Способ получения оптических активных хиральных аминов

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ ХИРАЛЬНЫХ АМИНОВ Настоящее изобретение относится к получению оптически чистых вторичных аминов, которые могут быть использованы как промежуточные соединения в синтезе, например, фармацевтических продуктов. 017070 Настоящее изобретение относится к способу получения оптически активных хиральных аминов. Хиральные амины играют важную роль в фармацевтической, агрохимической и химической отраслях промышленности. Их часто используют в качестве промежуточных соединений или синтонов при получении различных физиологически, например, фармацевтически активных веществ, таких как цефалоспорин или производные пирролидина. В большинстве различных областей применения хиральных аминов только одна конкретная оптически активная форма, либо (R), либо (S)-энантиомер, обладает желательной физиологической активностью. Таким образом, существует очевидная необходимость в способах получения хиральных аминов в оптически активной форме. Указанная необходимость частично обеспечивается получением хиральных аминов путем кристаллизации диастереомерных солей при добавлении хиральных карбоновых кислот (Breuer et al., Angewandte Chemie (2204) 116, 806-843). Другие химические методы предусматривают использование энантиоселективного синтеза на основе восстановления прохиральных предшественников с C=N двойными связями. Кроме того, известно об использовании различных ферментов, таких как протеазы, амидазы или липазы, для стереоселективного расщепления рацематов (Bornscheuer and Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim). Также известно, что специфические трансамилазы, а именно -трансамилазы, включающие -аминокислотные аминотрансферазы, подходят для получения оптически чистых аминокислот (Bartch et al., Appl. Environra. Microbiol, (1996) 62, 3794-3799, Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226-234, патент Японии 01153084 A2 (1998), патент Японии 63304986 А 2(1988), Европейский патент 0248357 А 2 и Ziehr et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487). Однако данные известные способы имеют различные недостатки. Хотя ферментативные способы, в отличие от классических методов, обычно предусматривают использование благоприятных мягких условий и обеспечивают достижение соответствующей стереоспецифичности, в них постоянно используются ферменты, чья субстратная специфичность, энантиоселективность и/или скорости конверсии являются недостаточно высокими для проведения процессов в промышленном масштабе. Кроме того, один из наиболее выраженных недостатков использования трансаминаз для получения оптически активных аминов представлен часто наблюдаемым явлением субстратного и продуктивного ингибирования. Поэтому одной из задач настоящего изобретения является разработка усовершенствованного способа получения оптически активных хиральных аминов, в частности способа с улучшенной субстратной специфичностью, улучшенной энантиоселективностью и, в частности, обеспечивающего конверсию выделяемых вещество до 100%. Техническая проблема, положенная в основу настоящего изобретения, решена путем разработки способа получения оптически активного хирального амина, включающего:a) обеспечение аминоакцептора и аланина в качестве аминодонора, где аминоакцептор выбран из группы, состоящей из фенилпировиноградной кислоты, ее соли, пировиноградной кислоты, ее соли, ацетофенона,2-кетоглутарата,3-оксобутирата,2-бутанона,3-оксопирролидина(3-ОР),3 пиридилметилкетона (3-PMK), сложного этилового эфира 3-оксомасляной кислоты (3-ОВЕЕ), сложного метилового эфира 3-оксопентановой кислоты (3-ОРМЕ), N-l-boc-3-оксопиперидинона, N-l-boc-3 оксопирролидина (В 3 ОР), 3-оксопиперидина, алкил-3-оксобутаноатов, метоксиацетона, 1-оксотетралона и 4-(3-пиридил)-2-бутанона;b) осуществление взаимодействия аминоакцептора и аминодонора с (R)- или (S)-селективной омега-трансаминазой,c) получение желаемого