Способ разделения и/или выделения протеинов плазмы методоm кольцевой хроматографии

1 Настоящее изобретение относится к способу разделения и/или выделения протеинов плазмы из смеси, содержащей протеины плазмы. Протеины плазмы играют важную роль во многих физиологических процессах. Так, например, зависимые от витамина К гликопротеины плазмы играют выдающуюся роль в каскаде свертывания крови. Следовательно, извлечение протеинов плазмы является важным техническим процессом. Исходный материал для получения протеинов плазмы уже является относительно дорогим, поскольку его получают, например, из донорской крови. Как по экономическим, так и по этическим причинам важно предложить способы, которые дают нужные протеины плазмы с высоким извлечением и высокой активностью. На сегодня, вдобавок к рекомбинантным методам, протеины плазмы обычно получают из плазмы крови путем использования обычных хроматографических методов. Было обнаружено, что вещества с высоким молекулярным весом могут быть разделены и выделены в порядке величины способом кольцевой хроматографии. Было далее обнаружено,что протеины плазмы человека могут быть получены в очищенной форме даже из сложных смесей неожиданно простым способом. Это достигается способом, включающим в себя следующие стадии: смесь, содержащую протеины плазмы, в частности протеины плазмы человека,наносят на разделяющую среду, имеющую кольцевую конфигурацию. Разделяющая среда,имеющая кольцевую конфигурацию, вращается вертикально вокруг оси, которая определяется в направлении потока смеси через разделяющую среду, имеющую кольцевую конфигурацию. Через разделяющую среду, имеющую кольцевую конфигурацию, пропускают элюент и собирают фракции, выходящие с конца разделяющей среды, имеющей кольцевую конфигурацию. Использование кольцевой хроматографии для обессоливания смесей, содержащих альбумин бычьей сыворотки, уже было описано K.(1997), 49-56. Рейсснер и др. придерживаются того мнения, что определяющей для успешной хроматографической очистки является большая разница размеров разделяемых веществ, а именно альбумина бычьей сыворотки и солей с низким молекулярным весом. Bloomingburg et al.(Ind. Eng. Chem. Res. 30, 1061-1067 (1991 показали, что смесь чистых компонентов альбумина бычьей сыворотки и бычьего гемоглобина может быть разделена посредством катионообменника, имеющего кольцевую конфигурацию. Элюирование вели одним элюентом в изократических условиях. Для нанесения вещества пробы применялся ряд средств нанесения. Для выполнения способа согласно изобретению предпочтительно использовать устройст 003708 2 во, описанное в упомянутой публикации. На фиг. 1 схематично показано рассматриваемое устройство. Фиг. 2 показывает типичную хроматограмму комплекса фактора VIII и фактора Виллебранда, и фиг. 3 показывает соответствующую хроматограмму фактора IX. Фиг. 4 показывает разделение альбумина бычьей сыворотки и IgG. Фиг. 5 показывает результат обычного разделения колоночной хроматографией. Предпочтительно в качестве источника гликопротеинов плазмы, которые должны быть разделены и/или выделены, используют плазму крови или смесь, содержащую вирусноинактивированные протеины плазмы. Указанная смесь, содержащая протеины плазмы, является предварительно обработанной обычными методами. В частности, для вирусной инактивации применялись методы, которые известны как методы растворитель/детергент. Такой метод описан, в частности, B. Horowitz et al., "Blood" 79 (1992), 826-831. Поэтому смесь может также содержать детергент, который может также дополнительно подавлять неспецифические взаимодействия протеинов плазмы с разделяющей средой. Применяемая смесь может быть получена не только из плазмы крови, но она может быть также предоставлена в виде фракции клеточной культуры,содержащей протеины плазмы человека, полученные путем генной инженерии. Разделяющая среда, имеющая кольцевую конфигурацию, предпочтительно состоит из материалов, используемых для адсорбционной хроматографии, такой как ионообменная, гельпроницаемая хроматография, хроматография исключения по размерам, или аффинная хроматография, или хроматография, основанная на гидрофобных взаимодействиях. Применяются обычные материалы. Может также оказаться предпочтительным использование более чем одной разделяющей среды в одном хроматографическом устройстве. Так, хроматографическая колонка может быть заполнена слоями различных разделяющих сред для того, чтобы достичь комбинированного разделительного эффекта. Могут быть выбраны не только подобные среды, но также и очень разные, например анионообменник и среда