Способ усиления продукции белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами (варианты)

СПОСОБ УСИЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ БЕЛКОВ, КОДИРУЕМЫХ РЕКОМБИНАНТНЫМИ АДЕНОВИРУСАМИ (ВАРИАНТЫ) Настоящее изобретение относится к области генной терапии, в частности к генной терапии с использованием рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов. Конкретнее, настоящее изобретение относится к способам усиления продукции белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, предусматривающим обработку инфицированных аденовирусом клеток LY294002(2-(4-морфолинил)-8-фенил-4 Н-1-бензопиран-4-оном) или LY303511 (2-(4-пиперазинил)-8 фенил-4 Н-1-бензопиран-4-оном) или их производными (совместно или последовательно с одним или несколькими дополнительными воздействиями, приводящими к усилению продукции белков,либо без таких воздействий). Коробко Игорь Викторович, Коробко Елена Владимировна (RU) Малахов С.В. (RU)Adenoviral Vectors", Cancer Research, 2008, v. 68,no. 23, p. 1-14, [найдено 08.02.2010], Найдено из Интернет URL:http://cancerres.aacrjournals org/(71)(73) Заявитель и патентовладелец: УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН (RU) Область техники, к которой относится настоящее изобретение Настоящее изобретение относится к области генной терапии, в частности к генной терапии с использованием рекомбинантных аденовирусов. Предшествующий уровень техники настоящего изобретения Генная терапия занимает все большее место в клинической практике. Одним из способов доставки терапевтического гена в клетки-мишени в организме является использование рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов, которые содержат модуль для экспрессии белка-мишени. В частности,подобный подход интенсивно исследуется для доставки терапевтических генов с целью элиминации опухолевых клеток. В качестве примеров можно привести проходящие в настоящее время клинические испытания репликативно-дефектных аденовирусов: (1) аденовирус для продукции эндостатина (для использования при раке головы и шеи, Sun Yat-sen University и Doublle Bioproduct, Inc., 2 фаза клинических испытаний; ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrails.gov) Identifier: NCT00634595); (2) аденовирус для продукции Her2, используемого для модификации дендритных клеток и последующей терапии с их помощью опухолей молочной железы (Hamilton Health Sciences, Ontario Cancer Research Network и CanadianIdentifier: NCT00197522); (3) аденовирус для продукции фактора некроза опухоли-альфа, используемого для терапии рака поджелудочной железы (GenVec, TNFerade, 3 стадия клинических испытаний; ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrails.gov) Identifier: NCT00051467), а также использование в клинической практике в Китае с 2003 года препарата Gendicine, представляющим собой рекомбинантный репликативно-дефектный аденовирус для продукции белка р 53 (Ma G., Shimada H., Hiroshima K., Tada Y., Suzukidata in China. Drug Des Dev Therapy 2008; 2:115-122). Одним из факторов, от которого зависит эффективность основанной на репликативно-дефектных аденовирусах терапии, является эффективная продукция белка-мишени, кодируемого аденовирусом, действующего начала рекомбинантного аденовируса. Увеличения уровня продукции белка-мишени можно добиться несколькими способами: например, увеличивая транскрипционную активность промотора, контролирующего экспрессию белка-мишени, или увеличивая множественность заражения аденовирусом. Однако оба этих способа имеют ограниченные возможности. Выбор промотора, как правило,ограничен специфичностью его активности именно в опухолевых, а не в нормальных клетках, и возможности увеличения его активности за счет введения дополнительных цис-действующих элементов без потери специфичности ограничены. Например, активность опухоль-специфического промотора hTERT действительно можно увеличить, однако, описано всего лишь два способа (введение последовательности синтетического ТАТА-бокса (Wirth T, Zender L, Schulte В, Mundt В, Plentz R, Rudolph KL, Manns M, Kubicka S, Khnel F. A telomerase-dependent conditionally replicating adenovirus for selective treatment ofcancer. Cancer Res. 2003; 63(12):3181-8) или минимального CMV-промотора (Davis JJ, Wang L., Dong F.,Zhang L., Guo W., Teraishi