Применение инактивированной нагреванием micobacterium w для снижения индуцированной tlr активности

ПРИМЕНЕНИЕ ИНАКТИВИРОВАННОЙ НАГРЕВАНИЕМ MICOBACTERIUM W ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННОЙ TLR АКТИВНОСТИMicobacterium w или ее компоненты обладают поли-TLR-антагонистической активностью в отношении индуцированных TLR (toll-подобных рецепторов) различными лигандами TLR. Индуцированный TLR, в отношении которого наблюдают ингибиторный эффект, включает TLR 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Кроме того, они демонстрируют антагонистические активности в отношении действия лигандов TLR. Кроме того, они полезны в лечении заболеваний, при которых имеет место повышенная экспрессия TLR, подобных сепсису, множественному склерозу, ретробульбарному невриту, хронической обструктивной болезни легких, множественной миеломе и т.д. Моди Индравадан Амбалал, Хамар Бакулеш Мафатлал (IN) Липатова И.И., Новоселова С.В.,Рыбаков В.М., Дощечкина В.В.,Хмара М.В. (RU)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: КАДИЛА ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ЛИМИТЕД (IN) Область изобретения Согласно настоящему изобретению предложено средство снижения индуцированной TLRактивности путем использования Micobacterium w (микобактерии w) или ее компонентов и лечение заболеваний, ассоциированных с антагонистами TLR, путем использования микобактерии w или ее компонентов. Предшествующий изобретению уровень техники Согласно настоящему изобретению предложен антагонист поли-toll-подобного рецептора (TLR).Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой семейство белков. Врожденная иммунная система распознает патогены и инициирует эффективный и соответствующий ответ посредством TLR. TLR представляют собой часть большого IL-1R/TLR-надсемейства, которое включает IL-1R (рецепторы интерлейкина 1), IL-18R и группу орфановых рецепторов. Семейство определяют по наличию цитоплазматического домена Toll-подобного/IL-1-рецептора, ответственного за устойчивость (Toll-like-IL-1 resistance(TIR) domain), отвечающего за опосредование передачи сигнала в прямом направлении. До настоящего времени идентифицировано 13 TLR; TLR 1-9 являются общими для мыши и человека, тогда как TLR10 функционирует только у людей, a TLR 11, 12 и 13 обнаружены только у мышей. Для многих, но не для всех этих рецепторов установлена роль в начальном детектировании специфических патогенассоциированных молекул (РАМ) и ответе на эти РАМ. В макрофагах и нейтрофилах это стимулирует врожденные иммунные ответы, такие как воспаление и индукция бактерицидной активности, в то время как активация TLR, экспрессируемых на дендритных клетках, приводит к запуску адаптивного иммунитета посредством индукции IL-12 и костимуляторных молекул. Несмотря на то что TLR представляют собой часть защитной системы организма, их повышенная экспрессия ассоциируется с рядом заболеваний. Одним из таких заболеваний является сепсис. Подсчитано, что в Соединенных Штатах возникновение сепсиса в результате инфекции составляет приблизительно 750000 случаев в год при среднем коэффициенте смертности примерно 30% (Angus et al., Crit. CareMed. Vol. 29, (2001), p. 1303-1310). Эндотоксин или липополисахарид (LPS), который является основным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий, представляет собой агент, вызывающий грамотрицательный сепсис. Эндотоксин индуцирует врожденный иммунный ответ главным образом через toll-подобный рецептор 4 (TLR4) (Medzhitov et al., Nature Vol. 388(6640), (1997), p. 394-397) у инфицированных хозяев, посредством чего организм получает предупреждение о бактериальной инфекции,вызывая таким образом антимикробную атаку под действием иммунной системы хозяина. Обычно такой иммунный ответ оказывает целебное действие на инфицированных хозяев, однако чрезмерный иммунный ответ на эндотоксин может быть патологическим, что приводит к синдрому системного воспалительного ответа (SIRS), органной недостаточности, тяжелому сепсису и, возможно, септическому шоку и смерти. Симптомы этих состояний включают лихорадку, разлитое воспаление и более тяжелые состояния, такие как диссеминированное внутрисосудистое свертывание (DIC), гипотензию, острую почечную недостаточность, острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), гепатоцеллюлярное поражение и сердечную недостаточность.Toll-подобные