для хроматографии гидрофобного взаимодействия,или два анионообменника различной силы, или адсорбционный материал и материал для гельпроницаемой хроматографии. Однако необходимо следить за тем, чтобы не происходило нежелательное смешение материалов и чтобы используемые буферные растворы подходили для всех применяемых разделяющих материалов. Предпочтительная разделяющая среда применяется в виде компактного блочного материала (монолита), который уже имеет кольцевую форму, пригодную, например, для хроматографической колонки. Такая среда может быть в комбинации, например, с рыхлой насадкой из 3 хроматографического материала. Средой в форме блока, пригодной в качестве разделяющей среды, могут быть не только неорганические или органические монолиты, полученные путем блочной полимеризации, которые описаны, например, в ЕР-А-0 320 023, включенном сюда в виде ссылки. Для кольцевой хроматографии могут также применяться такие материалыносители, как формованные мембраны или мембраны, имеющие текстильную структуру, такую как на основе целлюлозы. Монолиты или материалы-носители необязательно имеют модифицированную поверхность для образования лигандов, которые могут потребоваться. Другое предпочтительное осуществление относится к предпочтительному нанесению материала пробы на разделяющую среду. Было найдено, что следует предпочтительно использовать аппликационную среду для тщательно нацеленного локального нанесения материала пробы. Может быть применен любой материал,который позволяет узко локализовать пробу и который не смешивается с разделяющей средой. Этого можно достичь специфическим выбором материала, в котором играет роль выбор плотности и условий на поверхности материала. Однако можно также использовать устройство, в котором предусмотрен разделяющий слой между аппликационной средой и разделяющей средой. В качестве аппликационной среды предпочтительно применяются сферические частицы, например стеклянные бусины, причем частицы необязательно обрабатывают, чтобы предотвратить неспецифические взаимодействия. Может оказаться предпочтительным создать на сферических частицах гидрофобную поверхность, если они изначально не имели достаточно гидрофобную поверхность. Например, могут быть использованы стеклянные частицы, гидрофобизированные такими реагентами, как реагенты силанизации. Размер частицы стеклянных частиц преимущественно находится в интервале от 20 до 500 мкм. Сферические частицы покрывают разделяющую среду,имеющую кольцевую конфигурацию, и защищают ее от механических ударов, наносимых устройством для нанесения при вращении устройства, поддерживающего разделяющую среду, имеющую кольцевую конфигурацию. Если применяются поверхности, которые уже относительно гидрофобны, такие как обеспечивающиеся, например, подходящими пластиковыми частицами, нет необходимости гидрофобизировать их поверхность. Пластическими материалами, из которых состоят сферические частицы,могут быть, например, полиметакрилаты и полистирол/дивинилбензол. Протеины плазмы, которые можно получить способом согласно изобретению, включают в себя, в частности, ингибитор интер-трипсина, иммуноглобулины, такие как IgG,альбумин сыворотки человека или гликопро 003708 4 теины из каскада свертывания крови. Предпочтительно из плазмы крови получают такие витамин К-зависимые факторы каскада свертывания крови, как фактор IX, другие факторы свертывания крови, такие как факторы VIII, XI иXIII, антитромбин III, 1-антитрипсин и тромбин. Например, фактор VIII отделяют от сопутствующих во фракции криопреципитата (осадка,полученного вымораживанием) протеинов, таких как фибриноген, путем анионообменной хроматографии, необязательно сочетаемой с хроматографией исключения по молекулярному размеру. В качестве исходного материала применяется также фактор IX в смеси с витамин Кзависимыми протеинами плазмы, где сопутствующие протеины плазмы могут быть эффективно отделены посредством сочетания анионообмена и аффинной хроматографии или хроматографии исключения по размеру молекул, но также и посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия. Одним аспектом настоящего изобретения является применение протеинов человека, которые сами по себе должны быть с большой тщательностью выделены из сложной смеси протеинов. Следует отметить, что, в частности,протеины человека должны быть активированы или денатурированы в минимально возможной степени и смесь протеинов плазмы человека трудно разделять из-за схожести физикохимических свойств протеинов плазмы человека. Оказалось благоприятным, что способ согласно изобретению может, кроме