Сверхзагрузка липосом для доставки лекарственных веществ

010404 Настоящее изобретение относится к липосомам, содержащим эритропоэтин или другое фармацевтически активное соединение, представляющее собой гликопротеин или содержащее гликопротеиновый фрагмент с группами сиаловой кислоты на конце его гликозилированных сайтов. Далее, изобретение относится к способу получения липосом, к композиции, их содержащей, и к способам применения таких липосом. Уровень техники Эритропоэтин (ЕРО) является хорошо известным гликопротеином, участвующим в синтезе красных кровяных клеток. В данной области медицины хорошо известны фармацевтические композиции, содержащие ЕРО вместе с человеческим сывороточным альбумином (HSA) в качестве носителя. Однако, поскольку HSA, полученный из природных источников, всегда несет потенциальную опасность переноса инфекционных болезней, в особенности вирусных инфекций, были предприняты попытки заменить HSA в качестве носителя для парентеральных ЕРО лекарственных веществ. ЕР 0937456 А 1 раскрывает парентеральную композицию на основе липосомы, содержащую эритропоэтин вместе с липосомами в водной дисперсии, в которой гликопротеин, по существу, не внедрен внутрь липосом, а находится в водной фазе на внешней стороне липосом. Липосомы изготавливают введением спиртовой липидной фазы в водный буферный раствор с применением высокоскоростного гомогенизатора для создания липосом диаметром менее 1 мкм. Японский патент JP 8231417 раскрывает другой способ создания липосомно-ЕРО композиции, в которой липосомы создаются обращенно-фазовым выпариванием для включения ЕРО в липосомы. Сущность изобретения Поскольку способы, известные в данной области, могут иметь определенные преимущества, целью настоящего изобретения является улучшение известных композиций посредством получения липосом,которые содержат требуемые лекарственные вещества, не только инкапсулированные внутри, например,в водной фазе липосомы, но также связанные или присоединенные к внешней и/или внутренней стороне липосомной мембраны, в результате чего липосомы загружаются требуемым лекарственным веществом в степени, превышающей обычную или даже теоретически получаемую загрузку с помощью пассивного включения лекарственного вещества, которая предсказана численным расчетом, основанным на количествах лекарственного средства и липида среднего размера и/или общего внутреннего объема липосом(захваченный объем). Таким образом, настоящее изобретение относится к липосомам, содержащим молекулы по меньшей мере одного требуемого лекарственного вещества, где молекулы данного лекарственного вещества присутствуют в количестве, превышающем загрузку лекарственного вещества, достигаемую простым пассивным включением данного лекарственного вещества внутрь водной фазы, т.е. без присоединения лекарственного вещества к мембране. Требуемое лекарственное вещество представляет собой фармацевтически активное соединение, которое в предпочтительном варианте осуществления изобретения представляет собой гликопротеин или другое биоактивное соединение, содержащее, по меньшей мере, олигосахаридный или полисахаридный фрагмент, где данный гликопротеин, олигосахаридный или полисахаридный фрагмент содержит свободнодоступные, а, следовательно, реакционноспособные группы сиаловой кислоты, например, на концах его гликозилированных сайтов. Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение плотно загруженных липосом, в которых требуемое лекарственное вещество инкапсулируется в липосомы и в которых часть лекарственного вещества также связана или присоединена к липосомной мембране с внешней стороны и обычно также с внутренней стороны. В предпочтительном варианте осуществления данное лекарственное вещество представляет собой эритропоэтин. Другой целью настоящего изобретения является предложения способа получения плотно загруженных липосом. Еще одной целью изобретения является предложение фармацевтических композиций, содержащих такие плотно загруженные липосомы. Принцип изобретения дополнительно описывается в независимых пунктах формулы изобретения, в которой различные варианты осуществления изобретения являются объектом зависимых пунктов формулы изобретения. Подробное описание изобретения Более конкретно, в первом варианте осуществления изобретение относится к липосоме для доставки лекарственного вещества, которая содержит молекулы по меньшей мере одного желаемого лекарственного вещества, распределенного в водной фазе внутри липосомы и в котором липосома дополнительно содержит молекулы того же или другого лекарственного вещества, присоединенного к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны. Присоединение может иметь ковалентную и нековалентную природу, т.е. может осуществляться химическое связывание между лекарственным веществом и липидом или присоединение может быть осуществлено адгезионными силами, отличными от химического связывания, которые включают, но не ограничиваются этим, взаимодействие между молекулами лекарственного вещества и липидами посредством сил Ван-дер-Ваальса, водородных связей, электростатического притяжения, гидрофильно-гидрофобного взаимодействия, сил сродства и/или полярных взаимодействий.