра, лопатки,бедра, голени, пятки и костных точек вдоль позвоночника. В еще одном предпочтительном варианте осуществления внутрисуставное введение осуществляют в сустав бедра или колена. Препараты FGF-18 по настоящему изобретению обладают повышенной стабильностью и могут легко храниться при комнатной температуре (ровно или примерно 25C) или при 2-8C (см. следующие примеры), предпочтительно при комнатной температуре. Действительно, авторы изобретения обнаружили, что лиофилизированные препараты, содержащие FGF-18 (например, trFGF-18), 10 мМ фосфатный буфер при pH 7,2, 30 мг/емкость сахарозы и 0,2 мг/емкость полоксамера 188, стабильны с течением времени, особенно при хранении при комнатной температуре. Указанные препараты сводят к минимуму потерю активного вещества, т.е. FGF-18. Кроме того, было обнаружено, что указанные препараты более устойчивы к окислению и образованию белковых агрегатов. Следующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации получения препаратов и композиций по изобретению. Объем изобретения не следует рассматривать только как состоящий из следующих примеров. Чертеж демонстрирует эффект сурфактанта (полоксамера 188) на выход FGF-18 до процесса лиофилизации. Использовали предварительные препараты, содержащие 10 мг/мл (+5% избыток) FGF-18 в фосфатном буфере с pH 7,2 при различных концентрациях сурфактанта (от 0 до 0,2%). Содержание белка оценивали для каждого из предварительных препаратов до фильтрации (ДФ) и после фильтрации (T=0). Описание последовательностейSEQ ID NO: 1: аминокислотная последовательность природного человеческого FGF-18.SEQ ID NO: 2: аминокислотная последовательность рекомбинантного укороченного FGF-18 (trFGF18). Примеры Материалы. Рекомбинантный укороченный FGF-18 (trFGF-18) в настоящих примерах получали путем экспрессии в E. coli методом, описанным в заявке WO 2006/063362. В следующих примерах trFGF-18 и FGF-18 использованы взаимозаменяемо. Другие вещества, используемые в примерах, являются следующими: сахароза (1,07653, Merck; молекулярная масса: 342,30 г/моль),мононатрийфосфат, моногидрат (1,06345, Merck),динатрия гидрофосфат, дигидрат (1,06586, Merck),полоксамер 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf; молекулярная масса: 8400 г/моль),вода для инъекций,физиологический раствор (0,9% вес./об. раствор хлорида натрия для инъекций),моноклональное антитело против FGF-18 клонF5A2, для определения содержания белка (предоставлено RBM),клетки BAF3-FGFR3c (Вашингтонский университет),селективная среда на основе Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Invitrogen),система 1 этапного люминесцентного анализа ATPlite (Perkin Elmer),гепарин Н 3149 (Sigma). ОборудованиеAMICON ULTRA-4 10000 порог отсечения (UFC 8012024, Amicon),Biacore 2000 (Biacore),CO2-инкубатор (Heraeus),колонка TSK2000SW1, 7,8300 мм, 5 мк (TosoHaas, код 08540),предколонка TSKG2000 (Hichrom, код 8543),система ВЭЖХ (Waters),люминометр (Perkin Elmer),мембранные фильтры 0,22-мкм (Durapore тип GWVP, Millipore),программа Stabileo (вер. 1.1; пакет Microsoft Excel Visual Basic),программа GraphPad (Prism),держатели из нержавеющей стали емкостью 22 мл и 220 мл (Sartorius),колонка Zorbax 300SB-C18 (1504,6 см),стеклянные емкости DIN2R (3 мл) (Nuova OMPI),покрытые резиновые пробки (S2F452, D777-1, В 2-40, West Pharmaceutical),резиновые пробки (код 179, W1816 grey, Pharma-Gummi). Методы Различные анализы препаратов. Стандартные методы были использованы для эксклюзионной ВЭЖХ,ОФ-ВЭЖХ,остаточной влаги,pH,осмоляльности (только момент времени 0),SDS-ПААГ/окрашивания серебром и пептидного картирования/СВЭЖХ (окисленные формы). Содержание белка. Количественное определение белка, т.