Электрод на анион супероксида и сенсор, включающий таковой

009451 Область техники Настоящее изобретение относится к электроду на анионы супероксида, такие как in vivo анионрадикалы супероксидов (O2-), и к сенсору для определения концентрации анионов супероксида с использованием электрода. Более точно, изобретение относится к электроду на анионы супероксида, который может быть применен in vivo, не подвергаясь влиянию такого каталитического яда, как пероксид водорода, который может находиться в анализируемой системе, и к сенсору для определения концентрации анионов супероксида. Предшествующий уровень техники Анион-радикалы супероксида, которые являются разновидностью активного кислорода, образуютсяin vivo при окислении ксантина, гипоксантина и подобного в мочевую кислоту под действием ксантиноксидазы (КОД) при восстановлении кислорода гемоглобином и подобном. Анион-радикалы супероксида играют важную роль в in vivo синтезе физиологически активных веществ, бактерицидном действии,наступлении старости и подобном. Сообщают, что различные виды активного кислорода, полученные из анион-радикалов супероксида, вызывают различные заболевания, такие как рак. Таким образом, полагают, что определение in vivo концентрации разновидности активного кислорода, включая анион-радикалы супероксида, является важным для установления этих заболеваний. Как показано в формуле (1), когда субстрат отсутствует, эти анион-радикалы супероксида по реакции диспропорционирования становятся молекулами пероксида водорода (H2O2) и молекулами кислорода (O2). Эта реакция диспропорционирования состоит из образования (HO2) добавлением протонов к анион-радикалам супероксида, образования пероксида водорода и молекул кислорода взаимодействием(HO2) с молекулами кислорода и образования пероксида водорода и молекул кислорода при рекомбинации радикалов (HO2) (формулы (1)-(4. В этой реакционной системе анион-радикал супероксида действует как акцептор электронов (окисляющий агент), донор электронов (восстанавливающий агент) и акцептор ионов водорода (основание). Два последних действия были применены для определения концентрации анион-радикалов супероксида. Например, концентрация анион-радикалов супероксида была определена с использованием реакции превращения феррицитохрома с (трехвалентный) в ферроцитохром с (двухвалентный), реакции получения формазана голубого из нитротетразолия голубого (NBT) и реакции восстановления тетранитрометана(ТНМ). Все эти реакции проводились на in vitro. С другой стороны, был исследован способ количественного определения концентрации анион-радикалов супероксида in vivo. Например, McNeil et al., Tariov et al. и Cooper et al. сообщают, что концентрация анион-радикалов супероксида может быть определена электрохимически изготовлением ферментного электрода (электрода с иммобилизованным цитохромом с модификацией поверхности золотого или платинового электрода ферментом, N-ацетилцистеином и иммобилизацией через связь S-Au такого белка, как цитохром с, который является белком, содержащим металл, включающим комплекс железа, называемый гемом, в качестве окислительно-восстановительного центра (C.J. McNeil et al., Free Radical Res.Greenough, C.J. McNeil, J. Electroanal. Chem., 347, 267 (1993. Способ основан на следующем принципе определения. То есть цитохром с (трехвалентный) (цит.с(Fe3+ взаимодействует с анион-радикалами супероксида и восстанавливается до цитохрома с (двухвалентный) (цит.с (Fe2+ в соответствии с реакционной схемой (5). Далее цитохром с (двухвалентный),восстановленный O2-, снова электрохимически окисляется в соответствии со схемой реакции (6). Измеряют ток окисления, образующийся в этой реакции, посредством чего косвенным методом количественно определяют концентрацию анион-радикалов супероксида. Однако, поскольку цитохром с является белковым переносчиком электронов, который присутствуетin vivo в межклеточных митохондриальных мембранах, для формирования электрода, на котором цитохром с иммобилизован в достаточном для измерения количестве, требуется большое число клеток (например, 105-106 клеток). К тому же использованный фермент деактивируется в течение нескольких дней. Авторы настоящего изобретения ранее обнаружили, что электрод, полученный образованием на поверхности проводящего компонента полимерной пленки комплекса металлпорфирин, образованного введением атома металла в центр порфиринового соединения, не требует большого количества фермен-1 009451 тов, является свободным от проблем деактивации и может быть применен для детектирования разновидностей активного кислорода и определения их концентраций. Авторы подали заявление на патент (WO 03/054536), основанный на данном изобретении. Однако, поскольку пероксид водорода образуется и служит каталитическим ядом для полимерной пленки комплекса порфирин металла в реакции диспропорционирования анион-радикалов суперокисида,показанной в вышеупомянутой реакции, для определения анионов супероксида необходимо противодействие для избежания влияния пероксида водорода. Таким образом, желательно совершенствование электрода, который