-1 010404 В другом варианте осуществления изобретение относится к такой липосоме, в которой по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества, присоединенных к мембране, являются ковалентно связанными с липидными мембранами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ковалентная связь представляет собой химическую связь между реакционноспособной функциональной группой липида и функциональной группой лекарственного вещества, которое взаимодействует с функциональной группой липида. Предпочтительно, чтобы химическая связь была по природе такой, чтобы не мешать предписанному физиологическому действию лекарственного вещества на организм человека или животного. В другом предпочтительном варианте осуществления химическая связь имеет такую природу, что она может расщепляться под действием физиологических условий при введении в организм человека или животного. Соответственно, в конкретном варианте осуществления изобретение относится к таким липосомам,в которых функциональная группа липида представляет собой гидроксильную группу, при этом гидроксильная группа может быть частью многоатомного спиртового остатка. Подходящие многоатомные спиртовые остатки представляют собой остатки сахарных спиртов и особенно остатки глицерина и остатки инозита из липидов природного происхождения. Однако липидные функциональные группы, обеспечивающие присоединение желаемого лекарственного вещества к липосомной мембране, могут представлять собой остаток холина, такого как, например, фосфатидилхолин (лецитин). Там, где липидная функциональная группа представляет собой гидроксильную группу, предпочтительно, чтобы реакционноспособная функциональная группа лекарственного вещества представляла собой кислотную группу, в особенности кислотную группу, выбранную из группы, состоящей из остатка фосфорной кислоты, остатка серной кислоты, остатка угольной кислоты и остатка сиаловой кислоты. В этом случае молекулы лекарственного вещества или по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества, которые несут кислотную группу, будут ковалентно связываться сложноэфирной связью по меньшей мере с частью липидных молекул, которые несут гидроксильную группу. В другом варианте изобретение относится к липосоме, как описано выше, в которой лекарственное вещество представляет собой гликопротеин или содержит олигосахаридный или полисахаридный фрагмент, причем гликопротеин, олиго- или полисахаридный фрагмент содержит по меньшей мере одну свободную реакционноспособную группу сиаловой кислоты, которая может вступить в реакцию этерификации с гидроксилсодержащими липидами. Липидная композиция везикулярной мембраны липосом обычно содержит по меньшей мере одну составляющую природного происхождения и одну искусственную составляющую, выбранную из группы,состоящей из фосфолипидов, гликолипидов, церамидов и производных любого из этих видов липидов. Соответственно, в другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к вышеупомянутой липосоме, где липосома содержит фосфолипиды, в особенности фосфолипиды, выбранные из группы, состоящей из сфингофосфолипидов и глицерофосфолипидов, причем сфингофосфолипиды включают сфингомиелины и глицерофосфолипиды включают лецитины, кефалины, кардиолипиды, фосфатидилинозитолы и фосфатидилинозитолфосфаты. Если липосомы содержат гликолипиды вместо или в дополнение к фосфолипидам, упомянутые гликолипиды предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гликосфинголипидов и гликоглицеролипидов, причем гликосфинголипиды включают цереброзиды, ганглиозиды, сульфатиды и гликоглицеролипиды включают гликозилмоноглицериды и гликозилдиглицериды. В более конкретном варианте осуществления изобретения липосома согласно настоящему изобретению имеет липидную композицию, в которой мембрана включает дипальмитоилфосфатидилхолинDPPC:холестерин:EPG=7:2:1, и очевидно, что это соотношение может, конечно, различаться качественно и/или количественно, в зависимости от обстоятельств. В другом конкретном варианте осуществления изобретения лекарственное вещество для доставки в инкапсулированном и присоединенном к липосомам виде представляет собой эритропоэтин. В другом варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим липосомы, загруженные лекарственным веществом, как определено выше, вместе с фармацевтически подходящим носителем. Фармацевтическая композиция может находиться в любой подходящей жидкой, полужидкой или твердой форме, особенно для парентерального введения, например в виде раствора для инъекции, назального спрея, жидкости для ингаляции, крема, геля, мази, суппозитория или жидкого крема для местного и общего парентерального введения. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения липосомы, загруженной лекарственным веществом, содержащей молекулы по меньшей мере одного требуемого лекарственного вещества, распределенного в водной фазе внутри липосомы, и дополнительно содержащей молекулы такого же или другого лекарственного вещества, присоединенного к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны, включающему предоставление липидной фазы в органическом растворителе, где липидная фаза включает по меньшей мере одну липидную фракцию, в которой каждая липидная молекула имеет по меньшей мере одну реакционноспособную функциональную группу;-2 010404 предоставление водной фазы, включающей буферный раствор и растворенное в нем по меньшей мере одно требуемое лекарственное вещество, в котором по меньшей мере одно лекарственное вещество имеет реакционноспособную функциональную группу, способную к взаимодействию с функциональной группой липидов; введение липидной фазы в водную фазу при условиях, способствующих образованию липосом; необязательно циркулирование водной фазы в замкнутом контуре и повторение шага с) для увеличения эффективности захвата лекарственного вещества липосомами; и сбор липосом, заполненных лекарственным веществом,в которых по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества включена внутрь липосом, в то время как другая часть молекул лекарственного вещества присоединена