Суперпарамагнитные наночастицы на основе оксидов железа с модифицированной поверхностью, способ их получения и применение

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки СУПЕРПАРАМАГНИТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ ОКСИДОВ ЖЕЛЕЗА С МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Для маркирования клеток предлагается использовать образцы суперпарамагнитных наночастиц с узким диапазоном размеров, приготовленные преосаждением коллоидного Fe(OH)3 путем обработки водного раствора соли Fe(III) с небольшим содержанием NH4OH, к которому добавляют раствор соли Fe(II), и к смеси приливают избыток NH4OH. После выдержки,магнитной сепарации и промывки к смеси добавляют цитрат натрия и затем водный раствор гипохлорита натрия до образования коллоидного маггемита, к которому добавляют водный раствор модифицирующего агента. Модифицирующий агент включает моно-, ди- или полисахариды из группы, состоящей из D-арабинозы, D-глюкозы, D-галактозы, D-маннозы,лактозы, мальтозы, декстранов и декстринов, или аминокислоты, или полиаминокислоты из группы, образованной аланином, глицином, глутамином, аспарагином, гистидином,аргинином, L-лизином, аспарагиновой или глутаминовой кислотой. Полимеры производных(мет)акриловой кислоты выбраны из группы, включающей поли(N,N-диметилакриламид),поли(N,N-диметилметакриламид), поли(N,N-диэтилакриламид), поли(N,N-диэтилметакриламид),поли(N-изопропилакриламид), поли(N-изопропилметакриламид).(71)(73) Заявитель и патентовладелец: УСТАВ МАКРОМОЛЕКУЛАРНИ ХЕМИЕ АКАДЕМИЕ ВЕДЧЕСКЕ РЕПУБЛИКИ, В.В.И; УСТАВ ЭСПЕРИМЕНТАЛНИ МЕДИЦИНИ АКАДЕМИЕ ВЕДЧЕСКЕ РЕПУБЛИКИ, В.В.И (CZ) 015718 Область техники Изобретение относится к образцам суперпарамагнитных наночастиц на основе оксидов железа с модифицированной поверхностью, способу их получения и применению. Уровень техники За последние годы развитие медицинских методов диагностики направлено все больше и больше на раннее диагностирование зачастую очень серьезных заболеваний. Частью новых методик является мечение клеток или клеточное изображение с использованием магнитного резонанса. Магнитно-резонансная интроскопия (МРИ) позволила увидеть внутренние органы людей и, следовательно, является огромным усовершенствованием не только в диагностике, но и в терапии и хирургии. Медицинская диагностика требует использования наноразмерных частиц. МРИ использует тот факт, что магнитные наночастицы создают магнитное поле и воздействуют на окружающую среду (Shinkai M., Functional magnetic particlesfor medical application, J. Biosci. Bioeng. 94, 606-613, 2002). Диапазон размеров частиц может быть разделен в зависимости от применения на большие (диаметр 50 нм) и маленькие (диаметр 50 нм) частицы. МР диагностики печени и селезенки представляют основную область их применения, так как частицы данного размера легко и практически полностью поглощаются макрофагами этих органов (Kresse M.,Pfefferer D., Lawaczeck R., ЕР 516252 А 2; Groman E.V., Josephson L., U.S. Pat. 4770183). Частицы также нашли применения в клинической гипертермии (Hasegawa M., Nagae H., Ito Y., Mizutani A., Hirose K.,Ohgai M., Yamashita Y., Tozawa N., Yamada K., Kito K., Hokukoku S., WO 92/22586 A1; Gordon R.T., U.S.Pat. 4731239). Для мечения клеток ключевое значение имеет приготовление монокристаллических наночастиц оксида железа, диспергируемых в воде, которые также являются биосовместимыми, суперпарамагнитными,поверхностно-активными и которые при этом полностью поглощаются клетками. В настоящее время суперпарамагнитные оксиды железа (без магнитной памяти) являются классом материалов с сильнейшей четкостью при МР (Stark D.D., Weissleder R., Elizondo G., Hahn P.F., Saini S.,Todd L.E., Wittenberg J., Ferrucci J.T., Superparamagnetic iron oxide: clinical application as a contrast agent forMR imaging of the liver, Radiology 168, 297-301, 1988), следовательно, в низких концентрациях они особенно удобны для тканеспецифических применений. То есть существует критический размер, ниже которого частицы могут иметь только один магнитный домен даже в нулевом магнитном поле. Условием для суперпарамагнетизма является KVkT, где KV - это энергия анизотропии (K - константа анизотропии, V - объем частицы) и kT - это тепловая энергия движения (k - константа Больцмана, Т - абсолютная температура). Если данное условие выполнено, намагничивание частицы может быть вызвано тепловой энергией kT при условии, что она превышает потенциальный барьер анизотропной энергии. Критический размер суперпарамагнитных частиц магнетита равен приблизительно 25 нм. Суперпарамагнитные оксиды железа позволили увеличить тканевый контраст путем увеличения скорости релаксации воды. Варьируя размер, покрытие, толщину, поверхностные химические реакции и нацеливая лиганды, образцы наночастицы могут быть нацелены на специфичные органы и клетки или даже могут стать in vivo молекулярными маркерами для различных заболеваний. Однако размер кристаллического центра оксидов железа, которые придают специфичный характер материалам, является проблемой, потому что он проявляет существенное воздействие на биологическое поведение. Маленький