рецепторы, экспрессируемые под действием LPS, кроме TLR4 включают другие TLR 2, 9. Поскольку сам эндотоксин представляет собой высокогетерогенную молекулу, проявление многих токсичных свойств эндотоксина объясняется наличием высококонсервативной гидрофобной части липида А. Эффективное лекарственное средство, которое действует в качестве антагониста TLR4 и которое представляет собой антагонист к этой консервативной структуре липида А, известно как Е 5564(также известно как соединение 1287, SGEA и эриторан) (Mullarkey et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 304 (3): 1093-1102, 2003). Это лекарственное средство описано в качестве соединения 1 в патенте США 5681824, в WO/2004/071465 (Methods and kits for use in the diagnosis and treatment of endotoxemia (Способы и наборы для применения в диагностике и лечении эндотоксемии, где описан способ определения того, может ли пациент получать пользу или продолжать получать пользу от лечения антагонистом tollподобного рецептора 4 (TLR4). Также известно, что ингибирование Toll-подобного рецептора 4 эритораном ослабляет ишемия-реперфузионное поражение миокарда. Circulation 114(1 Suppl., (2006), p. I270-4. Другие заболевания, которые характеризуются повышенной экспрессией одного или более TLR,включают следующие: 1) обострение скрытых или активных вирусных инфекций (например инфекции ВИЧ, цитомегаловирусом, вирусом простого герпеса и вирусом гриппа),2) врожденную или приобретенную предрасположенность к легочной бактериальной инфекции,3) застойную сердечную недостаточность с отеком легких,4) хроническую обструктивную болезнь легких,5) множественную миелому,6) SLE (системную красную волчанку),7) обыкновенную волчанку,8) язвенный колит,9) болезнь Крона,-1 023046 10) аутоиммунные заболевания,11) ревматоидные заболевания,12) хронический гепатит,13) малярию (P. falciparum),14) множественный (рассеянный) склероз,15) ретробульбарный неврит (неврит зрительного нерва),16) вирусный энцефалит (западного Нила),17) кандидоз,18) атеросклероз,но этим не ограничиваются. Некоторые из этих расстройств поддаются традиционной терапии, тогда как для большинства заболеваний окончательной терапии не существует. Выбранные антибактериальные, противовоспалительные и иммуномодулирующие адъювантные терапии исследовали на пациентах с тяжелым сепсисом и септическим шоком. Несмотря на все перечисленное заболеваемость, ассоциированная с сепсисом, не снижается. Таким образом существует необходимость в предложении для таких заболеваний более хороших терапевтических вариантов. Микобактерия w является непатогенной, культивируемой, атипичной микобактерией с биохимическими свойствами и характеристиками быстрого роста, схожими с таковыми у микобактерий группы IV по классификации Runyon (Руньон). Было обнаружено, что она имеет общие антигены с Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis. Обнаружено, что с ее помощью обеспечивается профилактика лепры у людей путем превращения индивидуумов с отрицательной реакцией на лепромин в индивидуумы с положительной реакцией на лепромин. Также обнаружено, что с ее помощью обеспечивается профилактика туберкулза у животных. Кроме того, обнаружено, что при лепре ее применение приводит к уменьшению продолжительности терапии в отношении бактериального киллинга, клиренса, а также к уменьшению продолжительности курса лечения в клинике при совместном использовании с множественной лекарственной терапией. Фармацевтическая композиция, содержащая микобактерию w, разрешена для применения на людях с 1998 г. в Индии. Все это описано в различных патентах и публикациях. Препарат инактивированных теплом микобактерий w имеется в продаже в Индии. Он содержит 0,5109 клеток инактивированных теплом микобактерий w на 0,1 мл фармацевтической композиции. Задача изобретения Задача данного изобретения заключается в снижении индуцированной TLR-активности путем использования микобактерий w или ее компонентов. Другая задача изобретения заключается в предоставлении поли-TLR-антагонистической активности микобактерий или ее компонентов при индукции известными синтетическими агонистами TLR, такими как CpG, ODN (олигодезоксинуклеотид), или природными, такими как липополисахарид. Другая задача изобретения заключается в предоставлении антагонистической активности микобактерий w и ее компонентов в отношении действия лигандов TLR, подобных липополисахариду, E-coli и т.