к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны. Следует понимать, что термины, такие как реакционноспособная функциональная группа или взаимодействие с функциональной группой, примененные в данной заявке в связи с лекарственными веществами и липидами, не обязательно означают, что вид реакции или реакционная способность приводят к образованию ковалентной химической связи, но, вместо этого, могут иметь такую природу, чтобы привести к более или менее сильной адгезии или присоединению, а не к химической связи между липидом и лекарственным веществом, как подчеркивалось ранее. Как упоминалось выше, функциональная группа липидов может быть гидроксильной группой, особенно гидроксильной группой в составе остатка многоатомного спирта, такого как остаток сахарного спирта, предпочтительно производного остатка сахарных спиртов природного происхождения, таких как глицериновая и инозитная или холиновая группа, как в лецитинах. Также упомянутая выше реакционноспособная функциональная группа лекарственного вещества может быть кислотной группой, в особенности кислотной группой, выбранной из группы, состоящей из остатка фосфорной кислоты, остатка серной кислоты, остатка угольной кислоты и остатка сиаловой кислоты. В одном варианте осуществления способ получения включает введение липидной фазы в водную фазу при подходящих условиях для взаимодействия, например химической реакции по меньшей мере части данных липидов, несущих реакционноспособную функциональную группу с по меньшей мере частью молекул данного лекарственного вещества, несущего реакционноспособную функциональную группу. Там, где липидная функциональная группа представляет собой гидроксильную группу и функциональная группа лекарственного вещества представляет собой кислотный остаток, вышеупомянутые условия, приводящие к взаимодействию, и, необязательно, химическая реакция включают подачу липидной фазы в водную фазу при температуре реакции от приблизительно 25 до приблизительно 65 С и при значении pH водной фазы от приблизительно 6 до приблизительно 8, вследствие чего по меньшей мере часть вышеупомянутых молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособные функциональные группы, присоединяются, необязательно образуя ковалентную сложноэфирную связь, к по меньшей мере части вышеупомянутых липидов, имеющих функциональные группы. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственное вещество представляет собой гликопротеин или содержит олигосахаридный или полисахаридный фрагмент, причем гликопротеин или олиго- или полисахаридный фрагмент включает по меньшей мере одну реакционноспособную группу сиаловой кислоты. Еще в одном конкретном варианте осуществления способ получения липидной фазы включает по меньшей мере один липид природного или искусственного происхождения, выбранный из группы, состоящей из фосфолипидов, гликолипидов, церамидов и производных этих липидов, в то время как в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения липидная композиция липидной фазы подобрана так, что включает DPPC, холестерин и EPG в молярном соотношении 7:2:1, и очевидно, что это соотношение может, конечно, различаться качественно и/или количественно, в зависимости от обстоятельств. Предпочтительно, чтобы липидная фаза вводилась в водную фазу под давлением и, по существу, в отсутствие поперечного сдвига с применением перекрестного проточно-инжекционного метода, раскрытого в WO 02/36257, который приводит к немедленному и спонтанному образованию липосом при чрезвычайно мягких условиях, т.е. без применения сил поперечного сдвига, создающих высокую скорость гомогенизатора или сходные способы для создания высокой турбулентности для образованиявезикулы. Еще в одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения, в котором перед стадией образования везикул по меньшей мере часть липидной фракции или всю липидную фракцию,которая содержит липиды, имеющие по меньшей мере одну реакционноспособную функциональную группу на одну липидную молекулу, подвергают взаимодействию с по меньшей мере частью тех молекул лекарственного вещества, которые несут реакционноспособную функциональную группу, для присоединения или даже ковалентного связывания молекул лекарственного вещества к мембранным липидам. Эта предварительная реакция выполняется перед образованием везикул. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение относится к способам получения, в которых по меньшей мере часть липидов-3 010404 липидной фазы присоединяется, необязательно ковалентно связываясь, по меньшей мере к части молекул требуемого лекарственного вещества перед введением липидной фазы в водную фазу. В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к способам получения липосом,загруженных лекарственным веществом, включающим молекулы по меньшей мере одного требуемого лекарственного вещества, распределенные в водной фазе внутри липосомы, и дополнительно включающим молекулы того же или другого лекарственного вещества, присоединенного к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны, включающим предоставление липидной фазы в органическом растворителе или в качестве высушенной пленки,причем липидная фаза включает по меньшей мере одну липидную фракцию, в которой каждая липидная молекула имеет по меньшей мере одну реакционноспособную функциональную группу; предоставление первой водной фазы, включающей буферный раствор; предоставление второй водной фазы, включающей буферный раствор и растворенное в нем по меньшей мере одно требуемое лекарственное вещество, в которой по меньшей мере одно лекарственное вещество имеет реакционноспособную функциональную