способен легко определять анион-радикалы супероксида и является свободным от влияния такого вырабатываемого каталитического яда, как пероксид водорода и подобное. Раскрытие изобретения В результате обширных исследований по улучшению характеристик электрода, имеющего полимерную пленку с комплексом порфирин металла, образованную на поверхности проводящего компонента, авторы настоящего изобретения обнаружили, что явление отравления может быть предотвращено при использовании комплекса соединения порфирина с особым видом замещающей группы в мезо-положении и особым аксиальным лигандом. Это заключение привело к завершению настоящего изобретения. В частности, настоящее изобретение предусматривает сенсор для определения концентрации анионов супероксида, имеющих устойчивость к отравлению, включающий электрод на анионы супероксида,включающий пленку, полученную электролитической полимеризацией комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд, представленного формулой (I) где М является железом(III) или марганцем(III), по крайней мере один из четырех Rs означает тиофурильную группу и по крайней мере один из двух Ls означает производное имидазола, имеющее коэффициент комплексообразования 104 М-2 или более, которое образует устойчивый 5 координированный комплекс или 6 координированный комплекс, образованный на поверхности проводящего компонента, противоэлектрод и электрод сравнения. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ детектирования анионов супероксида в образце, не подвергаясь какому-либо влиянию каталитического яда, включающий определение тока, возникающего в реакции окисления-восстановления между металлом в полимерной пленке тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд и анионами супероксида с использованием вышеупомянутого сенсора, имеющего устойчивость к яду. Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает пример трехэлектродной ячейки, используемой для получения электрода настоящего изобретения. Фиг. 2 показывает пример двухкамерной трехэлектродной ячейки, используемой для получения электрода настоящего изобретения. Фиг. 3 показывает пример игольчатого электрода и двухкамерной трехэлектродной ячейки, используемые для получения электрода настоящего изобретения, где (А) является двухкамерной трехэлектродной ячейкой, (В) является цельным электродом игольчатого типа и (С) является наконечником электрода игольчатого типа. Фиг. 4 показывает улучшенный электрод игольчатого типа, используемый для получения электрода настоящего изобретения, где (А) показывает цельный улучшенный электрод игольчатого типа и (В) показывает наконечник улучшенного электрода игольчатого типа. Фиг. 5 показывает пример измерительного прибора, используемого для определения разновидностей активного кислорода. Фиг. 6 показывает другой пример измерительного прибора, используемого для определения разновидностей активного кислорода. Фиг. 7 показывает график УФ-видимого спектра бромида 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III). Фиг. 8 показывает график УФ-видимого спектра бромида бис-(имидазолил)-5,10,15,20-тетракис(3 тиофурил)порфирината железа(III). Фиг. 9 показывает график УФ-видимого спектра 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирина.-2 009451 Фиг. 10 представляет собой график, показывающий вольтамперную кривую во время электролитической полимеризации продукта настоящего изобретения. Фиг. 11 представляет собой график, показывающий изменение во времени тока окисления в процессе добавления КОД в сравнительном продукте 1. Фиг. 12 представляет собой график, показывающий изменение во времени тока окисления в процессе добавления КОД в продукте изобретения 1. Наилучший способ осуществления изобретения Электрод настоящего изобретения на анионы супероксида (в дальнейшем именуемый электрод) включает полимерную пленку комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд, образованную на поверхности проводящего компонента. В качестве проводящего компонента для электрода настоящего изобретения может быть использован любой компонент, обычно применяемый для электродов, без особых ограничений. Примеры включают такие угли, как стеклоуглерод (СУ), графит, пиролитический графит (ПГ), высоко ориентированный пиролитический графит (ВОПГ) и активированный уголь, такие благородные металлы, как платина,золото и серебро, и In2O3/SnO2 (ОИО). Среди них стеклоуглерод является особенно предпочтительным с точки зрения экономической рентабельности, технологичности, легковесности и подобного. Особых ограничений по форме проводящего компонента не существует, поскольку такая форма используется в качестве электрода. Могут быть использованы такие различные формы, как цилиндр, четырехугольный штырь, игла и волокно. Например, для определения концентрации анионов супероксида in vivo предпочтительна иглоподобная форма. В настоящем изобретении полимерная пленка комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд образуется на поверхности проводящего компонента. В качестве примера комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд для получения