размер частиц улучшает их точное нацеливание, но эффективность материала уменьшается из-за взаимозависимости размера частицы и магнитного момента. Вследствие этого, необходимо найти компромисс между хорошим эффектом контрастирования материала и точной поражаемостью (Kresse M., Pfefferer D., Lawaczeck R., WagnerS., Ebert W., Elste V., Semmler W., Taupitz M., Gaida J., Herrmann A., Ebert M., Swiderski U., U.S. Pat. Appl. 2003, 0185757). Как правило, железосодержащий центр должен быть большим, насколько это возможно,чтобы получить высокий эффект отображения (контрастность), но общий диаметр должен быть маленьким. Примеры МРИ контрастных агентов включают инъецируемые ядра, радионуклиды, диамагнитные,парамагнитные, ферромагнитные, суперпарамагнитные материалы, контрастные материалы, включающие ионы железа (например, оксид железа, ионы железа(III), цитрат аммония железа(III, агенты гадолиния (например, диэтилентриаминопентаацетат гадолиния) и марганцевые парамагнитные материалы. Типичными МРИ контрастными агентами являются, например, Magnevist и Resovit (оба от Schering),Omniscan, Feridex и Combidex (все три от Advanced Magnetics), Endorem и Sinerem (от Guerbet) иClariscan (от Nycomed). Был описан ряд способов получения кристаллов, содержащих железо (оксиды железа), с парамагнитными свойствами. Они могут быть классифицированы в соответствии с различными аспектами. Два основных способа производства суперпарамагнитных кристаллов основаны на спекании при высоких температурах и последующем механическом измельчении или на химическом синтезе в водном растворе. Для применений в медицине эффективные частицы были произведены по способам синтеза в жидкой среде; в противоположность, спекание желательно для производства железных оксидов для технологических (аудио/видеомедиа, пигменты для красителей, тонеры) и биотехнологических применений, таких как магнитные разделения (Schostek S., Beer A., DE 3729697 A1; Borelli N.F., LudererA.A., Panzarino J.N., U.S. Pat. 4323056; Osamu I., Takeshi H., Toshihiro M., Kouji N., JP 60260463 A2). Син-1 015718 тез с использованием жидких реактивов может быть разделен на двухступенчатый синтез, в котором сначала приготавливают содержащие оксид железа зародыши путем увеличения рН, к которым затем добавляют стабилизатор, обеспечивающий физические и другие требуемые свойства (Kresse М., PfeffererD., Lawaczeck R., Wagner S., Ebert W., Elste V., Semmler W., Taupitz M. Gaida J., Herrmann A., Ebert M.,Swiderski U., U.S. Pat. Appl. 2003, 0185757). В одноступенчатом синтезе оксиды железа приготавливают осаждением солей железа в присутствии стабилизатора, который покрывает зародыши во время нуклеации и таким образом препятствует агрегации и седиментации нанокристалов. Кроме классификации на двухступенчатый и одноступенчатый существует другое разделение в соответствии с видом использованного растворителя на методы, использующие воду (Hasegawa М., Hokukoku S., U.S. Pat. 4101435;Fuji Rebio K.K., JP 59195161) или органические растворители (Porath J., Mats L., ЕР 179039 A2; Aoyamaparticulate magnetic recording media, J. Mater. Chem. 2, 277-280, 1992; Norio H., Saturo O., JP 05026879 A2). Сырой продукт должен быть тщательно очищен и избыток смесей и примесей, таким образом, удален. Предпочтительным методом является термическая стерилизация. Используемые в настоящее время оксиды железа характеризуют полидисперсностью частиц, выраженной коэффициентом полидисперсности,ПДК 1,3 (ПДК=Dw/Dn, где Dn=Di/N и Dw=Di4/Di3, где N - число частиц, Di - диаметр отдельной частицы). Полидисперсные частицы имеют разные физические и химические свойства по сравнению с монодисперсными частицами, свойства которых, включая магнитные, одинаковые. Недостатком классических магнитных частиц также является то, что они меняют свои свойства на воздухе. Их химическая неустойчивость вызывает неконтролируемое окисление кислородом воздуха, магнитная чувствительность уменьшается, коллоид теряет стабильность, и наночастицы соединяются, что неприемлемо для применений в медицине. Таким образом, лучше использовать свежеполученные частицы магнетита немедленно после синтеза, чтобы контролировать окисление до маггемита (-Fe2O3), который устойчив в воздухе и не изменяет своих свойств. Как правило, поверхность магнитных частиц для обеспечения визуализации при использовании в медицине покрыта полимерами. Практически все наночастицы, обычно используемые в медицине в настоящее время, являются оксидами железа, полученными в присутствии полисахаридного декстрана в качестве стабилизатора (Bacicfirst 5 years, Am. J. Roentgenol. 