Микрочип с малыми молекулами, способ его получения и применение

МИКРОЧИП С МАЛЫМИ МОЛЕКУЛАМИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, такие как чипы и микрочипы, содержащие клетки и соединения, такие как малые молекулы или лекарственные средства, например, для скрининга лекарственных средств или тестирования токсичности.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТЕ РИДЖЕНТС ОФ ТЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ КАЛИФОРНИЯ Область техники, к которой относится изобретение Изобретение, в общем, относится к разработке лекарственных средств и биохимии. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, такие как чипы и микрочипы,содержащие клетки и соединения, такие как малые молекулы или лекарственные средства, например, для скрининга лекарственных средств или тестирования токсичности. Предшествующий уровень техники Традиционный высокопроизводительный скрининг малых молекул проводят с помощью робота для работы с жидкостями в многолуночном формате. Как правило, клетки культивируют в многолуночных планшетах, например от 96-луночных до 3456-луночных; и добавляют в каждую лунку низкомолекулярные соединения. Единичная культивируемая площадь в каждой лунке (например, для 3456-луночного планшета) составляет около 3 мм 2 для каждого соединения. Для скрининга в большом масштабе при работе с жидкостями требуется дорогой робот. Каждый тест требует 1 мкл соединения. При обычном скрининге лекарственных средств на микрочипах лекарственные средства иммобилизуют на стеклянной пластинке в поли(dl-лактид-когликолиде) (PLGA), а затем рассевают клетки, покрывающие все стекло. Эффективное лекарственное средство служит помехой для выживания клеток и пролиферации, что в результате приводит к появлению ячейки без клеток. Однако при таком подходе для покрытия всего стекла требуется большое количество клеток. Из-за отсутствия барьера между ячейками клетки свободно мигрируют из одной ячейки в другую. Клетки, которые были подвергнуты действию различных ячеек, могут взаимодействовать, что приводит к менее независимым экспериментам. Отсутствие барьера также является причиной менее четких областей считывания, что делает количественную оценку более трудной и менее точной. Сущность изобретения В альтернативных воплощениях изобретения предлагаются продукты производства, содержащие или состоящие из чипов или микрочипов, и способы их изготовления и применения. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются способы изготовления чипов или микрочипов, а продукты производства изобретения включают чипы или микрочипы, изготовленные способами изобретения. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, содержащие твердую полутвердую, гелевую или гелеподобную, коллоидальную или золь-гель подложку, по существу, содержащую поверхность или слой (или покрытие), которые предотвращают или ингибируют прикрепление клеток или не способны поддерживать прикрепление клеток, где поверхность или слой (или покрытие) содержат множество ячеек или ограниченных или определенных областей, к которым способна прикрепиться клетка или клетки,где необязательно поверхность или слой (или покрытие), предотвращающие или ингибирующие прикрепление клеток, содержат полиакриламид или гидрогель или покрытую полиакриламидом или гидрогелем поверхность или их комбинацию; необязательно поверхность является твердой, полутвердой, гелевой или гелеобразной, коллоидальной или золь-гель подложкой, которая содержит поверхность или слой (или покрытие), содержащих или являющихся стеклом или стеклянной пластинкой, покрытой полиакриламидом или гидрогелем; необязательно стекло или стеклянную пластинку, покрытые гидрогелем, обезвоживают перед точечным нанесением или печатью; необязательно твердая или полутвердая подложка содержит или состоит из стекла или его эквивалента и необязательно полиакриламид или гидрогель перекрестно связаны с силан-активированным стеклом или стеклянной пластинкой; необязательно множество ячеек или ограниченных областей, к которым способны прикрепляться клетки, содержат одну или несколько композиций или смесей композиций, способных облегчать, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток к множеству ячеек или ограниченных областей (и необязательно ячейка или ограниченная область, содержащая одну или несколько композиций, способных облегчать, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток, включает одну или несколько композиций или смесей композиций, напрямую прикрепленных к твердой, полутвердой, гелевой или гелеподобной, коллоидальной или гель-золь подложке, а не к поверхности или слою или покрытию, которые предотвращают или ингибируют прикрепление клеток); необязательно одну или несколько композиций, способных облегчить, инициировать и/или поддержать прикрепление клеток, содержащих один или несколько белков внеклеточного матрикса, или композицию, подобную внеклеточному матриксу, или смесь молекул, таких как, например, взаимосвязанная сеть фибриллярных белков и гликозаминогликаны (GAGs), протеогликаны (PG), гепаран сульфат(HS), хондроитин сульфат (CS), кератан сульфат (KS), гиалуроновая кислота, коллаген, эластин, фибро нектин, ламинин, молекула клеточной адгезии (САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин,аддрессин, или их смесь, или их эквиваленты; необязательно клетка является клеткой млекопитающего или клеткой человека. В альтернативных воплощениях продукт производства содержит или состоит из или изготовлен в виде чипа или микрочипа. