Моноклональное антитело s19 к поверхностному антигену сперматозоидов, антиген, выявляемый таким антителом, и содержащие его вакцина и спермицид

1 Область изобретения Данное изобретение относится к поверхностному антигену сперматозоидов, моноклональному антителу для него и применениям как моноклонального антитела, так и антигена. Конкретно, обеспечена противозачаточная (контрацептивная) вакцина с применением этого антигена в качестве иммуногена, а также стандарт для иммунотестов, а это моноклональное антитело находит применение в качестве спермицида и диагностического реагента. Предпосылки изобретения По существу непрерывное внимание сфокусировано на разработке усовершенствованных способов контрацепции. Одним из широко применяемых способов является использование спермицидов, по существу, химического барьера, который препятствует проникновению сперматозоидов в матку или яйцеклетку или ингибирует их активность, предотвращая тем самым оплодотворение. Одним из наиболее широко применяемых спермицидов является детергент,Nonoxinol-9. Сообщения указывают на увеличенную распространенность мочеполовых инфекций и шеечновлагалищного воспаления у женщин, применяющих этот детергентный спермицид. McGroarty et al., Journal of Urology,152 (3):831-833 (1994). В качестве альтернативы химическим детергентам авторы предложили применение моноклональных антител в качестве вероятных безопасных активных агентов для локальных применений, таких как использование в спермицидах для местного применения. См., например, Cone et al., Am. J. Reprod.Immun., 32:3,14-131 (1994). Исследования приводят к выводу, что кроме уменьшения или устранения нежелательных иммунных реакций,человеческие моноклональные антитела должны предоставлять безопасные спермициды, так как их доза и продолжительность нанесения могут легко регулироваться, местная доставка уменьшает до минимума системное воздействие и моноклональные антитела могут отбираться на безопасность и эффективность. Таким образом,действующие на сперматозоиды моноклональные антитела, доставляемые в виде локального спермицида, могут производить противозачаточные эффекты без отрицательных побочных эффектов, сопутствующих детергентным спермицидам. См. в общих чертах Alexander, Scientific American, Sept.:136-141 (1995). Поэтому,задачей в данной области продолжает быть обеспечение безопасного и эффективного спермицида, использующего моноклональные антитела. Большое разнообразие моноклональных антител исследовали в качестве потенциальных реагирующих со сперматозоидами агентов. Среди них находится моноклональное антителоS19 против сперматозоидов человека. Разработка этого моноклонального антитела отражена в(1987). Это антитело получали иммунизацией мышей гомогенатом спермы человека. В лаборатории авторов было обнаружено, что моноклональное антитело IgG1 сильно агглютинирует сперматозоиды человека, и затем оно было передано для дальнейшего изучения его характеристик во Всемирную Организацию Здравоохранения - Sponsored Workshops on Anti-SpermMonoclonal Antibodies. Моноклональное антитело S19 против сперматозоидов человека сильно агглютинирует сперматозоиды человека, ингибирует прочное связывание между сперматозоидами человека и zona pellucida (блестящей оболочкой (зоной) яйцеклетки и блокирует проникновение сперматозоидов в цервикальную слизь. Anderson, supra, Cone, supra, Mahoney etal., J. Reprod. Immunol., 19:269-285 (1991). Сильная агглютинация спермы этим антителом была продемонстрирована визуально на видеоленте. Эти открытия указывают на то, что родственный S19 антиген, участвующий во взаимодействиях гамет во время оплодотворения, может служить мишенью для аутоантител, которые способствуют иммунологическому бесплодию, и может быть кандидатом для разработки противозачаточной (контрацептивной) вакцины. Однако антитело S19 не было разработано далее ни в качестве инструмента для исследований, ни в качестве противозачаточного реагента. Не было произведено депонирование антителаS19, оно не было "очеловечено" для снижения возможности иммунологической реакции. Не проводились детальные исследования на этом моноклональном антителе и до настоящего времени оно остается по существу научным курьезом. Известны другие моноклональные антитела и антигены сперматозоидов. Моноклональное антитело MHS-10 и антиген, связываемый им, SP-10, интраакросомный антиген, который является кандидатом для применения как в диагностических средствах для сперматозоидов,так и в качестве противозачаточной вакцины,обсуждается в U.S. Patent 5 436 137, Herr et al.,включенном здесь в качестве ссылки. Однако в противоположность антигену SP-10 антиген,связываемый моноклональным антителом S19,антиген агглютинации сперматозоидов-1(SAGA-1), по-видимому, локализован на всей поверхности сперматозоида человека. Это решительно предполагает, что это моноклональное антитело будет связываться и агглютинировать во множественных сайтах по всей поверхности сперматозоидов. Работа по разработке вакцин с применением антигена SP-10 продолжается. Подобным образом, многие исследователи во всем мире продолжают поиски возможности разработки противозачаточных вакцин на основе антигенов сперматозоидов. См., например, Aitken et al,British Medical Journal, 49:88-99 (1993), Freemerman et al., Biol. Reprod., 50:615-621 (1994) иHerr, Fertility Control, pp. 431-452 (Second Edition 1994). В этой связи, продолжается работа на хорионическом гонадотропине человека (hCG) в качестве противозачаточной вакцины для женщин. Talwar, Current Opinion in Immunology,6:698-704 (1994) и European Patent 86304274.3. Хотя проводятся клинические вакцинные испытания этой потенциальной вакцины, используемый иммуноген hCG функционирует в качестве абортивного (вызывающего аборт) средства, т.