оптически активного хирального амина и пирувата в качестве альфакетонного побочного продукта иd) удаление пирувата из реакционной смеси посредством декарбоксилазы: причем взаимодействие аминоакцептора и аминодонора с (R)- или (S)-селективной омегатрансаминазой осуществляют в реакционной смеси, имеющей рН от 5,0 до 9,5, при времени реакции 4070 мин в температурном интервале от 10 до 65 С. Реакция настоящего изобретения протекает в основном по следующей схеме:-1 017070 Таким образом, настоящее изобретение относится к способу асимметричного синтеза хиральных аминов путем использования по меньшей мере одной трансаминазы для трансаминирования аминогруппы аминодонора к аминоакцептору с образованием в результате желаемого продукта. В зависимости от энантиопредпочтения конкретной использованной трансаминазы образуется оптически активный хиральный амин желаемой оптической конфигурации, т.е. либо (R), либо (S)-энантиомер. Таком образом,при использовании в одном варианте осуществления настоящего изобретения (S)-селективной трансаминазы для асимметричного синтеза образуется желаемый (S)-энантиомер хирального амина, тогда как при использовании в другом варианте осуществления настоящего изобретения (R)-селективной трансаминазы образуется желаемый (R)-энантиомер. Помимо желаемого оптически активного амина реакция приводит к образованию кетона в качестве побочного продукта, в частности -кетона как побочного продукта,из использованного аминодонора и возможно непрореагировавшего аминоакцептора и аминодонора. В предпочтительном варианте осуществления изобретения декарбоксилазой является пируватдекарбоксилаза (PDC). При этом ацетальдегид, образованный под действием PDC, удаляют из реакционной смеси, например, путем проведения реакции по меньшей мере с одним ферментом. Причем ферментом является спиртовая дегидрогеназа. Предпочтительно ацетальдегид удаляют, пропуская через реакционную смесь газообразный азот,предпочтительно прилагая к реакционной смеси пониженное давление. В другом варианте ацетальдегид удаляют химическими способами. В предпочтительном варианте способ согласно настоящему изобретению обеспечивает получение аминов, выбранных из группы, содержащей фенилаланин, аланин, 3-аминопиперидин, алкил-3 аминобутаноаты,3-аминопирролидин(3-РЕА),N-1-boc-3 аминопирролидин (В 3 АР), сложный этиловый эфир 3-аминомасляной кислоты (3-АВЕЕ), сложный метиловый эфир 3-аминопентановой кислоты (3-АРМЕ), -метилбензиламин (-МВА), 1-аминотетралин,-метил-4-(3-пиридил)бутанамин, глутаминовую кислоту, -аминобутират, вторбутиламин, метоксиизопропиламин и 1-N-boc-3-аминопиперидин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения -трансаминаза, используемая в настоящем способе, представляет собой -трансаминазу, полученную из Vibrio Fluvialis, в частности из штамма JS17. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения трансаминаза получена из Alcaligenes Denitrificans, в частности из штамма Y2k-2. В предпочтительном варианте осуществления настоящего избретения оптически активный хиральный амин, полученный на стадии с) или d), удаляют из реакционной смеси. В предпочтительно варианте способ согласно настоящему изобретению осуществляют в реакционной смеси, имеющей рН от 6,0 до 7,0, предпочтительно от 6,0 до 6,9. Ещ одним объектом настоящего изобретения является способ получения физиологически активного соединения, выбранного из группы, включающей производные 3-аминопирролидона, цефалоспорин,производные цефалоспорина, гетероциклические бороновые кислоты, L-дигидроксифенилаланин (LDopa), -метилдофа, D-фенилглицин, -гидроксифенилглицин, фосфинотрицин, пиримидопроизводные и производные пирролидона, где используется вышеописанный способ получения оптически активного хирального амина. В контексте настоящего изобретения физиологически активным соединением является соединение, которое обладает физиологической активностью по отношению к растениям, животным,людям, дрожжам или микроорганизмам, таким как простейшие, бактерии или вирусы, т.