е. trFGF-18, в различных препаратах выполняли при помощиBiacore. Образцы (25 мкл), содержащие trFGF-18, тестировали (надлежащим образом разведенные в присутствии 10 мг/мл БСА) при протекании со скоростью 5 мкл/мин при 25C над поверхностью сенсора,предварительно покрытого моноклональным антителом против FGF-18 клона F5A2, а затем 5 мкл 10 мМ глицина pH 2,0 в качестве буфера регенерации. Эталонный стандарт (IRS FGF-18 No. 051230) в диапазоне от 125 до 2000 нг/мл использовали в каждой аналитической сессии. Результаты получали в виде резонансных единиц (РЕ) (RU), и уровень FGF-18 в каждом образце экстраполировали из стандартной кривой, построенной с помощью квадратичного алгоритма с логарифмически преобразованными данными. Биоанализ. Биологическую активность FGF-18 измеряли как пролиферативную активность методом биоанализа in vitro с использованием клеточной линии BaF3, стабильно трансфицированной рецептором FGF 3 с(FGFR3c). Клетки BaF3, экспрессирующие FGFR3c, пролиферируют при стимуляции FGF-18. Клетки BaF3/FGFR3c культивировали в селективной среде на основе RPMI 1640 в присутствииr-hIL-3 в качестве фактора роста. Для того чтобы проверить специфический пролиферативный эффектFGF-18, клетки должны быть лишены IL-3. Вследствие этого клетки культивировали при 37C, 5% CO2 в отсутствие r-hIL-3 в течение 26 ч до анализа. Стандарт и образцы 5-кратно серийно разводили в среде для анализа в диапазоне концентраций от 0,002 Ед/мл до 177,5 Ед/мл. Лишенные IL-3 клетки BAF3/FGFR3c (20000 клеток/лунку) инкубировали при 37C, 5% CO2 с FGF-18 в присутствии 1 мкг/мл гепарина и 10% сыворотки новорожденных телят, а затем пролиферацию клеток оценивали через 48 ч с помощью "ATPlite 1 этапного" люминисцентного анализа, системы мониторинга АТФ на основе люциферазы светляков. Активность образца измеряли с применением расширенной модели кривой доза-ответ. С помощью данной модели все кривые доза-ответ стандарта и образцов строили как сигмоидные кривые доза-ответ с алгоритмом переменного наклона (4PL), отражающие зависимость значений cps (т.е. импульсов в секунду) от логарифма концентраций FGF-18. Для каждой кривой с помощью программы GraphPad было автоматически вычислено значение EC50. Активность образца рассчитывали на основе отношения междуEC50 эталонного препарата и EC50 неизвестного образца (коэффициент активности). Активность FGF-18 выражали в Ед/мл. Пример 1. Лиофилизированные препараты trFGF-18. Состав лиофилизированных препаратов FGF-18 приведен в табл. 1 ниже. Таблица 1 Состав лиофилизированных препаратов FGF-18 после восстановления в 1 мл ВДИ (WFI) (вода для инъекций) Лиофилизированные препараты получали следующим образом: сахарозу и полоксамер 188 растворяли в фосфатном буфере. Затем добавляли необходимое количество лекарственного вещества (trFGF18), проверяли pH и раствор доводили до конечного объема. Затем раствор фильтровали через 0,22-мкм мембрану (Durapore) под давлением азота, поддерживая скорость фильтрования примерно 20 см 3/см 2 или примерно 50 см 3/см 2. Конечный раствор затем в стерильных условиях вручную разливали в стеклянные емкости (0,5 мл/емкость) и лиофилизировали в соответствии со следующим циклом: Лиофилизированные препараты готовы для восстановления в любое время при помощи растворителя, такого как вода для инъекций или физиологический раствор. Пример 2. Предварительные исследования стабильности препаратов FGF-18. Пример 2.1. Условия для ускоренного изучения стабильности (при 2-8C, 25C и 40C) использовали для того, чтобы определить предварительные лиофилизированные препараты для дальнейшего изучения (данные не представлены). Готовили различные предварительные лиофилизированные препараты для определения лучших препаратов-кандидатов. В рамках этого предварительного исследования оценивали различные буферы,включая фосфатный и гистидиновый буферы. Также проверяли различные концентрации сахарозы и полоксамера 188. Предварительные препараты-кандидаты тестировали на чистоту (методами эксклюзионной ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ), содержание белка (с помощью Biacore), биологическую активность (in vitro биоанализ), остаточную влагу, pH и осмоляльность. Дополнительные данные о стабильности также получали с помощью SDS-ПААГ/окрашивания се-8 024937 ребром (чистота) и пептидного картирования/ СВЭЖХ (окисленные формы). Пример 2.2 (данные по стабильности для предварительных препаратов; данные не представлены). Данные по стабильности, полученные для предварительных лиофилизированных препаратов методом эксклюзионной ВЭЖХ в течение 3-4 недель хранения, свидетельствовали о том, что фосфатный буфер при pH 7,2 является предпочтительным, поскольку наблюдали намного более высокий уровень чистоты(т.