F., Xu K., Ji L., Fang B. Oncolysis and suppression of tumor growth by a GFPexpressing oncolytic adenovirus controlled by an hTERT and CMV hybrid promoter. Cancer Gene Ther. 2006; 13(7):720-3), приводящие к увеличению активности. Увеличение дозы вводимого аденовируса также имеет пределы по неспецифической токсичности. Кроме того, увеличение дозы вводимого аденовируса приводит к возникновению более эффективного иммунного ответа организма на аденовирус, что снижает его эффективность вплоть до полной ее потери. Таким образом, одной их насущных задач является поиск новых способов, позволяющих увеличить количество белка-мишени, экспрессией которого управляют рекомбинантные аденовирусы. В результате исследования совместного действия препаратов аденовирусов и традиционно используемых противоопухолевых средств было установлено, что некоторые из них способны усиливать продукцию белка-мишени, кодируемого рекомбинантными терапевтическими аденовирусами. К таким воздействиям относятся сопутствующее облучение (Hingorani M., White C.L., Zaidi S., Merron A., Peerlinck I.,Gore M.E., Nutting C.M., Pandha HS, Melcher AA, Vile RG, Vassaux G., Harrington KJ. Radiation-mediateddouble suicide gene expression, cytotoxicity and radiotoxicity. Cancer Gene Ther. 2002; 9(3): 267-74), совместное применение этопозида (Shieh GS, Shiau AL, Yo YT, Lin PR, Chang CC, Tzai TS, Wu CL. Low-dosecells through increased caspase-2 activity. Apoptosis. 2007; 12: 561-71). Увеличение эффективности генной терапии с использованием аденовирусов при их одновременном применении с этопозидом была продемонстрирована в экспериментальных моделях рака поджелудочной железы на мышах. При этом было продемонстрировано, что одновременная обработка этопозидом приводило к повышению уровня продукции трансгена, кодируемого аденовирусом (Liu X., Li J., Tian Y., Xutherapy by combination of adenoviral vector expressing c-erb-B2(Her-2/neu) targeted immunotoxin with a replication competent adenovirus or etoposide. Hum Gene Ther. 2009 Sep. 14. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 19751100). Аналогичные результаты были получены для моделей рака поджелудочной железы с совместным применением рекомбинантного репликативно-дефектного аденовируса и цисплатина, 5 фторурацила и этопозида (Egami T., Ohuchida K., Miyoshi K., Mizumoto K., Onimaru M., Toma H., Sato N.,Matsumoto K., Tanaka M. Chemotherapeutic agents potentiate adenoviral gene therapy for pancreatic cancer.Cancer Sci. 2009;100(4): 722-9). Эффективность этопозида в увеличении эффективности действия аденовирусных препаратов была также продемонстрирована на модели рака мочевого пузыря (Shieh GS, ShiauAL, Yo YT, Lin PR, Chang CC, Tzai TS, Wu CL. Low-dose etoposide enhances telomerase-dependent adenovirus-mediated cytosine deaminase gene therapy through augmentation of adenoviral infection and transgene expression in a syngeneic bladder tumor model. Cancer Res. 2006;66(20): 9957-66). Существенное увеличение эффективности было отмечено и при клиническом применении препарата рекомбинантного репликативно-дефектного аденовируса для продукции белка р 53 Gendicine. Применение гендицина совместно с химиотерапией (ингибитор топоизомераз камптотецин (является аналогом топотекана), доксорубицином и 5-фторурацилом приводило к увеличению эффективности терапии по сравнению только с химиотерапией - увеличение 6-месячной продолжительности жизни от 23,2 до 76,5% (Ma G., Shimada H., Hiroshimaaccumulated clinical data in China. Drug Des Dev Therapy 2008; 2:115-122). Это, хотя не позволяет судить о повышенной эффективности аденовирусной терапии при одновременном применении с химиотерапевтическими средствами, однозначно указывает на увеличение эффективности химиотерапии при ее комбинации с аденовирусными препаратами. Таким образом, не вызывает сомнения факт увеличения эффективности терапии при совместном применении аденовирусных и химиотерапевтических препаратов,причем для некоторых из химиотерапевтических препаратов (см. выше) было продемонстрировано, что они приводят к увеличению эффективности аденовирусной терапии. Сопутствующие аденовирусной терапии воздействия, приводящие к усилению продукции белкамишени, вызывали улучшение эффективности инфекции аденовируса за счет усиления экспрессии рецепторов