Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Объектом настоящего изобретения является новый способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений из раствора,полученного предпочтительно микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений путем обработки несколькими растворителями. 015973 Область техники Изобретение относится к способу селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений из раствора, полученного предпочтительно микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений. Предшествующий уровень техники Моногидроксилированные 3,17-дикетостероидные соединения, например 13-этил-11-гидрокси-4 гонен-3,17-дион, 13-этил-15-гидрокси-4-гонен-3,17-дион, 15-гидрокси-4-андростен-3,17-дион и 9 гидрокси-4-андростен-3,17-дион, а также 6-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-дион (который представляет собой смесь 6- и 6-стереоизомеров) являются важными ключевыми промежуточными соединениями в химическом синтезе активных ингредиентов, таких как дезогестрел, гестоден, дроспиренон, а также гидрокортизон, преднизолон и экземестан. В промышленных способах микробиологическое гидроксилирование является испытанной практикой, поскольку во многих случаях только специальный микроорганизм способен гидроксилировать данную молекулу в желаемом положении. В большинстве случаев химический синтез (если он осуществим) для решения этой проблемы является очень сложным, дорогостоящим, выходы являются низкими и образуется много побочных продуктов. Микробиологическое гидроксилирование в практике фармацевтической промышленности осуществляют следующим образом: сначала путем скриннинга выбирают микроорганизм, который способен гидроксилировать данную молекулу в желаемом положении, затем определяют такие оптимальные параметры (компоненты питательного вещества, pH, температуру, растворенный кислород и т.д.), которые должны поддерживаться для осуществления биоконверсии с хорошим превращением. В конце вышеупомянутой сложной процедуры образуется большой объем ферментационного бульона, и желаемый продукт, в данном случае моногидроксилированное стероидное соединение, должно быть выделено из этого раствора. Ферментационный бульон является гетерогенным как с физической,так и с химической точки зрения, он содержит микробные клетки, а также клеточные компоненты, высвобождающиеся из микробных клеток, оставшийся субстрат, оставшиеся компоненты питательного вещества, продукты метаболизма, образовавшийся продукт и побочные продукты, пеногасители, детергенты и т.д. Концентрация продукта в ферментационном бульоне составляет обычно от 1 до 10 г/дм 3,поэтому ферментационный бульон представляет собой "разбавленный раствор", содержащий большое количество примесей и естественно желаемый продукт в наибольшей концентрации. Как можно видеть, последовательная переработка ферментационных бульонов - выделение желаемого продукта - представляет собой очень сложную процедуру. Желаемый продукт и оставшиеся компоненты питательного вещества, продукты метаболизма микроорганизма, добавки (пеногасители, детергенты), оставшийся субстрат, образовавшиеся побочные продукты и другие примеси должны быть разделены. Ситуация является еще более сложной, поскольку обычно растворимость стероидных соединений в воде является очень низкой, поэтому образовавшийся продукт находится частично в растворе, частично осаждается на поверхности биомассы. В случае использования более высокой концентрации субстрата желаемый продукт должен быть выделен из двух различных сред: из фильтрата ферментационного бульона и с поверхности биомассы. Для решения вышеупомянутых проблем было предпринято несколько попыток. Например, согласно патенту Японии 54-105294, для разделения стероидных смесей гидроксильные группы стероидных соединений подвергают ацилированию, затем очищают с помощью колоночной хроматографии с использованием силикагеля или оксида алюминия, и в конце после фракционной кристаллизации получают желаемый продукт. Публикация не содержит числовых данных относительно эффективности данного способа, но последовательная обработка ацилированем в промышленном масштабе - с использованием пиридина в качестве растворителя - может вызвать множество проблем. В этом способе с несколькими стадиями эксплуатационные потери продукта являются неизбежно высокими, поэтому промышленное применение этого способа является неэкономичным. В описании изобретения к EP 245985 раскрыто выделение биологически активных соединений в лабораторном масштабе. Согласно данному способу забуференный раствор водорастворимых биологически активных соединений экстрагируют соответствующим специальным