155, 943-950, 1990). Синтез таких частиц обычно проводят по методу Молдея (Molday R.S., MacKenzie D., Immunospecific ferromagnetic iron-dextran agents for the labeling andmagnetic separation of cells, J. Immunol. Methods 52, 353-367, 1982), требующему трудоемкие и дорогие методы очистки. Декстран, однако, химически неустойчив, например, он деполяризуется в кислотной среде, и другие различные реакции могут привести к его полному разложению в щелочной среде. Более того, клетки плохо поглощают покрытые декстраном наночастицы, что не способствует безупречному МР мониторингу клеток, возможно, из-за относительно слабого эндоцитоза. Кроме декстрана описано использование других полисахаридов, таких как арабиногалактан (Josephson L., Groman E.V., Menz E.,Lewis J.M., Bengele H., A functionalized superparamagnetic iron oxide colloid as a receptor directed MR contrast agent, Magn. Reson. Imaging 8, 637-646, 1990), крахмал (Fahlvic A.K., Holtz E., Schroder U., Klavenessmicrospheres: a new MR contrast material, Am. J. Roentgenol. 148, 399-404,1987), такие как альбумин, или синтетические полимеры, такие как полиметакрилаты и полисиланы. Также описаны трансфекционные агенты, включающие также поли(аминокислоту)ы, (полиаланины, поли(L-аргинин)ы), ДНК лососиной икры, поли(L-орнитин)ы), дендримеры, полинуклеотиды (Franc J.A., Bulte J.W.M., Pat. WO 02100269 A1),полиглютамат, полиимины (Van Zijk P., Goffeney N., Duyn J.H., Bulte J.W.M., Pat. WO 3049604 A3). Полимерное покрытие существенно увеличивает размер частицы, что может влиять на их проникновение и скорость их метаболического удаления в теле. Недавно были описаны дисперсии непокрытых суперпарамагнитных наночастиц (непокрытых полимером) для МР представления (Cheng F.-Y., Su C.-H.,Yang Y.-S., Yeh C.-s., Tsai c.-L., Wu M.-T., Shieh D.-B., Characterization of aqueous dispersions of Fe3O4nanoparticles and their biomedical applications, Biomaterials 26, 729-738, 2005). Они были получены в воде и стабилизированы, например, мономером цитрата (Taupitz M., Schnorr J., Wagner S.A., Abramjuc С., Pilgrimm H., Kivelitz D., Schinc T., Hansel J., Laub G., Humogen H., Hamm В., Coronary MR angiography: ex-2 015718perimental results with a monomer-stabilized blood pool contrast medium, Radiology 222, 120-126, 2002) или гидроксидом тетраметиламмония Cheng F.-Y., Su C.-H., Yang Y.-S., Yeh C.-s., Tsai c.-L., Wu M.-T., ShiehD.-B., Characterization of aqueous dispersions of Fe3O4 nanoparticles and their biomedical applications, Biomaterials 26, 729-738, 2005). Как утверждают, наночастицы привнесли некоторые преимущества сверх тех,что требует присоединение полимера, чтобы быть защищенными от агрегации. Стволовые клетки проявляют способность видоизменяться в любые специализированные клетки организма и поэтому они находятся в центре внимания человеческой медицины, индивидуальной регенеративной медицины и клеточной терапии, где может быть допущено их использование.injury tepair, Exp. Neurol. 193, 261-262, 2005). Раскрытие изобретения Объектом изобретения являются образцы модифицированных суперпарамагнитных наночастиц на основе оксидов железа для диагностического и терапевтического применений. Образцы суперпарамагнитных наночастиц на основе оксидов железа, в основном магнетит или маггемит с модифицированной поверхностью, образованы коллоидом, включающим частицы, размер которых меняется от 0,5 до 30 нм,преимущественно 1-10 нм, и их коэффициент полидисперсности меньше 1,3. Их поверхность покрыта моно-, ди- или полисахаридами, аминокислотами или поли(аминокислотой)ами или синтетическими полимерами на основе (мет)акриловой кислоты и их производными. Сахариды выбраны из группы, образованной D-арабинозой, D-глюкозой, D-галактозой, D-маннозой, лактозой, мальтозой, декстранами, декстринами. Аминокислота или поли(аминокислота) выбраны из группы, образованной аланином, глицином,глутамином, аспарагином, гистидином, аргинином, L-лизином, аспарагиновой или глутаминовой кислотой. Полимеры производных (мет)акриловой кислоты выбраны из группы, включающей поли(N,Nдиметилакриламид), поли(N,N-диметилметакриламид), поли(N,N-диэтилакриламид), поли(N,N-диэтилметакриламид), поли(N-изопропилакриламид), поли(N-изопропилметакриламид). Поверхностный слой модифицирующего вещества составляет 0,1-30 мас.%, преимущественно 10 мас.%, оксид железа составляет 70-99,9 мас.%, преимущественно 90 мас.%. Вещества на поверхности частиц способствуют их проникновению в клетки. Согласно изобретению образцы суперпарамагнитных наночастиц получают преосаждением коллоидного Fe(OH)3 путем обработки водного 0,1-0,2 М раствора соли Fe(III), преимущественно FeCl3, с содержанием NH4OH меньше эквимолярного, при 21 С, под 2-минутным ультразвуком при 350 Вт. К гидрооксиду добавляют 0,1-0,2 М раствор соли Fe(II), преимущественно FeCl2, с мольным соотношениемFe(III)/Fe(II)=2 под 2-минутным ультразвуком, и смесь приливают от 5- до 10-кратного, преимущественно 8-кратный молярный избыток 0,5 М NH4OH. Смесь выдерживают 0-30 мин, преимущественно 15 мин и затем осадок многократно, преимущественно 7-10 раз, магнитно отделяют и промывают деионизированной водой с сопротивлением 18 Mсм-1. В отличие от настоящего уровня техники 1-3-кратное количество, преимущественно 1,5-кратное количество относительно количества магнетита добавляют 0,1 М водного раствора цитрата натрия и затем по каплям 1-3-кратное количество, преимущественно 1,5 кратное количество относительно количества магнетита 0,7 М водного раствора гипохлорита натрия. Осадок многократно, преимущественно 7-10 раз, промывают деионизированной водой с сопротивлением 18 Mсм-1 при образовании коллоидного