Способ лечения фиброзных заболеваний путем индукции иммунологической толерантности

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПУТЕМ ИНДУКЦИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ Настоящее изобретение впервые продемонстрировало, что введенные перорально фрагменты коллаген I типа (CI) вызвали толерантность к CI у пациентов, страдающих системным склерозом(SSc) и облегчали клинические проявления этого заболевания. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к способам лечения фиброзного заболевания путем перорального введения пациенту одного или более фрагментов коллагена, выбранного из группы, состоящей из 1(I) CB2,CB3, CB4, CB5, CB6, CB7, CB8 и 2(I) CB0, CB1, CB2, CB3, CB4, CB5.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОВ ТЕННЕССИ РИСЕЧ ФАУНДЭЙШН (US) 015764 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение главным образом относится к лечению фиброзных заболеваний. В частности, настоящее изобретение относится к лечению фиброзных заболеваний путем индукции иммунологической толерантности. Предпосылки к созданию изобретения Приобретенные фиброзные заболевания у людей имеют несколько общих признаков. Тканевому фиброзу предшествует повреждение и/или воспаление нормальной ткани. Инфильтрация ткани T-клетками и моноцитами имеет место на ранних стадиях развития фиброза. Системный склероз (SSc, склеродермия) является характерным системным фиброзным заболеванием с повышенным накоплением коллагена I, III, IV, VI, VII, XVI, XVIII типов. У пациентов с SSc был описан клеточный и/или гуморальный иммунный ответ на типы I, III и IV. В это заболевание наиболее характерно вовлекается кожа, которая утолщается и вплотную связывается с подлежащими структурами. Внутренними органами, обычно вовлеченными в этот процесс, являются желудочно-кишечный тракт,легкие, почки и сердце.T-лимфоциты через синтез цитокинов различных типов могут модулировать функции фибробластов и моноцитов/макрофагов, а также целый ряд других клеток-мишеней. В отношении фиброза продукция фиброгенных цитокинов T-клетками, таких как IL-4, TGF-31 и 2, может напрямую стимулировать синтез коллагена фибробластами в культуре. T-клетки, секретируя интерферон (IFN) гамма, могут активировать макрофаги, которые, в свою очередь, могут синтезировать некоторые фиброгенные цитокины, в том числе тромбоцитарный фактор роста, TGF- и 2, которые, в свою очередь, могут стимулировать фибробласты к повышению синтеза коллагена. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способам лечения фиброзного заболевания путем перорального введения тканевого белка, полученного из ткани, подвергаемой фиброзу. Фиброзные заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя, но не только, склеродермию (SSc), кожный фиброз, цирроз печени, почечный фиброз, легочный фиброз, фиброз сердца, гастроинтестинальный фиброз и сосудистый фиброз. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способы по настоящему изобретению используют для лечения пациента, страдающего фиброзным заболеванием по меньшей мере в течение 3 лет, предпочтительно по меньшей мере в течение 5 лет. В другом варианте осуществления фиброзное заболевание лечат путем перорального введения коллагена, полученного из ткани (тканей), подвергаемой фиброзу. В зависимости от типа ткани, в лечении можно использовать различные типы коллагена. Коллаген может быть получен из ткани, подверженной фиброзу, у пациента человека или из соответствующей ткани животного, например видов птиц или млекопитающего. Альтернативно, может быть использован химически синтезированный или рекомбинантно полученный коллаген. В соответствии с настоящим изобретением также может быть использован фрагмент или смесь фрагментов коллагена. В предпочтительном варианте осуществления предложен коллаген или фрагменты коллагена для перорального введения пациенту примерно 500 мкг/день примерно в течение 12 месяцев. Краткое описание чертежей На фиг. 1 изображены коробчатые диаграммы изменений MRSS в различные моменты времени в различных подгруппах пациентов с SSc; на фиг. 2 представлена корреляция процентов пациентов с SSc и процентов улучшения MRSS на 12 месяц; на фиг. 3 - корреляция процентов пациентов с SSc и процентов улучшения MRSS на 15 месяц; на фиг. 4 изображено расщепление 1(I) и 2(I) под действием CNBr. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение впервые продемонстрировало, что введенный перорально коллаген I типа(CI) вызывал толерантность к CI у пациентов, страдающих системным склерозом (SSc), и облегчал клинические проявления этого заболевания.SSc является характерным системным фиброзным заболеванием, связанным с повышенным накоплением белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген. Не привязываясь к какой-либо конкретной теории, считается, что пероральное введение тканевого белка (такого как коллаген), находящегося в участке ткани, подвергаемому фиброзу, где T-клетки активированы под действием различных стимулов,может отрицательно регулировать T-клетки. Вследствие этого происходит ингибирование T-клеток в результате секреции фиброгенных цитокинов и цитокинов, которые активируют моноциты/макрофаги,эти цитокины иным путем стимулировали бы фибробласты в этом участке ткани для продукции белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к способам лечения фиброзного заболевания путем перорального введения тканевого белка, полученного из ткани, которая подвергается фиброзу. Фиброзные заболевания, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, включают-1 015764 в себя, но не только, SSc, кожный фиброз, цирроз печени, почечный фиброз, легочный фиброз, фиброз сердца (как происходит, например, при застойной сердечной недостаточности), гастроинтестинальный фиброз и сосудистый фиброз, как происходит при атеросклерозе. Способами по настоящему изобретению можно лечить эти фиброзные заболевания, не зависимо от причины, вызвавшей это заболевание. В особом варианте осуществления способы по настоящему изобретению используют для лечения пациента, страдающего фиброзным заболеванием по меньшей мере в течение 3 лет, предпочтительно по меньшей мере в течение 5 лет. В соответствии с настоящим изобретением фиброзное заболевание можно лечить путем перорального введения коллагена, происходящего из ткани (тканей), подвергаемой фиброзу. Например, известно, что SSc связан с чрезмерным накоплением коллагена I типа и, следовательно,коллаген I типа или его фрагмент вводят перорально пациентам, страдающим SSc. Цирроз печени, легочный фиброз и интерстициальное коллагеновое заболевание связаны с повышенным накоплением коллагена I, III и V типа соответственно. Следовательно, коллагены I, III и V типов или их фрагмент(ы) перорально вводят пациентам, страдающим циррозом печени, фиброзом легких и интерстициальным коллагеновым заболеванием соответственно. Небольшие синтетические пептиды из коллагена также могут индуцировать толерантность при назальном введении, например, с помощью капель в нос или назального спрея, или их можно вдыхать при распылении в виде аэрозоля. Коллаген может быть получен и экстрагирован из ткани, которая подвергается фиброзу, человека пациента или из соответствующей ткани (тканей) животного, например видов птиц (например, домашних цыплят) или млекопитающего (например, быков или свиней). Альтернативно, может быть использован химически синтезированный или рекомбинантно полученный коллаген. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением может быть использован фрагмент или смесь фрагментов коллагена. Например, пептиды, полученные путем расщепления коллагена I типа под действием CNBr, могут быть использованы при лечении пациента, страдающего SSc. Коллаген или фрагменты коллагена также можно вводить перорально примерно 200-1000 мкг/день,предпочтительно около 400-600 мкг/день и более предпочтительно примерно 500 мкг/день. Лечение может продолжаться по меньшей мере в течение 6 месяцев, предпочтительно 12 месяцев или дольше, или до уменьшения или ослабления клинических проявлений заболевания. Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Чтобы определить, ослабляет ли клинические проявления системного склероза (SSc) пероральное введение коллагена быка I типа (CI) в дозах 500 мкг/день, было проведено многоцентровое двойное слепое плацебо-контролируемое исследование. Для включения в это исследование пациентов подвергали скринингу на основании следующих критериев:- мужчины или женщины по меньшей мере 18 лет;- с клиническим диагнозом диффузного SSc (по критерию ACR 1980) в течение 3 лет или менее- постоянное вовлечение кожи в патологический процесс по данным истории болезни или физикального осмотра в течение 6 месяцев до проведения скрининга и- стабильное состояние кожи в баллах по модифицированной шкале Роднана (Stable modified Rodnan