для аденовируса на поверхности клеток (этопозид (Shieh GS, Shiau AL, Yo YT, Lin PR, ChangHistone deacetylase inhibitor FR901228 enhances the antitumor effect of telomerase-specific replicationselective adenoviral agent OBP-301 in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2006; 312(3): 256-65 благодаря влиянию на постинфекционные процессы (топотекан, ингибирование топоизомеразы I (Zamir G., ZeiraE., Gelman AE, Shaked A., Olthoff KM, Eid A., Galun E. Replication-deficient adenovirus induces host topoisomerase I activity: implications for adenovirus-mediated gene expression. Mol Ther. 2007; 15(4): 772-81, или действуя одновременно на пост-инфекционном уровне и улучшая эффективность инфекции (облучение(Hingorani M., White CL, Zaidi S., Merron A., Peerlinck I., Gore ME, Nutting CM, Pandha HS, Melcher AA,Vile RG, Vassaux G., Harrington KJ. Radiation-mediated up-regulation of gene expression from replicationdefective adenoviral vectors: implications for sodium iodide symporter gene therapy. Clin Cancer Res. 2008; 14(15): 4915-24. Комбинированное применение терапии на основе рекомбинантных аденовирусов и таких противоопухолевых воздействий позволяет, с одной стороны, увеличить эффективность аденовирусной терапии, а с другой - сочетать в терапии два противоопухолевых средства, что повышает общую ее эффективность при условии отсутствия резистентности опухолевых клеток к этому сопутствующему воздействию. Расширение спектра противоопухолевых средств, обладающих способностью увеличивать эффективность аденовирусной терапии, позволит проводить их подбор для сочетания с аденовирусной терапией с учетом чувствительности к ним опухолевых клеток, что позволит достичь максимального терапевтического эффекта. Это делает актуальным идентификацию противоопухолевых средств, которые, помимо своей противоопухолевой активности, способны увеличивать эффективность аденовирусной терапии, усиливая экспрессию белка-мишени, кодируемого рекомбинантным аденовирусом. Соединения LY294002 и LY303511 как противораковые средства Внутриклеточный сигнальный каскад, включающий в себя PI3K-протеинкиназу Akt-mTOR, часто аномально активирован в опухолевых клетках и является привлекательной мишенью для терапии опухолей путем его ингибирования (LoPiccolo J., Blumenthal GM, Bernstein WB, Dennis PA. Targeting theCancer. 2009; 9(8): 550-62). В частности, производное ингибитора mTOR рапамицина, темсиролимус, в настоящее время одобрен для лечения некоторых типов опухолей. Однако опухолевые клетки часто приобретают резистентность к рапамицину, что делает необходимым поиск иных ингибиторов mTORсигнального пути. Соединение LY294002 (2-(4-морфолинил)-8-фенил-4 Н-1-бензопиран-4-он) обладает способностью ингибировать фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы mTOR и казеинкиназу II. Указанное соединение само по себе не является фармакологически применимым ингибитором в силу его нерастворимости в воде и быстрого распада после введения. Однако его растворимое в воде производное (конъюгат с пептидом RGDS), SF1126 (Semaphore Pharmaceuticals Inc) является перспективным лекарственным средством и проходит в настоящее время клинические испытания как ингибитор PI3K. В публикацииSF1126 по эффективному действию как противоопухолевого препарата на модели опухолей на мышах. К настоящему времени результаты клинических испытаний SF 1126 (I фаза) свидетельствуют о хорошей толерантности к SF1126 у пациентов и его клинической активности у пациентов с солидными опухолями, выраженную в стабилизации болезни (Chiorean et al., ASCO 2009, J. Clin Oncol). Близкий структурный аналог LY294002 - соединение LY303511 (2-(4-пиперазинил)-8-фенил-4 Н-1 бензопиран-4-он) - не способен ингибировать PI3K, но сохраняет способность ингибировать активностьmTOR и казеинкиназы П. Будучи ингибиторами mTOR-сигнального пути, LY303511 и его производные рассматриваются как перспективные средства для ингибирования нежелательной пролиферации клеток,в том числе опухолевых (заявка на выдачу патента США 20070173514). Соединение LY303511 сенсибилизирует клетки к апоптозу, индуцированному химиотерапевтическими средствами (например, винкристином) (Poh TW, Pervaiz S. LY294002 and LY303511 sensitize tumor cells to drug-induced apoptosis viaRes. 2005; 65(14): 6264-74) и ингибирует пролиферацию клеток в культуре, а также рост опухоли у мышей в модельной системе (Kristof AS, Pacheco-Rodriguez G., Schremmer В., Moss J. LY303511 (2piperazinyl-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one) acts via phosphatidylinositol 3-kinase-independent pathways toPharmacol Exp Ther. 2005; 314(3): 1134-43), что делает его перспективным как противоопухолевое средство. Компания Emiliem Inc. в настоящее время проводит исследования LY303511 (под названием ЕМ 101) и его аналогов в качестве возможных фармацевтических препаратов. Таким образом, LY294002, LY303511 и их производные являются основой для разработки перспективных препаратов, одной из ниш применения которых является лечение онкологических заболеваний. Раскрытие настоящего изобретения Был проведен скрининг веществ, используемых в качестве противоопухолевых средств (доксициклин, таксол, цисплатин, нокодазол) или являющихся их перспективными прототипами (ингибитор VIII протеинкиназы GSK3P, ингибитор X протеинкиназы Akt, ингибитор фосфоинозитид-3-киназ LY294002),на модели клеток опухоли легких NCI-H1299 и рекомбинантного репликативно-дефектного аденовирусаAd-Tet-EGFP, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (EGFP) под контролем тетрациклинрегулируемого промотора, на предмет усиления экспрессии белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом. В результате анализа было установлено, что из исследованных веществ только обработка клеток ингибитором фосфоинозитид-3-киназ LY294002 приводит к увеличению уровня продукции EGFP(фиг. 1). В то же время, другой ингибитор фосфоинозитид-3-киназ, вортманнин, не оказывал аналогичного эффекта на уровень продукции EGFP (фиг. 1). Это говорит о том, что эффект LY294002 на экспрессиюEGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом, не зависит от способности LY294002 ингибировать фосфоинозитид-3-киназы, а зависит от других активностей LY294002. Известные активности LY294002 включают в себя способность ингибировать протеинкиназы mTOR и казеинкиназу II. Из фиг. 1 ясно, что способность LY294002 оказывать эффект на продукцию кодируемого аденовирусом EGFP не зависит от его способности ингибировать действие сигнального комплекса протеинкиназы mTOR, mTORC1, поскольку рапамицин, другой ингибитор mTORC1, не обладает подобным свойством, однако не исключает возможности ингибирования другого сигнального комплекса mTOR, mTORC2, на активность которого рапамицин не оказывает влияния. Поскольку эффект LY294002 не зависит от его способности ингибировать активность фосфоинозитид-3-киназ, было исследовано влияние его неактивного в отношении фосфоинозитид-3-киназ аналога,LY303511, на экспрессию EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом. Как и LY294002,-3 019422LY303511 обладал способностью усиливать продукцию EGFP в клетках линии NCI-H1299 (фиг. 2). Усиление продукции EGFP, кодируемого аденовирусом, при обработке клеток LY294002, LY303511, как и этопозидом, является дозозависимым (фиг. 3). Обнаруженная способность LY294002 и LY303511 усиливать экспрессию рекомбинантных белков,кодируемых аденовирусом, не является узкоспецифичной для исследованной комбинации тетрациклинрегулируемого промотора и зеленого флуоресцентного белка. На фиг. 4 показано, что аналогичный эффект наблюдается и для раннего промотора цитомегаловируса (CMV) или промотора гена теломеразной обратной транкриптазы человека (hTERT) в комбинации с геном тимидинкиназы 1 вируса простого герпеса человека. Также был исследован эффект совместного применения ингибитора топоизомеразы II этопозида иLY303511 или LY294002 на усиление продукции рекомбинантных белков, кодируемых аденовирусом. Как видно из фиг. 4, совместная обработка клеток, инфицированных рекомбинантным аденовирусом,обладает синергетическим действием и приводит к значительно большему усилению продукции белковEGFP и тимидинкиназы, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, чем при обработке этопозидом или LY303511/LY294002 по отдельности. Аналогичный эффект наблюдался и при совместном приминении LY303511 и ингибитора топоизомеразы I камптотецина (фиг. 5). Следует отметить, что тимидинкиназа вируса простого герпеса является перспективным для терапевтических целей агентом для уничтожения опухолевых клеток, а промотор hTERT является опухоль-специфическим и используется для обеспечения специфической экспрессии терапевтических белков не только в опухолевых, но не в нормальных клетках. Поэтому способность LY294002 и LY303511 по отдельности, а также совместно с этопозидом, усиливать продукцию тимидинкиназы в опухолевых клетках является предпосылкой для их использования (или использования их производных) как противоопухолевых средств совместно с аденовирусными противоопухолевыми препаратами с целью получения синергетического эффекта от их применения, а также позволяя снизить дозу вводимого аденовируса. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу усиления продукции белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, предусматривающему обработку инфицированных аденовирусом клеток LY294002 или LY303511 или их производными. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу усиления продукции белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, предусматривающему обработку инфицированных аденовирусом клеток LY294002 или LY303511 или их производными совместно или последовательно с одним или несколькими дополнительными воздействиями, приводящими к усилению продукции белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами. В соответствии с конкретными вариантами осуществления этого комбинированного способа дополнительное воздействие может заключаться в облучении, гипертермии, обработке этопозидом, камптотецином, топотеканом или ингибитором гистондезацетилаз. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления обоих способов рекомбинантные аденовирусы предназначены для остановки роста опухолевых клеток, причем под остановкой роста понимают не только прекращение их деления и остановку роста опухоли в размерах и ее метастазирования,но и уничтожение клеток с редукцией опухоли. Очевидно, поскольку соединения LY294002, LY303511 и их производные, а также упомянутые дополнительные воздействия клинически апробированы, все они - по отдельности или совместно - могут использоваться как в исследованиях in vitro, так и для оказания противоопухолевого эффекта in vivo. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления способов согласно настоящему изобретению LY294002 или LY303511 или их производными (с дополнительным воздействием или без него) обрабатывают культуру инфицированных аденовирусом клеток in vitro. В соответствии с другим вариантом осуществления способов согласно настоящему изобретению LY294002 или LY303511 или их производными (с дополнительным воздействием или без него) обрабатывают инфицированные аденовирусом клетки in vivo, используя традиционные, широко известные в данной области техники пути доставки терапевтического агента к клетке-мишени. Таким образом, в соответствии с заявленными способамиLY294002, LY303511 и их производные, а также упомянутые дополнительные воздействия могут быть использованы как противоопухолевые средства для проведения противоопухолевой терапии. Как уже отмечалось, LY294002 и LY303511 плохо растворимы в воде, поэтому для их растворения можно использовать другие растворители, например, диметилсульфоксид (ДМСО). Известно, что с определенными ограничениями ДМСО и ряд других органических растворителей может быть включен в состав фармацевтических композиций. Однако, в случае когда желательно повысить растворимостьLY294002 и LY303511 именно в воде, это может быть сделано в соответствии с методиками, хорошо известными среднему специалисту в данной области техники. Так, известно растворимое в воде производное LY294002 - SF1126, которое представляет собой конъюгат LY294002 с пептидом RGDS. Для создания растворимых в воде производных применимо конъюгирование соединений и с другими аминокислотными последовательностями. Растворимость указанных соединений в воде может быть повышена и путем внесения в их структуру других гидрофильных функциональных групп. Такие производныеLY294002 и LY303511, в т.