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, изготовлен-1 023986(a) обеспечение соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства и мономерного раствора, способного полимеризоваться;(c)(i) смешивание соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства и мономерного раствора и необязательно также включающего второй раствор(или смешанного со вторым раствором), или композицию, способную инициировать и/или катализировать полимеризацию мономера, и точечное нанесение или печать смеси на множестве ограниченных областей (таких как ячейки) на поверхности твердой, полутвердой, гелевой или гелеподобной, коллоидальной или гель-золь подложки; или(ii) точечное нанесение или печать соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства на множестве ограниченных областей (таких как ячейки) на поверхности твердой, полутвердой, гелевой или гелеподобной, коллоидальной или золь-гель подложки, с последующим точечным нанесением или печатью мономерного раствора, способного полимеризоваться над (сверху) фактически каждой точечно нанесенной или напечатанной ячейкой или отпечатком с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством,где необязательно:(1) мономерный раствор изначально содержит второй раствор или композицию, способную инициировать и/или катализировать полимеризацию мономера, и мономерный раствор полимеризуется после стадии точечного нанесения или печати,(2) второй раствор или композиция, способная инициировать и/или катализировать полимеризацию мономера, точечно наносится или печатается над (сверху) фактически каждой точечно нанесенной или напечатанной ячейкой или отпечатком с соединением, лекарственным средством, малой молекулой, или низкомолекулярным лекарственным средством для инициации или катализа полимеризации мономера; или(iii) точечное нанесение или печать соединения, лекарственного средства малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства на множестве ограниченных областей (таких как ячейки) на поверхности твердой, полутвердой, гелевой или гелеподобной, коллоидальной или золь-гель подложки, а мономерный раствор индуцируется к полимеризации внешним источником, например, под действием светового излучения, такого как ультрафиолетовый свет, или тепла; где необязательно точечно нанесенная или напечатанная область для каждого соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства имеет площадь примерно от около 0,01 и 0,05 мм 2, или имеет площадь примерно от около 0,02 до 0,04 мм 2, или примерно имеет площадь 0,03 мм 2; необязательно точечное нанесение или печать смеси мономеров осуществляется с помощью струйного принтера или эквивалента, или робота для работы с жидкостями; необязательно раствор с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярной смесью получают в искомой концентрации и/или смешивают с раствором пре-полимера или получают в инкапсулирующих липидах, липосомах или частицах или наноинкапсулирующих частицах; необязательно раствор может быть напрямую напечатан на стекле с обезвоженным гелем с помощью робота для микрочипов; или соединение, лекарственное средство, малая молекула или низкомолекулярное лекарственное средство/пре-полимер или раствор с инкапсулированным соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством могут быть напечатаны на стекле с обезвоженным гелем. В альтернативных воплощениях продукт производства содержит или состоит из или изготовлен в виде чипа или микрочипа. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, содержащие комбинацию или множество продуктов производства изобретения. В альтернативных воплощениях продукт производства изобретения дополнительно содержит покрытие подложки, изготовленное способом, включающим точечное нанесение или печать одной или нескольких композиций, способных облегчить, инициировать и/или поддержать прикрепление клеток к множеству ячеек, отпечатков или ограниченных областей, и необязательно одна или несколько композиций, способных облегчить, инициировать и/или поддержать прикрепление клеток, содержит один или несколько белков внеклеточного матрикса, или композицию, подобную внеклеточному матриксу, или смесь молекул, например, таких как взаимосвязанная сеть фибриллярных белков и гликозаминогликаны(GAGs) или протеогликаны (PG), гепаран сульфат (HS), хондроитин сульфат (CS), кератан сульфат (KS),гиалуроновая кислота, коллаген, эластин, фибронектин, ламинин, молекула клеточной адгезии (САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин, аддрессин, или их смесь, или их эквиваленты. В альтернативных воплощениях продукт производства изобретения дополнительно включает помещение или точечное нанесение или печать клетки или множества клеток на множество ячеек, отпечатков или ограниченных областей, на которые наслоены одна или несколько композиций, способных об-2 023986 легчить, инициировать и/или поддержать прикрепление клетки, например компонентов внеклеточного матрикса, включая белки и/или полисахариды, и/или композиции, похожие на внеклеточный матрикс,или смесь молекул, например, таких как взаимосвязанная сеть фибриллярных белков и гликозаминогликаны (GAGs) или протеогликаны (PG), гепаран сульфат (HS), хондроитин сульфат (CS), кератан сульфат(САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин, аддрессин, или их смесь или их эквиваленты. В альтернативных воплощениях способы изобретения для определения того, имеют ли соединение,лекарственное средство, малая молекула или низкомолекулярное лекарственное средство либо искомый эффект, либо клеточный ответ клетки, включают:(а) измерение или наблюдение за клеткой (например, для