группу, способную к присоединению или к химической реакции с функциональной группой липидов; объединение липидной фазы с первой водной фазой в условиях, способствующих образованию липосом; объединение образовавшихся липосом со второй водной фазой в условиях, позволяющих ввести по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества в липосомы и способствующих взаимодействию,необязательно химической реакции, по меньшей мере части вышеупомянутых молекул липидов, несущих реакционноспособную функциональную группу, по меньшей мере с частью молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособную функциональную группу; и сбор липосом, загруженных лекарственным веществом, в которых по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества включена внутрь липосом, в то время как другая часть молекул лекарственного вещества присоединена к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны. При применении этого способа предпочтительно, чтобы липидная функциональная группа представляла собой гидроксильную группу и функциональная группа лекарственного вещества представляла собой кислотный остаток, и вышеупомянутые условия, способствующие взаимодействию, например химической реакции, включают объединение липосом со второй водной фазой при температуре реакции от приблизительно 25 до приблизительно 65 С и при значении pH второй водной фазы от приблизительно 6 до приблизительно 8 и выдерживание полученной липосомной суспензии до тех пор, пока по меньшей мере часть вышеупомянутых молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособные функциональные группы, не окажутся присоединенными, необязательно ковалентно связанными сложноэфирной связью, к по меньшей мере части вышеупомянутых липидов, имеющих функциональные группы. В дополнительном варианте осуществления вышеупомянутый способ включает дополнительную процедуру, где в течение или после выдерживания липосомную суспензию подвергают дальнейшей обработке для увеличения захвата лекарственного вещества липосомами, такая обработка предпочтительно выбирается из группы, состоящей из обработки ультразвуком, электропорации, встряхивания и градиентнонаправленной трансмембранной диффузии. Ковалентная связь может быть сложноэфироной связью. Подходящее лекарственное вещество для сверхзагрузки липосом лекарственным веществом для доставки представляет собой эритропоэтин. Плотно заполненные липосомы настоящего изобретения позволяют значительно снизить дозировку парентерально вводимых форм, таких как растворы для инъекции, назальные спреи, препараты местного нанесения, такие как кремы, гели, мази или жидкие кремы. В зависимости от природы требуемого лекарственного вещества, указанные липосомные композиции позволяют в известном смысле регулировать режимы приема лекарственных веществ так, чтобы уменьшить или, по существу, избежать нежелательных побочных эффектов по отношению к организму человека или животного. Более того, липосомные композиции согласно настоящему изобретению значительно увеличивают и пролонгируют биологическую доступность фармацевтически активных соединений, которые легко подвержены деградации или повреждению при физиологических условиях в организме человека или животного. В дополнение к сверхзагрузке липосом требуемым лекарственным веществом, другое значительное преимущество настоящего изобретения состоит в обеспечении возможности получения липосом,содержащих два или более различных лекарственных веществ в приемлемых количествах, в которых по меньшей мере одно лекарственное вещество прикреплено к липосомной мембране ковалентной или нековалентной связью, в то время как по меньшей мере одно другое лекарственное вещество находится в водной фазе внутри липосом. Таким образом, применяя концепцию настоящего изобретения, специалист в данной области фармакологии сможет создавать липосомы для одновременной доставки двух или более лекарственных компонентов туда, где такая доставка может быть необходима или полезна, например при комбинированной терапии. Настоящие липосомы предпочтительно получали перекрестным проточно-инжекционным методом,раскрытым в WO 02/36257, содержание которого будет включено сюда посредством ссылки. Вкратце,способ основан на инжекции органической липидной фазы, обычно этанольной липидной фазы, в вод-4 010404 ную фазу через узкое отверстие в стенке трубки с липидной фазой и соответствующее отверстие в стенке второй трубки, соединенной с упомянутой трубкой с липидной фазой и содержащей водную фазу. Особенность этого способа состоит в том, что место инжекции, то есть модуль перекрестной инжекции или смесительная камера, трубка, подающая липидную фазу, плотно соединена с трубкой, подающей водную фазу, так что трубки находятся в жидкостном контакте друг с другом через отверстие, позволяющее органической жидкости входить под давлением в виде распыленного вещества в поток водной фазы, проходящий через упомянутое отверстие. В области скрещивания жидкостей нет никаких элементов, создающих поперечные силы, то есть там, где органический липидный поток вбрасывается приблизительно под прямым углом в водный поток и самопроизвольно образуются липосомы исключительно высокого качества с распределением везикул по размерам. Этот исключительно мягкий способ пригоден для применения по отношению к липидам, неустойчивым к окислению и температурно-чувствительным, а также для капсулирования чувствительных лекарств, которые в других случаях могли бы быть повреждены или дезактивированы под действием явлений кавитации или локального перегрева вследствие поперечных сил, как это возможно в случае, например, гомогенизатора. В дополнение к способам пассивного включения лекарственных веществ в липосомы, настоящее изобретение предполагает также активное присоединение требуемых лекарственных веществ к липосомной мембране, которая обычно является моноламмелярным бислоем. Для того, чтобы достигнуть этой цели, т.