е. иммунные ответные реакции, индуцируемые инокуляцией этой вакцины, индуцируют аборт раннего эмбриона или плода. Это может быть неприемлемой формой контрацептива для многих индивидуумов. В качестве альтернативы, разнообразные поверхностные антигены сперматозоидов использовали в исследованиях на моделях приматов и грызунов. Так, пониженные скорости оплодотворения получали при иммунизации тестживотных поверхностными антигенами сперматозоидов, такими как LDH-C4, (O'Hern et al.,Biol. Reprod., 52.331-339 (1995), PH-20, Primakoff et al., Nature, 335:543-546 (1988), RSA-1,O'Rand et al., J. Reprod. Immunol., 25:89-102Dev., 43:70-75 (1995). К сожалению, в случае приматов, наивысшая степень эффективности,наблюдаемая с антигеном сперматозоидов, составляет приблизительно 75% ингибирования оплодотворяющей способности, O'Hern et al.,supra. Таким образом, до сих пор не был идентифицирован антиген сперматозоидов человека,который функционирует в качестве противозачаточной вакцины с уровнем эффективности,сравнимым с уровнем эффективности пероральной контрацепции. Таким образом, целью специалистов в данной области остается обеспечение безопасной и эффективной противозачаточной вакцины с высокой степенью ингибирования оплодотворяющей способности, порядка уровня эффективности, обеспечиваемого пероральными контрацептивами. Кроме того, поскольку реципиенты противозачаточной вакцины будут нуждаться в периодическом мониторинге антител в сыворотке для определения, являются ли они "безопасными", желательным является использование антигена SAGA-1 в качестве мишени в тестах для измерения концентрации антител в реципиентах этой вакцины. Имеющиеся в свободной продаже ("overthe counter") тест или диагностические наборы для обнаружения гормонов, связанных с беременностью (hCG и других), получили широко распространенный успех на рынке в качестве альтернативы или первой стадии относительно потенциально смущающих, неудобных и дорогих визитов в медицинские учреждения. В последние годы внимание было сфокусировано на тестах на присутствие и концентрацию сперматозоидов в эякулятах пользователей. Как с точ 003531 4 ки зрения консультирования по способности к оплодотворению, так и клинического диагноза в случае изнасилования или для целей тестирования на присутствие и эффективность вазэктомии, стал все более желательным удобный тестнабор, который мог бы безопасно и надежно применяться дома для обнаружения сперматозоидов в пробе. Такой тест-набор, использующий моноклональное антитело MHS-10 для интраакросомного антигена сперматозоидов SP10, описан в U.S. Patent Application Serial No. 08/231 675, который включен здесь в качестве ссылки. Антитело S19 является эффективной альтернативой связывания с антителом MHS-10 для применения в диагностических средствах сперматозоидов человека. Сущность изобретения Вышеописанные цели выполнены посредством применения "очеловеченной" рекомбинантной версии моноклонального антитела S19,продуцируемое гибридомой АТСС НВ-12144, и очистки и использовании соответствующего связываемого им антигена, SAGA-1, в качестве активных агентов. Моноклональное антитело,мобилизованное посредством подходящего носителя, обеспечивает эффективный связывающий агент в качестве спермицида и в качестве диагностического средства сперматозоидов человека. Антиген SAGA-1, гликопротеин сперматозоидов человека, распределенный по всей поверхности спематозоида, обеспечивает эффективный иммуноген, а также стандарт для тестирования генерирования контрацептивных антител в субъектах, подвергающихся вакцинной терапии. Для обеспечения эффективного спермицидного геля или крема моноклональное антитело должно быть обеспечено в эффективном носителе. Среди других носителей, доступных для исследования, находятся нефосфолипидные липосомы, изготовленные в сферическом виде,для доставки антигена или антитела. Один из коммерческих вариантов доступен в настоящее время из Novavax, Inc. of Rockville, Maryland под товарным названием NOVASOMES. Указанные моноклональные антитела S19 могут быть связаны с поверхностью этих положительно заряженных липосом. Могут быть приготовлены другие носители и композиции для агглютинации сперматозоидов. Очистка антигена SAGA-1 является первой стадией в приготовлении эффективной вакцины. Очищенный антиген, включенный в фармацевтически приемлемый носитель, может быть введен пациентам, желающим получить вакцинацию для контрацепции. Повторяемая вакцинация приводит к образованию антител против сперматозоида, высокоэффективных в связывании сперматозоидов. Для мониторинга развития эффективного уровня антител очищенный антиген может использоваться в качестве тест 5 стандартного реагента для определения присутствия и количества антител, присутствующих у пациента, с применением общепринятых диагностических средств. Краткое описание фигур Фиг. 1 - фотография результатов Вестернблот-анализа, полученных реакцией rtiAb S19 сSAGA-1; фиг. 2 - фотография результатов иммуноблота электрофореза в ДСН-ПААГ распределения SAGA-1 в фазе Тритона Х-114; фиг. 3 - нуклеотидная последовательность легкой цепи Каnnа mAb S19, полученная анализом последовательности; фиг. 4 - фотография Вестерн-блоттинганализа препарата SAGA-1, связанного с колонкой с mAb 519-иммуноматриксом; фиг. 5 - последовательность нуклеотидных оснований для тяжелой цепи mAb S19, полученная анализом последовательности. Подробное описание изобретения Данное изобретение включает моноклональное антитело S19, продуцируемое гибридомой АТСС НВ-12144, антиген, который оно связывает, SAGA-1, спермицид, использующий это моноклональное антитело в фармацевтически приемлемом носителе, противозачаточнуюSAGA-1 в качестве иммуногена, и диагностические тесты и наборы, использующие связанное антитело S19 в качестве диагностического средства для определения концентрации сперматозоидов и SAGA-1, в качестве стандартного реагента для определения развития антител в ответ на вакцинацию этой вакциной, и для родственных применений, каждый из этих объектов изобретения рассмотрен ниже. Хотя антитело, белок и их применения рассматриваются по отдельности, данное изобретение происходит из общего понимания, что белок SAGA-1 широко распределен по всей поверхности сперматозоидов и положительно связывается моноклональным антителом S19, которое, по-видимому, блокирует функционирование сперматозоидов на множественных стадиях в процессе оплодотворения, в том числе ингибирует подвижность сперматозоидов и взаимодействия гамет. Моноклональное антитело S19 Как отмечалось выше, моноклональное антитело S19, хотя и нигде не доступное публично ранее, было субъектом исследования и предыдущих публикаций. Исходное антитело S19 было получено иммунизацией мышей гомогенатами сперматозоидов человека. Это моноклональное антитело против сперматозоидов человека сильно агглютинирует сперматозоиды человека,ингибирует прочное связывание между сперматозоидами человека и блестящей зоной яйцеклетки, блокирует проникновение сперматозоидов в цервикальную слизь и индуцирует феномен встряхивания сперматозоидов. 