д. Другая задача изобретения заключается в обеспечении полезности микобактерий w или ее компонентов в лечении заболеваний, при которых имеет место повышенная экспрессия TLR. Другая задача изобретения заключается в предоставлении микобактерий w или ее компонентов для лечения заболевания, подобного сепсису, множественной миеломе, малярии, множественному склерозу,ретробульбарному невриту, хронической обструктивной болезни легких, с целью улучшения показателей заболеваемости и смертности, ассоциированных с ними. Краткое описание графических материалов Фиг. 1. Влияние микобактерии w на индукцию TLR под действием LPS. Фиг. 2. Влияние микобактерии w на поли-TLR-лиганд при индукции TLR. Фиг. 3. Влияние микобактерии w на действие лиганда LPS при индуцированной гипертермии (проба на пирогенность). Фиг. 4. Влияние композиции, содержащей микобактерию w, на сепсис, индуцированный Е. coli(внутривенное введение). Подробное описание изобертения Известно, что фармацевтические композиции, содержащие микобактерию w и/или ее компоненты,обеспечивают Th1-ответ. Также известно, что они имеют общие антигены с Mycobacterium leprae и Mycobacterium tuberculosis. Обнаружено, что они полезны в лечении лепры, улучшая киллинг микроорганизмов и клиренс их из организма, что приводит к более быстрому выздоровлению. Обнаружено также,что они полезны в качестве профилактического средства против туберкулза и лепры. Неожиданно обнаружено, что они также обладают уникальными свойствами по снижению активности TLR. Их эффект в качестве ингибитора/антагониста наблюдается по меньшей мере в отношении TLR 3, 4, 5, 6, 9. Снижение активности TLR наблюдается, когда TLR экспрессируются под воздействием множества лигандов TLR in vitro, а также in vivo. Также обнаружено, что они полезны при лечении состояний, индуцированных лигандами TLR, подобных, например, липополисахаридам, (цитокины и гипертермия). Также обнаружено, что они полезны в лечении заболеваний, при которых имеет место повышенная экспрессия различных toll-подобных рецепторов, например при сепсисе, множественной миеломе, малярии, множественном склерозе, ретробульбарном неврите, хронической обструктивной болезни легких и т.д. Данное изобретение проиллюстрировано следующими примерами без ограничения объема изобретения.I. В соответствии с изобретением в следующих далее примерах описаны состав фармацевтической композиции, способ изготовления, ее HPLC-характеристика, безопасность и переносимость, способы применения и исход лечений. Далее следуют иллюстративные примеры настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не следует ограничивать ими. Пример 1. Фармацевтические композиции. А. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержит В. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержит-3 023046 С. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержитD. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержит Е. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержитF. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержитG. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержит Н. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержитI. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержитJ. Каждая доза 0,1 мл терапевтического агента содержит Пример 2. Способ изготовления фармацевтической композиции. А. Культивирование микобактерии w. 1) Приготовление культуральной среды. Микобактерию w культивируют на твердой среде, подобной LJ-среде (среде ЛовенштейнаЙенсена), или жидкой среде, подобной среде Мидлбрука или жидкой среде Сатона. Для улучшения выхода среду Мидлбрука обогащают. Предпочтительно ее обогащают путем добавления глюкозы, бактотриптона и BSA (бычий сывороточный альбумин). Их используют в соотношении 20:30:2 предпочтительно. Обогащающую среду добавляют к среде Мидлбрука. Это выполняют предпочтительно в соотношении от 15:1 до 25:1, более предпочтительно в соотношении 20:1. 2) Работа с биореактором.a) Подготовка сосуда. Внутренние контактирующие части сосуда (стыки, механические уплотнения, уплотнительные кольца/пазы для прокладок и т.