ч. соли, также подпадают под объем настоящего изобретения. Среднему специалисту в данной области техники также будет очевидно, что соединения LY294002,-4 019422LY303511 и их производные применимы для целей настоящего изобретения и в виде солей, в частности,фармацевтически приемлемых солей. Используемый здесь термин "соль(и)" включает в себя кислотно-аддитивные соли, образуемые неорганическими и/или органическими кислотами, равно как и основно-аддитивные соли, образуемые неорганическими и/или органическими основаниями. Кроме того, если соединение или его производное содержит как основный радикал, такой как без ограничения пиридин или имидазол, так и кислый радикал, такой как без ограничения карбоновая кислота, могут образовываться и включаются в используемый здесь термин "соль(и)" цвиттерионы ("внутренние соли"). Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые (т.е. нетоксичные, физиологически приемлемые) соли, хотя в ряде случаев также применимы и другие соли. Соли указанных соединений или их производных могут образовываться, например, в результате взаимодействия соединения или его производного с количеством кислоты или основания, таким как эквивалентное количество, в среде, такой как среда, в которой соль выпадает в осадок,или в водной среде с последующей лиофилизацией. Показательные кислотно-аддитивные соли включают в себя ацетаты, аскорбаты, бензоаты, бензолсульфонаты, бисульфаты, бораты, бутираты, цитраты, камфораты, камфорсульфонаты, фумараты, гидрохлориды, гидробромиды, гидройодиды, лактаты, малеаты, метансульфонаты, нафталинсульфонаты, нитраты, оксалаты, фосфаты, пропионаты, салицилаты, сукцинаты, сульфаты, тартраты, тиоцианаты, толуолсульфонаты (также известные как тозилаты) и т.п. Кроме того, кислоты, которые, как правило, считаются подходящими для образования фармацевтически применимых солей основными фармацевтическими соединениями, обсуждаются, например, в работах P. Stahl et al., Camille G. (eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection и Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH; S. Berge et al., Journal of PharmaceuticalPractice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; и в The Orange Book (FoodDrug Administration, Washington D.C. на его Интернет-сайте). Эти публикации включены в настоящее описание посредством ссылки на них. Показательные основно-адцитивные соли включают в себя соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия, лития и калия, соли щелочно-земельных металлов, такие как соли кальция и магния, соли органических оснований (например, органических аминов), таких как дициклогексиламины, трет-бутиламины, и соли аминокислот, таких как аргинин, лизин и т.п. Основные азотсодержащие группы могут быть кватернизованы с помощью таких агентов, как галогениды низших алкилов (например, метил-, этил- и бутилхлориды, бромиды и йодиды), диалкилсульфаты (например, диметил-, диэтили дибутилсульфаты), длинноцепочечные галогениды (например, децил-, лаурил- и стеарилхлориды, бромиды и йодиды), аралкилгалогениды (например, бензил- и фенэтилбромиды) и другие. Подразумевается, что все подобные кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли являются фармацевтически приемлемыми солями в пределах объема изобретения, и для целей настоящего изобретения все кислотно-аддитивные и основно-аддитивные соли считаются эквивалентными свободным формам соответствующих соединений. Краткое описание фигур Фиг. 1. LY294002 усиливает продукцию белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусомGSK3 ; ингибитор Akt X, 10 мкМ ингибитора Akt X; LY294002, 50 мкМ LY294002; вортманнин, 200 нМ вортманнин; рапамицин, 500 нг/мл рапамицина; EGFP, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к EGFP; -тубулин, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Фиг. 2. LY294002 и LY303511 усиливают продукцию белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP. -, клетки, не обработанные ингибиторами; LY2, LY294002; LY3, LY303511;EGFP, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к EGFP; -тубулин, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Фиг. 3. Концентрационная зависимость способности этопозида, LY294002 и LY303511 усиливать продукцию белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP. EGFP, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к EGFP; -тубулин, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Фиг. 4. Способность LY294002 и LY303511 усиливать экспрессию белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, является универсальной для различных белков и промоторов, контролирующих их экспрессию, и синергетична с действием этопозида. Снизу приведены результаты