6 Моноклональное антитело S19 было депонировано, согласно условиям Будапештского Договора, в АТСС 26 июня 1996 г. под Депозитным номером НВ 12144. Насколько известно заявителю, такое депонирование было сделано впервые. Способность моноклонального антителаS19 сильно агглютинировать сперматозоиды человека была продемонстрирована in vitro. Агглютинацию анализировали видеомикроскопией. Был сделан видеофильм. Демонстрация агглютинации Для каждого эксперимента сперму человека разбавляли до конечной концентрации 20 миллионов сперматозоидов/мл и асцит разбавляли 1:10. Сперматозоиды и асцит смешивали в пробирке Эппендорф и затем помещали в гемоцитометр. Результаты с асцитом S19 отмечались фотографией по истечении времени. Результаты с нуль-асцитом отмечались в фактический момент времени. При времени 0 сперматозоиды были свободно плавающими. После 10 мин сперматозоиды были полностью агглютинированными. В качестве контроля использовали жидкость нульасцита. (Время D относится к помещению сперматозоидов на предметное стекло и началу фотографии). Сперматозоиды являются свободно плавающими. Видны остатки клеток и круглые клетки. В контроле после 10 мин не обнаружены изменения подвижности или степени агглютинации. Эти результаты свидетельствуют о том,что моноклональное антитело S19 связывает и агглютинирует сперматозоиды человека при множественных сайтах по всей поверхности сперматозоидов. Полная агглютинация всех сперматозоидов свидетельствует о том, что mAb против SAGA-1 действует как эффективное сдерживающее средство для функции сперматозоидов и, следовательно, для оплодотворения. Приготовление спермицида Как отмечалось, литература теоретизирует о множестве спермицидов на основе моноклональных антител. Подходящие носители описаны в Cone и Alexander, supra. Заявители разработали особый носитель для предоставленияmAb 519 в агглютинирующей форме с применением коммерчески доступной липосомной системы доставки, доступной из Novavax, Inc. ofNovasomes. Эти липосомы изготовлены специально для доставки антигенов или антител.Novasome, содержащие нативные молекулы моноклональных антител S19, связанные с поверхностью нефосфолипидных положительно заряженных липосом, функционируют эффективно в качестве спермицида в спермицидном геле. Композицию Novasome тестировали при помощи описанного теста агглютинации сперматозоидов. При разведении 1:10 носитель No 7vasome агглютинировал сперматозоиды с той же эффективностью, что и при разведении 1:20 асцитической жидкости S19. Эти результаты свидетельствуют о том, что моноклональное антитело S19 оказывает такое же действие на функцию сперматозоидов при включении в коммерчески доступные системы доставки, что и в нативной жидкости. Специалистам в данной области доступны и альтернативные системы доставки. Среди них следует отметить конъюгированные с липидами пептиды, см., например, Deres et al., Nature,342:561-564 (1989), и ISCOM, см., например,Takahashi, Nature, 344:873-875 (1990). Другие препараты, в том числе гидрофобные эмульсии и сапонины, были разработаны в прошлом для процессинга и предоставления специфических пептидов и могут использоваться в связи с антителами спермицида, описанными здесь. См.,например, Raychaudhuri et al., Proceedings National Academy of Science USA, 89:8308-8312(1992) и Newman et al., J. Immunol. 148:23572362 (1992). Могут быть использованы другие носители, в том числе предоставление антител на мембране, такой как мембрана, экспрессируемая рекомбинантным вирусом (т.е. рекомбинантные вирусные конструкции, в которых ДНК, кодирующая антитело, см., infra, экспрессируется в рекомбинантной клетке вместе со структурным белком мембраны) . Из доступных многочисленных носителей,кроме нефосфолипидных липосом, описанных выше,желательными свойствами обладают ISCOM(иском, иммуностимулирующие комплексы),обычно используемые в вакцинах для представления (презентирования) антигенов. ISCOM образуют клеткоподобные мембранные структуры, в которых или на которых могут быть представлены антитела. ISCOM использовали ранее в связи с представлением (презентацией) антигенов, но они также презентируют белки антител в открытой вирусподобной структуре. В этом отношении, известно, что другие носители,известные для представления активных белков,в том числе сополимерные сферы, и вирусподобные частицы (VLP) дают результаты,сходные с иммуностимулирующими комплексами, или ISCOM. Конечно, система, в высшей степени общепринятая, присоединение антитела через связывающий агент к поверхности микросферы, может быть подходящим образом использована в сочетании с приемлемыми способами изготовления для приготовления гелей и кремов, совместимых с этим подходом. Таким образом, сущность спермицида заявителей состоит во включении, в подходящем носителе, достаточной концентрации mAb S19 в подходящий носитель для эффективного ингибирования (агглютинации или связывания) всех сперматозоидов, присутствующих в эякуляте.mAb S19 Гибридомные клетки MHS-8, секретирующие S19, выращивали и считали таким образом, чтобы 10 миллионов клеток были обработаны для сбора РНК с использованием набораFastTrack 2.0 (Invitrogen). Общую РНК сразу выделяли из этих клеток с применением лизиса детергентом и буфера для деградации белка. Затем выделяли поли(А)+ РНК с применением модифицированного протокола Aviv and Leder,в котором мРНК связывали с олиго dT-смолой. Затем эту смолу промывали низкосолевом буфером для удаления посторонней общей РНК и поли(А)+ РНК элюировали из смолы. Спектрофотометрический анализ при 260 и 280 нм выявил конечную концентрацию 1,84 мкг/мкл поли (А) + РНК. Обратная транскрипция и амплификация поли(А)+ РНКS19, двухвалентное антитело, функционирует как агглютинин сперматозоидов человека благодаря его способности пер-крестно связывать эпитопы на поверхности сперматозоидов. Для сохранения этой функции в рекомбинантном белке идентифицировали эпитоп-узнающие области или определяющие комплементарность участки (CDR) этого антитела. Были приготовлены четыре мышиных олигонуклеотида дляIgG1-специфических субъединиц тяжелой цепи и лгкой (каппа) цепи. Эти олигонуклеотиды были сконструированы таким образом, что они могли амплифици-ровать только вариабельные области (приблизительно первые 360 пар основания) S19, которые содержат CDR. Они были следующими: 1. 