е. более высокий % мономера) по сравнению с тем, когда использовали гистидиновый буфер при pH 6(см. табл. 2). Количество сахарозы (15 мкг/емкость против 30 мкг/емкость) также играет роль в предохранении FGF-18 от агрегации, при этом, в целом, более высокий уровень выхода мономера наблюдали в случае 30 мкг/емкость сахарозы (хранение при 25 и 5C). Кроме того, более высокий уровень выхода белка наблюдали после этапа фильтрования (до процесса лиофилизации) при увеличении содержания сурфактанта (т.е. полоксамера 188), с наилучшими результатами при 0,2 мг/емкость (фиг. 1). Исходя из результатов данной фазы изучения предварительных препаратов, шесть лиофилизированных препаратов были подготовлены для дальнейших исследований (препараты 1-6 в табл. 1; также называемые препаратами-кандидатами). Пример 3. Изучение стабильности лиофилизированных препаратов FGF-18. Для лиофилизированных препаратов-кандидатов из табл. 1 собирали данные по стабильности в срок от двух недель до 24 месяцев. Пример 3.1 (чистота, определяемая методом эксклюзионной ВЭЖХ). Результаты статистической оценки, выполненной с помощью программы Stabileo, данных по стабильности, полученных методом эксклюзионной ВЭЖХ, приведены в табл. 3: существенной потери чистоты (содержание мономера) не было обнаружено ни в одном лиофилизированном препарате-кандидате при хранении при различных температурах (до 6 месяцев при 40C и до 24 месяцев при 25C). Пример 3.2 (чистота, определяемая методом SDS-ПААГ/окрашивания серебром): результаты, полученные методом SDS-ПААГ, подтверждали уровень чистоты, в целом, выше чем 99% для любых лиофилизированных препаратов при хранении при всех протестированных температурах (по меньшей мере 6 месяцев при 40C и до 18 месяцев при 25C). Результаты приведены в табл. 4. Пример 3.3 (чистота, определяемая методом ОФ-ВЭЖХ): результаты статистической оценки, выполненной с помощью программы Stabileo, данных по стабильности, полученных методом ОФ-ВЭЖХ,приведены в табл. 5: существенной потери чистоты (% основного пика) не было обнаружено ни в одном лиофилизированном препарате-кандидате при хранении при различных температурах (до 6 месяцев при 40C и до 18 месяцев при 25C). Таким образом, формулирование FGF-18 по настоящему изобретению не приводит к потере чистоты по сравнению с исходным материалом (чистым) FGF-18. Следует отметить, что поскольку исходный материал (до формулирования) не был полностью чистым (примеси не были полностью устранены ОФ-ВЭЖХ), пик до формулирования не соответствовал 100%, но соответствовал, например, 77,5% для FD-30 и 87,4% для FD-300, а пик в момент T=0 соответствовал, например,76,8% для FD-30 и 87,7% для FD-300. Пример 3.4 (анализ содержания белка): результаты по концентрации белка, полученные при помощи Bioacore, приведены в табл. 6 и 7. Не было обнаружено существенных потерь при фильтрации через 0,22-мкм мембрану, т.е. наблюдали почти полный выход белка (см. колонку "ПФ" в табл. 6). После восстановления лиофилизированного препарата в 1 мл ВДИ (см. колонку "ТО" в табл. 6), получали более низкий выход, что можно объяснить адсорбцией белка на стеклянной емкости (после восстановления белковый раствор соприкасался с большей поверхностью). С точки зрения стабильности не было обнаружено потери содержания белка методом Biacore для всех концентраций и при всех тестируемых температурах, как видно из табл. 7 (до 6 месяцев при 40C и до 24 месяцев при 25C). Пример 3.5 (биологическая активность): результаты по биологической активности (выраженной в Ед/контейнер) для всех лиофилизированных кандидатов при хранении приведены в табл. 8. Например,наблюдаемая биологическая активность в случае более высокой концентрации (300 мкг/емкость trFGF18) при хранении, как при 25C, так и при 40C, была стабильна с течением времени. Большую вариабельность наблюдали в случае более низкой концентрации FD-20. Поскольку никаких изменений в стабильности препарата не было обнаружено ни в одном из других тестов, то данное наблюдаемое снижение в случае FD-20 должно быть подтверждено через 39, 52, 78 и 104 недель хранения при 25C. Пример 3.6 (окисленные формы): уровень содержания окисленных форм, определенный для всех концентраций при