растворителем, который не смешивается с водой (например, полиэтиленгликолем), в присутствии микрогранулированного (0,01-10 мкм) адсорбента, содержащего функциональную группу. Продукт обратимо связывается с адсорбентом,из которого после осуществления процессов разделения фаз может быть выделен известными способами. Промышленная осуществимость этого способа является очень сомнительной. В описании изобретения к патенту Венгрии 192668 раскрыт микробиологический синтез 15 гидрокси-4-андростен-3,17-диона. Во время способа биоконверсия осуществляется грибками Penicilliummelinii или Fusarium oxysporum f. vasinfectum. В описании этого изобретения также кратко описан способ выделения стероидных соединений, согласно которому ферментационный бульон экстрагируют три раза изобутилметилкетоном (общая экстракция), объединенные экстракты концентрируют на пленочном ис-1 015973 парителе и упаривают досуха на роторном испарителе с использованием водяной бани. Остаток промывают гексаном для удаления пеногасителя, и в конце стероидные соединения кристаллизуют из изобутилметилкетона. Недостаток этого способа состоит в том, что он дает только сырые (неочищенные) кристаллы. Описание изобретения не дает какой-либо инструкции относительно дополнительной очистки продукта и разделения образовавшихся стероидных побочных продуктов и оставшегося субстрата. Согласно способу, опубликованному в описании изобретения к патенту Венгрии 217624, гидроксилированные стероиды выделяют из фильтрата ферментационного бульона, содержащего низкие концентрации (1 г/дм 3), с использованием макросетчатых адсорбционных смол и градиентного элюирования. Соотношение адсорбата и адсорбента составляет 1:20, т.е. 20 г смолы требуется для связывания 1 г стероида. Ограничение способа состоит в том, что в случае более высокой концентрации (6-10 г/дм 3) субстрата при производстве в промышленном масштабе (20-50 м 3) следует использовать максимальное количество адсорбента, поэтому и набивка, и оборудование были бы дорогостоящими, способ был бы неэкономичным. Как было упомянуто ранее, различные гидроксилированные стероидные соединения, например 13 этил-11-гидрокси-4-гонен-3,17-дион,13-этил-15-гидрокси-4-гонен-3,17-дион,15-гидрокси-4 андростен-3,17-дион и 9-гидрокси-4-андростен-3,17-дион, а также 6-гидроксиметил-1,4-андростадиен 3,17-дион - целевые соединения изобретения - являются важными ключевыми промежуточными соединениями в химическом синтезе активных ингредиентов, таких как дезогестрел, гестоден, дроспиренон, а также гидрокортизон, преднизолон и экземестан. Химический синтез представляет собой сложные способы в несколько стадий, поэтому эксплуатационные потери продукта являются неизбежно высокими при осуществлении в промышленном масштабе. Обычно для синтеза 1 кг активного ингредиента требуется применение 8-10 кг ключевого промежуточного соединения. Согласно этим фактам при крупномасштабном производстве (иногда несколько кг/партию) должен осуществляться синтез гидроксилированных стероидных соединений. Микробиологическое гидроксилирование стероидных соединений обычно может быть осуществлено с 60-90% биоконверсией. Самая большая проблема во время выделения продукта состоит в разделении оставшегося субстрата и образовавшегося побочного продукта, поскольку на следующих стадиях синтеза активного промежуточного соединения могут быть использованы только те продукты, в которых содержание субстрата ниже заданного предела. Этот предел зависит от продукта, обычно он составляет от 1 до 2,5%. Вышеупомянутый способ может быть осуществлен в лабораторном и полупромышленном масштабе с использованием силикагеля или макросетчатых адсорбционных смол при хроматографическом разделении. В случае количества вещества в несколько сотен килограмм, ни один из этих путей не может быть использован, поскольку количество хроматографической набивки и растворителей, необходимое для этого способа, было бы очень большим, способ не был бы экономичным в промышленном масштабе. Задача авторов изобретения состояла в том, чтобы разработать экономичный, промышленно применимый способ, который устраняет недостатки известных способов и позволяет выделить большое количество желаемого продукта с высокой чистотой и хорошим выходом. Сущность изобретения Во время экспериментов авторы изобретения должны были учитывать, что желаемые соединения по изобретению, упомянутые выше гидроксилированные стероидные соединения, имеют очень похожие химические, физические и физико-химические свойства, их полярности также различаются лишь незначительно. Это означает, что все эти соединения ведут себя весьма похожим образом во время заданной манипуляции (например, растворения, экстракции, осаждения). Во время экспериментов авторы изобретения обнаружили, что продукт, образовавшийся в ферментационном способе, оставшийся субстрат и побочные продукты - согласно их растворимости - могут быть обнаружены как растворенными в ферментационном бульоне, так и осажденными на поверхности биомассы. Исключением является случай, когда концентрация добавленного субстрата ниже 1,5 г/дм 3, в этом случае продукт остается в растворе. Соответственно, стероидные соединения должны быть выделены и из раствора, и из твердой фазы. Было обнаружено, что практичным является удаление биомассы из ферментационного бульона путем фильтрации, затем стероидные соединения могут быть выделены из фильтрата с помощью органического растворителя, не смешивающегося или частично смешивающегося с водой (алифатический сложный эфир или алифатический кетон). Также обнаружили, что примеси нестероидного типа биологического происхождения могут быть селективно удалены путем обработки органической фазы водным раствором основного характера, имеющим соответствующую ионную силу, затем может быть получен сырой (неочищенный) продукт, содержащий стероидные соединения, после добавления воды, путем выпаривания растворителя. Стероидные соединения растворяют из профильтрованной биомассы алифатическими спиртами или кетонами, смешивающимися с водой, с использованием экстракции твердого вещества растворителем, и после выпаривания растворителя получают кристаллический сырой продукт. Сырые кристаллические продукты, полученные из двух сред, смешивают, растворяют в алифатиче-2 015973 ском спирте или кетоне, смешивающемся с водой, и раствор обрабатывают древесным углем и/или перфилом. Флокулянт фильтруют, и растворитель выпаривают с получением однородных сырых кристаллов. Полученные таким образом однородные сырые кристаллы содержат продукт, от 8 до 25% оставшегося субстрата в зависимости от биоконверсии, а также несколько процентов других стероидов. Эти соединения также должны быть разделены, как упомянуто ранее, предпочтительно не хроматографически. Обычные способы кристаллизации, используемые в промышленной практике (например, кристаллизация из органического растворителя, из воды или осаждение водой), не были успешными, поскольку удаление одной единицы субстрата вызывало потерю 2-4 единиц продукта, т.е. растворимость продукта была лучше в этих смесях, чем растворимость основной примеси, субстрата. Во время экспериментов неожиданно обнаружили, что при растворении однородных сырых кристаллов в хлорированном углеводороде и осаждении продукта путем добавления алифатического или ароматического углеводорода соотношение растворимостей меняется. В этой системе растворимость неполярного компонента (субстрата) в 10-60 раз лучше, чем растворимость полярного соединения (продукта), в зависимости от количества субстрата. Соответственно, более неполярная примесь может быть удалена этой селективной кристаллизацией без потери большого количества продукта (потеря продукта составляет менее 1%). Целесообразно растворять сырой кристаллический материал в хлорированном углеводороде и осаждать продукт алифатическим или ароматическим углеводородом. В этом случае основная часть субстрата может быть обнаружена в маточной жидкости. Если биоконверсия является низкой (20-30% оставшегося субстрата), то желаемого качества можно достичь повторением вышеописанного способа. Согласно вышеуказанным фактам настоящее изобретение относится к способу селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений из раствора,полученного предпочтительно микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений,посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений,который состоит из следующих стадий: а) удаление биомассы из ферментационного бульона, в заданном случае (то есть, необязательно) после обработки фосфорной кислотой, путем фильтрации или центрифугирования, выделение стероидных соединений из фильтрата органическим растворителем, не смешивающимся или частично смешивающимся с водой, предпочтительно алифатическим кетоном или сложным эфиром алифатического спирта, селективное удаление примесей нестероидного типа из органической фазы путем обработки водным раствором основного характера и получение сырого кристаллического продукта, содержащего гидроксилированные стероиды, путем добавления воды и выпаривания растворителя и б) растворение стероидных соединений с поверхности профильтрованной биомассы, полученной на стадии (а), путем обработки C1-C4 алифатическими спиртами или кетонами или их водным раствором и получение сырого кристаллического продукта, содержащего гидроксилированные