определения какого-либо или искомого эффекта или клеточного ответа клетки) на ("тестовом") продукте производства (например, чипе, микрочипе) по любому из пп.1-5 (где продукт производства содержит соединение, лекарственное средство,малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство), и необязательно сравнение такой же клетки на "контрольном" продукте производства, который является таким же, что и продукт производства по пп.1-5, за исключением того, что "контрольный" продукт производства не содержит соединения,лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства, содержит другое соединение, лекарственное средство, малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство; содержит соединение, лекарственное средство, малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство, которое, как известно, оказывает другое воздействие на клетку; или содержит то же самое соединение, лекарственное средство, малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство, что и в "тестовом" продукте производства, но в другой концентрации;(b) способ (а), где либо искомый эффект, либо клеточный ответ клетки включает клеточную смерть(например, апоптоз), секрецию биомолекул (например, белков, липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот и т.п.), пролиферации (например, митоз), межклеточное взаимодействие, обновление и утилизацию полипептидов клеточной поверхности, высвобождение везикул, мембранную деполяризацию, ионные (например, натриевые, кальциевые или калиевые) внутриклеточные флуктуации или движение через клеточные мембраны и т.п. Подробности одного или нескольких воплощений изобретения изложены в сопровождающих чертежах и в представленном ниже описании. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей, и из формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки, процитированные в данном документе, явно включены ссылкой для всех целей. Краткое описание чертежей Предложенные в данном документе чертежи являются иллюстрациями воплощений изобретения и не предназначены для ограничения объема притязаний изобретения, охваченного формулой изобретения. На фиг. 1 схематически показан примерный протокол изготовления примерного микрочипа с малыми молекулами по изобретению, описанный ниже в примере 1. На фиг. 2 схематически показан примерный протокол изготовления примерного микрочипа с малыми молекулами по изобретению, описанный ниже в примере 1. На фиг. 3 схематически показан примерный протокол прикрепления малой молекулы к продукту производства по изобретению, где молекулы печатают на микрочипе, представленном первым слоем над подложкой из полиакриламидного геля, как описано в примере 1 ниже. На фиг. 4 показана примерная композиция изобретения (продукт производства), где первые два ряда ячеек в А и В являются ячейками иммобилизованных флуоресцентных малых молекул и где вторые ряды не иммобилизованы; на фиг. 4 А показаны флуоресцентные малые молекулы перед погружением в раствор-среду, а на фиг. 4 В показаны флуоресцентные малые молекулы после 10-минутного погружения в раствор-среду, как обсуждается в примере 1 ниже. На фиг. 5 представлена примерная композиция изобретения (продукт производства), где изображены интенсивности флуоресценции микрочипа с иммобилизованными малыми молекулами, на фиг. 5 А, в различных временных точках, в ходе погружения в раствор-среду; затем изменения интенсивностей флуоресценции представлены графически на фиг. 5 В, что обсуждается в примере 1 ниже. На фиг. 6 представлена примерная композиция изобретения (продукт производства), где флуоресцентное антинеопластическое лекарственное средство доксорубицин, как показано на фиг. 6 В, печатается в различных концентрациях на примерном микрочипе, как показано на фиг. 6 А; что обсуждается в примере 1 ниже. Одинаковые условные обозначения в различных чертежах обозначают одинаковые элементы. Далее подробно будет представлен образец различных примерных воплощений изобретения, примеры которых показаны в сопровождающих чертежах. Следующее подробное описание представлено для лучшего понимания читателем некоторых деталей аспектов и воплощений изобретения, и не должно истолковываться как ограничение объема притязаний изобретения. Подробное описание В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, содержащие или состоящие из чипа или микрочипа, содержащего твердую, полутвердую, гелевую или гелеподобную,коллоидальную или гель-золь подложку, фактически содержащую поверхность, слой или покрытие, которое предотвращает прикрепление клеток или не способно поддерживать прикрепление клеток, при этом поверхность, слой или покрытие содержат множество ячеек или ограниченных областей, к которым клетки способны прикрепляться. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются продукты производства, содержащие или состоящие из чипа или микрочипа, содержащего твердую, полутвердую, гелевую или гелеподобную,коллоидальную или гель-золь подложку, фактически состоящую из множества отпечатков или ячеек, где фактические каждый отпечаток или ячейка содержат многослойный "бутерброд", содержащий: в качестве первого слоя твердую, полутвердую, гелевую или гелеподобную, коллоидальную или гель-золь поверхность, которая необязательно сама по себе может быть уложена слоями (одним или несколькими) с композицией, которая ингибирует или не позволяет поддерживать или стимулировать прикрепление клеток (например, полимеризованным мономером) (в одном альтернативном воплощении ограниченная область или ячейка с напечатанной или точечно нанесенной малой молекулой не имеет композицию, которая ингибирует или не поддерживает или стимулирует прикрепление клеток, например полиакриламид или эквивалент); в качестве второго слоя композицию, способную стимулировать, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток; а в качестве третьего слоя клетку или множество клеток, где необязательно клетка является клеткой пациента, например, нормальной или аномальной клеткой, например злокачественной опухолевой клеткой. В альтернативных воплощениях изобретение включает способ иммобилизации малых молекул(множества малых молекул) или других соединений в формате чипа (например, микрочипа), например,для скрининга, например для высокопроизводительного скрининга эффектов малой молекулы или других соединений и их комбинаций на небольшом числе клеток. Манипулируя с полимером(ами), используемым для иммобилизации, можно контролировать количество и сроки высвобождения малой молекулы (молекул) на клетки. Механизм с контролируемым высвобождением может быть выполнен путем изменения свойств полимера, таких как величина полимеризации и перекрестного связывания цепей, тип цепей, геометрия сети, образованной цепями, химические свойства гелевых полимеров, деградация полимера, слои полимеров с различными свойствами. В альтернативных воплощениях другие способы достижения механизма контролируемого высвобождения содержат включение нанокапсул или наночастиц и/или микрочастиц, высвобождающих иммобилизованное лекарственное средство. В альтернативных воплощениях могут быть идентифицированы индивидуальное соединение (соединения) или смеси соединений, которые индуцируют клеточный ответ, например искомый клеточный ответ. В альтернативных воплощениях индуцированные клеточные ответы включают клеточную смерть(например, апоптоз), секрецию биомолекул (например, белков, липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот и т.п.), пролиферацию (например, митоз), межклеточные взаимодействия, обновление и утилизацию полипептидов клеточной поверхности, высвобождение везикул, мембранную деполяризацию и т.п. В альтернативных воплощениях применения продуктов производства изобретение включает персонализированную терапию посредством скрининга эффектов лекарственных средств и их комбинаций на нормальных, обнаруживающих симптомы заболевания и/или подвергнутых заболеванию или инфицированных клетках пациента; персонализированный скрининг эффектов, например искомых эффектов или побочных эффектов на нормальных, обнаруживающих симптомы заболевания и/или подвергнутых заболеванию или инфицированных клетках пациента; высокопроизводительный скрининг малых молекул с помощью небольшого количества клеток и соединений. В альтернативных воплощениях применения продуктов производства изобретения может значительно снизить количество клеток и количество низкомолекулярных соединений, необходимых в высокопроизводительном скрининге лекарственных средств по сравнению с обычными способами. Например, в одном воплощении формат чипа по изобретению (например, микрочипа) использует примерно 0,03 мм 2 культуральной площади для каждой малой молекулы, меньше чем 1/100 от традиционной единичной культуральной площади, равной примерно 3 мм 2, следовательно, больше чем в 100 раз уменьшается требуемое количество клеток. В результате данное воплощение позволяет провести скрининг лекарственных средств с помощью ограниченного количества клеток из одного пациента и, следовательно,обеспечивает основу для разработки персонализированной терапии. В одном воплощении в формате чипа по изобретению (например, микрочипа) используется намного меньшее количество подвергаемого скринингу соединения, например 1 нл на тест, или 1/1000 обычного объема 1 мкл. В альтернативных воплощениях продукты производства изобретения включают механизм контролируемого высвобождения; например, количество и сроки экспонирования соединений клеткам могут контролироваться механизмом с контролируемым высвобождением. В альтернативных воплощениях это осуществляется изменением свойств полимера чипа (например, микрочипа), таких как величина полиме-4 023986 ризации и перекрестного связывания цепей, тип цепей, геометрия сети, образованной цепями, химические свойства гелевых полимеров, деградация полимера, слои полимеров с различными свойствами, и т.п. В альтернативных воплощениях продукты производства изобретения содержат подложку, к которой не прикрепляются клетки, ячейки с белками внеклеточного матрикса и "ячейки с лекарственными средствами", например подложка, к которой не прикрепляются клетки, может обеспечивать виртуальный барьер для клеток. В одном воплощении клетки присутствуют только в ячейках с белками внеклеточного матрикса. Подобное воплощение может обеспечить хорошо определяемую область для считывания данных. "Ячейка лекарственного средства" и ячейка "внеклеточного матрикса" может варьировать по размеру для различных целей. В одном воплощении клетки на индивидуальной ячейке хорошо изолированы от клеток в других ячейках; это предотвращает миграцию клеток из одной ячейки в другую или взаимодействия между ячейками, и обеспечивает более надежные и независимые результаты для каждой ячейки. В этом заключается существенное отличие от предшествующего способа микрочипов на малых молекулах. Роботизированный и многолуночный скрининг. Высокопроизводительный скрининг малых молекул по изобретению. Субстрат, который препятствует прикреплению клеток, выбирают первым. Одно воплощение включает стеклянную пластинку, покрытую полиакриламидом или гидрогелем. Поверхность стекла вначале может быть