количественной оценки уровня продукции кодируемых аденовирусами белков после нормирования на количество тубулина (уровень белка в необработанных ингибиторами клетках принят за 1,0), eto, этопозид; LY2,LY294002; LY3, LY303511; EGFP, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к EGFP; ТК,образовавшиеся комплексы поликлональных антител к тимидинкиназе вируса простого герпеса человека; -тубулин, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке.EGFP, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к EGFP; -тубулин, образовавшиеся комплексы моноклональных антител к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Примеры Пример 1. LY294002 усиливает продукцию белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP. Клетки линии NCI-H1299 рассевали в лунки 24-луночного планшета (20000 клеток/лунку) и на следующий день заражали аденовирусом Ad-Tet-EGFP с множественностью заражения 10 БОЕ/клетка. Через 24 ч аденовирус удаляли и клетки обрабатывали в течение 24 ч 10 мкМ ингибитора GSK3P VIII, 10 мкМ ингибитора Akt X, 50 мкМ LY294002, 200 нМ вортманнина и 500 нг/мл рапамицина, после чего клетки лизировали и проводили Вестерн-блот анализ лизатов с моноклональными анти-EGFP антителами и моноклональными антителами к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Результаты эксперимента приведены на фиг. 1. Из фигуры следует, что обработка клеток LY294002 усиливает продукцию кодируемого аденовирусом белка, как ни один из четырех остальных ингибиторов. Пример 2. LY294002 и LY303511 усиливают продукцию белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP. Клетки линии NCI-H1299 рассевали в лунки 24-луночного планшета (20000 клеток/лунку) и на следующий день заражали аденовирусом Ad-Tet-GFP с множественностью заражения 10 БОЕ/клетка. Через 24 ч аденовирус удаляли и клетки обрабатывали LY294002 (LY2) или LY303511 (LY3) в концентрации 50 мкМ в течение 8, 18 или 24 ч, после чего клетки лизировали и проводили Вестерн-блот анализ лизатов с моноклональными анти-EGFP антителами и моноклональными антителами к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Результаты эксперимента приведены на фиг. 2. Из фигуры следует, что обработки клеток как LY294002, так и LY303511 одинаково успешно усиливают продукцию кодируемого аденовирусом белка, демонстрируя наилучшие результаты после воздействия в течение 18 и 24 ч. Пример 3. Концентрационная зависимость способности этопозида, LY294002 и LY303511 усиливать продукцию белка EGFP, кодируемого рекомбинантным аденовирусом Ad-Tet-EGFP. Клетки линии NCI-H1299 рассевали в лунки 24-луночного планшета (20000 клеток/лунку) и на следующий день заражали аденовирусом Ad-Tet-EGFP с множественностью заражения 10 БОЕ/клетка. Через 24 ч аденовирус удаляли и клетки обрабатывали этопозидом в концентрациях 0, 0,8, 3, 12,5 и 50 мкМ,LY294002 в концентрациях 0, 0,8, 3, 12,5 и 50 мкМ или LY303511 в концентрациях 0, 1,4, 10, 25, 50 и 100 мкМ в течение 24 ч, после чего клетки лизировали и проводили Вестерн-блот анализ лизатов с моноклональными анти-EGFP антителами и моноклональными антителами к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. Результаты эксперимента приведены на фиг. 3. Из фигуры очевидно следует, что все три вещества усиливают продукцию кодируемого аденовирусом белка в прямой зависимости от их дозы. Пример 4. Способность LY294002 и LY303511 усиливать экспрессию белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, является универсальной для различных белков и промоторов, контролирующих их экспрессию, и синергетична с действием этопозида. Клетки линии NCI-H1299 рассевали в лунки 24-луночного планшета (20000 клеток/лунку) и на следующий день заражали указанными аденовирусами: Ad-Tet-EGFP, кодирующим EGFP под контролем тетрациклин-регулируемого промотора; Ad-CMV-TK, кодирующим тимидинкиназу вируса простого герпеса под контролем раннего промотора цитомегаловируса; Ad-hTERT-TK, кодирующим тимидинкиназу вируса простого герпеса под контролем промотора гена теломеразой обратной транскриптазы человкеа (hTERT), со значениями множественности заражения 10 БОЕ/клетка для аденовирусов Ad-TetEGFP и Ad-CMV-TK и 200 БОЕ/клетка для аденовируса Ad-hTERT-TK. Через 24 ч аденовирусы удаляли и клетки обрабатывали этопозидом (10 мкМ), LY294002 (25 