5'-конец тяжелой цепи: Олигонуклеотиды тяжелой цепи получали из набора Ig-Prime (Novagen) и аббревиатуры для нуклеотидов были следующие: R=A или G,1=инозин и K=G или Т. Все олигонуклеотиды разводили до конечной концентрации 1,0 мкг/мкл dH2 О. Обратную транскрипцию и амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции поли (А) + РНК гибридомы S19 проводили в виде одной реакции с применением системыAccess RT-PCR от Promega. Вкратце, 5 мкг поли(А)+ РНК гибридомы S19, 1 мкг каждого из соответствующих праймеров (праймеры 1 и 2 для тяжелой цепи, праймеры 3 и 4 для легкой цепи), 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 10 мкл 5 х буфера для обратной транскрипции AMV, 2 мкл 25 мМ MgSO4, 1 мкл обратной транскриптазыAMV, 1 мкл полимеразы Tfl и 30 мкл не содержащей нуклеаз dH2O объединяли в центрифужной пробирке на 0,5 мл. Реакционную смесь инкубировали при 48 С в течение 45 мин с последующей инкубацией при 94 С в течение 2 мин. Реакция содержала 40 циклов: 94 С в течение 30 с, 60 С в течение 2 мин, 68 С в течение 2 мин. 7 мин инкубировали при 68 С с последующим конечным циклом. Амплифицированные продукты анализировали на 2% агарозном геле (фиг. 1). Дорожка 1, ДНК-маркер 1 т.п.н. изStratagene; дорожка 2, фрагмент легкой цепи и дорожка 3, фрагмент тяжелой цепи. Полосы тяжелой и легкой цепей обладали приблизительно той же подвижностью, что и маркер 396 п.н., как и ожидалось, так как праймеры для легкой цепи амплифицируют первые 384 п.н.(360 п.н. с дополнительными сайтами рестриктаз), а праймеры для тяжелой цепи амплифицируют дополнительные 60 п.н. Клонирование амплифицированных фрагментов антитела S19 в вектор Полосы тяжелой и легкой цепей из фиг. 1 вырезали из геля и элюировали с применением фильтров Ultrafree MC (Millipore). Эти очищенные фрагменты последовательно амплифицировали при помощи еще 40 циклов ПЦР с полимеразой Pfu вместо полимеразы Tfl. Опять фрагменты очищали на геле и ресуспендировали в 25 мкл dH2O. Клонирование проводили с применением системы pCR-Script SK(+) (Stratagene). Этот вектор использует лигирование тупых концов амплифицированных Pfu-c фрагментов ПЦР для включения кДНК в сайт рестриктазы Srfl в этом векторе. Srfl представляет собой новую рестриктазу редко встречающимся сайтом расщепления, которая узнает последовательность 5'GCCCGGGC3'. Для гарантии, что фрагменты тяжелой и легкой цепей не будут расщеплятьсяSrfl, 1 мкл каждой кДНК объединяли с 1 мкл фермента Srfl, 1 мкл 10 х реакционного буфера и 7 мкл dH2O и выдерживали в течение 1 ч при 37 С. Ни один фрагмент не расщеплялся этим ферментом. Затем проводили клонирование объединением 1 мкл вектора pCR-Script, 1 мкл 10 х буфера для pCR-Script, 0,5 мкл 10 мМ rАТР, 5,5 мкл кДНК тяжелой или легкой цепи, 1 мкл ферментаSrfl и 1 мкл ДНК-лигазы Т 4. Реакционные пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем нагревали при 65 С в течение 10 мин. Суперкомпетентные клетки Epicurean ColiXL1-Blue MRF Kan оттаивали на льду и помещали аликвоты 40 мкл в предварительно охлажденные пробирки на 15 мл. Затем добавляли 0,7 мкл 1,44 М -меркаптоэтанола к клеткам, которые инкубировали на льду в течение 10 мин. Для каждой из указанных выше реакцией клонирования к клеткам добавляли 2 мкл и оставляли их на льду еще в течение 30 мин. Затем 10 клетки и смесь кДНК нагревали в бане 42 С в течение 45 с и переносили на лед на 2 мин. После добавления 0,45 мл среды SOC клетки встряхивали в водяной бане при 37C в течение 1 ч. Затем эти клетки рапределяли на чашки Петри со средой LB/ампициллин/метициллин/ Х-gal/IPTG для отбора на устойчивые к антибиотикам колоний и инкубировали в течение ночи при 37 С. Позитивные колонии каждого клона отбирали и выращивали в 5 мл культурSOC для очистки плазмид. Плазмиды очищали с применением 20 колонок Qiagen-tip (Qiagen). 5 мл клеток центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об./мин. Избыток среды отсасывали и осадок клеток ресуспендировали в 0,3 мл буфера Р 1. Добавляли буфер Р 2 и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляли 0,3 мл охлажденного буфера Р 3 и смесь инкубировали на льду в течение 10 мин. Во время этого инкубирования колонки Qiagen уравновешивали нанесением 1 мл буфера QBT. Затем пробы клеток центрифугировали в течение 15 мин при 10000 об./мин, и супернатант удаляли и наносили на 20 колонок Qiagen-tip. После того как супернатанты полностью вошли в смолу колонок под действием силы тяжести, колонки промывали 4 мл буфера QC и элюировали 0,8 мл буфераQF. Для осаждения плазмидной ДНК к элюанту колонки добавляли объем 0,56 мл изопропанола и смесь центрифугировали при 10003 об/мин в течение 30 мин. Затем полученный осадок ДНК ресуспендировали в 25 мкл dH2O. Для подтверждения присутствия вставки кДНК в очищенных плазмидах каждый клон расщепляли двумя рестриктазами. Используемыми рестриктазами были Noti и EcoRl, которые имеют сайты рестрикции на 5' и 3' конце,соответственно, клонирующего вектора pCRScript. Если вставка присутствует, расщепление этими ферментами будет вырезать ее из хозяина-вектора. 1,5 мкл каждого клона объединяли с 0,75 мкл Noti, 0,75 мкл EcoRl, 1,5 мкл 10 х буфера, 10,5 мкл dH2O и инкубировали при 37 С в течение 90 мин. Затем продукты расщепления разделяли на 2% агарозном геле и клоны, содержащие вставку, секвенировали. Анализ последовательности клонов тяжелой и легкой цепей Позитивные клоны, полученные, как описано выше, секвенировали с применением набора Fidelity kit (Oncor). Каждая реакция секвестрования состояла из 5 мкл плазмидной ДНК, 1 мкл праймера Т 3 (который лежит слева (против хода транскрипции) от 5' сайта клонирования на векторе pCR-Script и 2 мкл dH2O. Их нагревали до 95 С в течение 5 мин, кратковременно центрифугировали, добавляли 2 мкл буфера для отжига и реакции инкубировали при 37 С в течение 15 мин. Затем реакции метили добавлением 3 мкл реакционного буфера, 1 мкл 33 Р-АТР, 2 мкл ДНК-полимеразы Т 4 и 2 мкл dH2O. 11 Эту смесь инкубировали при 40 С в течение 15 мин и затем добавляли 6 мкл дополнительной смеси Т 4. Из этой реакции мечения 5,5 мкл добавляли в каждую из 4 пробирок, содержащих 2 мкл каждой из смеси А, С, G или Т-терминации и инкубировали при 40 С в течение 5 мин. Реакции останавливали добавлением 5 мкл раствора протеиназы К и нагревали до 95 С перед нанесением на 6% акриламидный секвенирующий гель. Затем проводили электрофорез в течение 2 ч при 2000 В, сушили на фильтровальной бумаге Whatman 3MM под вакуумом и экспонировали на рентгеновской пленке в течение ночи при комнатной температуре. После проявления пленки гели прочитывали на боксе с подсветкой. Путем сравнения расшифрованных последовательностей клонов с известными мышиными последовательностями IgG1 было обнаружено, что клоны легкой цепи представляли собой аберрантную легкую цепь, амплифицированную из гибридомы sp2/0. Последовательность тяжелой цепи выделяли и эта последовательность оснований показана на фиг. 5. Продукты расщепления кДНК рестриктазами для удаления эндогенных антител Для отделения легкой цепи каппа S19 от аберрантной гибридомной легкой цепи RT-PCRpeакции повторяли. Аберрантную последовательность анализировали и обнаружили, что она имеет редкий сайт рестрикции Van91I(5'CCANNNNNTGG3') в одном из CDR. Предполагая, что эта легкая цепь S19 присутствовала в амплифицированной RT-PCR смеси кДНК из гибридом, эту смесь расщепляли Van91I (NewEngland Biolabs). Реакция расщепления состояла из 1 мкл Van91I, 3 мкл кДНК, 1 мкл 10 х реакционного буфера и 5 мкл dH2 О. Реакцию инкубировали в течение ночи при 37 С для гарантии полного расщепления. Любая кДНК, нерасщепляемая этим ферментом, должна была быть правильной легкой цепью каппа S19. Как показано на фиг. 2, продукт расщепления анализировали на 2% агарозном геле. (Дорожка 1 - маркер ДНК 1 т.