е. активно присоединить или ассоциировать фармацевтически активное соединение к липосомной мембране, предпочтительно, чтобы липидная композиция мембраны специально подбиралась в соответствии с требуемым лекарственным веществом(ами) для доставки, т.е. включала липиды, способные к взаимодействию с молекулами требуемого лекарственного вещества(в), например фосфолипиды природного и искусственного происхождения, имеющие концевые группы типа глицерина и инозита, и включала другие липиды, особенно природного происхождения, которые имеют низкие количества липидов,имеющих такую концевую группу. Подходящие липиды включают сфинголипиды и их производные, цереброзиды и их производные,церамиды и их производные. Для активной ассоциации или присоединения требуемого лекарственного вещества к липосомной мембране предпочтительно, чтобы липосомы были приготовлены с участием требуемого лекарственного вещества, например с эритропоэтином, при температуре от приблизительно 25 до приблизительно 65 С и при приблизительно нейтральном pH, т.е. при слабощелочном или слабокислом pH, предпочтительно при pH от 6 до 8. По-видимому, присоединение, необязательно включающее химическое связывание посредством реакции этерификации между группами сиаловой кислоты и фосфолипидами, осуществляется лучше всего при данных температуре и pH диапазоне. Липосомы согласно настоящему изобретению обычно содержат одну липидную фракцию, выбранную из группы, состоящей из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), яичного фосфатидилхолина(ЕРС), соевого фосфатидилхолина (SPC), церамидов и сфингозинов в качестве основной липидной фракции, вместе с по меньшей мере одной другой липидной фракцией, выбранной из группы, состоящей из холестерина и липидов, имеющих заряженные концевые группы. При применении вышеупомянутого способа пассивной инкапсуляции посредством перекрестной проточной инжекции липидной фазы в водную фазу были получены следующие результаты: а) с помощью пассивной инкапсуляции была достигнута степень инкапсуляции вплоть до 20-50 мас.% от массы лекарственного вещества, которое подвергалось инкапсуляции, эти результаты, в первую очередь, зависят от числа циклов рециркуляции, проведенных с водной фазой, содержащей лекарственное вещество,предварительно выбранного размера везикул образующейся липосомы и липидной композиции и липидной концентрации мембраны. Такая степень инкапсуляции является хорошей в соответствии с результатами предыдущих исследований, например, для включения в липосому определенных ферментов, таких как rhSOD, где б) с помощью комбинированной активной и пассивной загрузки липосом согласно настоящему изобретению была достигнута степень загрузки, т.е. инкапсуляция, а также внешнее и внутреннее присоединение к липосомной мембране, предназначенное для заполнения лекарственного вещества вплоть до 100 мас.%,что подтверждено анализом фильтратов после заполнения липосом. Обычно свободное лекарственное вещество находили в фильтратах в концентрациях 10 мас.% или меньше относительно первоначальной концентрации. Большинство экспериментов, которые привели к настоящему изобретению, были выполнены с применением эритропоэтина в качестве требуемого лекарственного вещества, который служит примером концепции загрузки лекарственным веществом по настоящему изобретению. Однако, как упоминалось в данной заявке ранее, изобретение применимо к любым веществам, которые могут быть инкапсулированы в липосомы и присоединены к липосомной мембране, в особенности к одной или к обеим сторонам мембраны. Присоединение может быть ковалентной и нековалентной природы, например из уровня техники известны присоединения по химическому сродству или при электростатическом взаимодействии, с помощью сил Ван-дер-Ваальса, гидрофильного и/или гидрофобного взаимодействия и т.п. Предпочтитель-5 010404 но, однако, чтобы лекарственное вещество было ковалентно связано с функциональной группой липида,содержащегося в липосомной мембране. Там, где функциональная группа представляет собой полиол,особенно группы сахарных спиртов, и обычно представляет собой или глицерин, или инозит, требуемое лекарственное вещество будет наиболее эффективно прикрепляться к мембране, если оно содержит реакционноспособную функциональную группу кислоты, например фосфорной кислоты, серной кислоты,угольной кислоты и остатка сиаловой кислоты. Такая реакционноспособная функциональная группа кислоты может взаимодействовать с гидроксильной группой липида, что приведет к ковалентному связыванию между липидом и лекарственным веществом за счет этерификации. Для того, чтобы изобретение, описанное в данной заявке, было более понятно, приведены следующие четыре примера. Пример 1 (сравнительный пример). Пассивная загрузка липосом лекарственным веществом. а) Липидная композицияDPPC:холестерин:стеариламин=7:2:1 б) Концентрация лекарственного вещества 2868 мкг эритропоэтина (ЕРО) на 2 мл водного буферного раствора (PBS). Липосомы получали согласно перекрестному проточно-инжекционному методу, раскрытому в WO 02/36257. Были получены моноламмелярные бислойные липосомы, имеющие диаметр везикул около 170 нм и последовательно подвергнутые фильтрации с применением ультра/диафильтрации. Фильтрат анализировали на наличие свободного, т.е. не инкапсулированного лекарственного вещества, и результаты по его содержанию были следующие. Липосомный концентрат (2 мл): 711 мкг ЕРО=25 мас.