стероиды, после выпаривания растворителя, затем в) растворение продукта, полученного на стадии (а), или в заданном случае (то есть, необязательно) - смеси двух сырых продуктов, полученных на стадиях (а) и (б), в C1-C4 алифатическом спирте или кетоне, смешивающемся с водой, или его водном растворе, обесцвечивание раствора и выделение очищенных однородных сырых кристаллов после выпаривания растворителя; и г) перекристаллизация очищенных однородных сырых кристаллов, полученных на стадии (в), из смеси хлорированного углеводорода/алифатического или циклоалифатического углеводорода и выделение чистого продукта. Согласно настоящему изобретению органический растворитель, не смешивающийся или частично смешивающийся с водой, может предпочтительно представлять собой алифатические сложные эфиры,такие как этилацетат, н-пропилацетат и тому подобное, а также алифатические кетоны, такие как изобутилметилкетон и тому подобное. Основность и ионную силу водного раствора, используемые для удаления нестероидных примесей,регулируют путем добавления соответствующего количества гидроксидов щелочных металлов или щелочно-земельных металлов и/или их основных солей, таких как карбонаты, гидрокарбонаты, гидрофосфаты, ацетаты и тому подобное. Согласно настоящему изобретению органический растворитель, смешивающийся с водой, может предпочтительно представлять собой C1-C3 алифатические спирты, такие как метанол, этанол, а также алифатические кетоны, такие как ацетон и тому подобное. На стадии селективной кристаллизации органический растворитель, не смешивающийся с водой,может предпочтительно представлять собой хлорированные углеводороды, такие как дихлорметан, дихлорэтан и тому подобное, а в качестве осаждающего растворителя могут быть использованы алифатические или ароматические углеводороды, такие как н-гексан, н-октан, изооктан, 1-додекан, циклогексан,метилциклогексан и тому подобное. Способ согласно настоящему изобретению может быть использован во время выделения 13-этил 11-гидрокси-4-гонен-3,17-диона,13-этил-15-гидрокси-4-гонен-3,17-диона,15-гидрокси-4-3 015973 андростен-3,17-диона и 9-гидрокси-4-андростен-3,17-диона, а также 6-гидроксиметил-1,4 андростадиен-3,17-диона. Преимущества способа по настоящему изобретению состоят в следующем: его осуществление не требует дорогостоящих капиталовложений; эффективный, дешевый способ разделения; он обеспечивает высокую селективность; потеря продукта является очень низкой; способ является быстрым, воспроизводимым и легко осуществимым; количество используемых растворителей является низким, например 450-500 кг сырого продукта может быть селективно кристаллизовано из 6 м 3 растворителя. Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Выделение 15-гидрокси-4-андростен-3,17-диона. Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно описанию изобретения к патенту Венгрии 192668, с помощью грибка Penicillium melinii, в полезном объеме 900 дм 3. Количество добавленного 4-андростен-3,17-дионового субстрата составляет 9 г/дм 3, биоконверсия составляет 75%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и рН ферментационного бульона доводят до 3,5-4,0 путем добавления 10%-ной фосфорной кислоты для повышения эффективности фильтрации, добавляют 9 кг перфила в качестве вспомогательного средства при фильтрации. Температуру ферментационного бульона увеличивают до 100C для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 40-45C, и биомассу фильтруют с помощью центрифуги типа C-10,оснащенной техническими тканями. Масса профильтрованной биомассы составляет 36 кг. Фильтрат охлаждают до температуры до 20-25C и смесь экстрагируют 500 дм 3 н-пропилацетата в аппарате, снабженном мешалкой. После разделения фаз водную фазу повторно экстрагируют 250 дм 3 нпропилацетата. После экстракции следуют методы TLC (тонкослойная хроматография) и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). Органические фазы, содержащие стероидные соединения,объединяют и концентрируют в дубликаторе до объема примерно 200 дм 3. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 100 дм 3 5%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 40 дм 3 воды и смесь переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и органический растворитель выпаривают. Полученные таким образом сырые кристаллы(содержащие стероидный продукт) фильтруют и сушат. Биомассу переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и добавляют 400 дм 3 60 мас.% водного этанола. Смесь перемешивают в течение 30 мин и биомассу фильтруют с помощью центрифуги типа C-10. Затем биомассу повторно экстрагируют 300 дм 3 60 мас.