прочего, быть применен для разделения, по меньшей мере,двух различных протеинов человека без существенного влияния на их биологическую активность. Из-за сложности исходных материалов часто необходимо наносить и разделять большое количество протеинов. Непрерывный процесс обладает большими преимуществами, поскольку производительность колонки может быть фактически неограниченной. При кольцевой конфигурации впервые может быть обеспечена подлинно непрерывная операция, что дает возможность проводить одновременно не только нанесение пробы, но и разделение протеинов плазмы и фракционирование. Одновременно может даже регенерироваться и доводиться до равновесия разделяющая среда. Пока одна область разделяющей среды регенерируется, другая область может доводиться до равновесия буфером, который затем непрерывно применяется для нанесения пробы. Таким образом, хроматографическая установка может быть использована на долгосрочной основе на протяжении дней и недель. Тем самым эффективная производительность колонки может быть увеличена в зависимости от продолжительности непрерывного хроматографического процесса. Это является, помимо всего, благоприятным для гельпроницаемой хроматографии и для хроматогра 5 фии исключения по размеру молекул, поскольку использование этих типов хроматографии для разделения протеинов согласно предшествующей практике ограничено их относительно низкой производительностью. Данная, подлинно непрерывная операция также коренным образом отличается от других квазинепрерывных хроматографических методов, в которых применяют ряд физически разделенных секций с разделяющей средой ("симулирование движущегося слоя"). Скорость вращения предпочтительно выбирают в интервале от 100 до 2000/ч, предпочтительно от 600 до 2000/ч. Было установлено,что более высокие скорости благоприятны для фракционирования и время пребывания протеинов человека в разделяющей среде может быть сведено к минимуму. Обычно для разделения выбирают скорости потока в интервале от 1 до 2000 см/мин, предпочтительно от 15 до 300 см/мин. Способ согласно изобретению, кроме всего, подходит для использования в промышленном масштабе для препаративного разделения протеинов плазмы человека. Так, в зависимости от специфической активности протеинов, могут быть получены извлечения, по меньшей мере, от 40 почти до 100%. Если в качестве исходного материала используют предварительно очищенные протеины, можно достичь даже извлечения,по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% при дополнительной очистке, такой как "полировка". Таким образом, фармацевтические препараты, содержащие протеины плазмы, в особенности протеины плазмы человека, в высокоочищенной форме могут быть получены экономичным путем. Кроме того, кольцевая хроматография имеет то преимущество, что ее можно проводить непрерывно. Разделение протеинов плазмы человека достигается особенно хорошо путем адсорбционной хроматографии с использованием ступенчатого градиента, с использованием, по меньшей мере, двух разных элюирующих растворов с различной элюирующей способностью. Было также доказано преимущество использования только одного прибора для нанесения материала пробы, даже если разделяющая среда будет перегружена материалом пробы, имеющим высокую концентрацию протеина. Для мониторинга процесса фракционирования и для целенаправленного отбора собираемых фракций успешно применяется прибор,который контролирует концентрацию протеина в элюатах. В качестве указанного прибора может быть применен подходящий детектор, например фотометр. На фиг. 1 схематично показано предпочтительное устройство для осуществления способа согласно изобретению. Материал-носитель, 003708 6 имеющий кольцевую конфигурацию, размещен между двумя концентрическими цилиндрами. Внешний цилиндр закрыт фланцем на верхнем конце. Предпочтительно, чтобы сам цилиндр был изготовлен из стали. Внутренний цилиндр предпочтительно изготовлен из прочного материала и короче, чем внешний цилиндр, так что на верхнем конце образуется зазор, который позволяет однородно распределить элюент по всей разделяющей среде, имеющей кольцевую конфигурацию. Верхнее днище хроматографической установки оборудовано устройством для ввода пробы и устройством для ввода элюента. Внизу установки оба цилиндра соединены вторым фланцем. Этот фланец имеет ряд отверстий, расположенных на одинаковом расстоянии друг от друга, причем отверстия предпочтительно распределены равномерно в интервале углов, по меньшей мере, от 2 до 180, предпочтительно от 4 до 36. Предпочтительно в эти отверстия вставлены гибкие