% инкапсулирования. Общие фильтраты: 2175 мкг ЕРО=75 мас.% не инкапсулировалось. Отдельные фракции: фильтрат F1=843 мкг; фильтрат F2=596 мкг, фильтрат F3=345 мкг, фильтратF4=391 мкг. В этом примере применение обычного в данной области техники способа для инкапсуляции ЕРО в липосомы привело к 25 мас.% включения лекарственного вещества, т.е. 356 мкг лекарственного вещества на 1 мл липосомного концентрата. В более общем смысле, применение этого способа для пассивной инкапсуляции лекарственных веществ обычно приводило к степеням включения, находящимся в диапазоне от приблизительно 25 до приблизительно 50 мас.% относительно исходного количества лекарственного вещества. Такая эффективность заполнения находится в хорошем соответствии с предварительными исследованиями пептидов или протеинов, таких как рекомбинантная человеческая супероксиддисмутаза(rhSOD), в качестве желательных лекарственных веществ для инкапсуляции в липосомы. Пример 2. а) Липидная композицияDPPC:холестерин:стеариламин=7:2:1 б) Концентрация лекарственного вещества 3375 мкг ЕРО на 2 мл водного буферного раствора (PBS). Липосомы получали согласно перекрестному проточно-инжекционному методу, раскрытому в WO 02/36257. Были получены моноламмелярные бислойные липосомы, имеющие диаметр везикулы около 170 нм и последовательно подвергнутые фильтрации с применением ультра/диафильтрации. Фильтрат анализировали на наличие свободного, т.е. некапсулированного лекарственного вещества,и результаты по его содержанию были следующие. Липосомный концентрат (2 мл): 3043 мкг ЕРО=90 мас.%. Общие фильтраты: 328 мкг ЕРО=10 мас.%. Отдельные фракции: фильтрат F1=24 мкг; фильтрат F2=128 мкг, фильтрат F3=0-1 мкг, фильтратF4=176 мкг. В этом примере перекрестный проточно-инжекционный способ для инкапсуляции ЕРО в липосомы выполнялся при pH 7,5 и при температуре 50 С, что привело к 90 мас.% включению лекарственного вещества, соответственно, 1522 мкг лекарственного вещества на 1 мл липосомного концентрата. В более общем смысле, применение этого или такого же способа, объединяющего пассивное и активное заполнение липосом требуемым лекарственным веществом с помощью правильного выбора липидов, способствующих легкому присоединению, необязательно включающему образование ковалентной связи между лекарственным веществом и липосомной мембраной (в дополнение к пассивному включению лекарственного вещества в водную фазу внутрь липосом), обычно приводит к скоростям заполнения в диапазоне от приблизительно 80 до приблизительно 100 мас.% относительно исходного количества лекарственного вещества. Пример 3. Комбинация из различных лекарственных веществ. Повторяли пример 2, за исключением того, что водные фазы дополнительно содержали 3500 мкгrhSOD. После фильтрации липосомный концентрат включая около 25% (приблизительно 820 мкг на 2 мл концентрата) rhSOD и приблизительно 70% (приблизительно 2200 мкг на 2 мл концентрата) ЕРО, причем балансовое количество лекарственного вещества определяли в фильтратах.-6 010404 Данный пример показывает, что возможна "сверхзагрузка" липосом, даже когда применяется два различных лекарственных вещества одновременно. Так как внутреннее водное пространство липосом способно к абсорбции, как ожидается, приблизительно 25 мас.% общего предложенного rhSOD, липосомы также способны абсорбировать огромные количества (приблизительно 70 мас.%) второго лекарственного вещества, т.е ЕРО. Это стало возможно благодаря взаимодействию между вторым лекарственным веществом и EPG липидной фракцией липосомной мембраны, приводящей к присоединению вышеупомянутого лекарственного вещества к вышеупомянутой липидной фракции в липосомной мембране, а также определенной степени пассивного включения в водную фазу внутри липосомных везикул (раздельное количественное определение не проводилось). Эксперименты, описанные в данной заявке, и дополнительные эксперименты (данные не показаны) с успехом продемонстрировали преимущества данного вида активной загрузки согласно настоящему изобретению по сравнению с обычным пассивным включением водной фазы, содержащей лекарственное вещество. Фактически, данный способ активной загрузки и особенно сочетания активной и пассивной загрузки привел к образованию липосом, загруженных лекарственным веществом в количествах вплоть до 200% от количества, которое теоретически могли бы ожидать в соответствии со значением захваченного объема водной фазы. Высококонцентрированная липосомная суспензия, собранная из водной фазы, согласно настоящему изобретению обычно содержит около 0,5-2 мг лекарственного вещества на 1 мл. Она может быть последовательно разбавлена и/или включена в состав обычных твердых, жидких или полужидких препаративных форм или фармацевтических композиций для перорального или парентерального введения, особенно для внутримышечного, внутривенного, подкожного, кожного, внутрислизистого, интраназального или внутрилегочного введения. Подходящие композиции могут быть в виде инъекционных растворов, назальных спреев, жидкостей для ингаляции, кремов, гелей, мазей, суппозиторий или лосьонов и т.д. для местного и системного парентерального введения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Липосома для доставки лекарственных веществ, которая содержит молекулы по меньшей мере одного желаемого лекарственного вещества, распределенного в водной фазе внутри липосомы, отличающаяся тем, что лекарственное вещество представляет собой гликопротеин или содержит олигосахаридный или полисахаридный фрагмент, при этом липосома дополнительно содержит молекулы того же или другого лекарственного вещества, присоединенные к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны. 2. Липосома по п.1, где молекулы вышеупомянутого лекарственного вещества присутствуют в количестве, превышающем максимальную загрузку лекарственного вещества, достигаемую пассивным включением данного лекарственного вещества во внутреннюю водную фазу без присоединения молекул лекарственного вещества к мембране. 