д.) должны быть надлежащим образом промыты, чтобы исключить любое загрязнение. Заполнить сосуд 0,1 н. NaOH и оставить в таком состоянии на 24 ч для удаления пирогенных веществ и других примесей. Затем сосуд промывают сначала подкисленной водой, затем обычной водой. Окончательно сосуд ополаскивают дистиллированной водой (3 раза) перед приготовлением среды.b) Стерилизация биореактора. Биореактор, содержащий 9 л дистиллированной воды, стерилизуют острым паром (не напрямую). Аналогичным образом биореактор стерилизуют еще раз со средой Мидлбрука. Другие дополнительные бутыли, входные/выходные воздушные фильтры и т.д. автоклавируют (дважды) при 121 С в течение 15 мин. Перед использованием все это сушат при 50 С в сушильном шкафу.B. Сбор и концентрирование. Обычно это делают к концу 6-х суток после культивирования в асептических условиях. Концентрирование клеток (сбор осадка) выполняют путем центрифугирования.C. Промывание клеток. Полученный таким образом осадок промывают как минимум три раза стандартным физиологическим раствором. Его можно промыть любой другой жидкостью, предпочтительно изотонической.D. Добавление фармацевтически приемлемого носителя. К осадку добавляют апирогенный стандартный физиологический раствор. В качестве фармацевтического носителя можно использовать любую другую апирогенную изотоническую жидкость. Носитель добавляют в таком количестве, чтобы получить желаемую концентрацию активного начала в конечной форме.E. Добавление консерванта. Чтобы продукт был свободен от других загрязняющих бактерий в течение своего срока годности,добавляют консервант. Предпочтительным консервантом является тиомерсал, который используют в конечной концентрации 0,01 мас./об.%.F. Окончательная стерилизация. Окончательная стерилизация может быть проведена различными физическими методами, подобными применению нагревания, или ионизирующего излучения, или стерильной фильтрации. Тепло может быть в форме сухого тепла или влажного тепла. Кроме того, оно может быть в форме кипячения или пастеризации. Ионизирующее излучение может представлять собой ультрафиолетовые или гамма-лучи либо микроволновое излучение или любую другую форму ионизирующего излучения. Предпочтительно проводить автоклавирование конечного продукта. Это может быть сделано до/после заполнения конечной упаковки.G. Контроль качества. 1. Вещество оценивают на предмет чистоты, стерильности. 2. Микроорганизмы контролируют на предмет кислотоустойчивости после окрашивания по Граму. 3. Тест на инактивацию: его проводят путем культивирования продукта на LJ-среде для обнаружения любого живого микроорганизма. 4. Патогенность и/или загрязнение патогеном. Культивируемыми микроорганизмами заражают мышей Balb/c. Ни одна из мышей не должна умереть, все должны остаться здоровыми и дать прибавку в весе. Не должны наблюдаться какие-либо макроскопические или микроскопические повреждения в печени, легком, селезенке или любых других органах после того, как животные будут убиты, вплоть до 8 недель после лечения. 5. Биохимический тест. Микроорганизм подвергают следующим биохимическим тестам:b) на гидролиз твина 80;d) тесту на восстановление нитрата. Микроорганизм дает отрицательные результаты в уреазном тесте, тесте на гидролиз твина 80 и ниациновом тесте. Положителен согласно тесту на восстановление нитрата. Н. Приготовление компонентов микобактерии w. Компоненты микобактерии w могут быть приготовлены для задачи данного изобретения путем: 1. разрушения клеток; 2. экстракции растворителем; 3. ферментативной экстракции. Разрушение клеток может быть выполнено путем обработки ультразвуком или применения работающего при высоком давлении устройства для фракционирования (fractionometer) или путем применения ингредиента для создания осмотического давления (osmotic pressure ingredient). Экстракция растворителем может быть проведена путем использования любого органического растворителя, подобного хлороформу, этанолу, метанолу, ацетону, фенолу, изопропиловому спирту, уксусной кислоте, мочевине, гексану и т.