маггемита, к которому после разбавления добавляют по каплям, возможно под 5-минутным ультразвуком, водный раствор модифицирующего агента в весовом соотношении модифицирующий агент/оксид железа 0,1-10, преимущественно 0,2 для аминокислот и поли(аминокислот)ы и 5 для сахаридов. Приготовленные таким образом наночастицы достигают размера примерно 10 нм согласно трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) с относительно узким размером распределения, характе-3 015718 ризуемым ПДК 1,3 (фиг. 1). Коллоидная устойчивость частиц в воде является следствием присутствия зарядов, возникающих от Fe(III), и цитрата ионов. Существенная особенность приготовления образцов суперпарамагнитных наночастиц с модифицированной поверхностью согласно изобретению заключается в том, что за осаждением следует медленное добавление раствора модифицирующего агента. Модифицирующий агент при этом неспецифично адсорбируется на поверхности оксида железа. Взаимодействие является результатом водородных связей между полярными ОН группами модифицирующего агента и гидроксилированными и протонированными участками на поверхности оксида или взаимодействия заряда агента с цитратом, комплексно связанного на поверхности оксида железа. Частицы, покрытые модифицирующим агентом, не агрегируют, как было подтверждено ТЭМ микрофотографиями, в соответствии с которыми размер поверхностномодифицированных частиц был таким же, как и размер исходных частиц оксида железа. Альтернативный способ, который делает возможным при его применении, в отличие от текущего состояния, обеспечение очень малых, приблизительно 2 нм, образцов суперпарамагнитных наночастиц с модифицированной поверхностью и с очень узким распределением размеров ПДК 1,1, заключается в осаждении оксида железа in situ в растворе модифицирующего агента. Метод приготовления состоит в том, что 1 объемную долю 10-60 мас.%, преимущественно 50 мас.%, водного раствора сахарида или полисахарида смешивают с 1 объемной долей водного раствора Fe(II) и Fe(III) соли, преимущественноFeCl2 и FeCl3, где мольное соотношение Fe(III)/Fe(II)=2, при 21 С, 5-15%, преимущественно 7,5%, раствор NH4OH добавляют до тех пор, пока не будет достигнут рН 12, и смесь нагревают при 60 С в течение 15 мин. Затем смесь подвергают действию ультразвука при 350 Вт в течение 5 мин и затем промывают в течение 24 ч при помощи диализа в воде, используя мембраны с номинально отсекаемой молекулярной массой 14000, пока не достигнут рН 7. Объем раствора уменьшают выпариванием, таким образом, содержание конечного сухого материала 50-100 мг, преимущественно 80 мг, на 1 мл. Наночастицы модифицированы агентом на основе поли(аминокислот)ы, как полиаланин, полиглицин, полиглутамин, полиаспарагин, полиаргинин, полигистидин или полилизин, аспарагиновой или глутаминовой кислот, моносахаридов (например, арабиноза, глюкоза, манноза, галактоза), дисахаридов (например, лактоза, мальтоза) и полисахаридов, включающих крахмал, декстраны и декстрины, и полимеры производных (мет)акриловой кислоты (например, поли(N,N-диметилакриламид), поли(N,N-диметилметакриламид), поли(N,N-диэтилакриламид), поли(N,N-диэтилметакриламид), поли(N-изопропилакриламид), поли(N-изопропилметакриламид. Образцы суперпарамагнитных наночастиц с модифицированной поверхностью согласно изобретению созданы для маркирования живых клеток, в частности стволовых клеток. Метод может найти широкое применение в мониторинге клеток, пригодных для клеточной терапии, включая эмбриональные стволовые клетки, зародышевые стволовые клетки, стволовые клетки взрослого человека (например,стволовые клетки костного мозга, обонятельные глиальные клетки, клетки жировой ткани). После введения клеток их судьба может быть проконтролирована в теле реципиента нонинвазивным методом, магнитным резонансом. Было обнаружено экспериментально, что способность нацеливания образцов суперпарамагнитных наночастиц согласно изобретению в клетки значительно лучше, чем с частицами оксида железа в соответствии с использовавшимися прежде методами. Поглощение наночастиц оксида железа, модифицированных поли(аминокислотой), клетками сделалось возможным благодаря их взаимодействию с отрицательно заряженной поверхностью клетки и последующей эндосомолитической абсорбции. Таким путем наночастицы переносятся в эндосомы, сливаются с лизосомами при одновременном разрушении везикулярных мембран. Иной механизм транспорта образцов наночастиц в клетки может заключаться в наличии переносчика маннозы, который находится на поверхности многих видов клеток млекопитающего. В сравнении с Endorem (0,11 мг Fe3O4 на 1 мл среды), относительно низкие концентрации наночастиц оксида железа, модифицированных в соответствии с изобретением, были достаточны для полного маркирования клеток. Дополнительным преимуществом является то, что организм пациента относительно менее перегружается примененными частицами, чем требуется при применении коммерчески доступных на данный момент веществ. Изобретение обеспечивает средство для мониторинга истории, судьбы и дифференциации клеток,трансплантированных в организм, включая их миграцию in vivo. В