3. Липосома по п.1 или 2, в которой по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества присоединена к мембране ковалентной связью путем образования химической связи или нековалентным путем с помощью адгезионных сил, отличных от химического связывания, которые обычно включают по меньшей мере один вид адгезионных сил, выбранных из группы, состоящей из сил Ван-дер-Ваальса, водородных связей, электростатического притяжения, гидрофильно-гидрофобных взаимодействий, сил сродства и полярных взаимодействий между лекарственным веществом и молекулами липидов. 4. Липосома по п.1 или 2, в которой присоединение осуществляется за счет реакционноспособной функциональной группы липида и функциональной группы лекарственного вещества. 5. Липосома по п.4, в которой функциональная группа липида представляет собой гидроксильную и холиновую группу. 6. Липосома по п.5, в которой гидроксильная группа представляет собой часть остатка многоатомного спирта. 7. Липосома по п.6, в которой остаток многоатомного спирта представляет собой остаток сахарного спирта, выбранный из группы, состоящей из остатка глицерина и остатка инозита. 8. Липосома по любому из пп.4-7, в которой реакционноспособная функциональная группа лекарственного вещества представляет собой кислотную группу, выбранную из группы, состоящей из остатка фосфорной кислоты, остатка серной кислоты, остатка угольной кислоты и остатка сиаловой кислоты, и по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества присоединена к липидам мембраны, необязательно ковалентно связана с липидами сложноэфирной связью. 9. Липосома по любому из пп.1-8, в которой гликопротеин или олиго- или полисахаридный фрагмент содержит по меньшей мере одну реакционноспособную группу сиаловой кислоты. 10. Липосома по любому из пп.1-9, в которой мембрана содержит по меньшей мере один липид природного или искусственного происхождения, выбранный из группы, состоящей из фосфолипидов,гликолипидов, церамидов и производных этих видов липидов. 11. Липосома по п.10, в которой фосфолипиды выбирают из группы, состоящей из сфингофосфоли-7 010404 пидов и глицерофосфолипидов, при этом сфингофосфолипиды включают сфингомиелины и глицерофосфолипиды включают лецитины, кефалины, кардиолипины, фосфатидилинозитолы и фосфатидилинозитолфосфаты. 12. Липосома по пп.10 и 11, в которой гликолипиды выбирают из группы, состоящей из гликосфинголипидов и гликоглицеролипидов, причем гликосфинголипиды включают цереброзиды, ганглиозиды,сульфатиды и гликоглицеролипиды включают гликозилмоноглицериды и гликозилдиглицериды. 13. Липосома по любому из пп.1-12, в которой мембрана включает DPPC, холестерин и EPG при молярном соотношении 7:2:1. 14. Липосома по любому из пп.1-13, в которой лекарственное вещество представляет собой эритропоэтин. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая загруженные лекарственным веществом липосомы по любому из пп.1-14 вместе с фармацевтически приемлемым носителем для перорального или парентерального введения. 16. Фармацевтическая композиция по п.15 в форме раствора для инъекции, назального спрея, жидкости для ингаляции, крема, геля, мази, суппозитория или лосьона. 17. Фармацевтическая композиция по п.15 или 16 для местного и системного парентерального введения. 18. Способ получения липосомы, загруженной лекарственным веществом, содержащей молекулы по меньшей мере одного требуемого лекарственного вещества, распределенного в водной фазе внутри липосомы, и дополнительно содержащей молекулы такого же или другого лекарственного вещества,присоединенные к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны, включающий предоставление липидной фазы в органическом растворителе, где липидная фаза включает по меньшей мере одну липидную фракцию, в которой каждая липидная молекула имеет по меньшей мере одну реакционноспособную функциональную группу; предоставление водной фазы, включающей буферный раствор и растворенное в нем по меньшей мере одно требуемое лекарственное вещество, представляющее собой гликопротеин или содержащее олигосахаридный или полисахаридный фрагмент в котором по меньшей мере одно лекарственное вещество имеет реакционноспособную функциональную группу, способную к присоединению или химическому взаимодействию с функциональной группой липидов; введение липидной фазы в водную фазу в условиях, способствующих образованию липосом; необязательно циркулирование водной фазы в замкнутом контуре и повторение стадии ведения для увеличения эффективности поглощения лекарственного вещества липосомами; и сбор липосом, загруженных лекарственным веществом, в которых по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества включена внутрь липосом, тогда как другая часть молекул лекарственного вещества присоединена к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны. 19. Способ по п.18, в котором функциональная группа липидов представляет собой гидроксильную или холиновую группу. 20. Способ по п.19, в котором гидроксильная группа представляет собой часть остатка многоатомного спирта. 21. Способ по п.20, в котором остаток многоатомного спирта представляет собой остаток сахарного спирта, выбранный из группы, состоящей из остатка глицерина и остатка инозита. 