д. Ферментативная экстракция может быть проведена путем использования ферментов, которые могут-5 023046 разрушать клеточные стенки/мембраны. Обычно они являются протеолитическими по своей природе. Предпочтительными ферментами являются ферменты литиказа и проназа. Для задачи изобретения вместо микроорганизмов микобактерий w можно использовать только клеточные компоненты микобактерииw или их можно добавить к продукту, содержащему микобактерию w. Добавление клеточных компонентов приводит к повышению эффективности продукта. Во всех примерах используют микобактерию w, описанную в примере 1 с, которая представляет собой инактивированную теплом микобактерию w в количестве 0,50109 в 0,1 мл.II. Примеры, демонстрирующие уменьшение индукции TLR путем использования фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Пример 1. Стимуляцию TLR тестируют путем оценки активации NF- (ядерного фактора ) в HEK293 клетках, экспрессирующих заданный TLR. Антагонистическую активность фармацевтической композиции, содержащей 0,5109 клеток инактивированной теплом микобактерии w в 0,1 мл изотонического раствора, тестируют в отношении человеческого TLR (hTLR): 2, 3, 4, 5, 7, 8 и 9. В данном исследовании используют следующие лиганды TLR:hTLR9: CpG ODN 2006 в концентрации 50 и 20 нг/мл. Общая методика. Репортерный ген секретируемой щелочной фосфатазы находится под контролем промотора, индуцируемого под действием транскрипционного фактора NF-B. Стимуляцию TLR в этом скрининге тестируют путем оценки активации NF-В в HEK293-клетках, экспрессирующих заданный TLR. Этот репортерный ген позволяет осуществлять мониторинг передачи сигнала, осуществляемого посредствомTLR, на основании активации NF-В. В лунки 96-луночного планшета (общим объемом 200 мкл), содержащие соответствующее количество HEK293-клеток (25000-50000 клеток/лунка), добавляют по 20 мкл инактивированной теплом микобактерии w, а также лиганды TLR. Среды, добавляемые в лунки, предназначены для детекции NF-В-индуцируемой экспрессии SEAP (секретируемая щелочная фосфатаза). Через 16-20 ч инкубации с целью обнаружения индуцированной NF-В-активности производят измерение OD (оптическая плотность) при 650 нм на Beckman Coulter AD 340C Absorbance Detector. Результаты представлены в табличной форме, как упомянуто ниже. В колонке (А) продемонстрирована активность, индуцированная лигандами TLR. В колонке (В) продемонстрирована активность, индуцированная лигандом TLR в присутствии композиции, содержащей микобактерии w (Mw). В последней колонке приведен выраженный в % антагонизм, обусловленный действием микобактерии w по сравнению только с одним лигандом TLR. Эти данные говорят об TLR-антагонизме при стимуляции R 3, 4, 5, 7, 8, 9 лигандом TLR. В этом эксперименте антагонизма в отношении TLR2 не наблюдают. Пример 2. Мышей возрастом 8-10 недель умерщвляли и выделяли спленоциты из селезенки. Клетки селезенки культивировали с LPS и комбинацией LPS с инактивированными теплом клетками микобактерии w в разных концентрациях. Клетки культивировали в средах 1640 от RPMI (Roswell Park Memorial Institute). Через 48 ч клетки собирали и контролировали на предмет экспрессии разных TLR. ЭкспрессиюTLR контролируют посредством амплификации специфической мРНК из клеточного лизата (набор CellcDNA II, Ambion), используя TLR-специфичные праймеры (RD systems). Контроль амплифицированных продуктов проводили на 1,5%-ном агарозном геле, используя окрашивание этидийбромидом. Обнаружено, что экспрессия TLR 3, 4, 5, 6 и 9 снижается, если клетки подвергают воздействию микобактерии w+LPS по сравнению только с LPS. Не обнаружен эффект только для TLR1. (фиг. 1). Таким-6 023046 образом, фармацевтическая композиция, содержащая микобактерию w, демонстрирует антагонистическую активность по отношению к LPS-индуцируемой индукции TLR 3, 4, 5, 6 и 9. Для TLR1, индуцированного LPS, никакого эффекта не обнаружено. Пример 3. Введение поли-TLR-лиганда мышам вызывает экспрессию TLR 1, 3, 5, 6, 9 в спленоцитах, собранных и проанализированных через 7 суток. Спленоциты, экспрессирующие TLR 1, 3, 5, 6, 9, после стимуляции их in vitro в течение 48 ч с использованием 0,5105 или более инактивированных теплом микобактерий w показывают отсутствие экспрессии TLR 3, 5 и 6 (100%-ное уменьшение экспрессии TLR 3, 5 и 6). Результаты продемонстрированы на фиг. 2. Таким образом, приведенные выше примеры демонстрируют снижение в индукции TLR под действием фармацевтической композиции по настоящему изобретению.III. Примеры, демонстрирующие антагонистическую активность в отношении действия TLR лигандов. Пример 1. Влияние на LPS-индуцируемые цитокины. Мышей возрастом 8-10 недель умерщвляли и спленоциты выделяли из селезенки. Клетки селезенки культивировали с LPS и комбинацией LPS с инактивированными теплом клетками микобактерий w в различных концентрациях. Клетки культивировали в средах 1640 от RPMI. Супернатант анализировали на предмет цитокинов, подобных