е. участвует в метаболических реакциях организма. Другим объектом настоящего изобретения является способ получения оптически активного 3-АР или оптически активного В 3 АР, включающий: а) обеспечение 3-ОР или В 3 ОР в качестве аминоакцептора и аминодонора,b) осуществление взаимодействия аминоакцептора и аминодонора с (R)- или (S)-селективной трансаминазой и с) получение оптически активного хирального 3-АР или оптически активного хирального В 3 АР и альфа-кетона как побочного продукта. Настоящее изобретение более подробно пояснено следующими примерами и прилагаемыми фигурами. Прилагаемые фигуры иллюстрируют настоящее изобретение. На фиг. 1 представлена тонкослойная хроматограмма,на фиг. 2 - относительная активность V. Fluvialis -ТА в зависимости от величины рН,на фиг. 3 - относительно снижение концентрации ВЗАР при инкубировании с различными веществами,на фиг. 4 - относительное снижение концентрации ВЗАР в присутствии пирувата и ацетальдегида,на фиг. 5 - зависимость конверсии В 3 ОР в В 3 АР от времени при различных давлениях,на фиг. 6 - относительная конверсия В 3 ОР в В 3 АР в присутствии различных РDС,на фиг. 7 - влияние повышенной концентрации аланина и повышенной концентрации PDC на синтез асимметричного В 3 АР,-2 017070 на фиг. 8 - конверсия В 3 ОР в В 3 АР при повышенных концентрациях аланина,на фиг. 9 - относительная PLP-зависимая конверсия В 3 ОР в В 3 АР,на фиг. 10 - относительная конверсия В 3 ОР в В 3 АР в зависимости от присутствия N2,на фиг. 11 - относительная конверсия В 3 ОР в В 3 АР в присутствии ADH. Пример 1. Асимметричный синтез В 3 АР Асимметричный синтез В 3 АР осуществляли в 1,5-мл реакционных пробирках. В 3 ОР как аминоакцептор использовали в концентрации 5 мМ (7,5 мкмоль). Концентрация использованного аминодонораL-аланина составляла 5 мМ. Использованные реактивы и условия реакции представлены ниже в табл. 1. Таблица 1. Условия реакции для синтеза асимметрического (S)-В 3 АР при использовании (S)-трансаминазы для трансаминирования аминогруппы аланина в В 3 ОР В качестве буфера использовали 50 мМ фосфат натрия, рН 7. ТА 7 обозначает -трансаминазу изVibrio fluvialis (Jlich Fine Chemicals, Germany). TA8 обозначает -трансаминазу из Alcaligenes denitrificans (Jlich Fine Chemicals, Germany). В качестве лактатдегидрогеназы использовали экстракт Escherichiacoli. Кроме того, NaDH добавляли до конечной концентрации 10 мМ. Концентрацию пируватдекарбоксилазы меняли. Использовали 1,5 единицы (20 мкл) и 15 единиц (200 мкл) пируватдекарбоксилазы изSaccharomyces cerevisiae (PDC1). Использовали 2 единицы (3,4 мкл) и 20 единиц (34 мкл) пируватдекарбоксилазы из Zymomonas mobilis (PDC2). Таблица 2. Степень конверсии и степень оптической чистоты, полученные с использованием ТА 8, для асимметричного синтеза В 3 АР Расчеты основаны на ГХ-анализе (+/- 5%) Далее, касательно представленной выше табл. 2, очевидно, что в каждом из шести проведенных опытов с использованием -трансаминазы ТА 8 можно достичь очень высокой степени оптической чистоты для образующегося (S)-B3AP. Также наблюдается, что независимо от использования либо ТА 7, либо ТА 8, степень конверсии остается весьма умеренной, если не влиять на равновесие реакции (опыт 1). Использование аланина в 10-50-кратном избытке лишь незначительно улучшает конверсию. В опытах 3,4, 5 и 6 являющийся побочным продуктом реакции кетон, то есть пируват, в процессе реакции трансаминирования выводили из равновесной реакционной смеси. Применение ТА 8 вместе с лактатдегидрогеназой из E.coli (опыт 6) приводит к значительному улучшению степени конверсии при сохранении и даже улучшении энантиоселективности. Практически то же справедливо для энантиоселективности, обеспе-3 017070 чиваемой пируватдекарбоксилазой из Zymomonas mobilis (опыты 3-5). Однако PDC1 только незначительно увеличивает конверсию, PDC2 умеренно увеличивает скорость конверсии (опыт 