22. Способ по любому из пп.18-21, в котором реакционноспособная функциональная группа лекарственного вещества представляет собой кислотную группу, выбранную из группы, состоящей из остатка фосфорной кислоты, остатка серной кислоты, остатка угольной кислоты и остатка сиаловой кислоты. 23. Способ по любому из пп.18-22, в котором липидную фазу вводят в водную фазу в условиях,способствующих взаимодействию по меньшей мере части вышеупомянутых липидов, имеющих реакционноспособную функциональную группу по меньшей мере с частью вышеупомянутых молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособные функциональные группы. 24. Способ по п.23, в котором липидная функциональная группа представляет собой гидроксильную группу и функциональная группа лекарственного вещества представляет собой кислотный остаток и в котором вышеупомянутые условия, способствующие взаимодействию, включают введение липидной фазы в водную фазу при температуре реакции от 25 до 65 С и при значении рН водной фазы от 6 до 8,вследствие чего по меньшей мере часть вышеупомянутых молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособные функциональные группы, присоединяется, необязательно образуя ковалентную сложноэфирную связь по меньшей мере с частью вышеупомянутых липидов, имеющих функциональные группы. 25. Способ получения липосомы, загруженной лекарственным веществом, включающей молекулы по меньшей мере одного требуемого лекарственного вещества, распределенные в водной фазе внутри липосомы, и дополнительно включающей молекулы того же или другого лекарственного вещества, присоединенные к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны, включающий предоставление липидной фазы в органическом растворителе или в качестве высушенной пленки,где липидная фаза включает по меньшей мере одну липидную фракцию, в которой каждая липидная мо-8 010404 лекула имеет по меньшей мере одну реакционноспособную функциональную группу; предоставление первой водной фазы, включающей буферный раствор; предоставление второй водной фазы, включающей буферный раствор и растворенное в нем по меньшей мере одно требуемое лекарственное вещество, которое является гликопротеином или имеет олигосахаридный или полисахаридный фрагмент, в которой по меньшей мере одно лекарственное вещество имеет реакционноспособную функциональную группу, способную к присоединению или к химическому взаимодействию с функциональной группой липидов; объединение липидной фазы с первой водной фазой в условиях, способствующих образованию липосом; объединение образовавшихся липосом со второй водной фазой в условиях, способствующих захвату по меньшей мере части молекул лекарственного вещества липосомами и способствующих взаимодействию, необязательно химическому взаимодействию, по меньшей мере части указанных молекул липидов, несущих реакционноспособную функциональную группу, по меньшей мере с частью молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособную функциональную группу; и сбор липосом, загруженных лекарственным веществом, в которых по меньшей мере часть молекул лекарственного вещества включена внутрь липосом, в то время как другая часть молекул лекарственного вещества присоединена к одной или к обеим сторонам липосомной мембраны. 26. Способ по п.25, в котором липидная функциональная группа представляет собой гидроксильную группу и функциональная группа лекарственного вещества представляет собой кислотный остаток и в котором указанные условия, способствующие взаимодействию, необязательно химическому взаимодействию, включают объединение липосом со второй водной фазой при температуре реакции от 25 до 65 С и при значении рН второй водной фазы от 6 до 8 и выдерживание полученной липосомной суспензии до тех пор пока по меньшей мере часть вышеупомянутых молекул лекарственного вещества, несущих реакционноспособные функциональные группы, не окажутся присоединенными, необязательно ковалентно связанными сложноэфирной связью по меньшей мере с частью вышеупомянутых липидов,имеющих функциональные группы. 27. Способ по п.26, в котором в течение или после выдерживания липосомную суспензию подвергают дальнейшей обработке для увеличения захвата лекарственного вещества липосомами, причем обработку предпочтительно выбирают из группы, состоящей из обработки ультразвуком, электропорации,встряхивания, градиентнонаправленной трансмембранной диффузии. 28. Способ по любому из пп.18-27, в котором гликопротеин или олиго- или полисахаридная часть включает по меньшей мере одну реакционноспособную группу сиаловой кислоты. 29. Способ по любому из пп.18-28, в котором липидная фаза включает по меньшей мере один липид природного или искусственного происхождения, выбранный из группы, состоящей из фосфолипидов,гликолипидов, церамидов и производных этих липидов. 30. Способ по любому из пп.18-29, в котором липидная фаза включает DPPC, холестерин и EPG в соотношении 7:2:1. 31. Способ по любому из пп.18-30, в котором липидная фаза вводится в водную фазу под давлением и, по существу, в условиях отсутствия поперечного сдвига с применением перекрестного проточноинжекционного метода, который приводит к немедленному и спонтанному образованию липосом. 32. Способ по любому из пп.18-31, в котором по меньшей мере часть липидов липидной фазы присоединяется, необязательно ковалентно связывается по меньшей мере с частью молекул требуемого лекарственного вещества перед введением липидной фазы в водную фазу. 33. Способ по п.32, в котором ковалентная связь представляет собой сложноэфирную связь. 34. Способ по любому из пп.18-33, в котором требуемое лекарственное вещество является эритропоэтином.