TNF-альфа (фактор-альфа некроза опухоли) и IFN-гамма (интерферон-гамма). В исследованиях in vitro микобактерия w, когда ее используют вместе с липополисахаридом (LPS),снижает индукцию TNF-альфа под действием LPS, a также снижает секрецию IFN-гамма. Уровень наблюдаемого ингибирования значителен и настолько велик, что секреция снижается до базального уровня(полное ингибирование). Пример 2. Влияние на LPS-индуцируемую гипертермию. Кроликов готовили так же, как для пробы на пирогенность, и проводили мониторинг температуры. Кроликам делали внутривенную инъекцию лизата E.coli, чтобы имитировать эндотоксин/LPSиндуцируемую гипертермию. Через два часа их разделяли на контрольную группу и леченную группу. Леченная группа получала инъекцию 2 мл фармацевтической композиции, содержащей инактивированную теплом микобактерию w (0,5109 клеток в 0,1 мл). Полученные данные воспроизведены три раза. Животные в леченной группе демонстрировали понижение температуры, тогда как у контрольных животных сохранялась повышенная температура. Эффект, устойчиво сохраняющийся до окончания эксперимента, представлен на фиг. 3. Таким образом, приведенные выше примеры демонстрируют антагонистический эффект фармацевтической композиции по настоящему изобретению по отношению к действию лигандов TLR.IV. Примеры, демонстрирующие полезность при заболеваниях, при которых имеет место повышенная экспрессия TLR.(А). Улучшенная выживаемость при Е. coli-индуцированном сепсисе у мышей. Парентеральная инъекция живой Е. coli мышам вызывает сепсис со смертностью 100%. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, содержащую 0,5109 клеток инактивированной теплом микобактерии w, оценивали (Mw) на предмет ее эффективности в этой модели на мышах. Животным вводили суспензию Е. coli, затем микобактерию w в/в (внутривенным) или и/д (интрадермальным) способами в различных комбинациях с дексаметазоном и амоксициллином или без них. Самое большое улучшение в выживаемости наблюдается у животных, леченных микобактерией w с глюкокортикоидом и амоксициллином. Эксперимент 1 (внутрибрюшинное введение). Мышам вводили по 1 мл живой Е. coli (20 OD) внутрибрюшинно. Мышей лечили, используя разную комбинацию терапий амоксициллином (500 мг) и дексаметазоном (2,0 мг) (фиг. 4). В каждой группе было по 10 животных. В контрольной группе все животные умерли в пределах 48 ч (группа I). При вмешательствах наблюдали улучшенную выживаемость (группа II-VII). 100%-ную выживаемость наблюдали, когда дексаметазон+амоксициллин комбинировали с микобактерией w (0,1 мл), доставляемой интрадермально (группа IV). За ней следовала группа, леченная теми же лекарствами, но с внутривенно введенной микобактерией w (группа V). Результаты представлены графически на фиг. 4. Эксперимент 2 (внутрибрюшинное введение). Во втором эксперименте дозу амоксициллина уменьшали с 500 мг/кг до 70 мг/кг (фиг. 5). И вновь наилучшие результаты наблюдали для группы II с микобактерией w, введенной интрадермально вместе со стероидами и антибиотиками, далее следовала группа III с внутривенным способом введения. Результаты представлены графически на фиг. 5. Сравнение экспериментов 1 и 2 показывает, что количество антибиотика является существенным. Это важно с точки зрения клиники, поскольку при лечении сепсиса применяется большая доза антибиотика, а не обычная доза, используемая для лечения других инфекций.-7 023046 Эксперимент 3 (внутривенное введение). В третьем эксперименте сепсис индуцировали внутривенным путем и уровни дексаметазона уменьшали от 2 до 0,5 мг/кг. Полученные данные подтверждают, что комбинация стероидов+антибиотиков+микобактерии w (группа VI) обеспечивает улучшенную выживаемость. Эти три эксперимента показали, что применение микобактерии w улучшает выживаемость при сепсисе. Результаты представлены графически на фиг. 6.(В) Модель малярии P. berghei. Известно, что нарушение регулирования иммунной системы при малярии Р. falciparum индуцирует сепсисоподобные синдромы. У животных, инфицированных внезапно и быстро развивающейся формой малярии, вызываемой штаммом Р. berghei ANKA, наблюдают идентичную ситуацию. В предшествующей работе, выполненной в Институте наук Индии (NSc) в Бангалоре, приведено наблюдение, что введение комбинации микобактерия w+артитер приводит к 70%-ной выживаемости по сравнению с 0% в контрольной группе, получающей только артитер или только плацебо. Таким образом, микобактерия w способна реверсировать сепсисоподобные синдромы, вызываемые при малярийных инфекциях. Таким образом, приведенные выше примеры (IV-A и IV-B) демонстрируют полезность фармацевтической композиции по настоящему изобретению при заболеваниях у животных, при которых имеет место повышенная экспрессия TLR.