4), если реакция протекает в течение 24 ч, тогда как при реакции, проводимой в течение 72 ч (опыт 5), конверсия значительно улучшается. Все реакции протекали в течение 24 ч, за исключением опыта 5, продолжительность которого составляла 72 ч. На фигуре представлена тонкослойная хроматограмма реакционных смесей согласно табл. 1. А обозначает -трансаминазу из Alcaligenis denitrificans, а V обозначает -трансаминазу из Vibrio fluvialis. К обозначает опыт 1 с использованием одного только ТА 7 или ТА 8 (опыт 1). PDC1 обозначает опыт с Saccharomyces cerevisiae пируватдекарбоксилазой (опыт 3). LDH обозначает опыт с лактатдекарбоксилазой из Escherichia coli (опыт 6), a PDC2 - опыт с Zymomonas mobilis пируватдекарбоксилазой (через 24 и 72 ч) (опыт 4 и 5). Таким образом, результаты ясно показывают, что получение (S)-B3AP из прохирального кетона В 3 ОР может быть осуществлено с очень высокой энантиоселективностью. Использование -трансаминаз как единственных ферментов в процессе получения, однако, приводит к умеренной конверсии. Данную умеренную скорость конверсии можно значительно повысить удалением пирувата из равновесной реакции, в частности, при использовании лактатдегидрогеназы или пируватдекарбоксилазы. Использование пируватдекарбоксилазы имеет, среди прочего, то преимущество,что нет необходимости в кофакторе рецикла (NADH). Оно дополнительно преимущественно обеспечивает ферментативное удаление пирувата с PDC и обеспечивает тем самым дополнительное преимущество удаления или избежания ингибирования образования продукта (кетонного продукта) и смещения равновесия реакции вправо с достижением более высокой конверсии (в идеальном случае 100%). Пример 2. Зависимость активности -трансаминазы от рН в реакции превращения (S)-МВА в ацетофенон Синтез осуществляли в кварцевой кювете, используя 50 мкл пирувата с концентрацией 100 мМ, 4 единицы/мл -ТА Vibrio fluvialis (далее по тексту также Vfl) (12 мкл) и 388 мкл натрийфосфатного буфера, 50 мМ, с увеличением величины рН от рН 6,0 до рН 7,4 с интервалом 0,2. Реакцию инициировали 50 мкл (S)-МВА с концентрацией 100 мМ в качестве аминодонора и увеличение поглощения измеряли в диапазоне 250-260 нм. Увеличение поглощения обусловлено образованием ацетофенона. Другие субстраты лишь незначительно влияют на поглощение, так что скорость реакции можно определить измерением поглощения ацетофенона. Величину, достигаемую при рН 7,4, принимали за 100%, а относительную активность для других величин рН рассчитывали так, как показано на фиг. 2. На фиг. 2 показана относительная активность V. fluvialis -ТА в зависимости от данной величины рН. На фиг. 2 показано, что при более низких величинах рН, таких как 6,0, 6,2 или 6,4, все еще сохраняется значительная активность, например 11% при рН 6,0. Таким образом, данный результат демонстрирует, что даже при низком значении рН возможно получить значительную активность трансаминазы,обеспечивающую взаимодействие субстратов при более низком значении рН, что, в свою очередь, позволяет увеличить конверсию при использовании PDC, которая чувствительна при более высоких значениях рН. Пример 3. Асимметричный синтез В 3 АР при различных величинах рН В данном примере показан асимметричный синтез В 3 АР из аланина и В 3 ОР в присутствии и отсутствие пируватдекарбоксилазы (PDC). Для каждого значения рН 6,0, 6,4 и 7,0 проводили три серии экспериментов. В опыте 1 использовали PDC из Zymomonas mobilis (клеточный экстракт дикорастущего вида), в опыте 2 использовали Zymobacter palmae (рекомбинант в E.coli) и опыт 3 был контрольным без PDC, в котором использовали только трансаминазу. Чтобы получить сравнимые результаты, определяли активности обеих PDC при рН 6 в пробе со спиртовой дегидрогеназой, и то же количество по активности PDC использовали в опытах, указанных выше. В табл. 3 даны объемы использованного вещества в мкл. Реакцию в каждом опыте проводили троекратно при значениях рН 6,0, 6,4 и 7,0. Значения рН