Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья и способ обеспечения повышенной продукции этанола при его использовании

ТЕРМОФИЛЬНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ ДЛЯ ПОВЫШЕННОЙ ПРОДУКЦИИ ЭТАНОЛА ИЗ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ И СПОСОБ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПОВЫШЕННОЙ ПРОДУКЦИИ ЭТАНОЛА ПРИ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИИ Изобретение относится к термофильному микроорганизму для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, модифицированному путем включения инсерции в гетерологичный ген амилазы под контролем подходящего промотора, а также далее модифицированному с достижением инактивации нативного гена лактатдегидрогеназы, в котором ген амилазы получен из видов Geobacillus.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТМО РЕНЬЮАБЛЗ ЛИМИТЕД (GB) Область техники Данное изобретение касается получения микроорганизмов для производства этанола. В частности,изобретение касается модификации микроорганизмов для возможности утилизации крахмала в качестве субстрата для брожения. Предшествующий уровень техники Бактериальный метаболизм может протекать по различным механизмам, в зависимости от вида бактерий и от условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, к которым относятся все патогенные микроорганизмы, получают энергию за счет окисления органических соединений; как правило, в роли таких веществ выступают углеводы (особенно глюкоза), липиды и белки. Биологическое окисление этих органических соединений бактериями приводит к синтезу АТФ как источника химической энергии. Этот процесс допускает также продукцию более простых органических веществ (молекулпредшественников), которые требуются бактериальной клетке для биосинтетических реакций. Крахмал представляет собой углевод, встречающийся в природе в большом количестве и являющийся основным депо глюкозы у растений. Молекулы крахмала состоят из двух полисахаридов, амилозы и амилопектина. Амилоза представляет собой линейный полимер, состоящий из 500-20000 остатковD-глюкозы, соединенных между собой через -1,4 гликозидные связи и формирующих спиральную структуру. Появление дополнительных -1,6 гликозидных связей приводит к образованию амилопектина, имеющего разветвленную структуру. Крахмал, как правило, состоит на 20-30% из амилозы и на 7080% из амилопектина. В клетках растений нерастворимый крахмал запасается в твердых гранулах, в которых амилопектин образует кластеры в виде кристаллических мицелл, а амилоза распределена по всему объему. Растворимость крахмала возрастает при нагревании; кристаллы амилопектина становятся желатинообразными и гранулы в итоге растворяются. Амилаза представляет собой металлсодержащую кальцийзависимую гликозид-гидролазу. Существуют три формы амилазы (,и ), различающиеся по типу гидролизуемых ими связей. Альфа-амилаза катализирует случайный гидролиз внутренних -D-1,4 гликозидных связей с высвобождением простых сбраживаемых сахаров, включая глюкозу, мальтозу (дисахарид, образованный двумя остатками глюкозы). Декстрины (короткие низкомолекулярные полимеры D-глюкозы, соединенные через -1,4-связи) высвобождаются при гидролизе амилопектина, а мальтотриоза и мальтоза высвобождаются при гидролизе амилозы. Бета-амилаза действует с невосстанавливающего конца цепочки крахмала, катализируя гидролиз второй -1,4 гликозидной связи с отщеплением двух остатков глюкозы (мальтозы). Гамма-амилаза способна расщеплять -1,6 связи в амилопектине. Альфа-амилаза широко распространена в природе,поскольку переваривать крахмал могут многие микроорганизмы. В организме человека -амилаза в наибольшем количестве встречается в слюне и секретах поджелудочной железы, -амилазы микроорганизмов классифицируются как разжижающие (случайным образом расщепляют полисахариды с формированием более коротких цепочек) или осахаривающие (образуют моно-, ди- или трисахаридные остатки), в зависимости от точек, в которых происходит гидролиз полимерной цепочки глюкозы. Основной процесс, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие субстраты, - это гликолиз, представляющий собой последовательность реакций, в результате которых глюкоза превращается в пируват с одновременным синтезом АТФ. Судьба пирувата в процессе выработки метаболической энергии может быть различной, в зависимости от микроорганизмов и условий окружающей среды. Четыре основные реакции с участием пирувата приведены на фиг. 1. Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы вырабатывают энергию, используя цикл лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетил-коэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой(PDH). Во-вторых, в анаэробных условиях определенные организмы, продуцирующие этанол, могут осуществлять спиртовое брожение путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, которое катализируется пируватдекарбоксилазой (PDC), и последующего восстановления ацетальдегида до этанола с помощью НАДН, которое катализируется алкогольдегидрогеназой (ADH). Третья реакция, также протекающая в анаэробных условиях, представляет собой превращение пирувата в ацетил-коэнзим А, которое катализируется пируват-формиат-лиазой (PFL). Ацетил-коэнзим А затем конвертируется в ацетальдегид ферментом ацетальдегид дегидрогеназой (AcDH), а этанол образуется при восстановлении ацетальдегида, катализируемом ADH. Четвертый процесс представляет собой превращение пирувата в лактат, осуществляемое при каталитическом действии лактатдегидрогеназы (LDH). Большой интерес представляет собой применение микроорганизмов для получения этанола с использованием как микроорганизмов, естественным образом способных осуществлять анаэробное брожение, так и рекомбинантных микроорганизмов, несущих гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Применение таких микроорганизмов, модифицированных с целью увеличения использования крахмала в качестве метаболического субстрата, позволит эффективно производить этанол из дешевого,широко распространенного неочищенного растительного материала. Для производства этанола было предложено использовать термофильные бактерии; их применение имеет то преимущество, что брожение можно проводить при повышенных температурах, что позволяет отгонять вырабатываемый этанол в виде пара при температурах свыше 50C; это позволяет также проводить брожение при высоких концентрациях субстрата. Тем не менее, существует потребность в улучшенных микроорганизмах для производства этанола из культуральной среды на основе крахмала. Сущность изобретения Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, модифицированный путем включения инсерции в гетерологичный ген амилазы под контролем подходящего промотора, а также далее модифицированный с достижением инактивации нативного гена лактатдегидрогеназы, в котором ген амилазы получен из видов Geobacillus. Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ обеспечения повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, включающий культивирование микроорганизма по изобретению в культуральной среде, содержащей крахмал. Также предложен корм для животных, включающий микроорганизмы по изобретению. Краткое описание графических материалов Настоящее изобретение описано со ссылками на сопроводительные графические материалы, где: фиг. 1 схематично изображает метаболический путь гликолиза; фиг. 2 изображает вектор pGEM-T Easy; фиг. 3 изображает гипотетические участки промотора и генов комплекса PDH; фиг. 4 изображает применение pTMO111 для внедрения гена амилазы, amyS; фиг. 5 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую amyS; фиг. 6 является графическим изображением, показывающим серию результатов брожения для штамма TM304 в культуре с 5% (вес./об.) раствором крахмала; фиг. 7 является графическим изображением, показывающим серию результатов брожения для штамма TM333 в культуре с 5% (вес./об.) раствором крахмала. Описание изобретения Настоящее изобретение основано на модификации термофильного микроорганизма с целью повышения экспрессии гена амилазы. Повышение экспрессии гена амилазы позволяет микроорганизмам гидролизовать крахмал на отдельные мономеры глюкозы, которые могут затем использоваться в качестве гликолитического субстрата для образования пирувата и затем этанола. Способы повышения экспрессии амилазы и активности фермента предпочтительно включают применение сильных расположенных выше промоторов для регуляции транскрипции гена и внедрения дополнительных генов амилазы, экспрессируемых с большей частотой по сравнению с нативными генами амилазы. Термофильные микроорганизмы по изобретению могут быть далее модифицированы с целью блокировки экспрессии нативного гена лактатдегидрогеназы и активации гена PDH. Инактивация гена лактатдегидрогеназы позволяет предотвратить расщепление пирувата до лактата и потому способствует (при подходящих условиях) расщеплению пирувата до этанола с помощью пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Предпочтительно, чтобы ген лакгатдегидрогеназы был блокирован путем делеции внутри или вне гена. Активация гена pdh способствует превращению пирувата в ацетил-CoA, который далее при подходящих условиях может быть использован для образования ацетальдегида и, в конечном счете, этанола с помощью ацетальдегиддегидрогеназы. Еще одно преимущество активации PDH заключается в том, что уровень пирувата, способного оказывать ингибирующий эффект на захват глюкозы и гликолиз, оказывается сниженным. Это еще больше активирует выработку этанола. Термин "сильный промотор" здесь означает промотор, обеспечивающий уровень экспрессии соответствующего белка выше 0,5% от растворимого белка клетки. Микроорганизм может представлять собой любой термофильный микроорганизм, но предпочтительно, чтобы микроорганизм относился к видам Bacillus. Особенно желательно, чтобы это был микроорганизм дикого типа, принадлежащий к видам Geobacillus, а особенно Geobacillus thermoglucosidasius. В предпочтительном воплощении микроорганизмы, выбранные для модификации, называют микроорганизмами "дикого типа", т.