(С). Сепсис у человека. Установлено, что способствующий выведению продукт (lead product) полезен в лечении хронического инфекционного заболевания. Также обнаружено, что он полезен в рассасывании устойчивой к стероидам гранулмы, плеврального выпота, гидропневмоторакса, ретробульбарного неврита и т.д. Его действие также оценено в лечении сепсиса. Пример 1. У пожилого пациента - мужчины 65 лет с резистентной миеломой был обнаружен сепсис, и пациент был подключен к аппарату искусственной вентиляции легких в течение 6 недель. Для лечения он получал более высокую дозу антибиотиков (пенемов), ЕРО (эритропоэтин), GM CSF (гранулярномакрофагальный колониестимулирующий фактор), ежедневную трансфузию тромбоцитов. Несмотря на это у него наблюдалось резкое ухудшение течения болезни с прогрессирующим снижением количестваCD4. Ему вводили 0,2 мл микобактерии w интрадермально в двух разделнных дозах выше дельтовидной мышцы. Через 48 ч он был отключен от аппарата искусственной вентиляции легких. Какой-либо инфузии тромбоцитов ему не потребовалось. Пример 2. У ослабленного молодого человека с застарелым туберкулезом (ТВ) легких развилась бактериальная инфекция легкого, приведшая к сепсису. Он не реагировал на традиционную терапию. Ему вводили микобактерию w (5 мл, в/в) в течение 5 суток. Это привело к излечению от сепсиса и инфекции и выписке из больницы. Состояние его оставалось стабильным без рецидива в течение последующих 6 недель Оба эти примера подтверждают, что микобактерия w полезна в лечении сепсиса у человека.(D). Ретробульбарный неврит. У пациента - мужчины 56 лет с ретробульбарным невритом было обнаружено остаточное нарушение зрения (residual visual deficit) после лечения метилпреднизолоном, 1 г, вводимым внутривенно ежесуточно в течение 3 суток. Зрение сохранялось стабильным на уровне 6/36 и 6/18 соответственно в правом и левом глазу соответственно. Ему вводили 5 мл микобактерии w (приготовленной согласно изобретению) в 500 мл изотонического раствора внутривенно, вновь инфузией. Зрение улучшилось, достигнув 6/12 и 6/9 соответственно, в правом и левом глазу через 10 суток после начала лечения.(Е). Множественный склероз. У пациентки - женщины 28 лет имелся паралич обеих нижних конечностей с уровнем двигательных способностей 0 (power grade 0) вследствие множественного склероза. Он не поддавался лечению в течение 6 месяцев. В течение этого периода времени она не получала какого-либо другого лечения. Ей вводили по 2 мл микобактерии w ежесуточно в 100 мл изотонического раствора внутривенно в течение трех суток. При осмотре через 15 суток продемонстрировала признаки выздоровления с уровнем двигательных способностей II для обеих нижних конечностей.(F). Хроническая обструктивная болезнь легких. Применение фармацевтической композиции, содержащей микобактерию w, в лечении хронической обструктивной болезни легких приводит к уменьшению выделений, уменьшению степени инфекции,уменьшению числа осложнений, требующих госпитализаций, согласно примерам, демонстрирующим ее влияние на FEV1 и PEFR. Эксперимент 1. Пациентам с хронической обструктивной болезнью легких вводили по 0,1 мл микобактерии w интрадермально каждые две недели в течение 2 месяцев. Это приводило к улучшению в односекундном объеме воздуха при форсированном выдохе (FEV1) более чем на 50% у 5 из 9 пациентов, у остальных улучшение составляло более 25%. Улучшение в максимальной скорости выдоха (PEFR) также следовало-8 023046 этой закономерности. Эксперимент 2. 16 пациентам с хронической обструктивной болезнью легких вводили внутримышечно по 0,5109 клеток инактивированной теплом микобактерии w после суспендирования их в 1 мл изотонического раствора. В результате однократной инъекции улучшение в FEV1 отмечали у 13 из 16 пациентов при проверке на 15-е сутки после инъекции (более чем на 50% у 7, более чем на 25% у 6). Это улучшение достигало своего пика через 4-6 недель. Аналогично, улучшение в PEFR отмечали у 11 из 16 пациентов. Эксперимент 3. 