регулировали буфером из раствора субстрата В 3 ОР. Активность PDC составляла примерно 2,5 единиц/мл при рН 7. Концентрации субстрата и фермента также представлены ниже в табл. 3. Через 10, 30, 60 и 120 мин отбирали образец объемом 100 мкл и реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М NaOH. Количественное определение концентрации В 3 АР проводили при использовании метода СЕ (капиллярного электрофореза). Ниже в табл. 4 показаны данные по конверсии при различных значениях рН для различных PDC. Очевидно, что применение PDC приводит к увеличению конверсии. Также видно, что PDC из Z. palmae(Zpa) вызывает несколько более высокую конверсию, чем PDC из Z. mobilis (Zmo). Также видно, что при более низких значениях рН, таких как 6,0 или 6,4, наблюдается заметное увеличение конверсии в опытах с использованием PDC, что отсутствует в контрольном опыте без использования PDC. В реакциях всех опытов можно наблюдать, что через 120 мин конверсия снижается. Таблица 4n.d. = не определено Пример 4. Стабильность В 3 АР в присутствии различных реагентов реакции асимметрического синтеза Чтобы показать стабильность В 3 АР в присутствии различных реагентов, проводили инкубирование 1 мМ В 3 АР в реакционной пробирке в течение 3 ч в присутствии различных веществ, перечисленных ниже в табл. 5. Пример осуществляли при рН 6 и 7 (натрийфосфатный буфер). Сразу после взаимодействия веществ отбирали первый образец Т 0, и другой образец, T1, отбирали через 3 ч. После экстракции амина определяли концентрацию по внутреннему стандарту сравнения (МВА) методом СЕ. По разнице полученных концентраций рассчитывали % снижения концентрации В 3 АР (см. фиг. 3). Из фиг. 3 очевидно, что различные реактивы существенно не влияют на концентрацию В 3 АР (опыты 1-9). На реакции опытов 11-13 влияет ацетальдегид. Из опыта 11 видно, что в отсутствие трансаминазы концентрация В 3 АР не снижается, тогда как в присутствии трансаминазы и ацетальдегида можно наблюдать сильное снижение концентрации В 3 АР. Ацетальдегид действует в реакции трансаминазы как аминоакцептор, такой как пируват, и, как очевидно, приводит к снижению концентрации В 3 АР. Пример 5. Взаимодействие В 3 АР с аминоакцепторами пирувата и ацетальдегида В данном примере показана активность трансаминазы V. fluvialis и A. denitrificans -ТА по отношению к субстратам В 3 АР и пирувата и по отношению к В 3 АР и ацетальдегиду. Осуществляли взаимодействие 2 мМ В 3 АР с 2 мМ пирувата или 2 мМ ацетальдегида (36 мкл Alcaligenes denitrificans (Ade) или 6 мкл Vibrio fluvialis (Vfl) -трансаминазы на 0,5 мкл реакционного объема,соответствующие 2 единица/мкл трансаминазы взаимодействовали в течение 30 мин). На фиг. 4 показаны полученные результаты. Соответственно, В 3 АР превращался в В 3 ОР под действием обоих ферментов, как с пируватом, так и ацетальдегидом, без каких-либо заметных различий. Пример 6. Асимметричный синтез В 3 АР при пониженном давлении и при рН 6 В данном примере пониженное давление прилагали к реакционной смеси для реакции асимметричного синтеза с образованием ВЗАР. В качестве контрольного опыта ту же реакцию осуществляли при нормальном давлении и без PDC. Условия реакции: Конечный объем: 1,5 мл 50 мМ натрийфосфатный буфер,рН 6 300 мклVibriio fluvialis-трансаминазы 60 мкл Zpa-PDC (соответствует 8 единиц/мл при рН 7), 5 мМ В 3 ОР 10 мМ D,L-аланина 0,1 мМ ТРР, PLP 5 мМ MgCl2 Пониженное давление создавали при использовании ротационного испарителя (150 мбар). Измерения проводили методом СЕ. На фиг. 5 показана конверсия В 3 ОР в В 3 АР во времени для различных давлений. Видно, что конверсия почти не зависит от прилагаемого давления. Конверсия при давлении 150 мбар, относительно максимально достигаемой конверсии, аналогична конверсии при давлении 1000 мбар. Пример 7. Сравнение различных пируватдекарбоксилаз В данном примере использовали три различные пируватдекарбоксилазы для асимметричного синтеза ВЗАР. Условия реакции соответствовали