полимерной пленки могут быть даны соединения следующей формулы (I). где М является металлом, окислительно-восстановительный потенциал которого между двухвалентной формой и трехвалентной формой выше, чем потенциал окисления О 2-, и ниже, чем потенциал окисления воды, по крайней мере один из четырех Rs означает аксиальный лиганд, имеющий коэффициент комплексообразования 104 М-2 или более, который образует стабильный 5 координированный комплекс или 6 координированный комплекс. В комплексе тиофурилпорфирин металла, представленном вышеуказанной формулой (I), железо(III), марганец (II) и подобное, представленное М, могут быть определены как металл, окислительновосстановительный потенциал которого между двухвалентной формой и трехвалентной формой выше,чем потенциал окисления О 2-, и ниже, чем потенциал окисления воды. В качестве примера тиофурильной группы, представленной R, можно привести 2-тиофурильную группу, 3-тиофурильную группу и подобное. В качестве аксиального лиганда, представленного L, имеющего коэффициент комплексообразования или более, который образует стабильный 5 координированный комплекс или 6 координированный комплекс, можно привести производные имидазола, например алкилимидазолы, такие как метилимидазол,этилимидазол, пропилимидазол и диметилимидазол; такие арилалкилимидазолы, как бензилимидазол; бензимидазол и подобное. Комплекс тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд настоящего изобретения является комплексным соединением, имеющим аксиальный лиганд и атом металла, координированные по соединению тиофурилпорфирина. Это соединение тиофурилпорфирина является циклическим соединением, образованным четырьмя пиррольным кольцами, в которых четыре метиновые группы связаны в -положении каждой и четыре атома азота расположены друг напротив друга по направлению к центру, соединение, содержащее по крайней мере одну тиофурильную группу в качестве заместителя метиновой группы(R в формуле (I. Другие заместители других метиновых групп могут быть либо той же тиофурильной группой, либо другой группой, такой как пиррольная группа, фурильная группа, меркаптофенильная группа, аминофенильная группа, гидроксифенильная группа, алкильная группа или арильная группа, или могут быть водородом. В качестве примера соединения тиофурилпорфирина, используемого в настоящем изобретении,можно привести [5,10,15,20-тетракис(2-тиофурил)]порфирин, [5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)]порфирин,-3 009451[5,10,15-трис-(2-тиофурил)-20-монофенил]порфирин, [5,10,15-трис-(3-тиофурил)-20-монофенил]порфирин,[5,10-бис-(2-тиофурил)-15,20-дифенил]порфирин, [5,10-бис-(3-тиофурил)-15,20-дифенил]порфирин, [5,15 бис-(2-тиофурил)-10,20-дифенил]порфирин, [5,15-бис-(3-тиофурил)-10,20-дифенил]порфирин, [5-моно-(2 тиофурил)-10,15,20-трифенил]порфирин и [5-моно-(3-тиофурил)-10,15,20-трифенил]порфирин. По крайней мере один из аксиальных лигандов (L в формуле (I соединения тиофурилпорфирина должен быть вышеупомянутым производным имидазола. Другие аксиальные лиганды могут быть либо производными имидазола, либо другими соединениями, например такими азотсодержащими аксиальными лигандами, как пиридин и его производные, анилин и его производные, гистидин и его производные и триметиламин и его производные, такими серасодержащими аксиальными лигандами, как тиофенол и его производные, цистеин и его производные и метионин и его производные, либо такими кислородсодержащими аксиальными лигандами, как бензойная кислота и ее производные, уксусная кислота и ее производные, фенол и его производные, алифатические спирты и его производные и вода. Комплекс тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд может быть образован как комплексное соединение внедрением атома металла (М в формуле (I в соединение тиофурилпорфирина, имеющее вышеупомянутые аксиальные лиганды. Для того, чтобы образовать это комплексное соединение, можно использовать обычный способ получения комплекса металла, такой как металлирование, для введения атома металла в центр комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд. Для образования полимерной пленки комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд на поверхности проводящего компонента можно использовать такие различные способы полимеризации,как электролитическая полимеризация, полимеризация в растворе и гетерогенная полимеризация. Среди них предпочтительной является электролитическая полимеризация. Более точно, полимерная пленка комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд может быть получена на поверхности проводящего компонента при электролитической полимеризации. Полимеризация проводится в процессе с двумя электродами (рабочий электрод и противоэлекрод) электролиза или (рабочий электрод, противоэлектрод и электрод сравнения) электролиза с тремя электродами, включающем электролиз при постоянном потенциале тока с тремя электродами, электролиз при постоянном потенциале с тремя электродами,электролиз при обратной развертке потенциала с тремя электродами, электролиз с импульсной подачей напряжения с тремя электродами с