skin score) (MRSS) за 1 месяц до проведения скрининга: постоянное значение MRSS16 при скрининге и постоянное значение MRSS при рандомизации (фоновое значение) представляет собой следующее: 168 пациентов, удовлетворяющие вышеуказанным критериям, случайным образом распределяли для ежедневного введения плацебо [2 мл 0,1 М уксусной кислоты (HAc)] или 500 мкг бычьего CI в течение 12 месяцев. MRSS измеряли в качестве основного параметра исхода заболевания изначально и через 4, 8, 12 и 15 месяцев. Анкету оценки состояния здоровья при склеродермии (SHAQ), опросник общего состояния здоровья 36 (SF-36), общую оценку лечащим врачом, общую оценку пациентом, кровяное давление, массу и креатитин в сыворотке определяли в качестве вторичных критериев исхода болезни изначально и через 4, 8, 12 и 15 месяцев. У пациентов определяли форсированную жизненную емкость легких(FVC) и диффузионную способность легких по методу одиночного вдоха окиси углерода (DLCO) не ранее чем за 5 недель до определения фонового значения и через 12 в качестве вторичных критериев клинического исхода заболевания. Посещение перед скринингом также требовалось для пациентов, прини-2 015764 мающих исключающие лекарственные средства/лечебные воздействия. На фиг. 1 суммированы изменения MRSS на 4 месяц (голубой), 8 месяц (красный), 12 месяц (зеленый) и на 15 месяц (оранжевый) по сравнению с исходными значениями и разбиты на четыре подгруппы. Каждая коробчатая диаграмма описывает распределение изменения MRSS в каждой группе и в каждый момент времени; верхний край представляет собой 75% процентиль; нижний край представляет собой 25%; а линия внутри столбца представляет собой среднее значение MRSS. Аномальные значения представлены отводами от коробки. Результаты указывают на то, что на 12 месяц не было статистически значимого различия в среднем изменении между группой, получавшей лечение CI, и группой, получавшей плацебо. Подобные заключения применимы также к другим клиническим и лабораторным параметрам (смотри табл. 1 и 2). Однако на 15 месяц было очень заметное изменение MRSS: 7,9 на поздней стадии у пациентов, получавших лечение CI (группа "поздняя стадия, коллаген") и 2,9 у пациентов на поздней стадии в группе,получающей плацебо ("поздняя стадия, плацебо"). Как показано на фиг. 1, на 15 месяц среднее значение в оранжевой коробке для пациентов с поздней стадией в группе, получавшей лечение коллагеном, несомненно, существенно ниже средних значений в других оранжевых коробках и в действительности также является наименьшим для всех коробок. Это означает, что у пациентов в подгруппе с поздней стадией,получавших лечение CI, было наибольшее улучшение в MRSS. Значение р разности средних в MRSS между группами лечения для пациентов на поздней стадии составляет 0,0063; все остальные тесты не являются значимыми при уровне 0,05. Отмечено, что переменное MRSS само по себе не является нормально распределенным, но изменение в MRSS на 12-й или 15-й месяц от исходного уровня является нормально распределенной величиной. Следовательно, p-величина была получена по t-критерию. Для того чтобы установить изменение в MRSS между испытуемой группой и группой плацебо, также использовалось непараметрическое исследование, то есть критерий суммы рангов, и p-величина была подобна. Когда изменения в MRSS были дихотомизированы и был определен процент пациентов, у которых наблюдалось улучшение кожи, определенное по MRSS, было построено два графика (фиг. 2 и 3). Каждый график показывает процент группы в каждой из четырех подгрупп, у которых были различные степени улучшения MRSS. Например, на первой кривой почти у 50% пациентов на поздней стадии, группа коллагена, к 12 месяцу наблюдалось снижение на 20% по MRSS. Напротив, на ранней стадии в группе коллагена только приблизительно у 19% было подобное улучшение. Обе кривые ясно показывают, что пациенты с поздней стадией больше всего получают пользу от лечения коллагеном по сравнению с другими подгруппами. Среди группы, получавшей лечение коллагеном, критерий хи-квадрат подтвердил,что к 15 месяцу значительно более высокая часть пациентов с поздней стадией имела по крайней мере 25%-ное улучшение MRSS по сравнению с пациентами с ранней стадией. Итак, описанное выше исследование показывает, что перорально введенный бычьий CI в дозе 500 мкг/день в течение 12 месяцев демонстрирует значительное уменьшение по MRSS на 15 месяц исследования