хранении, приведен в табл. 9: среди остатков Met, которые могут подвергаться окислению, согласно полученным результатам, Met 1 наиболее восприимчив к окислению, для всех концентраций и при всех изученных температурах. Пример 3.7 (остаточная влага): никакого существенного увеличения содержания остаточной влаги не произошло при хранении в случае всех концентраций; в целом, значения остаточной влаги ниже или около 1% были измерены на протяжении всего исследования стабильности (см. табл. 10) (до 6 месяцев при 40C и до 24 месяцев при 25C). Пример 3.8 (изменение pH): никакого существенного изменения pH не наблюдали при хранении при всех тестируемых температурах и для всех концентраций (см. табл. 11) (до 6 месяцев при 40C и до 24 месяцев при 25C). Пример 3.9 (изменение осмоляльности): никакого существенного изменения осмоляльности не наблюдали при хранении при всех тестируемых температурах и для всех концентраций (см. табл. 12) (до 6 месяцев при 40C и до 24 месяцев при 25C). Таблица 2 Процентное (%) содержание мономеров FGF-18 в лиофилизированных предварительных препаратах (10 мкг/емкость FGF-18 и 0,2 мг/емкость F68) при хранении, по данным анализа эксклюзионной ВЭЖХ Таблица 3 Процентное (%) содержание мономеров FGF-18 в лиофилизированных препаратах-кандидатах при хранении, по данным анализа эксклюзионной ВЭЖХ Пик до формулирования составлял 87,4% Пик до формулирования составлял 77,5% Таблица 6 Выход FGF-18 после фильтрования/расфасовки, по данным анализа BiacoreT0= в емкостипосле восстановления в 1 мл ВДИ, исходная партия была в 0,5 мл% выхода; по сравнению с количеством белка FGF-18 в препаратах ДФ Таблица 7 Выход FGF-18 после хранения, по данным анализа Biacore (в лиофилизированных препаратах-кандидатах) Таблица 8 Биологическая активность trFGF-18 в лиофилизированных препаратах-кандидатах после хранения, по данным биоанализа (Ед/контейнер) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Стабильный лиофилизированный препарат, содержащий FGF-18, фосфатный буфер, поддерживающий pH на уровне от 7,0 до 7,5, полоксамер 188 и сахарозу. 2. Стабильный лиофилизированный препарат по п.1, в котором фосфатный буфер поддерживает pH на уровне или примерно 7,2. 3. Стабильный лиофилизированный препарат по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрация буфера составляет ровно или примерно 5-100 мМ. 4. Стабильный лиофилизированный препарат по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрация полоксамера 188 составляет ровно или примерно 0,1-0,4 мг/емкость. 5. Стабильный лиофилизированный препарат по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрация сахарозы составляет ровно или примерно 10-60 мг/емкость. 6. Стабильный лиофилизированный препарат по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрация FGF-18 составляет ровно или примерно 20-300 мкг/емкость. 7. Стабильный лиофилизированный препарат по любому из предшествующих пунктов, содержащий 20, 30, 60, 100, 200 или 300 мкг/емкость FGF-18, 10 мМ фосфатного буфера, который поддерживает pH на уровне или примерно 7,2, 30 мг/емкость сахарозы и 0,2 мг/емкость полоксамера 188. 8. Стабильный препарат по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащий 5% избыток FGF-18. 9. Стабильный лиофилизированный препарат по любому из предшествующих пунктов, в которомa) полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотных остатков 28-207 в SEQ ID NO: 1,b) полипептида, содержащего или состоящего из аминокислотных остатков 28-196 в SEQ ID NO: 1,иc) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO:2. 10. Способ получения стабильного лиофилизированного препарата по любому из предшествующих пунктов, включающий этапы:a) получения смеси FGF-18 с фосфатным буфером, поддерживающим pH на уровне от 7,0 до 7,5,полоксамером 188 и сахарозой, иb) лиофилизации смеси. 11. Изделие, включающее первый контейнер, содержащий стабильный лиофилизированный препарат по любому из пп.1-9, и второй контейнер, содержащий растворитель для восстановления. 12. Изделие по п.11, в котором контейнер, содержащий стабильный лиофилизированный препарат,и контейнер, содержащий растворитель для восстановления, представляют собой два отделения двухкамерной системы.