соответствии с изобретением образцы наночастиц пригодны для определения диагнозов патологий, связанных с клеточной дисфункцией. Вопервых, стволовые клетки пациента маркируют ex vivo. В клеточном маркировании, 5-20 мкл, преимущественно 10 мкл, коллоида, содержащего 0,05-45 мг оксида железа на 1 мл, преимущественно 1-5 мг оксида железа на 1 мл среды, добавляют к готовой питательной среде и клетки культивируют в течение 1-7 дней, преимущественно 1-3 дня, при 37 С и 5% СО 2. Во время культирования клетки захватывают методом фагоцитоза наночастицы из среды в цитоплазму. Маркированные таким образом клетки вводят в организм пациента, при этом применение магнитного поля позволяет отслеживать движение, локализацию и продолжительность существования экзогенных клеток путем МРИ представления и таким образом выявлять патологии, связанные с клеточными дисфункциями.-4 015718 Описание чертежей Фиг. 1 - ТЭМ микрофотография исходных (непокрытых) суперпарамагнитных наночастиц оксида железа; фиг. 2 - микроскопическое наблюдение стволовых клеток костного мозга, маркированных (a) Endoreem (контрольный эксперимент, концентрация 0,11 мг Fe3O4/мл), (b) исходные (непокрытые) суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, (с) суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, модифицированные D-маннозой согласно одностадийному методу (концентрация 0.022 мг оксида железа/мл),(d) суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, модифицированные D-маннозой согласно двустадийному методу (концентрация 0,022 мг оксида железа/мл), и (е) суперпарамагнитные частицы оксида железа, модифицированные поли(L-лизином) (концентрация 0,022 мг оксида железа/мл). Масштаб (a-d) 100 мкм, (е) 50 мкм; фиг. 3 - ТЭМ микрофотографии, маркированные суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированными (а) D-маннозой и (b) поли(L-лизином); фиг. 4 - А: желатиновые фантомы, содержащие (а) 100000, (b) 200000, (с) 400000, (d) 600000, (е) 800000, (f) 1000000 и (g) 2000000 клеток, маркированных суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированными поли(L-лизином), и контроли с (h) 100000, (i) 600000 (j) 2000000 немаркированными клетками; В: желатиновые фантомы, содержащие (а, b) 100000 клеток, маркированных суперпарамагнитными частицами оксида железа, модифицированными поли(L-лизином), и (с, d) немаркированные клетки в 0,5 мл. Развртки (а, с) были получены в стандартной турбоспиновой эхочастоте, (b, d) при градиентной эхочастоте. Даже хотя градиентная эхочастота дала худшее соотношение сигнал/шум, наибольшая чувствительность наночастиц оксида железа, модифицированных поли(L-лизином), заметно увеличила соотношение сигнал/шум; С: полушария крысы с (а) 90000 введнными немаркированными клетками и (b) 22000, (с) 45000 и(d) 90000 клетками, маркированными суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированными поли(L-лизином). МР изображения снимали в течение 3 дней после имплантации. Примеры Пример 1. Приготовление исходных (непокрытых) суперпарамагнитных наночастиц оксида железа. 12 мл водного 0,2 М FeCl3 смешали с 12 мл водного 0,5 М NH4OH под ультразвуком (Аппарат Sonicator W-385; Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NY, USA) при лабораторной температуре в течение 2 мин. Затем 6 мл водного 0,2 М FeCl2 прибавили под ультразвуком и смесь влили в 36 мл водного 0,5 М NH4OH. Полученный осадок магнетита оставили на окисление в течение 15 мин, магнитно отделили и многократно (7-10 раз) промыли деионизированной водой с сопротивлением 18 Mсм-1, чтобы удалить все остаточные примеси (включая NH4OH). Затем 1,5 мл водного 0,1 М цитрата натрия добавили под ультразвуком и окислили магнетит путем медленного прибавления 1 мл 5% водного раствора гипохлорита натрия. Вышеприведенная процедура многократного промывания обеспечила исходный первичный коллоид. Для определения размера наночастицы использовали динамическое рассеяние света (ДРС), которое представило средний гидродинамический диаметр частиц в размере 903 нм, предполагая узкое распределение по размерам. Из ТЭМ микрофотографии, фиг. 1, следует, что Dn=6,5 и ПДК=1,26. ПДК - это коэффициент полидисперсности, характеризующий ширины распределения размера, ПДК=Dw/Dn, где Dw иDn - это массово- и численно-средний диаметр частицы. Пример 2. Обработка суперпарамагнитных наночастиц оксида железа поли(аминокислотой)ами двуступенчатый синтез. К 10 мл исходного коллоидного раствора, содержащего наночастицы оксида железа, приготовленного по примеру 1 и разбавленного до концентрации 2,2 мг оксид железа/мл, добавили по каплям при перемешивании 0,01-2 мл (как правило, 0,2 мл) водного раствора поли(аминокислоты) с концентрацией 0,5-10 мг/мл (как правило, 1 мг/мл) и смесь подвергли действию ультразвука в течение 5 мин. Поли(аминокислотой) может быть полиаланин, полиглицин, полиглутамин, полиаспарагин, полиаргинин, полигистидин или поли(L-лизин), аспарагиновая и глутаминовая кислота. Пример 3. Обработка суперпарамагнитных наночастиц оксида железа сахаридами - двуступенчатый синтез. Различные объемы (0,1-5 мл) 4 мас.