у пациентов с продолжительностью болезни более 4-10 лет, указывая на отсроченное действие перорального лечения коллагеном кожного фиброза. Никаких значимых эффектов перорального введения CI в этом исследовании на PFT или HAQ и никаких нежелательных явлений, которые могли бы относиться к лечению CI, не было обнаружено. Отсроченное действие перорального лечения коллагеном согласуется с мнением, что для фибробластов требуется некоторое время для того, чтобы "свести на нет" однажды нейтрализованные T-клеточные стимулы. Эти результаты также дают возможность предположить, что T-клетки предоставляют основной источник фиброгенных сигналов только у пациентов с поздней стадией. Пример 2. В этом примере описываются эксперименты, проводимые для определения, индуцирует ли пероральное введение CI в дозе 500 мкг/день толерантность к CI у пациентов, набранных для участия в исследовании, описанном в примере 1. Сыворотку и PMBC получали от пациентов до проведения лечения пероральным введением бычьего CI и через 12 месяцев, или в период, не попадающий в интервал от 3 до 11 месяцев. PMBC культивировали с 1(I) цепью бычьего CI, 2(I) цепью бычьего CI, нативным бычьим CI, или CB (CNBr) пептидами 1(I) или 2(I). CB пептиды выделяли путем расщепления 1(I) и 2(I) CI быка или человека под действием CNBr (показано на фиг. 4 и в табл. 3) и проводили очистку с помощью ионообменной хроматографии. Очищенные CB пептиды 1(I) и 2(I), а также неотделенные CB пептиды 1(I) и 2(I) использовали в культуре PMBC, полученных от пациентов с SSc изначально до введения CI или плацебо, и на 12 месяце. Супернатанты PMBC анализировали с помощью ELISA на IFN и IL-10 в 0 и 12 месяцы. Снижение продукции IFN или повышение продукции IL-10 PMBC стимулированными цепями после перорального введения CI определяли в качестве основного параметра иммунологического исхода. Результаты суммированы в табл. 4-9. Как видно из табл. 5-6, значительные снижения наблюдались в продукции IFN PMBC в отношении 1(I) CB пептидной смеси и 1(I) CB7 во всей популяции пациентов и у пациентов с ранней стадией заболевания, получавших лечение пероральным введением CI в течение 12 месяцев. Кроме того, наблюда-3 015764 лись значительные повышения продукции IL-10 PMBC, культивированными с 2(I) человека и 1(I) CB7 в общей популяции пациентов и у пациентов с поздней стадией (табл. 7-8). Эти результаты дают возможность предположить, что перорально введенный бычий CI является потенциально эффективным при лечении пациентов с диффузным SSc продолжительностью 4 лет, по-видимому, путем модуляции продукции TH1/TH2. Положительная регуляция продукции антигенспецифичного IL-10 дает возможность предположить, что толерантность была индуцирована к CI у LD пациентов. Для всей популяции SSc была обратная корреляция между продолжительностью заболевания и продукцией IL-10 следующим образом: 1(I) CB3 (p=-0,0059, N=153); 1(I) CB7 (p=-0,0335, N=150); 1(I) человека (p=-0,0166, N=152) и 2(I) CB смесь (p=-0,0032, N=154). У пациентов с ранней стадией была обратная корреляция между MRSS и продукцией IFN в отношении 2(I) CB2 (p=-0,026, N=94). Для всей популяции SSc была обратная корреляция между SF-36 и продукцией IFN в отношении 1(I) CB4 (p=-0,0448, N=143). У пациентов с ранней стадией была обратная корреляция между SF-36 и продукцией IFN в отношении 1(I) CB4 и PHA (p=-0,0364, N=57; р=-0,028, N=58 соответственно). Для всей популяции с диффузным SSc были прямые корреляции между FVC и продукцией IL-10PMBC, культивированными с 1(I) CB4 и 2(I) человека (p=0,0122, N=152; р=0,0072, N=94 соответственно). У пациентов с ранней стадией была прямая корреляция между FVC и продукцией IL-10 в отношении 2(I) человека (p=0,0062, N=94). У пациентов с ранней стадией была обратная корреляция между FEV1 и продукцией IL-10 в отношении смеси 2(I) CB4 и 1(I) CB (p=-0,0067, N=92; р=-0,0041, N=94 соответственно). Для всей популяции с диффузным SSc была обратная корреляция между FEV1 и продукцией IL-10 в отношении 1(I) CB смеси (p=0,0241, N=154). У пациентов с ранней стадией была прямая корреляция между DLCO и продукцией IFN в отношении 1(I) CB7 (p=0,0367, N=90). У пациентов с поздней стадией была прямая корреляция между DLCO и продукцией IFN в отношении 2(I) CB2 (p=0,0383, N=59). Итак, изучение иммунного ответа, проводимое путем культивирования PMBC пациентов с CI и пептидами, производными CI, показали, что в основном