тем же, что и в примере 6, за исключением того, что величина рН составляла 7. Использовали PDC из Z. mobilis, Z. palmae и PDC от Biocatalytics (каталожныйPDC-101). Активности PDC по ADH-пробе были идентичными (1,6 единиц/мл). Из фиг. 6 видно, что все три PDC по существу приводят к сравнимым степеням конверсии. Пример 8. Влияние концентраций фермента и косубстрата на конверсию В 3 ОР в В 3 АР В данном примере показано влияние концентрации PDC на конверсию В 3 ОР в В 3 АР при использовании аланина в качестве аминодонора. Кроме того, показано влияние концентрации аланина на конверсию В 3 ОР в В 3 АР.-6 017070 Условия реакции представлены в примере 6, за исключением того, что использовали величину рН 7 и за исключением того, что указано иначе. Использовали Zymobacter palmae ТА. Как видно из фиг. 7, в реакции без PDC 5-кратное увеличение концентрации аланина с 5 мМ до 25 мМ приводит к удвоению степени конверсии (12% в отличие от 5,3% конверсии через 2 ч). В присутствии PDC конверсия возрастает при 5-кратном избытке аланина в два раза (30% по сравнению с 17% через 90 мин). В том случае, когда при обычной концентрации аланина количество PDC увеличивается от 1,6 единиц/мл до 50 единиц/мл, конверсия также возрастает, однако только меньше, чем в 2 раза (29% по сравнению с 17% через 40 мин). В следующей серии экспериментов показано влияние объединенного избытка аланина и избыткаPDC, в обоих случаях при рН 6 и 7. Реакция протекает быстрее при рН 6, хотя после достижения конверсии 49% концентрация В 3 АР также снижается быстрее. При рН 7 конверсия возрастет до 56%. Пример 9. Влияние концентрации аланина на ферментативный синтез В 3 АР В четырех реакциях использовали концентрации аланина 5, 25, 110, 300 и 500 мМ. Для каждого опыта осуществляли один контрольный без PDC и одну реакцию с PDC. Величину рН доводили до рН 7,0. Образцы для испытаний отбирали каждые полчаса в течение всего времени реакции 3 ч. Времена реакции для концентраций, приведенных на фиг. 8, составляли для 5 мМ - 40 мин, для 2 5 мМ - 60 мин и для 110-500 мМ - 90 мин. На фиг. 8 показана конверсия В 3 АР при асимметрическом синтезе при повышенных концентрациях аланина. Фиг. 8 четко показывает, что конверсия может достигать 60-70%. Ясно, что увеличение концентрации с 25 до 110 мМ существенно влияет на конверсию В 3 ОР в В 3 АР и что при дальнейшем увеличении концентрации до 500 мМ конверсия меняется незначительно. Влияние PDC на конверсию снижается при увеличении концентрации аланина. По данным контрольной реакции константу равновесия реакции синтеза В 3 АР рассчитывали следующим образом: Таким образом, используя измеренную концентрацию ВЗАР, константу равновесия рассчитывают следующим образом: В табл. 6 представлены расчетные величины. Так, константа равновесия для реакции с В 3 АР составляет 3,110-3. Таким образом, субстрат В 3 АР является подходящим субстратом для асимметричного синтеза в отличие от других кетонов. Пример 10. Влияние PLP на асимметричный синтез В 3 АР В данном примере показано влияние PLP (пиридоксаль-5'-фосфата) на конверсию В 3 ОР в В 3 АР. Изучены следующие три реакции:a) Опыт 1 с использованием 0,1 мМ PLP без добавления дополнительного количества PLPb) В опыте 2 PLP добавляли в ходе реакции, как только исчезал желтый цвет, обусловленный присутствием PLP в реакционной среде. Для этой цели добавляли 1-2 мкл насыщенного раствора PLP, в результате чего восстанавливался яркий желтый цвет. Влияние на концентрацию амина за счет незначительного увеличения объема составляло менее 1%, чем можно пренебречь.c) PLP не содержался и PLP не добавляли. Условия реакции: 1 мл конечный объем, 37 мкл Vfl-трансаминазы, 5 мМ В 3 ОР, фосфатный буфер рН 7,0. Концентрация L-аланина составляла 110 мМ. Измерения проводили методом СЕ, а в качестве внутреннего стандарта сравнения использовали -МВА.