% водного этанола и разделяют центрифугированием. Профильтрованную биомассу сжигают. Два фильтрата объединяют и этанол отгоняют в дубликаторе. Остаток охлаждают до 20C и осажденные стероиды, содержащие второй сырой продукт, фильтруют и сушат. Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в смеси 36 дм 3 ацетона и 4 дм 3 воды при 45-50C. Затем добавляют 1 кг Norit и 1 кг перфила, и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянт фильтруют и промывают смесью 1 дм 3 ацетона и 3 дм 3 воды. Фильтрат и промывку объединяют и концентрируют до половины объема в дубликаторе. Остаток охлаждают до 10C, осажденные очищенные сырые кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученных таким образом кристаллов составляет 6,4 кг, и согласно HPLC их состав является следующим: Для того чтобы разделить продукт и субстрат, к вышеописанному продукту добавляют 64 дм 3 метилциклогексана, и воду удаляют из смеси азеотропной перегонкой. Затем к смеси добавляют 25,6 дм 3(объем в четыре раза больше массы кристаллов) дихлорметана с получением прозрачного раствора, который осветляют с помощью 2 кг оксида алюминия. Осветленный раствор концентрируют при атмосферном давлении до объема 70 дм 3 и охлаждают до 25C. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученного таким образом кристаллического 15-гидрокси-4-андростен-3,17-диона составляет 5,6 кг, и согласно HPLC его состав является следующим (выход составляет 89% в пересчете на ферментационный бульон): В заданном случае (то есть, при необходимости, но необязательно) количество субстратной примеси может быть дополнительно снижено путем повторения последней стадии кристаллизации. Пример 2. Выделение 13-этил-15-гидрокси-4-гонен-3,17-диона. Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно патенту Венгрии 221745,с помощью грибка Fusarium equiseti, в полезном объеме 20 м 3. Количество добавленного 13-этил-4 гонен-3,17-дионового субстрата составляет 1,5 г/дм 3, биоконверсия составляет 77%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и основное количество стероидных соединений обнаруживают в растворе, осаждение на поверхности биомассы является лишь минимальным. Ферментационный бульон фильтруют согласно способу, описанному в примере 1, отличающемуся тем, что вместо центрифуги используют фильтр-пресс с полезной поверхностью фильтрации 30 м 2. Масса фильтрованной влажной биомассы составляет 500 кг (ее сжигают из-за низкого содержания в ней стероидов). Фильтрат ферментационного бульона экстрагируют 4 м 3 этилацетата в сепараторе типа CINC (continuous integrated mixer, комбинированный смеситель непрерывного типа) с противоточным операторным методом. Рафинат отбрасывают и органическую фазу концентрируют до объема 2 м 3. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 1 м 3 5%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 600 дм 3 воды и смесь переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и органический растворитель выпаривают. Полученные таким образом сырые, содержащие стероиды, кристаллы фильтруют и сушат. Сырой продукт переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в смеси 180 дм 3 ацетона и 360 дм 3 воды при 45-50C. Затем добавляют 4 кг древесного угля Norit и 4 кг перфила и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянты фильтруют и промывают смесью 20 дм 3 ацетона и 60 дм 3 воды. Фильтрат и промывку объединяют и органический растворитель выпаривают в дубликаторе. Остаток охлаждают до 10C, осажденные очищенные сырые кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученных таким образом кристаллов составляет 21,5 кг, и согласно HPLC их состав является следующим: Для того чтобы разделить продукт и субстрат, вышеописанный сырой продукт растворяют в 54 дм 3(объем составляет две с половиной массы кристаллов) дихлорметана и медленно добавляют 270 дм 3 метилциклогексана из резервуара с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученного таким образом 13-этил-15-гидрокси-4-гонен-3,17-диона составляет 20,8 кг, и,согласно HPLC, его состав является следующим (выход составляет 87% в пересчете на ферментационный бульон): Пример 3. Выделение 13-этил-11-гидрокси-4-гонен-3,17-диона. Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно патенту Венгрии 216874,с помощью грибка Cylindrocarpon dydimum, в полезном объеме 5 дм 3. Количество добавленного 13 этил-4-гонен-3,17-дионового субстрата составляет 4 г/дм 3, биоконверсия составляет 87%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и стероидные соединения обнаруживают как в ферментационном бульоне, так и на поверхности профильтрованной биомассы. pH ферментационного бульона доводят до 3,5-4,0 путем добавления 10%-ной фосфорной кислоты для повышения эффективности фильтрации, добавляют 50 г перфила в качестве вспомогательного средства при фильтрации и температуру ферментационного бульона увеличивают до 100C для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 40-45C, и биомассу фильтруют через керамический фильтр, оснащенный техническими тканями. Фильтрат охлаждают до температуры 20-25C и смесь экстрагируют 2 дм 3 н-пропилацетата. После разделения фаз водную фазу повторно экстрагируют 1 дм 3 н-пропилацетата. Органические фазы, содер-5 015973 жащие стероидные соединения, объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема примерно 1 дм 3 в роторном испарителе с использованием водяной бани 65C. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 0,5 дм 3 10%-ного раствора карбоната калия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 0,2 дм 3 воды и органический растворитель выпаривают в роторном испарителе с использованием водяной бани 65C. Полученные таким образом сырые, содержащие стероиды, кристаллы фильтруют и сушат. Биомассу переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и добавляют 2 дм 3 60 мас.% водного ацетона. Смесь перемешивают в течение 30 мин и биомассу фильтруют через пресс-фильтр. Фильтрат переносят в роторный испаритель и растворитель отгоняют. Остаток охлаждают до 20C и осажденные стероиды, содержащие второй сырой продукт, фильтруют и сушат. Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в 0,7 дм 3 70 мас.% метанола. Затем добавляют 4 г Norit и 4 г перфила и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянт фильтруют через плоский фильтрSeitz K5. К фильтрату добавляют 0,5 дм 3 воды и метанол отгоняют в роторном испарителе, как описано выше. Остаток охлаждают до 20C, осажденные очищенные однородные сырые кристаллы фильтруют через стеклянный фильтр PO-3 и сушат. Масса полученных таким образом кристаллов составляет 18,4 г, и согласно HPLC их состав является следующим: Для того чтобы разделить желаемый конечный продукт и исходный субстрат, вышеуказанный сырой продукт растворяют в 36 см 3 (объем составляет две с половиной массы кристаллов) дихлорметана и медленно добавляют 180 см 3 н-гексана из резервуара с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученного таким образом 13-этил-11-гидрокси-4-гонен-3,17-диона составляет 15,2 г, и согласно HPLC его состав является следующим (выход составляет 83% в пересчете на ферментационный бульон): Пример 4. Выделение 9-гидрокси-4-андростен-3,17-диона. Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно описанию изобретения в патенте США 4065236, с помощью бактерии Mycobacterium fortuitum, в полезном объеме 5 дм. Количество добавленного -ситостеринового субстрата составляет 30 г/дм 3, и, согласно HPLC, концентрация 9-гидрокси-4-андростен-3,17-диона в ферментационном бульоне составляет 12 г/дм 3, когда биоконверсия завершается. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и 1,5 г/дм 3 продукта обнаруживают в ферментационном бульоне, а остаток находится на поверхности профильтрованной биомассы. Профильтрованный ферментационный бульон выделяют, как описано в примере 3, за исключением того, что растворитель, используемый в экстракции, представляет собой изобутилметилкетон, с получением 6 г сырого кристаллического продукта. Стероиды дважды растворяют с поверхности биомассы с помощью 2 дм 3 60 мас.% метанола и второй сырой кристаллический продукт (68 г) получают путем выпаривания растворителя. Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, объединяют и растворяют в 1,1 дм 3 70 мас.% метанола. Затем добавляют 8 г Norit и 8 г перфила и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянты фильтруют. К фильтрату добавляют 0,5 дм 3 воды и этанол отгоняют при пониженном давлении. Осажденные очищенные однородные сырые кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученных таким образом кристаллов составляет 65 г, и согласно HPLC их состав является следующим: Вышеописанный сырой продукт растворяют в 0,2 дм 3 дихлорэтана и медленно добавляют 1 дм 3 ноктана с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученного таким образом 9-гидрокси-4-андростен-3,17-диона составляет 58 г, и согласноHPLC его состав является следующим (выход составляет 92% в пересчете на ферментационный бульон). Пример 5. Выделение 6-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-диона (который представляет собой смесь 6- и 6-стереоизомеров). Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно заявке на патент ВенгрииР 07 00584, с помощью бактерии Arthrobacter simplex, в полезном объеме 5 дм 3. Количество добавленного 6-гидроксиметил-4-андростен-3,17-дионового субстрата составляет 3 г/дм 3, и биоконверсия составляет 70%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и основное количество стероидных соединений обнаруживают в растворе, осаждение на поверхности биомассы является лишь минимальным. В качестве вспомогательного средства при фильтрации к ферментационному бульону добавляют 50 г перфила и температуру увеличивают до 100C для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 30-35C и биомассу фильтруют через керамический фильтр, оснащенный техническими тканями. Фильтрат охлаждают до температуры 20-25C и смесь экстрагируют 2 дм 3 этилацетата. После разделения фаз водную фазу повторно экстрагируют 1 дм 3 этилацетата. Органические фазы объединяют и экстрагируют 1,2 дм 3 5%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 0,2 дм 3 воды и органический растворитель выпаривают в роторном испарителе с использованием водяной бани 65C. Полученные таким образом сырые, содержащие стероиды, кристаллы являются неоднородными, поэтому их растворяют в 0,2 дм 3 метанола и 0,1 дм 3 воды и добавляют 4 см 3 5%-ного раствора гидроксида натрия. Затем органическую фазу выпаривают с получением однородных сырых кристаллов. Масса полученных таким образом кристаллов составляет 8,8 г, и согласно HPLC их состав является следующим: Для того чтобы получить продукт желаемой чистоты, удаление неполярных примесей осуществляют следующим образом: вышеописанный сырой продукт растворяют в 20 см 3 дихлорметана и медленно добавляют 100 см 3 метилциклогексана из дополнительной воронки с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученного таким образом 6-гидроксиметил-1,4-андростен-3,17-диона составляет 8,32 г, и согласно HPLC его состав является следующим (выход составляет 77,6% в пересчете на ферментационный бульон): Авторы изобретения отмечают, что в следующей реакции синтеза экземестана - и -изомеры дают одинаковый продукт, поэтому нет необходимости отделять их друг от друга. Пример 6. Выделение 15-гидрокси-4-андростен-3,17-диона в промышленном масштабе. Биоконверсию осуществляют согласно способу, описанному в примере 1, в полезном объеме 20 м 3. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и стероидные соединения обнаруживают как в ферментационном бульоне, так и на поверхности профильтрованной биомассы. pH ферментационного бульона доводят до 3,5-4,0 путем добавления 10%-ной фосфорной кислоты для повышения эффективности фильтрации и температуру ферментационного бульона увеличивают до 100C для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 40-45C, добавляют 9 кг/м 3 перфила в качестве вспомогательного средства при фильтрации и биомассу фильтруют через пресс-фильтр типа Lenser, оснащенный техническими тканями. Масса профильтрованной биомассы составляет 700 кг. Фильтрат ферментационного бульона экстрагируют 4 м 3 н-пропилацетата в сепараторе типа CINC с противоточным операторным методом. Рафинат отбрасывают после нейтрализации, а органическую фазу-7 015973 концентрируют до объема примерно 2 м 3. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 1 м 3 1%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 1600 дм 3 воды и смесь переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и органический растворитель выпаривают. Остаток охлаждают до 20C и осажденный сырой кристаллический продукт фильтруют с помощью центрифуги типа C-10, оснащенной техническими тканями. Полученные таким образом сырые кристаллы содержат большое количество полярных примесей, поэтому их перекристаллизовывают следующим образом: В аппарате, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, 1300 дм 3 40 мас.% водного этанола смешивают с полученными выше сырыми кристаллами. Затем температуру смеси увеличивают до 65C, добавляют 5 кг древесного угля и 3 кг перфила, и смесь перемешивают в течение 1 ч при этой температуре. Флокулянты фильтруют через фильтр Sparkler и отбрасывают. Фильтрат переносят в дубликатор и добавляют 200 дм 3 воды, и этанол отгоняют при атмосферном давлении. Остаток охлаждают до 20C, а осажденные очищенные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа C-10,оснащенной техническими тканями. Масса полученных таким образом очищенных сырых кристаллов составляет 28 кг. Биомассу переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и добавляют 8 м 3 60 мас.% водного этанола. Затем температуру смеси увеличивают до 60C, смесь перемешивают в течение 60 мин при этой температуре и биомассу фильтруют с помощью мембранного фильтрующего устройства. Профильтрованную биомассу сжигают. Фильтрат переносят в дубликатор и этанол отгоняют при атмосферном давлении. Остаток охлаждают до 20C и осажденные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа C-10, оснащенной техническими тканями. Масса сырых кристаллов, полученных из биомассы, составляет 135 кг. Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, переносят в дубликатор, оснащенный мешалкой, и растворяют в смеси 1000 дм 3 ацетона и 1600 дм 3 воды при 70C. Затем добавляют 8 кг карбоната натрия и смесь подвергают дефлегмации в течение 1 ч. Затем раствор охлаждают до 55C, добавляют 10 дм 3 уксусной кислоты, 10 кг древесного угля и 5 кг перфила и смесь перемешивают в течение 60 мин, затем флокулянты фильтруют через фильтр Sparkler. Фильтрат переносят в дубликатор, добавляют 400 дм 3 воды, ацетон отгоняют при атмосферном давлении. Остаток охлаждают до 20C, и осажденные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа C-10, оснащенной техническими тканями. Масса полученных таким образом однородных кристаллов составляет 112 кг, и согласно HPLC их состав является следующим: Для того чтобы разделить продукт и субстрат, к вышеописанному продукту в дубликаторе добавляют 400 дм 3 метилциклогексан и воду удаляют из смеси азеотропной перегонкой. Затем осажденные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа C-10, оснащенной техническими тканями, переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в дихлорметане (объем в два раза превышает массу кристаллов). Затем добавляют метилциклогексан (объем в восемь раз превышает массу кристаллов) с медленным перемешиванием. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат. Масса полученного таким образом кристаллического 15-гидрокси-4-андростен-3,17-диона составляет 98 кг, и согласно HPLC его состав является следующим (выход составляет 70% в пересчете на ферментационный бульон): При необходимости количество субстратной примеси может быть дополнительно снижено путем повторения последней стадии кристаллизации, но в данном случае это не является необходимым для дальнейших химических стадий. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17 дикетостероидных соединений из раствора, полученного микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений, отличающийся тем, что: а) удаляют биомассу из ферментационного бульона, необязательно после обработки фосфорной ки-8 015973 слотой путем фильтрации или центрифугирования выделяют стероидные соединения из фильтрата органическим растворителем, не смешивающимся или частично смешивающимся с водой, селективно удаляют примеси нестероидного типа из органической фазы путем обработки водным раствором и получают сырой продукт, содержащий гидроксилированные стероиды путем добавления воды и выпаривания растворителя, и б) растворяют стероидные соединения с поверхности профильтрованной биомассы, полученной на стадии а), путем обработки C1-C3 органическим растворителем, представляющим собой алифатический спирт или кетон, или их водным раствором, и получают твердый остаток, содержащий гидроксилированные стероиды, после выпаривания растворителя, затем в) растворяют остаток, полученный на стадии а), или необязательно - смесь двух сырых остатков,полученных на стадиях а) и б), в C1-C3 органическом растворителе, смешивающемся с водой, представляющем собой алифатический спирт или кетон, или их водный раствор, обесцвечивают раствор активированным углем и выделяют очищенные однородные сырые кристаллы после выпаривания растворителя, и г) перекристаллизовывают очищенные однородные сырые кристаллы, полученные на стадии в), из смеси хлорированного углеводорода/алифатического или циклоалифатического углеводорода, и выделяют чистый продукт. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют этилацетат, н-пропилацетат или изобутилметилкетон в качестве органического растворителя, не смешивающегося или частично смешивающегося с водой. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что регулируют основность и ионную силу водного раствора, используемого для удаления нестероидных примесей, путем добавления соответствующего количества гидроксидов щелочных металлов или щелочно-земельных металлов и/или их основных солей,таких как карбонаты, гидрокарбонаты, фосфаты, гидрофосфаты, ацетаты. 4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что используют метанол, этанол, пропанол или ацетон в качестве C1-C3 органического растворителя, смешивающегося с водой. 5. Способ по пп.1-4, отличающийся тем, что однородные сырые кристаллы на стадии селективной кристаллизации растворяют в хлорированных углеводородах, предпочтительно в дихлорметане или в дихлорэтане, и в качестве алифатических или циклоалифатических углеводородов используют н-гексан,н-октан, додекан, циклогексан или метилциклогексан.