е. они не являются мутантами, полученными в лабораторных условиях. Микроорганизмы могут быть выделены из образцов окружающей среды, в которых предполагается присутствие термофилов. Выделенные микроорганизмы дикого типа могут иметь ограниченную амилазную активность, которая недостаточна для выработки этанола при культивировании в среде, содержащей крахмал в качестве основного источника углерода. Выделенные микроорганизмы дикого типа будут способны продуцировать этанол из пирувата, но в отсутствие модификации основным продуктом брожения,скорее всего, будет лактат. Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению имел конкретные желаемые характеристики, которые позволили бы использовать его в процессе брожения. Микроорганизм желательно не должен иметь системы рестрикции, что устранило бы необходимость в метилировании in vivo. Предпоч-2 018814 тительно, чтобы микроорганизм можно было трансформировать с высокой частотой. Более того, микроорганизм должен быть стабилен по меньшей мере в 3% этаноле (вес./об.), предпочтительно по меньшей мере в 5-10% этаноле (вес./об.). Микроорганизм должен иметь такую скорость роста в непрерывной культуре, чтобы обеспечивать скорости разбавления порядка 0,3 ч-1 и выше. Микроорганизм должен являться термофилом и быть способным к росту в диапазоне температур 40-85C. Предпочтительно, чтобы микроорганизм был способен к росту в температурном диапазоне 5070C. Кроме того, желательно, чтобы микроорганизм мог расти при pH 7,2 и ниже, в частности pH 4,56,9. Культуральная среда предпочтительно может содержать по меньшей мере 1% крахмала (вес./об.),предпочтительно по меньшей мере 10% крахмала (вес./об.) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20% крахмала (вес./об.). Крахмал может быть растворимым или нерастворимым (например, зерновой крахмал). Другие предпочтительные компоненты культуральной среды могут включать те, что приведены в табл. 1, но не ограничиваться ими. Таблица 1 Приготовлено путем растворения 0,1 г биотина в 10 мл DMSO. Конечная концентрация глюкозы предпочтительно между 1 и 4% (вес./об.). Компоненты матричного раствора сульфатов элементов в следовых количествах показаны в табл. 2. Таблица 2 В предпочтительном воплощении гетерологичный ген амилазы кодирует -амилазу (-1,4-глюкан 4-глюканогидролазу, в классификации ферментов EC 3.2.1.1). Предпочтительно, чтобы ген амилазы был получен из видов Geobacillus, в частности Geobacillus stearothermophilus. Кодирующая последовательность -амилазы была расшифрована, и методики, позволяющие выделять и амплифицировать ген, хорошо известны специалистам. Предпочтительно, чтобы для обеспечения повышенной экспрессии амилазы у микроорганизма по изобретению по сравнению с диким типом ген амилазы был помещен под контроль сильного промотора, работающего в условиях низкой аэрации или анаэробных условиях, благоприятствующих продукции этанола термофильными микроорганизмами. Предпочтительно, чтобы промотором являлся промотор ldh, который может быть аутологичным, но предпочтительно должен быть гетерологичным и наиболее предпочтительно полученным у тех же видов,что и ген амилазы. Подходящие промоторы включают, например, Pldh из G.stearothermophilus NCA 1503, PferrA из G.stearothermophilus DSM13240 и Ppfl из B.cereus ATCC 14579, но не ограничиваются ими. В другом воплощении изобретения ряд различных сильных промоторов помещается выше гена амилазы с целью еще большего усиления экспрессии. Подходящие промоторы включают, например,-3 018814 промотор глицеральдегид-3-фосфата (PGAPDH) и промотор амилазы из G.stearothermophilus NCA 1503,но не ограничиваются ими. Нуклеотидная последовательность Pldh также известна, и методики клонирования и сборки последовательности промотора выше гена амилазы известны квалифицированным специалистам. Последовательность промотора/амилазы может быть клонирована в подходящую плазмиду или вектор экспрессии, содержащие множественные сайты рестрикции. Существуют многочисленные коммерчески доступные векторы экспрессии, такие как вектор pGEM-T Easy (фиг. 2). Рестрикционные ферменты могут применяться для вырезания конструкции Pldh/амилаза в виде отдельного фрагмента,который можно лигировать по соответствующим сайтам рестрикции в температурочувствительную плазмиду, например pUC19 (New England Biolabs). Предпочтительно использовать плазмиду с нокаутом