% водного раствора сахарида добавляли по каплям при перемешивании к 10 мл исходного коллоидного раствора, содержащего наночастицы оксида железа, приготовленного по примеру 1 и разбавленного до концентрации 2,2 мг оксид железа/мл, и смесь подвергли действию ультразвука в течение 5 мин. Затем частицы многократно промыли. Сахаридом может быть D-арабиноза, D-глюкоза, D-галактоза, D-манноза, лактоза, мальтоза, декстраны, декстрины. Пример 4. Обработка суперпарамагнитных наночастиц оксида железа производными-5 015718 прибавили соответствующее количество коллоида, содержащего 0,1-2 г (как правило, 0,5 г) частиц, приготовленного по примеру 1, таким образом, что общий объем смеси составил 30 мл. К раствору добавили 0,1-2 г (как правило, 1 г) производного (мет)акриловой кислоты, раствор барботировали азотом в течение 10 мин и грели при 70 С 8 ч при перемешивании (400 об/мин). Полученный продукт многократно (3-5 раз) магнитно отделили или центрифугировали (14000 об/мин), промыли водой или изотоническим 0,15 М хлоридом натрия и подвергли действию ультразвука до образования коллоидального раствора. Производным (мет)акриловой кислоты может быть поли(N,N-диметилакриламид), поли(N,Nдиметилметакриламид), поли(N,N-диэтилакриламид), поли(N,N-диэтилметакриламид), поли(N-изопропилакриламид), поли(N-изопропилметакриламид). Пример 5. Осаждение in situ суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в растворе сахарида. 10 мл 50 мас.% водного раствора сахарида смешали при перемешивании с 10 мл водного раствора,содержащего 1,51 г FeCl36H2O и 0,64 г FeCl24H2O. 15 мл 7,5% водного NH4OH медленно прибавили,пока не достигли рН 12, и смесь нагрели при 60 С в течение 15 мин. Большие агрегаты были разбиты ультразвуком (Sonicator W-385; Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NY, USA) в течение 5 мин. Для того чтобы удалить водорастворимые соли и избыток сахарида, частицы промыли водным диализом на мембране Вискинга (номинально отсекаемая молекулярная масса 14000, Carl Roth GmbH, Germany) в течение 24 ч при комнатной температуре (воду меняли 5 раз, каждый раз 2 л), пока не достигли рН 7. Объем уменьшили выпариванием: сухой материал 80 мг оксида железа на 1 мл коллоида. Сахаридом может быть D-арабиноза, D-глюкоза, D-галактоза, D-манноза, лактоза, мальтоза, декстран, декстрины. Пример 6. Оптическая микроскопия маркированных клеток. Стволовые клетки костного мозга (МСК) крыс, маркированные как исходными непокрытыми, так и поверхностно-модифицированными суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, наблюдали в оптический микроскоп. Клетки, маркированные Endorem (0,11 мг Fe3O4/мл), выполняли функцию сравнения (фиг. 2 а). Недостатком Endorem являлась его склонность прилипать к клеточной поверхности,более того, он налипал также на дно сосуда. Клетки во взаимодействии с исходными (непокрытыми) наночастицами, приготовленными в соответствии с примером 1, размножились и приблизительно одна из каждых десяти клеток эндоцитировала наночастицы оксида железа с оксида железа (фиг. 2b). Клетки во взаимодействии с исходными (непокрытыми) наночастицами, модифицированными Dманнозой по одностадийному методу (приготовленными осаждением in-situ в концентрированном растворе D-маннозы в соответствии с примером 4), хорошо пролиферировали уже при концентрации 0,02 мг оксида железа/мл, без образования агрегатов частиц, прилипающих к клеточной поверхности (фиг. 2 с). Из наблюдения клеток во взаимодействии с суперпарамагнитными наночастицами, модифицированными D-маннозой по двустадийному методу (после синтеза), в соответствии с примером 3, оптимальная концентрация D-маннозы, добавленная к коллоиду, была определена в размере 12,8 мг Dманнозы на 1 мл коллоида, что обеспечивает маркирование примерно 50% популяции клеток (фиг. 2d). Максимальное маркирование клеток (около 100%) было достигнуто с наночастицами, модифицированными поли(L-лизином) (0,02 мг поли(L-лизина) на 1 мл коллоида (фиг. 2 е. Пример 7. Трансмиссионная электронная микроскопия клеток, маркированных суперпарамагнитными наночастицами оксида железа. Трансмиссионная электронная микрофотография МСК клеток, маркированных суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированных D-маннозой в соответствии с примером 3, и поли(L-лизином) (ПЛЛ) в соответствии с примером 2, показана на фиг. 3. Видны многочисленные агрегаты обоих видов суперпарамагнитных наночастиц внутри клеток, маркированных наночастицами, модифицированными как D-маннозой, так и поли(b-лизином). Агрегаты наночастиц были равномерно распределены в клеточной цитоплазме; их накопление на клеточных мембранах не было заметно. Пример 8. Количественное определение клеток, маркированных суперпарамагнитными наночастицами оксида железа. Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, модифицированные как поли(L-лизином, в соответствии с примером 2, так и D-маннозой в соответствии с примером 3, были успешно эндоцитированы МСК клетками (как следует из фиг. 2 и 3). МСК клетки были культивированы в двух экземплярах на шестилуночных культуральных пластинах при плотности 105 клеток на 1 мм 2.Endorem и наночастицы, модифицированные поли(L-лизином) или D-маннозой, добавили к питательной среде (10 мкл/мл) и клетки выращивали в течение 72 ч. После вымывания избытка контрастного вещества с питательной средой клетки зафиксировали 4% раствором параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PBS) и протестировали на содержание железа образованием ферроцианида железа(III) (берлинская лазурь). Число маркированных и немаркированных клеток определили в отражающий световой микроскоп (Axiovert 200, Zeiss) путем подсчета произвольно выбранных пяти областей в лунке и двух лунок в каждом пробеге (табл. 1). Клетки в каждом образе маркировали вручную как берлинская лазурьположительные или -отрицательные; число маркированных клеток затем подсчитали, используя инстру-6 015718 ментальные средства анализа изображения в программе Matlab 6.1 (The MathWorks, Natick, MA, USA). Наилучшее маркирование клеток было получено при использовании наночастиц, содержащих 0,02 мг поли(L-лизина) на 1 мл коллоида. Таблица 1 Процентное содержание стволовых клеток костного мозга (МСК),маркированных in vitro суперпарамагнитными наночастицами Пример 9. Релаксация клеток, маркированных суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированных поли(L-лизином). Для дальнейшей проверки наличия суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, модифицированных поли(L-лизином), приготовленных согласно примеру 2, в клетках костного мозга (МСК) были приготовлены образцы с суспензией Endorem с суперпарамагнитными наночастицами, модифицированными поли(L-лизином) в 4% желатиновом растворе, и образцы с суспензиями клеток, маркированныхEndorem, и суперпарамагнитными наночастицами, модифицированными поли(L-лизином), с различными содержаниями клеток в желатиновом растворе. Затем было измерено время релаксации образцов и были получены их МР изображения. Для определения времени релаксации Т 1 и Т 2 использовали релаксометр Bruker Minispec 0.5 Т. Значения были пересчитаны на протонные релаксации R1=1/T1, R2=1T2 и отнесены к истинным концентрациям r1=R1/c (с-1/ммоль), r2=R2/с (с-1/ммоль) или были отнесены к числу клеток в 1 мл, где R2 и R1 приведены для желатина. Значения релаксаций представлены в табл. 2 и 3. Из табл. 3 следует, что значение r2 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, модифицированных поли(L-лизином) в соответствии с примером 2, значительно выше, чем с Endorem. Таблица 2 Значения r1 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа,модифицированных поли(L-лизином), (ПЛЛ) и Endorem Таблица 3 Значения r2 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа,модифицированных поли(L-лизином), (ПЛЛ) и Endorem-7 015718 Среднее содержание железа, определенное спектрофотометрически после минерализации, составило 35,9 пг Fe на клетку в суперпарамагнитных наночастицах оксида железа, модифицированных поли(Lлизином), и 14,6 пг Fe на клетку в клетках, маркированных Endorem. Пример 10. In vitro МР изображение клеток, маркированных образцами суперпарамагнитных наночастиц. Изображение маркированных клеток in vitro является полезным для проверки МРИ чувствительности и в то же время для имитации пути сигнала в мозговой ткани. МСК клетки крысы были маркированы суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированными поли(L-лизином) в соответствии с примером 2, и была приготовлена клеточная суспензия в 4% желатиновом растворе концентрации 4000, 2000, 1600, 1200, 800, 400 и 200 клеток на 1 мкл. Немаркированные МСК клетки крысы были суспендированы в 4% желатиновом растворе концентрации 4000, 1200 и 200 клеток на 1 мкл. Клеточные образцы были затем отображены на спектрометре 4.7 Т Bruker, используя стандарт турбоспиновой последовательности (частотные параметры: время повторения TR=2000 мс, эффективное эховремя ТЕ=42,5 мс, турбофактор=4, число приобретений АС=16, область изображения FOV=6464 мм,матрица МТХ=512512, толщина слоя 0,75 мм, установленная геометрия обеспечила аналогичный размер воксела как при in vivo измерении) и градиент эхочастоты (TR=180 мс, ТЕ=12 мс, геометрия изображения та же). При использовании обеих частот клетки, маркированные суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированными поли(L-лизином) (фиг. 4 А, В) или D-маннозой, дают превосходный контраст в сравнении с немаркированными клетками. Видимый контраст в МР изображении также наблюдали в образце, каждое изображение воксела которого содержало в среднем не более 2,3 клеток. Похожие серии экспериментов были представлены в предшествующей работе (Jendelov P., Herynec V.,DeCroos J., Glogarov K., Andersson В., Hjek M., Sykov E., Imaging the fate of implanted bone marrowstromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles, Magn. Reson. Med. 50, 767-776, 2003), где МР изображение желатиновых фантомов показало гипоинтенсивный сигнал при концентрациях свыше 625 клеток на 1 мкл. Пример 11. In vivo МР изображение клеток, маркированных образцами суперпарамагнитных наночастиц. В процессе измерения использовались крысы Вистара, подвергнутые анестезии путем пассивной ингаляции 1,5-2% изофлорана в воздухе, при осуществлении контроля дыхания. За крысами осуществляли контроль в