п.н. Stratagene, дорожка 2-3 мкл нерасщепленная кДНК и дорожка 3 - реакция расщепления). В дорожке 3 основная часть реакции была расщеплена на 2 фрагмента,но имелась слабая полоса при 396 п.н., представляющая нерасщепленную предполагаемую легкую цепь S19. Эту полосу вырезали из геля и очищали, как описано выше, затем амплифицировали при помощи 40 циклов ПЦР с полимеразой Pfu, как описано выше. Затем эту кДНК клонировали в вектор pCR-Script, как описано выше, и отбирали шесть позитивных клонов тем же самым способом посева. Опять эти позитивные клоны выращивали, плазмиду очищали и расщепляли рестриктазами для подтверждения присутствия вставки. 12 Автоматизированное секвенирование легкой цепи каппа Секвенирование новых клонов легкой цепи проводили в University of Virginia BiomolecularResearch Facility с применением автоматизированного секвенатора ДНК ABI Prism 377. Для каждого клона 100 нг кДНК и 3,2 пмоль праймера Т 3 объединяли в общем объеме 12 мкл и помещали в прибор. Там в те же самые пробирки добавляли 4 меченых красителем дидезоксинуклеотида и полимеразу AmpliTaq FS. Всю реакцию наносили на одну дорожку для электрофореза в 5,0% акриламидном геле 36 см для хорошего считывания. Фактическое время обнаружения подвергнутых электрофорезу индивидуальных фрагментов достигалось лазерным сканированием с получением изображения при помощи камеры CCD. Результаты секвенирования из этого прибора согласуются с легкими цепями каппа из базы данных Gen Bank, и правильная последовательность оснований легкой цепи показана на фиг. 3. Последовательности кДНК тяжелой и легкой цепей S19 в АВ могут использоваться с применением общепринятой технологии для обеспечения рекомбинантных антител, в том числе антител с делециями сайтов и делециями и добавлениями доменов. Белок SAGA-1 Депонированные теперь mАb S19 эффективно связывают и агглютинируют сперматозоиды человека. Результаты сфотографированных тестов агглютинации ясно показывают, что связывание и агглютинация имеют место во множественных сайтах на всей поверхности сперматозоидов. Кроме эффективного спермицида, обеспечиваемого mAb S19, связываемый антиген, SAGA-1, является, как доказывают результаты, эффективным вакциногеном. В частности, способность генерировать антитела к белку , SAGA-1 в качестве антигена/иммуногена должна обеспечить женщин эффективной защитой против оплодотворения, т.е. контрацептивной вакциной. Тот же самый антиген может использоваться в качестве стандартного тестреагента для мониторинга эффективности вакцинной схемы. Так, вакцинированные женщины могут обследоваться периодически и пробу жидкости тестируют против известного количества SAGA-1, в общепринятых формах тестов, в том числе в ELISA и в Вестерн-блоттинганализе и в блоттинг-анализе по Саузерну. Позитивное связывание отражает образование антител, которые связывают белок SAGA-1, и,следовательно, защиту против оплодотворения. Путем использования SAGA-1 в качестве стандартизованного теста и тестирования на количество связывания могут быть измерены титр или концентрация образованных антител. Так как адекватные титры могут быть установлены на основании теста агглютинации, обсуждаемого выше, тест с применением белка SAGA-1 в качестве стандарта, отражающего адекватно тит 13 ры, является подтверждением достижения состояния отсутствия способности к оплодотворению, которое затем должно только поддерживаться на протяжении желаемого периода бесплодия. Идентификация белка SAGA-1 Моноклональное антитело S19 идентифицирует SAGA-1 как ряд низкомолекулярных гликопротеинов при помощи Вестерн-блотанализа (фиг. 1). Экстракт промытых сперматозоидов человека готовили в 1% ДСП и разделяли при помощи восстанавливающего электрофореза в ДСН-ПААГ. Моноклональное антитело S19 реагировало с рядом перекрывающихся полос в диапазоне приблизительно 15-25 кДа(дорожка 3). Иммунореактивность S19 с родственным антигеном устранялась обработкой 10 мМ периодной кислотой (дорожка 6), тогда как на реактивность моноклонального антителаMHS-10 с пептидным эпитопом белка SP-10 эта обработка не влияла (дорожки 2 и 5) . Этот факт указывает на то, что эпитоп, узнаваемый моноклональным антителом S19, является углеводной частью молекулы. (фиг. 1; дорожка 1, окрашивание амидо черным; дорожки 2 и 5, MHS10; дорожки 3 и 6, 319; дорожки 4 и 7, нульасцит; дорожки 2-4, без обработки периодной кислотой; дорожки 5-7, полоски иммуноблота,обработанные периодной кислотой; М, маркеры молекулярной массы в кДа: 97,4, 68, 43, 29, 18,4,14,3). Кроме того, обработка ДСН-экстракта сперматозоидов протеиназой К разрушала иммунореактивность 519 (данные не показаны),указывая на то, что антиген S19, по-видимому,является гликопротеином. Идентифицированный при помощи S19 гликопротеин был назван антигеном агглютинации сперматозоидов-1(SAGA-1) на основании его способности сильно агглютинировать сперматозоиды человека. Способ высокого обогащения SAGA-1 Характеристики растворимости SAGA-1 указывают на то, что он является гидрофобным интегральным (неотъемлемым) мембранным белком. Реактивность S19 не детектировалась в экстрактах сперматозоидов человека, полученных с высокой концентрацией соли (1 М NaCl или 0,6 М КСl) и/или с мягким неионогенным детергентом (0,1% NP-40 или Тритоном Х-100). Эти результаты показали, что SAGA-1 не экстрагируется при обработках, классически используемых для удаления периферических белков. Дальнейшее доказательство, что SAGA-1 существует в виде интегрального мембранного белка, получили с применением распределения в фазе Тритона Х-114, как описано