пируват-формиат-лиазы. Конструкция плазмиды, содержащая ген амилазы/промотор ldh, может затем быть введена в микроорганизм по изобретению путем электропорации и пройти гомологичную рекомбинацию с геномной ДНК. Микроорганизмы с интеграцией плазмиды в хромосому могут быть селектированы на основании их устойчивости к антибактериальным агентам, таким как ампициллин или канамицин. Амилазная активность может быть также выявлена по видимым зонам просветления крахмала, например в тестах на пластинах. Нуклеотидная последовательность для лактатдегидрогеназы теперь известна. Используя эту последовательность, квалифицированный специалист может направленно воздействовать на ген лактатдегидрогеназы для достижения инактивации гена через различные механизмы. Возможно инактивировать ген лактатдегидрогеназы путем вставки транспозона. Однако предпочтительно, чтобы ген лактатдегидрогеназы был инактивирован путем делеции последовательности гена или части последовательности гена. Делеция предпочтительнее, поскольку она позволяет избежать проблем с реактивацией последовательности гена, которая часто происходит при использовании инактивации с помощью транспозона. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируется путем интеграции температурочувствительной плазмиды (например, плазмиды pUB190-ldh, как описано в PCT/GB06/01586), что приводит к естественной гомологичной рекомбинации, или интеграции плазмиды в хромосому микроорганизма. Микроорганизмы с интеграцией плазмиды в хромосому могут быть селектированы на основании их устойчивости к антибактериальным агентам. Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может произойти в результате единичной кроссинговерной рекомбинации или двух (или более) кроссинговерных рекомбинаций. В следующем предпочтительном воплощении микроорганизм модифицируют далее с целью активации PDH. PDH представляет собой большой ферментный комплекс, содержащий три единицы: Е 1 пируват декарбоксилазу (EC 1.2.4.1, не EC 4.1.1.1), E2 - дигидролипоамид-трансацетилазу и Е 3 дигидролипоамид-дегидрогеназу. Для этого комплекса необходим ряд кофакторов, включая НАД, ФАД,коэнзим А, липоевую кислоту и тиаминпирофосфат (ТПФ). Этот комплекс кодируется четырьмя генами(поскольку единица Е 1 является гетеродимером, состоящим из субъединици ), которые часто обозначаются как pdhA, pdhB, pdhC и pdhD (Е 1, Е 1, E2 и Е 3 соответственно). Единица Е 1 пируватдегидрогеназы требует наличия кофермента ТПФ по той же причине, что и пируватдекарбоксилаза (EC 4.1.1.1) требует наличия ТПФ и катализирует аналогичную реакцию декарбоксилирования, но в присутствии коэнзима А и липоевой кислоты, которые несут другие единицы фермента, а продуктом является ацетилCoA, а не ацетальдегид. Однако пируватдекарбоксилазная активность единицы Е 1 была зафиксирована,когда последняя не была комплексирована с другими единицами PDH (LessardPerham; The Journal ofBiological Chemistry; 1994, 269:14, 10378-10383; Tomar et al.; Applied Microbiology and Biotechnology; 2003, 62, 76-82; Frank et al.; Science; 2004, 306: Oct. 29, 872-876, supplementary data). Соответственно, пируватдекарбоксилазная активность фермента EC 1.2.4.1 может быть повышена путем активации PDH с тем, чтобы ацетальдегид продуцировался в большей степени, чем ацетил-CoA. Повышения пируватдегидрогеназной активности добиваются также с целью устранения лимитирующего звена производства,обусловленного пируватом, имеющего место у штаммов с инактивированной LDH, чтобы обеспечить выработку большего количества этанола при меньшем количестве ацетата и формиата в качестве побочных продуктов. С этой целью были выделены гены pdh и окружающей последовательности с помощью стандартного метода "прогулки по хромосоме". Было выделено и секвенировано примерно 8,8 кб ДНК, в которой было обнаружено присутствие следующих генов, приведенных на фиг. 3 и в табл. 3. Гипотетические участки промотора показаны на фиг. 3 (стрелки) - один выше от начала pdhA и второй потенциальный промотор, расположенный перед pdhB. Предыдущий пример вторичного промотора в кластере PDH был описан для Bacillus subtilis (Gao et al.; Journal of Bacteriology, 2002, 184:10,2780-2788), однако наиболее подробно описанные кластеры гена содержат только один промотор выше от кластера (Neveling et al.; Biochimica Acta; 1998, 1385, 367-372). Активацию можно проводить с помощью методик, известных в данной области. В частности, активацию можно осуществлять путем введения подходящей промоторной или энхансерной последовательности выше комплекса PDH. Известно, что ферментный комплекс работает как в аэробных, так и в анаэробных условиях(Carlsson et al/; Infection and Immunity; 1985, 49:3, 674-678), но в целом считается, что это аэробный фермент (Ch. 15; Principles of Biochemistry, Lehninger, NelsonCox; 2nd Ed, Worth