течение 3 дней после трансплантации на спектрометре Bruker 4.7 Т, оборудованным поверхностной катушкой отечественного производства. Простая сагиттальная, корональная и поперечная развертки были получены быстрым градиентным эхосигналом для локализации последующих T2- и Т 2 утяжеленных изображений, измеренных стандартной турбоспиновой последовательностью (TR=2000 мс,ТЕ=42,5 мс, турбофактор=4, АС=16, FOV=3030 мм, матрица МТХ 256256, толщина слоя 0,75 мм), и градиент эхочастоты (TR=180 мс, ТЕ=12 мс, геометрия изображения та же). Фиг. 4 С доказывает, что клетки, маркированные суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, модифицированными поли(L-лизином) согласно примеру 2, были отчетливо различимы также in vivo. Импланты немаркированных клеток были видны на МР изображениях как тканевая неоднородность без гипоинтенсивного сигнала (фиг. 4 С). Промышленное применение Изобретение может быть использовано в человеческой и ветеринарной медицине, биологии и микробиологии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Суперпарамагнитные наночастицы на основе оксидов железа с модифицированной поверхностью, отличающиеся тем, что они покрыты моно-, ди- или полисахаридами из группы, включающей Dарабинозу, D-глюкозу, D-галактозу, D-маннозу, лактозу, мальтозу, декстраны и декстрины, или аминокислотами или поли(аминокислотой)ами из группы, включающей аланин, глицин, глутамин, аспарагин,гистидин, аргинин, L-лизин, аспарагиновую и глутаминовую кислоту, или полимеры производных(мет)акриловой кислоты из группы, включающей поли(N,N-диметилакриламид), поли(N,Nдиметилметакриламид),поли(N,N-диэтилакриламид),поли(N,N-диэтилметакриламид),поли(Nизопропилакриламид), поли(N-изопропилметакриламид), и образуют коллоид, состоящий из частиц с узким распределением размеров с коэффициентом полидисперсности менее 1,3, при этом средний размер частиц колеблется между 0,5 и 30 нм, содержание оксида железа составляет 70-99,9 мас.%, а содержание модифицирующего вещества составляет 0,1-30 мас.%. 2. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что их размер меньше 2 нм и коэффициент полидисперсности менее 1,1. 3. Способ получения суперпарамагнитных наночастиц по п.1 или 2, отличающийся тем, что коллоидный Fe(OH)3 осаждают обработкой водным 0,1-0,2 М раствором соли Fe(III) при обработке ультразвуком с содержанием NH4OH меньше эквимолярного, при 21 С, затем добавляют 0,1-0,2 М раствор солиFe(II) в мольном соотношении Fe(III)/Fe(II)=2 и смесь заливают в 5- до 10-кратного молярный избыток 0,5 М NH4OH, смесь выдерживают 0-30 мин, затем осадок многократно магнитно отделяют и промывают деионизированной водой с сопротивлением 18 Mсм-1, затем прибавляют 1-3-кратное количество относительно количества магнетита 0,1 М водного раствора цитрата натрия при обработке ультразвуком и затем после этого этапа по каплям 1-3-кратное количество относительно количества магнетита 0,7 М водного раствора гипохлорита натрия, затем осадок многократно промывают деионизированной водой с сопротивлением 18 Mсм-1 при образовании коллоидного маггемита, к которому после разбавления добавляют по каплям, при необходимости под обработкой ультразвуком в течение 5 мин, водный раствор модифицирующего агента, в весовом соотношении модифицирующий агент/оксид железа 0,1-10. 4. Способ получения суперпарамагнитных наночастиц по п.1 или 2, отличающийся тем, что 1 объемную долю 10-60 мас.% водного раствора сахарида или полисахарида, такого как D-арабиноза, Dглюкоза, D-галактоза, D-манноза, лактоза, мальтоза, декстран, декстрины, смешивают с 1 объемной долей водного раствора Fe(II) и Fe(III) соли, в котором мольное соотношение Fe(III)/Fe(II)=2, при 21 С, 515% раствор NH4OH добавляют до тех пор, пока не будет достигнут рН 12, и смесь нагревают при 60 С в течение 15 мин, затем смесь подвергают действию ультразвука при 350 Вт в течение 5 мин и затем промывают в течение 24 ч при помощи диализа в воде, используя мембраны с номинально отсекаемой молекулярной массой 14000, пока не достигнут рН 7, при этом объем раствора уменьшают выпариванием,таким образом обеспечивая содержание конечного сухого материала 50-100 мг на 1 мл. 5. Применение суперпарамагнитных наночастиц по п.1 или 2 для маркирования клеток, используемого в магнитно-резонансной интроскопии для мониторинга их движения, локализации, выживания и дифференциации. 6. Применение суперпарамагнитных наночастиц по п.1 или 2 для маркирования и мониторинга клеток, введенных в целях клеточной терапии, эмбриональных стволовых клеток, зародышевых стволовых клеток, стволовых клеток взрослого человека, включая стволовые клетки костного мозга, обонятельных глиальных клеток, клеток жировой ткани в теле реципиента методом магнитно-резонансной интроскопии. 7. Применение суперпарамагнитных наночастиц по п.1 или 2 для маркирования клеток для мониторинга изменения трансплантированных в организм клеток методом магнитно-резонансной интроскопии,отличающееся тем, что 5-20 мкл коллоида, содержащего 0,05-45 мг оксида железа на 1 мл среды, добавляют к готовой питательной среде и клетки культивируют в течение 1-7 дней при 37 С и 5% CO2.