Bordier(1981). Неионогенные детергенты, такие как Тритон Х-114, солюбилизируют интегральные мембранные белки замещением нормального липидного окружения. Тритон Х-100 образует небольшие мицеллы при 0 С при диспергировании в водном растворе выше его критической 14 мицеллярной концентрации. Гидрофобные интегральные мембранные белки включаются в эти мицеллы, тогда как гидрофильные белки остаются в водном окружении. При нагревании такого раствора мицеллы увеличиваются в размере и выходят из раствора, образуя обогащенную детергентом фазу, которая может быть отделена от водного раствора центрифугированием. Bordier (1981) использовал этот способ для демонстарции того, что большинство интегральных мембранных белков распределяются с фазой детергента, тогда как гидрофильные белки остаются в водной фазе. Для исследования распределения SAGA-1 в фазе Тритона X-114 промытые сперматозоиды человека экстрагировали в 1% Тритон Х-114, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl при 4 С и центрифугировали для удаления остатков клеток. После трех циклов фазового распределения эквивалентные количества исходного экстракта сперматозоидов, фазу детергента и водную фазу анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ и иммуноблоттингом (фиг. 2). Специфический для сперматозоидов/яичек человека белок SP10, периферический, акросомный мембранный белок служил в качестве контроля; реактивность моноклонального антитела MHS-10 с SP-10 детектировали в водной фазе. Реактивность S19 детектировали в исходном экстракте сперматозоидов и в фазе детергента, но не в водной фазе. Эти результаты показывают, что моноклональное антитело S19 реагирует с гидрофобным,интегральным мембранным гликопротеином. Окрашивание амидо черным показало, что большая часть общих белков сперматозоидов остается нерастворимой в водной фазе, тогда как небольшая часть белков распределяется с Тритоном Х-114. Таким образом, распределение с фазой Тритона Х-114 будет применимо в качестве начальной стадии в очистке нативногоSAGA-1. Замещение детергента является необходимым для очистки Биохимические свойства детергента Тритона Х-114 не способствуют последующим способам очистки. При требуемой концентрации этого детергента Тритон Х-114 включает белок в большие мицеллы, которые препятствуют связыванию белка с аффинным матриксом. Кроме того, Тритон Х-114 не может использоваться при комнатной температуре. Таким образом,белок в экстракте Тритона Х-114 осаждали ацетоном -20 С и ресуспендировали в 0,5% октилглюкозиде, TBS (10 мМ Трис-HCl [рН 7,4], 150 мМ NaCl). Октилглюкозид может быть использован при комнатной температуре и требуемая концентрация не ингибирует взаимодействия белок-иммуноматрикс. Моноклональное антитело S19 сшивали сProtein G-Sepharose с применением дигидрохлорида диметилпимелимидата, как описано подробно ниже. Этот иммуноматрикс и гранулыProtein G-Sepharose без пришитого моноклонального антитела, негативный контроль на специфичность антител, инкубировали с октилглюкозидным экстрактом. Связанные фракции подвергали Вестерн-блоттингу с моноклональным антителом S19 (фиг. 4). SAGA-1 идентифицировали в октилглюкозидном экстракте и во фракции, которая связана с иммуноматриксом, но не во фракции, элюированной из гранулProtein G-Sepharose без антитела. Эти результаты указывают на то, что SAGA-1 связан специфически с иммуноматриксом. Полосы приблизительно 42 кДа, наблюдаемые в каждой дорожке окрашенного серебром геля, были, как было показано, примесями, присутствующими в буфере для нанесения на гель. (фиг. 3; дорожки 13, окрашивание серебром; дорожки 4-6, Вестерн-блот; дорожки 1 и 4, октилглюкозидный экстракт, инкубированный с иммуноматриксом; дорожки 2 и 5, фракция белка, который связан с иммуноматриксом; дорожки 2 и 5, фракция белка, который связан с иммуноматриксом ProteinG-S19; дорожки 3 и 6, фракция белка, который связан с гранулами Protein G-Sepharose только). Протокол для иммуноаффинной очисткиSAGA-1 из сперматозоидов человека Получение экстракта сперматозоидов: Дайте 20-30 эякулятам человека ожижиться при комнатной температуре, промойте дважды центрифугированием при 400 х g со средой Хема F10, забуференной 0,1 М Hepes (pH 7,4) и храните в замороженном виде до использования. Разделение фаз. Объедините оттаявшие осадки и экстрагируйте при 4 С в TBS (10 мМ Трис-HCl [рН 7,4], 150 мМ NaCl), содержащем 1,7% Тритон Х-114, и центрифугируйте при 13000 х g для удаления остатков клеток. Нагрейте экстракт при 30 С в течение 3 мин и центрифугируйте при 300 х g в течение 3 мин для разделения детергентной и водной фаз. Повторно распределите каждую фазу дважды для гарантии полного разделения. Осветлите конечную фазу детергента ультрацентрифугированием при 100000 х g для удаления нерастворимых клеточных остатков. Иммуноблоттинг с S19 должен подтвердить, что SAGA-1 распределен с фазой детергента. Осаждение ацетоном и ресуспендирование в октилглюкозиде. Для осаждения белка в экстракте Тритона Х-114 добавьте 8 объемов ацетона -20 С, смешайте и храните от 4 ч до ночи при -20 С. Соберите осадок центрифугированием при 3000 х g, декантируйте супернатант и дайте осадку высохнуть на воздухе. Ресуспендируйте осадок в 0,5% октилглюкозиде, TBS при двойном исходном объеме экстракта Тритон Х-114. Ультрацентрифугируйте при 100000 х g в течение 1 ч при 4 С для удаления нерастворимых белков. Удалите супернатант для применения в аффинной хроматографии. Получение S19-иммуноматрикса. Частично очистите иммуноглобулины от объединенного 16 асцита, содержащего S19, осаждением 50% сульфатом аммомония. Промойте осадок дважды 50% сульфатом аммония и ресуспендируйте в PBS (20 мМ NaPO4, 150 NaCl, рН 7,4) при 1/10 исходного объема асцита. Диализуйте противPBS для удаления сульфата аммония. Определите концентрацию белка при помощи набора тест-реагентов BSA Reagent Assay Kit (PierceChemical Company). Инкубируйте осажденный сульфатом аммония белок с гранулами ProteinG-Sepharose (Pharmacia, Pitscataway, NJ) в PBS,pH 7,4, в течение ночи при 4 С для связыванияIgG. Включите 15 мг осажденного сульфатом аммония белка для каждого мл гранул Protein GSepharose. Вылейте суспензию гранул в хроматографическую колонку и промывайте PBS (рН 8,2) до тех пор, пока белок не перестанет детектироваться в элюате согласно мониторингу по УФ-поглощению при А 280. Для ковалентного сшивания связанного IgG с гранулами Protein G уравновесьте колонку 0,2 М триэтаноламином(рН 8,2), ресуспендируйте этот матрикс в 20 объемах 20 мМ дигидрохлорида диметилпимелимидата, 0,2 М триэтаноламина (рН 8,2) и инкубируйте в течение 45 мин, с осторожным перемешиванием, при комнатной температуре. Для остановки реакции сшивания центрифугируйте гранулы в равном объеме 20 мМ этаноламина и инкубируйте эту суспензию в течение 5 мин при комнатной температуре. Вылейте суспензию гранул в хроматографическую колонку,уравновесьте 0,2% азидом натрия, PBS (рН 8,2) и храните при 4 С до использования. Афинная хроматография. Уравновесьте приготовленную иммуноаффинную колонку 0,5% октилглюкозидом, TBS. Рециркулируйте раствор октилглюкозида, содержащий гидрофобные белки сперматозоидов через колонку при 1,3 мл/мин, непрерывно в течение 16 ч при 4 С. Промойте колонку 0,5% октилглюкозидом,TBS для удаления несвязанного материала и проведите мониторинг концентрации белка в промывке по УФ-поглощению. После удаления несвязанного белка элюируйте связанный материал 0,1 М глицином, 0,15 М NaCl (рН 2,4),0,4% ДСН. Соберите фракции 3 мл и проведите мониторинг их концентрации белка при помощи набора BSA Reagent Assay Kit и по УФпоглощению. Объедините фракции, содержащие белок, и концентрируйте с применением фильтрационного концентратора с мембранойAmicon. Анализ чистоты пробы. Разделите белок,очищенный на S19-иммуноаффинной колонке,при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ на 15% акриламиде и либо окрасьте серебром, либо перенесите на нитроцеллюлозу. Тестируйте иммуноблоты на реактивность с SAGA-1 инкубацией с моноклональным антителом S19 с последующим стандартным Вестерн-блотанализом. Сравните молекулярную массу и число белковых полос, детектируемых окрашива 17 нием серебром и по реактивности с S19 для оценки чистоты. Вакцина Данное изобретение включает в себя противозачаточную вакцину,использующуюSAGA-1 и, конкретно, любой белок, который связывается mAb S19, в качестве иммуногена. Иммунизация SAGA-1 будет генерировать антитела в хозяине в достаточном количестве для целей ингибирования оплодотворения. Приготовление самой вакцины выполняют по традиционной схеме. Очищенный иммуноген, предпочтительно рекомбинантный иммуноген,имеющий эпитопные участки S19, включают в подходящий фармацевтический носитель. Препарат приемлемой вакцины, использующий новый иммуноген заявителей, может быть получен согласно традиционным способам. Вакцины, описанные в Aitken, Freemerman и Herr, supra, могут быть легко приспособлены для белка SAGA-1 и его производных, связываемых mAb S19. В частности, контрацептивные вакцины, использующие белок РН-20, разработанные Primakoff, supra и Primakoff et al., и(1994), отражают успешное приспособление белкового антигена сперматозоидов с получением вакцинного иммуногена в подходящем носителе. Хотя белки, используемые в Primakoff и других ссылках, к сожалению, не были способны давать высокую (более 95%) степень ингибирования оплодотворения у приматов, специфический характер белка SAGA-1, в частности,его распределение по всей поверхности клетки сперматозоида, и многочисленные пути для взаимодействия между ним и отвечающими на него моноклональными антителами обеспечивают возможность достижения ингибирования оплодотворения порядка, характерного для пероральных контрацептивов (т.е. 99%) . Для развития адекватного титра антител, возможно, что большинство тест-субъектов, в том числе женщин, должны будут вакцинироваться согласно протоколу, с инъекциями при больших интервалах для предоставления времени для генерирования подходящего титра антител после каждой инъекции. Инъекции, вводимые с интервалом приблизительно один месяц, с последующим тестом с применением белка SAGA-1 в качестве стандарта для определения титра антител должны быть адекватными после периода 3 месяцев для получения достаточного ингибирования оплодотворения для целей надежного применения. Конечно, если диагностический тест отражает низкий титр антител, так что почти полное ингибирование оплодотворения не обеспечивается, должна быть предпринята дополнительная программа вакцинирования или другой способ тестирования для определения причины низкого титра антител. Применение иммуногена для генерирования антител к антигену природного состояния 18 или к рекомбинантному антигену, оба из которых включены в данное изобретение, является,per se, рутиной для специалистов в данной области. Новая разработка заявителя простирается на включение уникального белка SAGA-1 и возложение надежд на белок SAGA-1, впервые полно охарактеризованный в данном изобретении. Рутинная оптимизация доз, носителей, способов представления (презентации) и т.п. не составляют аспекта данного изобретения per se. Тем не менее, предполагается, в качестве рутинной дозы, что диапазон доз 100 мкг белкаSAGA-1 - 500 мкг белка SAGA-1 в объеме 0,5 мл является подходящим в качестве величины индивидуальной дозы. Поскольку антитела, генерируемые этой программой вакцинации, будут агглютинировать сперматозоиды более эффективно, чем другие специфические антитела против сперматозоидов, вследствие связывания по увеличенной площади поверхности, получена повышенная эффективность этой вакцины. Как это имеет обычно место с большинством вакцин, поливалентная вакцина является часто более эффективной, чем монобелковая вакцина. Как отмечалось ранее, известны многочисленные специфические для сперматозоидов антигены, кроме SAGA-1. Хотя индивидуально эти антигены не вызывают высокой степени уверенности в ингибирования оплодотворения, они могут быть добавлены к вакцине на основе SAGA-1 для получения дополнительной надежности. В частности, желательно комбинирование SAGA-1 и SP-10 в качестве иммуногена в поливалентной вакцине. Поскольку исследование демонстрирует, что антитела к этим белкам легко генерируются, возможно генерирование комбинированной связывающей способности в отношении обоих белков, а также иным образом узнаваемых белков, которые могут быть добавлены в качестве иммуногенных членов поливалентной вакцины. Однако существенным является то, что белок SAGA-1 или любой вариантный белок, связываемый антителомS19, является центральным элементом этой вакцины, поскольку антитела к нему обеспечивают значительно повышенные возможности связывания и, следовательно, большую степень доверия к ингибированию оплодотворения. Диагностическое средство Свойства белков, связываемых mAb S19,включающих в себя белок SAGA-1, делают возможными два различных типа диагностического тестирования. Исходно необходим мониторинг развития антител к вакцинному иммуногену,белку SAGA-1 или его