более высокая продукция IFN и IL-10 культивированными PMBC встречалась у пациентов с ранней стадией заболевания (продолжительность 4 лет). Продукция IFN на антиген C. albicans отсутствовала как у пациентов с ранней стадией заболевания, так и у пациентов с поздней стадией заболевания, что говорит о нарушенной реактивности Th1 на обычные антигены окружающей среды. Нативный бычий CI вызывал существенное повышение продукции IFN и IL-10 как у пациентов с ранней стадией, так и у пациентов с поздней стадией. СпецифическиеCB пептиды CI, которые не вызывали продукцию IFN или IL-10 у пациентов с поздней стадией, включали в себя 1(I) CB2, 4, 5 и 7 и 2(I) CB2, 3 и 3-5. Самый сильный стойкий IFN и IL-10 ответ у пациентов как с ранней, так и с поздней стадией, наблюдался с 1(I) CB8, 1(I) CB6, 2(I) CB4, указывая на то,что эти части 1(I) и 2(I) содержат эпитопы, которые вызывают T-клеточные ответы на протяжении всей продолжительности болезни у большинства пациентов с диффузным SSc. Корреляции между специфическими IFN или IL-10 ответами PMBC на CI и пептиды, производные CI, говорят о том, что могли бы существовать подгруппы пациентов, в которых особый цитокиновый ответ на специфические эпитопы CI мог был влиять на проявление болезни. Таблица 1 Изменения HAQ при склеродермии между исходными значениями и 12, и 15 месяцами Таблица 2 Изменения PFT между исходным значением и значением на 12 месяц Таблица 4 Продукция IFN на исходном уровне и на 12 месяце Таблица 5 Продукция IFN PMBC при SSc, культивируемыми с 1(I) CB пептидами быка на исходном уровне и на 12 месяце-5 015764 Таблица 6 Продукция IFN PBMC при SSc, культивируемыми с 2(I) CB пептидами быка на исходном уровне и на 12 месяце Таблица 7 Продукция IL-10 PMBC при SSc на исходном уровне и на 12 месяце Таблица 8 Продукция IL-10 PMBC при SSc, культивируемыми с 1(I) CB пептидами быка на исходном уровне и на 12 месяце-6 015764 Таблица 9 Продукция IL-10 PMBC при SSc, культивируемыми с 2(I) CP пептидами быка на исходном уровне и на 12 месяце ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения фиброзного заболевания у пациента, включающий пероральное введение пациенту одного или более фрагментов коллагена, выбранного из группы, состоящей из 1(I) CB2, CB3, CB4,CB5, CB6, CB7, CB8 и 2(I) CB0, CB1, CB2, CB3, CB4, CB5. 2. Способ по п.1, в котором указанный пациент страдал от указанного фиброзного заболевания по меньшей мере в течение 3 лет. 3. Способ по п.1, в котором указанный коллаген представляет собой коллаген, полученный от человека или видов животных, отличных от человека. 4. Способ по п.1, в котором указанный фрагмент коллагена перорально вводят указанному пациенту в дозе примерно 500 мкг/день. 5. Способ по п.4, в котором пациента лечат примерно в течение 12 месяцев. 6. Способ по п.1, в котором пероральное введение указанного фрагмента коллагена вызывает толерантность у указанного пациента. 7. Средство перорального введения для лечения фиброзного заболевания у пациента, включающее один или более фрагментов коллагена, выбранного из группы, состоящей из 1(I) CB2, CB3, CB4, CB5,CB6, CB7, CB8 и 2(I) CB0, CB1, CB2, CB3, CB4, CB5. 8. Средство по п.7, которое пригодно для ежедневного применения. 9. Средство по п.7, в котором указанный один или более фрагменты коллагена пригодны для вызывания толерантности у указанного пациента после перорального введения. 10. Средство по любому из пп.7-9, которое используется примерно в течение 12 месяцев. 11. Средство перорального введения по меньшей мере один раз в день для лечения фиброзного заболевания у пациента, страдающего от указанного фиброзного заболевания около 3 лет, содержащее по меньшей мере 500 мкг одного или более фрагментов коллагена, выбранного из группы, состоящей из 1(I) CB2, CB3, CB4, CB5, CB6, CB7, CB8 и 2(I) CB0, CB1, CB2, CB3, CB4, CB5. 12. Средство по п.11, которое используется для лечения фиброзного заболевания по меньшей мере 12 месяцев. 13. Средство по п.11, которое используется для лечения фиброзного заболевания по меньшей мере 15 месяцев. 14. Средство перорального введения по меньшей мере один раз в день для лечения фиброзного заболевания у пациента, страдающего от указанного фиброзного заболевания около 3 лет, содержащее по меньшей мере 500 мкг фрагмента коллагена, выбранного из группы, состоящей из 1(I) CB6, CB7, CB8 или 2(I) CB2. 15. Применение средства по п.14 по меньшей мере 12 месяцев.