активирована с помощью силана. Полиакриламид или гидрогель могут быть перекрестно связаны на активированных силаном стеклянных пластинках. Пластинки, покрытые гидрогелем, могут быть обезвожены перед печатью микрочипа. Таким образом, в одном воплощении, продукты производства изобретения включают стеклянную пластинку с активированной силаном поверхностью, покрытую полиакриламидом или гидрогелем. После этого раствор с соединением или смесью соединений может быть приготовлен в необходимой концентрации и/или смешан с раствором пре-полимера или приготовлен в наноинкапсулирующих частицах. Раствор может быть напрямую напечатан на пластинки с обезвоженным гелем с помощью робота для микрочипов; или соединение/пре-полимер или растворы инкапсулированных соединений могут быть напечатаны на пластинках с обезвоженным гелем. Чистые растворы пре-полимеров могут быть напечатаны поверх соединения/смесей соединений, а для иммобилизации соединений может быть индуцирована полимеризация. Для получения искомых параметров удержания и высвобождения лекарственного средства могут быть разработаны различные химические составы полимеров или инкапсуляция. В альтернативных воплощениях продукты производства изобретения содержат белки внеклеточного матрикса. Белки внеклеточного матрикса могут быть напечатаны поверх чипа с соединениями, что позволяет клеткам прикрепиться. В альтернативных воплощениях клетки рассевают на чип, например на чипы, имеющие поверхности с белками внеклеточного матрикса. В альтернативных воплощениях клетки в ячейках чипа могут прикрепляться к поверхностям с белками внеклеточного матрикса. Индивидуальное соединение или смеси соединений, которые индуцируют искомый клеточный ответ, могут быть идентифицированы любыми средствами. Такие ответы могут включать, без ограничения перечисленным, клеточную смерть (например, апоптоз), секрецию биомолекул (например, белков, липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот и т.п.), пролиферацию (например, митоз), межклеточное взаимодействие, обновление или утилизацию полипептидов клеточной поверхности, высвобождение везикул,деполяризицию мембран, ионные (например, натриевые, кальциевые или калиевые) внутриклеточные флуктуации или движение через клеточные мембраны и т.п. В альтернативном воплощении поверхность, слой или покрытие включает множество ячеек или ограниченных областей, к которым клетка или клетки способны прикрепляться, и эти ячейки или ограниченные области могут быть изготовлены, например, структурированием подложки, например оптическим формированием матрицы реакционноспособных ячеек. Например, в одном воплощении стеклянную пластину промывают органосиланом, который абсорбируется и покрывает стекло. Органосилановое покрытие облучают глубоким УФ через оптическую маску или с помощью матрицы микрозеркал, которая определяет структуру чипа. Излучение расщепляется связи Si-С с образованием реактивного радикала Si. Реакция с водой вынуждает радикалы Si образовывать полярные силанольные группы. Полярные силанольные группы, образующие ячейки на чипе, дополнительно модифицируются для прикрепления других реакционноспособных молекул к ячейкам, как описано, например, в патенте США No. (USPN) 5324591 и 6653124. Например, силан, содержащий биологически функциональную группу, такую как свободную аминогруппу, может реагировать с силанольными группами. Свободные аминогруппы используют в качестве участков ковалентного прикрепления биомолекул, таких как белки внеклеточного матрикса, или композиции, подобные внеклеточному матриксу или смеси молекул. В другом воплощении поверхность, слой или покрытие содержат множество ячеек или ограниченных областей, к которым способны прикрепляться клетки, и эти ячейки или ограниченные области могут быть созданы, например, путем образования фактически регулярной матрицы структур на подложке, как описано, например, в USPN 6649491, где первый материал-поверхностный слой помещен на подложку-5 023986 второй материал, и где поверхностный слой значимо тоньше, чем поля напряжений на границе раздела поверхностного слоя и подложки, что приводит к образованию отдельных участков. При направлении пучка частиц на поверхностный слой определяется направление выравнивания отдельных областей и/или относительное положение прилегающих отдельных областей, и это обеспечивает преимущество, которое заключается в том, что на поверхности могут быть образованы структуры наномерного масштаба, имеющие высокую степень регулярности. Далее изобретение дополнительно будет описано с помощью представленных ниже примеров; однако следует понимать, что изобретение не ограничивается данными примерами. Примеры Пример. Изготовление и демонстрация эффективности чипов по изобретению. Данные, представленные в данном документе, демонстрируют способы изготовления чипов по изобретению, например микрочипов с малыми молекулами. В альтернативных воплощениях в изобретении предлагаются микрочипы с малыми молекулами, применимые при скрининге лекарственных средств в некоторых областях, таких как пациент-специфичный скрининг лекарственных средств и недорогой скрининг лекарственных средств. Далее описаны способы создания такого микрочипа с малыми молекулами и полученные данные. В альтернативных воплощениях скрининга клеточного ответа на микрочипе, для отчетливого считывания показаний клетки должны присутствовать только на ячейках микрочипа. Один из способов заключается в применении в качестве подложки микрочипа поверхности, которая предотвращает прикрепление клеток. Покрытая полиакриламидом стеклянная