Publishers, New York,1993, p. 447), при этом пируват-формиат-лиаза (PFL) является его анаэробным аналогом. Оба фермента превращают пируват, образовавшийся в ходе гликолиза, в ацетил-CoA, чтобы направить его в цикл трикарбоновых кислот, но этот цикл работает полностью только в аэробных условиях. Тем не менее, поскольку желательно использовать анаэробные условия, в данном изобретении предпочтительно использовать промоторы, работающие в анаэробных условиях. Так, можно использовать промоторы для ферментов, которые, как полагают, работают в анаэробных условиях: примерами могут быть промотор LDHDSM13240) - согласно описанию в PCT/GB2007/03699, включенному в описание во всей полноте путем ссылки. В предпочтительном воплощении следующая модификация проводится с целью повышения активности PDC, таким образом способствуя превращению пирувата в ацетальдегид. Это может быть осуществлено путем инактивации E2; дигидролипоамид-трансацетилазы (EC 2.3.1.12). Инактивацию можно проводить таким же образом, как и инактивацию LDH, но в данном случае мишенью для блокировки выступает ген E2. В следующем воплощении микроорганизм по изобретению имеет модификацию, которая инактивирует ген пируват-формиат-лиазы и, таким образом, предотвращает/уменьшает превращение пирувата в ацетил-CoA и формиат. Пируват-формиат-лиаза (PFL) является "анаэробным аналогом" пируватдегидрогеназы (PDH) и превращает пируват в ацетил-CoA и формиат (см. фиг. 1). Ацетил-CoA может быть превращен в этанол с помощью ацетальдегиддегидрогеназы (AcHD), в то время как формиат представляет собой нежелательный побочный продукт, способный ингибировать рост этанологенных организмов.PFL была выбрана как мишень для нокаута с целью направления метаболического потока в сторону выработки этанола и улучшения окислительно-восстановительного баланса остального пути синтеза этанола. Дополнительным преимуществом такой обработки является выключение образования формиата. Активность PFL можно ингибировать с помощью вставки транспозона, делеции гена или делеции части гена с получением мутанта, который не требует селекции с помощью антибиотика для поддержания измененного фенотипа. В данном воплощении предпочтительно, чтобы микроорганизм претерпел как инактивирование лактатдегидрогеназы, так и активирование пируватдегидрогеназы, с тем чтобы при анаэробных условиях получить повышенную продукцию этанола. В следующем предпочтительном воплощении микроорганизм также содержит гетерологичные гены пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Экспрессия таких гетерологичных генов приводит к синтезу ферментов, которые переключают метаболизм таким образом, чтобы этанол был основным продуктом брожения. Эти гены могут быть получены у микроорганизмов, обычно осуществляющих анаэробное брожение, включая виды Zymomonas, в том числе Zymomonas mobilis. Способы получения и внедрения гена в микроорганизмы известны, например, в Ingram et al.,Biotech.BioEng., 1998; 58 (2+3): 204-214 и US 5916787, содержание которых включено в описание во всей полноте путем ссылки. Ген может быть введен в плазмиду или встроен в хромосому, по усмотрению квалифицированного специалиста. Микроорганизмы по изобретению культивируют с применением растворимого крахмала в качестве составной части исходного сырья. Температура, pH и другие условия роста могут быть выбраны исходя из известных требований культуры. Теперь будет дано описание воплощения настоящего изобретения, со ссылками на сопроводительные иллюстрации, в следующем примере. Ниже описаны в общих чертах два подхода для внедрения гена-амилазы G.stearothermophilus DSM22 в геном G.thermoglucosidasius NCIMB 11955. Способы осуществления настоящего изобретения, приведенные в качестве примеров, не являются лимитирующими. Пример. Внедрение гена амилазы. Подход 1. Быстрая стратегия с применением фрагмента Notl из существующего клона pGEM-LA. С помощью методик, известных в данной области техники, последовательность -амилазы (amyS) была получена в ходе ПЦР и присоединена к промотору ldh (Pldh) из 11955. Данная конструкция была клонирована в коммерчески доступный вектор экспрессии pGEM-T Easy и обозначена pGEM-LA. Как показано на фиг. 2, сайт лигирования в векторе pGEM-T Easy фланкирован полилинкером. Благодаря этому возможно вырезать встроенные последовательности Pldh/амилаза в составе фрагмента Notl/Notl. Фрагмент Notl из pGEM-LA был лигирован по сайту Notl плазмидной конструкции pTMO111 с нокаутом pfl для получения двух дочерних плазмидных конструкций, pTMO139 и pTMO140. Они были введены путем электропорации в ТМ 242, стабильный PFL-негативный штамм 11955. Микроорганизмы,предположительно интегрировавшие плазмиду (интегранты), были селектированы при 68C. Первичные трансформанты (автономные плазмиды) и первичные интегранты были протестированы на