использованием такого подходящего фонового электролита, как перхлорат тетрабутиламмония (ПТБА: Bu4NClO4), перхлорат тетрапропиламмония (ПТПА: Pr4NClO4) или перхлорат тетраэтиламммония (ПТЭА: Et4NClO4), в таком органическом растворителе, как дихлорметан,хлороформ или четыреххлористый углерод, с использованием проводящего компонента в качестве рабочего электрода, в качестве противоэлектрода такой нерастворимый электрод, как электрод из благородного металла (например, Pt электрод), титановый электрод, угольный электрод или электрод из нержавеющей стали, и в качестве электрода сравнения насыщенный каломельный электрод (НКЭ), хлорсеребряный электрод или подобное. Предпочтительно, чтобы электролитическая полимеризация проводилась при электролизе или подобном с использованием трехэлектродной ячейки, например, как показано на фиг. 1. На фиг. 1 поз.1 представляет собой сосуд для ячейки; 2 - проводящий компонент; 3 - противоэлектрод; 4 - электрод сравнения; 5 - раствор комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд; 6 - потенциостат и 7 - XY рекордер. При использовании раствора комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд высокой концентрации можно использовать двухкамерную трехэлектродную ячейку, например, как показано на фиг. 2. На фиг. 2 номера 1-7 означают те же объекты, что и на фиг. 1, 8 означает раствор электролита и 9 является виалой с образцом. Принимая во внимание измерения in vivo, комплексные измерения, клиническую диагностику и лечение и подобное, для производства упрощенного электрода на анионы супероксида (электрод игольчатого типа) можно использовать электрод игольчатого типа 10 и трехэлектродную ячейку, например, как показано на фиг. 3(А) и 3(В). На фиг. 3 1 представляет собой сосуд для ячейки; 4 - электрод сравнения; 5 раствор комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд; 6 - потенциостат; 7 - Х-У рекордер; 8 раствор электролита; 9 - виала с образцом; 10 - электрод игольчатого типа; 11 - противоэлектрод; 12 конец проводящего компонента (площадь образованной полимерной пленки комплекса тиофурилпорфирина металла/аксиальный лиганд); 13 - электроизоляционный материал и 14 - провод противоэлектрода. Как показано на фиг. 3(С), этот электрод получен заполнением проводящим компонентом маленькой трубки, сделанной из электрически непроводящего материала 13. Эта маленькая трубка покрыта таким же материалом, как и металл, использованный для противоэлектрода 11. Электрод может быть использован в качестве электрода игольчатого типа, формируя полимерную пленку комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд на поверхности кончика 12 проводящего компонента. Толщина полимерной пленки комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд, соответственно, определяется согласно типу электрода и комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд и подобное. С точки зрения электродной активности, модификационной стабильности и подобного, предпочтительна толщина 10 мкм или менее. Предпочтительная проводимость составляет 10-3 См/см или более.-4 009451 Для того, чтобы получить упрощенный электрод на анионы супероксида (улучшенный электрод игольчатого типа), основанный на упрощенном электроде на анионы супероксида (электрод игольчатого типа), показанный на фиг. 3, с функцией удаления ненужного тока в теле, шума тока и подобного, и улучшенной чувствительности, отношением сигнал/шум (отношение S/N) и подобным, можно использовать, например, улучшенный электрод игольчатого типа 15, как показано на фиг. 4(А), и трехэлектродную ячейку, как показано на фиг. 3(А). На фиг. 4 поз.11 означает противоэлектрод; 12 - кончик проводящего компонента (площадь образованной пленки комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд); 13 - электроизоляционный материал; 14 - провод противоэлектрода; 15 - улучшенный электрод игольчатого типа; 16 - заземление и 17 - провод заземления. Как показано на фиг. 4(В), этот электрод имеет проводящий компонент, вставленный в электроизолирующий материал 13 (двухслойная структура). Электроизолирующий материал 13 расположен внутри материала против электрода 11 (трехслойная структура), материал противоэлектрода 11 расположен в электроизолирующем материале 13 (четырехслойная структура), и в итоге наружная поверхность маленькой трубки покрыта материалом, таким как металл, способный выполнять роль заземления (пятислойная структура). Покрытие действует как заземление 16. Элеутрод может быть использован в качестве упрощенного электрода для супероксид анионов (улучшенный электрод игольчатого типа) за счет образования металлпорфириновой полимерной пленки на поверхности тонкого конца 12 проводящего компонента. Толщина полимерной пленки комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд, соответственно, определяется согласно типу электрода и комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд и подобное. С точки зрения электродной активности, модификационной стабильности и подобного, предпочтительна толщина 10 мкм или менее. Предпочтительная проводимость составляет 10-3 См/см или более. Этот