6 пациентам с хронической обструктивной болезнью легких вводили по 0,5109 клеток инактивированной теплом микобактерии w в слизистую оболочку носа посредством назального спрея (0,1 мл). Улучшение в FEV1 более чем на 25% отмечали у 5 из 6 пациентов, при этом у 3 пациентов наблюдалось улучшение более чем на 50%. Улучшение в PEFR более чем на 25% отмечали у 4 из 6 пациентов, при этом у 2 из них наблюдалось улучшение более чем на 50%. Эксперимент 4. Десяти пациентам с хронической обструктивной болезнью легких однократно вводили по 0,5109 клеток инактивированной теплом микобактерии w, суспендированных в 3 мл разбавителя, в легкое посредством распыления. Улучшение в FEV1 (более чем на 25%) отмечали у всех 10 пациентов. Наблюдается сохранение эффекта в течение более 6 недель. Улучшение в PEFR составляло более 25% у 8 пациентов, при этом у 4 из них достигнуто улучшение более чем на 50%.(G). Множественная миелома. У пациентки - женщины 70 лет с миеломой, невосприимчивой к традиционным способам лечения,наблюдалось прогрессирование заболевания. Она испытывала сильную боль в костях. Боль была настолько сильной, что она не могла ходить. Микобактерию w (0,1 мл микобактерии w) вводили интрадермально ежемесячно. Была достигнута ремиссия заболевания. Через три месяца терапии у нее не наблюдалось симптомов заболевания, и она могла свободно передвигаться. У не улучшился показатель гемоглобина от 5,5 до 7,5 г-%. Таким образом, вышеупомянутые примеры (от IV-C до IV-G) демонстрируют позитивные эффекты фармацевтической композиции по настоящему изобретению в лечении заболеваний у людей, при которых имеет место повышенная экспрессия TLR. Примеры II-1 - III-3 иллюстрируют поли-TLR-антагонистическую активность микобактерии или ее компонентов при индукции известными TLR-агонистами, синтетическими, такими как CpG, ODN, или природными, такими как липополисахарид. Примеры II-1 и II-2 также иллюстрируют антагонистическую активность микобактерии w и ее компонентов в отношении действия лигандов TLR, подобных липополисахариду, E-coli и т.д. Примеры(IV-A, IV-B также иллюстрируют полезность микобактерии w или ее компонентов в лечении заболеваний, при которых имеет место повышенная экспрессия TLR. ПримерыIV-C, IV-D также иллюстрируют позитивные эффекты микобактерии w или ее компонентов в лечении заболевания, подобного сепсису, ретробульбарному невриту, множественному склерозу, хронической обструктивной болезни легких, множественной миеломе. Ссылки ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение инактивированной нагреванием Micobacterium w (микобактерии w) для снижения индуцированной TLR 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 активности. 2. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована при заболеваниях. 3. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована лигандами TLR. 4. Применение по п.3, где лиганд TLR представляет собой лиганд природного происхождения, например липополисахарид или эндотоксин, или синтетический, например CpG, ODN (олигодезоксинуклеотид). 5. Способ снижения индуцированной TLR-активности при заболеваниях с использованием микобактерии w, который включает введение терапевтического количества фармацевтической композиции,содержащей инактивированную нагреванием микобактерию w. 6. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована при сепсисе. 7. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована при хронической обструктивной болезни легких. 8. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована при множественной миеломе. 9. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована при рассеянном склерозе. 10. Применение по п.1, где TLR активность индуцирована при ретробульбарном неврите. 11. Применение терапевтически эффективного количества инактивированной нагреванием микобактерии w для лечения сепсиса. 12. Применение терапевтически эффективного количества инактивированной нагреванием микобактерии w для лечения хронической обструктивной болезни легких. 13. Применение терапевтически эффективного количества инактивированной нагреванием микобактерии w для лечения множественной миеломы. 14. Применение терапевтически эффективного количества инактивированной нагреванием микобактерии w для лечения рассеянного склероза. 15. Применение терапевтически эффективного количества инактивированной нагреванием микобактерии w для лечения ретробульбарного неврита.