продукцию амилазы при культивировании колоний на чашках со средой TGP с 0,4% растворимым крахмалом в течение 3 дней при 60C с последующей окраской йодным раствором по Граму. Вокруг этих штаммов были видны большие зоны просветления (гидролиза крахмала), сравнимые с контролемDSM22. ТМ 242 в этом тесте обнаружил следы активности, значительно меньшей, чем у DSM22, обладающего некоторой фоновой активностью. Субкультивирование первичных интегрантов в отсутствие канамицина с последующей репликацией колоний в среде TGP с канамицином использовали для выявления потенциальных мутантов с двойным кроссинговером (DCOs). Всего на амилазную активность было протестировано 32 канамицин-чувствительные колонии в среде TGP с 0,4% растворимым крахмалом(3 мл на лунку 12-луночных плашек Costar, в течение 3 дней при 60C). Ни одна не вызвала образования больших зон, за исключением положительного контроля DSM22. У большинства штаммов имелись следы просветления, сравнимые с контролем ТМ 242, а у 5 обнаружились небольшие, но значимые зоны просветеления. ПЦР-анализ был проведен на образцах генома двух из этих штаммов, TM319 и TM320, с применением вырожденных праймеров bamr66a и bamr72, которые были созданы на основании гомологии в последовательности между известными последовательностями PFL Bacillus. У обоих штаммов был получен единственный ПЦР-продукт размером приблизительно 3,1 кб, при разрезании которого с помощью Notl образовывалась двойная полоса размером приблизительно 0,6 кб и полоса размером приблизительно 2,0 кб. Это согласовывалось с предполагаемой заменой/вставкой гена. В контролях были получены ожидаемые результаты, продукт размером приблизительно 1,7 кб из 11955 (дикий тип), который не разрезался при помощи Notl, и продукт размером приблизительно 1,3 кб из ТМ 242, при расщеплении которого при помощи Notl образовывалась двойная полоса размером приблизительно 0,6 кб. Таким образом, было обнаружено, что в данных штаммах (TM319 и TM320) произошла интеграция конструкции амилазы по локусу pfl. Подход 2. Получение конструкций амилазы с промотором Pldh (NCA). Стратегия, использованная для помещения кодирующей последовательности амилазы из DSM22 под контроль Pldh (NCA), показана на фиг. 4. pTMO31 представляет собой плазмидный вектор, содержащий фрагмент ECOR1/SnaB1 pUB110, вставленный в полилинкер (или multiple cloning site, mcs)pUC19 (NEB). Кодирующую последовательность амилазы амплифицировали в ходе ПЦР в виде фрагментаNdel/Notl, с использованием в качестве матрицы конструкции pGEM-LA. Pldh (NCA) амплифицировали в виде фрагмента Ndel/Notl с использованием pTMO49 (полученным при клонировали Pldh (NCA 1503) в pTMO23) в качестве матрицы, продукты были клонированы и собраны в pTMO23 (pUC19 с удаленным сайтом Ndel) для получения конструкций с инсерцией (заменой гена) pTMO146 и pTMO147 (дочерние плазмиды). В табл. 4 подробно представлены компоненты ПЦР для получения конструкций Pldh Секвенирование клонов амилазы. Клонированные продукты ПЦР кодирующей последовательности амилазы, полученные с помощью олигонуклеотидов bamr87 и bamr88 (см. табл. 4), секвенировали для проверки их целостности. Секвенировали два отдельных клона. В каждом обнаружили различные точечные мутации, предположительно возникшие в ходе ПЦР. Для дальнейшей работы был выбран клон pTMO135 (продукт ПЦР, лигированный по тупым концам по сайту Smal в pTMO23). Мутация, возникшая у данного клона в ходе ПЦР, представляет собой молчащую мутацию, кодирующую ту же аминокислоту, с одинаковой частотой встречаемости кодона согласно опубликованным частотам встречаемости кодонов G.kaustophilus. Кодирующая последовательность амилазы из pTMO135 (за исключением стартового кодона) показана на фиг. 5. Нуклеотиды, отличающиеся в данной последовательности от опубликованной последовательности DSM22pTMO135 (охватывающей 15 пн) и опубликованной последовательностью DSM22 amyS (М 57457). Несовпадение в позиции 1449 представляет собой мутацию, возникшую в pTMO135 в ходе ПЦР. Секвенирование вставки амилазы в pTMO139, имеющей фрагмент Notl из pGEM-LA, показало идеальное совпадение с pTMO135 (за исключением мутации 1449 пн). Кодирующая последовательность амилазы затем была амплифицирована в ПЦР непосредственно с геномной ДНК G.stearothermophilusDSM22 (штамм был получен из коллекции DSMZ). Полученный ПЦР-продукт (с помощью олигонуклеотидов bamr87 и bamr88, как ранее) клонировали в pTMO23 (для получения pTMO145) и секвенировали. Последовательность была идентичной pTMO135 (за исключением мутации 1449) и pTMO139, за исключением 904 пн. Как в pTMO135, так и в pTMO139 нуклеотидом в положении 904 является "А", а вpTMO145 - "G". Эта мутация приводит к замене в этом положении аспарагиновой кислоты на аспарагин. Данный кодон (GAC для аспарагиновой кислоты) оказался консервативным