мкМ) или LY303511 (25 мкМ) в указанных на фиг. 4 комбинациях в течение 24 ч, после чего клетки лизировали и проводили Вестерн-блот анализ лизатов с моноклональными анти-EGFP антителами или поликлональными антителами к тимидинкиназе вируса простого герпеса человека и моноклональными антителами к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. В результате эксперимента было обнаружено, что по отдельности этопозид, LY294002 и LY303511 усиливают продукцию кодируемого аденовирусом белка независимо от типа кодируемого белка и используемых промоторов, но наиболее существенное усиление наблюдается при совместном использовании этопозида и LY294002 или этопозида и LY303511. Пример 5. Способность LY303511 усиливать экспрессию белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, синергетична с действием камптотецина. Клетки линии NCI-H1299 рассевали в лунки 24-луночного планшета (20000 клеток/лунку) и на следующий день заражали аденовирусом Ad-Tet-EGFP, кодирующим EGFP под контролем тетрациклинрегулируемого промотора, со значениями множественности заражения 10 БОЕ/клетка. Через 24 ч аденовирусы удаляли и клетки обрабатывали этопозидом (10 мкМ), камптотецином (0.1 мкМ) или LY303511(25 мкМ) в указанных на фиг. 5 комбинациях в течение 24 ч, после чего клетки лизировали и проводили Вестерн-блот анализ лизатов с моноклональными анти-EGFP антителами и моноклональными антителами к -тубулину для контроля количества суммарного белка в дорожке. В результате эксперимента было обнаружено, что по отдельности этопозид, камптотецин и LY303511 усиливают продукцию кодируемого аденовирусом белка EGFP, но наиболее существенное усиление наблюдается при совместном использовании камптотецина и LY303511, также как и при совместном использовании этопозида и LY303511. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ усиления продукции белков, кодируемых рекомбинантными репликативно-дефектными аденовирусами, предусматривающий обработку инфицированных аденовирусом клеток LY294002 (2-(4 морфолинил)-8-фенил-4 Н-1-бензопиран-4-он) или(2-(4-пиперазинил)-8-фенил-4 Н-1 бензопиран-4-он) или их фармацевтически приемлемыми солями или конъюгатами с пептидными последовательностями. 2. Способ по п.1, в соответствии с которым рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы предназначены для остановки роста опухолевых клеток. 3. Способ по п.2, в соответствии с которым остановка роста опухолевых клеток сопряжена с уничтожением опухолевых клеток. 4. Способ по п.2 или 3, в соответствии с которым инфицированные аденовирусом клетки являются клетками в культуре, a LY294002 или LY303511 или их фармацевтически приемлемые соли или конъюгаты с пептидными последовательностями добавляют в культуральную среду. 5. Способ по п.2 или 3, в соответствии с которым инфицированные аденовирусом клетки являются клетками организма, а остановку роста опухолевых клеток осуществляют в рамках проведения противоопухолевой терапии. 6. Способ усиления продукции белков, кодируемых рекомбинантными аденовирусами, предусматривающий обработку инфицированных аденовирусом клеток LY294002 или LY303511 или их производными совместно или последовательно с одним или несколькими дополнительными воздействиями, приводящими к усилению продукции белков, кодируемых рекомбинантными репликативно-дефектными аденовирусами, причем указанные одно или несколько дополнительных воздействий выбраны из группы, состоящей из облучения, гипертермии, обработки этопозидом, топотеканом, камптотецином или ингибитором гистондезацетилаз. 7. Способ по п.6, в соответствии с которым рекомбинантные аденовирусы предназначены для остановки роста опухолевых клеток. 8. Способ по п.7, в соответствии с которым остановка роста опухолевых клеток сопряжена с уничтожением опухолевых клеток. 9. Способ по любому из пп.6-8, в соответствии с которым инфицированные аденовирусом клетки являются клетками в культуре, а культуру клеток обрабатывают LY294002 или LY303511 или их фармацевтически приемлемыми солями или конъюгатами с пептидными последовательностями совместно с дополнительным воздействием. 10. Способ по п.7, в соответствии с которым инфицированные аденовирусом клетки являются клетками организма, а остановку роста опухолевых клеток осуществляют в рамках проведения противоопухолевой терапии.