пластинка является одним из вариантов. Из-за того что клеточный скрининг проводится в растворе, малые молекулы необходимо иммобилизовать для предотвращения растворения в растворе-среде. Примерные способы описаны в данном документе. В альтернативном воплощении, представленном на фиг. 2, низкомолекулярное лекарственное средство смешивают с мономерным раствором; затем смесь лекарственное средство-мономер точечно наносят на подложку в формате чипа; затем индуцируют процесс полимеризации из мономеров, образуя полимерный гель, иммобилизующий малую молекулу. В альтернативном воплощении, представленном на фиг. 2, вначале на подложку микрочипа печатают раствор низкомолекулярного лекарственного средства. Поверх каждой ячейки с лекарственным средством печатают раствор мономера. Затем индуцируется процесс полимеризации для покрытия и иммобилизации низкомолекулярных лекарственных средств. В одном воплощении после иммобилизации низкомолекулярных лекарственных средств в формате микрочипа, поверх каждой ячейки печатают материал, к которому прикрепляются клетки. Белки внеклеточного матрикса или композиция, похожая на внеклеточный матрикс, или смесь молекул, например,таких как взаимосвязанная сеть фибриллярных белков и гликозаминогликанов (GAGs), или протеогликанов (PG), гепаран сульфат (HS), хондроитин сульфат (CS), кератан сульфат (KS), гиалуроновая кислота,коллаген, эластин, фибронектин, ламинин, молекулы клеточной адгезии (САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин, аддрессин, или их смесь, или их эквиваленты, которые все являются альтернативами, выбранными для примера. В альтернативном воплощении, показанном на фиг. 3, низкомолекулярные лекарственные средства печатают на биочипе, представленном первым слоем подложки из полиакриламидного геля. Белки внеклеточного матрикса (ЕСМ), или смесь белков и GAG, или протеогликанов (PG), гепаран сульфат (HS),хондроитин сульфат (CS), кератан сульфат (KS), гиалуроновая кислота, коллаген, эластин, фибронектин,ламинин, молекулы клеточной адгезии (САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин, аддрессин, или их смесь, или их эквиваленты точечно наносятся на каждую ячейку с лекарственным средством. Затем на микрочип рассевают клетки. Из-за того что не покрытая ячейками полиакриламидная поверхность не позволяет клеткам прикрепляться, клетки присутствуют только в ячейках. В альтернативном воплощении, показанном на фиг. 4, первые ряды ячеек в А и В являются ячейками с иммобилизованными флуоресцентными молекулами, где вторые ряды не являются иммобилизованными. После погружения в раствор-среду на 10 мин не иммобилизованные ячейки (вторые два ряда) утрачивают большую часть своего флуоресцентного сигнала, что подтверждает то, что основная часть молекул удаляется из ячеек. С другой стороны, иммобилизованные ячейки (первые два ряда) эффективно сохранили свое низкомолекулярное содержимое, представленное устойчивой интенсивностью флуоресцентных сигналов. В альтернативном воплощении, представленном на фиг. 5, интенсивности флуоресценции микрочипа с иммобилизованными малыми молекулами изображены в различных временных точках при погружении в раствор-среду. Изменение интенсивностей флуоресценции затем наносится графически (В). Утрата интенсивностей флуоресценции представляет собой снижение количества малых молекул, оставшихся в ячейках. Кривая также показывает скорость высвобождения малой молекулы в раствор. Эта скорость может контролироваться различными факторами, такими как величина полимеризации и перекрестного связывания, деградация иммобилизованного полимера, химические свойства и не только. В альтернативном воплощении, представленном на фиг. 6, на микрочипе печатают флуоресцентное антинеопластическое лекарственное соединение доксорубицин в различных концентрациях. Изображение получили после погружение в раствор-среду на 2 ч. Было описано несколько воплощений изобретения. Тем не менее, следует понимать, что различные модификации могут быть осуществлены без отхода от сущности и объема притязаний изобретения. Соответственно другие воплощения находятся в рамках представленной ниже формулы изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Продукт производства, изготовленный для применения в виде чипа или микрочипа, где поверхность содержит множество четырехслойных структур, причем чип или микрочип получены способом,который включает:(a) обеспечение соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства и мономерного раствора, способного полимеризоваться;(b) обеспечение твердого, полутвердого, гелевого или гелеподобного, коллоидального или гель-золь субстрата, по существу, содержащего поверхность, слой или покрытие, которое предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток;(c)(i) смешивание соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства и мономерного раствора, точечное нанесение или печать смеси на множество ограниченных участков или пятен на поверхности твердого, полутвердого, гелевого или гелеподобного,коллоидального или гель-золь субстрата, имеющего поверхность, слой или покрытие, которое предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток; или(ii) точечное нанесение или печать соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства на множество ограниченных участков или пятен на поверхности твердого, полутвердого, гелевого или гелеподобного, коллоидального или гель-золь субстрата, имеющего поверхность, слой или покрытие, которое предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток, за которым следует точечное нанесение или