во всех протестированных последовательностях амилазы Geobacillus, так что, вероятно, эта мутация возникла в ходе ПЦР при клонировании последовательности амилазы из DSM22. Другие отличия в последовательности предположительно являются ошибками в опубликованной последовательности; сравнение с другими последовательностями амилазы Geobacillus указывает на то, что последовательность (например, в pTMO135 иpTMO145) гораздо ближе к консенсусной, чем опубликованная последовательность (М 57457). Эксперименты были продолжены с конструкциями pTMO145 и pTMO146, несмотря на мутацию 904, поскольку было очевидно, что клонированный фрагмент Notl из pGEM-LA обусловливал существенную амилазную активность на крахмальных пластинах. Получение и характеризование мутантов с двойным кроссинговером для pTMO145 и pTMO146pTMO145 и pTMO146 были введены в ТМ 242 путем электропорации и предполагаемые мутанты с двойным кроссинговером (DCO) были отобраны согласно предыдущему описанию. Всего на амилазную активность в тестах на пластинах было протестировано 48 предполагаемых мутантов с DCO (канамицинчувствительных). У 18 была обнаружена очень высокая амилазная активность (другие оказались сравнимы с контролем ТМ 242). При посеве колоний на большие плашки у них образовывались зоны просветления, по меньшей мере, такого же размера, как в контроле DSM22. Четыре из этих штаммов, TM304,TM305, TM311 и TM315, были выбраны для дальнейшей работы. Геномная ДНК была получена и использована в ПЦР-анализе. Для всех четырех полученные результаты указывали на инсерцию гена amyS по локусу pfl. Два штамма мутантов амилазы, TM304 и TM305, были протестированы на продукцию этанола в среде ASYE (0,5%) вначале с глюкозой в качестве источника углерода, а затем с растворимым крахмалом. Тестирование проводили в условиях низкой и высокой аэрации. Результаты показаны в табл. 5. TM304 и TM305 продуцировали приблизительно столько же этанола из растворимого крахмала,как и из глюкозы, как в условиях высокой, так и низкой аэрации. ТМ 242 продуцирует значительно более низкие количества этанола из крахмала по сравнению с глюкозой, но этот эффект значительно менее выражен в в условиях более высокой аэрации. TM304 и TM305 продуцируют количество этанола, сравнимое с ТМ 242 при культивировании с глюкозой, однако при инкубации этих трех штаммов в присутствии крахмала очевидно, что более высокая активность амилазы у TM304 и TM305 позволяет микроорганизмам конвертировать практически весь крахмал в этанол. В условиях низкой аэрации это осуществляется практически на том же уровне, как с глюкозой, тогда как способность ТМ 242 продуцировать этанол из крахмала составляет приблизительно треть от его способности конвертировать глюкозу в этанол. Тест на остаточный крахмал; 0,5 мл культуры плюс 0,2 мл иодного раствора для окраски по Граму; отрицательный во всех случаях, за исключением отмеченных. Инокулят: 100 мкл замороженной исходной культуры. Посев: 10 мл 2TY в 50 мл конической колбе, 52C в течение ночи, 250 об/мин, пересадка 1 мл (10%). Выращивание: 10 мл ASYE (0,5%) плюс источник углерода в 15 или 50 мл пробирке типа falcon, 60C, 250 об/мин, 24 ч. Результаты серии ферментаций для штамма TM304, культивируемого в 5% (вес./об.) растворимом крахмале, показаны на фиг. 6. Простой тест с иодным раствором для окраски по Граму показал, что в отличие от ТМ 242, мутанты DCO гидролизовали весь крахмал. Результаты четко подтверждали эффективность встраивания гетерологичной амилазы под контролем промотора Pldh (NCA) для утилизации крахмала в условиях низкой аэрации. Получение и характеризование мутантов DCO для pTMO150 и pTMO151 (Pldh (NCA)/amyS - отсутствие мутации). Новый ПЦР-продукт amyS из геномной ДНК DSM22 использовали для получения "чистых" конструкций DCO, обозначенных pTMO150 и pTMO151. Эти две плазмиды имеют вставку Pldh (NCA) в генеpfl в противоположных ориентациях. pTMO150 находится в том же направлении транскрипции, как pfl.pTMO151 находится в противоположном направлении, как Pldh (NCA) в pTMO146 и pTMO147. Мутанты DCO были получены из обеих плазмид, и по два мутанта из каждой были верифицированы при помощи ПЦР (TM328 и 329 из pTMO150 и TM333 и 335 из pTMO151). Были протестированы два мутантных штамма с амилазой, TM304 и TM305. Все четыре мутантных штамма, наряду с TM304, TM305 и ТМ 242, протестировали на продукцию этанола в условиях низкой аэрации в среде ASYE (0,5%), вначале с 2% (вес./об.) глюкозой в качестве источника углерода, а затем с 2% (вес./об.) растворимым крахмалом и, наконец, с 3% (вес./об.) растворимым крахмалом. Результаты, приведенные в табл. 6, показывают, что все мутантные штаммы одинаково хорошо себя продемонстрировали в 2% (вес./об.) растворимом крахмале, продуцируя в два раза больше этанола по сравнению с исходным штаммом ТМ 242. В 