капилляры, которые ведут, например, к коллектору фракций. Подробнее на фиг. 1 показан ввод элюента 1, ввод пробы 2, стационарный распределитель ввода 3, отсечка давления ввода 4, непрерывный поток пробы 5, вращающаяся кольцевая хроматографическая установка 6, поток элюента 7,разделенная проба 8, стационарное коллекторное устройство для сброса элюента 9, выход элюента 10, материал-носитель, имеющий кольцевую конфигурацию 11, и выход продукта 12. На фиг. 2 показана кольцевая хроматограмма смеси фактор VIII/фактор Виллебранда. На фиг. 3 показана кольцевая хроматограмма фактора IX. На фиг. 4 показана кольцевая хроматограмма иммуноглобулинa G и альбумина бычьей сыворотки, где иммуноглобулин G элюируется первым. На фиг. 5 для сравнения приведена хроматограмма исключения по размеру концентрата фактора VIII на обычной периодической осевой колонке. Изобретение далее поясняется посредством следующих примеров. Пример 1. Прибор для кольцевой хроматографии согласно Journal of Chromatography A, 563 (1997),49-56, заполняли 2 л Fractogel BioSec EMD 650(S). Продолжительность нанесения разделяемой смеси зависит от скорости элюирующего потока. После прохода до дна среды-носителя,имеющей кольцевую конфигурацию, нанесение пробы продолжали еще 1 ч для достижения равновесия. После этого начинали сбор фракций. Аппарат, используемый в примерах, имел выходы на днище хроматографической установки на расстоянии в 2 каждый. Выходные отверстия были соответственно объединены попарно, для того чтобы получить одну фракцию. 7 Разделение поликлонального IgG человека и альбумина бычьей сыворотки Разделяемая смесь: 2,5 мг/мл IgG и 5 мг/мл альбумина бычьей сыворотки в воде для инъекций Буфер: 27,5 мМ дигидрата кислого двунатрийфосфата, 12,5 мМ дигидрата двукислого натрийфосфата, 0,2 мМ хлористого натрия, рН=7,2 Результаты разделения показаны на фиг. 4. Пример 2. Разделение концентрата фактора IX Анализируемый раствор: Лиофилизаты фактора IX с содержанием в 500 иммунных единиц (Octanyne, Octapharma GmbH) растворяли и доводили до концентрации от 20 до 500 иммунных ед./мл. Буфер: 20 мМ цитрата натрия, 0,2 мМ хлористого натрия, 2 мМ хлористого кальция,рН=7,4 Хроматограмма разделения показана на фиг. 3. Пример 3. Разделение концентрата фактора VIII Разделяемая смесь: Лиофилизат фактора(Emoclot) растворяли и доводили до концентрации от 20 до 500 иммунных ед./мл. Буфер: 20 мМ цитрата натрия, 0,2 мМ хлористого натрия, 2 мМ хлористого кальция,рН=7,4 Хроматограмма разделения показана на фиг. 2. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ разделения и/или выделения протеинов плазмы человека из плазмы крови или смеси, содержащей вирусно-инактивированные протеины плазмы, с использованием метода кольцевой хроматографии, отличающийся тем, что разделение осуществляют на разделяющей среде, имеющей слой аппликаци Фиг. 1 8 онной среды, представляющей собой сферические частицы с гидрофобной поверхностью. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная смесь содержит, по меньшей мере,два протеина плазмы, подлежащих разделению. 3. Способ по п.1, где указанная разделяющая среда, имеющая кольцевую конфигурацию,используется для ионообменной,гельпроникающей, эксклюзионной по размеру молекул, или аффинной хроматографии, или для хроматографии, основанной на гидрофобных взаимодействиях. 4. Способ по п.1, где указанными протеинами плазмы являются ингибитор интер-трипсина, 1-антитрипсин, антитромбин III, иммуноглобулины, такие как IgG, сывороточный альбумин человека или гликопротеины, предпочтительно из каскада свертывания, или витамин К-зависимые факторы свертывания крови. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные протеины плазмы выбраны из факторов свертывания крови VIII, IX и тромбина. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные функции смешения, разделения протеинов плазмы и фракционирования осуществляются непрерывно. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что одновременно с разделением протеинов плазмы разделяющую среду непрерывно регенерируют и уравновешивают. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что когда в качестве разделяющей среды используют материал для адсорбционной хроматографии, через указанную разделяющую среду,имеющую кольцевую конфигурацию, одновременно пропускают, по меньшей мере, два различных элюента. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в слоях используют, по меньшей мере, две различные разделяющие среды. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве указанной разделяющей среды используют блок-полимерный материал.