-7 017070 На фиг. 9 представлена зависимость изменения концентрации во времени. Оказывается, что нет заметного влияния на максимальную конверсию при добавлении PLP в опыте b) по сравнению с опытом а). Оказывается, что реакция без PLP протекает медленнее, хотя она достигает той же конверсии, что и другие реакции. Добавление PLP в опыте b) вызывает несколько большее снижение концентрации амина по сравнению с холостым опытом. Пример 11. Асимметричный синтез В 3 АР с удалением ацетальдегида введением азота Следующий пример детализирует один из путей улучшения конверсии асимметричного синтеза ВЗАР удалением ацетальдегида. Условия реакции: Субстраты: 5 мМ В 3 ОР 500 мМ L-аланин 32 Ед/мл Zpa-PDC 37 мкл/мл Vfl-трансаминазы Натрийфосфатный буфер рН 7,0 0,1 мМ PLP и ТРР (триаминдифосфата) 5 мМ МgСl2 Поскольку реакционный раствор содержал значительное количество белка, то наблюдалась сильная тенденция к пенообразованию. Чтобы подавить данное ценообразование, в реакционную среду добавляли 0,6 мкл концентрата пеногасителя А (Sigma, силиконовый полимер). Концентрат подавлял образование пены в значительной степени, но не мог ингибировать ее образование. Чтобы исключить ингибирование ферментов названным концентратом пеногасителя, проводили контрольный опыт без добавления азота, но с добавкой пеногасителя А. Поскольку добавление сухого азота привело к испарению воды из реакционного раствора, азот увлажняли. На фиг. 10 показаны рассчитанные значения относительной конверсии В 3 АР. Контрольный опыт с пеногасителем A (N2-контрольный: Vfl-TA, Zpa-PDC, пеногаситель, без N2) без добавления азота точно соответствует реакции в опыте без пеногасителя A (Vfl-TA, Zpa-PDC). Таким образом, на ферменты не влияет добавление другого концентрата. Опыт с реакцией (опыт N2: Vfl-TA, Zpa-PDC, пеногаситель, N2) при использовании азота показал увеличенную конверсию через 60, 90 и 180 мин. Пример 12. Асимметричный синтез В 3 АР в различных условиях Условия реакции: Конечный объем: 1 мл 37 мкл Vfl-трансаминазы 32 единиц/мл Zpa-PDC или PDC от Biocatcilytics или 3,2 единиц/мл Zmo-PDC 5 мМ В 3 ОР 500 мМ L-аланина Кофакторы 0,1 мМ PLP или ТРР, 5 мМ МgСl2 рН 7, фосфат натрия На фиг. 10 показана конверсия В 3 ОР в В 3 АР для вышеназванных реакций, сочетающих Vflтрансаминазу с каждой PDC. На фиг. 10 опыт, обозначенный N2, представляет собой опыт с использованием реакционной смеси,содержащей Vfl-трансаминазу и Zpa-PDC и обработанной азотом и пеногасителем A. N2 контрольный представляет собой образец, содержащий Vfl-трансаминазу, Zpa-PDC и пеногаситель А без обработки азотом. Очевидно, что конверсия существенно увеличивается от N2 контрольного до N2-образца вследствие присутствия азота, который подавали в реакционный раствор. Таким образом, введение азота в газообразном виде в реакционную среду значительно увеличивает конверсию В 3 ОР в В 3 АР. Пример 13. Асимметричный синтез В 3 АР в присутствии спиртовой дегидрогеназы (ADH) Для удаления из реакционной смеси ацетальдегида, образовавшегося в реакции PDC, может быть использована ADH для превращения ацетальдегида в этанол. Условия реакции: 110 мМ L-аланина 5 мМ В 3 ОР 37 мкл/мл Vfl-трансаминазы 32 единиц/мл Zpa-PDC 0,1 мМ PLP и ТРР 5 мМ МgСl2 Натрийфосфатный буфер рН 7 Представлены следующие опыты с реакциями: Реакционный опыт 1: реакция с PDC и трансаминазой. Реакционный опыт 2: реакция с PDC и трансаминазой с 5 мМ этанола (конечная концентрация) с добавлением NADH. Реакционный опыт 3: реакция с PDC, ADH и NaDH.-8 017070 Использованной ADH была ADH из Saccharomyces cerevisae с активностью между 50 и 100 единиц/мл. PDC-активность составляла 32 единицы/мл. В начале реакции в реакционную смесь опыта 2 добавляли абсолютный этанол в конечной концентрации 5 мМ. В начале реакции в опытах 2 и 3 добавляли 5 мкмоль NADH, соответствующие конечной концентрации 5 мМ NADH. Через 10 мин в каждом случае добавляли дополнительно еще 2,4 мкмольNADH (4 мкл 0,6 М раствора NADH в 50 мМ фосфатном буфере, рН 8,5). Раствор NADH хранили на льду и получали непосредственно перед применением. Результаты представлены на фиг. 11 и в табл. 5. Очевиден эффект ADH. Конверсия увеличивается приблизительно до 90%. Реакция контрольного опыта 2 без ADH и 5 мМ этанола лишь незначительно отклонялась от реакции контрольного опыта 1. Таким образом, добавление ADH значительно увеличивает конверсию при асимметричном синтезе В 3 АР из В 3 ОР. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения оптически активного хирального амина, включающий:a) обеспечение аминоакцептора и аланина в качестве аминодонора, где аминоакцептор выбран из группы, состоящей из фенилпировиноградной кислоты, ее соли, пировиноградной кислоты, ее соли, ацетофенона,2-кетоглутарата,3-оксобутирата,2-бутанона,3-оксопирролидина(3-OP),3 пиридилметилкетона (3-PMK), сложного этилового эфира 3-оксомасляной кислоты (3-OBEE), сложного метилового эфира 3-оксопентановой кислоты (3-OPME), N-1-boc-3-оксопиперидинона, N-1-boc-3 оксопирролидина (B3OP), 3-оксопиперидина, алкил-3-оксобутаноатов, метоксиацетона, 1-оксотетралона и 4-(3-пиридил)-2-бутанона;b) осуществление взаимодействия аминоакцептора и аминодонора с (R)- или (S)-селективной омега-трансаминазой;c) получение желаемого оптически активного хирального амина и пирувата в качестве альфакетонного побочного продукта иd) удаление пирувата из реакционной смеси посредством декарбоксилазы,причем взаимодействие аминоакцептора и аминодонора с (R)- или (S)-селективной омегатрансаминазой осуществляют в реакционной смеси, имеющей pH от 5,0 до 9,5, при времени реакции 4070 мин в температурном интервале от 10 до 65 С. 2. Способ по п.1, где декарбоксилазой является пируватдекарбоксилаза (PDC). 3. Способ по п.2, где ацетальдегид, образованный под действием PDC, удаляют из реакционной смеси. 4. Способ по п.3, где ацетальдегид удаляют реакцией по меньшей мере с одним ферментом. 5. Способ по п.4, где ферментом является спиртовая дегидрогеназа. 6. Способ по п.3, где ацетальдегид удаляют, пропуская через реакционную смесь газообразный азот. 7. Способ по п.3, где ацетальдегид удаляют, прилагая к реакционной смеси пониженное давление. 8. Способ по п.3, где ацетальдегид удаляют химическими способами. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полученные амины выбраны из группы, содержащей фенилаланин, аланин, 3-аминопиперидин, алкил-3-аминобутаноаты, 3-аминопирролидин (3AP), 3-пиридил-1-этиламин (3-PEA), N-1-boc-3-аминопирролидин (B3AP), сложный этиловый эфир 3 аминомасляной кислоты (3-ABEE), сложный метиловый эфир 3-аминопентановой кислоты (3-APME), метилбензиламин (-MBA), 1-аминотетралин, -метил-4-(3-пиридил)бутанамин, глутаминовую кислоту,-аминобутират, вторбутиламин, метоксиизопропиламин и 1-N-boc-3-аминопиперидин. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где -трансаминазой является трансаминаза изVibrio fluvialis или Alcaligenes denitrificans. 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где оптически активный хиральный амин, полученный на стадии с) или d), удаляют из реакционной смеси. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ осуществляют в реакционной смеси, имеющей pH от 6,0 до 7,0. 13. Способ по п.12, где pH реакционной смеси составляет от 6,0 до 6,9. 14. Способ получения физиологически активного соединения, выбранного из группы, включающей производные 3-аминопирролидона, цефалоспорин, производные цефалоспорина, гетероциклические бороновые кислоты, L-дигидроксифенилаланин (L-Dopa), -метилдофа, D-фенилглицин, гидроксифенилглицин, фосфинотрицин, пиримидопроизводные и производные пирролидона, где использован способ по любому из пп.1-13. 15. Способ получения оптически активного 3-АР или оптически активного B3AP, включающий: а) обеспечение 3-ОР или B3OP в качестве аминоакцептора и аминодонора,b) осуществление взаимодействия аминоакцептора и аминодонора с (R)- или (S)-селективной трансаминазой и с) получение оптически активного хирального 3-АР или оптически активного хирального B3AР и