3% (вес./об.) растворе крахмала TM333 продуцирует больше этанола и образует большую зону просветления на крахмальных пластинах, чем другие мутанты, что указывает на то, что TM333 может быть лучшим продуцентом этанола по сравнению с TM304. Данные результаты подтверждаются результатами серии ферментаций TM333 (проведенных в тех же условиях, что и ферментация штамма TM304 (фиг. 6, которые отображены на фиг. 7 и позволяют предположить, что TM333 способен утилизировать всю глюкозу, полученную из крахмала. Для гарантии того, что мутантные штаммы TM304 и TM333 ведут себя аналогичным образом с исходным штаммом ТМ 242 и не несут каких-либо не предполагаемых мутаций, было проведено их сравнительное тестирование. Результаты приведены в табл. 7 А и 7 Б. Таблица 7 А ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Термофильный микроорганизм для повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, модифицированный путем включения инсерции в гетерологичный ген амилазы под контролем подходящего промотора, а также далее модифицированный с достижением инактивации нативного гена лактатдегидрогеназы, в котором ген амилазы получен из видов Geobacillus. 2. Микроорганизм по п.1, в котором промотор работает в условиях низкой аэрации или в анаэробных условиях. 3. Микроорганизм по п.2, в котором промотором является ldh промотор. 4. Микроорганизм по п.3, в котором ldh промотор является аутологичным. 5. Микроорганизм по п.3, в котором ldh промотор является гетерологичным. 6. Микроорганизм по п.5, в котором ldh промотор получен из Geobacillus stearothermophilus. 7. Микроорганизм по п.1, в котором ген амилазы находится под контролем промотора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы или промотора амилазы. 8. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором произведена делеция гена лактатдегидрогеназы или его части. 9. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором микроорганизм не содержит инсерционного элемента в гене лактатдегидрогеназы. 10. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, где дальнейшая модификация инактивирует нативный ген пируват-формиат-лиазы. 11. Микроорганизм по п.10, в котором произведена делеция гена пируват-формиат-лиазы или его части. 12. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, также включающий модификацию,активирующую ген пируватдегидрогеназы. 13. Микроорганизм по п.12, в котором перед геном пируватдегидрогеназы вставлен промотор, работающий в анаэробных условиях. 14. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, также включающий модификацию,повышающую активность пируватдекарбоксилазы. 15. Микроорганизм по п.14, в котором модификация инактивирует нативный ген дигидролипоамидтрансацетилазы (EC 2.3.1.12). 16. Микроорганизм по п.15, в котором произведена делеция гена дигидролипоамид-трансацетилазы или его части. 17. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором ген амилазы получен изGeobacillus stearothermophilus. 18. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, в котором ген амилазы кодирует-амилазу (EC 3.2.1.1). 19. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который относится к роду Geobacillus. 20. Микроорганизм по п.19, который представляет собой Geobacillus thermoglucosidasius. 21. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который содержит гетерологичный ген пируватдекарбоксилазы. 22. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который содержит гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы. 23. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который не содержит системы рестрикции. 24. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который является стабильным в культуральной среде, содержащей до 10% (вес./об.) этанола. 25. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который способен трансформироваться с высокой частотой. 26. Микроорганизм по любому из предшествующих пунктов, который растет при температуре 4085C, предпочтительно 50-70C. 27. Способ обеспечения повышенной продукции этанола из крахмалсодержащего сырья, включающий культивирование микроорганизма по любому из предшествующих пунктов в культуральной среде,содержащей крахмал. 28. Способ по п.27, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 1% (вес./об.) крахмала. 29. Способ по п.27 или 28, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 10% (вес./об.) крахмала. 30. Способ по любому из пп.27-29, в котором культуральная среда содержит по меньшей мере 20%(вес./об.) крахмала. 31. Способ по любому из пп.27-30, который осуществляют при температуре 40-70C. 32. Способ по п.31, в котором температура составляет 52-65C. 33. Способ по любому из пп.27-32, в котором pH культуральной среды составляет 4,0-7,5. 34. Корм для животных, включающий микроорганизмы по любому из пп.1-26.