вариантам. Некоторые потенциальные кандидаты могут не иметь подходящей системы иммунного ответа и многие индивидуумы отличаются по титру антител,генерируемых в ответ на любой иммуноген или протокол введения иммуногена. Развитие адекватного титра антител может быть легко подтверждено с использованием белка SAGA-1 в 19 качестве антигенного стандарта. При помощи теста агглютинации, описанного выше в отношении mAb SI9, можно легко определить концентрацию, необходимую для 100% агглютинации. Эту концентрацию белка SAGA-1, правильно иммобилизованного и представленного,тестируют против пробы, взятой от пациента. Достижение 100% связывания предполагает адекватный титр антител. Поскольку любая такая программа вакцинации должна проводиться под клиническим наблюдением, форма тестирования может быть общепринятой, с применением ELISA, Вестерн-блоттинг-анализа или других форм установленного типа. Существует, кроме того, возрастающий интерес к простым в применении, благоприятным для пользователя коммерческим диагностическим средствам, т.е. имеющимся в свободной продаже диагностическим средствам. Причины заинтересованности в таком типе диагностического средства и множество применений такого диагностического средства обсуждаются детально в U.S. Patent 5 605 803, issued February 25, 1997, включенном здесь в качестве ссылки. Описанные в нем диагностические средства используют связывающее SP-10 антитело, MHS10, или антитела, имеющие характеристики связывания антител, экспрессируемых гибридомной клеточной линией, доступной в АТСС под номером доступа НВ 10037. Как описано во включенной заявке, этот тип имеющегося в свободной продаже диагностического средства находит применение в судебной среде, может быть применим в определении присутствия нормальной линии дифференцировки зародышевых клеток, имеет существенную ценность для субъектов, испытывающих затруднения в достижении зачатия, для подвергнутых вазэктомии мужчин, а также для тестирования подвергнутых вазэктомии мужчин, для определения успеха хирургического повторного соединения протока. Для любой из множества причин определение присутствия сперматозоидов в биологической пробе, либо в эякуляте, либо в пробе,полученной из эякулята или из мужских половых путей, имеет существенное значение в медицине. Антиген, связываемый mAb S19, белокSAGA-1 и соответствующие варианты и рекомбинантные производные, имеющие отвечающий на CDR S19 эпитоп, могут быть применены в формах тестов, таких как описанные во включенном в качестве ссылки U.S. Patent 5605 803,issued February 25, 1997. Таким образом, антитело S19 может быть связано с твердой фазой и использовано для захвата белка SAGA-1. Распознавание присутствия антигена SAGA-1 может быть выполнено с применением второго моноклонального или поликлонального реагента. См., например, Shen(1993). Другие формы тестов могли бы исполь 003531 20 зовать тампон или палочку для погружения(dipstick) и покрытые антителом цветные гранулы. Во всех этих вариациях основным реагентом является mAb S19 или подобное антитело к белку SAGA-1. Любой белок, присутствующий в тестируемой пробе, связывается или улавливается иммобилизованным антителом. Так, в диагностическом средстве, предназначенном для мониторинга развития адекватного титра антител, белок SAGA-1 или сходный белок используют в качестве стандартного тест-реагента. В"домашнем тест-наборе", где желательна проверка присутствия этого антигена, и, следовательно, проверка присутствия сперматозоидов,реагентом является моноклональное антитело,отвечающее на него. Заявитель описал изобретение как в общих, так и в специфических терминах. Специалистам в данной области могут встретиться вариации, и примеры, и характерные варианты, не предназначенные для ограничения, если оно не указано в описании. Вариации, которые могут иметь место для специалистов с обычной квалификацией в данной области, не требуют чрезмерного экспериментирования и дара изобретательства. В частности, уровни концентраций,схемы введения, рекомбинантные способы и варианты и т.п., которые могут встретиться специалистам в данной области, находятся в объеме данного изобретения, кроме тех, которые лежат за пределами формулы изобретения,представленной ниже. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Моноклональное антитело S19, продуцируемое гибридомой АТСС НВ-12144, специфичное к поверхностному гликопротеину сперматозоидов SAGA-1. 2. Очищенный поверхностный гликопротеин сперматозоидов SAGA-1, связываемый моноклональным антителом по п.1. 3. Противозачаточная вакцина, содержащая поверхностный гликопротеин сперматозоидов по п.2 в количестве, эффективном для индуцирования образования антител к нему при введении в женскую особь млекопитающего, в фармацевтически приемлемом носителе. 4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что количество указанного гликопротеина достаточно для того, чтобы при завершении схемы вакцинации в организме указанной женской особи титр индуцируемых антител был достаточно высоким для обеспечения, по меньшей мере, 95% ингибирования оплодотворения. 5. Способ определения титра антител у вакцинированного пациента, получающего вакцину по п.3, заключающийся в смешивании пробы, полученной от указанного пациента, с известным количеством гликопротеина SAGA1, иммобилизованного на твердой подложке, и детектировании связывания между указанным гликопротеином SAGA-1, иммобилизованном на твердом носителе, и антителами, присутствующими в пробе, причем полное связывание всего указанного иммобилизованного гликопротеина свидетельствует о титре антител в указанной пробе, достаточном для ингибирования оплодотворения у указанного пациента. 6. Спермицид, содержащий в качестве активного ингредиента моноклональное антитело по п.1 в фармацевтически приемлемом носителе. 7. Спермицид по п.6, отличающийся тем,что концентрация моноклонального антитела достаточна для того, чтобы одна доза указанного спермицида эффективно связывала 100% всех клеток сперматозоидов, присутствующих в эякуляте. 8. Спермицид по п.7, отличающийся тем,что указанный спермицид приготавливают в форме липосом. 9. Спермицид по п.8, отличающийся тем,что указанные липосомы являются нефосфолипидными, положительно заряженными липосомами. 10. Способ определения титра антител у пациента, получающего вакцину по п.3, заключающийся в смешивании пробы, полученной от указанного пациента, с гликопротеином SAGA1 и измерении количества антитела в указанной пробе, которое связывается с гликопротеином