улучшенный электрод игольчатого типа может быть также использован для измерения композитных материалов и подобного. В таком случае, возможно создать электрод, имеющий структуру до десяти или более слоев. В качестве материала заземления могут быть использованы такие благородные металлы, как платина, золото и серебро, титан, нержавеющая сталь, такие коррозионноустойчивые сплавы, как железохромовый сплав, углерод или подобное. Поскольку заземление часто приводится в контакт с внутренней стороной живого организма, то предпочтителен материал высокой безопасности, такой как благородный металл (например, платина, золото, серебро) титан, нержавеющая сталь и углерод. Для использования электрода настоящего изобретения для определения анионов супероксида, особенно для определения концентрации анионов супероксида, предпочтительно объединить электрод с (1) противоэлектродом и электродом сравнения (трехэлектродный тип) или (2) противоэлектродом (двухэлектродный тип). В качестве материала этого противоэлектрода могут быть использованы такие благородные металлы, как платина, золото и серебро, титан, нержавеющая сталь, такие коррозионно-устойчивые сплавы, как железохромовый сплав, углерод или подобное. Поскольку противоэлектрод часто приводится в контакт с внутренней стороной живого организма, то предпочтителен такой материал высокой безопасности, как благородный металл (например, платина, золото, серебро), титан, нержавеющая сталь и углерод. В качестве электрода сравнения обычно могут быть использованы различные электроды сравнения,такие как серебро/хлоридсеребряный электрод и ртуть/хлоридртутный электрод. К тому же могут быть использованы другие материалы, такие как платина, золото и серебро, титан, нержавеющая сталь, такие коррозионно-устойчивые сплавы, как железохромовый сплав, углерод или подобное. Конкретный пример устройства для определения, который может быть использован для определения анионов супероксида, показан на фиг. 5. На фиг. 5 номера 1, 3, 4, 6 и 7 обозначают те же объекты,что и на фиг. 1, 18 обозначает измеряющий электрод (рабочий электрод), 19 обозначает микрошприц, 20 обозначает раствор для определения, 21 обозначает магнитную мешалку и 22 является мешалкой. Другой конкретный пример устройства для определения, используемый для определения анионов супероксида, показан на фиг. 6. На фиг. 6 номера 1, 6, 7 и 19-22 обозначают те же объекты, что и на фиг. 4,и 10 обозначает электрод игольчатого типа. Хотя электрод на анионы супероксида настоящего изобретения может быть использован в качестве электрода для обнаружения анионов супероксида с использованием вышеописанного устройства, электрод также может быть использован в качестве сенсора для определения концентрации анионов супероксида при использовании в комбинации с (1) противоэлектродом и электродом сравнения (трехэлектродный тип) или (2) противоэлектродом (двухэлектродный тип). Если сенсор для определения концентрации анионов супероксида в данной конфигурации используется, например, в системе, содержащей анион-радикалы супероксида, то металл в комплексе тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд, образующем полимерную пленку, восстанавливается анион-радикалами супероксида. Например, если металл является железом, то Fe3+ восстанавливается до Fe2+ анион-радикалами супероксида (формула (7. Если Fe2+, восстановленное анион-радикалами супероксида, электрохимически реокисляется (формула (8, в то время как электрод для определения концентрации поддерживается при потенциале (в случае трехэлектродной ячейки типа (1 или напряжении (в случае двухэлектродной ячейки типа (2 до степени, при которой может быть окислено Fe2+, ток (ток окисления), протекающий в этот момент, соот-5 009451 ветствует концентрации анион-радикалов супероксида. Таким образом, концентрация анион-радикалов супероксида, растворенных в растворе образца, может быть количественно определена из тока окисления. Конкретно, концентрация анион-радикалов супероксида может быть определена, основываясь на том же принципе вышеописанных формул (5) и (6). Поскольку электрод на анионы супероксида настоящего изобретения имеет полимерную пленку комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд на поверхности проводящего компонента, то не только такой каталитический яд, как пероксид водорода, мало влияет на электрод, но и полимерная пленка комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд прочнее по сравнению с электродом с обычной полимерной пленкой порфирина металла. Таким образом, электрод может выдержать повторное использование. Кроме того, поскольку полимерная пленка комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд получена электролитической полимеризацией или подобным, получение электрода настоящего изобретения в сравнении с обычным электродом является очень простым. Электрод настоящего изобретения может быть получен в форме, особенно подходящей для применения in vivo, например в форме игольчатого типа. Таким образом, электрод на анионы супероксида настоящего изобретения может не только определять анион-радикалы