печать мономерного раствора, способного полимеризоваться над или поверх фактически каждого точечно нанесенного или напечатанного пятна или отпечатка с соединением, лекарственным средством,малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством; или(iii) точечное нанесение или печать соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства на множество ограниченных участков или пятен на поверхности твердого, полутвердого, гелевого или гелеподобного, коллоидального или гель-золь субстрата, имеющего поверхность, слой или покрытие, которое предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток, и индукция полимеризации мономерного раствора с помощью внешнего источника, например световым излучением, таким как ультрафиолетовый свет, или теплом; и(d) обеспечение материала для прикрепления клеток и печать материала для прикрепления клеток или одной или нескольких композиций, способных облегчить, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток поверх каждого из ограниченных участков или пятен. 2. Продукт производства по п.1, в котором поверхность, слой или покрытие, которые предотвращают или ингибируют прикрепление клеток или являются не способными поддерживать прикрепление клеток, включает полиакриламид или гидрогель или твердый, полутвердый, гелевый или гелеподобный,коллоидальный или гель-золь субстрат, силан-активированное предметное стекло, покрытое полиакриламидом или гидрогелем. 3. Продукт производства по п.1 или 2, где стадия (с)(i) дополнительно содержит также включение или смешивание второго раствора или композиции, способной инициировать и/или катализировать полимеризацию мономера. 4. Продукт производства по любому из пп.1-3, где в стадии (с)(ii):(1) мономерный раствор изначально содержит второй раствор или композицию, способную инициировать и/или катализировать полимеризацию мономера, и мономерный раствор полимеризуется после стадии точечного нанесения или печати; или(2) второй раствор или композиция, способные инициировать и/или катализировать полимеризацию мономера, точечно наносятся или печатаются над или сверху фактически каждого точечно нанесенного или напечатанного пятна или отпечатка с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством для инициации или катализа полимеризации мономера. 5. Продукт производства по любому из пп.1-4, где материал для прикрепления клеток или одна или несколько композиций, способных облегчать, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток,содержат белок внеклеточного матрикса или композицию, подобную внеклеточному матриксу, или смесь молекул, взаимосвязанную сеть фибриллярных белков и гликозаминогликанов (GAGs), полигликан (PG), гепаран сульфат (HS), хондроитин сульфат (CS), кератан сульфат (KS), гиалуроновую кислоту,-7 023986 коллаген, эластин, фибронектин, ламинин, молекулу клеточной адгезии (САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин, аддрессин, или их смесь, или их эквиваленты, причем полученный таким образом продукт включает поверхность, содержащую множество четырехслойных структур, и каждая структура включает:(1) основу или твердый, полутвердый гелеподобный коллоидальный или гель-золь субстрат в качестве первого или нижнего слоя;(2) второй над этой основой слой покрытия или покрывающий, который предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток;(3) третий над слоем покрытия или покрывающем слой полимеризированного мономера, смешанного с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством; и(4) четвертый над слоем полимеризированного мономера слой, содержащий материал, прикрепляющий/заякоревающий клетку или одно или более веществ, способных к облегчению, инициации и/или поддержке прикрепления клеток. 6. Продукт производства по любому из пп.1-5, где ограниченный, точечно нанесенный или напечатанный участок для каждого соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства имеет площадь примерно от около 0,01 до 0,05 мм 2. 7. Продукт производства по п.6, где ограниченный, точечно нанесенный или напечатанный участок для каждого соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства имеет площадь примерно от около 0,02 до 0,04 мм 2. 8. Продукт производства по п.7, где ограниченный, точечно нанесенный или напечатанный участок для каждого соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства имеет площадь примерно около 0,03 мм 2. 9. Продукт производства по любому из предшествующих пунктов, где точечное нанесение или печать смеси мономера осуществляется с помощью струйного принтера или эквивалента, или робота для работы с жидкостями. 10. Продукт производства по любому из предшествующих пунктов, где раствор с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярной смесью получают в искомой концентрации и/или смешивают с раствором пре-полимера или получают в инкапсулирующих липидах, липосомах или частицах или наноинкапсулирующих частицах. 11. Продукт производства по любому из предшествующих пунктов, где раствор может быть напрямую напечатан с помощью робота для микрочипов; или соединение, лекарственное средство, малая молекула или низкомолекулярное лекарственное средство/пре-полимер или раствор с инкапсулированным соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством могут быть напечатаны на стекла с дегидрированным гелем. 12. Продукт производства по любому из предшествующих пунктов, который включает или состоит из или изготовлен в виде чипа или микрочипа. 