супероксида, но также и количественно определять анионы супероксида в любой среде, включая как среду in vivo, так и среду in vitro при комбинировании с противоэлектродом и электродом сравнения. Таким образом, электрод настоящего изобретения может быть широко использован в различных областях. Конкретнее, определением концентрации анионов супероксида in vivo, например, в крови могут быть установлены различные заболевания, такие как рак. С другой стороны, что касается применения в среде in vitro, то можно наблюдать условия разложения пищи измерением анионов супероксида и их концентрации в пище. Условия загрязнения воды также могут быть наблюдаемы определением анионов супероксида и их концентрации в водопроводной воде,сточной воде и подобном. Более того, концентрации супероксиддисмутазы (СОД), которая является ферментом с функцией удаления анион-радикалов супероксида и анионов, могут быть определены определением степени пропускания анион-радикалов супероксида при добавлении образца, содержащего СОД. Причина, по которой, как полагают, электрод на анионы супероксида может предотвращать отравление каталитическим ядом, таким как пероксид водорода, является следующей. Полагают, что такой каталитический яд, как пероксид водорода, отравляет вещество, координируясь по такому металлу, как железо, который является активным центром вещества. Если имидазол, который является аксиальным лигандом, предварительно координируется и занимает пятое или шестое координационное положение по железу, пероксид водорода не может скоординироваться по железу (поскольку первое и четвертое положения по железу уже скоординированы по пирролу или порфирину). Таким образом, анион-радикалы супероксида могут быть устойчиво измерены даже в присутствии пероксида водорода, потому что аксиальный лиганд, такой как имидазол, координируется по железу активного центра для предотвращения отравления пероксидом водорода. Пример Настоящее изобретение будет описано более детально в ссылочных примерах, примерах, сравнительных примерах и тестовых примерах, которые не должны толковаться как ограничивающие настоящее изобретение. Ссылочный пример 1. Синтез комплекса (1) тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд. 0,036 г бромида 5,10,15,20-тетракис-(3-тиофурил)порфирината железа(III) и 200 мкл 1-метилимидазола растворили в 1 мл перегнанного дихлорметана и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь выпарили досуха, используя испаритель, получив бромид бис-(1-метилимидазоло)-5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) (выход: 92%). УФ (CHCl3, нм, max): 419. Координация имидазола была подтверждена тем фактом, что длина волны УФ поглощения отличается от длины волны комплекса без имидазола (max=424 нм). К тому же гексакоординированная структура была подтверждена тем фактом, что в спектре магнитного кругового дихроизма циркулярно-поляризованного света угол поляризации в окрестности 580 и 600 нм уменьшается из-за координации имидазола. Фиг. 7 показывает УФ-спектр бромида 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) сырья. Фиг. 8 показывает УФ-спектр продукта бромид бис-(1-метилимидазоло)-5,10,15,20-тетракис(3 тиофурил)порфирината железа(III). Ссылочный пример 2. Синтез комплекса (2) металлтиофурилпорфирин/аксиальный лиганд. 0,041 г бромида 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) и 0,08 г 1-бензилимидазола растворили в 3 мл перегнанного хлороформа и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь выпарили досуха, используя испаритель (выход: 90%).-6 009451 УФ (CHCl3, нм, max): 418. Координация имидазола была подтверждена тем фактом, что длина волны УФ поглощения отличается от длины волны комплекса безимидазола (max=424 нм). Ссылочный пример 3. Раствор 50 мл пропионовой кислоты, 2,0 мл 3-тиофенкарбоальдегида и 1,4 мл пиррола нагревали с обратным холодильником при постоянном перемешивании при 90C в течение 1 ч. После реакции реакционный раствор оставили охлаждаться льдом до комнатной температуры, добавили по каплям 200 мл метанола. Осадок отделили фильтрацией, промыли метанолом и очистили колоночной хроматографией на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ). В результате был получен 5,10,15,20-тетракис(2) Затем в строгой атмосфере азота 100 мг восстановленного железа добавили к 10 мл бромоводородной кислоты (48%) и перемешивали смесь при 100C. После упаривания растворителя досуха добавили 250 мг 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирина и 200 мл диметилформамида и смесь перемешивали в течение 4 ч в атмосфере азота. Затем после добавления 200 мл хлороформа реакционный продукт промыли ионно-обмененной водой, дегидратировали и упарили досуха с последующей очисткой с использованием колоночной хроматографии на оксиде алюминия (проявляющий растворитель: хлороформ/метанол=20/1). После добавления к полученному элюату 48% бромоводородной кислоты смесь дегидратировали и упарили досуха с последующей перекристаллизацией, получив бромид 5,10,15,20 тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) (выход: 54%). УФ (CHCl3, нм, max): 424. Ссылочный пример 4. Усовершенствование способа синтеза бромида 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) ссылочного примера 3. В круглодонную колбу на 300 мл поместили 150 мл пропионовой кислоты, 8,0 мл 3-тиофенкарбальдегида и 5,6 мл пиррола. Получившийся раствор нагревали при перемешивании с обратным холодильником при 160C в течение 1 ч. После того, как реакционную смесь оставили охладиться до комнатной температуры, добавили 200 мл метанола, охлажденного до 0C. Образовавшийся осадок собрали фильтрацией под вакуумом и высушили при пониженном давлении (120C, 6 ч). Образовавшиеся кристаллы в виде порошка черного цвета растворили в хлороформе. Нерастворимые компоненты удалили фильтрацией и очистили колоночной хроматографией на силикагеле (проявляющий растворитель: хлороформ). После высушивания при пониженном давлении был получен продукт 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирин в виде кристаллов черно-фиолетового цвета (выход: 20%). 1H ЯМР (CDCl3, м.д.):-2,7 (с, 2 Н), 7,7 (т, 4 Н), 8,0 (м, 8 Н), 8,9 (с, 8 Н). Затем 6 мл бромисто-водородной кислоты (48%) поместили четырехгорлую колбу на 500 мл, внутри которой поддерживалась атмосфера чистого аргона. После добавления 200 мг измельченного железа смесь оставили реагировать при перемешивании при 90C. Раствор упарили и остаток высушили, получив твердый FeBr2, к которому в атмосфере чистого аргона добавили 150 мл диметилформамида (ДМФ) с последующим добавлением 150 мг 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирина. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч в атмосфере чистого аргона (140C). После отгонки ДМФ добавили 200 мл хлороформа, чтобы растворить твердое вещество. Полученный раствор промыли ионно-обмененной водой. После добавления 2 капель бромисто-водородной кислоты растворитель отогнали и остаток высушили при пониженном давлении (100C, 6 ч). Продукт бромид 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) был получен с выходом 74%. Пример 1. Получение электрода на анионы супероксида (1). Стеклоуглеродный (СУ) электрод (диаметр: 1,0 мм) отполировали, используя полирующее средство из оксида алюминия (0,05 мкм). После промывания водой электрод был дополнительно промыт метанолом. На поверхности данного электрода электролитической полимеризацией была сформирована полимерная пленка с использованием следующего электролитического раствора и метода получения стеклоуглеродного электрода с полимерной пленкой, в которой две молекулы имидазола скоординированы с 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфиринатом железа(III), образованным на поверхности (продукт изобретения 1). Пробный раствор. Бромид бис(имидазоло)-5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III), синтезированный в ссылочном примере 1, использовался как комплекс трифторпорфирин металла/аксиальный лиганд в концентрации 0,001 М. В качестве растворителя использовался (безводный) дихлорметан, содержащий 0,1 М перхлорат тетрабутиламмония (Bu4NClO4/ПТБА) в качестве фонового электролита. Кислород, растворенный в растворителе, удалили газообразным аргоном. Метод. Электролитическую полимеризацию проводили электролизом при обратной развертке потенциала в трехэлектродной ячейке, имеющей конфигурацию, показанную на фиг. 1 (рабочий электрод: СУ, проти-7 009451 воэлектрод: Pt нить, электрод сравнения: НКЭ). Диапазон развертки составлял от 0 до 2,0 В для НКЭ в случае получения электрода на анионы супероксида с использованием полимерной пленки, в которой две молекулы имидазола скоординированы с 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфиринатом железа(III); диапазон составлял от -0,2 до 1,8 В для НКЭ в случае получения электрода на анионы супероксида с использованием полимерной пленки, в которой две молекулы 1-бензилимидазола были скоординированы с 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфиринатом железа(III) из ссылочного примера 2. Скорость развертки составляла 0,05 В/с в обоих случаях. Число циклов развертки составляло 15 в обоих случаях. Циклические вольтамперограммы, полученные в данном электролитическом методе (кривые ТН), показаны на фиг. 9 и 10. Фиг. 10 представляет собой кривую ТН в течение электролитической полимеризации (продукт изобретения 1), полученную с использованием бис(имидазоло)-5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III) как комплекса трифторпорфирин металла/аксиальный лиганд. Результаты подтвердили,что полимерная пленка комплекса трифторпорфирин металла/аксиальный лиганд (комплекс, в котором две молекулы имидазола скоординированы с 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфиринатом железа(III была сформирована на поверхности СУ электрода. Сравнительный пример 1. Получение электрода сравнения на анионы супероксида. Стеклоуглеродный электрод, покрытый полимерной пленкой тиофурилпорфирина металла (сравнительный продукт 1), был получен таким же образом, как и ссылочный пример 3, с использованием тиофурилпорфирина металла бромида 5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил)порфирината железа(III), с