13. Продукт производства по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно включает клетку или множество клеток или человеческие клетки, животные клетки или культивируемые клетки, расположенные слоями на материале для прикрепления клеток, или одну или несколько композиций, способных облегчать, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток. 14. Продукт производства, изготовленный для применения в качестве чипа или микрочипа, где поверхность содержит множество четырехслойных структур, которые содержат твердый, полутвердый, гелевый или гелеподобный, коллоидальный или золь-гель субстрат, по существу, содержащий поверхность, слой или покрытие, которое предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток, и поверхность, слой или покрытие, содержащее множество пятен или ограниченных участков, к которым способна прикрепиться клетка или множество клеток, где множество пятен или ограниченных участков включают первый слой, содержащий полимеризованный мономер, смешанный с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством; и второй слой, расположенный над первым слоем, где второй слой содержит материал для прикрепления клеток или одну или несколько композиций, способных облегчить, инициировать и/или поддержать прикрепление клеток; и материал для прикрепления клеток или одна или несколько композиций, способных облегчать,инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток, содержат белок внеклеточного матрикса или композицию, подобную внеклеточному матриксу, или смесь молекул, взаимосвязанную сеть фибриллярных белков и гликозаминогликанов (GAG), полигликан (PG), гепаран сульфат (HS), хондроитин сульфат(CS), кератан сульфат (KS), гиалуроновую кислоту, коллаген, эластин, фибронектин, ламинин, молекулу клеточной адгезии (САМ) или САМ лиганд, интегрин, кадгерин, селектин, аддрессин, или их смесь, или их эквиваленты,причем полученный таким образом продукт включает поверхность, содержащую множество четырехслойных структур и каждая структура включает:(1) основу или твердый, полутвердый гелеподобный коллоидальный или гель-золь субстрат в качестве первого или нижнего слоя;(2) второй над этой основой слой покрытия или покрывающий, который предотвращает или ингибирует прикрепление клеток или является не способным поддерживать прикрепление клеток;(3) третий над слоем покрытия или покрывающем слой полимеризировавшего мономера, смешанного с соединением, лекарственным средством, малой молекулой или низкомолекулярным лекарственным средством; и(4) четвертый над слоем полимеризировавшегося мономера слой, содержащий материал, прикрепляющий/заякоревающий клетку или одно или более веществ, способных к облегчению, инициации и/или поддержке прикрепления клеток. 15. Продукт производства по п.14, где:(i) поверхность, слой или покрытие, предотвращающее или ингибирующее прикрепление, содержит полиакриламид или гидрогель или поверхность, покрытую полиакриламидом или гидрогелем; или(ii) поверхность твердого, полутвердого, гелевого или гелеподобного, коллидального или золь-гель субстрата, содержащего поверхность, слой или покрытие, является покрытым полиакриламидом или гидрогелем стеклом или стеклянной пластинкой; или(iii) стекло, покрытое гидрогелем, или стеклянная пластинка обезвожены перед точечным нанесением или печатью; или(iv) твердый, полутвердый, гелевый или гелеобразный, коллоидальный или золь-гель субстрат содержит или состоит из стекла или его эквивалента; или(v) полиакриламид или гидрогель перекрестно связаны с силан-активированным стеклом или стеклянной пластинкой. 16. Продукт производства, изготовленный для применения в виде чипа или микрочипа, содержащий комбинацию или множество продуктов производства:(b) любого из пп.14, 15. 17. Способ определения наличия у соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства какого-либо искомого эффекта или клеточного ответа у человеческих клеток, животных клеток или культивированных клеток, включающий:(a)(i) обеспечение продукта производства, содержащего комбинацию, или множество продуктов производства по пп.1-16, где продукт производства включает клетку или множество клеток, расположенных слоями на материале для прикрепления клеток или одной или нескольких композиций, способных облегчать, инициировать и/или поддерживать прикрепление клеток; и(ii) измерение или наблюдение клетки или множества клеток для любого или для искомого эффекта или клеточного ответа в продукт производства и сравнение такой же клетки на "контрольном" продукте производства, который является таким же, что и продукт производства по пп.1-14, за исключением того,что "контрольный" продукт производства не содержит соединения, лекарственного средства, малой молекулы или низкомолекулярного лекарственного средства, содержит другое соединение, лекарственное средство, малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство; содержит соединение, лекарственное средство, малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство, которое, как известно, оказывает другое воздействие на клетку или то же самое соединение, лекарственное средство,малую молекулу или низкомолекулярное лекарственное средство, что и в "тестируемом" продукте производства, но в другой концентрации; или(b) способ (а), в котором искомый эффект или клеточный ответ включают клеточную смерть или апоптоз, секрецию биомолекул, где биомолекулы включают белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты и т.п., пролиферацию или митоз, межклеточные взаимодействия, обновление и утилизацию полипептидов клеточной поверхности, высвобождение везикул, мембранную деполяризацию, внутриклеточные флуктуации ионов или движение через клеточные мембраны.