которым не скоординировано никаких аксиальных лигандов, полученных в ссылочном примере 3. Тестовый пример 1. Определение количества анион-радикалов супероксида. Количество анион-радикалов супероксида определяли с использованием электродов продукта изобретения 1 и сравнительного продукта 1. Сначала электрод продукта изобретения 1 или сравнительного продукта 1 как рабочий электрод иPt нить как противоэлектрод поместили в емкость ячейки и серебряный/хлорсеребряный электрод(Ag/AgCl) использовали как электрод сравнения, составляя трехэлектродную ячейку для данного теста. Прибор, показанный на фиг. 5, был изготовлен с использованием трехэлектродной ячейки для теста в центре. В этом тесте диапазон развертки потенциала установили от -0,2 до 0,25 В (для Ag/AgCl) для электрода продукта сравнения 1 и от -0,5 до 0,5 В (для Ag/AgCl) для электрода продукта изобретения 1. Измерения были сделаны с использованием нескольких частот развертки Был приготовлен 2 мМ водный раствор гидроксида калия, содержащий 14,4 мМ ксантина и 10 мМTris буферный раствор, содержащий 10 мМ хлорида натрия (рН 7,5). Для приготовления 0,35 мМ раствора ксантина, который использовали в качестве тестового раствора, смешали 0,365 мл первого и 14,635 мл последнего. Кислород, растворенный в тестовом растворе, был удален с использованием газообразного аргона высокой чистоты. Далее тестовый раствор добавили в трехэлектродную ячейку для теста. Приложили потенциал 0,2 В(для Ag/AgCl), который является достаточно большим, чем окислительно-восстановительный потенциал каждого электрода. К тестовому раствору прибавили ксантиноксидазу (КОД) до конечной концентрации 0-100 мВ/мл. Были записаны изменение тока окисления во времени. Результаты представлены на фиг. 12 для продукта изобретения 1 и фиг. 11 для продукта сравнения 1. Перед использованием КОД подвергли диализу 10 мл кислого фосфатного буферного раствора (рН 7,0). Все измерения проводились при комнатной температуре. В результате можно увидеть, что электрод продукта сравнения подвергается повреждающему току пероксида водорода, приводящего к быстрому уменьшению определения тока анионов супероксида, тогда как неизменное определение тока наблюдается с электродом, полученным полимеризацией имидазол-координированного комплекса бромида бис(1-метилимидазолил)-5,10,15,20-тетракис(3-тиофурил) порфирината железа(III). Промышленное применение Электрод на анионы супероксида настоящего изобретения показывает не только превосходную характеристику электрода, снабженного полимерной пленкой комплекса порфирина металла, но также обладает способностью предотвращать отравление каталитическим ядом, таким как пероксид водорода. Соответственно, в любой из сред in vitro или in vivo данный электрод на анионы супероксида позволяет определять анион-радикалы супероксида, не подвергаясь какому-либо влиянию со стороны каталитического яда, такого как пероксид водорода. К тому же возможно количественно определить эти анионы супероксида, объединяя электрод с противоэлектродом или электродом сравнения. Таким образом, электрод может быть широко применим в различных областях. Например, при использовании in vivo из образцов активного кислорода и других активных радикалов могут быть определены различные заболевания в живом организме. С другой стороны, при использовании in vitro могут быть определены анионы супероксида и их концентрации в пище, на основе которых можно судить об условиях разложении пищи. Условия загрязнения воды также могут отслеживаться определением анионов супероксида и их концентрации в воде и подобном.-8 009451 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Сенсор для определения концентрации анионов супероксида, обладающий устойчивостью к каталитическому яду и в состав которого входят электрод, включающий проводящий компонент и пленку,полученную на поверхности проводящего компонента электролитической полимеризацией комплекса тиофурилпорфирин металла/аксиальный лиганд, представленного следующей формулой (1): где М является железом(III) или марганцем(III), по меньшей мере один из четырех R представляет собой тиофурильную группу, противоэлектрод и электрод сравнения, отличающийся тем, что по меньшей мере один из двух L представляет собой производное имидазола, имеющее коэффициент комплексообразования 104 М-2 или более, который образует устойчивый 5 координационный комплекс или 6 координационный комплекс. 2. Сенсор по п.1, отличающийся тем, что R является 2-тиофурильной группой или 3-тиофурильной группой. 3. Сенсор по п.1 или 2, отличающийся тем, что производное имидазола является алкилимидазолом или арилалкилимидазолом. 4. Сенсор по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что проводимость пленки, полученной электролитической полимеризацией комплекса металлтиофурилпорфирин/аксиальный лиганд, составляет 10-3 См/см или более. 5. Способ детектирования присутствия анионов супероксида в образце, включающий использование сенсора, в соответствии с любым из пп.1-4 для измерения тока в ходе реакции окислениявосстановления между металлом и анионом супероксида.